CN113774000A - 动物双歧杆菌发酵滤液、制备方法及其应用 - Google Patents

动物双歧杆菌发酵滤液、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种动物双歧杆菌发酵滤液、制备方法及其应用。所述发酵滤液由包含下述步骤的方法制备得到：将动物双歧杆菌接种到种子培养基中进行培养，得到种子液；将种子液接种到含有麦芽提取物、氯化钙和葡萄糖的发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；将所述发酵液进行离心、过滤处理得到动物双歧杆菌发酵滤液。所述的发酵滤液具有显著的屏障修复功效，与未添加该产品的空白对照相比，皮肤的角质层含水量提高9％‑10％、经皮水分散失量降低5％，可应用于化妆品领域，用于皮肤屏障修复产品的研发。

Description

动物双歧杆菌发酵滤液、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物发酵的技术领域，尤其涉及一种动物双歧杆菌发酵滤液、制备方法及其应用。
背景技术
益生菌通常指的是对人类和动物具有有益作用的微生物。益生菌的益生功能研究已经拓展到肠道以外的健康相关的各个方面，是当前基础研究的热点。生活中其应用随处可见，包括食品行业、医药领域、护肤领域。
人类皮肤每平方厘米约有十亿的微生物所定植，这些微生物通过分泌抗菌肽或自由脂肪酸，预防病体的皮肤定植，从而保护皮肤的健康。
目前国内外对于益生菌的功能特性研究得比较成熟，已知确切功效和潜在功效达十余种之多，其中对益生菌的屏障修复功效也在进行相关研究。Gueniche等人研究了益生菌(长双歧杆菌)对敏感性皮肤的影响。体外实验发现神经细胞与长双歧杆菌的裂解产物共孵育，显著抑制辣椒素所诱导的神经元释放的降钙素基因相关肽。临床应用长双歧杆菌提取物(10％)每天2次，共2个月，皮肤敏感性明显下降。研究者推测，长双歧杆菌可能是通过降低神经元反应性来降低皮肤敏感性。该研究团队的另一项研究发现，口服补充益生菌(副干酪乳杆菌)可降低敏感性皮肤患者皮肤的敏感性，并促进皮肤屏障功能的修复。目前益生菌的屏障修复功效被广泛应用在食品、医药、化妆品领域。
专利CN106520603B公开了一种在细胞水平筛选具有增强肠道细胞紧密连接功能益生菌的方法，先利用消化后的麦醇溶蛋白处理细胞，在洗去残留的消化后的麦醇溶蛋白后加入一定量益生菌共孵育一定时间后洗去，以确定益生菌改善被消化麦醇溶蛋白破坏的细胞紧密连接的能力。体外实验模型反映益生菌对麦醇溶蛋白已造成的肠上皮损伤的实际修复作用，所得结果符合益生菌对肠道内已形成的肠道屏障破坏的修复能力，从而在细胞水平为确定益生菌及其他微生物是否增强肠道细胞紧密连接提供一个更为便捷准确的检测方法。
专利申请CN105163747A公开了一种能够恢复在胃酸过多的药物治疗期间丧失的胃的屏障效应的包含益生菌的组合物，并使由于所述药物治疗造成的副作用最小化。
专利申请CN111265468A公开了一种皮肤双屏障修复组合物及其应用，该发明申请的皮肤双屏障修复组合物通过二裂酵母发酵产物滤液、燕麦发酵滤液、类皮肤脂质复合物的相互搭配，模拟皮肤微生物组分中的益生元、益生菌及微生物代谢物，有效稳定、平衡皮肤微生物屏障；而类皮肤脂质复合物与燕麦仁油主要修复皮肤砖墙结构，改善角质层脂质组成，以达到修复皮肤物理屏障的目的，通过两大屏障修复组分的相互配合，同时修复皮肤微生物屏障及皮肤物理屏障(角质层)，帮助皮肤重新建立结构完整的角质层和建立健康良好的微生物菌落生态圈，促使屏障受损肌肤重回健康、活力状态。
专利申请CN108403502A公开了一种提高皮肤应激反应和促进益生菌平衡的组合物及形成方法，由黄花蒿叶提取物、乳酸杆菌和北美圣草发酵产物提取物、α-葡萄糖寡糖、肌肽及1，2-戊二醇构成；其中，所述黄花蒿叶提取物的浓度在5％-80％之间；所述乳酸杆菌和北美圣草发酵产物提取物的浓度在5％-80％之间；所述肌肽的浓度在5％-80％。
综上所述，目前市场上的屏障修复益生菌产品主要存在以下不足：
1.屏障修复益生菌主要应用于食品、医药领域。化妆品领域较少；
2.应用于化妆品领域的益生菌缺乏有效功效数据，未对使用前后的功效进行对比；
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种动物双歧杆菌发酵滤液、制备方法及其应用，所述的动物双歧杆菌发酵滤液具有显著的屏障修复功效，可广泛应用于化妆品领域，以用于皮肤屏障修复产品的研发。
本发明具体技术方案如下：
1.一种动物双歧杆菌发酵滤液，其由包含下述步骤的方法制备得到：
将动物双歧杆菌接种到种子培养基中进行培养，得到种子液；
将种子液接种到含有麦芽提取物、氯化钙和葡萄糖的发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；
将所述发酵液进行离心、过滤处理得到动物双歧杆菌发酵滤液。
2.根据项1所述的动物双歧杆菌发酵滤液，其中，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)CCFM1160，其保藏编号为GDMCC No.61500。
3.根据项1或2所述的动物双歧杆菌发酵滤液，其中，所述麦芽提取物的浓度为0.1-0.9g/L，优选为0.2-0.8g/L，进一步优选为0.5g/L；所述氯化钙的浓度为0.02-0.50g/L，优选为0.05-0.35g/L，进一步优选为0.2g/L。
4.根据项1-3中任一项所述的动物双歧杆菌发酵滤液，其中，所述发酵培养基还包括如下浓度的各组分：碳源1.00-11.00g/L，优选为2.00-9.00g/L，氮源2.5-14.5g/L，优选为3.5-12.5g/L，无机盐2.0-16.3g/L，优选为3.2-14.3g/L，表面活性剂0.20-2.10ml/L，优选为0.30-1.75ml/L以及抗氧化剂0.10-1.50g/L，优选为0.20-1.20g/L；
优选的，碳源为葡萄糖，
氮源为1.50-8.00g/L的胰蛋白胨和1.00-6.50g/L的酵母粉，优选为2.00-7.00g/L的胰蛋白胨和1.50-5.50g/L的酵母粉，
无机盐为0.60-4.50g/L的无水乙酸钠、0.60-4.50g/L的柠檬酸氢二铵、0.05-2.15g/L的七水硫酸镁、0.05-1.15g/L的一水硫酸锰和0.70-4.00g/L的三水合磷酸氢二钾，优选为1.00-4.00g/L的无水乙酸钠、1.00-4.00g/L的柠檬酸氢二铵、0.10-1.80g/L的七水硫酸镁、0.10-0.75g/L的一水硫酸锰和1.00-3.75g/L的三水合磷酸氢二钾，
表面活性剂为吐温80，以及
抗氧化剂为L-半胱氨酸盐酸盐。
5.根据项1-4中任一项所述的动物双歧杆菌发酵滤液，其中，种子液的接种量为1.0-5.0％(v/v)。
6.根据项1-5中任一项所述的动物双歧杆菌发酵滤液，其中，发酵温度为30-40℃，优选为33-38℃；优选的，发酵时间为15-45h，优选为22-40h。
7.根据项1-6中任一项所述的动物双歧杆菌发酵滤液，其中，发酵压力为0.01-0.05MPa。
8.根据项1-7中任一项所述的动物双歧杆菌发酵滤液，其中，发酵液中的OD600为2.0-5.0，优选为2.5-4.5；优选的，发酵液的pH为4.0-6.0，优选为4.3-4.9；优选的，发酵液的残糖浓度为0-1.0g/L。
9.根据项1-8中任一项所述的动物双歧杆菌发酵滤液，其中，所述种子液的OD600在2.5以上，优选为2.5-4.5。
10.根据项1-9中任一项所述的动物双歧杆菌发酵滤液，其中，在得到种子液的步骤中，其包括将动物双歧杆菌接种到种子培养基中培养10-28h得到一级种子液，然后将所述一级种子液接种到种子培养基中进行培养得到所述种子液。
11.根据项10所述的动物双歧杆菌发酵滤液，其中，所述一级种子液的接种量为1.0-5.0％(v/v)。
12.根据项1-11中任一项所述的动物双歧杆菌发酵滤液，其中，所述种子培养基为改良MRS培养基。
13.根据项1-12中任一项所述的动物双歧杆菌发酵滤液，其中，所述动物双歧杆菌发酵滤液包含：蛋白质、糖、氨基酸、乙酸、乳酸、维生素B6、维生素PP和叶酸。
14.一种制备动物双歧杆菌发酵滤液的方法，其包括下述步骤：
将动物双歧杆菌接种到种子培养基中进行培养，得到种子液；
将种子液接种到含有麦芽提取物和氯化钙的发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；
将所述发酵液进行离心、过滤处理得到动物双歧杆菌发酵滤液。
15.根据项14所述的方法，其中，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)CCFM1160，其保藏编号为GDMCC No.61500。
16.根据项14或15所述的方法，其中，所述麦芽提取物的浓度为0.1-0.9g/L，优选为0.2-0.8g/L，进一步优选为0.5g/L；所述氯化钙的浓度为0.02-0.50g/L，优选为0.05-0.35g/L，进一步优选为0.2g/L。
17.根据项14-16中任一项所述的方法，其中，所述发酵培养基还包括如下浓度的各组分：碳源1.00-11.00g/L，优选为2.00-9.00g/L，氮源2.5-14.5g/L，优选为3.5-12.5g/L，无机盐2.0-16.3g/L，优选为3.2-14.3g/L，表面活性剂0.20-2.10ml/L，优选为0.30-1.75ml/L以及抗氧化剂0.10-1.50g/L，优选为0.20-1.20g/L；
优选的，碳源为葡萄糖，
氮源为1.50-8.00g/L的胰蛋白胨和1.00-6.50g/L的酵母粉，优选为2.00-7.00g/L的胰蛋白胨和1.50-5.50g/L的酵母粉，
无机盐为0.60-4.50g/L的无水乙酸钠、0.60-4.50g/L的柠檬酸氢二铵、0.05-2.15g/L的七水硫酸镁、0.05-1.15g/L的一水硫酸锰和0.70-4.00g/L的三水合磷酸氢二钾，优选为1.00-4.00g/L的无水乙酸钠、1.00-4.00g/L的柠檬酸氢二铵、0.10-1.80g/L的七水硫酸镁、0.10-0.75g/L的一水硫酸锰和1.00-3.75g/L的三水合磷酸氢二钾，
表面活性剂为吐温80，以及
抗氧化剂为L-半胱氨酸盐酸盐。
18.根据项14-17中任一项所述的方法，其中，种子液的接种量为1.0-5.0％(v/v)。
19.根据项14-18中任一项所述的方法，其中，发酵温度为30-40℃，优选为33-38℃；优选的，发酵时间为15-45h，优选为22-40h。
20.根据项14-19中任一项所述的方法，其中，发酵压力为0.01-0.05MPa。
21.根据项14-20中任一项所述的方法，其中，发酵液中的OD600为2.0-5.0，优选2.5-4.5，发酵液的pH为4.0-6.0，优选4.3-4.9，发酵液的残糖浓度为0-1.0g/L。
22.根据项14-21中任一项所述的方法，其中，所述种子液的OD600在2.5以上，优选为2.5-4.5。
23.根据项14-22中任一项所述的方法，其中，在得到种子液的步骤中，其包括将动物双歧杆菌接种到种子培养基中培养10-28h得到一级种子液，然后将所述一级种子液接种到种子培养基中进行培养得到所述种子液。
24.根据项23所述的方法，其中，所述一级种子液的接种量为1.0-5.0％(v/v)。
25.根据项14-24中任一项所述的方法，其中，所述种子培养基为改良MRS培养基。
26.动物双歧杆菌在化妆品领域中的应用，其中，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)CCFM1160，其保藏编号为GDMCC No.61500。
27.项1-13中任一项所述的动物双歧杆菌发酵滤液或者项14-25中任一项所述的方法制备得到的动物双歧杆菌发酵滤液在化妆品领域中的应用。
28.一种化妆品组合物，其包含项1-13中任一项所述的动物双歧杆菌发酵滤液或者项14-25中任一项所述的方法制备得到的动物双歧杆菌发酵滤液。
29.根据项28所述的化妆品组合物，其中，所述组合物还包括辅料。
30.一种动物双歧杆菌发酵滤液，其包含蛋白质、糖、氨基酸、乙酸、乳酸、维生素B6、维生素PP和叶酸。
31.根据项30所述的动物双歧杆菌发酵滤液，其是由项14-24中任一项所述的方法制备得到。
发明的效果
本发明所述的动物双歧杆菌发酵滤液具有显著的屏障修复功效，与未添加该产品的空白对照相比，皮肤的角质层含水量提高9％-10％、经皮水分散失量降低5％，可应用于化妆品领域，用于皮肤屏障修复产品的研发。
附图说明
图1是实验例3中人体斑贴实验的示意图。
图2-1是实验例4中使用实施例1所述的发酵滤液对皮肤角质层含水量的影响的示意图。
图2-2是实验例4中使用实施例1所述的发酵滤液对经皮水分散失量的影响的示意图。
图2-3是实验例4中使用实施例1所述的发酵滤液对皮肤红斑a值的影响的示意图。
图3是实验例5中的实施例1和对比例1所述的发酵滤液稳定性研究的示意图，其中，a为对比例1所得到的发酵滤液示意图，b为对比例1所得到的发酵滤液在40℃下放置4个月的示意图，c为实施例1所得到的发酵滤液的示意图，d为实施例1所得到的发酵滤液在40℃下放置4个月的示意图。
菌株保藏信息
本发明用的菌株动物双歧杆菌(Bifidobacterium amimalis)CCFM1160，于2021年2月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC NO:61500，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，电话：020-87137633 37656629。
具体实施方式
下面结合附图所描述的实施方式对本发明做以详细说明，其中所有附图中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本发明提供了一种动物双歧杆菌发酵滤液，其由包含下述步骤的方法制备得到：
将动物双歧杆菌接种到种子培养基中进行培养，得到种子液；
将种子液接种到含有麦芽提取物、氯化钙和葡萄糖的发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；
将所述发酵液进行离心、过滤处理得到动物双歧杆菌发酵滤液。
所述种子培养基指的是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为活力强的“种子”。
所述麦芽提取物是一种完全源自谷物的天然食品，它含有丰富的麦芽糖、果糖、葡萄糖、蛋白质、小分子肽、人体必须的氨基酸和多种维生素、矿物质，还含有具有保健功能的β-葡聚糖和生育酚，所述麦芽提取物是以精选优质大麦芽(大麦)为原料，经粉碎、酶解后制成麦汁，再经过过滤、真空浓缩，制得液体麦芽提取物，液体麦芽提取物经过带式真空干燥、粉碎后得到固体麦芽提取物。
在一个实施方案中，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)CCFM1160，其保藏编号为GDMCC No.61500。
在一个实施方案中，所述麦芽提取物的浓度为0.1-0.9g/L，优选为0.2-0.8g/L，进一步优选为0.5g/L；所述氯化钙的浓度为0.02-0.50g/L，优选为0.05-0.35g/L，进一步优选为0.2g/L。
例如，所述麦芽提取物的浓度可以为0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L等；
所述氯化钙的浓度可以为0.02g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.35g/L、0.5g/L等。
在一个实施方案中，所述发酵培养基还包括如下浓度的各组分：所述发酵培养基还包括如下浓度的各组分：碳源1.00-11.00g/L，优选为2.00-9.00g/L，氮源2.5-14.5g/L，优选为3.5-12.5g/L，无机盐2.0-16.3g/L，优选为3.2-14.3g/L，表面活性剂0.20-2.10ml/L，优选为0.30-1.75ml/L以及抗氧化剂0.10-1.50g/L，优选为0.20-1.20g/L；
优选的，碳源为葡萄糖，
氮源为1.50-8.00g/L的胰蛋白胨和1.00-6.50g/L的酵母粉，优选为2.00-7.00g/L的胰蛋白胨和1.50-5.50g/L的酵母粉，
无机盐为0.60-4.50g/L的无水乙酸钠、0.60-4.50g/L的柠檬酸氢二铵、0.05-2.15g/L的七水硫酸镁、0.05-1.15g/L的一水硫酸锰和0.70-4.00g/L的三水合磷酸氢二钾，优选为1.00-4.00g/L的无水乙酸钠、1.00-4.00g/L的柠檬酸氢二铵、0.10-1.80g/L的七水硫酸镁、0.10-0.75g/L的一水硫酸锰和1.00-3.75g/L的三水合磷酸氢二钾，
表面活性剂为吐温80以及抗氧化剂为L-半胱氨酸盐酸盐。
本发明通过在发酵培养基中加入麦芽提取物和氯化钙以及碳源，能够使所得的发酵液比较稳定，从而可以应用于化妆品领域。
在一个实施方案中，种子液的接种量为1.0-5.0％(v/v)。
所述接种量是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。例如，种子液的接种量可以为1.0％(v/v)、1.5％(v/v)、2.0％(v/v)、2.5％(v/v)、3.0％(v/v)、3.5％(v/v)、4.0％(v/v)、4.5％(v/v)、5.0％(v/v)等。
在一个实施方案中，发酵温度为30-40℃，优选为33-38℃；优选的，发酵时间为15-45h，优选为22-40h。
例如，发酵温度可以为30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等；
发酵时间可以为15h、22h、25h、30h、35h、40h、45h等。
在一个实施方案中，发酵压力为0.01-0.05MPa。
本发明所述的发酵压力指的是在发酵容器中的压力，例如，当使用发酵罐进行发酵时，指的是发酵罐中的压力。
所述发酵压力例如可以为0.01MPa、0.02MPa、0.03MPa、0.04MPa、0.05MPa等。
在一个实施方案中，发酵液中的OD600为2.0-5.0，优选2.5-4.5；优选的，发酵液的pH为4.0-6.0，优选为4.3-4.9；优选的，发酵液的残糖浓度为0-1.0g/L。在此时，动物双歧杆菌发酵充分，基本耗尽了培养基中的营养物质，获得的产品功效较为显著。
例如，发酵液中的OD600可以为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0等；
发酵液的pH可以为4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0等；
发酵液的残糖浓度可以为0.1g/L、0.2g/L、0.5g/L、0.8g/L、1.0g/L等。
在一个实施方案中，所述种子液的OD600在2.5以上，优选为2.5-4.5。
此时，种子液处于对数期中后期，活力旺盛且能保证后续的接种量。
在一个实施方案中，在得到种子液的步骤中，其包括将动物双歧杆菌接种到种子培养基中培养10-28h得到一级种子液，然后将所述一级种子液接种到种子培养基中进行培养得到所述种子液。
具体地，其是先将单株动物双歧杆菌接种到种子培养基中进行培养，优选在33-38℃下培养10-28h得到一级种子液，然后将得到的一级种子液再次接种到新鲜的种子培养基中进行培养，优选在33-38℃下培养10-28h得到所述的种子液。
在一个实施方案中，所述一级种子液的接种量为1.0-5.0％(v/v)。
例如，所述一级种子液的接种量可以为1.0％(v/v)、1.5％(v/v)、2.0％(v/v)、2.5％(v/v)、3.0％(v/v)、3.5％(v/v)、4.0％(v/v)、4.5％(v/v)、5.0％(v/v)等。
在一个实施方案中，所述种子培养基为改良MRS培养基，优选的，所述改良MRS培养基为含有L-半胱氨酸盐酸盐的MRS培养，例如含有L-半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基包含以下浓度的组分的MRS培养基：葡萄糖20.00g/L、胰蛋白胨10.00g/L、酵母粉5.00g/L、无水乙酸钠2.00g/L、柠檬酸氢二铵2.00g/L、七水硫酸镁0.58g/L、一水硫酸锰0.25g/L、吐温801.00ml/L、三水合磷酸氢二钾2.60g/L和L-半胱氨酸盐酸盐0.50g/L
在一个实施方案中，所述动物双歧杆菌发酵滤液包含：蛋白质、糖、氨基酸、乙酸、乳酸、维生素B6、维生素PP和叶酸。
在一个实施方案中，所述蛋白质的浓度为69.00-150.00mg/L，糖的浓度为1.40-2.50g/L，氨基酸的浓度为1.30-2.10g/L，乙酸的浓度为2.50-3.70g/L，乳酸的浓度为0.10-0.24g/L，维生素B6的浓度为0.70-1.30mg/L，维生素PP的浓度为2.80-3.85mg/L以及叶酸的浓度为19.50-36.50μg/L。
本发明所述的动物双歧杆菌发酵滤液具有显著的屏障修复功效，与未添加该产品的空白对照组相比，皮肤的角质层含水量提高9％-10％、经皮水分散失量降低5％。可应用于化妆品领域，用于皮肤屏障修复产品的研发。
本发明提供了一种制备动物双歧杆菌发酵滤液的方法，其包括下述步骤：
将动物双歧杆菌接种到种子培养基中进行培养，得到种子液；
将种子液接种到含有麦芽提取物和氯化钙的发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；
将所述发酵液进行离心、过滤处理得到动物双歧杆菌发酵滤液。
其中，在将动物双歧杆菌接种到种子培养基之前，需要对种子培养基进行灭菌，灭菌方法是本领域技术人员公知的，例如，将种子培养基的各种组分(蛋白胨、酵母粉、七水硫酸镁、一水硫酸锰、吐温80、柠檬酸氢二铵、三水磷酸氢二钾等)加入到水中溶解调pH 6.2～6.4，分装，葡萄糖按照一定浓度配制母液，单独分装，115～121℃灭菌15～25min后，冷却后将葡萄糖按照相应的比例加入培养基中。
在一个实施方案中，在将种子液接种到发酵培养基之前，需要将发酵培养基进行灭菌，灭菌方法是本领域技术人员公知的，例如，将发酵培养基的各种组分(葡萄糖单独称量，放入灭菌锅中115～121℃灭菌15～25min，接种前加入发酵罐中)加入到发酵罐中，升温至30～40℃，开启搅拌充分溶解培养基。随后通入蒸汽灭菌，培养基灭菌条件为115℃左右，灭菌20min。
在一个实施方案中，对于所得到的发酵液进行离心、过滤处理，离心和过滤处理方法对于本领域技术人员来说是已知的，其可以根据需要进行选择。
在一个实施方案中，当进行后续人体皮肤功效测试实验时，可以在所得到的动物双歧杆菌发酵滤液中加入具有防腐作用的成分进行实验。
所述具有防腐作用的成分例如可以是丁二醇、戊二醇、乙基己基甘油、苯氧乙醇、山梨酸钾、苯甲酸钠和辛甘醇中的一种或几种的组合物。
本发明通过改变发酵培养基中的成分能够使所得到的发酵滤液比较稳定，以用于化妆品领域，此外，所得到的发酵滤液对屏障损伤具有很好的修复效果。
本发明提供了动物双歧杆菌在化妆品领域中的应用，其中，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)CCFM1160，其保藏编号为GDMCC No.61500。
本发明提供了上述所述的动物双歧杆菌发酵滤液或者上述所述的方法制备得到的动物双歧杆菌发酵滤液在化妆品领域中的应用。
本发明提供了一种化妆品组合物，其包含上述所述的动物双歧杆菌发酵滤液或者上述所述的方法制备得到的动物双歧杆菌发酵滤液。
在一个实施方案中，所述组合物还包括辅料。
所述辅料是本领域技术人员公知的用于化妆品领域的辅料，例如，所述辅料可以为1，3-丁二醇、戊二醇、乙基己基甘油、苯氧乙醇、山梨酸钾、苯甲酸钠和辛甘醇等。
本发明提供了一种动物双歧杆菌发酵滤液，其包含蛋白质、糖、氨基酸、乙酸、乳酸、维生素B6、维生素PP和叶酸。
在一个实施方案中，所述蛋白质的浓度为69.00-150.00mg/L，糖的浓度为1.40-2.50g/L，氨基酸的浓度为1.30-2.10g/L，乙酸的浓度为2.50-3.70g/L，乳酸的浓度为0.10-0.24g/L，维生素B6的浓度为0.70-1.30mg/L，维生素PP的浓度为2.80-3.85mg/L以及叶酸的浓度为19.50-36.50μg/L。
在一个实施方案中，所述发酵滤液由上述所述的方法制备得到。
实施例
本发明对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1动物双歧杆菌发酵滤液的制备：
1.种子液培养：
(1)种子液培养基配方如下：葡萄糖20.00g/L、胰蛋白胨10.00g/L、酵母粉5.00g/L、无水乙酸钠2.00g/L、柠檬酸氢二铵2.00g/L、七水硫酸镁0.58g/L、一水硫酸锰0.25g/L、吐温80 1.00ml/L、三水合磷酸氢二钾2.60g/L和L-半胱氨酸盐酸盐0.50g/L。
(2)灭菌：按照种子液培养基配方将蛋白胨、酵母粉、七水硫酸镁、一水硫酸锰、吐温80、柠檬酸氢二铵、三水磷酸氢二钾等加入到纯化水中溶解调pH 6.2，分装，葡萄糖按照一定浓度配制母液，单独分装，115℃灭菌20min后，冷却后将葡萄糖按照相应的比例加入培养基中。
(3)培养：在超净台内，取一支动物双歧杆菌CCFM1160菌种，接入种子培养基中，37℃下于厌氧培养箱中静置培养28h，获得一级种子，按2.0％接种量将一级种子接种于新鲜的种子培养基中，37℃下于厌氧培养箱中静置培养28h，OD600达到3.8，获得种子液。
2.发酵培养：
(1)发酵培养基配方如下：
碳源为葡萄糖4.20g/L，
麦芽提取物0.5g/L，氯化钙0.2g/L，
氮源为胰蛋白胨和酵母粉，胰蛋白胨3.50g/L，酵母粉2.90g/L，
无机盐为无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、七水硫酸镁、一水硫酸锰和三水合磷酸氢二钾，其中，无水乙酸钠2.00g/L，柠檬酸氢二铵1.80g/L，七水硫酸镁0.55g/L，一水硫酸锰0.25g/L，三水合磷酸氢二钾2.50g/L，
表面活性剂为吐温80 0.90ml/L，
抗氧化剂为L-半胱氨酸盐酸盐0.60g/L。
(2)灭菌：按照上述配方称量培养基(葡萄糖单独称量，放入灭菌锅中118℃灭菌15min，接种前加入发酵罐中)，加入发酵罐中，用磷酸/氢氧化钠溶液调pH值为6.8，升温至30℃，开启搅拌充分溶解培养基。随后通入蒸汽灭菌，培养基灭菌条件为115℃左右，灭菌20min。
(3)接种：取培养好的动物双歧杆菌种子液(OD600为3.80)进行火焰接种，接种时，先接入灭菌好的葡萄糖溶液，再将种子液以1.5％(v/v)的接种量接入发酵罐，关闭门窗，保持空气不流动。
(4)发酵培养：接种完毕，设置培养温度36℃，发酵罐转速为60rpm左右，通入无菌氮气保持罐内压为0.03MPa左右，设置一定的通气量充分置换出罐内的空气，关闭进气、排气。培养30h，OD600达到3.68，pH降至3.86，残糖降至0.24g/L，结束发酵得到发酵液。
3.发酵液离心、过滤
(1)设备、管道准备：中转料车、离心机、中转罐1#、中转罐2#、缓冲罐等相应设备、管道等提前加碱水灭菌、清洗干净。
(2)离心：发酵结束后，打开相应阀门将发酵液打入管式离心机中进行离心，进料速度200L/h，分别收集上清液及菌体，将上清液打入中转罐1#中等待过滤，菌体灭活处理后废弃。
(3)试漏、铺板：在板框过滤机上安装好孔径为0.8μm的过滤纸板，纯化水试漏，正常维持在0.13MPa，试漏正常后，用纯水混匀珍珠岩对过滤机进行铺板。
(4)过滤：打开进气阀门，升高中转罐1#压力至0.05MPa左右，打开相应阀门，将中转罐1#中发酵液经过过滤机过滤到中转罐2#中。根据过滤速度逐步提升中转罐1#压力。过滤结束之后直接向中转罐2#中加入硅藻土，开启搅拌混匀，用纯划水将中转罐1#清洗干净。中转罐2#通入空气升压，打开相应阀门，将中转罐2#中的发酵液再次过滤到中转罐1#中。过滤结束后，将中转罐1#升压，将其中的发酵清液(此时为淡黄色透亮液体)通过过滤机过滤到缓冲罐中。
4.配料
用6M氢氧化钠溶液调节发酵滤液pH值，最终pH调至4.90左右。
5.除菌灌装
将灌装发酵滤液用白桶及桶盖清洗干净，置于消毒间臭氧灭菌。将0.22μm滤芯安装到过滤器上，与缓冲罐连接好。将缓冲罐升压至0.05MPa左右，打开灌装阀门，发酵滤液经0.22μm滤芯过滤除菌后灌装到PP塑料桶中，每桶灌装20L。灌装过程应在D级洁净区的层流罩下进行，得到动物双歧杆菌发酵滤液，其中，蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法，
糖类含量测定采用苯酚-硫酸法，
氨基酸含量测定采用日立LA8080超高速全自动氨基酸分析仪，乙酸含量的测定采用高效液相色谱仪检测(冯向东.高效液相色谱法测定白酒中乳酸和乙酸含量[J].酿酒科技,2009,2009(005):115-116.)，
乳酸含量的测定采用GB5009.157—2016中的方法，，
维生素B6含量的测定采用GB 5009.154-2016 1st Method第一法，
维生素PP含量的测定采用GB 5009.89-2016 2nd Method第二法，
叶酸含量的测定采用GB 5009.211-2014，测得蛋白质含量101.93mg/L,糖类含量1.95g/L、氨基酸含量1.97g/L、乙酸含量3.60g/L、乳酸含量0.20g/L，维生素B6含量1.21mg/L、维生素PP含量3.77mg/L以及叶酸含量35.80μg/L。
实施例2动物双歧杆菌发酵滤液的制备
1.种子液培养
种子液培养基配方、灭菌和培养与实施例1相同。
2.发酵培养：
(1)发酵培养基配方如下：碳源为葡萄糖2.00g/L，
麦芽提取物0.5g/L，氯化钙0.2g/L，
氮源为胰蛋白胨和酵母粉，胰蛋白胨2.00g/L，酵母粉1.50g/L，
无机盐为无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、七水硫酸镁、一水硫酸锰和三水合磷酸氢二钾，其中，无水乙酸钠1.00g/L，柠檬酸氢二铵1.00g/L，七水硫酸镁0.10g/L，一水硫酸锰0.10g/L，三水合磷酸氢二钾1.00g/L，
表面活性剂为吐温80 0.30ml/L，
抗氧化剂为L-半胱氨酸盐酸盐0.20g/L。
(2)灭菌：与实施例1相同。
(3)接种：取培养好的动物双歧杆菌种子液(OD600为2.5)进行火焰接种，接种时，先接入灭菌好的葡萄糖溶液，再将种子液以1％(v/v)的接种量接入发酵罐，关闭门窗，保持空气不流动。
(4)发酵培养：接种完毕，设置培养温度38℃，发酵罐转速为60rpm左右，通入无菌空气保持罐内压为0.01MPa左右，关闭进气、排气。培养20h，OD600达到2.54，pH降至4.8，残糖降至0g/L，结束发酵得到发酵液。
3.发酵液离心、过滤、配料以及除菌灌装与实施例1相同，所得到的发酵液按照实施例1的方法测定，得到蛋白质含量70.04mg/L、糖类含量1.52g/L、氨基酸含量1.41g/L、乙酸含量2.59g/L、乳酸含量0.11g/L，维生素B6含量0.74mg/L、维生素PP含量2.87mg/L以及叶酸含量20.09μg/L。
实施例3动物双歧杆菌发酵滤液的制备
1.种子液培养
种子液培养基配方、灭菌和培养与实施例1相同。
2.发酵培养：
(1)发酵培养基配方如下：碳源为葡萄糖9.00g/L，
麦芽提取物0.5g/L，氯化钙0.2g/L，
氮源为胰蛋白胨和酵母粉，胰蛋白胨7.00g/L，酵母粉5.50g/L，
无机盐为无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、七水硫酸镁、一水硫酸锰和三水合磷酸氢二钾，其中，无水乙酸钠4.00g/L，柠檬酸氢二铵4.00g/L，七水硫酸镁1.80g/L，一水硫酸锰0.75g/L，三水合磷酸氢二钾3.75g/L，
表面活性剂为吐温80 1.75ml/L，
抗氧化剂为L-半胱氨酸盐酸盐1.20g/L。
(2)灭菌：与实施例1相同。
(3)接种：取培养好的动物双歧杆菌种子液(OD600为4.5)进行火焰接种，接种时，先接入灭菌好的葡萄糖溶液，再将种子液以5.0％(v/v)的接种量接入发酵罐，关闭门窗，保持空气不流动。
(4)发酵培养：接种完毕，设置培养温度33℃，发酵罐转速为60rpm左右，通入无菌空气保持罐内压为0.05MPa左右，关闭进气、排气。培养40h，OD600达到4.02，pH降至4.42，残糖降至0.96g/L，结束发酵得到发酵液。
3.发酵液离心、过滤、配料以及除菌灌装与实施例1相同，所得到的发酵液按照实施例1的方法测定，得到蛋白质含量147.89mg/L、糖类含量2.33g/L、氨基酸含量1.84g/L、乙酸含量3.12g/L、乳酸含量0.16g/L，维生素B6含量0.98mg/L、维生素PP含量3.05mg/L以及叶酸含量21.70μg/L。
实施例4动物双歧杆菌发酵滤液的制备
实施例4和实施例1的区别在于，发酵培养基中麦芽提取物的含量不同，所述麦芽提取物为0.2g/L，所得到的发酵液按照实施例1的方法测定，得到蛋白质含量83.76mg/L、糖类含量1.87g/L、氨基酸含量1.69g/L、乙酸含量3.50g/L、乳酸含量0.14g/L，维生素B6含量1.04mg/L、维生素PP含量3.54mg/L以及叶酸含量30.96μg/L。
实施例5动物双歧杆菌发酵滤液的制备
实施例5和实施例1的区别在于，发酵培养基中麦芽提取物的含量不同，所述麦芽提取物为0.8g/L，所得到的发酵液按照实施例1的方法测定，得到蛋白质含量88.06mg/L、糖类含量1.79g/L、氨基酸含量1.83g/L、乙酸含量3.31g/L、乳酸含量0.21g/L，维生素B6含量1.17mg/L、维生素PP含量3.65mg/L以及叶酸含量32.77μg/L。
实施例6动物双歧杆菌发酵滤液的制备
实施例6和实施例1的区别在于，发酵培养基中氯化钙的含量不同，所述氯化钙为0.05g/L，所得到的发酵液按照实施例1的方法测定，得到蛋白质含量91.03mg/L、糖类含量1.94g/L、氨基酸含量1.72g/L、乙酸含量3.26g/L、乳酸含量0.19g/L，维生素B6含量1.09mg/L、维生素PP含量3.21mg/L以及叶酸含量33.16μg/L。
实施例7动物双歧杆菌发酵滤液的制备
实施例7和实施例1的区别在于，发酵培养基中氯化钙的含量不同，所述氯化钙为0.35g/L，所得到的发酵液按照实施例1的方法测定，得到蛋白质含量100.22mg/L、糖类含量1.81g/L、氨基酸含量1.98g/L、乙酸含量3.42g/L、乳酸含量0.20g/L，维生素B6含量1.12mg/L、维生素PP含量3.63mg/L以及叶酸含量34.05μg/L。
实施例8动物双歧杆菌发酵滤液的制备
实施例8和实施例1的区别在于，发酵培养基中葡萄糖的含量不同，所述葡萄糖为12.00g/L，所得到的发酵液按照实施例1的方法测定，得到蛋白质含量95.02mg/L、糖类含量2.30g/L、氨基酸含量1.78g/L、乙酸含量3.01g/L、乳酸含量0.13g/L，维生素B6含量0.75mg/L、维生素PP含量2.89mg/L以及叶酸含量20.53μg/L。
实施例9动物双歧杆菌发酵滤液的制备
实施例9和实施例1的区别在于，发酵培养基中葡萄糖含量不同，所述葡萄糖为1g/L，所得到的发酵液按照实施例1的方法测定，得到动物双歧杆菌发酵滤液，其中，蛋白质含量68.39mg/L、糖类含量0.65g/L、氨基酸含量1.16g/L、乙酸含量1.03g/L、乳酸含量0.04g/L，维生素B6含量＜0.60mg/L(最低检出限)、维生素PP含量＜2.20mg/L(最低检出限)以及叶酸含量2.10μg/L。
对比例1动物双歧杆菌发酵滤液的制备
对比例1和实施例1的区别仅在于发酵培养基的成分不同，对比例1的发酵培养基中不含有麦芽提取物和氯化钙，发酵培养至OD600达到3.68，pH降至3.86，残糖降至0.24g/L，结束发酵，发酵液离心、过滤、配料以及除菌灌装与实施例1相同，得到发酵滤液，所得到的发酵液按照实施例1的方法测定，得到蛋白质含量92.04mg/L、糖类含量1.82g/L、氨基酸含量1.59g/L、乙酸含量2.76g/L、乳酸含量0.15g/L，维生素B6含量0.85mg/L、维生素PP含量3.56mg/L以及叶酸含量26.08μg/L。
表1实施例和对比例中发酵培养基的组分的比例表
葡萄糖g/L 胰蛋白胨g/L 酵母浸粉g/L 麦芽提取物物g/L 氯化钙g/L
实施例1 4.20 3.5 2.9 0.5 0.2
实施例2 2.00 2 1.5 0.5 0.2
实施例3 9.00 7 5.5 0.5 0.2
实施例4 4.20 3.5 2.9 0.2 0.2
实施例5 4.20 3.5 2.9 0.8 0.2
实施例6 4.20 3.5 2.9 0.5 0.05
实施例7 4.20 3.5 2.9 0.5 0.35
实施例8 12 3.5 2.9 0.5 0.2
实施例9 1 3.5 2.9 0.5 0.2
对比例1 4.20 3.5 2.9 / /
实验例1 MTT法验证其屏障修复功效(采用SDS诱导损伤)：
MTT法检测细胞活率：细胞处理后，弃去培养基，添加无血清培养基配置的MTT工作液，37℃孵育2～4h，弃去MTT工作液，每孔添加150μLDMSO，震荡5min后，用酶标仪检测570nm处吸光度(OD值)，根据公式计算细胞存活率。计算公式如下：
细胞存活率＝(实验组-空白组)/(正常对照组-空白组)
SDS模型：将HaCaT细胞(中国典型培养物保藏中心)接种于96孔板培养24h后，更换含50μM SDS的完全培养基处理细胞24h，更换含实施例1所得到的动物双歧杆菌发酵滤液的完全培养基继续培养24h，MTT法检测细胞存活率，其结果如表2所示。
表2 MTT法检测的细胞存活率
Figure BDA0003322387430000181
其中，正常对照为纯培养基。
从上述可以看出，使用动物双歧杆菌发酵滤液的完全培养基继续培养细胞后，对SDS处理细胞造成的屏障损伤具有修复效果。
实验例2FLG、LOR、IVL、AQP3相关蛋白基因表达的检测
将HaCaT细胞以每孔106个细胞接种于10cm细胞培养皿中培养24h，设置正常对照组、模型组、阳性对照组和实验组，除正常对照组外其他各组更换含50μM SDS的完全培养基处理细胞24h，模型组(用50μM SDS处理的HaCaT细胞)更换完全培养基，阳性对照组更换为含终浓度0.2mg/ml神经酰胺的完全培养基，实验组更换含实施例1所得到的动物双歧杆菌发酵滤液的完全培养基，继续培养24h。细胞处理后，收集细胞，提取总RNA，测RNA浓度，反转录后于-20℃冰箱保存备用。Q-PCR法检测FLG、LOR、IVL、AQP3基因表达水平。
其中，AQP3的引物序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，
SEQ ID NO:1的核苷酸序列为：
AQP-3-F AGGTGGACCCAGAAGTGAGT
SEQ ID NO:2的核苷酸序列为：
AQP-3-R CCCCAGTCAAGGGTCATAGC
LOR的引物序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，
SEQ ID NO:3的核苷酸序列为：
LOR-F TCTCAGCAGACCAGTCAGACCTC
SEQ ID NO:4的核苷酸序列为：
LOR-R CCTCCACAGCTACCACCTCCTC
IVL的引物序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，
SEQ ID NO:5的核苷酸序列为：
IVL-F CATAAGCCAGAACTGTACCTGA
SEQ ID NO:6的核苷酸序列为：
IVL-R GATGCTGCTTCTCTTCCAATTG
FLG的引物序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，
SEQ ID NO:7的核苷酸序列为：
FLG-F ATGTCCGCTCTCCTGGAAAG
SEQ ID NO:8的核苷酸序列为：
FLG-R TGGATTCTTCAAGACTGCCTGTA
内参基因的序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，
SEQ ID NO:9的核苷酸序列为：
Actin-F GTGACGTTGACATCCGTAAAGA
SEQ ID NO:10的核苷酸序列为：
Actin-R GCCGGACTCATCGTACTCC
RNA提取步骤：
所需试剂：Trizol、氯仿(三氯甲烷)、异丙醇、70％-75％乙醇(无RNA酶水配置)、无RNA酶水(DEPC水)等。
实验操作：
1)细胞处理后，弃去培养液，PBS清洗细胞，每孔加入1mL Trizol，反复吹吸细胞使细胞脱落并裂解(或用细胞刮刀将细胞刮下)，将细胞收集于无酶EP管中，标记后置室温放置5min。
2)每管加入0.2mL氯仿，盖上盖子，剧烈摇晃15s，然后室温放置5min。
3)冷冻离心机4℃12000r离心10min，溶液将分为三层，下层为红色氯仿层，中间为白色DNA层，上层为无色水相，RNA即位于无色水相中。
4)将无色水相转移至新的离心管中，尽量吸尽但不要吸到下层液体。
5)重复2-4步骤一次。
6)向离心管中加入0.5mL异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10min。
7)冷冻离心机4℃12000r离心10min，此时，管底会出现白色的RNA沉淀。
8)移除上清，加入1mL70％乙醇轻晃，然后用冷冻离心机4℃12000r离心5min，尽量弃去上清。
9)敞开离心管盖子，将离心管倒置，打开超净台风机，晾20～30min，至RNA变成无色透明状。
10)加入20～40μL无RNA酶水，吹吸溶解。
11)Nanodrop测定RNA浓度，RNA纯品OD260/OD280的比值在1.85-1.98之间。
12)逆转录或置于-20℃短期保存，置-80℃长期保存。
RNA逆转录：详细步骤参照诺唯赞反转录试剂盒(型号R323-01)说明书。
Q-PCR：详细步骤参照诺唯赞荧光定量PCR试剂盒(型号q711-02)说明书，其结果如表3所示。
表3实施例1所述的发酵滤液对HaCaT细胞中FLG、LOR、IVL、AQP3mRNA表达影响(±s，n＝3)
组别 FLG LOR IVL AQP3
模型组 1.01±0.01 1.03±0.02 1.005±0.02 1.004±0.01
正常对照组 1.25±0.02 1.19±0.01 1.25±0.01 1.46±0.01
阳性对照组 1.78±0.05<sup>▲▲</sup> 2.07±0.06<sup>▲▲</sup> 1.944±0.04<sup>▲▲</sup> 1.84±0.01<sup>▲▲</sup>
5％的实施例1 1.64±0.05<sup>▲▲</sup> 1.8±1.83<sup>▲▲</sup> 1.64±0.03<sup>▲▲</sup> 2.26±0.05<sup>▲▲</sup>
2.5％的实施例1 1.72±0.04<sup>▲▲</sup> 1.75±0.04<sup>▲▲</sup> 1.71±0.02<sup>▲▲</sup> 2.42±0.02<sup>▲▲</sup>
0.5％的实施例1 1.41±0.06<sup>▲▲</sup> 1.41±0.01<sup>▲▲</sup> 1.26±0.02<sup>▲▲</sup> 1.865±0.03<sup>▲▲</sup>
其中，与模型组相比，▲：P<0.05，▲▲：P<0.01
从上表中可以看出，与模型组比较，在相同培养时间下，添加实施例1中的动物双歧杆菌发酵液的培养基培养的HaCaT细胞FLG、LOR、IVL、AQP3 mRNA相对表达量明显增加，皮损组织中AQP3、LOR、IVL、FLG四种相关保湿因子的表达是改善皮肤损伤的可能机制之一，说明实施例1所述的发酵滤液能促进皮肤HaCaT细胞保湿相关基因AQP3、LOR、IVL和FLG的表达，增强皮肤保湿能力和屏障功能。
实验例3人体斑贴实验
斑贴测试志愿者：人数54人、年龄20～41岁、4名男性50名女性；
受试物：将实施例1所得到的发酵滤液使用去离子水稀释至10％
阴性对照：去离子水
斑贴试验流程：
(1)试验部位:前臂屈侧的正常皮肤。
(2)去除斑试器(8mm Finn Chamber)的保护纸、将准备好的动物双歧杆菌发酵上清置于铝制斑试器内。斑试物添加量为0.02ml。
(3)将加有斑试物的斑试器贴敷于受试者前臂，用手掌轻压以使之均匀地贴敷于皮肤上，并用标记笔标记斑贴部位。
(4)斑贴试验时间：48小时。
(5)观察结果时间：贴敷后48小时，首先去除斑试器，为避免斑试器压迫皮肤所可能造成的反应，应在去除斑试器至少30分钟后观察结果，其结果如图1所示。
从图1可以看出，皮肤无任何不良反应，说明10％的实施例1所述的动物双歧杆菌发酵滤液外用对人体皮肤无伤害。
实验例4人体皮肤功效测试
采用半脸对照的方法，左右半脸分别使用添加实施例1所述发酵滤液的精华(实验组，添加量为2.5％)和空白精华(对照组，添加相同含量蒸馏水)，其中，空白精华包含丁二醇、戊二醇、乙基己基甘油、甘油、甜菜碱、卡波U21、黄原胶、水。于使用前后检测受试者面部苹果肌区域的角质层含水量、经皮水分散失量及皮肤a值的变化。
招募健康受试者15名，30-55岁，敏感性皮肤。受试者洁面后15分钟，分别采用皮肤水分测试仪Corneometer CM 825(Courage+Khazaka，德国)、多探头皮肤测试系统MPA580(Courage+Khazaka，德国)、VISIA CR面部图像分析系统(Canfield，美国)检测左、右半脸苹果肌区域的角质层含水量、经皮水分散失量、皮肤a值的初始值，然后分别使用等量添加屏障修复产品的精华和空白精华，以后早晚各一次，并于初次使用后1周、2周、3周再次检测所有指标，其结果如图2-1至图2-3所示。
从图2-1可以看出，使用前角质层含水量初始值设为100％。与对照组相比，使用含实施例1所述的发酵滤液的精华2周以后，皮肤角质层含水量显著提高(比对照组提高9％-10％)。
从图2-2可以看出，使用前经皮水分散失量初始值设为100％。与空白精华组相比，使用含实施例1所述的发酵滤液的精华3周时间内，经皮水分散失量降低5％左右，说明本发明所述的发酵滤液能够改善皮肤屏障功能。
用Lab值中的a值分析面部照片红斑图层的皮肤泛红情况，a值越高表示皮肤越红，从图2-3可以看出，使用前a值初始值设为100％，结果表明长期使用含实施例1所述的发酵滤液的精华，对a值无显著影响。
实验例5稳定性的研究
将实施例1-9所得到的发酵滤液和对比例1所得到的发酵滤液进行稳定性研究，稳定性数据如表4所示，其中实施例1和对比例1的稳定性结果如图3所示，其中，a为对比例1所得到的发酵滤液示意图，b为对比例1所得到的发酵滤液在40℃下放置4个月的示意图，c为实施例1所得到的发酵滤液的示意图，d为实施例1所得到的发酵滤液在40℃下放置4个月的示意图。
表4各培养条件下样品在40℃下的稳定性(470nm下吸光度)对比
Figure BDA0003322387430000221
从上表可知，对比例1的发酵滤液在470nm下吸光度较高，且40℃放置4个月后，吸光度升高较为显著(OD470增加了0.472)；而实施例1至实施例9的发酵滤液在470nm下吸光度处于较低水平，且40℃放置4个月后，吸光度仅有较轻微的变化(OD470最高增加了0.049)，仍然处于较低水平。从图中亦可明显看出优化前后的颜色差异。因此实施例1的发酵滤液比对比例1所得到的发酵滤液的稳定性较好，从而说明了本发明所述的发酵滤液可以用于化妆品领域。
综上所述，本发明所述的发酵滤液稳定性较好，可以用于化妆品领域，并且所述的发酵滤液具有显著的屏障修复功效，与未添加该产品的空白对照组相比，皮肤的角质层含水量提高9％-10％、经皮水分散失量降低5％。可应用于化妆品领域，用于皮肤屏障修复产品的研发。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 华熙生物科技股份有限公司
山东华熙海御生物医药有限公司
华熙生物科技（天津）有限公司
<120> 动物双歧杆菌发酵滤液、制备方法及其应用
<130> TPE01565-2
<150> CN2021108723244
<151> 2021-07-30
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 1
aggtggaccc agaagtgagt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<400> 3
tctcagcaga ccagtcagac ctc 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
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<220>
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<400> 4
cctccacagc taccacctcc tc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 5
cataagccag aactgtacct ga 22
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<211> 22
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<220>
<223> 人工合成的
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 7
atgtccgctc tcctggaaag 20
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 8
tggattcttc aagactgcct gta 23
<210> 9
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<220>
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<400> 9
gtgacgttga catccgtaaa ga 22
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<211> 19
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 10
gccggactca tcgtactcc 19

Claims (10)

1.一种动物双歧杆菌发酵滤液，其由包含下述步骤的方法制备得到：
将动物双歧杆菌接种到种子培养基中进行培养，得到种子液；
将种子液接种到含有麦芽提取物、氯化钙和葡萄糖的发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；
将所述发酵液进行离心、过滤处理得到动物双歧杆菌发酵滤液。
2.根据权利要求1所述的动物双歧杆菌发酵滤液，其中，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)CCFM1160，其保藏编号为GDMCC No.61500；
优选的，所述麦芽提取物的浓度为0.1-0.9g/L，优选为0.2-0.8g/L，进一步优选为0.5g/L；所述氯化钙的浓度为0.02-0.50g/L，优选为0.05-0.35g/L，进一步优选为0.2g/L；
优选的，所述发酵培养基还包括如下浓度的各组分：碳源1.00-11.00g/L，优选为2.00-9.00g/L，氮源2.5-14.5g/L，优选为3.5-12.5g/L，无机盐2.0-16.3g/L，优选为3.2-14.3g/L，表面活性剂0.20-2.10ml/L，优选为0.30-1.75ml/L以及抗氧化剂0.10-1.50g/L，优选为0.20-1.20g/L；
优选的，碳源为葡萄糖，
氮源为1.50-8.00g/L的胰蛋白胨和1.00-6.50g/L的酵母粉，优选为2.00-7.00g/L的胰蛋白胨和1.50-5.50g/L的酵母粉，
无机盐为0.60-4.50g/L的无水乙酸钠、0.60-4.50g/L的柠檬酸氢二铵、0.05-2.15g/L的七水硫酸镁、0.05-1.15g/L的一水硫酸锰和0.70-4.00g/L的三水合磷酸氢二钾，优选为1.00-4.00g/L的无水乙酸钠、1.00-4.00g/L的柠檬酸氢二铵、0.10-1.80g/L的七水硫酸镁、0.10-0.75g/L的一水硫酸锰和1.00-3.75g/L的三水合磷酸氢二钾，
表面活性剂为吐温80，以及
抗氧化剂为L-半胱氨酸盐酸盐。
3.根据权利要求1或2所述的动物双歧杆菌发酵滤液，其中，种子液的接种量为1.0-5.0％(v/v)；
优选的，发酵温度为30-40℃，优选为33-38℃；
优选的，发酵时间为15-45h，优选为22-40h；
优选的，发酵压力为0.01-0.05MPa；
优选的，发酵液中的OD600为2.0-5.0，优选2.5-4.5；
优选的，发酵液的pH为4.0-6.0，优选为4.3-4.9；
优选的，发酵液的残糖浓度为0-1.0g/L；
优选的，所述种子液的OD600在2.5以上，优选为2.5-4.5；
优选的，在得到种子液的步骤中，其包括将动物双歧杆菌接种到种子培养基中培养10-28h得到一级种子液，然后将所述一级种子液接种到种子培养基中进行培养得到所述种子液；
优选的，所述一级种子液的接种量为1.0-5.0％(v/v)；
优选的，所述种子培养基为改良MRS培养基；
优选的，所述动物双歧杆菌发酵滤液包含：蛋白质、糖、氨基酸、乙酸、乳酸、维生素B6、维生素PP和叶酸。
4.一种制备动物双歧杆菌发酵滤液的方法，其包括下述步骤：
将动物双歧杆菌接种到种子培养基中进行培养，得到种子液；
将种子液接种到含有麦芽提取物和氯化钙的发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；
将所述发酵液进行离心、过滤处理得到动物双歧杆菌发酵滤液。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)CCFM1160，其保藏编号为GDMCC No.61500；
优选的，所述麦芽提取物的浓度为0.1-0.9g/L，优选为0.2-0.8g/L，进一步优选为0.5g/L；所述氯化钙的浓度为0.02-0.50g/L，优选为0.05-0.35g/L，进一步优选为0.2g/L；
优选的，所述发酵培养基还包括如下浓度的各组分：碳源1.00-11.00g/L，优选为2.00-9.00g/L，氮源2.5-14.5g/L，优选为3.5-12.5g/L，无机盐2.0-16.3g/L，优选为3.2-14.3g/L，表面活性剂0.20-2.10ml/L，优选为0.30-1.75ml/L以及抗氧化剂0.10-1.50g/L，优选为0.20-1.20g/L；
优选的，碳源为葡萄糖，
氮源为1.50-8.00g/L的胰蛋白胨和1.00-6.50g/L的酵母粉，优选为2.00-7.00g/L的胰蛋白胨和1.50-5.50g/L的酵母粉，
无机盐为0.60-4.50g/L的无水乙酸钠、0.60-4.50g/L的柠檬酸氢二铵、0.05-2.15g/L的七水硫酸镁、0.05-1.15g/L的一水硫酸锰和0.70-4.00g/L的三水合磷酸氢二钾，优选为1.00-4.00g/L的无水乙酸钠、1.00-4.00g/L的柠檬酸氢二铵、0.10-1.80g/L的七水硫酸镁、0.10-0.75g/L的一水硫酸锰和1.00-3.75g/L的三水合磷酸氢二钾，
表面活性剂为吐温80，以及
抗氧化剂为L-半胱氨酸盐酸盐。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，种子液的接种量为1.0-5.0％(v/v)；
优选的，发酵温度为30-40℃，优选为33-38℃；
优选的，发酵时间为15-45h，优选为22-40h；
优选的，发酵压力为0.01-0.05MPa；
优选的，发酵液中的OD600为2.0-5.0，优选为2.5-4.5；
优选的，发酵液的pH为4.0-6.0，优选为4.3-4.9；
优选的，发酵液的残糖浓度为0-1.0g/L；
优选的，所述种子液的OD600在2.5以上，优选为2.5-4.5；
优选的，在得到种子液的步骤中，其包括将动物双歧杆菌接种到种子培养基中培养10-28h得到一级种子液，然后将所述一级种子液接种到种子培养基中进行培养得到所述种子液；
优选的，所述一级种子液的接种量为1.0-5.0％(v/v)；
优选的，所述种子培养基为改良MRS培养基。
7.动物双歧杆菌在化妆品领域中的应用，其中，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)CCFM1160，其保藏编号为GDMCC No.61500。
8.权利要求1-3中任一项所述的动物双歧杆菌发酵滤液或者权利要求4-6中任一项所述的方法制备得到的动物双歧杆菌发酵滤液在化妆品领域中的应用。
9.一种化妆品组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的动物双歧杆菌发酵滤液或者权利要求4-6中任一项所述的方法制备得到的动物双歧杆菌发酵滤液；
优选的，所述组合物还包括辅料。
10.一种动物双歧杆菌发酵滤液，其包含蛋白质、糖、氨基酸、乙酸、乳酸、维生素B6、维生素PP和叶酸；
优选的，所述动物双歧杆菌发酵滤液是由权利要求4-6中任一项所述的方法制备得到。
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