ES2601602T3 - Procedimiento para la preparación del ácido gamma-aminobutírico (GABA) por medio de bacterias de ácido láctico (LAB) sobre el excedente de la industria agrícola y alimentaria - Google Patents

Abstract

Lactobacillus plantarum DSM 19463 o Lactococcus lactis ssp. DSM 19464 o sus asociaciones.

Description

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El mosto concentrado (cantidad de azúcar total 59,2%) no se añade con anhídrido sulfuroso, se diluyó a la concentración de azúcar total de 1% con agua destilada, o con agua destilada y agua de levadura en la proporción de 50/50, a continuación, se desacidificó por medio de NaOH 1 N a un pH de aproximadamente 4,0 a 4,5 o aproximadamente 6,0 y luego se esterilizó en autoclave a 120°C durante 15 minutos. Cuando se emplea agua de levadura, ésta se prepara mediante la suspensión de aproximadamente 60 g de levadura de cerveza comercial en aproximadamente 300 ml de agua destilada; esterilización en autoclave a 120°C durante unos 30 minutos; separiación por decantación durante 12 horas a 4°C de la biomasa; luego centrifugación a 6000 × g durante 10 minutos a 4°C; y la recuperación final en condiciones estériles del sobrenadante (agua de levadura) que contiene el extracto citoplásmico de las células de levadura.

El suero de leche, obtenido como un producto secundario de la producción de "ricotta 'se ha caracterizado por los siguientes parámetros: lactosa 4,80%, proteínas 0,79%, grasas 0,40%, pH 5,0. Dicho suero de leche se ha empleado en los procesos de fermentación como tal o con la adición de un extracto de levadura (0,5%).

Se añadió L-glutamato monosódico 20 mM a los sustratos de fermentación y, en algunos experimentos, se añadió piridoxal 5-fosfato 0,1 mM.

Las fermentaciones se llevaron a cabo por medio de inóculo del 4% de las bacterias lácticas (densidad celular inicial de aproximadamente 107 ufc/ml) e incubación a 30°C durante 96 horas.

Cuando se empleaban 'células en reposo', es decir, células que no están en la fase de crecimiento, se proporcionaba un inóculo capaz de permitir obtener una densidad celular inicial igual a aproximadamente 10 ufc/ml. Cuando L. plantarum DSM 19463 y Lc. lactis ssp. DSM 19464 se utilizaban en asociación, se inoculaban de acuerdo a una densidad celular de aproximadamente 107 ufc/ml cada uno.

(2)

Cinética de crecimiento y acidificación

La densidad celular de las bacterias lácticas se ha determinado por recuento en placa de agar MRS (Oxoid). La cinética de acidificación de la mezcla suave amasada se obtuvio en línea por medio de la medición del pH (pH-metro 507, Crison, Italia). Los datos relativos a la cinética del crecimiento y de la acidificación se han modelado a través de la ecuación de Gompertz modificada por Zwietering et al. (Zwietering et al., 1990. Modelling of bacterial growth curve. Appl. Environ. Microbiol. 56:1875-1881). En cuanto a los experimentos iniciales, el crecimiento de las bacterias lácticas sobre diferentes sustratos se analizó mediante la determinación de la densidad óptica a 620 nm (O.D.620). La determinación del ácido D-y L-láctico se llevó a cabo por medio de un kit enzimático (DHFF CHAMB Italia Srl, Italia).

(3)

Determinación de GABA

La concentración de GABA en los diferentes sustratos fermentados se determinó por medio del "Analizador de Aminoácidos Biochrom 30' (Biochrom Ltd, Cambridge, RU) que emplea una columna de intercambio catiónico (Productos alimenticios oxidados Na, 20 cm x 4,6 mm) (Di Cagno et al., 2007, Characterization of Italian Cheeses Ripened Under Nonconventional Conditions, J. Dairy Sci. 90:2689-2704).

La producción de GABA también se caracterizó en términos de productividad como gl-1h-1; rendimiento como ΔP/ΔS, es decir la producción de GABA en relación con el consumo de sustrato (L-glutamato monosódico); y la tasa de producción específica (1/x dP/dt), donde x representa la densidad celular en el momento considerado.

(4)

Determinación del contenido de vitaminas, minerales y polifenoles

El contenido de vitaminas del grupo B y de los polifenoles de los sustratos fermentados se determinó por medio de análisis HPLC. La concentración de los minerales se determinó por el método de absorción atómica.

(5)

Caracterización molecular del gen GAD en lactobacterium plantarum DSM 19463

La extracción de ADN de L. plantarum DSM 19463 se llevó a cabo por medio del método descrito por De Los Reyes-Gavilan (De Los Reyes-Gavilan et al., A Lactobacillus helveticus-specific DNA probe detects restriction fragment length polymorphisms in this species. Appl. Environ. Microbiano. 58: 3492 hasta 3432). Los cebadores diseñados por regiones altamente conservadas del gen de GAD, COref/CoreR (5'-CCTCGAGAAGCCGATCGCTTAGTTCG-3 (SEQ. ID NO2) y 5'-TCATATTGACCGGTATAAGTGATGCCC-3' (SEQ ID NO 3)) (PRIM srl San Raffaele Biomedical Science Park, Milán, Italia) se han usado para amplificar el gen de GAD. Cincuenta microlitros de cada reacción de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) contenían: 200 mM de cada 2'-desoxirribonucleótido 5'-trifosfato, 1 M de cada cebador, 2 M de MgCl, 2 U de Taq ADN polimerasa y aproximadamente 50 ng de DNA. Las reacciones de amplificación de PCR se llevaron a cabo por medio del Sistema GeneAmpPCR 9700 (Applied Biosystem, EE.UU.). Los productos de amplificación se separaron por medio de electroforesis en gel de agarosa al 1,5% y coloración y se obtuvieron por medio de bromuro de etidio (0,5 g/ml). Los amplicones eluidos por medio del gel se purificaron a través del ADN GFX PCR y el Kit Gel Band Purification (Amersham Biosciences, Upsala, Suecia). Las reacciones de secuenciación de DNA han sido realizadas por PRIM. La comparación de secuencias se llevó a cabo por medio de

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una base de datos de BLAST Basic. La traducción de las secuencias de nucleótidos se llevó a cabo por medio del software Omiga (Oxford Molecular, Madison, EE.UU.).

Resultados

(1)

Crecimiento y acidificación de mosto y de suero de leche

Teniendo en cuenta la innovación biotecnológica asociada a la utilización del mosto y al suero de leche como sustratos para la síntesis de GABA a partir de bacterias lácticas, la potencialidad del crecimiento y la acidificación de las bacterias fue probada inicialmente en los dos sustratos. Como es posible observar en la figura. 1, también el mosto diluido en agua destilada (azúcares totales 1%), modificación del pH a aproximadamente 4,0, permitió un crecimiento moderado de las bacterias lácticas. Ejemplos relativos a los cultivos reportados en la fig. 1 mostraron un valor de DO620 de 0,89 a 1,06 después de 48 horas de incubación a 30°C. También las otras bacterias empleadas para la selección inicial mostraron valores de DO620 en el intervalo informado anteriormente. Para el crecimiento microbiano, diversos valores de pH en el intervalo de 3,11 a 3,65 correspondieron (Fig. 1). Cuando la dilución del mosto se llevó a cabo no solo por medio de agua destilada, sino también con agua de levadura (relación de 50:50) el crecimiento microbiano fue definitivamente aumentado (Fig. 2). Como se estimó por medio de la determinación de la DO620, el crecimiento bacteriano se demostró que estaba en el intervalo desde 2,28 hasta 2,48, con el valor más alto registrado en el caso de L. plantarum DSM 19463. Los mismos resultados se obtuvieron también por comparación del crecimiento de bacterias lácticas en el suero de leche como tal o en el suero de leche añadido con extracto de levadura (0,5%). En particular, Lc. lactis ssp. DSM 19464 ha mostrado el mayor crecimiento en el suero de leche. Al final de esta primera etapa de selección fue así como se decidió seguir con la parte experimental de L. plantarum DSM 19463 y en Lc. lactis DSM 19464 empleando como sustratos mosto diluido (azúcares totales 1%) con agua de levadura y agua destilada (en una proporción de 50:50), y el suero de leche añadido con extracto de levadura (0,5%).

(2)

Síntesis de GABA de Lactobacillus plantarum DSM 19463 y Lactococcus lactis ssp. DSM 19464

La figura 3 muestra la síntesis de GABA de Lactobacillus plantarum DSM 19463 en mosto y suero de leche integrados de manera diferente. Una modificación adicional que se refiere a la utilización del mosto (pH de aproximadamente 4,5) fue la adición de L-glutamato monosódico (20 mM) como sustrato para la actividad de la enzima GAD. El valor de pH del suero de leche era obviamente de aproximadamente de 5,9. Como se observa en el caso de los procesos de crecimiento y acidificación, la adición de agua de levadura favoreció las producciones más altas de GABA, cuyas producciones después de 96 horas de fermentación se fijaron en valores de aproximadamente 95 g/l (aproximadamente 0,91 mM). Las producciones de GABA en el suero de leche han mostrado ser notablemente inferiores, incluso en la presencia de extracto de levadura.

Por el contrario, Lc. lactis ssp. DSM 19464 mostró la mayor síntesis de GABA en el suero de leche fijada en valores de aproximadamente 80 g/l (0,77 mM).

Sobre la base de los resultados así obtenidos se decidió optimizar de todos modos la producción de GABA de L. plantarum DSM 19463 a partir de mosto como el único sustrato.

(3) Optimización de la síntesis de GABA de L. plantarum DSM 19463 en Deva

En particular, se han considerado las siguientes variables de fermentación: (i) el pH; (ii) las concentraciones iniciales de azúcares en el mosto; (iii) la adición de piridoxal 5-fosfato como un cofactor de la enzima GAD; (iv) el uso de las 'células en reposo'; y (v) el uso combinado de L. plantarum DSM 19463 y Lc. lactis ssp. DSM 19464.

El uso de un tampón de fosfato con el fin de mantener constante el valor de pH durante el período de incubación forzó el empleo de molaridades demasiado altas, lo que resultó ser inhibitorio del crecimiento y la actividad enzimática de L. plantarum DSM 19463. Con el objetivo de evitar que el valor de pH alcanzara valores notablemente ácidos demasiado rápidamente durante el período de incubación, el valor inicial del pH del mosto se modificó hasta que el valor del mosto fue de aproximadamente 6,0, mediante la adición de NaOH 1N. La figura 4 muestra la cinética de acidificación, crecimiento y síntesis de GABA de L. plantarum DSM 19463 en mosto diluído (azúcares totales 1%) con agua destilada y agua de levadura, pH de aproximadamente 6,0, y con la adición de L-glutamato monosódico (20 mM). Es posible observar en tales condiciones un fuerte proceso de acidificación que se caracteriza por valores de ΔpH = 2,12 unidades, Vmax = 0,151 dpH min-1 y λ = 0,89 h, al cual corresponde la síntesis de aproximadamente 25 mM de ácido láctico. Un crecimiento microbiano corresponde a este tipo de cinética de acidificación, siendo caracterizado dicho crecimiento por valores de A = 1,79 log ufc ml-1, μmax = 0,31 Δlog ufc ml-1 h-1 y λ = 0,89 h; y sobre todo un aumento constante de la síntesis de GABA que se fija en el valor de aproximadamente de 500 mg/ml (aproximadamente 4,79 mM) después de 78 horas de fermentación.

La concentración de azúcares iniciales en el mosto se cambió en el intervalo de 0,3 a 1,0% (Fig. 5). Aunque la síntesis de GABA está vinculada a las reacciones del catabolismo de los aminoácidos, tal síntesis se ha convertido en aumentar proporcionalmente (376-500 mg/l) a la concentración de azúcares (0,3-1%). Las concentraciones superiores al 1% no dieron aumentos significativos en la síntesis de GABA. En presencia de la concentración inicial

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de 1%, solo trazas (<0,1%) de glucosa y fructosa se pusieron de manifiesto en el mosto después de 72-96 horas de fermentación.

Como se muestra en la figura 6, la adición de piridoxal 5-fosfato (0,1 mM) no favoreció un aumento en la síntesis de GABA con respecto a lo que se observa en el caso de su ausencia (Fig. 5). Evidentemente, la concentración de dicho compuesto en el mosto es suficiente para desarrollar la función de co-factor de la enzima GAD. Como era de esperar, también las cinéticas de acidificación y de crecimiento no se vieron afectadas por la adición de piridoxal 5fosfato.

Como la síntesis de GABA es una reacción puramente enzimática que no está vinculada a ninguna teoría de multiplicación bacteriana, se evaluó la posibilidad de la inoculación del mosto con una alta biomasa (10 ufc/ml) de L. plantarum DSM 19463 en condiciones virtuales de 'células en reposo'. La figura 7 muestra que en estas condiciones de subdesarrollo de células la síntesis de GABA es más baja que la observada en condiciones de crecimiento de las células (Fig. 5). El uso de células de L. plantarum DSM 19463 en tales condiciones solo permitió un aumento bajo alcanzado en la producción de GABA en las primeras horas de incubación.

De nuevo con el objetivo de aumentar la producción de GABA obtenido de L. plantarum de acuerdo con las condiciones de fermentación de la figura. 5, se consideró la hipótesis de llevar a cabo un inóculo combinado de tal bacteria en asociación con Lc. lactis DSM 19464. También bajo estas condiciones experimentales no se observaron aumentos en la síntesis de GABA.

(4) Caracterización del proceso de síntesis de GABA de L. plantarum DSM 19463 en mosto.

Algunos parámetros biotecnológicos como la productividad como gl-1h-1, rendimiento como ΔP/ΔS y la tasa de producción específica (1/x dP/dt) de GABA se han determinado durante la fermentación del mosto diluido con agua de levadura y agua destilada (50/50 (azúcares totales 1%), pH de aproximadamente 6,0, y añadido con L-glutamato monosódico (20 mM), debido a la acción de L. plantarum DSM 19463. Como es posible observar en la figura 8, los valores más altos de productividad que eran iguales a 5,74 a 5,79 gl-1h-1 se han observado respectivamente, después de 72-78 horas. De acuerdo con ello, también los valores más altos de rendimiento y tasa específica de GABA, respectivamente, de 0,206 y 0,673 1/x dP/dt se han observado después de 72 horas de fermentación a 30°C.

Después de 72 horas de fermentación, el caldo de cultivo se recuperó y se sometió como tal al proceso de liofilización. La Tabla 2 representa la composición como moléculas funcionales y como bacterias lácticas de la preparación, en particular, la concentración de moléculas funcionales por 100 g de sustancia seca de la preparación que se basa en mosto después de la fermentación por medio de L. plantarum DSM 19463 y liofilización sucesiva.

Tabla 2

Compuesto

Concentración

ácido gamma-aminobutírico

890 mg/100 g de sustancia seca

Vitamina B3

25,8 mg/100 g

polifenoles totales (método espectrofotométrico)

2,09 g / 100 g

Zinc

28,1 mg/100 g

Cobre

1,11 mg/100 g

Magnesio

155 mg/100 g

bacterias lácticas

1010 ufc/g

Como es posible observar en la Tabla 2, la preparación contiene una concentración de GABA de aproximadamente 890 mg/100 g de sustancia seca, siendo esta última más de ocho veces mayor que la descrita en la patente JP-A2005-102559. La preparación también contiene otras moléculas funcionales tales como vitaminas del grupo B que se derivan de la utilización del agua de levadura como medio de dilución para el mosto, y minerales y polifenoles que se derivan del mosto como sustrato básico. Por último, aproximadamente 10 células por gramo de L. plantarum DSM 19463 están presentes en la preparación, siendo probable que tales células muestren potenciales actividades probióticas sobre la base de las pruebas preliminares.

Ejemplo 2. Evaluación de la eficiencia de la mezcla enriquecida con GABA de acuerdo con la presente invención y que se define en este documento como la biomasa o el complejo bio, en un modelo de epidermis humana reconstituida in vitro y a continuación en un modelo de piel FT reconstituida in vitro

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Análisis histológico

Las preparaciones histológicas necesarias para los análisis histológicos de la RHE se llevan a cabo por un centro especializado exterior. Al final de todos los tratamientos se retiran las RHE de su soporte de plástico por medio de una lanceta y se

someten a un proceso de fijación que emplea 10% de formalina. PCR a tiempo real En este estudio se emplearon los siguientes genes:

DEFB4

Hs00175474 m1

IL10

Hs00174086 m1

IL12B

Hs00233688 m1

HAS1

Hs00155410 m1

GCLC

Hs00155249 m1

GSS

Hs00609286 m1

IVL

Hs00846307 s1

FLG

Hs00863478 g1

1.

Extracción de ARN

2.

Síntesis de cADN a partir del ARN total

3.

PCR La técnica emplea sondas Taqman para detectar la señal fluorescente y es muy sensible, consistiendo en la amplificación y cuantificación de una secuencia específica de ácidos nucleicos. La detección del producto de la PCR se produce en tiempo real. La cuantificación de ADN, ADNc o ARN se lleva a cabo mediante la determinación del ciclo en el que el producto PCR puede detectarse por primera vez, por lo tanto no en el momento cuando la reacción

se ha saturado. La cuantificación del producto se produce a través de la detección de la fluorescencia medida en cada ciclo; la fuerza de la señal es directamente proporcional a la cantidad de producto amplificado. Extracción de ARN Materiales Kit RNAqueous (Ambion) Principio del método El RNAqueous es un método rápido para el aislamiento del ARN basado en filtro. El método se basa en la capacidad

de las fibras de vidrio para unir los ácidos nucleicos en soluciones salinas concentradas.

La concentración de RNA se determina leyendo el valor de la absorbancia a 200 nm y 280 nm en una placa de 96

pocillos que era transparente a UV y empleando la siguiente fórmula:

A260*Factor de dilución*40 = g de ARN/ml

Retrotranscripción de ARN en ADNc

Materiales

Alta capacidad del Kit de transcripción inversa de ADNc

(Applied Biosystems)

Principio del método

El principio del método se basa en el uso de cebadores aleatorios que aseguran una síntesis eficaz de la primera

hélice de todas las moléculas de ARN presentes. cDNA se diluye y se conserva a -20°C.

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PCR a tiempo real La cuantificación determina el cambio de expresión de una secuencia de ácidos nucleicos (diana) en una muestra

con respecto a la misma secuencia en una muestra calibrada que puede una muestra de control sin tratar o de la muestra en el momento de referencia. En la cuantificación relativa se emplea un control endógeno como la "referencia activa 'con el fin de normalizar el

ADNc diana. Materiales 2× TaqMan universal PCR Master Mix Ensayo de la expresión de genes 20× TaqMan (Applied Biosystems); GAPDH (control endógeno) Hs 999999 m1 gen diana, consulte la tabla 4.4 agua 'nucleasa libre' Procedimiento Cada muestra biológica se evalúa en ensayos triples. El termociclador de Applied Biosystems 7500 se emplea

aplicando el siguiente programa:

Condiciones

PASO 1. AmpliTaq PASO 2: 40 ciclos

ADN Oro

Activación de polimerasa

TEMPERATURA

95°C 95°C 60°C

TIEMPO

10 MIN 15 s 1 MIN

Los datos generales del instrumento se registran por el software SDS 1.3.1 interno y se reportan como "datos en bruto 'de la cuantificación relativa. Los resultados se exportan como Excel.

Un valor es aceptado como significativo si se sobreexpresa o desregula por una vez con respecto a la muestra de calibración.

Protocolos

Tolerabilidad cutánea y eficiencia de la función de barrera

El potencial de irritación se evalúa en el modelo de la epidermis SkinEthic después de la aplicación aguda de la biomasa en la cantidad de 50 l (1% -3% -3% + 0,8% agente de conservación) para cuatro tiempos: 24 horas-24 horas-24 horas de recuperación-48 horas-72 horas.

Tres parámetros complementarios se han estudiado con el objetivo de definir una evaluación global y predictiva de la acción biológica de la biomasa a nivel cutáneo cuando el tipo de evaluación no se ha realizado hasta el momento y representa una nueva forma de investigación en dermatología. La evaluación permite que la monitorización de la tolerabilidad se lleve a cabo y, al mismo tiempo el control de la acción biológica descrita en la literatura por medio de biomarcadores específicos.

Monitoreo de la vitalidad celular a través de la prueba MTT que define el potencial de irritación cutánea: en ese caso los inventores querían no sólo verificar el resultado después de la aplicación aguda a corto plazo (24 horas), sino también los efectos a largo plazo teniendo en cuenta el potencial actividad biológica de la biomasa.

Evaluación histológica de H & E, complementaria y para la confirmación de los valores de citotoxicidad.

Aparte del interés para la acción antimicrobiana y por lo tanto para el aumento de la protección antimicrobiana fisiológica, las beta-defensinas tienen un papel sobre la regulación global de la inmunidad innata a nivel cutáneo, ya que aumentan la proliferación celular y la producción de citoquinas específicas.

Acción sobre la síntesis del ácido hialurónico en el equilibrio redox y en los marcadores de diferenciación terminal (Filagrina e involucrina) en el Modelo Ft-piel con respecto a GABA

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Los productos (1% de biomasa y GABA) se aplican en cantidades de 50 l en la superficie del tejido y después se

aplican de nuevo cada día durante 3 días = 72 horas. Al final del tratamiento los tejidos se procesan para la RT-PCR. Este tipo de tratamiento en ausencia de estímulos negativos y sobre un tejido en una situación "fisiológica" permite efectos biológicos tras una exposición repetida al ingrediente y su mecanismo de acción que se pondrá en evidencia a nivel dérmico.

El control de GABA positivo aplicado a la dosis de 1 mm ha sido elegido debido a que su eficiencia se documenta en la literatura tanto en la síntesis de ácido hialurónico como en la protección frente al estrés oxidativo a través de la mayor producción de GSH, un antioxidante no enzimático hidrófilo.

Adquisición de datos

Los datos generales obtenidos mediante el instrumento ABI PRISM 7500 son registrados por el software SDS 1.3.1. interno y se presentan como datos brutos de cuantificación relativa. Los resultados se exportan como Excel. Un valor es aceptado como significativo si se sobreexpresa o es el desregulado por una vez con respecto a la

muestra de calibración.

Las muestras histológicas (portaobjetos de vidrio) se analizaron por medio del microscopio Leica DM2500, las imágenes se guardan y se procesan mediante el software Leica Application Suite (LAS). Las modificaciones morfológicas de los tejidos se comparan con los tejidos no tratados. Resultados Tolerabilidad cutánea Resultados de la prueba MTT expresados como % de la vitalidad celular calculada con respecto a la muestra de

control negativo. Los resultados de la prueba de MTT en todos los tiempos definidos muestran que ninguna actividad citotóxica se puede atribuir al compuesto bajo examen, es decir, la biomasa de LB plantarum.

La presencia de un agente conservante antimicrobiano (Isocida 0,8%) no afectó a los resultados de la citotoxicidad. Se hace hincapié en que la vitalidad celular después del tratamiento con la biomasa, tanto en el 1% como al 3% aumentó (en los tiempos de 24 horas + recuperación y 48 horas) más allá del valor de la variabilidad intrínseca de la prueba (+/-15%) con un aumento del 40% con respecto al 100% atribuido a la muestra de control negativo.

Dicho resultado ofrece una valencia superior considerando también el hecho de que el tiempo de 24 horas + 24 horas de recuperación es un tratamiento particularmente severo, ya que permite que se observen los efectos de la toxicidad retardada.

En ausencia de otros elementos de la toxicidad a nivel histológico tal aumento se puede correlacionar con una estimulación de la proliferación celular que es inducida por el tratamiento con la biomasa.

Tratamientos de 24 horas Ninguna modificación significativa en los tejidos tratados con la biomasa con respecto a la muestra de control negativo al 1%. Al 3%, y en presencia del agente conservante se observa que para algunas células basales hay una pérdida de cohesión y un citoplasma ligeramente hinchado (espongiosis).

Tratamientos de 24 horas + recuperación de 24 horas Ninguna modificación significativa se observa con respecto a la muestra de control de 24 horas. Tratamientos de 48 horas Ninguna modificación morfológica significativa se observó con respecto a la muestra de control, aumento en el

espesor de la epidermis tanto en el 1% como al 3%.

En presencia del agente conservante se observa una capa córnea ligeramente engrosada, con marcas de descamación de superficie (S. disjunctum) Tratamientos de 72 horas Tanto en el 1% como al 3% se observa una disminución del espesor de la epidermis vital que no es significativa con

respecto a la muestra de control lo que está en conexión con la evolución fisiológica del tejido. RT-PCR

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