KR101280482B1 - 야국화 발효 추출물에 포함된 인중합체를 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 기능성 화장품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 야국화 발효 추출물에 포함된 인중합체를 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 기능성 화장품에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 야국화를 즉시 동결건조한 뒤, 야국화를 90 내지 110℃에서 1시간 내지 3시간 동안 열수 추출하여 여과한 다음 감압농축하고 정제하는 단계를 거친 야국화 추출물을 락토바실러스 애시도필러스를 이용하여 배양한 야국화 발효 추출물를 통해 자외선에 대하여 콜라겐을 보호하는 효과가 뛰어난 화장품을 제조할 수 있는 야국화 발효 추출물에 포함된 인중합체를 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 기능성 화장품에 관한 것이다.
본 발명인 야국화 발효 추출물에 포함된 인중합체를 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 기능성 화장품은,
야국화의 꽃과 잎을 동결건조시키는 단계와;
상기 동결건조시킨 야국화를 90 내지 110℃에서 1시간 내지 3시간 동안 열수 추출하여 여과한 다음 감압농축하고 정제하는 단계와;
락토바실러스 애시도필러스를 이용하여 상기 정제된 야국화 추출물을 배양하여 야국화 발효액을 제조하는 단계;로 제조된다.
본 발명을 통해 자외선으로부터 콜라겐을 보호하는 효과가 우수하므로 피부 주름개선에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

야국화 발효 추출물에 포함된 인중합체를 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 기능성 화장품{Cosmetic for Improving Skin Wrinkle Comprising polyphosphate of fermented Chrysanthemum indicum .}

본 발명은 야국화 발효 추출물에 포함된 인중합체를 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 기능성 화장품에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 야국화를 즉시 동결건조한 뒤, 야국화를 90 내지 110℃에서 1시간 내지 3시간 동안 열수 추출하여 여과한 다음 감압농축하고 정제하는 단계를 거친 야국화 추출물을 락토바실러스 애시도필러스를 이용하여 배양한 야국화 발효 추출물를 통해 자외선에 대하여 콜라겐을 보호하는 효과가 뛰어난 화장품을 제조할 수 있는 야국화 발효 추출물에 포함된 인중합체를 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 기능성 화장품에 관한 것이다.

피부탄력은 진피층에 존재하는 엘라스틴(elastin)으로 구성된 탄력섬유에 의해 나타나는데, 이러한 탄력섬유는 고무와 같이 매우 낮은 탄성계수를 가지고 있어서, 작은 힘에 의해서도 쉽게 변형되고, 또 그 힘이 제거되었을 때는 쉽게 원형으로 되돌아온다.

또한, 탄력섬유는 엘라스틴이라는 무정형의 기질에 미원섬유(microfibrils)들이 박혀 있는 형태를 띠고 있는데 엘라스틴은 라이신에서 유래한 데스모신(desmosine)과 아이소데스모신(isodesmosine)이라는 탄력섬유에서만 발견되는 아주 톡특한 아미노산으로 구성된 단백질이다.

이러한 데스모신과 아이소데스모신 등은 긴 펩타이드 사슬안에서 가교(cross-link)를 형성하고 있는데, 이러한 구조가 엘라스틴으로 하여금 고무와 같은 성질을 갖게 한다. 또한, 엘라스틴으로 구성된 탄력섬유는 콜라겐(collagen)이라고 하는 교원섬유와 함께 존재하는데, 엘라스틴과 콜라겐이 충분히 존재하는 상태에서 피부 탄력유지가 가능하다.

피부 탄력저하는 노화와 자외선 등에 의한 피부세포(섬유아세포)의 약화로 엘라스틴의 생성저하 및 파괴에 의해 유발되는데, 자외선 등에 의해 피부내에 엘라스틴 분해효소가 발현되며 이 효소는 피부내의 정상적인 엘라스틴을 분해하여 피부 탄력 저하를 가져온다.

또한, 피부 탄력저하는 피부 진피의 70% 이상을 구성하는 콜라겐이라는 단백질의 손상 및 생성저하에 의해서도 발생된다.

콜라겐 역시 자외선 등에 의해 유발되는 콜라게나제(collagenase)라는 분해효소에 의해 분해된다.

한편, 레구미노사 종자(Leguminosae seed)에서 얻어진 단백질 분획은 탄력증대효과를 나타내며(미국특허 제5,322,839호), 맥아 추출물(malt extract) 등을 포함하는 조성물은 콜라게나제(collagenase)의 활성을 억제하는데 응용되고 있다.

콜라게나제 또는 엘라스티나제의 억제제로는 카르바민산 펩티드(peptidyl carbamates), 티오카르바민산 펩티드(peptidyl thiocarbamates), 하이드록사메이트(hydroxamates), 세팔로스포린(cephalosporins), 설포산염(sulphonate salts) 등을 함유하는 화장료 조성물(미국특허 제5,614,489호) 등이 보고되어 있다.

그러나, 이러한 종래의 보고에서는 피부탄력증대 효과를 나타내기 위해 단순히 콜라게나제의 활성을 억제시키거나 또는 엘라스티나제의 활성을 억제한 것으로, 그 효과가 진피층에 한정되어 있다는 한계가 있다.

본 발명에서 설명하고 있는 야국화는 가을에 꽃이 활짝 필 때 채집하여 햇볕에 말리거나 불에 쪼여 말리는 것으로 acacetin-7-rhamnoglucoside, chrysanthemin, 비타민 A, 비타민 B가 들어 있다.

약리 작용으로는 혈압을 낮추고 항바이러스 및 항균 작용을 갖고 있으며 in vitro에서 황색 포도상구균, 디프테리아 및 적리균에 대하여 억제 작용을 나타내고 있다.

열을 내리고 소종 해독하는 효능이 있어 폐렴, 디프테리아, 위장염, 고혈압, 단독, 습진 등을 다스리는 역할을 수행하고 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 감안하여 제안된 것으로서, 본 발명의 목적은 본 발명의 목적은 자외선으로부터 콜라겐을 보호하는 효과가 뛰어난 야국화 발효 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 야국화 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 기능성화장품을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제를 달성하기 위하여,

본 발명의 일실시예에 따른 야국화 발효 추출물에 포함된 인중합체를 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 기능성 화장품은,

야국화의 꽃과 잎을 동결건조시키는 단계와;

상기 동결건조시킨 야국화를 90 내지 110℃에서 1시간 내지 3시간 동안 열수 추출하여 여과한 다음 감압농축하고 정제하는 단계와;

락토바실러스 애시도필러스를 이용하여 상기 정제된 야국화 추출물을 배양하여 야국화 발효액을 제조하는 단계;를 포함하여 구성된다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 야국화 발효 추출물은 자외선으로부터 콜라겐을 보호하는 효과가 우수하므로 피부 주름개선에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 UV를 30분 처리한 시료의 세포생존율을 나타낸 도면이다.
도 2는 UV를 1시간 처리한 시료의 세포생존율을 나타낸 도면이다.
도 3은 야국화의 인 함량을 나타낸 도면이다.
도 4는 sepadex G-25의 크로마토그래피를 나타낸 도면이다.
도 5는 야국화에서 추출한 인중합체의 sepadex G-25 column의 결과를 나타낸 도면이다.

상기 과제를 달성하기 위한 본 발명인 야국화 발효 추출물에 포함된 인중합체를 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 기능성 화장품은,

야국화의 꽃과 잎을 동결건조시키는 단계와;

상기 동결건조시킨 야국화를 90 내지 110℃에서 1시간 내지 3시간 동안 열수 추출하여 여과한 다음 감압농축하고 정제하는 단계와;

락토바실러스 애시도필러스를 이용하여 상기 정제된 야국화 추출물을 배양하여 야국화 발효액을 제조하는 단계;로 제조된다.

이때, 상기 제조된 야국화 발효 추출물의 함량은,

화장품 총 중량을 기준으로 0.001 내지 20중량부인 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 야국화 발효 추출물에 포함된 인중합체를 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 기능성 화장품은,

유화 제형의 영양화장수, 크림, 에센스 및 가용화 제형의 유연화장수로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 야국화 발효 추출물에 포함된 인중합체를 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 기능성 화장품은,

인간의 피부에 도포하여 자외선에 대하여 콜라겐을 보호하는 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 열수 추출은,

동결 건조시킨 야국화를 90℃에서 5시간 내지 7시간 동안 열수 추출하는 것을 특징으로 한다.

이때, 야국화 발효 추출물에 포함된 인중합체를 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 기능성 화장품은,

화장품 총 중량을 기준으로 인중합체가 0.0001 내지 10 중량부인 것을 특징으로 한다.

기능성 화장품의 주름개선 효력이 있는 원료로 이용할 수 있음을 의미한다.

특히, 화장품 산업분야에서 주목해야할 부분은 주름개선, 미백, 자외선 차단 분야이다.

<실시예 1> 야국화 발효 추출물의 물리 화학적인 성질

야국화 발효 추출물을 제조하여 비중, 굴절률, 건조잔분, pH, 중금속(납), 비소함량을 측정하였다.

이는 야국화 발효 추출물을 이용하여 화장품 원료로 판매할 경우에 갖추어야 하는 항목이며 이들 중 중금속 및 비소함량이 가장 중요한 항목이다.

비중(DFT)이라 함은 검체와 물과의 각각 t' ℃ 및 t ℃에 있어서 같은 체적의 중량비를 말한다.

비중부액계에 의한 측정법을 이용하여 비중부액계가 정지하였을 때 메니스커스의 상연에서 비중의 눈금을 측정하였으며 비중계는 대한계량기 제작소사의 비중계를 이용하여 측정하였다.

물질의 굴절률은 진공 중의 광의 속도와 물질 중의 광의 속도와의 비율이며 물질에 대한 광의 입사각의 정현과 굴절각의 정현과의 비는 같다.

보통 굴절률은 광의 파장 및 온도에 따라 변화한다.

굴절률 n tD라 함은 광선으로 나트륨의 스펙트라 중 D선을 써서 온도 t ℃에서 측정하였을 때의 공기에 대한 굴절률을 말한다.

본 실험에서는 NAR-1T(ATAGO CO.)를 이용하여 20 ℃에서 측정하였다.

강열잔분시험법은 보통 유기물 중에 불순물로서 들어있는 무기물의 함량을 알기 위하여 적용되나 때에 따라서는 유기물중의 구성 성분으로서 들어있는 무기물 또는 휘발성무기물 중에 들어있는 불순물의 양을 측정하는데 적용된다.

그러나, 본 실험에서는 가혹조건은 500 ℃ 이상에서 수행하지 않고 일반적으로 적용되는 105 ℃에서 2시간 동안 가열하여 남은 잔분을 측정하였다.(Mettler LP16, TOLEDO Co.)

pH 측정은 유리전극을 단 pH메터를 이용하여 표준완충용액을 쓰며 그 값을 ±0.02 이내로 정확도를 갖도록 하였다.(1% Soln., Model 420, ThermoOrion Co.)

비소시험법은 원료 중에 불순물로서 들어있는 비소의 한도시험을 의미한다.

그 한도는 삼산화비소(As203)의 양으로 나타내며, 보통 중량백만분률(ppm)로 나타낸다.

중금속 시험법은 원료 중에 불순물로서 들어있는 중금속의 한도시험이다.

중금속이란 산성에서 황화나트륨시액으로 정색하는 금속성 혼재물을 말하며 그 한도는 납(Pb)으로서 중량백만분률(ppm)로 나타낸다.

물리적인 성질

실험항목	야국화
비중	1.005
굴절률	1.351
강열잔분(%)	1.5
pH(1%)	5.57
비소(ppm)	LOQ
납(ppm)	LOQ

상기 LOQ(Limit of Quantification), 즉 용액으로 하여 측정할 경우에 pb에 대하여 <7.0 ppb , As에 대하여 <11.0 ppb을 보이고 있다.

즉, 상기 실험항목 중 가장 중요한 중금속이나 비소의 함량은 극히 낮은 량으로 검출되었다.

<실시예 2> 야국화 발효 추출물의 일차 피부 자극 시험

피부 일차 자극은 피부에 자극을 주는 물질의 1회 접촉에 의해 나타나는 급성 염증 또는 피부 괴사를 나타내며 1차 자극에서는 염증을 유발하지 않지만 반복 접촉에 의해 나타나는 경우는 누적 자극이라 한다.

1차 자극을 일으킬 수 있는 물질은 아주 많으며 강한 자극성을 나타내는 물질을 피부에 1회 적용함으로써 나타나며 인체 시험에서의 자극 또는 누적 자극을 예측하기 위한 수단으로 많이 쓰인다.

일반적으로 일차 자극 방법은 Draize 방법의 변형이 많이 쓰인다.

야국화 추출물의 pH 2 이하 또는 pH 11.5 이상의 경우에는 실험을 하지 않으며 피부 LD50이 200mg/kg 이상의 경우는 하지 않는다.

시험동물로 토끼를 선택하였으며 토끼는 의약품 및 화장품 신원료 개발에 널이 이용되고 있으며 생리, 해부 독성학적 기초 자료가 풍부하다.

주령은 6주령이며, 12마리를 실험하였다.

약 7일간 검역 및 적응기간을 갖고 이 기간동안 체중 증가 및 일반 증상 등에 대하여 검사를 실시한다.

시험 물질 적용 약 24시간 전에 토끼 등부위의 털을 가로, 세로 약 10cm 이상이 되도록 상처가 나지 않도록 제모기를 이용하여 제모하며 시험 동물은 등 부위에 찰과용 테이프를 이용하여 등 오른쪽 부위에 약 20mm x 20mm 크기의 찰과 부위를 만들며 찰과 부위에 대칭이 되도록 비찰과 부위를 두어 시험한다.

패취 시험용 테이프에 시험물질 0.1ml를 도포한 후 각각 찰과, 비찰과 부위에 테이프를 부착한다.

테이프 부착 부위는 탈락되지 않도록 종이 테이프를 이용하여 고정한 후 탄력성이 있는 밴드를 이용하여 시험 부위 전체를 고정한 후 보정틀에서 24시간 동안 유지하여 준다.

24시간이 경과한 후 패취를 제거하여 주며 시험물질이 잔류하지 않도록 생리식염수로 세정하여 준다.

단일 농도 투여시에는 0.5ml 또는 0.5g을 투여량으로 한다.

도포 후 24시간 및 72시간 후에 홍반 및 가피 형성 유무와 부종 형성 유무 등의 자극 유무를 평가하게 된다.

각 동물의 피부 반응의 결과는 의약품등의독성시험기준의 피부반응의 평가기준에 따라 평점으로 평가한다.

피부 일차 자극 지수(P.I.I)는 시험 물질 적용 후 24시간과 72시간 째의 홍반과 부종 평점에 의하여 산출한다.

찰과 부위와 비찰과 부위 각각에 홍반 평점의 평균과 부종 평점의 평균을 구하여 24시간 째의 결과와 72시간 째의 결과의 평균값을 피부 일차 자극 지수로 한다.

피부 반응의 평가(홍반과 가피형성 평점과 부종 형성 평점의 합)

홍반과 가피형성	점수
홍반이 전혀 없음	0
아주 가벼운 홍반	1
뚜렷한 홍반	2
약감 심한 홍반	3
심한 홍반과 가피형성	4
부종 형성	점수
부종이 전혀 없음	0
아주 가벼운 부종	1
경증의 부종(뚜렷하게 부어올라서 변연부가 구별될 경우)	2
중증의 부종(약 1mm 정도 부어올랐을 경우)	3
심한 부종(1mm 이상 부어오르고 노출부위 밖에까지 확장된 경우)	4

피부 일치 자극 지수에 의한 결과 판정표

안정성 구분	피부일차자극지수(P.I.I)	판정
0.0~0.5	무자극	사용가능
0.6~2.0	경자극	사용농도조정
2.1~5.0	중자극	사용불가
5.1 이상	강자극	사용불가

야국화 발효 추출물의 피부일차자극 지수 결과

시험 사이트수	시험농도(%)	Vehicle	P.I.I	판정	비고
12	10	water	0.188	무자극	사용가능

상기 표 4에 도시한 바와 같이 실험 기간 중 특이한 임상 증상을 보이거나 사망한 토끼는 없었으며, 야국화 발효 추출물의 P.I.I는 0.188로 무자극 범위에 해당하였다.

또한, 10% 농도에서 물질 자체에 의한 착색이 있었으나 자극 평가에 영향을 줄 정도는 아니었다.

<실시예 3> 야국화 발효 추출물의 안점막 자극 시험

눈에 접촉할 가능성이 있으므로 안점막 자극 시험을 실시하는 것이다.

각 동물의 안점막 반응의 자극 평가는 의약품등의독성시험기준의 안구병변의 등급을 이용하여 평가한다.

주령은 6주령이며, 18마리를 실험하였다.

야국화 발효 추출물의 안점막자극 시험

시험사이트수 NWA )/WB )	시험농도(%)	Vehicle
4/2	10	Water

NW^{A )}는 non-washing이며, W^{B )}는 washing을 의미한다.

추출물을 투여한 후 1, 24, 48, 72시간째에 시험물질 적용부위를 관찰하여 각막의 혼탁 및 혼탁된 각막의 범위, 홍채의 반응, 결막의 발적, 부종 및 배설물 유무 등의 변화를 육안으로 관찰하였다.

야국화 발효 추출물의 안점막자극 시험 결과

자극결과 : M.O.Ia ) (NW/W)				A.O.Ib )
1시간	24시간	48시간	72시간
1/0.5	0/0	0.75/0	0/0	1

M.O.I^{a )} (Mean ocular irritation index) : Total score/tested animal NO. In each observation time

A.O.I^{b )} (Acute ocular irritation index) : Max. Among M.O.I

상기 자극 결과(A.O.I^{b )})는 1로 practically non irritant를 나타내었다.

<실시예 4> 야국화 발효 추출물의 단회투여경구시험

종 및 계통은 ICR 마우스이며, 주령은 4~5주령이고 사용 수는 암컷 5마리, 수컷 5마리이다.

야국화 발효 추출물의 단회투여경구시험 시험군

투여량	성별	시험동물수	투여경로	Vehicle
2 g/kg	암컷	5	경구	Water
	수컷	5	경구

야국화 발효 추출물의 단회투여경구시험 결과

Vehicle	도스	성별	Mortality	LD50
Water	2 g/kg	암컷	0/5	2 g/kg 이상
		수컷	0/5	2 g/kg 이상

상기한 바와 같이 단회투여경구독성으로 인한 어떠한 이상 증상도 나타나지 않았으며, LD50이 2 g/kg 이상으로 단회투여경구독성 측면에서 안전한 추출물임을 알 수 있었다.

<실시예 5> 야국화 발효 추출물의 UV 조사에 따른 세포보호효과 분석

피부 노화의 원인 중 가장 대표적인 원인은 자외선이다. 이 자외선은 피부색을 결정하는 멜라딘 색소를 분비케 하는 원인일 뿐만 아니라, 활성산소를 발생시키는 주범으로서 DNA를 파괴하거나 피부 노화를 급속히 앞당기게 된다.

자외선은 파장의 크기에 따라 A B C 등 세 종류로 나뉘어지는데 제일 큰 파장부터 UVA(320~400nm), UVB(290~320nm), UVC(290nm이하) 등으로 분류하며 일반적으로 파장이 작을수록 피부 훼손도가 훨씬 크다고 볼 수 있다.

실험실에서 미생물의 DNA를 변이시켜 변동 미생물을 만들어내는 변이균주실험에 이용하는 자외선은 260nm의 파장(UVC)을 활용한다.

본 발명에서는 이러한 경향에 맞추어 UVC를 이용하여 UV 보호 효과를 분석하였다.

Keratinocyte cell을 이용하여 UV 처치 후 셀 proliferation을 MTS로 확인하고, 셀에서 RNA를 분리하여 RT-PCR 후 전기영동법으로 처치전과 비교하였다.

Keratinocyte cell을 T-75 플래스크에 KGM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시키고 이틀에 한번씩 HEPES-BSS를 이용하여 세척한 후에 다시 배지를 갈아준다.

T-75 플래스크에 80% 정도 키운 후 Reagent pack을 사용하여 2~3회 subculture하여 샘플의 양을 늘려서 실험에 사용하였다.

96 웰 플레이트에 Keratinocyte cell을 5 x 10³ 셀로 시딩한 후 4일 동안 배양한 후 시간대 별로 UV처리 후 MTS(celltiter96)를 집어넣어서 셀 proliferation을 ELISA(precision microplate reader, molecular devices)로 측정하였다.

배양한 Keratinocyte cell을 Trizol 솔루션(Gibco BRL)을 사용하여 토탈 RNA를 분리하였다.

1㎖의 Trizol 솔루션(Gibco BRL)을 처리하여 셀을 lysis 시킨 후 셀 스크래퍼로 세포를 긁어내어 세포를 수획하였다.

셀 extract를 1.5㎖ 마이크로튜브에 모은 후 18~21G syringe homogenize한다.

세포 추출물은 4℃에서 12000rpm으로 10분간 원심분리를 통하여 상층액을 수거한 후 이 상층액과 phenol : chloroform : isoamylalchol이 25:24:1로 섞여 있는 용액 200㎕를 혼합한 다음 5~15분 정도 상온에 두었다가 맑은 상층액만을 수거하여 4℃에서 12000rpm으로 15분간 원심분리한다.

RNA 층만 떠서 새로운 마이크로 튜브에 옮긴다.

동량의 100% isorophanol alchol을 혼합한 뒤 5~15분 정도 상온에 두었다가 4℃에서 12000rpm으로 15분간 원심분리한다.

상층 액을 제거하고 RNA 펠렛에 1.5㎖ 75% ET-OH로 세척하고 4℃에서 12000rpm으로 5분간 원심분리한다.

5~10분간 상온에서 완전히 건조시킨 후 100㎕의 DEPC 워터에 RNA을 녹인 다음 분광광도계(UV spectrophotometer, HEWLETT Packard, USA)를 사용하여 정량하였다.

2μg의 총 RNA를 70℃에서 15분 동안 denaturation시킨 후 200 U moloney murine leukemia virus reverse transcriptase(GIBCO BRL, MD, USA)를 이용하여 최종 부피가 30μg인 반응 혼합액에서 역전사 반응을 수행하여 cDNA mixture를 얻었다.

cDNA를 합성(RT 반응)을 위하여 42℃에서 50min, 75℃에서 15min 동안 반응하였고, PCR을 위한 포지티브 컨트롤로서 house keeping gene인 human glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)를 사용하였다.

GAPDH는 94℃에서 5분 1사이클, 94℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72℃에서 90초 30 사이클, 72℃에서 5분 1사이클 동안 반응을 수행하였다.

cDNA는 10mM Tris-HCl(pH8.3), 50 mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 0.2mM dNTP, 0.4mM의 각 primer와 0.5 U Taq polymerase(TaKaRa, Shiga, Japan)을 포함한 20 μ의 반응 혼합액에서 GeneAmp PCR 시스템 9700(applied biosystems, USA)을 사용하여 증폭되었다.

각각의 primer는 Genbank에 기록된 염기 서열을 토대로 적당한 부위를 선택하여 제작하였으며 각각의 염기 서열은 표 9과 같다.

primer

name	primer	size(bp)
GAPDH	forward 5' - ATCCCATCACCATCTTCCAG-3'	500bp
	reverse 5' - CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'
MMP-2	forward 5' - ACATCAAGGGCATTCAGGAG-3'	500bp
	reverse 5' - GGAAAGCCAGGATCCATTTT-3'
IL-8	forward 5' - AGGGTTGCCAGATGCAATAC-3'	378bp
	reverse 5' - AGACTAGGGTTGCCAGA-3'
BAX	forward 5' - TGTTTTCTGACGGCAACTTCA-3'	385bp
	reverse 5' - CCCGGAGGAAGTCCAATG T-3'

증폭 반응의 조건은 다음과 같다. 즉, GAPDH는 94℃ 30초, 60℃ 45초, 72℃ 90초의 반응 주기를 30회 반복하였고, MMP-2는 94℃ 30초, 57℃ 45초, 72℃ 90초의 반응 주기를 30회 반복하였고, IL-8은 94℃ 30초, 60℃ 45초, 72℃ 90초의 반응 주기를 30회 반복하였고, BAX는 94℃ 30초, 55℃ 45초, 72℃ 90초의 반응 주기를 40회 반복하였다.

증폭된 DNA는 1.5% agarose gel에서 전기 영동하여 확인하였다.

젤 상의 band intensity는 GEL Doc 2000(bio rad, piscataway, NJ)을 이용하여 분석하였고 내부표준물질로 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)를 사용하여 유전자의 정량적 발현 수준을 보정하였다.

cDNA의 합성과 PCR을 위한 혼합액의 조성은 표 10과 같다.

혼합액의 조성

cDNA의 합성 혼합액	PCR 혼합액
5X RT BUFFER 6㎕
10mM dNTP 0.5㎕	10X BUFFER(TAKARA) 2.0㎕
RANDOM PRIMER 1㎕	10mM dNTP 1.6㎕
100mM DTT 1㎕	PRIMER(MIX) 0.4㎕
MMLV 1㎕	Taq polymerase(5U) 0.1㎕
RNasin 0.1㎕	cDNA 5.0㎕
RNA template 1㎕	DEPC water 10.9㎕
DEPC water 19.4㎕
total 반응액 30㎕	total 반응액 20㎕

10 ㎕의 RT-PCR 프로덕트를 1.5% agarose gel에 전기 영동하여 분석하였다.

전기 영동은 100V에서 40분 동안 수행하였으며, 1X TAE buffer를 사용하였다.

전기 영동한 agarose gel을 Et-Br 용액으로 20분간 염색을 한 후 다시 3차 증류수에 15~20분간 탈염색을 하였다.

탈 염색된 젤은 전기 영동 결과를 UV transilluminator(Ultra LUM, CA 90723)로 관찰한 후 GEL-DOC(PHOTODOC SYSTEM, BIO-RAD)을 사용하여 다시 확인하였다.

- 실험 결과

1) UV를 30분 처리한 샘플

UVC를 30분 처리한 결과 야국화의 경우 10 ㎕/㎖의 농도에서 가장 좋은 cell proliferation을 보였다.(도 1참조)

2) UV를 1시간 처리한 샘플

UVC를 1시간 처리한 결과 야국화의 경우 10 ㎕/㎖의 농도에서 가장 좋은 cell proliferation을 보였다.(도 2참조)

즉, 30분 처리시 100%의 세포 생존율을 유지하고 있다가 1시간 처리시 82%로 세포 생존율이 떨어지는 것을 알 수 있었으며, 종래의 UV 차단제들의 경우보다 급격히 생존율이 떨어지지 않는 효과를 나타내었고, 피부를 구성하는 콜라겐을 보호하는 효과에 야국화가 뛰어남을 알 수 있었다.

<실시예 7> 락토바실러스 애시도필러스를 이용한 야국화 발효 추출물의 제조

야국화의 꽃과 잎을 즉시 동결 건조시킨 후 건조된 야국화 20g을 400 ㎖의 3차 증류수에 넣고, 110℃에서 2시간 동안 열수 추출한 뒤 여과하였다.

상기 여과된 야국화 추출물을 50 내지 70℃에서 감압농축하고 최종 농축액이 40 ㎖이 되도록 맞춘 후 이를 여과하여 야국화 추출물로 이용하였다.

상기 추출된 추출물을 10g/L되게 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 배양액에 첨가하였다.

여기에 탄소원으로 덱스트로즈와 pH조절제로 디포타슘 포스페이트(Dipotassium phosphate)를 첨가하였다.

이때 사용한 균주로는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 사용하였으며, 배양액당 50,000 cfu/L로 첨가하였다.

배양은 발효조를 이용하여 10일간, 35℃, pH 5-7로 유지하며 배양하였다.

배양 후 배양액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거한 후 여과기를 이용하여 최종 여과하였다.

이렇게 얻은 여과액을 다시 4℃의 저온 창고에서 약 10일간 숙성시킨 후 액을 다시 여과기를 이용하여 여과하여 최종 야국화 발효액을 획득하게 되며 이를 화장품의 제조에 사용하게 된다.

상기 열수 추출시 동결 건조시킨 야국화를 90℃에서 5시간 내지 7시간 동안 열수 추출하는 이유는 동결 건조시킨 야국화를 100℃ 보다 낮은 온도에서 적어도 5시간 이상을 열수 추출할 경우에 야국화 조직들의 파괴를 최소화하기 위한 것이다.

한편, 인중합체(polyphosphate)는 두 개 이상의 인산염이 수십개 내지 수백개 연결되어 오르소포스페이트(orthophosphate, Pi)를 이루고 있는 인산염의 선형 중합체를 말하는 것으로서, 인중합체 분자의 각 결합은 고에너지 무수인산염(phosphoanhydride) 결합으로 이루어져 있다.

이러한 인중합체의 사슬 말단은 P-AMP 포스포트랜스퍼라제, 인중합체 키나아제, 인중합체 글루코키나아제 및 엑소폴리포스파타아제의 촉매작용에 의하여 각각 AMP, ADP, 포도당 또는 물에 의한 공격을 받으며, 내부적으로는 엔도폴리포스파타아제에 의하여 공격을 받는다.

이러한 인중합체 분자는 음이온가가 높은 상태이므로 코발트, 구리, 마그네슘, 칼슘, 철, 아연 등과 같은 다가 양이온과 견고하게 결합할 수 있는데, 상기 특성으로 인하여 정상적인 미생물 대사를 통해 취하여야 할 물질들이 안정적으로 결합할 수 있어서 결국 미생물의 성장에 저해요인이 되는 것으로 알려져 있다.

인중합체는 식용육류와 치즈의 발색 촉진제 및 첨가제, 통조림의 응유제거제, 다양한 탄산수 첨가물, 치양 및 위장약 등에 사용되고 있으며, 미국의 FDA와 농무부(Department of Agriculture)에서 인체에 무해한 물질로 공인받은 바 있다.

통상적으로 항산화제로 많이 사용되는 비타민 C, 비타민 E 등은 여러 제형에서 물이나 빛에 의하여 변색되는 등의 한계가 있어 그 사용량이 극히 제한되어 왔다.

인중합체는 이러한 종래의 항산화제가 갖는 제형의 한계를 극복할 수 있기 때문에 각종 항산화용 화장품에 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 야국화 발효 추출물에 포함된 인중합체를 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 기능성 화장품에 있어서, 인중합체는 과산화 저해 활성 및 라디칼 제거 활성이 우수하여 높은 항산화 활성을 가지므로, 피부의 과산화 예방을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

따라서, 인중합체는 피부 노화 억제, 피부 탄력 유지 또는 주름 개선을 위한 화장품 시료로서 이용될 수 있으며, 바람직하게는 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 엣센스, 팩 또는 목욕용 파우더의 기초 화장품 시료로서 이용될 수 있다.

본 발명의 야국화 발효 추출물에 포함된 인중합체를 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 기능성 화장품에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장품 조성물에 인중합체가 0.0001 내지 20 중량부, 바람직하게는 0.001 내지 10 중량부의 양으로 첨가된다.

도 3에 도시한 바와 같이, 본 발명의 야국화 발효 추출물은 인중합체 (polyphosphte)가 많이 함유되어 있음을 확인할 수 있었다.

많은 양의 인이 함유된 야국화에서 추출한 인중합체를 borate-EDTA urea gel에 전기 영동한 결과 야국화는 65chain을 나타났다.

또한, 인중합체 체인 length별 추출을 유도하고자 sepadex G-25 column을 이용하였다.

이에 sepadex G-25 column에 다양한 길이의 인중합체를 적용하여 각 크기별로 나눠지는 인중합체를 확인하였다.

그 결과, 각각의 sing peak로 나눠지지는 않으나, fraction의 부피를 조절하여 sing peak 유도가 가능함을 확인하였다.(도 4참조)

야국화는 chain75보다 긴 체인을 나타냈고, 도 5에 도시한 바와 같이, 뒷부분에서 피크를 보였다.

이는 인중합체가 서로 뭉쳐서 column에서 내려오는 것이 약간의 차이를 나타내는 것으로 판단된다.

상기와 같은 결과로 보아 야국화 속에 포함된 인중합체는 동물세포에 soluble 형태로 존재하는 인중합체 크기를 갖고 있으며, 이는 DNA protection 기능을 갖고 있을 것으로 판단된다.

<제조예 1> 야국화 발효 추출물을 이용한 화장품의 제조

본 발명의 야국화 발효 추출물에 포함된 인중합체를 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 기능성 화장품은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 제조예에서는 야국화 발효 추출물을 이용하여 영양화장수, 크림, 에센스 등의 유화 제형의 화장품, 유연화장수와 같은 가용화 제형의 화장품을 제조하였다.

유화 제형은 야국화 발효 추출물을 전체 화장품 중량부에 대해 20 중량부를 함유하도록 제조하였으며, 가용화 제형은 야국화 발효 추출물을 전체 화장품 중량에 대해 10 중량부를 함유하도록 제조하는 것이 피부 노화의 가장 큰 원인인 UV에 대하여 콜라겐을 보호하는 효과가 뛰어나기 때문에 상기한 중량부를 유지하는 것이 바람직하다.

<1-1> 유화 제형의 화장품 제조

제조 방법은 하기와 같다.

1) 스테아린산 0.3 중량부, 스테알리 알콜 0.2 중량부, 글리세릴 모노스테아레이트 1.2 중량부, 밀납 0.4 중량부, 폴리옥시에틸렌솔비탄 모노라우린산 에스테르 2.2 중량부, 파라옥시안식향산 메틸 0.1 중량부, 파라옥시안식향산 프로필 0.05 중량부, 세틸에틸헥사노에이트 5 중량부, 트리글리세라이드 2 중량부를 혼합한 1차 혼합물을 60∼80℃로 가열하였다.

2) 이후, 사이클로메티콘 3 중량부를 상기 1차혼합물에 투입하여 2차 혼합물을 제조하였고,

3) 증류수 100 중량부, 농글리세린 5 중량부, 트리에탄올아민 0.15 중량부를 혼합한 혼합물을 65∼70℃로 가열하여 완전히 용해시키는 용해단계를 거치게 된다.

4) 상기 용해단계를 거치면서 상기 2)의 2차 혼합물을 서서히 첨가하여 8,000 rpm에서 2∼3분간 유화시켰다.

5) 폴리아크릴산 중합체 0.12 중량부를 물에 용해시킨 후 상기 4)의 혼합물에 첨가하고 2분간 더 유화시켰다.

6) 색소 0.0001 중량부, 향 0.1 중량부, 야국화 발효 추출물 20 중량부를 상기 5)의 혼합물에 넣고 1분간 더 유화시켰다.

7) 상기 6)의 혼합물을 유화 후 탈기 과정을 거쳐 25∼35℃로 냉각시킴으로서 유화제형의 화장품을 제조하였다.

<1-2> 가용화 제형의 화장품 제조

제조 방법은 하기와 같다.

1) 농글리세린 3 중량부, 1,3-부틸렌글리콜 2 중량부, EDTA-2Na 0.01 중량부, 색소 0.0002 중량부, 야국화 발효 추출물 10 중량부를 정제수 100 중량부에 넣고 아직믹서를 이용하여 용해시켰다.

2) 파라옥시안식향산 메틸 0.1 중량부, 폴리옥시에틸렌 하이드로제네이디트 에스테르 0.3 중량부, 향 0.15 중량부, 사이클로메티콘 0.2 중량부를 알코올(95%) 8 중량부에 넣고 완전용해시켰다.

3) 상기 2)의 혼합물을 상기 1)의 혼합물에 서서히 첨가하면서 가용화시켜 가용화 제형의 화장품을 제조하였다.

이상에서와 같은 내용의 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시된 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다.

본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구 범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (6)

1. 야국화의 꽃과 잎을 동결건조시키는 단계와;
   상기 동결건조시킨 야국화를 90 내지 110℃에서 1시간 내지 3시간 동안 열수 추출하여 여과한 다음 감압농축하고 정제하는 단계와;
   락토바실러스 애시도필러스를 이용하여 상기 정제된 야국화 추출물을 배양하여 야국화 발효액을 제조하는 단계;로 구성되되, 제조된 야국화 발효 추출물의 함량은,
   화장품 총 중량을 기준으로 0.001 내지 20중량부인 것을 특징으로 하는 야국화 발효 추출물에 포함된 인중합체를 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 기능성 화장품.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제

Images