ES2601432T3 - Péptidos inmunógenos y su uso en trastornos inmunitarios - Google Patents

Péptidos inmunógenos y su uso en trastornos inmunitarios Download PDF

Info

Publication number
ES2601432T3
ES2601432T3 ES07801643.3T ES07801643T ES2601432T3 ES 2601432 T3 ES2601432 T3 ES 2601432T3 ES 07801643 T ES07801643 T ES 07801643T ES 2601432 T3 ES2601432 T3 ES 2601432T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
peptide
lymphocytes
motif
cells
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES07801643.3T
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Marie Saint-Remy
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Katholieke Universiteit Leuven
Life Sciences Research Partners vzw
Original Assignee
Katholieke Universiteit Leuven
Life Sciences Research Partners vzw
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0615966A external-priority patent/GB0615966D0/en
Priority claimed from GB0710081A external-priority patent/GB0710081D0/en
Priority claimed from GB0711403A external-priority patent/GB0711403D0/en
Application filed by Katholieke Universiteit Leuven, Life Sciences Research Partners vzw filed Critical Katholieke Universiteit Leuven
Application granted granted Critical
Publication of ES2601432T3 publication Critical patent/ES2601432T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/35—Allergens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464839—Allergens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43531—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from mites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4717—Plasma globulins, lactoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C12Y111/01008—Iodide peroxidase (1.11.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01015—Glutamate decarboxylase (4.1.1.15)

Abstract

Un péptido inmunógeno aislado, con una longitud de entre 12 y 50 aminoácidos, que comprende: - un epítopo de linfocito T de un alérgeno o autoantígeno, cuyo epítopo encaja en la hendidura de una proteína MHC II, y - un motivo C-X(2)-C, estando dicho motivo adyacente a dicho epítopo o separado de dicho epítopo por como máximo 7 aminoácidos, en donde dicho alérgeno o autoantígeno no comprende un motivo C-X(2)-C dentro de una secuencia de 11 aminoácidos N o C terminales de dicha secuencia de epítopo. .

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Peptidos inmunogenos y su uso en trastornos inmunitarios Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a peptidos inmunogenos y a su uso en terapias para suprimir alergias y trastornos autoinmunitarios.
Antecedentes de la invencion
El sistema inmunitario de los mamferos es una red compleja que sirve para proteger a un sujeto de factores externos e internos que lo ponen en peligro. Sin embargo, en algunas circunstancias, este mecanismo de proteccion complejo mantiene o el mismo se convierte en la causa de trastornos, la mayona con implicaciones cronicas, dentro del sujeto. Existen muchos trastornos inmunitarios, siendo dos importantes las enfermedades alergicas y los trastornos autoinmunitarios. Las enfermedades alergicas, descritas convencionalmente como enfermedades mediadas de tipo 1 o enfermedades mediadas por IgE, han visto casi duplicar su prevalencia a lo largo de los ultimos 20 anos. Las manifestaciones clrnicas de las enfermedades alergicas incluyen asma bronquial, rinitis alergica, dermatitis atopica, hipersensibilidad alimentaria y reacciones anafilacticas a picaduras de insectos o farmacos. La carga economica relacionada con el cuidado de pacientes alergicos esta aumentando continuamente a lo largo de los anos. Como un ejemplo, el coste asociado con la prescripcion de tratamiento alergico en EE.UU. se preve que alcance alrededor de 10 mil millones de dolares americanos en 2006. Actualmente no hay terapia curativa para dichas enfermedades, que se mantienen bajo control por expulsion del alergeno cuando es posible, y/o terapia sintomatica usando broncodilatadores, antihistaminas, corticosteroides e inmunomoduladores tales como ciclosporina. La desensibilizacion al alergeno, que consiste en la administracion regular de alergenos a los que es sensible el paciente, ha mostrado ser eficaz en la rinitis alergica, pero sigue siendo polemico en el asma y la dermatitis atopica. Algunos smtomas clrnicos, tales como los relacionados con los alergenos de alimentos, no se pueden tratar por desensibilizacion.
La autoinmunidad es el fallo del organismo para reconocer sus propias partes constituyentes (hasta el nivel submolecular) como "propias", lo que produce una respuesta inmunitaria contra sus propias celulas y tejidos. Cualquier enfermedad que produce dicha respuesta inmunitaria aberrante se denomina enfermedad autoinmunitaria. Son ejemplos destacados el lupus eritematoso sistemico (SLE), smdrome de Sjogren y la artritis reumatoide (RA). Las enfermedades autoinmunitarias se clasifican ampliamente en dos categonas, en concreto enfermedades sistemicas y enfermedades espedficas de organo. La etiologfa precisa de las enfermedades autoinmunitarias sistemicas no esta definida. En cambio, las enfermedades autoinmunitarias espedficas de organo estan relacionadas con una respuesta inmunitaria espedfica que incluye linfocitos B y T, que se dirigen al organo y de esta forma induce y mantiene un estado cronico de inflamacion local. Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias espedficas de organo incluyen la diabetes de tipo 1, miastenia grave, tiroiditis, esclerosis multiple, enfermedad celiaca, enfermedades inflamatorias del intestino, aterosclerosis, adrenalitis, smdromes poliendocrinos, gastritis, anemia perniciosa, enfermedades oculares tales como uveftis, y enfermedades del ofdo interno tales como cocleftis.
Las reacciones autoinmunitarias estan, por lo tanto, dirigidas a las propias celulas o tejidos, mas en particular a "autoantigenos", es decir antfgenos (o protemas) que estan presentes de forma natural en el organismo del mairnfero. En este mecanismo, los autoantfgenos son reconocidos por linfocitos B y/o T que activan el sistema inmunitario para atacar al tejido que comprende el autoantfgeno. Esta bien reconocido que la supresion del sistema inmunitario es beneficiosa y en algunos casos puede conducir a la recuperacion parcial o completa de la funcion del organo en algunos casos. Sin embargo, este tipo de terapia no es eficaz para la enfermedad autoinmunitaria espedfica de organo y hasta la fecha la supresion inmunitaria no se puede lograr de una forma espedfica del antfgeno. La terapia actual usa la supresion inmunitaria no espedfica obtenida por el uso de corticosteroides y agentes inmunosupresores, que presentan todos efectos secundarios importantes relacionados con la falta de especificidad, limitando asf su uso y su eficacia general.
Es interesante que por razones que no se entienden del todo, la incidencia de las enfermedades autoinmunitarias se ha duplicado a lo largo de los ultimos 20 anos, muy en paralelo con el aumento observado de enfermedades alergicas. De nuevo, el coste relacionado con el tratamiento de las enfermedades autoinmunitarias ha aumentado enormemente en los ultimos anos, anadiendo una razon mas a la necesidad de una nueva forma de terapia.
En la tecnica anterior, se han usado epftopos de linfocitos T de alergenos para fines de desensibilizacion. Los peptidos derivados de alergenos que contienen uno o unos pocos epftopos de linfocitos T se usan en experimentos con animales y en seres humanos en un intento de inhibir la activacion de linfocitos T espedficos e inducir una estado de falta de respuesta, tal como se describe en la solicitud de patente WO93/08279. Una aplicacion humana de este concepto es la administracion de un peptido derivado de la secuencia de epftopos de linfocitos T presentes en el alergeno Fel d 1, por inyecciones subcutaneas en individuos sensibles a los gatos (Wallner & Gefter (1994) Allergy 49, 302-308). Un procedimiento complementario alternativo de este concepto tambien se ha usado en experimentos con animales. Los peptidos usados se modificaron de forma que mantuvieran su capacidad para
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
unirse a determinates de MHC de clase II en linfocitos B espedficos, pero estos peptidos pierden su capacidad de activar los correspondientes linfocitos T (O'Hehir et al. (1991) Int. Immunol. 3, 819-826).
El cribado del alergeno Der p 2 del acaro del polvo domestico con un conjunto de peptidos que se solapan de esta protema, muestra que un peptido espedfico p21-35 comprende un epftopo de linfocito T que se comporta como epftopo universal y podna ser un candidato adecuado para la induccion de anergia de linfocitos T (Wu et al. (2003) J. Immunol. 169, 1430-2435, WO0170263).
En una publicacion relacionada, se ha mostrado que un peptido que comprende un epftopo de MHC de clase II y una secuencia CHGS del mismo tiene un efecto espedfico de epftopo en la apoptosis mediada por CD4+ CD25+ de linfocitos B presentadores de antigeno (Janssens et al. (2003) J. Immunol. 171, 4604-4612). Sin embargo, los autores no mencionaban que esta secuencia CxxS tiene una actividad reductora. Sin embargo, la identificacion de este peptido requiere un cribado exhaustivo del alergeno y no hay indicacion de que para todas y cada una de las protemas antigenas, se pueda identificar dicho peptido con un efecto inductor de apoptosis.
El documento US2003152581 describe el mismo peptido p21-35 de Wu et al. fusionado a un epftopo de linfocito T similar a Th1 de toxoide tetanico.
El documento WO9308279 describe conjuntos de peptidos que se solapan de alergenos de acaros y el ensayo de secuencias de epftopos de estos fragmentos de peptidos. Algunos de los peptidos contienen una secuencia CGSC cerca de un epftopo de MHC de clase II. La presencia e importancia de dicha secuencia no se describe en esta publicacion.
Compendio de la invencion
La presente invencion se refiere a nuevos peptidos inmunogenos con actividad citotoxica. Los peptidos de la invencion comprenden (i) al menos un epftopo de linfocito T de un antfgeno (propio o no propio) con potencial para producir una reaccion inmunitaria, acoplado, opcionalmente a traves de un conector a (ii) un compuesto organico que tiene una actividad reductora, tal como una secuencia de tiorreductasa, y que ademas comprende opcionalmente (iii) una secuencia de aminoacidos que dirige al endosoma.
En un aspecto, la presente invencion proporciona peptidos inmunogenos aislados derivados de una protema antfgena que comprende una secuencia artificial que comprende un epftopo de linfocito T de la protema antfgena y el motivo C-X(2)-[CST] o [CST]-X(2)-C, cuyo motivo tiene actividad reductora, dando como resultado una respuesta espedfica de linfocitos T cuando se ponen en contacto con este peptido.
En realizaciones particulares, se proporcionan peptidos inmunogenos aislados derivados de una protema antfgena que comprenden una secuencia artificial que comprende un epftopo de linfocito T de la protema antfgeno y el motivo C-X(2)-C, de modo que el motivo esta situado adyacente al epftopo, o separado del epftopo dentro de la secuencia artificial por un conector de como maximo 7 aminoacidos. En realizaciones particulares adicionales, el peptido inmunogeno derivado de una protema antfgena comprende una secuencia artificial que comprende un epftopo de linfocitos T de la protema antfgena y un patron C-X(2)-[CST] o [CST]-X(2)-C, de modo que el motivo esta situado adyacente al epftopo, o separado del epftopo por un conector de como maximo 7 aminoacidos dentro de la secuencia artificial y de modo que el motivo no se encuentra de forma natural dentro de una region de 11 aminoacidos N terminales o C terminales del epftopo de linfocito T en la protema de la que deriva el epftopo. Realizaciones particulares adicionales proporcionan peptidos inmunogenos aislados derivados de una protema antfgena que comprenden una secuencia artificial que comprende un epftopo de linfocito T de la protema antfgeno y el motivo C-X(2)-[ST] o [ST]-X(2)-C, de modo que el motivo esta situado adyacente al epftopo, o separado del epftopo por un conector de como maximo 7 aminoacidos dentro de la secuencia artificial, y de modo que en los peptidos donde el motivo es C-X(2)-S o S-X(2)-C, el epftopo de linfocito T no comprende la secuencia EPCIIHRGKP [sEq ID. NO: 1] del peptido p21-35 de Der p 2. Realizaciones particulares adicionales corresponden a peptidos inmunogenos como se han descrito antes, en donde para los peptidos en donde el motivo es C-X(2)-S o S-X(2)-C, la protema antfgena no es Der p 2.
Realizaciones particulares adicionales de la invencion se refieren a peptidos inmunogenos tales como los descritos en lo que antecede, que ademas comprenden, unido a la secuencia artificial una secuencia que dirige al endosoma tardfo.
Realizaciones particulares adicionales de la invencion se refieren a peptidos inmunogenos tales como los descritos en lo que antecede, que comprende el motivo situado N terminal del epftopo.
Realizaciones particulares adicionales de la invencion se refieren a peptidos inmunogenos tales como los descritos en lo que antecede, en donde la secuencia artificial tiene una longitud de entre 12 y 19 aminoacidos.
En realizaciones particulares de la invencion, se proporcionan peptidos inmunogenos tales como los descritos en lo que antecede, en donde X en el motivo no es Tyr, u otro aminoacido voluminoso tal como Trp o Phe. Adicional o alternativamente, en realizaciones particulares, al menos uno de X en el motivo es Gly, Ala, Ser o Thr. Adicional o alternativamente en realizaciones particulares, al menos uno de X en el motivo es H o P.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En realizaciones particulares de la invencion, se proporcionan peptidos inmunogenos tales como los descritos en lo que antecede, en donde la cistema en el correspondiente motivo esta metilada. En el caso del motivo C-X(2)-C una o ambas cistemas en el motivo pueden estar metiladas.
Los peptidos inmunogenos de la presente invencion se preve que sean utiles en la generacion de un efecto inmunosupresor, de modo que el efecto inmunosupresor dirigido determinara la naturaleza de la protema antigena de la que deriva el epftopo. En realizaciones particulares de los peptidos inmunogenos descritos en lo que antecede, la protema antfgena es un autoantfgeno, mas en particular un autoantigeno seleccionado del grupo que consiste en tiroglobulina, peroxidasa tiroidea, receptor de tSh, insulina (proinsulina), acido glutamico descarboxilasa (GAD), tirosina fosfatasa IA-2, protema oligodendrodtica de la mielina, protema de choque termico HSP65.
En realizaciones particulares adicionales de los peptidos inmunogenos descritos en lo que antecede, la protema antfgena es un alergeno, mas en particular un alergeno seleccionado del grupo que consiste en alergeno Bet v1 de Betula, betalactoglobulina bovina y Der p1.
Un aspecto adicional de la presente invencion se refiere al uso terapeutico y profilactico de peptidos inmunogenos descritos en lo que antecede. Por consiguiente, la presente invencion proporciona peptidos tales como los descritos antes, para usar como un medicamento, y composiciones farmaceuticas que comprenden uno o mas de los peptidos descritos antes, que comprenden opcionalmente un vehmulo farmaceuticamente aceptable.
Un aspecto adicional de la presente invencion se refiere al uso de los peptidos descritos en lo que antecede en el tratamiento y prevencion de trastornos autoinmunitarios. Como se ha indicado antes, se describe que los peptidos tienen tanto efecto terapeutico como profilactico permitiendo de esta forma una reduccion en la aparicion, una reduccion en la aparicion y/o gravedad de recafda y/o la prevencion y/o tratamiento de las enfermedades autoinmunitarias. Por lo tanto, la presente invencion proporciona los peptidos inmunogenos descritos en lo que antecede, para usar en el tratamiento y prevencion de un trastorno autoinmunitario. Realizaciones espedficas de trastornos autoinmunitarios contemplados en el contexto de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a esclerosis multiple, diabetes dependiente de insulina espontanea y tiroiditis autoinmune.
Un aspecto adicional mas de la presente invencion se refiere al uso de los peptidos descritos en lo que antecede en el tratamiento y prevencion de afecciones alergicas. Como se ha indicado antes, se describe que los peptidos tienen tanto efecto terapeutico como profilactico permitiendo asf la aparicion y/o gravedad de la afeccion alergica y/o la prevencion de la afeccion alergica y/o una reduccion de los smtomas de la afeccion alergica. Mas en particular, la presente invencion proporciona peptidos, como se describe en la presente memoria, para usar en el tratamiento y prevencion de una afeccion alergica seleccionada del grupo que consiste en alergia a acaros del polvo, alergia a la leche y alergia al polen de abedul.
Un aspecto adicional mas de la presente invencion proporciona metodos para preparar un peptido de una protema antfgena capaz de producir actividad de linfocitos T Cd4+ citolfticos, comprendiendo dicho metodo las etapas de (a) proporcionar una secuencia de peptido que consiste en un epftopo de linfocito T de la protema antfgena, y conectada a esta secuencia de peptido, una secuencia que comprende el motivo C-X(2)-[CST] o [CST]-X(2)-C, de modo que el motivo y el epftopo estan adyacentes entre sf o separados por un conector de como maximo 7 aminoacidos. En realizaciones particulares, el motivo es el motivo C-X(2)-C. En realizaciones particulares de metodos de acuerdo con este aspecto de la invencion, el epftopo de linfocito T es un epftopo de una protema antfgena que no comprende de forma natural el motivo C-X(2)-[CST] o [CST]-X(2)-C dentro de una region de 11 aminoacidos N terminales o C terminales del epftopo de linfocito T, y el epftopo de linfocito T esta unido al motivo C- X(2)-[CST] o [CST]-X(2)-C. En otras realizaciones particulares mas de los metodos de acuerdo con este aspecto de la invencion, donde el epftopo de linfocito T comprende la secuencia EPCIIHRGKP [SEQ ID. NO: 1] del peptido p2135 de Der p 2, el motivo no es C-X(2)-S o S-X(2)-C. En realizaciones particulares adicionales, la protema antfgena no es Der p 2.
En realizaciones particulares, los metodos de la presente invencion comprenden ademas modificar la secuencia del peptido asf obtenido, modificando los aminoacidos en el epftopo, asegurandose asf que en el peptido modificado la secuencia del epftopo esta modificada de modo que se mantiene la capacidad para encajar en la hendidura de MHCII. Dichas modificaciones incluyen sustituciones de aminoacidos, pero tambien incluyen cambios en la cadena de aminoacidos tales como modificaciones que se encuentran en modificaciones postraduccionales de aminoacidos o incluso cadenas laterales de aminoacidos no naturales que no se encuentran de forma no natural.
Otro aspecto mas de la invencion se refiere a metodos para preparar un peptido inmunogeno aislado de una protema antfgena capaz de producir actividad de linfocitos T CD4+ citolfticos, cuyos metodos comprenden las etapas de identificar dentro de la protema antfgena, una secuencia que comprende un epftopo de linfocito T flanqueado, en la protema antfgena, por el motivo C-X(2)-(CST] o [CST]-X(2)-C dentro de una region de 11 aminoacidos N terminales o C terminales de dicho epftopo de linfocito T, y generar un peptido que comprende esta secuencia como un peptido aislado de entre 12 y 19 aminoacidos. No se ha demostrado previamente que de esta forma se puedan generar peptidos con propiedades inmunogenas particulares. En realizaciones particulares, la protema antfgena no es Der p 2.
5
10
15
20
25
30
35
40
De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, los metodos de acuerdo con este aspecto de la invencion comprenden ademas modificar la secuencia de dicho peptido modificando los aminoacidos en el motivo y/o modificando el numero de aminoacidos entre el motivo y el epftopo y/o modificando la secuencia de epftopo, asegurandose as^ que en dicho peptido modificado:
- se mantiene la capacidad del epftopo de linfocito T para encajar en la hendidura de MHCII,
- se conserva el motivo y
- dicho motivo y dicho epftopo permanecen adyacentes entre sf o separados por un conector de como maximo 7 aminoacidos.
De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, los metodos de acuerdo con este aspecto de la invencion comprenden ademas la etapa de unir una secuencia que dirige al endosoma tardfo al peptido obtenido como se ha descrito antes.
Un aspecto adicional mas de la invencion se refiere a metodos de identificacion de una poblacion de Treg citotoxicos. En realizaciones particulares, se proporcionan metodos que comprenden determinar que las celulas expresan CD4, no expresan IL-10 o TGF-beta, y expresan Krox-20 y producen granzimas (en particular granzimas B y C) y ligando Fas.
En realizaciones particulares adicionales, los metodos de acuerdo con este aspecto de la invencion comprenden determinar una o mas de las siguientes caractensticas, cuando se comparan con Treg no citotoxicos: :
a) una mayor expresion de marcadores de superficie incluyendo CD103, CTLA-4, FasL e ICOS tras activacion,
b) una expresion alta de CD25, expresion de CD4, ICOS, CTLA-4, GITR y expresion baja o sin expresion de CD127 (IL7-R),
c) la expresion del factor de transcripcion T-bet y/o egr-2 (Krox-20) pero no del represor de transcripcion Foxp3,
d) una produccion alta de IFN-gamma y no de, o solo cantidades en trazas de IL-10, IL-4, IL-5, IL-13 o TGF-beta.
e) una mayor expresion de marcadores que incluyen FasL y granzimas B y C tras activacion.
En realizaciones particulares adicionales, los metodos de acuerdo con este aspecto de la invencion comprenden determinar que estas celulas no responden a la activacion por reconocimiento de TCR.
Un aspecto mas de la invencion, proporciona metodos in vitro para obtener una poblacion de linfocitos T reguladores espedficos de antfgeno con propiedades citotoxicas. En una realizacion particular, los metodos de acuerdo con este aspecto comprende las etapas de:
- proporcionar celulas de sangre periferica,
- poner en contacto dichas celulas con un peptido inmunogeno como se ha descrito antes y
- aumentar dichas celulas en presencia de IL-2.
En una realizacion particular adicional, estos metodos in vitro comprenden administrar un peptido inmunogeno de acuerdo con la presente invencion a un sujeto, y aislar de dicho sujeto linfocitos T reguladores espedficos de antfgeno con propiedades citotoxicas.
Un aspecto adicional mas de la presente invencion se refiere a poblaciones in vitro de linfocitos T reguladores con propiedades citotoxicas, que se pueden obtener (y/o identificar) por los metodos de la presente invencion descritos antes.
Un aspecto adicional mas de la presente invencion, proporciona el uso de la poblacion de linfocitos T reguladores descritos en lo que antecede en el tratamiento y prevencion de una afeccion alergica o un trastorno autoinmunitario.
Se describen en el presente documento metodos in vitro que comprenden las etapas de:
- proporcionar celulas de sangre periferica del sujeto que se va a tratar,
- poner en contacto las celulas con un peptido inmunogeno como se describe en la presente memoria,
- aumentar las celulas, y
- administrar las celulas aumentadas al sujeto que se va a tratar.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Mas en particular, en metodos proporcionados en la presente memoria se usa un peptido inmunogeno del cual se obtiene el epftopo de linfocito T de una protema antfgena implicada en el proceso patologico que se va a tratar. Mas en particular, el antigeno es un antfgeno dominante.
Se describen en la presente memoria metodos para tratar o prevenir una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto, que comprende las etapas de administrar uno o mas peptidos inmunogenos como se describen en la presente memoria, a dicho sujeto. Ademas se describen metodos para tratar o reducir los smtomas de una afeccion alergica en un sujeto, que comprenden las etapas de administrar uno o mas de los peptidos inmunogenos como se describen en la presente memoria a dicho sujeto. Mas en particular, en metodos proporcionados en la presente memoria se usan peptidos inmunogenos de los cuales se obtiene el epftopo de linfocito T de una protema antigena implicada en el proceso patologico que se va a tratar. Mas en particular, el antfgeno es un antigeno dominante.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra la capacidad de p21-35 de Der p 2 para reducir los puentes disulfuro en el ensayo de reduccion de insulina (ensayo turbodimetrico) (lrnea de trazos: control; lrnea negra con triangulos: peptido B4; lrnea negra con cuadrados: Trx (tiorredoxina).
La figura 2 muestra el aumento de absorcion de p21-35 por celulas presentadoras de antfgeno (ensayado por apoptosis de linfocitos B wehi diana) por adicion de un epftopo de linfocito T subdominante (lrnea gris con cuadrados: peptido T-B (p21-35 unido a epftopo T menor (p830-844) de toxina tetanica; lrnea negra con triangulos: peptido p21-35).
La figura 3 muestra el efecto de mutar las posiciones 21 a 24 en P21-35 a alanina en la proliferacion de clones Treg (incorporacion de 3H timidina (panel B) y lisis de celulas Wehi (panel C) de acuerdo con una realizacion de la invencion. El motivo y los restos que forman la hendidura de union a MHC de clase II en p21-35 estan indicados en el panel A. (neg: sin peptido; a21: mutacion Cys21Ala; a22: mutacion His22Ala; a23: mutacion Gly23Ala, a24 : mutacion Ser24Ala).
La figura 4 muestra el efecto de la preinmunizacion con T-B en un modelo de raton in vivo para la alergia, tras inyeccion de protema Der p 2 de acuerdo con una realizacion de la invencion. El "modelo de Der p 2" es un grupo de ratones de control, Tbalum es un grupo experimental previamente tratado con el peptido T-B.
Panel A: Cantidad (expresada como cifras totales) de macrofagos, eosinofilos y linfocitos en el grupo de control y experimental.
Panel B: Cantidad de eosinofilos, linfocitos y celulas calciformes expresada usando un sistema de puntuacion de intensidad de 0 a 6.
Panel C: Hiperreactividad de las vfas aereas en el grupo de control y experimental. La hiperreactividad se mide calculando el area bajo la curva (AUC) de valores PenH obtenidos exponiendo los ratones a concentraciones crecientes de metacolina.
La figura 5 muestra el efecto de p21-35 en el metabolismo oxidativo de linfocitos Treg cognados, medido por separacion celular de celulas marcadas con Carboxi-H2DCFDA. Panel A: PBS (control negativo); Panel B: peptido p21-35; Panel C; hidroperoxido de terc-butilo (control positivo).
La figura 6 muestra las propiedades citotoxicas de una lrnea de Treg (G121) en la lrnea de linfocitos B WEHI usada como una celula presentadora de antfgeno tras la adicion del peptido p21-25, indicado como porcentaje de lisis celular (rombos: WEHI + linfocitos T, cuadrados: celulas WEHI + linfocitos T + peptido p21-35, triangulos linfocitos T + celulas WEHI precargadas con el peptido p21-35).
La figura 7 muestra la supresion de clones de linfocitos Treg en la activacion de linfocitos T espedficos para otro epftopo en el mismo antfgeno, o espedfico para otro antfgeno por citotoxicidad de acuerdo con una realizacion de la invencion.
Paneles A y B: lrnea de linfocitos T espedficos para Der p1.
Paneles C y D: lrnea de linfocitos T espedficos para el peptido p71-85 de Der p 2.
Los paneles A y C muestran la proliferacion de las lmeas celulares antes de incubacion con un clon de Treg citotoxico espedfico para el peptido 21-35.
Los paneles B y D muestran la proliferacion de las lmeas celulares despues de incubacion con un clon de Treg citotoxico espedfico para el peptido 21-35.
La figura 8 muestra que los linfocitos Treg de la invencion tienen un perfil fenotfpico caractenstico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
La figura muestra la produccion de citoquinas de 4 clones de Treg espedficos del peptido p21-35 derivados de ratones tratados con el peptido p21-35, peptido T-B como en la figura 4 (panel izquierdo). Se analizo en los ftquidos sobrenadantes de los cultivos celulares el contenido de citoquinas despues de cuatro dfas de estimulacion con celulas presentadoras de antfgenos (esplenocitos irradiados de ratones sin tratamiento previo, 105 celulas) y peptido p21-35 (2 jg/ml, 200 jl). Puede verse que los clones de Treg produdan principalmente IFN-G y solo cantidades en trazas de TNF-a e IL-10. El panel de la derecha muestra que en el analisis del ARNm de dichos linfocitos Treg, no se detectaron transcritos para el represor de transcripcion Foxp3, pero eran altamente expresados transcritos para T- bet, granzima A y granzima B.
La figura 9 muestra la expresion de diferentes marcadores celulares de cuatro clones de linfocitos T espedficos de p21-35 en reposo, usando separacion celular activada por fluorescencia (Facs).
La figura 10 muestra un vision general esquematica de la generacion de clones de linfocitos T con propiedades citotoxicas despues de estimulacion con un peptido de control (senal directora - epftopo de Der p1) y un peptido experimental (senal directora - CFGS - epftopo de Der p 1) de acuerdo con una realizacion de la invencion. "n" es el numero total de clones de linfocitos T, "lftico" es el numero de estos clones que tienen la capacidad de producir la lisis de celulas WEHI.
La figura 11 muestra la produccion de linfocitos T reguladores espedficos de antfgeno usando secuencias de epftopo con restos mutados de acuerdo con una realizacion de la invencion.
Panel A: Induccion de apoptosis (indicada como expresion de anexina V en celulas reguladas por CD19+ usando celulas Wehi precargadas con p21-35 (triangulos), p21-35met (peptido p21-35 con cistema metilada) (cruces) o mp21-35 (peptido de fusion de un epftopo menor de toxoide tetanico y P21-35) (cuadrados), y cocultivadas durante 24 horas con el clon de Treg citolftico G121. Resultados representativos de al menos 3 experimentos;
Panel B: Supresion de la proliferacion de linfocitos T CD4+ del bazo (medido como incorporacion de [3]H timidina) inducida por la protema Der p 2 entera (negro), p21-35met (peptido p21-35 con cistema metilada) (blanco) o una mezcla de p830 (peptido p830-844 de toxoide tetanico) y p21-35met (gris). Los histogramas son la media de cpm ± e.e.m. de 6 ratones ensayados individualmente por triplicado;
Panel C: Produccion de citoquinas por los linfocitos T CD4+ del bazo pretratados con los peptidos indicados en el panel b. Las tres poblaciones de celulas se estimularon con Der p2 intacto. Los histogramas son para la concentracion media ± e.e.m. de 6 ratones ensayados individualmente.
Panel D: Procesamiento y presentacion de p21-35met, mp21-35 y Der p 2 evaluado usando esplenocitos adherentes como APC y un clon de linfocitos T cD4+ espedficos de p21-35 efectores (G221N). Las APC se trataron previamente con los inhibidores indicados. La proliferacion de linfocitos T se muestra como un mdice de estimulacion. Las barras representan los valores del e.e.m. de cultivos por triplicado.
La figura 12 muestra la caracterizacion fenotfpica de clones Treg citolfticos obtenidos con mp21-35Asn (peptido de fusion de peptido toxoide tetanico y p21-35 mutado (IIe28Asn)) de acuerdo con una realizacion de la invencion. Se ensayo en los clones de Treg en alumbre la expresion de marcadores de superficie y CTLA-4 intracelular.
Panel A: Expresion de marcadores de superficie (Facs) de un clon de Treg;
Panel B: Deteccion intracelular de Foxp3, T-bet, granzima B (Grz-B), perforina y CD127 de superficie usando anticuerpos espedficos con marcadores de fluorescencia (negro). La tincion de control con un anticuerpo de isotipo correspondiente tambien se muestra (blanco).
Panel C: RT-PCR de transcritos de ARNm de Grz-A y Grz-B detectados 12 dfas despues de la ultima estimulacion en 4 clones citolfticos. Las bandas 1, 3, 4 y 5 muestran los clones de Treg y la banda 2 un clon de linfocito T efector CD4+ espedfico de p21-25. Se uso beta-actina como control.
Panel D: Deteccion por ELISA de citoquinas en 4 clones despues de 3 dfas de estimulacion con esplenocitos empobrecidos en linfocitos T irradiados, obtenidos de ratones sin tratamiento previo, y cargados con mp21-35Asn
La figura 13 muestra la induccion de apoptosis en celulas presentadoras de antfgeno de acuerdo con una realizacion de la invencion.
Parte A: Panel izquierdo: Incubacion (18 horas) de linfocitos B esplenicos precargados con p21-35 con clon de linfocito T R3TB7 (relacion 2/1).
Panel derecho: Incubacion (18 horas) de linfocitos B esplenicos precargados con p21-35 con un clon de linfocitos T efectores CD4+ de control. Las areas blancas con lrneas de trazos representan la expresion de caspasa-3 en linfocitos B cultivados sin linfocitos T; las areas grises con lrneas negras muestran la expresion de caspasa 3 en presencia del clon de Treg citolftico (panel izquierdo) o del clon efector CD4+ (panel derecho). Tincion con anticuerpo contra la caspasa 3 escindida. Los datos representan la evaluacion de un mmimo de 3 experimentos independientes.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Parte B: Panel izquierdo: Celulas dendnticas (celulas dendnticas CD11c+ activadas por LPS)
Panel derecho: Celulas WEHI
Ambos tipos de celulas se cargan con p21-35 y se cocultivan con Treg R3TB7 (areas negras) o un clon no citolftico de control de la misma especificidad (G221 N) (areas blancas). La apoptosis se mide usando un anticuerpo contra la caspasa 3 escindida. El recuento de celulas se refiere al numero de celulas WEHI que sobreviven despues de 18 horas de incubacion. Datos representativos de dos experimented. El % de supresion indicado es el % de supresion de crecimiento de Wehi por R3TB7.
Parte C: Panel izquierdo: Incubacion de celulas WEHI (cargadas con p21-35met e incubadas con Treg R3TB7 (relacion 1/1)) con anticuerpo anti-FasL.
Panel derecho: Incubacion de celulas WEHI (cargadas con p21-35met e incubadas con Treg R3TB7 (relacion 1/1)) con un peptido antagonista de GZ-B (Z-AAD-CMK) (cuadrados negros) o un inhibidor qmmico de serina proteasas (DCIC: 3,4-dicloroiso-cumarina) (cuadrados blancos).
Parte D: Panel izquierdo: Apoptosis medida por la expresion de anexina V (area gris) de celulas dendnticas (celulas CD11c+ cargadas con p21-35 e incubadas en presencia de Treg G121 en una relacion 1/1 durante 18 horas)
Panel derecho: como en el panel izquierdo, pero las DC y linfocitos Treg estan separados por una membrana semipermeable en un sistema de cultivo en transpocillos.
(Area blanca (oculta en el panel D) representa la union de anexina V en DC sin linfocitos T citotoxicos). Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.
Parte E: Dos poblaciones de celulas WEHI se marcaron con CFSE 80 nM o 300 nM y se incubaron durante 1 hora con p21-35 o p71-85, respectivamente. Despues las celulas se incubaron con Treg G121 (panel izquierdo) o con linfocitos T efectores CD4+ de control (panel derecho). La union de anexina V se analizo por citometna de flujo despues de una incubacion de 18 horas.
Figura 14: Supresion de linfocitos T inespecfticos (bystander) por linfocitos T citotoxicos de acuerdo con una realizacion de la invencion.
Parte A: Analisis por FACS de celulas tenidas con CFSE de celulas el bazo CD4+CD25(-), incubadas con esplenocitos con reduccion drastica de linfocitos T usados como APC, anticuerpo anti-CDr 1 pg/ml, p21-35 1 pg/ml, y una lmea de linfocitos Treg. Se uso una relacion 1/3 de Treg frente a linfocitos T CD4+CD25(-) en placas de cultivo de poliestireno sin recubrir con pocillos con forma de V para optimizar el contacto celular.
Paneles izquierdos: Lmea de linfocitos Treg citolfticos G121
Paneles medios: Lmea de linfocitos Treg citolfticos R3TB7
Paneles izquierdo: Cultivo de celulas de control en donde los Treg citolfticos se sustituyen por esplenocitos CD4+CD25(-) no marcados (paneles derechos). El numero de celulas, las divisiones celulares y el tamano celular se evaluaron por Facs despues de seleccion de las celulas vivas.
Paneles superiores: incubacion durante 48 horas
Paneles inferiores: incubacion durante 72 horas
Parte B: Analisis de la union de anexina V en linfocitos T CD4+CD25(-) marcados con CFSE despues de cocultivo con la lmea de linfocitos Treg R3TB7 despues de 18 horas (panel medio) y despues de 24 horas (panel derecho). El panel izquierdo muestra un cocultivo de control (24 horas) sin Treg citolfticos.
Parte C: Experimento con las configuraciones experimentales de los paneles inferiores de la parte A, pero las divisiones de CFSE se evaluaron despues de 72 h de cocultivo (excepto para el panel izquierdo), sin EGTA y sin lmea de linfocitos Treg citolfticos (panel izquierdo), en presencia de EGTA 2 mM (panel medio) o de EGTA 4 mM (panel derecho). Parte D: Marcaje de un clon de celulas Th2 especfticas de Der p 1 con CFSE y cocultivo durante 72 h con esplenocitos empobrecidos en linfocitos T cargados con peptido cognado (aminoacidos 114 a 128 de Der p 1). La seleccion se hizo en celulas positivas para CFSE y negativas para yoduro de propidio. El panel izquierdo muestra la proliferacion determinada en un desplazamiento de fluorescencia hacia la izquierda en presencia de las mismas celulas Th2 no marcadas (relacion 1/1). El segundo panel desde la izquierda muestra los resultados obtenidos tras la adicion de Treg G121 (relacion 1/1 con el clon de Th2) mas p21-35 (1 pg/ml) al cultivo, en presencia de un anticuerpo de control. Los siguientes 3 paneles (de izquierda a derecha) muestran los efectos obtenidos cuando se anadieron los anticuerpos FasL, GITR o Lag3 desde el principio del cocultivo con el clon citolftico. Cada anticuerpo se uso en concentracion de 10 pg/ml. Los porcentajes son para la proporcion de celulas marcadas con CFSe negativas para PI dentro de la poblacion total de celulas CFSE.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Parte E: Incubacion de un clon de Th1 marcado con CFSE espedfico para p71-85 de Der p 2, durante 72 horas con un numero igual del mismo clon no marcado (panel izquierdo). La proliferacion se muestra como un desplazamiento de la fluorescencia hacia la derecha. Este experimento se repitio pero sin sustituir el clon no marcado por un Treg citolftico en un solo pocillo (panel medio), o en dos pocillos separados por una membrana transpocillo (panel derecho). La relacion de celulas era 1/1. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. Los histogramas representan celulas marcadas con CFSE negativas para PI.
Parte F: Incubacion de esplenocitos empobrecidos en linfocitos T con un clon de Th1 espedfico para p71-85 marcado con CFSE durante 18 horas. El peptido p71-85 se anadio para activar el clon en cada caso excepto para el control (panel izquierdo alejado). A este cultivo, se anadio un clon de celulas de control con p830-844 con su peptido espedfico (panel izquierdo), o un clon citolftico (R3TB7) con o sin el peptido p21-35 (paneles derecho alejado y derecho, respectivamente). La relacion de celulas era 1/1. Se muestran graficas de densidad de puntos. Los resultados se expresan como los valores de FSC medios (valor superior, negro) y porcentajes de celulas CFSE que forman blastos (valor inferior, gris). La formacion de blastos se calculo a partir del tamano celular en celulas positivas para CFSE en la separacion de linfocitos que viven (establecido en las graficas de FSC / SSC). La separacion de linfocitos en reposo se ajusto respecto a la region que mostraba la mayor densidad de celulas no estimuladas (panel izquierdo alejado). Los datos son representativos de al menos 3 experimentos.
La figura 15 muestra la localizacion de Treg citolfticos en los pulmones en ratones expuestos a alergeno y la induccion in vivo de apoptosis por linfocitos B presentadores de anftgeno de acuerdo con una realizacion de la invencion.
A: Linfocitos B esplenicos aislados por perlas magneticas de ratones BALB/c sin tratamiento previo, se transdujeron con un vector retrovmco que codificaba 21-35 y la protema gp75. El panel izquierdo representa linfocitos B incubados durante 18 horas con un clon de linfocitos T citolfticos (relacion 2/1). El panel derecho representa el mismo ensayo pero llevado a cabo con una celula efectora CD4+ de control. Las curvas de trazos representan la tincion anti-caspasa 3 en linfocitos B cultivados sin linfocitos T.
B: Se administraron 5x106 linfocitos B transducidos con p21-35 via IV a cada raton (n=6) seguido 5 dfas mas tarde de 5x105 Treg citolfticos. Dos semanas mas tarde, los ratones se sacrificaron y se prepararon las celulas de bazo y pulmones por purificacion por gradiente de densidad y seleccion con CD19+ usando perlas magneticas. La presencia de ARNm que codifica la construccion retrovmca usada para generar linfocitos B transgenicos se detecto por PCR. Un grupo de ratones (n=6) recibio los linfocitos B transducidos pero no linfocitos T citolfticos, se trato de la misma forma. Se analizaron 6 ratones de cada grupo y los resultados representativos se muestran en las bandas A para los bazos de 2 ratones, tratados con Treg citolfticos y en la bandas B para 2 ratones del grupo de control.
C: Se administraron 5x105 Vp8.1 + Treg citolfticos, o un V8.1+ clon de linfocitos T de control, via IV a ratones BALB/c sin tratamiento previo, seguido 24 h mas tarde de tres instilaciones nasales con 100 microgramos de Der p 2. Dos semanas mas tarde, los ratones se sacrificaron y los linfocitos de los pulmones se prepararon por centrifugacion por gradiente de densidad. La proporcion de celulas que expresaban Vbeta.8.1 se calculo por Facs dentro de la poblacion de celulas CD4+. Los resultados se expresan como el % medio ± e.e.m. de 6 ratones de cada grupo. el % CD4 es el porcentaje de CD4 dentro de la poblacion linfocftica total; % Vb8.1 es el porcentaje de celulas que expresan Vb8.1 dentro de la poblacion total de celulas CD4.
La figura 16 muestra la prevencion (a-f) y la supresion (g-l) de asma experimental por lo clones de Treg citolfticos de acuerdo con una realizacion de la invencion. Los paneles A a F muestran datos de ratones tratados con Treg citolfticos especfticos para mp21-35Asn (clones T1 y T3) antes de sensibilizacion IP con Der p 2. (El "clon de linfocito T de control" es espedfico para el peptido 830-844 de toxoide tetanico, el "modelo Der P 2" se refiere a experimentos en donde no se administran celulas a las celulas).
En los paneles G a L los ratones se trataron con las lmeas celulares anteriores despues de sensibilizacion IP con Der p 2
Los paneles A y H muestran el numero de celulas de BALF total;
Los paneles B y H muestran los recuentos de celulas de BALF diferenciales;
Los paneles C e I muestran citoquinas de BALF medidas por ELISA;
Los paneles D y J muestran una puntuacion semicuantitativa para la infiltracion pulmonar por eosinofilos y linfocitos.
Los paneles E y K muestran el recuento de celulas calciformes. Los resultados se expresan como la proporcion (%)
de celulas calciformes dentro de la poblacion de celulas epiteliales despues de tincion con PAS;
Los paneles F y L muestran la hiperreactividad de vfas aereas evaluada por inhalacion de concentraciones crecientes de metacolina. Los valores de PenH se determinaron usando un pletismografo de cuerpo entero. Los resultados se muestran como el "area bajo la curva" (AUC) para valores de PenH. Para comparacion, se muestran
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
los valores de AUC obtenidos en ratones sin tratamiento previo en un experimento independiente (naive). Este grupo da valores base tanto en ensayos de prevencion como de supresion.
Los datos representan resultados de un mmimo de 5 ratones por grupo. Las barras representan la media ± e.e.m. *P < 0,05, **P < 0,01 comparado (P valor de una cola) respecto al modelo de Der p 2.
La figura 17 muestra la induccion de apoptosis por la lrnea de linfocitos T CD4 efectores espedfica para el epftopo de linfocitos T Der pi (114-128), marcada con CFSE e incubada con APC cargadas con el correspondiente peptido (114-128) (panel superior) de acuerdo con una realizacion de la invencion. El panel inferior muestra la mortalidad base (40%) cuando un numero identico de celulas efectoras (no marcadas) sustituye al clon de linfocito T regulador.
La figura 18A muestra el recuento de celulas diferencial en BALF despues de instilaciones nasales con 100|jg de Der p1 (modelo) o NaCl (negativo). Se realizo en los ratones la transferencia adoptiva de linfocitos T citolfticos antes (prevencion) o despues (supresion) de la primera serie de instilaciones nasales con Der p 1. Las barras representan media ± EEM, *p<0,05; **p<0,01 comparado con el grupo negativo.
La figura 18B muestra la puntuacion de histologfa despues de transferencia adoptiva de linfocitos T citolfticos de acuerdo con una realizacion de la invencion. Se establecieron las puntuaciones para los infiltrados de eosinofilos, linfocitos y plasmocitos usando una escala de 0 a 6 (sin lesion para infiltrado masivo). Los ratones recibieron 2 series de 3 instilaciones nasales con 100 jg de Der p 1 (modelo) o NaCl (negativo). Se llevo a cabo en los ratones la transferencia adoptiva de linfocitos T citolfticos antes (prevencion) o despues (supresion) de la primera serie de instilacion nasal con Der p 1. Las barras representan media ± EEM, *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 comparado con el grupo modelo.
La figura 19A muestra la produccion de TNF-alfa (histogramas en negro) y de IFN-gamma (histogramas en gris) de clones citolfticos estimulados con APC no usando peptido, usando peptido p21-35 de tipo natural (C-x-x-S), o p21-35 mutado Ser24Cys (C-x-x-C) de acuerdo con una realizacion de la invencion.
La figura 19B muestra la deteccion por PCR semicuantitativa de transcritos de granzimas (bandas 1 a 3) y Fas-L (bandas 6 a 8). Un clon citotoxico se estimulo con APC cargadas con p21-35 de tipo natural (bandas 1, 6), p21-25 modificado Ser24Cys (bandas 2, 7) o sin peptido (bandas 3, 8). Las bandas 4 y 5 son marcadores de peso molecular.
La figura 20 muestra la apoptosis de linfocitos T efectores marcados con CFSE y cocultivados con celulas APC de acuerdo con una realizacion de la invencion. Las barras indican linfocitos T efectores no marcados y peptido MOG de tipo natural: Tefectores wtMOG; celulas Tr y peptido MOG no modificado: Tr wtMOG; celulas Tr y peptido MOG modificado que contiene la secuencia de tiorredoxina: Tr CsMOG). Los linfocitos T CD4+ CD25+ se obtuvieron de animales inmunizados con peptido MOG que contema una secuencia consenso de tiorredoxina (CSMOG). Las celulas efectoras CD4+CD25- se obtuvieron de animales EAE (Tefectores).
La figura 21 muestra el efecto de la inyeccion de peptido MOG modificado en el desarrollo de EM en un modelo de raton. (0: sin enfermedad, 1: cola flacida, 2: cola flacida y perdida de peso mayor de 10%, 3: paralisis parcial de las extremidades traseras, 4: paralisis completa de las extremidades traseras). Modelo: 3 ratones C57BL/6 recibieron, el dfa 0, inyeccion SC de 100 jg de peptido MOG/400 jg de Mycobacterium butyricum en CFA e inyeccion ip de 300 ng de Bortetella pertussis en NaCl. El dfa +2, se les dio una segunda inyeccion de B. pertussis. Transferencia adoptiva: 3 ratones recibieron inyeccion ip de 500.000 Treg, 24 h antes de la induccion de la enfermedad como en el grupo modelo.
La figura 22 muestra la puntuacion clmica de los ratones con y sin la prevencion por inyeccion del peptido MOG en un modelo de esclerosis multiple.
La figura 23 muestra la induccion in vitro de apoptosis en celulas CD4 policlonales marcadas con CFSE de dos esplenocitos de ratones NOD. Estas celulas se cocultivaron con APC cargadas con peptido GAD65 524-543 [SEQ ID. NO: 34] junto con celulas CD4 policlonales purificadas de ratones NOD tratados con peptido modificado. La figura muestra la tincion de las celulas CD4 diana con 7-AAD y anexina V-PE. La tabla representa el porcentaje de celulas positivas dobles (celulas muertas).
Descripcion detallada
Definiciones
El termino "peptido" como se usa en la presente memoria se refiere a una molecula que comprende una secuencia de aminoacidos de entre 2 y 200 aminoacidos, conectados por enlaces peptfdicos, pero que, en una realizacion particular, pueden comprender estructuras que no son aminoacidos (como por ejemplo un compuesto organico conector). Los peptidos de acuerdo con la invencion pueden contener cualquiera de los 20 aminoacidos convencionales o versiones modificadas de los mismos, o pueden contener aminoacidos que no se encuentran de forma natural, incorporados mediante smtesis qrnmica de peptidos o por modificacion qrnmica o enzimatica.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
El termino "antigeno" como se usa en la presente memoria se refiere a una estructura de una macromolecula, tipicamente protema (con o sin polisacaridos) o hecha de composicion proteica que comprende uno o mas haptenos y comprende epftopos de linfocitos T. La expresion "protema antigena" como se usa en la presente memoria se refiere a una protema que comprende uno o mas epftopos de linfocitos T. Un autoantfgeno o protema autoantigena como se usa en la presente memoria se refiere a una protema humana o animal presente en el cuerpo, que produce una respuesta inmunitaria dentro del mismo cuerpo humano o animal.
La expresion "protema antigena alimentaria o farmaceutica" se refiere a una protema antigena presente de forma natural en un alimento o producto farmaceutico, tal como en una vacuna.
El termino "epftopo" se refiere a una o varias partes (que pueden definir un epftopo conformacional) de una protema antigena que es/son reconocidas espedficamente y a las que se unen un anticuerpo o una parte del mismo (Fab', Fab2', etc.) o un receptor presentado en la superficie de la celula de un linfocito B o T, y que mediante dicha union es capaz de inducir una respuesta inmunitaria.
La expresion "epftopo de linfocito T" en el contexto de la presente invencion, se refiere a un epftopo de linfocito T subdominante o menor, es decir, una parte de una protema antigena que es reconocida espedficamente y a la que se une un receptor en la superficie celular de un linfocito T. El que un epftopo sea dominante, subdominante o menor depende de la reaccion inmunitaria producida contra el epftopo. La dominancia depende de la frecuencia con la que dichos epftopos son reconocidos por linfocitos T y son capaces de activarlos, entre todos los posibles epftopos de linfocitos T de una protema.
En realizaciones particulares, un epftopo de linfocito T es un epftopo reconocido por moleculas MHC de clase II, que consisten en una secuencia de +/- 9 aminoacidos que encajan en la hendidura de la molecula MHC II. Dentro de una secuencia de peptido que representa un epftopo de linfocito T, los aminoacidos en el epftopo se numeran de P1 a P9, los aminoacidos N terminales del epftopo se numeran P-1, P-2 etc., los aminoacidos C terminales del epftopo se numeran P+1, P+2 etc., como se ilustra en la figura 3A.
El termino "homologo" como se usa en la presente memoria con referencia a los epftopos usados en el contexto de la invencion, se refiere a moleculas que tienen una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos 50%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% con el epftopo que se encuentra de forma natural, a la vez que mantiene la capacidad del epftopo de unirse a un anticuerpo o receptor de superficie celular de un linfocito B y/o T. Realizaciones particulares de homologos de un epftopo corresponden al epftopo natural modificado en como maximo 3, mas en particular como maximo 2, mas en particular en un aminoacido.
El termino "derivado" como se usa en la presente memoria con referencia a los peptidos de la invencion, se refiere a moleculas que contienen al menos la parte activa del peptido (es decir, capaz de producir la actividad de linfocitos T CD4+ citolfticos) y, ademas de esta, comprende una parte complementaria que puede tener diferentes fines tales como estabilizar los peptidos o alterar las propiedades farmacocineticas o farmacodinamicas del peptido.
La expresion "identidad de secuencias" de dos secuencias como se usa en la presente memoria se refiere al numero de posiciones con nucleotidos o aminoacidos identicos dividido entre el numero de nucleotidos o aminoacidos en la mas corta de las secuencias, cuando se alinean las dos secuencias. En realizaciones particulares, dicha identidad de secuencia es de 70% a 80%, de 81% a 85%, e 86% a 90%, de 91% a 95%, de 96% a 100%, o 100%.
Las expresiones "polinucleotido (o acido nucleico) codificante de peptido" y "polinucleotido (o acido nucleico) que codifica un peptido", como se usan en la presente memoria, se refieren a una secuencia de nucleotidos, que cuando se expresan en un entorno adecuado, producen la generacion de la secuencia peptfdica relevante o un derivado y homologo de la misma. Dichos polinucleotidos o acidos nucleicos incluyen las secuencias normales que codifican los peptidos, asf como derivados y fragmentos de los acidos nucleicos capaces de expresar un peptido con la actividad requerida. De acuerdo con una realizacion, el acido nucleico que codifica los peptidos de acuerdo con la invencion o fragmento del mismo, es una secuencia que codifica el peptido o fragmento del mismo procedente de un mairftfero, o que corresponde a un mairftfero, mas en particular un fragmento de peptido humano.
La expresion "compuesto organico que tiene una actividad reductora" se refiere, en el contexto de esta invencion, a compuestos, mas en particular secuencias de aminoacidos, con una actividad de reduccion de enlaces disulfuro en protemas. La expresion "trastornos inmunitarios" o "enfermedades inmunitarias" se refiere a enfermedades en donde una reaccion del sistema inmunitario es responsable de o mantiene un mal funcionamiento o situacion no fisiologica en un organismo. Estan incluidos en los trastornos inmunitarios, entre otros, trastornos alergicos y enfermedades autoinmunitarias.
Las expresiones "enfermedades alergicas" o "trastornos alergicos" como se usan en la presente memoria, se refieren a enfermedades caracterizadas por reacciones de hipersensibilidad del sistema inmunitario frente a sustancias espedficas llamadas alergenos (tales como polen, picaduras, farmacos o alimentos). La alergia es el conjunto de signos y smtomas observados siempre que un paciente individual atopico encuentra un alergeno al que ha sido sensibilizado, que puede producir el desarrollo de diferentes enfermedades, en particular enfermedades respiratorias y smtomas tales como asma bronquial. Existen varios tipos de clasificaciones y la mayona de los trastornos alergicos tienen diferentes nombres dependiendo de en que sitio del cuerpo del marnffero ocurre.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
"Hipersensibilidad" es una reaccion no deseable (que produce dano, incomodidad y a veces es mortal) producida en un individuo tras la exposicion a un antigeno al cual se ha sensibilizado; la "hipersensibilidad inmediata" depende de la produccion de anticuerpo IgE, y por lo tanto es equivalente a una alergia.
Las expresiones "enfermedad autoinmunitaria" o "trastorno autoinmunitario" se refieren a enfermedades que resultan de una respuesta inmunitaria aberrante de un organismo contra sus propias celulas o tejidos, debido a un fallo del organismo para reconocer sus propias partes constituyentes (hasta el nivel submolecular) como "propias". El grupo de enfermedades se puede dividir en dos categonas, enfermedades espedficas de organo y sistemicas.
Un "alergeno" se define como una sustancia, normalmente una macromolecula o una composicion protema que produce la produccion de anticuerpos IgE en pacientes individuales (atopicos) predispuestos, en particular geneticamente dispuestos. Se presentan definiciones similares en Liebers et al. (1996) Clin. Exp. Allergy 26, 494516.
La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad del peptido de la invencion o derivado del mismo, que produce el efecto terapeutico o preventivo deseado en un paciente. Por ejemplo, en referencia a una enfermedad o trastorno, es la cantidad que reduce en alguna medida uno o mas smtomas de la enfermedad o trastorno, y mas en particular, devuelve a la normalidad, parcial o completamente, los parametros fisiologicos o bioqmmicos asociados con o causantes de la enfermedad o trastorno. De acuerdo con una realizacion particular de la presente invencion, la cantidad terapeuticamente eficaz es la cantidad del peptido de la invencion o derivado del mismo, que conducira a una mejora o restablecimiento de la situacion fisiologica normal. Por ejemplo, cuando se usa para tratar terapeuticamente a un mamfero que padece un trastorno inmunitario, es una cantidad diaria de peptido/kg de peso corporal de dicho mamfero. Alternativamente, cuando la administracion es a traves de terapia genica, la cantidad de ADN desnudo o vectores vfticos, se ajusta para asegurar la produccion local de la dosis relevante del peptido de la invencion, derivado u homologo del mismo.
El termino "natural" cuando se refiere a un peptido o una secuencia en la presente memoria, se refiere al hecho de que la secuencia es identica a una secuencia que se encuentra de forma natural. En contraste con esto, el termino "artificial" se refiere a una secuencia o peptido que como tal, no se encuentra en la naturaleza. Opcionalmente, una secuencia artificial se obtiene de una secuencia natural mediante modificaciones limitadas tales como el cambio de uno o mas aminoacidos dentro de la secuencia natural o por adicion de aminoacidos N o C terminales de una secuencia natural. Los aminoacidos en la presente memoria se nombran con su nombre completo, su abreviatura de tres letras o su abreviatura de una letra.
Los motivos de secuencia de aminoacidos se escriben en la presente memoria en el formato de Prosite. El sfmbolo X se usa para una posicion donde un aminoacido es aceptado. Las alternativas se indican citando los aminoacidos aceptables para una posicion dada, entre corchetes ('[ ]'). Por ejemplo: [CST] representa un aminoacido seleccionado de Cys, Ser o Thr. Los aminoacidos que estan excluidos como alternativas se indican citandolos entre llaves ('{ }'). Por ejemplo: {AM} representa cualquier aminoacido excepto Ala y Met. Los diferentes elementos en un motivo estan separados unos de otros por un guion -. La repeticion de un mismo elemento dentro de un motivo se puede indicar poniendo detras de ese elemento un valor numerico o un intervalo numerico entre parentesis. Por ejemplo: X(2) corresponde a X-X, X(2, 4) corresponde a X-X o X-X-X o X-X-X-X , A(3) corresponde s A-A-A.
La presente invencion se basa en el descubrimiento de que un peptido que comprende un epftopo de linfocito T y una secuencia peptfdica, que tiene actividad reductora, es capaz de generar una poblacion de linfocitos T reguladores que tiene un efecto citotoxico en las celulas presentadoras de antfgeno.
Por consiguiente, en su sentido mas amplio, la invencion se refiere a peptidos que comprenden al menos un epftopo de linfocito T de un antfgeno (propio o no propio) con el potencial para producir una reaccion inmunitaria, acoplado a un compuesto organico que tiene actividad reductora, tal como un motivo de secuencia de tiorreductasa. El epftopo de linfocito T y el compuesto organico estan opcionalmente separados por una secuencia conectora. En realizaciones opcionales adicionales, el peptido comprende adicionalmente una secuencia que dirige al endosma y/o secuencias "flanqueadoras" adicionales.
Los peptidos de la invencion se pueden representar esquematicamente como A-L-B o B-L-A, en donde A representa un epftopo de linfocito T de un antfgeno (propio o no propio) con un potencial para producir una reaccion inmunitaria, L representa un conector y B representa un compuesto organico que tiene una actividad reductora.
La actividad reductora de un compuesto organico se puede ensayar por su capacidad para reducir un grupo sulfhidrilo tal como en el ensayo de solubilidad de insulina descrito en los ejemplos en la presente memoria, en donde se altera la solubilidad de la insulina tras la reduccion, o con una insulina marcada de modo fluorescente. El compuesto organico reductor se puede acoplar al extremo amino del epftopo de linfocito T o en el extremo carboxi del epftopo de linfocito T.
En general, el compuesto organico con actividad reductora es una secuencia peptfdica. Se encuentran fragmentos peptfdicos con actividad reductora en tiorreductasas que son enzimas reductoras de disulfuro pequenas que incluyen glutarredoxinas, nucleorredoxinas, tiorredoxinas y otras tiol/disulfuro oxidorreductasas (Holmgren (2000) Antioxid Redox Signal 2, 811-820; Jacquot et al. (2002) Biochem Pharm 64, 1065-1069). Son multifuncionales,
5
10
15
20
25
30
35
ubicuas y se encuentran en muchas procariotas y eucariotas. Ejercen actividad reductora para enlaces disulfuro en protemas (tales como enzimas) a traves de las cistemas activas redox dentro de las secuencias consenso de dominio activo conservado: C-X(2)-C, C-X(2)-S, C-X(2)-T, S-X(2)-C, T-X(2)-C (Fomenko et al. (2003) Biochemistry 42, 11214-11225; Fomenko et al. (2002) Prot. Science 11: 2285-2296), en las que X representa cualquier aminoacido. Dichos dominios tambien se encuentran en protemas mayores tales como la protema disulfuro isomerasa (PDI) y fosfolipasa C espedfica de fosfoinosftido (tabla 1).
Tabla 1: Aparicion del motivo CST-X(2)-CST en protemas reductoras representativas
Organismo Longitud posicion en la protema de estructura secundaria y descripcion
de la C-X(2)-S flanqueadora de C-X(2)-S n°
protema
D. pteronyssinus
129 21-25 b-CHGS-espiral alergeno Der p 2
E. coli K12
115 30-35 b-CGFS-a Glutarredoxina
E. coli K12
104 14-18 b-CGTS-a arsenato reductasa
S. cerevisiae
203 108-112 b-CPYS-a homologo de glutarredoxina
S. cerevisiae
231 136-140 b-CSYS-a homologo de glutarredoxina
S. cerevisiae
517 62-66 b-CLHS-a protema disulfuro isomerasa
H. sapiens
793 72-78 b-CGHS-a homologo de
tiorredoxina
n° b: cadena beta; A: helice alfa
Por consiguiente, en realizaciones particulares, los peptidos de acuerdo con la presente invencion comprenden el motivo de la secuencia de tiorreductasa [CST]-X(2)-[CST] en donde al menos uno de [CST] es Cys; por lo tanto, el motivo es [C]-X(2)-[CST] o [CST]-X(2)-[C]. En la presente solicitud dicho tetrapeptido se denominara "el motivo". En realizaciones particulares, los peptidos de la invencion contienen el motivo de secuencia [C]-X(2)-[CS] o [CS]-X(2)- [C]. En realizaciones mas particulares, los peptidos contienen el motivo de secuencia C-X(2)-S, S-X(2)-C o C-X(2)-C.
Como se explica en detalle mas adelante, los peptidos de la presente invencion se pueden hacer por smtesis qrnmica, que permite la incorporacion de aminoacidos no naturales. Por consiguiente, en el motivo de los compuestos reductores de acuerdo con realizaciones particulares de la presente invencion, C representa cistema u otros aminoacidos con un grupo tiol tal como mercaptovalina, homocistema u otros aminoacidos naturales o no naturales con una funcion tiol. Con el fin de tener actividad reductora, las cistemas presentes en el motivo no deben estar como parte de un puente disulfuro de cistemas. No obstante, el motivo puede comprender cistemas modificadas tales como cistema metilada, que se convierte en cistema con grupos tiol libres in vivo.
El aminoacido X en el motivo [CST]-X(2)-[CST] de realizaciones particulares de los compuestos reductores de la invencion puede ser cualquier aminoacido natural, incluyendo S, C o T, o puede ser un aminoacido no natural. En realizaciones particulares, X es un aminoacido con cadena lateral pequena tal como Gly, Ala, Ser o Thr. En realizaciones particulares adicionales, X no es un aminoacido con una cadena lateral voluminosa tal como la Tyr. En realizaciones particulares adicionales al menos un X en el motivo [CST]-X(2)-[CST] es His o Pro.
En los peptidos de la presente invencion que comprenden el motivo descrito antes como el compuesto reductor, el motivo esta situado de modo que cuando el epftopo encaje en la hendidura de MHC, el motivo permanece fuera de la hendidura de union del MHC. El motivo esta situado inmediatamente adyacente a la secuencia de epftopo dentro del peptido, o esta separado del epftopo de linfocito T por un conector. Mas en particular, el conector comprende una secuencia de aminoacidos de 7 aminoacidos o menos. Mas en particular, el conector comprende 1, 2, 3 o 4 aminoacidos. Alternativamente, el conector puede comprender 6, 8 o 10 aminoacidos. En aquellas realizaciones particulares de los peptidos de la invencion donde la secuencia del motivo esta adyacente a la secuencia del epftopo, esto se indica como la posicion P-4 a P-1 o P+1 a P+4 comparado con la secuencia del epftopo.
Ademas del conector peptfdico, se pueden usar otros compuestos organicos como conectores para unir las partes del peptido entre sf, (p. ej., el motivo de la secuencia de epftopo de linfocito T).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Los peptidos de la presente invencion pueden comprender ademas secuencias de aminoacidos cortas adicionales N o C terminales de la secuencia (artificial) que comprende el epftopo de linfocito T y el compuesto reductor (motivo). Dicha secuencia de aminoacidos en general se denomina en la presente memoria como "secuencia flanqueadora". Una secuencia flanqueadora puede estar situada entre el epftopo y una secuencia que dirige al endosoma y/o entre el compuesto reductor (p. ej., motivo) y una secuencia que dirige al endosoma. En realizaciones adicionales, que no comprenden una secuencia que dirige al endosoma, puede estar presente una secuencia de aminoacidos corta N o C terminal del compuesto reductor y/o secuencia de epftopo en el peptido. Mas en particular, una secuencia flanqueadora es una secuencia de entre 1 y 7 aminoacidos, mas en particular una secuencia de 2 aminoacidos.
En realizaciones particulares de los peptidos de la invencion, el motivo esta situado N-terminal desde el epftopo.
En realizaciones particulares adicionales, donde el motivo presente en el peptido contiene una cistema, esta cistema esta presente en el motivo en la posicion remota desde el epftopo, por lo tanto el motivo aparece como C-X(2)-[ST] o C-X(2)-S N terminal del epftopo, o aparece como [ST]-X(2)-C o S-X(2)-C C terminal del epftopo.
En algunas realizaciones de la presente invencion, se proporcionan peptidos que comprenden una secuencia de epftopo y una secuencia de motivo. En realizaciones particulares adicionales, el motivo aparece varias veces (1, 2, 3, 4 o incluso mas veces) en el peptido, por ejemplo, como repeticiones del motivo que pueden estar separadas unas de otras por uno o mas aminoacidos (p. ej. CXXC X CXXC X CXXC), como repeticiones que son adyacentes entre sf (CXXC CXXC CXXC) o como repeticiones que se superponen entre si CXXCXXCXXC o CXCCXCCXCC). Alternativamente, se proporcionan uno o mas motivos tanto en el extremo N como el C de la secuencia de epftopo de linfocito T.
Otras variaciones contempladas para los peptidos de la presente invencion incluyen peptidos que contienen repeticiones de una secuencia de epftopo de linfocito T, en donde cada secuencia de epftopo esta precedida y/o seguida del motivo (p. ej., repeticiones de "motivo-epftopo" o repeticiones de "motivo-epftopo-motivo"). En la presente memoria, los motivos pueden tener todos la misma secuencia, pero esto no es obligatorio. Hay que indicar que las secuencias repetitivas de peptidos que comprenden un epftopo que comprende en el mismo el motivo, tambien dara como resultado una secuencia que comprende tanto el "epftopo" como un "motivo". En dichos peptidos, el motivo dentro de una secuencia de epftopo funciona como un motivo fuera de una segunda secuencia de epftopo.
Sin embargo, en realizaciones particulares, los peptidos de la presente invencion comprenden solo un epftopo de linfocito T.
Por consiguiente, los peptidos de acuerdo con la presente invencion comprenden, ademas de un compuesto reductor, un epftopo de linfocito T derivado de un antfgeno, tfpicamente un alergeno o un autoantfgeno, dependiendo de la aplicacion. Como se describe mas adelante, un epftopo de linfocito T en una secuencia de protema se puede identificar por ensayos funcionales y/o uno o mas ensayos de prediccion in silico. Los aminoacidos en una secuencia de epftopo de linfocito T se numeran de acuerdo con su posicion en la hendidura de union a las protemas MHC. En realizaciones particulares, el epftopo de linfocito T presente dentro de los peptidos de la invencion consiste en entre 8 y 25 aminoacidos, todavfa mas en particular entre 8 y 16 aminoacidos, todavfa lo mas en particular consiste en 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 aminoacidos. En una realizacion mas particular, el epftopo de linfocito T consiste en una secuencia de 9 aminoacidos. En una realizacion particular adicional, el epftopo de linfocito T es un epftopo que es presentado a los linfocitos T por moleculas MHC de clase II. En realizaciones particulares de la presente invencion, la secuencia del epftopo de linfocito T es una secuencia de epftopo que encaja en la hendidura de una protema MHC II, mas en particular un nonapeptido que encaja en la hendidura de MHC II.
El epftopo de linfocito T de los peptidos de la presente invencion puede corresponder a una secuencia de epftopo natural de una protema o pude ser una variante modificada de la misma, con la condicion de que el epftopo de linfocito T retenga su capacidad para unirse dentro de la hendidura del MHC, similar a la secuencia de epftopo de linfocito T natural. El epftopo de linfocito T modificado puede tener la misma afinidad de union por la protema MHC que el epftopo natural, pero tambien puede tener una menor afinidad. En realizaciones particulares, la afinidad de union del peptido modificado no es menor que 10 veces menos que la del peptido original, mas en particular no menor que 5 veces menos. Es un descubrimiento de la presente invencion que los peptidos de la presente invencion tienen un efecto estabilizante en complejos de protemas. Por consiguiente, el efecto estabilizante del complejo de peptido-MHC compensa la menor afinidad del epftopo modificado por la molecula de MHC. Un ejemplo de esto, es la sustitucion lle28Asn del peptido p21-25 de Der p 2, que a pesar de su menor afinidad por la hendidura de MHC II, es capaz de producir la misma respuesta de linfocitos T que el peptido p21-35 de Der p 2 natural.
En realizaciones particulares, la secuencia que comprende el epftopo de linfocito T y el compuesto reductor dentro del peptido esta ademas unido a una secuencia de aminoacidos (u otro compuesto organico) que facilita la absorcion del peptido en endosomas tardfos para el procesamiento y presentacion dentro de los determinantes del MHC II. El direccionamiento a endosomas tardfos es mediado por senales presentes en la cola citoplasmatica de protemas y corresponde a motivos de peptidos bien identificados, tales como el motivo [DE]XXXL[LI] o DXXLL basados en dileucina (p. ej. DXXXLL), el motivo YXX0 basado en tirosina, o similares, llamados motivo de agrupacion acido. El sfmbolo 0 representa restos de aminoacidos con cadenas laterales hidrofobas voluminosas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
tales como Phe, Tyr y Trp. Las secuencias que dirigen al endosoma tardm permiten el procesamiento y la presentacion eficaz del epftopo de linfocito T derivado de antigeno por las moleculas de MHC de clase II. Dichas secuencias que dirigen al endosoma estan contenidas, por ejemplo, dentro de la protema gp75 (Vijayasaradhi et al. (1995) J Cell Biol 130, 807-820), la protema CD3 gamma humana, HLA-BM U (Copier et al. (1996) J. Immunol. 157, 1017-1027), la cola citoplasmatica del receptor DEC205, (Mahnke et al. (2000) J Cell Biol 151, 673-683). Se describen otros ejemplos de peptidos que funcionan como senales clasificadoras al endosoma en la revision de Bonifacio y Traub (2003) Annu. Rev. Biochem. 72, 395-447. Alternativamente, la secuencia puede ser la de un epftopo de linfocito T subdominante o menor de una protema, que facilita la absorcion en el endosoma tardm sin superar la respuesta de linfocitos T hacia el antigeno, es decir, alergeno o epftopo de linfocito T derivado de autoantigeno.
La secuencia que dirige al endosoma tardm puede estar situada en el extremo amino o en el extremo carboxi del alergeno o peptido derivado de autoantigeno para la absorcion eficaz y procesamiento, y tambien puede estar acoplada por una secuencia flanqueadora, tal como una secuencia de peptido de hasta 10 aminoacidos. Cuando se usa el epftopo de linfocito T menor para el proposito de dirigir, este ultimo tfpicamente esta situado en el extremo amino terminal del alergeno o peptido derivado de autoantfgeno.
Por consiguiente, la presente invencion contempla peptidos de protemas antfgenas y su uso para producir reacciones inmunitarias espedficas. Los peptidos de la presente invencion pueden corresponder a fragmentos de protemas que comprenden, dentro de su secuencia, las caractensticas de la presente invencion, es decir un compuesto reductor y un epftopo de linfocito T separado por como maximo 10, preferiblemente 7 aminoacidos o menos. Alternativamente, y para la mayona de las protemas antfgenas, los peptidos de la invencion se generan por acoplamiento de un compuesto reductor, mas en particular un motivo reductor como se describe en la presente memoria, N terminal o C terminal respecto a un epftopo de linfocito T de la protema antfgena (directamente adyacente a la misma o con un conector de como maximo 10, mas en particular como maximo 7 aminoacidos) para asf obtener las propiedades que caracterizan la invencion. Ademas, la secuencia de epftopo de linfocito T de la protema y/o el motivo se pueden modificar y/o se pueden introducir (o modificar) una o mas secuencias flanqueadoras y/o una secuencia directora, comparado con la secuencia que se encuentra de forma natural. Por lo tanto, dependiendo de si se pueden encontrar o no las caractensticas de la presente invencion dentro de la secuencia de la protema antfgena de interes, los peptidos de la presente invencion pueden comprender una secuencia que es "artificial" o "natural".
Los peptidos de la presente invencion pueden variar sustancialmente de longitud. En realizaciones particulares, cuando el compuesto reductor corresponde al motivo como se describe en la presente memoria, la longitud de los peptidos vana de 12-13 aminoacidos, es decir, consisten en un epftopo de 8-9 aminoacidos y adyacente al mismo el motivo como se describe en la presente memoria de 4 aminoacidos, hasta 50 o mas aminoacidos. Por ejemplo, un peptido de acuerdo con la invencion puede comprender una secuencia que dirige al endosoma de 40 aminoacidos, una secuencia flanqueadora de aproximadamente 2 aminoacidos, un motivo como se describe en la presente memoria de 4 aminoacidos, un conector de 4 aminoacidos y un peptido de epftopo de linfocito T de 9 aminoacidos.
Por consiguiente, en realizaciones particulares, los peptidos completos consisten en entre 12 aminoacidos y 20 hasta 25, 30, 50, 75, 100 o 200 aminoacidos. En una realizacion mas particular, los peptidos consisten entre 10 y 20 aminoacidos. Mas en particular, cuando el compuesto reductor es un motivo como se describe en la presente memoria, la longitud de la secuencia (artificial o natural) que comprende el epftopo y el motivo opcionalmente conectados por un conector (denominado en la presente memoria una secuencia de "epftopo-motivo"), dentro de la secuencia que dirige al endosoma, es crftica. Mas en particular, el "epftopo-motivo" tiene una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 aminoacidos, de forma optima 18 aminoacidos o menos. Dichos peptidos de 12 o 13 a 18 aminoacidos pueden estar acoplados opcionalmente a una senal que dirige al endosoma cuyo tamano no es crftico.
Como se ha detallado antes, en realizaciones particulares, los peptidos de la presente invencion comprenden un motivo reductor como se describe en la presente memoria conectado a una secuencia de epftopo de linfocito T. De acuerdo con una realizacion particular, los peptidos son peptidos de protemas que no comprenden dentro de su secuencia natural nativa una secuencia de aminoacidos con propiedades redox en la cercama (es decir, dentro de una secuencia de 11 aminoacidos N o C terminales) del epftopo de interes, mas espedficamente que no comprende en su secuencia natural nativa una secuencia consenso de tiorredoxina, glutarredoxina o tiorreductasas u homologos de las mismas, en la cercama del epftopo de interes. Mas en particular, la invencion abarca generar peptidos inmunogenos a partir de protemas antfgenas que no comprenden una secuencia seleccionada de C-X(2)-S, S-X(2)-C, C-X(2)-C, S-X(2)-S, C-X(2)-T, T-X(2)-C, o cualesquiera otras secuencias consenso que son tfpicas de secuencias consenso de tiorredoxina, glutarredoxina o tiorreductasas, en la cercama del epftopo de interes, es decir dentro de una secuencia de 11 aminoacidos N o C terminal de la secuencia del epftopo. En realizaciones particulares adicionales, la presente invencion proporciona peptidos inmunogenos de protemas antfgenas que no comprenden las secuencias de aminoacidos descritas antes con propiedades redox dentro de su secuencia. En realizaciones particulares adicionales, la protema antfgena no comprende de forma natural la secuencia C-H-G-S dentro de una secuencia de 11 aminoacidos N o C terminales de la secuencia de epftopo. Mas en particular, la presente invencion reivindica peptidos distintos de los peptidos que comprenden el epftopo EPCIIHRGKP [SEQ ID. NO: 1] del peptido p21-35 de Der p 2 (CHGSEPCIIHRGKPF [SEQ ID. NO: 2]) y el motivo C-H-G-S [SEQ ID. NO: 3], en particular aquellos peptidos donde este motivo esta situado N terminal de la secuencia de epftopo, puesto que
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
dichos peptidos corresponden a peptidos generados en la tecnica anterior y usados para inducir una respuesta inmunitaria en el contexto de la cartograffa de epftopos de Der p 2 (Wu et al. 2002, J. Immunol. 169, 2430-2435).
En realizaciones particulares adicionales, los peptidos de la invencion son peptidos que comprenden epftopos de linfocitos T que no comprenden una secuencia de aminoacidos con propiedades redox dentro de su secuencia natural.
Sin embargo, en realizaciones alternativas, el epftopo de linfocito T puede comprender cualquier secuencia de aminoacidos que asegure la union del epftopo a la hendidura de mHc. Cuando un epftopo de interes de una protema antigena comprende un motivo tal como se describe en la presente memoria dentro de su secuencia de epftopo, los peptidos inmunogenos de acuerdo con la presente invencion comprenden la secuencia de un motivo como se describe en la presente memoria y/o de otra secuencia reductora acoplada N o C terminal a la secuencia de epftopo de modo que (al contrario que el motivo presente dentro del epftopo, que es enterrado dentro de la hendidura) el motivo unido puede asegurar la actividad reductora.
En realizaciones particulares, los peptidos de la presente invencion no son naturales sino peptidos artificiales que contienen, ademas de un epftopo de linfocito T, un motivo como se describe en la presente memoria, de modo que el motivo esta opcionalmente separado del epftopo de linfocito T por un conector que consiste en hasta 7, mas en particular hasta 4 aminoacidos.
En una realizacion particular, se proporcionan peptidos de acuerdo con la invencion de la protema Der p 2, que comprenden un motivo como se describe en la presente memoria y un epftopo de Der p 2. Mas en particular, se proporcionan peptidos que comprenden una o mas copias del epftopo nonapeptido EPCIIHRGKP [SEQ ID. NO: 1] de Der p 2 cada una unida a un motivo reductor que consiste en el motivo C-X2-C. Alternativamente se proporcionan peptidos de la protema de Der p 2 que comprenden un epftopo de linfocito T distinto de una secuencia que comprende EPCIIHRGKP [SEQ ID. NO: 1] unido a un motivo C-X(2)-[CST] o [CST]-X(2)-C. Los peptidos de la invencion comprenden opcionalmente una secuencia que dirige al endosoma. Mas en particular, se proporcionan peptidos inmunogenos de Der p 2 que comprenden el motivo G-X2-C.
Otro aspecto de la presente invencion se refiere a procedimientos de generacion de peptidos inmunogenos de la presente invencion descritos en la presente memoria.
En una primera realizacion de procedimientos de acuerdo con la presente invencion, se prepara un peptido de una protema antfgena capaz de producir actividad de linfocitos T CD4+ citolfticos, proporcionando un peptido que consiste en un epftopo de linfocito T de dicha protema antfgena, y conectar a dicho epftopo un compuesto reductor. Mas en particular, los metodos de acuerdo con la invencion abarcan la union de dicho epftopo de linfocito T a una secuencia de aminoacidos que corresponde al motivo C-X(2)-[CST] o [CST]-X(2)-C, de modo que dicho motivo y dicho epftopo estan adyacentes entre sf o separados por un conector de como maximo 7 aminoacidos, mas en particular como maximo 4 aminoacidos. Mas en particular, el motivo corresponde a C-X2-C.
En realizaciones particulares de los metodos de la invencion, el epftopo de linfocito T de la protema antfgena se selecciona de modo que la protema antfgena no comprende, en su secuencia natural, una secuencia que corresponde a la secuencia combinada del epftopo y un motivo de acuerdo con la presente invencion dentro de una region de 11 aminoacidos N o C terminales de dicho epftopo. En realizaciones particulares adicionales, cuando el epftopo comprende la secuencia EPCIIHRGKP [SEQ ID. NO: 1] del peptido p21-35 de Der p 2, el motivo corresponde a [CT]-X2-C o C-X2-[CT], mas en particular a C-X2-C. Los metodos de la presente invencion generan peptidos inmunogenos que inducen una respuesta inmunitaria que no es generada, o no en esta medida, por los epftopos de linfocitos T generados de forma natural de la protema antfgena. El efecto se asegura por la combinacion espedfica del epftopo de linfocito T y el compuesto reductor, mas en particular del epftopo de linfocito T y el motivo reductor.
Por consiguiente, los metodos descritos antes son particularmente adecuados para la generacion de peptidos inmunogenos a partir de alergenos o autoantfgenos de protemas que no tienen un motivo tal como el que se describe en la presente memoria en su secuencia o en donde un motivo como se describe en la presente memoria esta presente completa o parcialmente dentro de una secuencia de epftopo de interes o en donde un motivo esta presente fuera, pero alejado (es decir, mas de 4, 7, 10 aminoacidos) de una secuencia de epftopo de interes.
En realizaciones particulares de los metodos descritos antes, se proporcionan una o mas etapas adicionales de modo que se introduce un conector entre el epftopo de linfocito T y el compuesto reductor y/o se anaden secuencias adicionales (tales como una secuencia directora) y/o una o mas secuencias flanqueadoras y/o se introducen modificaciones en la secuencia de epftopo del peptido.
En realizaciones adicionales de metodos de acuerdo con la invencion de obtencion de un peptido capaz de producir actividad de linfocito CD4+ citolftico de una protema antfgena, se proporcionan metodos que aseguran la identificacion de un peptido inmunogeno adecuado dentro de una protema antfgena. En estas realizaciones, los metodos de la presente invencion abarcan determinar si la protema antfgena comprende, dentro de su secuencia natural, un epftopo de linfocito T de modo que la protema comprende ademas dentro de una region de 11, mas en particular dentro de una region de 8 aminoacidos N o C terminales del epftopo de linfocito T, un motivo reductor
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
como se describe en la presente memoria. Por consiguiente, estas realizaciones comprenden la identificacion dentro de la protema antigena de una secuencia adecuada para usar como un peptido inmunogeno y la produccion de un peptido que corresponde con la secuencia identificada. Mas en particular, los peptidos aislados generados de esta forma comprenden una longitud de entre 12 y 19 aminoacidos. Se describen mas adelante metodos de produccion de peptidos. Cuando estan presentes sitios de escision enzimaticos adecuados en la protema, se contempla ademas que los peptidos de la presente invencion tambien se pueden generar por escision enzimatica de la protema original.
En realizaciones particulares de los diferentes metodos descritos antes, se proporcionan una o mas etapas de modo que se anaden secuencias adicionales a los peptidos obtenidos, tales como una secuencia directora y/o una o mas secuencias flanqueadoras y/o se introducen modificaciones en el epftopo, conector y/o motivo reductor del peptido. Estas modificaciones pueden ademas potenciar las propiedades inmunogenas del peptido o pueden mejorar otras caractensticas de los peptidos tales como la facilidad de smtesis, solubilidad etc.
Los metodos descritos antes permitiran la generacion de un peptido inmunogeno de acuerdo con la presente invencion, solo para la seleccion de protemas antfgenas que comprenden de forma natural, en la cercama de un epftopo de interes, un motivo C-X(2)-[CST] o [CST]-X(2)-C. En realizaciones particulares, el epftopo de linfocito T no comprende la secuencia EPCIIHRGKP [sEq ID. NO: 1] del peptido p21-35 de Der p 2. En realizaciones particulares, la protema antfgena puede comprender de forma natural un motivo C-X(2)-[ST] o [STI-X(2)-C dentro de como maximo 11 aminoacidos que flanquean el epftopo de interes, y los metodos de la invencion generan un peptido aislado que comprende dicho motivo y dicha secuencia de epftopo y modifican dicho motivo a C-X(2)-C de modo que aumentan mas las propiedades inmunogenas descritas en la presente memoria.
La identificacion de un epftopo de linfocito T adecuado de una protema antfgena se puede usar en la generacion de peptidos como se describe en los metodos anteriores y se detalla mas adelante.
Se ha mostrado que tras la administracion (es decir, inyeccion) a un mamfero de un peptido de acuerdo con la invencion (o una composicion que comprende dicho peptido), el peptido produce la activacion de linfocitos T que reconocen el antfgeno (es decir, el alergeno o autoantfgeno) derivado del epftopo de linfocito T y proporciona una senal adicional al linfocito T a traves de la reduccion del receptor de superficie. Esta activacion supraoptima da como resultado linfocitos T que adquieren propiedades citotoxicas para la celula que presenta el epftopo de linfocito T, asf como propiedades supresoras en linfocitos T inespedficos. De esta forma, los peptidos o composiciones que comprenden los peptidos descritos en la presente invencion, que contienen un epftopo de linfocito T derivado de antfgeno y, fuera del epftopo, un compuesto reductor, se pueden usar para la inmunizacion directa de mairftferos, incluyendo seres humanos.
Un aspecto de la invencion proporciona, por lo tanto, peptidos de la invencion o derivados de los mismos, para usar como un medicamento. Por consiguiente, la presente invencion proporciona metodos terapeuticos que comprenden administrar uno o mas peptidos de acuerdo con la presente invencion, a un paciente que lo necesite.
La presente invencion ofrece metodos mediante los cuales se pueden producir linfocitos T espedficos de alergeno/antfgeno provistos de propiedades citotoxicas, por inmunizacion con peptidos pequenos. Se ha encontrado que peptidos que contienen (i) una secuencia que codifica un epftopo de linfocito T de un antfgeno (es decir, alergeno, autoantfgeno), y (ii) una secuencia consenso con propiedades redox, y ademas opcionalmente comprende tambien una secuencia que facilita la absorcion del peptido en los endosomas tardfos para la presentacion eficaz por MHC de clase II, produce linfocitos T supresores.
Las propiedades inmunogenas de los peptidos de la presente invencion son de particular interes en el tratamiento y prevencion de reacciones inmunitarias. Por consiguiente, otro aspecto de la presente invencion proporciona el uso de peptidos descritos en la presente memoria como un medicamento, mas en particular para la fabricacion de un medicamento para la prevencion o tratamiento de un trastorno inmunitario en un mairftfero, mas en particular un ser humano.
Se describe en la presente memoria un metodo de tratamiento o prevencion de un trastorno inmunitario de un mairftfero que necesite dicho tratamiento o prevencion, usando los peptidos de la invencion, homologos o derivados de los mismos, comprendiendo los metodos las etapas de administrar a dicho mamfero que padece o esta en riesgo de tener un trastorno inmunitario, una cantidad terapeuticamente eficaz de los peptidos de la invencion, homologos o derivados de los mismos, para asf reducir los smtomas del trastorno inmunitario. Esta contemplado el tratamiento tanto de seres humanos como de marnfferos, tales como, pero no limitado a mascotas y caballos.
Los trastornos inmunitarios a citados antes, se seleccionan en una realizacion particular de enfermedades alergicas y enfermedades autoinmunitarias. Las enfermedades alergicas son enfermedades. Las manifestaciones clmicas de las enfermedades alergicas incluyen asma bronquial, rinitis alergica, dermatitis atopica, hipersensibilidad alimentaria y reacciones anafilacticas a picaduras de insectos o farmacos. Las enfermedades alergicas son causadas por reacciones de hipersensibilidad del sistema inmunitario a sustancias espedficas llamadas alergenos (tales como polen, picaduras, farmacos o alimentos). La forma mas grave de un trastorno alergico es el choque anafilactico, que es una urgencia medica. Los alergenos incluyen alergenos de transmision aerea, tales como los de acaros del polvo
5
10
15
20
25
30
35
40
domesticos, mascotas y polenes. Los alergenos tambien incluyen alergenos ingeridos responsables de la hipersensibilidad a alimentos, que incluyen frutas, verduras y leche.
Los peptidos de acuerdo con la invencion se generan a partir de las protemas antigenas o alergenos que se sabe o se cree que son el factor causante de la enfermedad. Los alergenos que se pueden usar para la seleccion de epftopos de linfocitos T tipicamente son alergenos que se seleccionan del grupo que consiste en:
- alergenos alimentarios presentes en los cacahuetes, pescado, p. ej. bacalao, clara de huevo, crustaceos, p. ej., gambas, leche, p. ej., leche de vaca, trigo, cereales, frutos de la familia Rosacea (manzana, ciruela, fresa), verduras de las familias liliaceas, crudferas, solanaceas y umbeftferas, frutos secos, sesamo, cacahuete, soja y otros alergenos de la familia de las leguminosas, especias, melon, aguacate, mango, higo, platano, ....
- alergenos de acaros del polvo domestico obtenidos de Dermatophagoides spp o D. pteronyssinus, D. farinae y D. microceras, Euroglyphus maynei o Blomia sp.,
- alergenos de insectos presentes en cucaracha o himenopteros,
- alergenos del polen, en especial polen de arbol, cesped y maleza,
- alergenos de animales, en especial, perros, gatos, caballos y roedores,
- alergenos de hongos, en especial de Aspergillus, Alternaria o Cladosporium, y
- alergenos ocupacionales presentes en productos tales como el latex, amilasa, etc.
El epftopo de linfocito T que corresponde a una protema antfgena (o inmunogeno) para usar en el contexto de la presente invencion, tipicamente es un epftopo de linfocito T universal o promiscuo (es decir, un epftopo de linfocito T capaz de unirse a la mayona de las moleculas de MHC de clase II), mas en particular presente sobre un alergeno de transmision aerea o un alergeno de transmision alimentaria. En realizaciones particulares, dicho alergeno se selecciona del grupo que consiste en alergenos de rinosinusitis, alergenos de asma bronquial alergico y alergenos de dermatitis atopica.
Los alergenos tambien pueden ser alergenos principales presentes en mohos o diferentes farmacos tales como hormonas, antibioticos, enzimas, etc. (Vease tambien la definicion en Clin. Exp. Allergy 26, 494-516 (1996) y en Molecular Biology of Allergy and Immunology, Ed. R. Bush (1996)). Tambien se conocen en la tecnica otros alergenos relacionados con enfermedades alergicas espedficas y se pueden encontrar en internet, p. ej., en
www.allergome.org.
Las enfermedades autoinmunitarias se clasifican ampliamente en dos categonas, enfermedades espedficas de organo y sistemicas. La etiologfa precisa de las enfermedades autoinmunitarias sistemicas no esta definida. En cambio, las enfermedades autoinmunitarias espedficas de organo estan relacionadas con una respuesta inmunitaria espedfica que incluye linfocitos B y T, que se dirigen al organo y de esta forma induce y mantiene un estado cronico de inflamacion local. Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias espedficas incluyen diabetes de tipo 1, miastenia grave, tiroiditis y esclerosis multiple. En cada una de estas afecciones, se ha identificado uno o un numero pequeno de autoantfgenos, incluyendo la insulina, el receptor muscular de acetilcolina, peroxidasa tiroidea, y protema basica mayor, respectivamente. Esta bien aceptado que la supresion de esta respuesta inmunitaria espedfica de organo es beneficiosa y conduce a la recuperacion parcial o completa de la funcion del organo. Sin embargo, no hay terapia que suprima dicha respuesta inmunitaria de una forma espedfica del antfgeno. La terapia actual mas bien usa la supresion inmunitaria no espedfica obtenida por el uso de corticosteroides y agentes inmunosupresores, que presentan todos efectos secundarios importantes relacionados con la ausencia de especificidad, limitando asf su uso y su eficacia general. La tabla 2 muestra una lista no limitante de ejemplos de autoantfgenos conocidos que estan relacionados con trastornos autoinmunitarios espedficos de organo y que estan contemplados dentro del contexto de la presente invencion.
Tabla 2. Autoantigenos representativos y enfermedades relacionadas con los mismos
Enfermedad enfermedades tiroideas
diabetes de tipo 1
adrenalitis
smdromes poliendocrinos
gastritis y anemia perniciosa esclerosis multiple
miastenia grave enfermedades oculares enfermedades del ofdo interno enfermedad celiaca
enfermedades inflamatorias del intestino aterosclerosis
Antfgeno
tiroglobulina
peroxidasa tiroidea
receptor de TSH
insulina (proinsulina)
acido glutamico descarboxilasa (GAD)
tirosina fosfatasa IA-2
protema de choque termico HSP65
protema relacionada con la subunidad catalftica de glucosa-6-fosfatasa espedfica de los islotes (IGRP)
21-OH hidroxilasa
17-alfa-hidroxilasa histidina descarboxilasa
triptofano hidroxilasa
tirosina hidroxilasa
H+/K+ ATPasa factor intrmseco
glucoprotema oligodendrocitaria de la mielina (MOG)
protema basica de la mielina (MBP)
protema proteolipfdica (PLP)
receptor de acetilcolina
protema de union a retinol (RBP)
colageno de tipo II y tipo IX
transglutaminasa tisular
protema histona H1 pANCA
protema de choque termico HSP60
De acuerdo con la presente invencion, se proporcionan peptidos inmunogenos que comprende un epftopo de linfocito T de un antfgeno (propio o no propio) con potencial para producir una reaccion inmunitaria, tal como un 5 alergeno o un autoantfgeno, tales como los descritos en la tabla 2. En una realizacion particular, el epftopo de linfocito T es un epftopo de linfocito T dominante.
Los metodos de tratamiento y prevencion que se describen en el presente documento comprenden la administracion de un peptido inmunogeno como se describe en la presente memoria, en donde el peptido comprende epftopo de linfocito T de una protema antfgena que tiene una funcion en la enfermedad que se va a tratar (por ejemplo, tales 10 como las descritas en la tabla 2 anterior). En realizaciones particulares adicionales, el epftopo usado es un epftopo dominante.
La identificacion y seleccion de un epftopo de linfocito T de dichas protemas antfgenas, mas en particular de alergenos o autoantfgenos, para usar en el contexto de la presente invencion es conocido para el experto en la tecnica.
15 Para identificar un epftopo adecuado para usar en el contexto de la presente invencion, se ensayan secuencias de peptidos aisladas de una protema antfgena, por ejemplo, por tecnicas biologicas de linfocitos T, para determinar si la secuencia de peptido produce una respuesta de linfocitos T. Las secuencias de peptidos que se encuentra que producen respuesta de linfocitos T, son definidas como que tienen actividad de estimulacion de linfocitos T.
La actividad de estimulacion de linfocitos T humanos se puede ensayar ademas cultivando linfocitos T obtenidos de un individuo sensible, p. ej., a un alergeno de acaro (es dedr, un individuo que tiene una respuesta inmunitaria mediada por IgE a un alergeno de acaro) con un peptido/epftopo derivado del alergeno y determinando si se produce proliferacion de linfocitos T en respuesta al peptido/epftopo medido, p. ej., por captacion celular de timidina 5 tritiada. Los indices de estimulacion para respuestas por linfocitos T a peptidos/epftopos se puede calcular como las CMP maximas en respuesta a un peptido/epftopo dividido entre las CPM del control. Un mdice de estimulacion (S.I.) de linfocitos T igual o mayor que dos veces el nivel base se considera "positivo". Los resultados positivos se usan para calcular el mdice de estimulacion medio para cada peptido/epftopo para el grupo de peptidos/epftopos ensayado.
10 Se puede ensayar ademas opcionalmente la afinidad de union de lo epftopos de linfocitos T no naturales (o modificados) a moleculas de MHC de clase II. Esto se puede realizar de diferentes formas. Por ejemplo, se obtienen moleculas de HLA de clase II solubles por lisis de celulas homocigoticas para una molecula de clase II dada. Esta ultima se purifica por cromatograffa de afinidad. Las moleculas de clase II se incuban con biotina-molecula de clase II. Los peptidos en los que se va a evaluar la union de clase II despues se incuban en diferentes concentraciones y 15 se calcula su capacidad para desplazar el peptido de referencia de su union de clase II por adicion de neutravinida. Los metodos se pueden encontrar, por ejemplo, en Texier et al., (2000), J. Immunology 164, 3177-3184.)
De acuerdo con la presente invencion, las propiedades inmunogenas de los epftopos de linfocitos T aumentan uniendolo a un compuesto reductor. En particular, los peptidos de la presente invencion que comprenden al menos un epftopo de linfocito T y el compuesto reductor, como se describe en la presente memoria, tienen un mdice de 20 estimulacion de linfocitos T medio mayor o igual a 2,0. Un peptido que tiene un mdice de estimulacion de linfocitos T mayor o igual que 2,0, se considera util como un agente terapeutico. Mas en particular, los peptidos de la invencion tienen un mdice de estimulacion de linfocitos T de al menos 2,5, al menos 3,5, al menos 4,0, o incluso al menos 5,0. Ademas, los peptidos tfpicamente tienen un mdice de positividad (P.I.) de al menos aproximadamente 100, al menos 150, al menos aproximadamente 200 o al menos aproximadamente 250. El mdice de positividad para un peptido se 25 determina multiplicando el mdice de estimulacion de linfocitos T medio por el porcentaje de individuos, en una poblacion de individuos sensibles al acaro del polvo domestico (p.ej., al menos 9 individuos, al menos 16 individuos o al menos 29 o 30, o incluso mas), que tienen linfocitos T que responden al peptido (por lo tanto que corresponde al SI multiplicado por la naturaleza promiscua del peptido/epftopo. Por lo tanto, el mdice de positividad representa tanto la fuerza de una respuesta de linfocitos T a un peptido (S.I.) como la frecuencia de una respuesta de linfocitos T a un 30 peptido de una poblacion de individuos sensibles al acaro del polvo domestico.
Con el fin de determinar los epftopos de linfocitos T optimos, por ejemplo, mediante tecnicas de cartograffa fina, un peptido que tiene actividad de estimulacion de linfocitos T y por lo tanto comprende al menos un epftopo de linfocito T determinado por tecnicas biologicas de linfocitos T, se modifica por adicion o eliminacion de restos de aminoacidos en el extremo amino o caboxi del peptido, y se ensaya para determinar un cambio en la reactividad de los linfocitos T 35 al peptido modificado. Si se encuentra que dos o mas peptidos que comparten una zona de solapamiento en la secuencia de protema original tienen actividad de estimulacion de linfocitos T, determinado por tecnicas biologicas de linfocitos T, se pueden producir peptidos adicionales que comprenden todo o una parte de dichos peptidos y estos peptidos adicionales se pueden ensayar por un procedimiento similar. Siguiendo esta tecnica, se seleccionan peptidos y se producen de forma recombinante o sintetica. Los epftopos de linfocitos T o peptidos se seleccionan 40 basandose en diferentes factores, que incluyen la fuerza de la respuesta de los linfocitos T al peptido/epftopo (p. ej., mdice de estimulacion) y la frecuencia de la respuesta de linfocitos T al peptido en una poblacion de individuos.
Adicional y/o alternativamente, se pueden usar uno o mas algoritmos para identificar una secuencia de epftopo de linfocito T dentro de una protema antfgena. Los algoritmos adecuados incluyen, pero no se limitan a los encontrados en los siguientes sitios en la red:
45 -
http://antigen.i2r.a-star.edu.sg/predBalbc/:
-
http://antigen.i2r.a-star.edu.sg/predBalbc/:
-
http://www.imtech.res.in/raghava/mhcbn/:
-
http://www.syfpeithi.de/home.htm:
-
http://www-bs.informatik.uni-tuebingen.de/SVMHC:
50 -
http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html:
-
http://www.jenner.ac.uk/MHCPred/.
Mas en particular, dichos algoritmos permiten predecir dentro de una protema antfgena una o mas secuencias de nonapeptidos que encajaran en la hendidura de una molecula MHC II.
Los peptidos de la presente invencion se pueden generar usando tecnicas de ADN recombinante, en bacterias, 55 levaduras, celulas de insectos, celulas de plantas o celulas de mairftferos. En vista de la longitud limitada de los
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
peptidos, se pueden preparar por smtesis qmmica de peptidos, en donde se preparan peptidos por acoplamiento de diferentes aminoacidos entre sf La smtesis qmmica es particularmente adecuada para la inclusion, p. ej., de D- aminoacidos, aminoacidos con cadenas laterales que no se encuentran de forma natural o aminoacidos naturales con cadenas laterales modificadas tales como cistema metilada.
Los metodos de smtesis qmmica de peptidos estan bien descritos y se pueden encargar peptidos en empresas tales como Applied Biosystems y otras empresas.
La smtesis de peptidos se puede llevar a cabo por smtesis de peptidos en fase solida (SPPS) o al contrario por smtesis de peptidos en fase de solucion. Los metodos de SPPS mejor conocidos son la qmmica en fase solida de t- Boc y Fmoc:
Durante la smtesis de peptidos se usan varios grupos protectores. Por ejemplo, los grupos funcionales hidroxilo y carboxilo se protegen con el grupo t-butilo, la lisina y triptofano se protegen con el grupo t-Boc, y las asparaginas, glutamina, cistema e histidina se protegen con el grupo tritilo, y la arginina se protege con el grupo pbf. En realizaciones particulares, dichos grupos protectores se pueden dejar en el peptido despues de la smtesis.
Los peptidos se pueden unir unos con otros para formar peptidos mas largos usando una estrategia de ligado (acoplamiento quimioselectivo de dos fragmentos de peptidos no protegidos) como describe originalmente Kent (Schnolzer & Kent (1992) Int. J. Pept. Protein Res. 40, 180-193) y revisado, por ejemplo, en Tam et al. (2001) Biopolymers 60, 194-205, que proporciona el enorme potencial de conseguir smtesis de protemas que estan mas alla del alcance de la SPPS. Se han sintetizado con exito muchas protemas con el tamano de 100-200 restos por este metodo. Los peptidos sinteticos continuan teniendo una funcion crucial incluso creciente en los campos de investigacion de bioqmmica, farmacologfa, neurobiologfa, enzimologfa y biologfa molecular, debido a los enormes avances en la SPPS.
Alternativamente, los peptidos se pueden sintetizar usando moleculas de acido nucleico que codifican los peptidos de esta invencion, en un vector de expresion adecuado, que incluye las secuencias de nucleotidos codificantes. Dichas moleculas de ADN se pueden preparar facilmente usando un sintetizador de ADN automatico y la relacion bien conocida de codon-aminoacido del codigo genetico. Dicha molecula de ADN tambien se puede obtener como ADN genomico o como ADNc usando sondas de oligonucleotidos y metodologfas de hibridacion convencionales. Dichas moleculas de ADN se pueden incorporar en vectores de expresion, incluyendo plasmidos, que estan adaptados para la expresion del ADN y produccion del polipeptido en un hospedante adecuado tal como una bacteria, p.ej. Escherichia coli, celula de levadura, celula animal o celula vegetal.
Las propiedades ffsicas y qmmicas de un peptido de interes (p. ej., solubilidad, estabilidad) se examinan para determinar si el peptido es/sena adecuado para usar en composiciones terapeuticas. Tfpicamente, esto se optimiza ajustando la secuencia del peptido. Opcionalmente, el peptido se puede modificar despues de smtesis (modificaciones qmmicas, p. ej., anadiendo/eliminando grupos funcionales) usando tecnicas conocidas en la materia.
Los epftopos de linfocitos T por sf mismos se cree que producen sucesos tempranos a nivel del linfocito T auxiliar por union a una molecula de HLA adecuada en la superficie de una celula presentadora de antfgeno y estimulacion de la subpoblacion de linfocitos T relevantes. Estos sucesos conducen a la proliferacion de linfocitos T, secrecion de linfoquinas, reacciones inflamatorias locales, el reclutamiento de celulas inmunitarias adicionales en el sitio, y la activacion de la cascada de linfocitos B que conduce a la produccion de anticuerpos. Un isotipo de estos anticuerpos, IgE, es muy importante en el desarrollo de smtomas alergicos y en su produccion influye pronto la cascada de sucesos, a nivel de linfocito T auxiliar, por la naturaleza de las linfoquinas secretadas. Un epftopo de linfocito T es el elemento basico o unidad mas pequena de reconocimiento por un receptor de linfocitos T donde el epftopo comprende restos de aminoacidos esenciales para el reconocimiento del receptor, que son contiguos en la secuencia de aminoacidos de la protema.
Sin embargo, tras la administracion de los peptidos de acuerdo con la invencion (que comprenden un epftopo de linfocito T acoplado a una secuencia redox) o composiciones de los mismos, se cree que ocurren los siguientes sucesos:
- activacion de linfocitos T espedficos de antfgeno (es decir, alergeno o autoantfgeno) que resulta de la interaccion cognada con el peptido derivado de antfgeno (es decir, alergeno o autoantfgeno) presentado por moleculas de MHC de clase II;
- la secuencia consenso de reductasa reduce las protemas de superficie de linfocitos T, tales como la molecula CD4 (y tambien CD3), cuyo segundo dominio contiene un puente disulfuro restringido. Esto transduce una senal a los linfocitos T. Entre una serie de consecuencias relacionadas con la ruta oxidativa mayor, sucesos importantes son el mayor influjo d calcio y la traslocacion del factor de transcripcion NF-kB al nucleo. Esto ultimo da como resultado la mayor transcripcion de IFN-gamma y granzimas, lo que permite que las celulas adquieran propiedades citotoxicas;
- la citotoxicidad afecta a celulas presentadoras del peptido por un mecanismo, que implica secrecion de granzima B e interacciones Fas-FasL. La destruccion de las celulas diana presentadoras de antfgeno previene la activacion de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
otros linfocitos T espedficos para epftopos situados en el mismo antigeno, o en un antigeno no relacionado que sena procesado por la misma celulas presentadora de antfgeno;
- una consecuencia adicional de la activacion de linfocitos T es suprimir la activacion de linfocitos T inespedficos por un mecanismo dependiente del contacto celula-celula. En dicho caso, los linfocitos T activados por un antigeno presentado por una celula presentadora de antigeno diferente tambien son suprimidos con la condicion de que los linfocitos T citotoxicos y los inactivos esten cerca.
El mecanismo de accion postulado antes es respaldado con datos experimentales (vease a continuacion). Algunos experimentos tambien han sugerido, ademas, la implicacion de la ruta de la perforina y/o la activacion de la indolamina oxidasa en celulas diana, que produce un mayor catabolismo del triptofano, un aminoacido esencial para la supervivencia celular, asf como para la produccion de micropartfculas por Treg activados.
Experimentos en modelos in vivo descritos mas adelante, han demostrado que la administracion (es decir, inyeccion) de un peptido de acuerdo con la invencion o una composicion del mismo, puede prevenir o suprimir la respuesta inmunitaria espedfica de antfgeno. Como un ejemplo, en un modelo de raton de asma debido a la sensibilizacion a un alergeno. Der p 2, la preinmunizacion con un peptido de acuerdo con la invencion descrito antes, previene la infiltracion de celulas inflamatorias pulmonares, que es una caractenstica distintiva del asma. La hiperreactividad de las vfas aereas no espedfica, medida por inhalacion de dosis crecientes de metacolina, es esencialmente prevenida por el mismo protocolo experimental. La migracion de celulas en el lfquido broncoalveolar tambien se previene completamente (vease el ejemplo 4). Ademas, la transferencia adoptiva de clones de linfocitos T (derivados de animales inmunizados con la composicion) previene y suprime completamente tanto la infiltracion de celulas inflamatorias como la hiperreactividad de las vfas aereas en los receptores. Dichos clones de linfocitos T que son producidos por la administracion de otros peptidos de acuerdo con la invencion, presentan una serie de caractensticas fenotfpicas, que los hacen distintos de los Treg identificados habitualmente, sea Treg naturales o Treg adoptivos. Por lo tanto, los Treg citotoxicos muestran mayor expresion de los marcadores de superficie incluyendo CD103, CTLA-4, FasL y ICOS (tras activacion). Son altos en CD25 incluso en reposo y bajos en CD127 (IL7-R). La expresion del factor de transcripcion incluye T-bet pero no el represor de transcripcion Foxp3, considerado una caractenstica distintiva de los Treg naturales. A parte de la alta produccion de IFN-gamma, dichos clones no segregan o solo cantidades en trazas de IL-10, IL-4, IL-5, IL-13 o TGF-beta. Las caractensticas anteriores no son exclusivas, pero proporcionan como una ilustracion, el hecho de que dichos Treg citotoxicos son distinguibles de otros Treg.
Por consiguiente, en un aspecto adicional mas, la presente invencion proporciona metodos para generar Treg citotoxicos espedficos de antfgeno in vitro, independientemente de los mismos, metodos para discriminar Treg citotoxicos de otros Treg basandose en los datos de expresion caractensticos descritos antes.
Se describen en la presente memoria metodos para la produccion de los Treg espedficos de antfgeno de la invencion. Una realizacion particular se refiere al metodo para producir o aislar dichos Treg por inmunizacion de animales (incluyendo seres humanos) con los peptidos de la invencion, como se describe en la presente memoria, y despues aislar los Treg de dichos animales inmunizados. Se describen procedimientos mas detallados en la seccion de ejemplos de la presente memoria y son parte de la invencion.
Un aspecto adicional de la presente invencion se refiere a metodos in vitro para la produccion de Treg espedficos de antfgeno de la invencion. Los Treg son cruciales en la inmunorregulacion y tienen un gran potencial terapeutico. La eficacia de la inmunoterapia basada en Treg depende cnticamente de la especificidad del Ag de los linfocitos T reguladores. Ademas, el uso de Treg espedficos de Ag en oposicion a lo Treg expandidos policlonales reduce el numero total de Treg necesarios para la terapia. La generacion de linfocitos T reguladores in vitro usando metodos conocidos en la tecnica tiene una serie de desventajas importantes. El porcentaje de Treg dentro de una muestra de celulas perifericas aisladas es aproximadamente 5% y el cultivo de linfocitos Treg es diffcil, de modo que la cantidad de Treg esta siempre limitada. Ademas, los Treg generados de esta forma no son espedficos y por lo tanto no son capaces de suprimir una respuesta inmunitaria espedfica, sino que tienen solo un efecto inmunosupresor general cuando se administran a un paciente. Por consiguiente, se han desarrollado estrategias para el desarrollo de procedimientos de seleccion que permiten la seleccion y expresion de Treg espedficos de Ag, muy potentes. Sin embargo, el numero de linfocitos Treg espedficos de antfgeno obtenido de esta forma, sigue siendo limitado.
La presente invencion proporciona metodos para generar linfocitos T reguladores espedficos de antfgeno que tiene actividad citotoxica.
En una realizacion, se proporcionan metodos que comprenden el aislamiento de celulas de sangre periferica, la estimulacion de la poblacion de celulas in vitro por un peptido inmunogeno de acuerdo con la invencion y la expansion de la poblacion de celulas estimulada, mas en particular en presencia de IL-2. Los metodos de acuerdo con la invencion tiene la ventaja de que se producen mayor numero de Treg y que se pueden generar Treg que son espedficos para la protema antfgena (usando un peptido que comprende un epttopo espedfico de antfgeno).
Los linfocitos T reguladores espedficos de antfgeno que se pueden obtener por los metodos de la presente invencion tienen un interes particular para la administracion a marnfferos en inmunoterapia, en la prevencion de
reacciones alergicas y el tratamiento de reca^das en enfermedades autoinmunitarias. Esta contemplado tanto el uso de celulas alogenicas como autogenicas.
Por consiguiente, un aspecto de la presente invencion proporciona poblaciones de Treg citotoxicos caracterizados como se describe en lo sucesivo. Mas en particular, las poblaciones de Treg de la presente invencion se obtienen 5 por los metodos descritos en la presente memoria.
Por consiguiente, la presente invencion proporciona Treg espedficos de antigeno con propiedades citotoxicas de acuerdo con la invencion, para usar como un medicamento, mas en particular para usar en terapia celular adoptiva, mas en particular para el tratamiento de reacciones alergicas agudas y recafdas de enfermedades autoinmunitarias tales como la esclerosis multiple. La presente invencion se refiere ademas al uso de dichos Treg aislados o 10 poblaciones de linfocitos Treg generadas como se describe en la presente memoria, mas en particular poblaciones de linfocitos Treg espedficos de antfgeno como se describe en la presente memoria, para la fabricacion de un medicamento para la prevencion o tratamiento de trastornos inmunitarios.
Un aspecto adicional de la presente invencion proporciona metodos para discriminar linfocitos Treg citotoxicos de otros linfocitos Treg basandose en las caractensticas de expresion de las celulas. Mas en particular, los metodos de 15 acuerdo con la invencion comprenden determinar si la poblacion de linfocitos Treg demuestra una o mas de las siguientes caractensticas comparados con una poblacion de linfocitos Treg no citotoxicos:
- una mayor expresion de marcadores de superficie incluyendo CD103, CTLA-4, FasL e ICOS tras activacion,
- expresion alta de CD25,
- expresion de CD4, ICOS, CTLA-4, GITR y expresion baja o no expresion de CD127 (IL7-R),
20 - expresion del factor de transcripcion T-bet y egr-2 (Krox-20) pero no del represor de transcripcion Foxp3,
- una produccion alta de IFN-gamma y no de, o solo cantidades en trazas de IL-10, IL-4, IL-5, IL-13 o TGF-beta.
Mas en particular, los metodos de la presente invencion comprenden determinar que las celulas expresan CD4, que no expresan IL-10 o TGF-beta, que expresan Krox-20 y producen granzimas y ligando Fas. Mas en particular, estas celulas se seleccionan ademas funcionalmente como celulas que no responden a la activacion por el reconocimiento 25 de TCR. En realizaciones particulares adicionales, los metodos abarcan determinar todas las caractensticas descritas antes.
En anos recientes se ha progresado mucho en la caracterizacion de linfocitos T reguladores (Treg) tanto en condiciones fisiologicas como patologicas. Mas en particular, se ha descrito el potencial de uso de los Treg para la terapia de algunas enfermedades. La presente invencion aborda el desarrollo de un subconjunto recien definido de 30 Treg adoptivos espedficos de antfgenos que difieren de los Treg previos descritos, por el metodo usado para la induccion in vitro y por propiedades espedficas. Los Treg pertenecen a dos categonas amplias, es decir, Treg naturales y Treg inducidos (o adoptivos). Los Treg naturales se describieron por primera vez en el raton en 1995, y se definieron como un subconjunto de linfocitos T CD4+ activamente seleccionados en el timo. Dichas celulas se caracterizan por la expresion de una serie de marcadores de superficie, que incluyen CD25 en celulas en reposo, 35 GITR, CTLA-4 y LAG-3. Mas recientemente, los Treg naturales se han definido ademas por la falta de expresion de CD127 (IL-7R). El represor de transcripcion Foxp3 tiene una funcion determinante en la seleccion de Treg naturales. Las mutaciones de Foxp3 dan como resultado la ausencia de Treg naturales, con una desregulacion inmunitaria ligada al cromosoma X con manifestaciones de poliendocrinopatia, enteropatfa, atopicas e infecciones letales. Dichos Treg naturales suprimen diferentes procesos inflamatorios incluyendo smdromes gastrointestinales. A nivel 40 molecular, Foxp3 se combina con el factor de transcripcion NFAT en competicion con AP1, y de esta forma regula la transcripcion de una serie de citoquinas. El mecanismo de accion de los Treg naturales esta bajo un intenso escrutinio. In vitro, dichas celulas producen IL-10 y TGF-beta. In vivo, sin embargo, la neutralizacion de IL-10 y/o TGF-b no superan la supresion, indicando que hay otros mecanismos en juego. In vitro, los Treg naturales suprimen la respuesta adaptativa de una forma dependiente del contacto de celulas. Es interesante que los Treg naturales 45 expresan proteasas granzimas tales como granzima-A (GZ-A) y granzima-B (GZ-B). Aunque todavfa es polemico, un mecanismo adicional o alternativo de accion para los Treg naturales parece que se basa en su capacidad para producir la lisis de celulas diana por exocitosis de granzimas. Los Treg deficientes en GZ-B pierden en parte su capacidad para suprimir la respuesta inmunitaria. Los Treg adaptativos constituyen una familia heterogenea de linfocitos T que tienen en comun que son espedficos de antfgeno, ejercen una actividad supresora en los linfocitos T 50 inespedficos y son inducidos en la periferia. Las celulas Th3 son producidas principalmente por la administracion oral de antfgeno y se encuentran en lo ganglios linfaticos mesentericos. Dichas celulas ejercen su actividad supresora produciendo niveles altos de TGF-beta con cantidades variables de IL-4 e IL-10. Las celulas Tr1 producen altas concentraciones de IL-10 y cantidades variables de TGF-beta. Estas son inducidas in vitro por exposicion a linfocitos T CD4+ vfrgenes a altas concentraciones de IL-10 o activacion combinada por anticuerpos anti-CD3 y anti- 55 CD46. La relacion precisa entre las celulas Th3 y Tr1 no esta establecida, en ausencia de marcadores fenotfpicos
espedficos. No solo parece existir un solapamiento entre estos dos Treg adaptativos, sino que es probable que en los proximos anos se definan subconjuntos adicionales. Los Treg adaptativos no expresan el factor represor Foxp3. Aparte de la produccion de citoquinas supresoras tales como IL-10 y/o TGF-beta, se ha descrito que los linfocitos T
5
10
15
20
25
30
35
40
45
CD4+CD25(-) pueden ser inducidos para expresar granzimas, principalmente GZ-B, por la estimulacion por anticuerpos anti-CD3 y anti-CD46. No esta claro si estos Treg inducidos in vitro, no espedficos, ejercen actividad citotoxica debido a la secrecion de granzima. Los peptidos de la invencion, tras la administracion a un animal vivo, tipicamente un ser humano, producen linfocitos T espedficos que ejercen una actividad supresora en los linfocitos T inespedficos. Los peptidos aparentemente activan el metabolismo oxidativo de los linfocitos T despues de interaccion cognada y reducen el puente disulfuro restringido del segundo dominio extracelular de la molecula CD4.
Este mecanismo tambien implica y los resultados experimentales muestran que los peptidos de la invencion, aunque comprenden un epftopo de linfocito T espedfico de un determinado antigeno, se pueden usar para la prevencion o tratamiento de trastornos producidos por una reaccion inmunitaria contra otros epftopos de linfocitos T del mismo antigeno, o en determinadas circunstancias incluso para el tratamiento de trastornos producidos por una reaccion inmunitaria contra otros epftopos de linfocitos T de otros antigenos diferentes si fueran presentados por el mismo mecanismo por moleculas de MHC de clase II en la cercama de linfocitos T activados por peptidos de la invencion.
Un aspecto particular adicional de la presente invencion se refiere, por lo tanto, a un tipo de celula, que son linfocitos T, mas en particular Treg o linfocitos T supresores, caracterizados porque expresan lL-10 o TGF-beta (mientras que otros linfocitos T adaptativos producen IL-10 y/o TGF-beta), expresan Krox-20 y producen granzimas y ligando Fas. Mas en particular, estas celulas se seleccionan ademas funcionalmente como celulas que no responden a la activacion por el reconocimiento de TCR. Mas en particular, se proporcionan en la presente memoria, poblaciones de tipos de linfocitos Treg que tienen las caractensticas descritas en el presente documento, de modo que la respuesta anergica es espedfica de antfgeno.
En realizaciones particulares adicionales, los linfocitos Treg de la invencion se caracterizan porque tienen:
- expresion de CD25, CD4, ICOS, CTLA-4, GITR, y no expresion de CD127 (IL7-R), expresion del factor de transcripcion T-bet y egr-2 (Krox-20) pero no de Foxp3,
- una mayor expresion de marcadores que incluyen FasL y granzimas (B y C) tras activacion.
- una produccion alta de IFN-gamma.
En una realizacion particular adicional, la invencion proporciona un tipo de celula, que son linfocitos T, mas en particular Treg o linfocitos T supresores, caracterizados porque tienen:
- expresion de CD25, CD4, ICOS, CTLA-4, GITR, y no expresion de CD127 (IL7-R), expresion del factor de transcripcion T-bet y egr-2 (Krox-20) pero no de Foxp3,
- una mayor expresion de marcadores que incluyen FasL y granzimas (B y C) tras activacion.
- una produccion alta de IFN-gamma.
Mas en particular, los linfocitos o poblaciones de Treg de la invencion se caracterizan porque tienen:
- una mayor expresion de marcadores de superficie incluyendo CD103, CTLA-4, FasL e ICOS tras activacion,
- expresion alta de CD25, mientras que otros linfocitos T adaptativos son negativos para CD25, expresion de CD4, ICOS, CTLA-4, GITR y expresion baja, o sin expresion de CD127 (IL7-R),
- expresion del factor de transcripcion T-bet e egr-2 (Krox-20) pero no del represor de transcripcion Foxp3, mientras que otros linfocitos T adaptativos son positivos para Foxp3,
- una produccion alta de IFN-gamma y no de, o solo cantidades en trazas de IL-10, IL-4, IL-5, IL-13 o TGF-beta.
- una mayor expresion de marcadores que incluyen FasL y granzimas (B y C) tras activacion.
Mas en particular, la presente invencion proporciona poblaciones de celulas aisladas del tipo celular que tiene las caractensticas descritas antes, que, ademas son espedficas de antfgeno, es decir, capaces de suprimir una respuesta inmunitaria espedfica de antfgeno. Por consiguiente, la presente invencion proporciona linfocitos Treg espedficos de antfgeno aislados, caracterizados como se ha descrito antes. Mas en particular, la presente invencion proporciona linfocitos Treg espedficos de antfgeno distintos de los producidos por Der p 2.
Los peptidos, de acuerdo con la invencion, tambien se pueden usar en metodos de terapia genica bien conocidos en la tecnica, y la terminologfa usada en la presente memoria que explica el uso de peptidos de acuerdo con la invencion, tambien incluye el uso de acidos nucleicos que codifican o expresan peptidos inmunogenos de acuerdo con la invencion.
Por consiguiente, un aspecto adicional de la presente invencion, se refiere a secuencias de acido nucleico que codifican peptidos de la presente invencion y metodos para su uso.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Estan contemplados diferentes metodos para conseguir, mediante terapia genica, niveles de peptidos, homologos o derivados de los mismos de acuerdo con la invencion, en un mairnfero in vivo, dentro del contexto de la presente invencion.
Se pueden usar moleculas de acido nucleico recombinantes que codifican secuencias de protemas como ADN desnudo o en liposomas u otros sistemas lipfdicos para el suministro a celulas diana. Otros metodos para la transferencia directa de ADN plasmfdico en celulas son bien conocidos para los expertos en la tecnica, para usar en terapia genica, e implican dirigir el ADN a receptores en celulas mediante complejo del ADN plasmfdico con protemas. En su forma mas simple, la transferencia de genes se puede llevar a cabo inyectando simplemente cantidades pequenas de ADN en el nucleo de la celula, por un procedimiento de microinyeccion. Una vez que los genes recombinantes se han introducido en una celula, pueden ser reconocidos por los mecanismos normales de celulas para la transcripcion y traduccion, y se expresara un producto genico. Tambien se han intentado otros metodos para introducir ADN en mayores numeros de celulas. Estos metodos incluyen: transfeccion, en donde el ADN precipita con fosfato calcico y es absorbido por las celulas por pinocitosis; electroporacion, en donde las celulas son expuestas a pulsos de gran voltaje para introducir agujeros en la membrana; lipofeccion/fusion de liposomas, en donde el ADN se empaqueta en vesmulas lipofilas que se fusionan con una celula diana; y bombardeo con partmulas usando ADN unido a proyectiles pequenos. Otro metodo para introducir ADN en las celulas es acoplar el ADN a protemas qmmicamente modificadas. Las protemas de adenovirus son capaces de desestabilizar endosomas y potenciar la absorcion de ADN en las celulas. La mezcla de adenovirus con soluciones que contienen complejos de ADN, o la union de ADN a polilisina unida covalentemente a adenovirus usando agentes de reticulacion de protemas, mejora sustancialmente la absorcion y expresion del gen recombinante. Los vectores de virus adenoasociados tambien se pueden usar para el suministro genico en celulas vasculares. Como se usa en la presente memoria, la "transferencia de genes" significa el procedimiento de introduccion de una molecula de acido nucleico extrana en una celula, que normalmente se lleva a cabo para permitir la expresion de un producto particular codificado por el gen. Dicho producto puede incluir una protema, polipeptido, ADN de sentido contrario o ARN, o ARN enzimaticamente activo. La transferencia de genes se puede realizar en celulas cultivadas o por administracion directa a mamfferos.
En otra realizacion, se proporciona un vector que comprende una secuencia de molecula de acido nucleico que codifica un peptido de acuerdo con la invencion. En realizaciones particulares, el vector se genera de modo que la secuencia de molecula de acido nucleico es expresada solo en un tejido espedfico. Los metodos para conseguir la expresion genica espedfica de tejido son bien conocidos en la tecnica. De acuerdo con una realizacion, esto se logra poniendo la secuencia que codifica un peptido de acuerdo con la invencion, bajo el control de un promotor que dirige la expresion en uno o mas tejidos particulares.
Se pueden usar vectores de expresion derivados de virus tales como retrovirus, virus vaccinia, adenovirus, virus adenoasociados, virus el herpes, virus de ARN o virus del papiloma bovino, para el suministro de secuencias de nucleotidos (p. ej., ADNc) que codifican peptidos, homologos o derivados de los mismos de acuerdo con la invencion, en los tejidos o poblacion celular seleccionados. Se pueden usar metodos que son bien conocidos para los expertos en la tecnica para construir vectores recombinantes que contienen dichas secuencias codificantes.
Por consiguiente, la presente invencion describe el uso de un acido nucleico que es capaz de expresar los peptidos de la invencion, in vivo, para el tratamiento y/o prevencion de enfermedades alergicas y autoinmunitaria. De acuerdo con una realizacion, el acido nucleico capaz de expresar un peptido de acuerdo con la invencion in vivo, es una secuencia que codifica dicho peptido, que esta operativamente unida a un promotor. Dicha secuencia se puede administrar directa o indirectamente. Por ejemplo, un vector de expresion que contiene la secuencia codificante para un peptido de acuerdo con la invencion, se puede insertar en celulas, despues de lo cual dichas celulas se cultivan in vitro y despues se inyectan o infunden al paciente. Alternativamente, el acido nucleico capaz de expresar un peptido de acuerdo con la invencion in vivo, es una secuencia que modifica la expresion endogena de las celulas. El metodo de terapia genica puede implicar el uso de un vector de adenovirus que incluye una secuencia de nucleotidos que codifica los peptidos, homologos o derivados de los mismos de acuerdo con la invencion, o una molecula de acido nucleico desnuda que codifica un peptido de acuerdo con la invencion. Alternativamente, se pueden inyectar celulas modificadas geneticamente que contienen una molecula de acido nucleico que codifica un peptido de acuerdo con la invencion.
Cuando la administracion de uno o mas peptido de acuerdo con la invencion se asegura por transferencia genica (es decir, la administracion de un acido nucleico que asegura la expresion de los peptidos de acuerdo con la invencion in vivo, tras administracion), la dosis adecuada del acido nucleico se puede determinar basandose en la cantidad de peptido expresado como resultado del acido nucleico, tal como, p. ej., determinando la concentracion de peptido en la sangre despues de administracion. Por lo tanto, en una realizacion particular, los peptidos de la invencion se administran mediante el uso de polinucleotidos que codifican dichos peptidos, sea en un vector de expresion o no, y por lo tanto, la presente invencion tambien se refiere a metodos de terapia genica. Otra realizacion particular se refiere al uso de metodos para inducir un exceso de expresion local del peptido de la invencion, para el tratamiento o prevencion de trastornos inmunitarios.
Otro aspecto mas de la presente invencion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden uno o mas peptidos de acuerdo con la presente invencion, comprendiendo ademas un vedculo farmaceuticamente aceptable.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Como se ha detallado antes, la presente invencion tambien se refiere a las composiciones para usar como un medicamento o a los metodos para el tratamiento de un mairnfero de un trastorno inmunitario, usando dicha composicion, y al uso de dichas composiciones para la fabricacion de un medicamento para la prevencion o tratamiento de trastornos inmunitarios.
La composicion farmaceutica podna ser, por ejemplo, una vacuna adecuada para tratar o prevenir trastornos inmunitarios, en especial alergia de transmision aerea y transmision alimentaria, asf como enfermedades de origen alergico. Como un ejemplo descrito ademas en la presente memoria de una composicion farmaceutica, un peptido de acuerdo con la invencion se adsorbe sobre un adyuvante adecuado para la administracion a mamnferos, tales como hidroxido de aluminio (alumbre). Tfpicamente, se inyectan 50 |jg del peptido adsorbido sobre alumbre por via subcutanea en 3 ocasiones en un intervalo de 2 semanas. Sera evidente para los expertos en la tecnica que son posibles otras vfas de administracion, que incluyen la via oral, intranasal o intramuscular. Ademas, el numero de inyecciones y la cantidad inyectada pueden variar dependiendo de las afecciones que se van a tratar. Ademas se pueden usar otros adyuvantes distintos del alumbre, con la condicion de que faciliten la presentacion del peptido en la presentacion de MHC de clase II y la activacion de linfocitos T. Por lo tanto, aunque los ingredientes activos se pueden administrar solos, tipicamente se presentan como formulaciones farmaceuticas. Las formulaciones, tanto para uso veterinario como para uso humano, de la presente invencion, comprenden al menos un ingrediente activo, como se ha descrito antes, junto con uno o mas vetuculos farmaceuticamente aceptables. Una realizacion particular de la presente invencion se refiere a composiciones farmaceuticas, que comprende como un ingrediente activo, uno o mas peptidos de acuerdo con la invencion, mezclados con un vetuculo farmaceuticamente aceptable. La composicion farmaceutica de la presente invencion debe comprender una cantidad terapeuticamente eficaz del ingrediente activo, como se ha indicado en lo que antecede con respecto al metodo de tratamiento o prevencion. Opcionalmente, la composicion comprende ademas otros ingredientes terapeuticos. Otros ingredientes terapeuticos adecuados, asf como su dosis habitual dependiendo de la clase a la que pertenezcan, son bien conocidos para los expertos en la tecnica y se pueden seleccionar de otros farmacos conocidos usados para tratar trastornos inmunitarios.
La expresion "vetuculo farmaceuticamente aceptable" como se usa en la presente memoria, significa cualquier material o sustancia con la que se formula el ingrediente activo con el fin de facilitar su aplicacion o diseminacion en el sitio que se va a tratar, por ejemplo, disolviendo, dispersando o difundiendo dicha composicion, y/o facilitar su almacenamiento, transporte o manipulacion sin deteriorar su eficacia. Incluyen todos y cada uno de los medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos (por ejemplo, fenol, acido sorbico, clorobutanol), agentes isotonicos (tales como azucares o cloruro sodico) y similares. Se pueden incluir ingredientes adicionales con el fin de controlar la duracion de la accion del ingrediente activo anticuerpo monoclonal en la composicion. El vetuculo farmaceuticamente aceptable puede ser un solido o un lfquido o un gas que se ha comprimido para formar un lfquido, es decir, las composiciones de esta invencion se pueden usar de forma adecuada como concentrados, emulsiones, soluciones, granulados, polvos espolvoreables, pulverizadores, aerosoles, suspensiones, pomadas, cremas, comprimidos, granulos o polvos. Dichos vehfculos farmaceuticos aceptables para usar en dichas composiciones farmaceuticas y su formulacion, son bien conocidos para los expertos en la tecnica, y no hay restriccion particular para su seleccion dentro de la presente invencion. Tambien pueden incluir aditivos tales como agentes humectantes, agentes dispersantes, adherentes, adhesivos, agentes emulsionantes, disolventes, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos (por ejemplo, fenol, acido sorbico, clorobutanol), agentes isotonicos (tales como azucares o cloruro sodico) y similares, con la condicion de que estos sean coherentes con la practica farmaceutica, es decir, vehfculos y aditivos que no creen dano permanente a mamfferos. Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se pueden preparar de cualquier forma conocida, por ejemplo, mediante mezcla homogenea, recubrimiento y/o molienda de los ingredientes activos, en un procedimiento en una etapa o en multiples etapas, con el material vehfculo seleccionado y, cuando sea adecuado, otros aditivos tales como agentes tensioactivos. Tambien se pueden preparar por micronizacion, por ejemplo, con vistas a obtenerlos en forma de microesferas que normalmente tienen un diametro de aproximadamente 1 a 10 jm, en concreto para la fabricacion de microcapsulas para la liberacion controlada o sostenida de los ingredientes activos.
Los agentes tensioactivos adecuados, tambien conocidos como emulgente o emulsionante, para usar en las composiciones farmaceuticas de la presente invencion, son materiales no ionicos, cationicos y/o anionicos que tienen buenas propiedades de emulsion, dispersion y/o humectantes. Los tensioactivos anionicos adecuados incluyen tanto jabones solubles en agua como agentes tensioactivos sinteticos solubles en agua. Los jabones adecuados son sales de metales alcalinos y alcalinoterreos, sales de amonio no sustituidas o sustituidas de acidos grasos superiores (C10-C22), pej. las sales de sodio o potasio de acido oleico o estearico, o de mezclas de acidos grasos naturales que se pueden obtener de aceite de coco o aceite de sebo. Los tensioactivos sinteticos incluyen sales de sodio o calcio de acidos poliacnlicos; sulfonatos y sulfatos grasos; derivados de bencimidazol sulfonato y alquilarilsulfonatos. Los sulfonatos y sulfatos grasos estan normalmente en forma de sales de metales alcalinos o alcalinoterreos, sales de amonio no sustituidas o sales de amonio sustituidas con un radical alquilo o acilo que tiene de 8 a 22 atomos de carbono, p. ej., la sal de sodio o calcio del acido lignosulfonico o acido dodecilsulfonico, o una mezcla de sulfatos de alcoholes grasos obtenidos de acidos grasos naturales, sales de metales alcalinos o alcalinoterreos de esteres de acido sulfurico o sulfonico (tales como laurilsulfato sodico) y acidos sulfonicos de alcohol graso/aductos de oxido de etileno. Los derivados de bencimidazol sulfonado adecuados tfpicamente contienen de 8 a 22 atomos de carbono. Los ejemplos de alquilarilsulfonatos son las sales de sodio, calcio o
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
alcanolamina de acido dodecilbencenosulfonico o dibutilnaftalenosulfonico o un producto de condensacion de acido naftalenosulfonico/formaldetHdo. Tambien son adecuados los correspondientes fosfatos, p. ej., sales de ester de acido fosfonico y un aducto de p-nonilfenol con oxido de etileno y/o propileno, o fosfoUpidos. Los fosfolfpidos adecuados para este fin son los fosfolfpidos naturales (procedentes de celulas animales o vegetales) o sinteticos del tipo cefalina o lecitina, tales como p.ej. fosfatidil-etanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerina, lisolecitina, cardiolipina, dioctanilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina y sus mezclas.
Los tensioactivos no ionicos adecuados incluyen derivados polietoxilados y polipropoxilados de alquilfenoles, alcoholes grasos, acidos grasos, aminas o amidas alifaticas que contienen al menos 12 atomos de carbono en la molecula,, alquilarensulfonatos y dialquilsulfosuccinatos, tales como derivados del eter poliglicolico de alcoholes alifaticos y cicloalifaticos, acidos grasos saturados e insaturados y alquilfenoles, dichos derivados tipicamente contienen de 3 a 10 grupos eter glicolico y de 8 a 20 atomos de carbono en el resto hidrocarbonado (alifatico) y de 6 a 18 atomos de carbono en el resto alquilo del alquilfenol. Tensioactivos no ionicos adecuados adicionales son aductos solubles en agua de poli(oxido de etileno) con polipropilenglicol, etilendiaminopolipropilenglicol que contiene de 1 a 10 atomos de carbono en la cadena de alquilo, con aductos que contienen de 20 a 250 grupos de eter etilenglicol y/o de 10 a 100 grupos de eter propilenglicol. Dichos compuestos normalmente contienen de 1 a 5 unidades de etilenglicol por unidad de propilenglicol. Ejemplos representativos de tensioactivos no ionicos son nonilfenol-polietoxietanol, esteres poliglicolicos de aceite de ricino, aductos de poli(oxido de propileno)/poli(oxido de etileno), tributilfenoxipolietoxietanol, polietilenglicol y octilfenoxipolietoxietanol. Los esteres de acidos grasos de polietilensorbitan (tales como trioletato de sorbitan polioxietilenico), glicerol, sorbitan, sacarosa y pentaeritritol, tambien son tensioactivos no ionicos adecuados. Los tensioactivos cationicos adecuados incluyen sales de amonio cuaternario, en particular haluros, que tienen 4 radicales hidrocarbonados opcionalmente sustituidos con halogeno, fenilo, fenilo sustituido o hidroxi; por ejemplo, sales de amonio cuaternario que contienen como N-sustituyente al menos un radical alquilo C8-C22 (p. ej., cetilo, laurilo, palmitilo, miristilo, oleilo y similares) y, como sustituyente adicionales, radicales alquilo inferior no sustituido o halogenado, bencilo y/o hidroxialquilo inferior.
Se puede encontrar una descripcion mas detallada de agentes tensioactivos adecuados para este fin, por ejemplo, en "McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual" (MC Publishing Crop., Ridgewood, New Jersey, 1981), "Tensid-Taschenbucw', 2a ed. (Hanser Verlag, Vienna, 1981) y "Encyclopaedia of Surfactants, (Chemical Publishing Co., New York, 1981). Los peptidos, homologos o derivados de los mismos de acuerdo con la invencion (y sus sales fisiologicamente aceptables o composiciones farmaceuticas todos incluidos en la expresion "ingredientes activos") se pueden administrar por cualquier via adecuada para la afeccion que se va a tratar y adecuada para los compuestos, aqu las protemas y fragmentos que se van a administrar. Las posibles vfas incluyen via regional, sistemica, oral (forma solida o inhalacion), rectal, nasal, topica (incluyendo ocular, bucal y sublingual), vaginal y parenteral (incluyendo subcutanea, intramuscular, intravenosa, intradermica, intraarterial, intratecal y epidural). La via de administracion preferida puede variar, por ejemplo, con la afeccion del receptor o con las enfermedades que se van a tratar. Como se describe en la presente memoria, el o los vehnculos son "aceptables" de forma optima en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulacion y no ser perjudiciales para su receptor. Las formilaciones incluyen las adecuadas para la administracion oral, rectal, nasal, topica (incluyendo ocular, bucal y sublingual), vaginal y parenteral (incluyendo subcutanea, intramuscular, intravenosa, intradermica, intraarterial, intratecal y epidural). Las formulaciones se pueden presentar de forma conveniente en forma farmaceutica y se pueden preparar por cualquiera de los metodos bien conocidos en la tecnica de la farmacia. Dichos metodos incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con el vehfculo que constituye uno o mas ingredientes auxiliares. En general, las formulaciones se preparan por asociacion uniforme e mtima del ingrediente activo con vehnculos lfquidos o vehnculos solidos finamente divididos o ambos, y despues, si es necesario, conformando el producto. Las formulaciones de la presente invencion adecuadas para la administracion oral se pueden presentar como unidades discretas tales como capsulas, sellos o comprimidos, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del ingrediente activo; en forma de polvo o granulos; en forma de solucion o una suspension en un lfquido acuoso o lfquido no acuoso; o en forma de una emulsion lfquida de aceite en agua o una emulsion lfquida de agua en aceite. El ingrediente activo tambien se puede preparar en forma de un bolo, electuario o pasta. Un comprimido puede estar hecho por compresion o moldeo, opcionalmente con uno o mas ingredientes auxiliares. Los comprimidos por compresion se pueden preparar por compresion en una maquina adecuada del ingrediente activo en una forma fluida tal como un polvo o granulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, tensioactivo o agente dispersante. Se pueden hacer comprimidos moldeados por moldeo en una maquina adecuada de una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente lfquido inerte. Los comprimidos se pueden opcionalmente recubrir o ranurar y se pueden formular para proporcionar liberacion lenta o controlada del ingrediente activo de los mismos.
Para tratamientos locales, por ejemplo, en la piel, tal como de la articulacion, las formulaciones se aplican opcionalmente como una pomada o crema topica que contiene el o los ingredientes activos en una cantidad de, por ejemplo, 0,075 a 20% en p/p (que incluye el o los ingredientes activo en un intervalo entre 0,1% y 20% en incrementos de 0,1% en p/p tal como 0,6% en p/p, 0,7% en p/p, etc.), en particular de 0,2 a 15% en p/p y mas en particular de 0,5 a 10% en p/p. Cuando se formula en una pomada, los ingredientes activos se pueden usar con una base de pomada parafrnica o miscible en agua. Alternativamente, los ingredientes activos se pueden formular en una crema con una base de crema de aceite en agua. Si se desea, la fase acuosa de la base de crema puede incluir, por ejemplo, al menos 30% en p/p de un alcohol polihndrico, es decir, un alcohol que tiene dos o mas grupos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
hidroxilo tal como propilenglicol, butano, 1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol y polietilenglicol (incluyendo PEG400) y mezclas de los mismos. Las formulaciones topicas pueden incluir de forma conveniente un compuesto que potencia la absorcion o penetracion del ingrediente activo a traves de la piel u otras zonas afectadas. Los ejemplos de dichos potenciadores de la penetracion dermica incluyen dimetilsulfoxido y analogos relacionados. La fase aceitosa de las emulsiones de esta invencion puede estar constituida de ingredientes conocidos en una forma conocida. Aunque la fase puede comprender simplemente un emulsionante (conocido tambien como un emulgente), comprende de forma conveniente una mezcla de al menos un emulsionante con una grasa o un aceite o tanto con una grasa como con un aceite. Opcionalmente, se incluye un emulsionante hidrofilo junto con un emulsionante lipofilo que actua como un estabilizante, tfpicamente incluyendo ambos un aceite y una grasa. Juntos, el o los emulsionantes con o sin el o los estabilizantes componente la llamada cera emulsionante, y la cera junto con el aceite y la grasa componente la llamada basa de pomada emulsionante que forma la fase dispersada en aceite de las formulaciones en crema.
La eleccion de los aceites y grasas adecuados para la formulacion se basa en lograr las propiedades cosmeticas deseadas, puesto que es probable que la solubilidad del compuesto activo en la mayona de los aceites que se van a usar en formulaciones farmaceuticas sea muy baja. Por lo tanto, la crema podna ser opcionalmente un producto no graso, que no mancha y lavable con consistencia adecuada para evitar la perdida de los tubos u otros recipientes. Se pueden usar esteres de alquilo mono o dibasico de cadena lineal o ramificada tales como diisoadipato, estearato de isocetilo, diester de propilenglicol y acidos grasos de coco, miristato de isopropilo, oleato de decilo, palmitato de isopropilo, y en particular estearato de butilo, palmitato de 2-etilhexilo o una mezcla de esteres de cadena ramificada conocida como Crodamol CAP. Estos se pueden usar solos o en combinacion dependiendo de las propiedades requeridas. Alternativamente, se pueden usar lfpidos de alto punto de fusion, tales como parafina blanda blanca y/o parafina lfquida u otros aceites minerales. Las formulaciones adecuadas para la administracion topica en el ojo tambien incluyen colirios en donde el ingrediente activo se disuelve o suspende en un vehnculo adecuado, en especial un disolvente acuoso para el ingrediente activo. El ingrediente activo esta presente opcionalmente en dichas formulaciones en una concentracion de 0,5 a 20%, ventajosamente de 0,5 a 10% en particular aproximadamente 1,5% en p/p. Las formulaciones adecuadas para la administracion topica en la boca incluyen pastillas para chupar que comprenden el ingrediente activo en una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arabiga o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arabiga; y enjuagues bucales que comprende el ingrediente activo en un vehnculo lfquido adecuado. Las formulaciones para administracion rectal pueden estar presentes como un supositorio con una base adecuada que comprende, por ejemplo, manteca de cacao o un salicilato. Las formulaciones adecuadas para administracion nasal en donde el vehnculo es un solido, incluyen un polvo grueso que tiene un tamano de partfculas, por ejemplo, en el intervalo de 20 a 500 micrometros (que incluye tamanos de partfculas en el intervalo entre 20 y 500 micrometros en incrementos de 5 micrometros tal como 30 micrometros, 35 micrometros, etc.), que se administra de una forma en la que se toma una aspiracion, es decir, mediante inhalacion rapida a traves de la fosa nasal desde un recipiente del polvo mantenido cerca de la nariz. Las formulaciones adecuadas en donde el vehnculo es un lfquido, para administracion, por ejemplo, como un pulverizador nasal o como gotas nasales, incluyen soluciones acuosas o aceitosas del ingrediente activo. Las formulaciones adecuadas para la administracion por aerosol se pueden preparar de acuerdo con metodos convencionales y se pueden suministrar con otros agentes terapeuticos. Las formulaciones adecuadas para la administracion vaginal se pueden presentar como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en pulverizador que contienen ademas del ingrediente activo vehnculos tales como los que se sabe en la tecnica que son adecuados. Las formulaciones adecuadas para la administracion parenteral incluyen soluciones para inyeccion esteriles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostaticos y solutos, que hacen a la formulacion isotonica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones esteriles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspension y agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitarias o de multiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y se pueden almacenar en condiciones liofilizadas que requieren solo la adicion del vehnculo lfquido esteril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de usar. Las soluciones y suspensiones para inyeccion extemporanea se pueden preparar a partir de polvos, granulos y comprimidos esteriles del tipo previamente descrito.
Las formas farmaceuticas unitarias son las que contienen una dosis diaria o una subdosis diaria unitaria, como se ha descrito antes en la presente memoria, o una fraccion adecuada de la misma, de un ingrediente activo. Debe entenderse que ademas de los ingredientes mencionados antes en particular, las formulaciones de esta invencion pueden incluir otros agentes convencionales en la tecnica, teniendo en cuenta el tipo de formulacion en cuestion, por ejemplo las adecuadas para administracion oral pueden incluir agentes de sabor. Los peptidos, homologos o derivados de los mismos de acuerdo con la invencion se pueden usar para proporcionar formulaciones farmaceuticas de liberacion controlada que contienen como ingrediente activo uno o mas compuestos de la invencion ("formulaciones de liberacion controlada") en las que la liberacion del ingrediente activo se puede controlar y regular para permitir la administracion menos frecuente o para mejorar el perfil farmacocinetico o de toxicidad de una compuesto dado de la invencion. Las formulaciones de liberacion controlada adaptadas para la administracion oral, en las que unidades discretas comprenden uno o mas compuestos de la invencion, se pueden preparar de acuerdo con metodos convencionales. Se pueden incluir ingredientes adicionales con el fin de controlar la duracion de la accion del ingrediente activo en la composicion. Las composiciones de liberacion controlada pueden, por lo tanto, conseguirse mediante la seleccion adecuada de vehnculos polfmeros tales como por ejemplo poliesteres, poliaminoacidos, polivinilpirrolidona, copolfmeros de etileno-acetato de vinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
sulfato de protamina y similares. La velocidad de liberacion del farmaco y la duracion de la accion se pueden controlar incorporando el ingrediente activo en partfculas, p. ej., microcapsulas, de una sustancia polimerica tal como hidrogeles, poli(acido lactico), hidroximetilcelulosa, poli(metacrilato de metilo) y otros poftmeros descritos antes. Dichos metodos incluyen sistemas de suministro de farmacos coloidales tales como liposomas, microesferas, microemulsiones, nanopartfculas, nanocapsulas, etc. Dependiendo de la via de administracion, la composicion farmaceutica puede requerir recubrimientos protectores. Las formas farmaceuticas adecuadas para inyeccion incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de las mismas. Los veldculos tfpicos para este fin incluyen, por lo tanto, tampones acuosos biocompatibles, etanol, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares, y mezclas de los mismos. En vista del hecho de que cuando los ingredientes activos se usan en combinacion, no proporcionan necesariamente su efecto terapeutico conjunto directamente al mismo tiempo en el mamfero que se va a tratar, la composicion correspondiente tambien puede estar en forma de un kit o envase medico que contiene los dos ingredientes en repositorios o compartimentos separados pero adyacentes. En este ultimo contexto, cada ingrediente activo se puede formular, por lo tanto, de una forma adecuada para una via de administracion diferente de la del otro ingrediente, p. ej., uno de ellos puede estar en forma de una formulacion oral o parenteral mientras que el otro esta en forma de una ampolla para inyeccion intravenosa o un aerosol.
La parte experimental de la presente invencion muestra un subconjunto de linfocitos T espedficos de antfgeno, inducidos in vivo y faciles de expandir, con propiedades reguladoras. Esto ultimo incluye: (1) induccion de apoptosis de APC despues de la activacion cognada dependiente de MHC de clase II, que afecta tanto a celulas dendnticas como linfocitos B, y demostrado in vitro e in vivo, y; (2) supresion de linfocitos T inespedficos por un mecanismo dependiente de contacto en ausencia de IL-10 y/o TGF-p. La presente invencion describe ademas metodos para distinguir Treg citolfticos inducidos tanto de Treg naturales como adaptativos. Basado en la caracterizacion de 15 clones, el fenotipo de superficie se define como CD25hi, CTLA-4hi, GITR+ y ICOS+, pero CD127(-). Dichos clones expresan niveles bajos de CD62L y CD103 pero no CCR7. La produccion de citoquinas estaba limitada a IFN- gamma, sin TGF-beta o IL-10. Todos los clones eran Foxp3(-) pero fuertemente positivos para T-bet y Egr-2, junto con niveles altos de transcrito para granzima B. Los Treg naturales se definen por la expresion de Foxp3 y ausencia de CD127, producen niveles altos de IL-10, al menos in vitro, y son espedficos para autoantfgenos. Entre los numerosos linfocitos T adaptativos descritos hasta ahora, la mayona comparten la produccion de IL-10 (y TGF-beta en algunos casos como en las celulas Th3) y son negativos para Foxp3 y CD25. Es central para los Treg citolfticos la fuerte expresion de T-bet. T-bet es inducido por IFN-y por una via dependiente de STAT1 y ejerce diferentes actividades, incluyendo la supresion de la transcripcion de IL-2, induccion de transcripcion de granzima y es un factor de maduracion para la diferenciacion de Th1.
No se encontro transcrito para IL-2 en los clones de linfocitos T de la presente invencion y, es interesante que la IL-2 endogena no restablece la transcripcion de IL-2, incluso despues de repetidos ciclos de estimulacion in vitro. Esto sugiere que los Treg citolfticos han sufrido un alteracion epigenetica, que mantendna su actividad reguladora tanto in vitro como in vivo. Aunque T-bet es necesario para la maduracion del subconjunto de Th1, su expresion no cualifica necesariamente a las celulas como perteneciente a dicho linaje. La induccion de granzima B por T-bet se ha observado con linfocitos T citolfticos CD8+. Los Treg descritos aqrn son anergicos en el sentido de que no eran capaces de proliferar y/ o producir IL-2 tras reticulacion de su receptor de antfgeno. Es interesante, que esta estado anergico podna superarse por la adicion de IL-2. Se observo una expresion afta del factor de transcripcion Egr-2 (Krox-20), que regula por aumento los inhibidores del ciclo celular p21cip1 y p27kip. Se sabe que la IL-2 puede anular la supresion mediada por Egr-2, posiblemente por activacion de NF-kB. Este ultimo regula por aumento la transcripcion de granzimas, lo cual puede tener un efecto sinergico con T-bet para la produccion de granzimas. Debe tenerse presente que las propiedades reguladoras no se pierden cuando las celulas son estimuladas por la adicion de IL-2. En una realizacion particular, esta es una propiedad de los Treg citolfticos presentes, un subconjunto de celulas aparentemente estable que ejerce su actividad reguladora tras activacion dependiente de IL-2. La induccion de apoptosis es el mecanismo en la base de la actividad reguladora. Esto se demostro tanto a nivel de las APC como de linfocitos T inespedficos, mostrando la activacion de caspasa 3 y/o union de anexina. Se mostro que las dos rutas principales que conducen a la apoptosis eran activadas en los Treg citolfticos. Tanto la produccion de GrB como de perforina se indujeron por activacion de Treg, con mayor transcripcion de GrB pero no de granzima A. GrB a diferencia de GrA, induce la apoptosis por al menos dos mecanismos, en concreto la activacion directa e indirecta de pro-caspasa 3, esta ultima por la liberacion de citocromo C por mitocondrias y activacion de caspasa 9. Los inhibidores espedficos de GrB mostraron reduccion significativa de la induccion de apoptosis y solo en concentraciones cercanas a la citotoxicidad celular. Es dudoso si es necesaria la perforina para dicha actividad, puesto que EFTA no bloquea la apoptosis en ningun grado significativo. La segunda ruta por la cual se puede inducir apoptosis es la ruta Fas-FasL. Es interesante que FasL esta presente en la exocitosis de granulos junto con granzimas, y se ancla a la membrana tras la activacion celular, que constituye la ruta principal para la expresion de FasL en linfocitos T. FasL senaliza a traves de Fas conduciendo a la activacion de la caspasa 8, con activacion corriente abajo de la caspasa 3 y caspasa 9 por la liberacion mitocondrial de citocromo C, mediante sinergia con GrB. La inhibicion parcial de la apoptosis se obtuvo usando un anticuerpo espedfico de FasL. La participacion relativa de las rutas de GrB y FasL esta dirigida por la extension de la expresion de FasL. Por lo tanto, las celulas Wehi que tienen una expresion constitutiva alta de Fas son lisadas facilmente por los Treg, comparado, por ejemplo, con las celulas dendnticas. No esta totalmente establecido si la accion combinada de GrB y FasL da cuenta de toda la actividad citolftica, puesto que experimentos preliminares han mostrado que la combinacion de los dos inhibidores
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
no anula la apoptosis celular dirigida. Se sabe que las granzimas son secretadas por los Treg. Por lo tanto, la granzima B esta implicada en el mecanismo por el cual los Treg naturales controlan las respuestas inmunitarias, tanto en seres humanos como en los ratones. Los ratones que no expresan GrB pueden tener un defecto en la regulacion. Sin embargo, es diffcil establecer en que medida los Treg inducidos usan las granzimas para ejercer su actividad reguladora. Una publicacion muestra que la proporcion de Treg de tipo Tr1 activados por anticuerpos anti- CD3 y anti-CD46 expresan GrB. Una dificultad que todav^a hay que resolver con las granzimas es la falta de inhibidores espedficos y eficaces. Los inhibidores qmmicos o peptfdicos, tales como los usados en la presente invencion (ejemplo 11), requieren altas concentraciones para ser activos. El uso de la ruta Fas-FasL no se ha descrito antes en Treg adaptativos, y muy pocos datos indican que los Terg CD4+CD25+ naturales podnan usar tambien Fas-L como mecanismo. Hay que destacar que se observa induccion de apoptosis con celulas dendrfticas y linfocitos B, sugiriendo que tanto las repuestas inmunitarias primarias y secundarias pueden ser reguladas. Ademas, los Treg que reconocen un solo epftopo de linfocito T incluso de antfgenos complejos, tienen la capacidad de suprimir la respuesta a la protema entera eliminando la celula presentadora de antfgeno, Esto esta bien ilustrado por los datos in vivo, en los que la respuesta hacia el alergeno completo, Der p 2, es suprimida despues de la transferencia adoptiva de un solo clon de Treg. Este efecto esta reforzado por la supresion de linfocitos T inespedficos, incluso cuando estos ultimos son activados por la interaccion con una APC diferente, siempre que sea posible el contacto celular entre Treg y linfocitos T efectores. Es interesante que los Treg pueden regular los linfocitos T efectores en diferentes estadios de maduracion, Th0, Th1 o Th2. Es importante que los Treg citolfticos inducen la apoptosis en celulas diana y no necrosis. Las APC apoptoticas pueden tener una funcion en la supresion. De hecho se ha demostrado que las celulas apoptoticas recogidas por celulas presentadoras de antfgenos inducen tolerancia, mientras que las celulas necroticas inducen mas bien inflamacion. In vivo, la supresion casi completa de la inflamacion en los pulmones debena considerarse verdaderamente como un sfmbolo de la apoptosis de celulas diana en lugar de necrosis. Un aspecto de la presente invencion es la demostracion de que la apoptosis de linfocitos B ocurre tambien in vivo. Por lo tanto, los ratones sometidos a transferencia adoptiva de linfocitos B que expresan p21-35 seguido de Treg citolfticos de la especificidad correspondiente, muestran la desaparicion completa de linfocitos B, detectados en el bazo. No es probable que los linfocitos B transgenicos hubieran migrado a otros sitios. No se encontraron pruebas de dichas celulas en pulmones o en el hftgado. Las propiedades funcionales de las celulas transgenicas p21-35 son identicas a las de los linfocitos B incubados con el peptido en un ensayo de carga convencional. Se muestra aqrn que los linfocitos B transgenicos son inducidos a la apoptosis in vitro por cocultivo con Treg citolfticos, indicando una buena prueba de la importancia in vivo de la citolisis de APC. Se presto particular atencion a la posible implicacion de IL-10. Los Treg naturales, asf como la mayona si no todos los subconjuntos de Treg adaptativos, producen IL-10 (Levings et al. (2002) Int. Arch. Allergy Immunol. 129, 263-276. Uno de estos subtipos era inducido despues de exposicion respiratoria a alergeno y expresaba Foxp3, GATA3, y no produda IFN- Y (Akbari et al. (2002) Nature medicine 8, 1024-1032). Se indujo otro tipo durante las condiciones de polarizacion fuerte de Th1 (Listeria monocytogenes como adyuvante), expresaba Foxp3, T-bet, y produda IFN-y (Stock et al. (2004) Nat. Immunol. 5, 1149-1156). Ambos subconjuntos podfan inhibir la hiperreactividad de las vfas aereas y la inflamacion por un mecanismo dependiente de IL-10. No habfa pruebas de la produccion de IL-10 por los Trec citolfticos negativos para Foxp3 ni activacion de STAT3 o SP1. La observacion de que la induccion de la apoptosis requena contacto directo de celulas como se muestra en los experimentos en transpocillos, y la supresion conocida de la transcripcion de IL-10 por el IFN-gamma, siendo este ultimo producido en altos niveles por todas los Treg citolfticos, se considero una prueba contra la implicacion significativa de la IL-10 en la actividad de los Treg citolfticos. Hay que destacar que un adyuvante medio como el alumbre era todo lo que se requena. Es interesante que la inmunizacion con el peptido mp21-35 peptido hecho en CFA/IFA era incluso mas eficaz en la supresion de la inflamacion e hiperreactividad de las vfas aereas, pero esto era en detrimento de la acumulacion de un gran numero de linfocitos Th1 en los pulmones. Ademas, esto muestra que la inmunizacion en CFA no consiguio producir Treg citolfticos. La metilacion de la cistema aumentaba la presentacion de MHC de clase II, pero esto es atribuible a la mayor estabilidad del peptido y mayor captacion por las APC. Es interesante que no era posible inducir Treg citolfticos contra el segundo epftopo de linfocito T mayor de Der p 2, p71-85. La sustitucion de la isoleucina 28 por la asparagina reduda la afinidad de union a las moleculas MHC de clase II, que se mostro que no era perjudicial para la produccion de Treg citolfticos. Se ha descrito que peptidos alterados que llevan epftopos de linfocitos T o bien aumentan la afinidad de union y/o reconocimiento de TCR, o bien inducen tolerancia, un resultado a veces diffcil de predecir. En el caso presente, tanto los Treg citolfticos como efectores reconodan el mismo epftopo, y podfan expandirse in vitro con p21-25 en su secuencia natural o mutada.
Un aspecto interesante del presente estudio era la demostracion de que los Treg citolfticos migraban hacia los pulmones tras la exposicion de las vfas aereas al alergeno Der p 2, y esto en ausencia de sensibilizacion con alergeno periferico. Las quimioquinas implicadas en atraer los linfocitos T al pulmon no estan identificadas de forma precisa. Los Treg citolfticos descritos aqrn expresan CD103 pero no CCR7, lo que les conferina la capacidad para migrar a tejidos inflamados. Otras quimioquinas como CCR5 y CCR3 no se detectaron. Sin embargo, el sistema modelo usado aqrn, en el que los ratones sometidos a transferencia adaptativa de Treg citolfticos se someten a 2 series de 3 instilaciones nasales a intervalos de una semana, no produce inflamacion significativa en los pulmones, como se muestra en los ratones de control sometidos solo a la inhalacion de alergeno. El un modelo experimental de asma, que incluye sensibilizacion periferica e inhalacion de alergeno, se mostro que los Treg tienen capacidad de prevenir y suprimir tanto la infiltracion inflamatoria como la hiperreactividad de las vfas aereas, que son caractensticas distintivas del asma bronquial. Se uso una forma recombinante exenta de LPS de un alergeno principal, Der p 2, que esta implicada en una gran proporcion de pacientes que padecen asma alergico. En estudios
paralelos, se determino que el peptido p21-35 activaba linfocitos T efectores CD4+ de pacientes sensibilizados con Der p 2. Un clon de linfocito T espedfico de p21-35 derivado de dicho paciente, muestra propiedades comparables con las de los Treg citolfticos de raton, lo que sugiere que los Treg citolfticos son generados como parte de una respuesta inmunitaria normal a un alergeno tal como Der p 2.
5 Estas observaciones respaldan la utilidad de los Treg citolfticos de acuerdo con la invencion, para tratar el asma alergico en clmica. Los Treg citolfticos son activados y expandidos facilmente por la presentacion de epftopo restringida a MHC de clase II, y no producen citoquinas supresoras, lo que proporciona la especificidad requerida para uso clmico. Ademas, dichos Treg se obtienen tras inmunizacion usando adyuvante convencional, en concreto alumbre, sin requerirse material derivado de bacterias tal como micobacteria o CFA. Lo mas esperanzador es la 10 observacion de que la hiperreactividad de las vfas aereas frente a un estimulante no espedfico, en concreto la metacolina, era reducida significativamente incluso despues de sensibilizacion con alergeno. Esto era inesperado, puesto que la inflamacion e hiperreactividad de las vfas aereas no estan necesariamente conectadas. De hecho, en el modelo de asma de Der p 2, los dos fenomenos estan disociados entre sf.
La presente invencion ahora se ilustrara mediante los siguientes ejemplos que se proporcionan sin intencion 15 limitante.
Ejemplos
Ejemplo 1: P21-35 contiene una secuencia consenso de tiorredoxina/glutarredoxina
La tabla 1 muestra la homologfa de secuencia de aminoacidos entre un fragmento de p21-35 y motivos redox C- X(2)-S en protemas de diferentes organismos.
20 La figura 1 muestra la capacidad de p21-35 para reducir los puentes disulfuro en el ensayo de reduccion de insulina (ensayo turbidimetrico). En la presente memoria, se incubo una solucion de insulina (1 mg/ml) que contema DL- Ditiotreitol con una protema o peptido reductor o control durante 20 minutos a 25°C. Despues se midio el aumento de densidad optica a 650 nm (eje Y) debido a la precipitacion de la insulina reducida a pH 7, en diferentes tiempos de medicion (eje X). Se uso un tetramero recombinante de p21-35 (B4) [SEQ ID. NO: 4] con tiorredoxina 25 recombinante como control positivo.
Ejemplo 2: La captacion de p21-35 por las celulas presentadoras de antfgeno aumenta por la adicion de un epftopo de linfocitos T subdominante (figura 2).
La induccion de apoptosis de celulas WEHI B se uso como una medida de la captacion y presentacion de antfgeno. Se mezclaron linfocitos B WEHI (2x104) con un clon de Treg espedfico del peptido p21-35 (relacion 1/1) y 30 concentraciones decrecientes del peptido p21-35 (eje X), o el mismo peptido unido al epftopo T menor de la toxina tetanica (p830-844; T-B). Despues de 18 horas, las celulas se marcaron con anticuerpos anti-CD19-PE (un marcador de celulas WEHI) y anexina V-FITC, un marcador de apoptosis. Las muestras despues se analizaron por citometna de flujo. Los resultados son representativos para la proporcion de celulas WEHI positivas para la anexina V. Se observo un aumento de 100 veces de la capacidad de inducir apoptosis cuando el peptido p21-25 se unio a un 35 epftopo de linfocito T menor, como se indica en la figura 2.
Ejemplo 3: Los restos de aminoacidos implicados en la secuencia consenso de tipo tiorredoxina son decisivos para la expresion de propiedades reguladoras.
El panel A de la figura 3 muestra la situacion del motivo de la secuencia de tipo tiorredoxina dentro del peptido p2135. La secuencia de CHGS [SEQ ID. NO: 3] esta adyacente a la hendidura de union de MHC de clase II. La 40 sustitucion por alanina del resto 21C o resto S24 del motivo de tipo tiorredoxina C-X(2)-S no deteriora el reconocimiento del epftopo de linfocito T medido por la proliferacion (incorporacion de 3H-timidina) de un clon de Treg, se indica en el panel B de la figura 3. La proliferacion se llevo a cabo usando 5x104 celulas WEHI incubadas durante 1 h a 37°C con un peptido 6 pM. Despues las celulas se lavaron y cocultivaron durante 4 dfas con 5x104 linfocitos T. Se anadio 3H-timidina 24 h antes del final del cultivo. La radiactividad se conto en las celulas adsorbidas 45 sobre filtros de fibra de vidrio. La sustitucion de los restos 21 y 24 anula la capacidad del clon de Treg para la lisis de las celulas presentadoras de antfgeno en un ensayo de induccion de apoptosis (vease el panel C de la figura 3) llevado a cabo como se describe en el ejemplo 2.
Ejemplo 4: Generacion de Treg con propiedades fisiologicas tras inyeccion de T-Bb en ratones.
La capacidad del peptido T-B para prevenir el asma inducido por Der p 2 se evaluo como sigue. Un grupo de 8 50 ratones BALB/c (indicados como Tbalum en la figura 4) recibieron 3 inyecciones en la almohadilla de la pata (20 pg por inyeccion) llevado a cabo a intervalos de 2 semanas con el peptido T-B adsorbido sobre alumbre. Dos semanas despues de la ultima inyeccion, todos los ratones recibieron inyecciones IP de rDer p 2 de longitud completa adsorbido sobre alumbre (40 pg por inyeccion) en 3 ocasiones con un intervalo de 2 semanas, seguido de instilaciones nasales de rDer p 2 en solucion salina (100 pg de rDer p 2 en 50 pl de PBS por instilacion). Los 55 resultados se evaluaron por comparacion con un grupo de ratones tratado con rDer p 2 (indicado como "modelo Der p 2" en la figura 4) pero que no recibieron inyecciones de peptido. La figura indica que la preinmunizacion con el
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
peptido reduce significativamente los recuentos de celulas en el BAL evaluado en aparatos Cytospin (figura 4 panel A), puntuaciones de histologfa de pulmones (figura 4, panel B) e hiperreactividad de las vfas aereas (figura 4 panel C) evaluado por la reactividad a concentraciones crecientes de metacolina.
Ejemplo 5: Efecto de P21-35 en el metabolismo oxidativo de linfocitos Treg cognado
Se incubo un clon de Treg (105 celulas) espedfico para p21-35 durante 90 minutos en PBS (figura 5, panel A), peptido p21-35 (20 |jg/ml en 200 jl de PBS; figura 5, panel B) o hidroperoxido de terc-butilo (100 jM en PBS; figura 5, panel
C) , que es un inductor de especies de oxfgeno reactivas (ROS). Despues las celulas se marcaron durante 30 minutos con carboxi-H2DCFDA (12 jM), un marcador fluorogenico para ROS en celulas vivas, y despues se analizaron por citometna de flujo. La figura muestra que el peptido p21-35 estimula el metabolismo oxidativo de linfocitos Treg cognados e induce la duplicacion de la intensidad de fluorescencia debido al aumento de ROS.
Ejemplo 6: Los clones de linfocitos TREG presentan propiedades citotoxicas en celulas presentadoras de antfgeno.
Se ensayaron las propiedades citotoxicas de una lmea Treg (G121) en la lmea de linfocitos B WEHI como una celula presentadora de antfgeno. La figura 6 muestra el % de celulas lisadas a lo largo de un periodo de tiempo de 14 h en presencia de la lmea celular citotoxica sola (WEHI (104 celulas) + linfocito T (104 celulas)), la lmea de linfocitos T con adicion del peptido p21-35 (WEHI + linfocito T + p21), o celulas WEHI precargadas con el peptido p21-35 (WEHIp21 + linfocito T). La lisis de las celulas WEHI se midio usando el ensayo JAM (un ensayo cuantitativo de fragmentacion del ADN): 104 celulas WEHI se preincubaron con 3H-timidina (4,5 jCu/ml, 1 ml) durante 10 h a 37°C y despues se lavaron antes de cocultivo con la lmea de Treg. La liberacion de 3H-timidina en los lfquidos sobrenadantes se tomo como una medida de la lisis de celulas WEHI. Los datos muestran que es necesaria la presencia del peptido para activar la lmea de linfocitos T.
Ejemplo 7: Los clones de linfocitos TREG suprimen la activacion de linfocitos T espedficos para otro epftopo en el mismo antfgeno, o espedficos para otro antfgeno por citotoxicidad (figura 7).
Lmeas de linfocitos T (TCL; 105 celulas) espedficas para Der p 1, un alergeno no relacionado con Der p 2 o espedfico para un epftopo de linfocito T mayor alternativo (p71 -85) situado en Der p 2 se marcaron con CFSE (que es un marcador para protemas citoplasmaticas, que hace posible la evaluacion del numero de divisiones celulares, basado en la intensidad de tincion, que se reduce a 50% cada vez que la celula se divide) (12,5 nanoM) (figura 7). La proliferacion de dichos TCl espedficos para Der p 1 marcados con CFSE (Panel A y B) o TCL p71-85 (panel C y
D) se midio antes (panel A y C) o despues (panel B y D) de incubacion con el clon de Treg citotoxico (relacion 1/1). Se precargaron celulas presentadoras de antfgeno tanto con el alergeno espedfico (Der p 1 o Der p 2; 0,5 ml que conteman 10 jg/ml en cada caso) como con el peptido 21-35 (0,5 ml que conteman 10 jg/ml). Despues de 72 horas de incubacion, las celulas se recogieron, se tineron con yoduro de propidio y se analizaron en un citometro de flujo. Los histogramas y porcentajes en las partes B y D de la figura representan la proporcion de celulas positivas para CFSE vivas residuales (las celulas vivas se discriminaron siendo negativas para el yoduro de propidio). La figura muestra que el clon de Treg citotoxico espedfico para el peptido 21-35 disminuye fuertemente la proliferacion de cada uno de los 2 linfocitos T inespedficos (divisiones CFSE). La mayona de las celulas tenidas con CFSE se volvieron positivas para el marcador de apoptosis yoduro de propidio, indicando que los linfocitos T inespedficos monan en el ensayo.
Ejemplo 8: Determinacion del perfil fenotfpico de los linfocitos Treg.
La figura 8 muestra la produccion de citoquinas de 4 clones de Treg espedficos para p21-35 obtenidos de ratones tratados con la composicion de peptido T-B como en el ejemplo 4 (panel izquierdo). Se analizo en los lfquidos sobrenadantes de los cultivos celulares el contenido de citoquinas despues de cuatro dfas de estimulacion con celulas presentadoras de antfgenos (esplenocitos irradiados de ratones sin tratamiento previo, 105 celulas) y peptido p21-35 (2 jg/ml, 200 jl). Los clones de Treg produdan principalmente IFN-y (IFN-G) y solo cantidades en trazas de TNF-a (TNF-a) e IL-10. El panel derecho muestra el analisis de ARNm de dichos linfocitos Treg. No se detectaron transcritos para el represor de la transcripcion Foxp3, pero T-bet, granzima A y granzima B muestran niveles de transcripcion altos.
La figura 9 muestra los niveles de expresion de diferentes genes en un clon de linfocitos T espedfico para el peptido 21-35 en reposo por separacion de celulas activada por fluorescencia (Facs). En la tabla 4, se proporciona la intensidad de fluorescencia media de 4 clones diferentes (T1 a T4) (2x105 celulas). Se observaron niveles altos de CD25, ICOS, GITR, CD103 y CTLA-4 intracelular. CD28 no era expresado o era muy poco expresado. CD62-L y CD45RB eran expresados con niveles bajos. Todos los anticuerpos eran de Becton-Dickinson (NJ, EE.UU.).
5
10
15
20
25
30
35
40
Tabla 4: Fluorescencia media de clones de Treg marcados con anticuerpo fluorescente
CD28 CD62L CD103 CD45RB ICOS gitr CTLA-4
T1
5 36 21 6 251 127 98
T2
12 27 25 10 245 150 110
T3
4 39 27 6 263 110 92
T4
4 36 14 7 253 129 87
Ejemplo 9: Los linfocitos Treg con propiedades citotoxicas son producidos por inmunizacion con un peptido hecho de un epftopo de linfocito T dominante del alergeno Der p 1 unido a una secuencia consenso de glutarredoxina (figura 10).
Se sintetizo un epftopo de linfocito T dominante del alergeno Der p 1 reconocido por SNYCQIYPPNANKIR p114-128 de ratones BALB/c [SEQ ID. NO: 5] en lmea con la secuencia CGFS (secuencia del motivo [SEQ ID. NO: 6]), que lleva una secuencia consenso de tipo glutarredoxina de E. coli k12. Esta ultima se anadio al extremo amino terminal del epftopo de linfocito T (considerando s114 como P1).
El peptido completo tiene la secuencia CGFSSNYCQIYPPNANKIR [SEQ ID. NO: 7]. La secuencia que contiene el epftopo de linfocito T de Der p 1 sin la secuencia consenso de tipo glutarredoxina [SEQ ID. NO: 5] se uso como control.
Ambos peptidos se unieron mediante una secuencia conectora SGGSGGSGG [SEQ ID. NO: 8] en el extremo amino terminal de la secuencia al extremo amino terminal de la secuencia IITIAWAALLLVAAIFGVASCLI RSRSTKNEANQPLLTDS [SEQ ID. NO: 9], que corresponde al dominio transmembrana y la cola citosolica truncada de la protema gp75, con el fin de dirigir el epftopo de linfocito T al endosoma tardfo (el motivo basado en dileucina esta subrayado).
La secuencia completa del peptido que comprende la secuencia directora, conector, motivo y secuencia de epftopo es:
CGFS SNYCQIYPPNANKIR SGGSGGSGG
IITIAWAALLLVAAIFGVASCLI RSRSTKNEANQPLLTDS [SEQ ID. NO: 10],
mientras que el peptido de control sin la secuencia CGFS [SEQ ID. NO: 6] tiene la secuencia:
SNYCQIYPPNANKIR SGGSGGSGG
IITIAWAALLLVAAIFGVASCLIRSRSTKNEANQPLLTDS [SEQ ID. NO: 11]
Se inmunizaron grupos de ratones BALB/c por via subcutanea (20 |jg) con el peptido experimental [SEQ ID. NO: 10] o el peptido de control [SEQ ID. NO: 11] adsorbido sobre hidroxido de aluminio. Se realizaron tres inyecciones en intervalos de 2 semanas. Diez dfas despues de la inmunizacion, los ratones se sacrificaron y se prepararon los linfocitos T CD4+ a partir de los bazos usando perlas magneticas. Los linfocitos T CD4+ (2x106 celulas) despues se estimularon con el epftopo de linfocito T de Der p 1 (20 jg) presentado por celulas de bazo adherentes que sernan como celulas presentadoras de antfgeno.
Diez dfas despues de la estimulacion, se calculo el numero de lrneas de linfocitos T obtenidas en cada grupo, por analisis de dilucion limitante. Para cada lmea celular se evaluo su capacidad de producir la lisis de celulas WEHI, una lmea de linfocitos B seleccionada por su eficacia en la presentacion de antfgenos por determinantes MHC de clase II, como se describe en el ejemplo 6. Solo las celulas obtenidas de animales inmunizados con el peptido que contiene la secuencia consenso de glutarredoxina han adquirido la capacidad de producir la lisis de celulas WEHI, y la lisis se produce solo en presencia del epftopo de linfocito T de Der p 1 cognado.
(La figura 10 muestra que los clones de linfocitos T con propiedades Treg solo podfan obtenerse de ratones que habfan recibido la construccion hecha con el epftopo de Der p 1 conectado al motivo redox de tipo glutarredoxina y gp75, pero no de ratones que habfan recibido el peptido de control. Todos los clones de linfocitos T obtenidos despues de tratamiento con la construccion y reestimulados in vitro, eran citotoxicos.
Ejemplo 10: Uso de un epftopo de linfocito T dominante de protema MOG en un modelo in vivo de esclerosis multiple
La esclerosis multiple se puede inducir en modelos experimentales por inmunizacion con el peptido de la glucoprotema oligodendrocftica de la mielina (MOG) VGWyRsPFSRVVHLYR [SEQ ID. NO: 12], que corresponde a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
los restos de aminoacidos 37-52 de la protema MOG. Este peptido contiene un epttopo de linfocito T dominante. La posicion P1, es decir, el primer aminoacido anclado en la hendidura de MHC de clase II es Y40 (la secuencia P1-P9 esta subrayada). Los 3 aminoacidos del extremo amino terminal del peptido se sustituyen por la secuencia CGPS [SEQ ID. NO: 13], que corresponde a la secuencia de tiorredoxina humana, restos 21 a 24), dando como resultado el peptido CGPSYRSPFSRVVHLYR [SEQ ID. NO: 14]. El peptido experimental [SEQ ID. NO: 14] y el peptido de control [SEQ ID. NO: 12] se unen mediante una secuencia conectora SGGSGGSGG [SEQ ID. NO: 8] en el extremo amino terminal de la secuencia VSVSAVTLGLGLIIFSLGVIS WRRAGHSSYTPLPGSNYSEGWHIS [SEQ ID. NO: 15], que corresponde al dominio transmembrana y la cola citosolica truncada de la protema HLA-DMI3, con el fin de dirigir el epttopo de linfocito T al endosoma tardm (el motivo del peptido basado en tirosina esta subrayado).
Las secuencias de los peptidos dirigidos son:
VSVSAVtLGLGLIlFSLGViSWRRAGHSSYTPLPGSNYSEGWHIS SGGSGGSGG CGPS YRSPFSRWHLYR [SEQ ID. NO: 16] and VSVSAVTLGLGLHFSLGVISWRRAGHSSYTPLPGSNYSEGWHIS SGGSGGSGG YRSPFSRWHLYR [SEQ ID. NO: 17]
Se lleva a cabo la transferencia adoptiva en un grupo de ratones C57BL/6 de un clon de linfocitos T efectores espedficos de MOG CD4+ siguiendo un protocolo que se entiende que induce un smdrome de tipo esclerosis multiple. Esto implica la administracion del peptido MOG en adyuvante completo de Freund y 2 inyecciones de toxina Pertussis. Este protocolo produce una expansion del clon de linfocitos T efectores, que da como resultado el desarrollo de senales compatibles con la esclerosis multiple, en el plazo de 12 dfas despues de la administracion del peptido MOG.
En un segundo grupos de ratones C57BL/6 se lleva a cabo la transferencia adoptiva primero con un clon de linfocitos T reguladores espedficos de MOG (obtenido usando los peptidos [SEQ ID. NO: 16 y 17] descritos antes), seguido despues de 1 dfa del protocolo entero de induccion de enfermedad.
Se observa que la puntuacion clmica desarrollada por ratones previamente tratados con un clon de linfocitos T citoltticos se reduce significativamente comparado con los ratones que recidan solo el clon de linfocitos T efectores.
Metodos y materiales
Ratones. Los ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad se obtuvieron de instalaciones del laboratorio. Los estudios in vivo fueron aprobados por el comite etico de la University of Leuven.
Reactivos. Los peptidos obtenidos del alergeno del grupo 2 de Dermatophagoides pteronyssinus (Der p 2) Der p 1 y el toxoide tetanico, fueron sintetizados (pureza, >85%). Las secuencias son: p21-35, ChGsEPCIIHRGKpF [SeQ ID. NO: 2]; p114-128 (aminoacidos 114-128 de Der p 1), SNYCQIYPPNANKIR [SEQ ID. NO: 5]; p830 (aminoacidos 830-844 del toxoide tetanico), QYIKANSKFIGITEL [SEQ ID. NO: 18]; mp21-35
QYIKANSKFIGITELGGCHGSEPCIIHRGKPF [SEQ ID. NO: 19]; mp21-35Asn
QYIKANSKFIGITELGGCHGSEPCNIHRGKPF [SEQ ID. NO: 20]. Der p 2 de longitud completa recombinante se produjo en Pichia pastoris.
Sensibilizacion con alergeno. Los animales se sensibilizaron el dfa 1, 14 y 28 por una inyeccion i.p. de 40 |jg de alergeno recombinante absorbido sobre 6 mg de AL(OH)3. El dfa 43, 44, y 45, los ratones se expusieron a 100 jg de alergeno en 50 jl de solucion salina por instilacion intranasal, seguido de una primera medicion de la funcion pulmonar por pletismografo de cuerpo entero. Se llevaron a cabo una segunda serie de instilaciones nasales el dfa 50, 51 y 52 seguido de evaluacion de la funcion pulmonar por pletismografo de cuerpo entero.
Purificacion celular. Los linfocitos T CD4 esplenicos se obtuvieron despues de inmunizacion con el peptido. Despues de purificacion por gradiente de densidad con Ficoll (Nycomed Pharma), se enriquecieron por seleccion negativa usando el kit de aislamiento de linfocitos T CD4 (Miltenyi Biotec) y columnas de separacion de LS. Las celulas dendnticas esplenicas se seleccionaron positivamente usando microperlas de CD11c (Miltenyi Biotec) en columnas de separacion de LS. Se estimularon con 5 jg/ml de LPS (Sigma) durante 5 horas, despues se lavaron y se mantuvieron durante 18 horas en un incubador de CO2; se recuperaron celulas vivas eliminando las celulas muertas y apoptoticas con microrperlas de anexina V en columnas de LS y MidiMacs (todo de Miltenyi Biotec).
Los linfocitos V se prepararon a partir de celulas del bazo de ratones BALB/c sin tratamiento previo, por seleccion positiva usando microperlas CD19 (Miltenyi Biotec). Como celulas presentadoras de antfgeno, los esplenocitos se empobrecieron de linfocitos T mediante microperlas de CD90 (Miltenyi Biotec) en columnas de empobrecimiento de LD. En algunos ensayos, las celulas adherentes esplenicas se prepararon incubando los esplenocitos durante 2 h a 37°C en medio de cultivo. Las celulas no adherentes se separaron y el resto de las celulas se recuperaron para los ensayos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Los linfocitos pulmonares se prepararon por digestion con colagenasa (Sigma) y centrifugacion con Percoll (Pharmacia) como se ha descrito previamente (Abraham et al. (1990) J. Immunol. 144, 2117-2122).
Cultivo celular. Se cultivaron celulas dendrfticas, linfocitos T y linfocitos B en medio RPMI 1640 que contema FCS al 5%, 2-ME 50 |jM, Gentamicina 200 jg/ml (Invitrogen). Las celulas Wehi 231 se adquirieron en la coleccion europea de cultivos celulares (ECACC).
El clon de linfocitos T efectores G221 N es espedfico para el peptido p21-35. G121, R3TB7, T1 y T3 identifican clones de linfocitos T citotoxicos ensayados en este estudio (en el ejemplo 11).
Ensayos de procesamiento de peptidos. G221N, un clon de linfocitos T efectores espedficos para el peptido p21-35 se ensayo en un ensayo de proliferacion donde se usaron celulas adherentes esplenicas como APC. Se trataron previamente o con leupeptina 0,2 jM, cloroquina 0,1 mM, colchicina 60 jM o se dejaron sin tratar, durante 30 min. Despues de 3 lavados con PBS, las APC se cargaron durante 1 hora con el peptido p21-35 mp21-35 o Der p 2 a 37 °C. Despues se lavaron dos veces con medio de cultivo y se anadieron al clon G221 N (105 cada uno) durante 72 h. Para bloquear la endocitosis, las APC tambien se trataron con NaN3/desoxiglucosa (2 mg/ml, 50 mM, respectivamente) durante todo el tiempo de incubacion con los peptido seguido de 3 lavados con PBS fno. La proliferacion se ensayo por la adicion de 1 jCi/pocillo de [3H]timidina (ICN) durante las ultimas 18 h. Las celulas se recogieron y se contaron los isotopos incorporados (cpm). Los datos se expresaron como el mdice de estimulacion calculado dividiendo las cpm obtenidas para linfocitos T G221N estimulados con APC cargadas con peptido entre el valor obtenido con las APC sin cargar.
Obtencion de clones de linfocitos T reguladores. Se inmunizaron ratones BALB/c mediante 3 inyecciones en la almohadilla de la pata de 20 jg/ml de peptido mp21-35Asn en alumbre, en intervalos de 2 semanas. Diez dfas despues de la ultima inyeccion los linfocitos T cD4+ de bazo se estimularon con esplenocitos empobrecidos en linfocitos T de ratones sin tratamiento previo, en presencia del peptido mp21-35Asn. Despues de 10 dfas, las celulas se volvieron a estimular en las mismas condiciones con 10 U/ml de IL-2 de raton (Roche). Despues de la quinta estimulacion, los linfocitos T se subclonaron en presencia de 10 U/ml de IL-2 por dilucion limitante. Las posteriores estimulaciones espedficas se llevaron a cabo en presencia de 20 U/ml de lL-2 de raton. La lrnea de linfocitos T G121 se obtuvo como se ha descrito previamente (Janssens et al. (2003) J. Immunol. 171,4604-4612.
Analisis por FACS. Se uso un FACSCalibur (Becton Dickinson) para la citometna de flujo analftica y los datos se analizaron con el programa CellQuest. Diez dfas despues de la ultima estimulacion, los linfocitos T se tineron con anticuerpos contra CD25, CD28, CD62-L, CD103, CD45RB, ICOS, CTLA-4, y CD11c, (Pharmingen), GITR, Foxp3, granzima-B, T-bet(4B10), perforina, CD127, y Vb8.1 TCR, (eBioscience).
Ensayos de supresion inespedfica. Los clones de linfocitos T cooperadores y CD4+CD25- objetivo se marcaron con CFSE 125 nM (Molecular Probes) durante 15 minutos en PBS a 37 °C. La reaccion se detuvo lavando las celulas con PBS que contema FBS al 30%. Estas celulas (3 x 105) se cocultivaron con 105 clones de linfocitos T CD4+ citotoxicos y esplenocitos empobrecidos en linfocitos T con 1 jg/ml de anticuerpo anti-CD3 (eBioscience). Para la supresion de los clones de T cooperadores, se cocultivaron 105 celulas con el mismo numero de celulas citotoxicas y esplenocitos empobrecidos en linfocitos T. Despues de 48 h o 72 horas, las celulas se recogieron y se analizaron por citometna de flujo.
Para algunos cultivos se usaron anticuerpos de bloqueo contra FAS-L, GITR, LAG-3 con 10 jg/ml) (eBioscience). Se llevaron a cabo ensayos de transpocillos en placas de 24 pocillos (Becton Dickinson).
Deteccion de apoptosis. Se usaron anexina V-FITC o -PE para detectar la muerte celular en linfocitos B, celulas dendrfticas y linfocitos T (kit de deteccion con anexina V, BD Biosciences). En algunos experimentos, la apoptosis se midio por deteccion intracelular de caspasa-3 activada con anticuerpos marcados con FITC o PE (Pharmingen) o por marcaje nuclear con una solucion de tincion de yoduro de propidio (PI) (Pharmingen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para la inhibicion de la actividad de GZ-B, se anadieron Z-AAD-CMK (Calbiochem) o 3,4-dicloroisocumarina (DCIC) (SIGMA) en las concentraciones indicadas durante todo el periodo de cocultivo. .
Deteccion de citoquinas. Se volvieron a estimular un millon de linfocitos Treg con 3 millones de esplenocitos empobrecidos en linfocitos T irradiados, durante 72 horas. Se evaluo en los ftquidos sobrenadantes la presencia de diferentes citoquinas. IL-10 e IL-13 se evaluaron usando el kit de Elisa OptEIA mouse Elisa kit (BD Biosciences). TGF-p y IL-13 se evaluaron con los kits de ensayo de anti-TGF-b1 de raton de DuoSet o anti-IL-13 de raton de DuoSet, respectivamente (R&D Systems). La produccion de II-2, IL-4, IL-5, IFN-y y TNF-a se analizaron por citometna de flujo usando el kit Th1/Th2 Cytokine CBA kit (BD Biosciences).
Para la estimulacion de celulas CD4+ policlonales, se estimularon 106 celulas con 5 x 105 esplenocitos empobrecidos en linfocitos T irradiados (de ratones sin tratamiento previo) y 10 jg/ml de Der p 2 durante 72 h.
Proliferacion de celulas CD4+ policlonales. Se estimularon 105 celulas CD4 esplenicas de ratones tratados con peptido, con 105 esplenocitos empobrecidos en linfocitos T y 10 jg/ml de mp21-35, 5 jg/ml de peptido p830 o 10
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
|jg/ml de Der p 2. La incorporacion de (3H)-timidina se ensayo como se ha descrito antes. Los resultados se muestran como el recuento de isotopos medio (cpm) ± e.e.m. de 6 ratones individuales ensayados por triplicado.
Hiperreactividad de las vfas aereas. La hiperreactividad de las vfas aereas (AHR) se midio en ratones sin restriccion usando un pletismografo de cuerpo entero (EMKA) de acuerdo con metodos publicados (Hamelmann et al. (1997) Am. J. Resp. Crit. Care Med. 156, 766-775). La pausa potenciada maxima (PenH) se uso como un parametro para la broncoconstriccion. Los animales se expusieron durante 1 minuto a dosis crecientes de metacolina aerolizada (de 10 a 100 mg/ml), seguido de 3 minutos de reposo durante los cuales se evaluaron los parametros de respiracion. Los valores de PenH se expresaron como la media de las mediciones llevadas a cabo cada 30 segundos a lo largo de un periodo de 3 minutos despues de cada exposicion a la metacolina. La distensibilidad pulmonar se midio con el sistema FlexiVent (Scireq).
Recoleccion del fluido de lavado broncoalveolar (BALF). Tres dfas despues de la estimulacion con metacolina, los ratones se sacrificaron, se aislo la traquea y se inserto una canula. El BALF se recogio lavando con 1 ml de solucion salina que contema BSA al 5% (usado para la deteccion de citoquinas) y despues seguido de 2x1 ml de solucion salina. Se establecio el recuento de celulas, se prepararon los Cytospin por centrifugacion a 1400 rpm durante 6 min y se tineron (metodo de Diff-Quik). Se contaron 100 celulas en 3 campos diferentes para la identificacion celular.
Histologfa pulmonar. Los pulmones se fijaron con formaldetndo al 4%, se deshidrataron y se insertaron en parafina para la formacion de secciones (portaobjetos de 7 jm de grosor) y se tineron con hematoxilina/eosina. Los eosinofilos se detectaron por tincion de May-Grunwald Giemsa. Se identificaron celulas calciformes en la mucosa de las vfas aereas por la reaccion de acido peryodico-Schiff (PAS). Se contaron las celulas positivas para PAS y se expreso como porcentaje de celulas epiteliales totales. Para cada raton, se examinaron 5 campos de cada seccion pulmonar, de los bronquios centrales asf como de bronquios pequenos. La densidad de infiltracion de eosinofilos y linfocitos se clasifico como sigue: ausente: 0; ligera pero no sistemico: 1; ligera: 2; de ligera a media: 3; media: 4; de media a alta: 5; alta: 6.
Todos los portaobjetos fueron examinados por dos personas, que inclrna el patologo que no conoda los grupos a los que pertenedan los ratones.
Para el analisis de linfocitos T transferidos, los pulmones se fijaron con paraformaldetndo, se crioprotegieron con sacarosa al 20% durante la noche y se congelaron instantaneamente en medio OCT. Se cortaron secciones con el criostato (9 jm), se fijaron en acetona y se montaron en reactivo antidecolorante (ProLong Gold; Invitrogen) y se analizaron con microscopio confocal. El analisis se llevo a cabo en un Zeiss Axioplan2 conectado a una camara de video de 3CCD (DXC-93OP, Sony), y el programa KS300 (Zeiss).
Expresion dirigida del peptido en linfocitos B. El vector onco-retrovmco pMND-SN se obtuvo de Dr. D. Kohn, USC. Se hizo una construccion de fusion que contema p21-35 (aminoacidos 21 a 35 de Der p 2) y el extremo carboxi terminal de gp75 (aminoacidos 488 a 539) conectados con un conector, Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly [SEQ ID. NO: 8], por PCR y se clono en el vector pMND. El vector resultante pMND-p21gp75 se uso junto con vectores que codifican protemas vmcas para la transfeccion transitoria de celulas 293T y las celulas productoras oncovirales se obtuvieron como se ha descrito previamente (Janssens W. et al., Human gene therapy 14, 263-276 (2003)). Linfocitos B esplenicos previamente activados durante 24 h con LPS bacteriano 50 jg/ml se cocultivaron con el lfquido sobrenadante que contema el vector vmco en presencia de polibreno (6 jg/ml) y LPS (50 jg/ml). Despues los linfocitos B se lavaron exhaustivamente antes de la transferencia adoptiva a ratones BALB/c sin tratamiento previo.
Analisis del ARNm. La reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) se llevaron a cabo como se ha descrito previamente (Janssens W. et al. (2003), Human gene therapy 14, 263-276. Para los linfocitos T, se analizaron 106 celulas el dfa 12 despues de reestimulacion. Las secuencias de los cebadores eran: granzima A, (directo) 5' ctctggtccccggggccatc 3' [sEq ID. NO: 21] y (inverso) 5' tatgtagtgagccccaagaa 3' [SEQ ID. NO: 22]; para granzima B, (directo) 5' ctccacgtgctttcaccaaa 3' [SeQ ID. NO: 23] y (inverso) 5' ggaaaatagtacagagaggca 3' [SEQ ID. NO: 24]; para (3-actina, (directo) 5' cattgtgatggactccggagacgg 3' [SEQ ID. NO: 25] y (inverso) 5' catctcctgctcgaagtctagagc 3' [SEQ ID. NO: 26]. La temperatura de reasociacion era 55 °C durante 27 ciclos.
Deteccion de linfocitos B transducidos in vivo. Los ratones que recibieron linfocitos B transducidos con pMND- p21gp75 seguido de transferencia de clon de linfocito T, se sacrificaron y los linfocitos B esplenicos se purificaron con microperlas de CD19 (Miltenyi Biotec). Se realizo la transcripcion inversa de 5 jg de ARN total para la preparacion de ADNc. Se llevo a cabo la PCR en el ADNc usando cebadores espedficos del vector retrovmco, (directo) 5' ccctttatccagccctcactc 3' [SEQ ID. NO: 27] y (inverso) 5' cctggggactttccacaccc 3' [SEQ ID. NO: 28]. La temperatura de reasociacion era 56 °C durante 28 ciclos.
Analisis estadfstico. Se usaron ensayos no parametricos para evaluar diferencias entre medias (prueba U de Mann- Whitney). Para evaluar la hiperreactividad de las vfas aereas, se calculo el area bajo la curva y las diferencias se evaluaron con la prueba U de Mann-Whitney.
Ejemplo 11: Los linfocitos T reguladores CD4+CD25+ inducidos in vivo previenen y suprimen el asma experimental. Produccion de linfocitos T reguladores espedficos de antfgeno in vivo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Un primer clon de linfocitos CD4+CD25+ citolfticos (G121) se obtuvo de ratones inmunizados con el peptido sintetico p21-35, que abarca un epftopo de linfocito T mayor del alergeno Der p 2. La frecuencia de dichos linfocitos T citolfticos era extremadamente baja comparada con la de las celulas efectoras CD4+ de la misma especificidad. Los intentos de obtener linfocitos T con las mismas propiedades usando adyuvantes alternativos tales como alumbre no tuvieron exito.
Esto podfa deberse a la presentacion ineficaz del peptido debido, por ejemplo, a la rapida degradacion y/o ineficaz captacion por el endosoma tardm. Se ensayo la capacidad in vitro de diferentes formas de peptido para inducir la apoptosis de una lrnea de linfocitos B (celulas Wehi) usada como celula presentadora de antfgeno (APC) por el clon de linfocitos T reguladores G121. La metilacion de las dos cistemas puede potenciar la estabilidad del peptido (p21- 35met). Alternativamente, el acoplamiento de p21-35 con un peptido que lleva una secuencia conocida de epftopo de linfocito T subdominante podna aumentar la captacion por endosomas tardms. En ratones BALB/c, la secuencia que abarca los restos de aminoacidos 830 a 844 del toxoide tetanico representa un epftopo menor (QYIKANSKFIGITEL, [SEQ ID. NO: 18]). Por lo tanto, se produjo un peptido sintetico que cubna los aminoacidos 830-844 de toxoide tetanico, unido por dos glicinas a p21-35 (QYIKANSKFIGITELGGCHGSEPCNIHRGKPF, [SEQ ID. NO: 20], y por razones de estabilidad tambien se metilaron dos cistemas (peptido modificado, mp21-35). mp21- 35 era 100 veces mas eficaz en la induccion de la apoptosis de celulas Wehi en presencia de Treg G121, comparado con p21-35 (figura 11a). La metilacion de dos restos de cistema de p21-35 (p21-35met) tambien aumentaba la presentacion de MHC de clase II, y este peptido estabilizado era tan eficaz como mp21-35. Un peptido de control hecho invirtiendo el orden de los dos componentes de mp21-35 era ineficaz en la induccion de apoptosis de celulas WEHI.
La forma metilada de p21-35 (p21-35met) o la variante acoplada (mp21-35) se ensayaron respecto a la eficacia de produccion in vivo de linfocitos T citolfticos. Se inmunizaron ratones BALB/c con Der p 2 en alumbre. La reestimulacion in vitro de linfocitos T CD4+ daba como resultado la proliferacion robusta cuando se uso Der p 2 para la estimulacion, pero poca respuesta a la presentacion de p21-35 (figura 11b: grupo de control de solucion salina). Posteriormente, se ensayo la capacidad de mp21-35 para prevenir la proliferacion de linfocitos T CD4+ por preinmunizacion de ratones BALB/c con mp21-35 o una mezcla de p830-844 y p21-35met, en concreto los dos componentes peptfdicos de mp21-35. A esto le siguio la administracion IP de Der p 2 en alumbre, como antes. Se observo una reduccion significativa de proliferacion inducida por Der p 2 solo cuando se uso mp21-35 para la preinmunizacion (figura 11b). La produccion de citoquinas hecha por las celulas del bazo CD4+ estimuladas con Der p 2 era identica en el grupo de control y en el grupo preinmunizado con los dos componentes peptfdicos separados (figura 11c), mostrando una respuesta de tipo Th2. En el grupo pretratado con mp21-35, la produccion de citoquinas se redujo a concentraciones indetectables.
Hay que destacar que la estimulacion de esplenocitos CD4+ in vitro obtenidos de ratones pretratados con mp21-35 o la mezcla de peptidos, no produjo proliferacion de p830-844 (Figura 11b), ni produccion de citoquinas, indicando que el peptido derivado del toxoide tetanico no interfena con la generacion de Treg.
mp21-35 tema que ser procesado para la presentacion eficaz, como se muestra evaluando la activacion de un linfocito T efector de p21-35 (G221N) en presencia de diferentes inhibidores (figura 11d). Esto muestra que p21- 35met, mp21-35 y Der p 2 requenan la internalizacion en las celulas presentadoras de antfgeno (inhibida por NaN3/desoxiglucosa), fusion con y acidificacion de los endosomas tardfos (inhibido por colchicina y cloroquina respectivamente). No se requena el procesamiento de peptido para p21-35met, como se muestra por la ausencia de inhibicion por adicion de leupeptina, un inhibidor de serina/cistema proteasa, que refleja la capacidad de las moleculas MHC de clase II para acomodar las secuencias de hasta 15 aminoacidos.
Considerados juntos, estos datos indican que mp21-35 era procesado de forma eficaz in vivo, a diferencia de una mezcla de sus dos componentes, y que la preinmunizacion con mp21-35 prevema la activacion de linfocitos T espedficos de alergeno. Basado en descubrimiento que muestran que la regulacion se puede lograr mas facilmente con analogos de epftopos de linfocitos T, se determino la capacidad de varios mutantes de aminoacidos individuales de p21-35 para producir linfocitos T CD4+ despues de inmunizacion IP en alumbre. En particular, un peptido mutante con una mutacion IIe28Asn, una posicion que se sabe que corresponde al resto de anclaje de MHC de clase II P4, mostro capacidad solo ligeramente reducida para inducir la proliferacion de linfocitos T. Por lo tanto, se uso la forma mutada de mp21-35 (mp21-35Asn) en el resto de los experimentos en este ejemplo.
Obtencion y caracterizacion fenotfpica de clones de Treg
Se obtuvieron clones de linfocitos T clones para el analisis fenotfpico del bazo de ratones a los que se inyecto mp21- 35Asn en alumbre, mp21-35Asn en CFA/IFA (adyuvante de Freund completo o incompleto), Der p 2 o solucion salina como control. Se obtuvieron un total de 17 clones, cuya expansion dependfa completamente de la adicion de IL-2. Estos clones se mantuvieron en reposo durante 10 dfas antes de evaluar la expresion de CD25. Despues se cribaron los clones positivos por su capacidad para inducir la apoptosis de celulas Wehi cargadas con p21-35 usando la union a anexina V como resultado de lectura. Todos los clones de linfocitos T CD4+CD25+ (8/8) obtenidos de ratones inmunizados con mp21-35Asn en alumbre, se mostro que eran citolfticos, mientras que no se obtuvieron dichos clones con mp21-35Asn en CFA/IFA (0/5) o de ratones inmunizados con Der p 2 (0/4). Es interesante que se
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
obtuvo un pequeno numero de linfocitos T efectores CD4+ de ratones no inmunizados (vease a continuacion), pero ninguno era citolftico.
Se caracterizo el fenotipo de los Treg citolfticos. Se obtuvieron resultados similares para un total de 15 clones, obtenidos de inmunizaciones separadas. Los resultados representativos de Facs para los marcadores de superficie se muestran en la figura 12a (un clon representativo) y en la tabla 5 (4 clones), indicando niveles de expresion homogeneos.
Tabla 5 Presencia de marcadores de superficie en 4 clones citolfticos obtenidos con el peptido mp21-35Asn (expresado como MFI)
CD28 CD26L CD103 CD45RB ICOS GITR CTLA-4
T1
5 36 21 6 251 127 96
T2
12 27 25 10 245 150 110
T3
4 39 27 6 263 110 92
T4
4 36 14 7 253 129 87
Todos los clones expresaban niveles altos de CTLA-4, GITR e ICOS, con expresion significativa, aunque baja de CD62L y CD103, y expresion apenas detectable del receptor de quimioquina CCR7. T-bet era expresado uniformemente, pero no Foxp3, mientras que CD127 era solo debil (figura 12b). Ademas, los clones de Treg expresan niveles altos de granzima B y perforina. Los experimentos de RT-PCR muestran niveles detectables de ARNm de granzima A, pero un nivel mucho menor de granzima B (figura 12c). El patron de secrecion de citoquinas mostraba casi exclusivamente IFN-gamma, pero nada o muy poca IL-10 y no TGF-p (figura 12d). No se detecto TGF-p unido a superficie.
Todos los Treg citolfticos eran anergicos ya que no respondfan a la activacion por anftgeno en ausencia de IL-2 anadida. Esta ultima invertfa la anergia sin restablecer la transcripcion de IL-2 y sin perdida de propiedades reguladoras, como se muestra despues de ciclos de reestimulacion. Esto sugiere una alteracion epigenetica, posiblemente relacionada con la hiperexpresion de T-bet. Ademas, estos clones expresaban niveles altos de egr-2, que se sabe que activa la transcripcion de reguladores negativos del ciclo celular. Estas celulas expresaban niveles altos de CD44, pero mostraban expresion baja de CD45RB (y CD62L como se ha mencionado antes), identificandolas como celulas de memoria. La ausencia de produccion de citoquinas supresoras sugiere que su mecanismo de accion requiere el contacto de celula-celula. La expresion de granzimas y perforina clasifica dichos clones entre los linfocitos T con un potencial citolftico. Finalmente, se determino el uso de Vp de los Treg citolfticos, que indica una predominancia de Vp8.1, con algunos clones pertenecientes a la familia Vp7. Se secuencio la cadena beta de una serie de clones, mostrando las diferencias significativas en CD3, que indica que la respuesta hacia el peptido p21-35 era oligoclonal. Por lo tanto, los clones de Treg se evaluaron funcionalmente para determinar tanto el mecanismo de lisis de las celulas diana como su capacidad para producir la supresion de linfocitos T inespedficos.
Induccion de apoptosis en celulas presentadoras de anftgeno
La lisis de celulas presentadoras de anftgeno se obtuvo tanto con linfocitos B como con celulas dendrfticas. Linfocitos B esplenicos de ratones BALB/c sin tratamiento previo, precargados con p21-35 indujeron al activacion de caspasa 3 solo cuando se incubaron con el clon de linfocito T citolftico R3TB7 (es decir, otro clon de linfocito T con actividad citolftica, obtenido de una forma similar) (figura 13a: panel izquierdo), pero no cuando se anadio un linfocito T espedfico de p21-35 CD4+ de control (figura 13a, panel derecho). Se repitieron los mismos experimentos usando anexina V como un marcador de apoptosis, proporcionando los mismos resultados. Se llevaron a cabo experimentos con celulas dendrfticas CD11c+ cargadas con p21-35 (figura 13b: panel izquierdo) o celulas WEHI (figura 13b: panel derecho). Tras incubacion con R3TB7 practicamente todas las celulas dendrfticas (DC) o celulas Wehi fueron inducidas a la apoptosis, medido por la activacion de la caspasa 3. Se llevaron a cabo los mismos experimentos con anexina V y mostraron resultados identicos.
La apoptosis puede ser inducida por la ruta Fas-FasL o por secrecion de granulos citotoxicos que contienen granzimas. Se hicieron intentos de inhibir cada una de estas rutas. La adicion de concentraciones crecientes de un anticuerpo contra FasL, o de inhibidores de granzima B a un cultivo celular que contema celulas WeHi cargadas con p21-35 y un clon de linfocito T citolftico, aumento el numero de celulas WEHI que sobrevivfan de una forma dependiente de la dosis (figura 13c). En una serie de experimentos se mostro que el anticuerpo anti-FasL restableda hasta 80% de la supervivencia de las celulas WEHI. Se obtuvo solo es restablecimiento parcial de la supervivencia con inhibidores de granzima B y solo cuando se usaron dosis altas, cercanas a la citotoxicidad celular, indicando que la granzima B no da cuenta de mucha de la citolisis celular. En experimentos adicionales, se uso EGTA como un inhibidor de la exocitosis de granulos, que tambien mostro solo restablecimiento parcial de la supervivencia de celulas Wehi. .
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Se evaluo ademas si la lisis de las celulas diana requena el contacto entre celulas. Para este fin, se usaron DC CD11+ cargadas con p21-35 (o mp21-35Asn en experimento paralelos). Cuando las celulas DC cargadas se incubaron con el clon de linfocito T citolftico G121, se observo lisis en 89% de las celulas, medido por la expresion de anexina V (figura 13d, panel izquierdo). Cuando se llevaron a cabo los mismos experimentos en un sistema de transpocillos, la lisis de DC se limito a 15%, indicando que la lisis requena el contacto directo entre celulas (figura 13d, panel derecho).
Para evaluar mejor que la lisis de APC requena el contacto directo con linfocitos T citolfticos a traves de la presentacion de MHC de clase II de p21-35, se llevo a cabo un experimento en el que se cargaron dos poblaciones identicas de celulas Wehi con p21-35 o con un peptido irrelevante (p71-85). Estas dos poblaciones se podfan distinguir por el marcaje diferencial con CFSE. Se puede ver en la figura 13e que, mientras que las celulas WEHI que presentaban p21-35 eran lisadas completamente, solo eran afectadas el 40% de las celulas cargadas con p7185.
De todo junto surge que los clones de linfocitos T citolfticos indudan la apoptosis de DC y linfocitos B por un mecanismo que requena la formacion de una inmunosinapsis por la presentacion de peptido dependiente de MHC de clase II. Se demuestra la participacion significativa de Fas-FasL, pero solo la implicacion limitada de granzima B.
Supresion de linfocitos T inespedficos
Se examino el mecanismo de supresion de linfocitos T inespedficos con linfocitos T CD4+CD25(-) policlonales y con diferentes clones de linfocitos T efectores CD4+.
Primero se ensayo la capacidad de Treg para suprimir la proliferacion de linfocitos T CD4+CD25(-) despues de activacion con anti-CD3 en presencia de celulas presentadoras de anftgeno. Los resultados obtenidos para dos clones de linfocitos T citolfticos (G121 y R3TB7). se muestran en la figura 14a. El numero de linfocitos T CD4+CD25(-) detectables, asf como el numero de divisiones observadas disminuyo notablemente en el plazo de 48 h de incubacion cuando se anadio uno cualquiera de los dos clones citolfticos (paneles izquierdo superior y medio). El efecto era incluso mas pronunciado a las 72 h para el segundo clon de linfocitos T (panel medio inferior). Es interesante que solo los linfocitos T CD4+CD25(-) activados eran lisados, como puede verse del eje vertical que representa la formacion de blasto. El experimento de control en el que Treg era sustituido por un numero identico de linfocitos T CD4+CD25(-) no marcados (panel derechos) eliminaba un posible artefacto relacionado con numero variables de celulas totales en el medio de cultivo.
Despues, se analizo la cinetica de supresion. En los experimentos mostrados en la figura 14b, puede verse que 48 y 70% de los linfocitos T CD4+CD25(-) marcados con CFSE expresan anexina V despues de 18 y 24 h de coincubacion con un Treg citolftico (R3TB7), respectivamente, usando el mismo sistema de ensayo que en la figura 14a.
Dicho efecto rapido sugiere la implicacion de rutas secretoras similares a las usadas por los linfocitos T CD8+ citotoxicos. Por lo tanto, los experimentos se repitieron para verificar si la inhibicion de exocitosis de granulos por adicion de EGTA al cultivo inhibina la supresion. Basicamente no habfa inhibicion de la supresion de linfocitos T inespedficos a las 72 h con 2 concentraciones de EGTA (figura 14c).
Despues, se evaluo si los clones de linfocitos T de especificidad definida y fenotipos diferentes podnan ser suprimidos por linfocitos T citolfticos cuando eran activados por el reconocimiento cognado de los anftgenos correspondientes, en lugar de activacion con anti-CD3 no espedfica. Para este fin, se obtuvieron tres clones de ratones BALB/c, en concreto una celula Th2 espedfica para un segundo alergeno no relacionado de la misma fuente (Der p 1), una celula Th1 espedfica para un segundo epftopo de linfocito T mayor de Der p 2 (aminoacidos 71-85) y un clon Th0 espedfico para el epftopo de linfocito T subdominante 830-844 de toxoide tetanico. Cada uno de estos 3 clones se uso en todos los sistemas de ensayo descrito aqrn, Se muestran los resultados para un solo clon en cada ensayo, pero los resultados se confirmaron en todas las posibles combinaciones de ensayos y clones.
En un primer conjunto de ensayos, se midio la proliferacion de un clon de linfocitos T usando celulas marcadas con CFSE despues de presentacion del correspondiente anftgeno por esplenocitos empobrecidos en linfocitos T. Para eliminar un artefacto debido a la competicion por nutrientes en el medio de cultivo, se anadio la misma cantidad del clon Th2 no marcado al clon Th2 marcado con CFSE. Un clon Th2 espedfico para Der p 1 proliferaba facilmente, medido a lo largo de un periodo de tiempo de 72 h (figura 14d). En ensayos paralelos, las APC tambien se cargaron con p21-35 y un clon de linfocitos T citolfticos anadidos en una relacion 1/1 al clon Th2 espedfico de Der p 1. La figura muestra que solo 5% de los clones Th2 sobrevivfan despues de 72 h de incubacion. La figura tambien mostraba que la adicion de anticuerpos espedficos para FasL a lo largo del periodo de incubacion entero, daba como resultado la inhibicion parcial de la supresion (36% de clon Th2 residual). mientras que un anticuerpo anti- GITR o anti-Lag3 no tema efecto. Se obtuvieron resultados identicos con un clon Th1 para Der p 2 y con un clon Th0 para toxoide tetanico. Por lo tanto, era factible la supresion de los clones por los linfocitos T citolfticos independientemente de su estado de maduracion, con la condicion de que se produzca la activacion a traves de la interaccion cognada de MHC de clase II.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La cuestion de si la interaccion con contacto era necesaria entre los linfocitos T citolfticos y los linfocitos T inespedficos, se examino en un sistema de cultivo de transpocillos. Los resultados se muestran en la figura 14e. Los esplenocitos empobrecidos en linfocitos T cargados con p21-35 y p71-85 manteman la proliferacion de un clon Th1 espedfico de p71-85. La adicion de un Treg citolftico de p21-35 supriirfta la proliferacion (panel medio). Cuando se separaban las APC cargadas con peptido en un sistema de cultivo de transpocillo y se anadfa la lmea de celulas citolfticas en un compartimento con el clon Th1 espedfico de 71-85 no se observaba supresion en el segundo compartimento (panel derecho). Por lo tanto, se podfa concluir que la supresion no era mediada por factores solubles. Estos experimentos se confirmaron usando el clon de celulas Th2 para Der p 1.
Los linfocitos T citolfticos preveman de forma eficaz la formacion de blastos de linfocitos T inespedficos. El tamano celular medio de linfocitos T inespedficos aumentaba solo marginalmente cuando se cultivaba en presencia de Treg citolfticos activados (R3TB7) como se muestra en la figura 14f. Esto estaba acompanado de una mayor proporcion de muerte celular, medida con las celulas inespedficas marcadas con CFSE. El porcentaje de muerte celular era 26% por celulas inespedficas solas, 36% con el clon de control p830-844 usado en lugar del clon citolftico, 34% con el clon citolftico sin activacion, y 51% con el clon citolftico en presencia del peptido activante.
Con el fin de excluir que la supresion inespedfica pudiera ser parcialmente debida a artefactos, debido a la lisis de APC, se llevaron a cabo ensayos adicionales en los que dos poblaciones distintas de APC (celulas Wehi-231 B), se incubo cada una con p21-35 o con un peptido de lectura (el epftopo de linfocito T derivado de Der p 1 o p830-844 de toxoide tetanico). Las dos APC se cultivaron en el mismo pocillo y tanto un clon de linfocitos T citolfticos como una celula efectora marcada con CFSE. Se observo que el clon de linfocitos T marcados era suprimido. La presentacion en APC de p21-35, requerida para activar Treg citolfticos, se sustituyo por una combinacion de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. En dichas circunstancias la proliferacion de las celulas efectoras activada por reconocimiento cognado tambien era suprimida. Considerado junto con los experimentos descritos en la figura 14a, esto muestra que los clones de linfocitos T citolfticos supriirftan linfocitos T inespedficos en ausencia de induccion de apoptosis de la APC.
Treg citolfticos lisan linfocitos B cargados con p21-35 in vivo
Los Treg citolfticos inducen la apoptosis de APC in vitro. Para determinar si la actividad era relevante en un marco in vivo, se usaron linfocitos B transgenicos que expresaban p21-35 en el contexto de determinantes MHC de clase II. Dichos linfocitos B transgenicos persisten al menos 3 meses en el bazo despues de transferencia adoptiva. Primero, se verifico si los Treg citolfticos inducen apoptosis de linfocitos B transgenicos in vitro. 52% de linfocitos B son inducidos a la apoptosis despues de 18 h de incubacion con un clon de linfocitos T citolfticos (figura 15a). La expresion de la construccion en bazos de ratones de control (bandas B), pero no en bazos de ratones a los que se ha transferido tanto linfocitos B transgenicos como Treg (bandas A) se muestra en la figura 15b. No se detecto construccion vftica en celulas pulmonares, en ausencia de la exposicion a alergeno. Estos datos indica que los linfocitos T citolfticos manteman su capacidad de producir la lisis de linfocitos B que presentan el antfgeno cognado despues de transferencia in vivo.
Los Treg citolfticos se acumulan en los pulmones despues de exposicion a alergeno
El fenotipo de memoria de los Treg, combinado con la ausencia de CCR7 y niveles bajos de CD103, sugiere que pueden migrar a los pulmones, donde pueden ejercer su actividad supresora.
Dos lmeas de linfocitos T citolfticos diferentes se marcaron con CFSE o SNARF (ambos marcadores para protemas citoplasmaticas, que emiten a diferentes longitudes de inda) y se usaron en experimentos separados. Se encontro la acumulacion de celulas marcadas con CFSE en areas pulmonares perivasculares y peribronquiales (no se muestran los datos). Ratones de control que recidan Treg marcados pero no instilaciones de alergenos no mostraron practicamente fluorescencia.
Para establecer si los Treg representan una proporcion significativa de linfocitos que se acumulan en los pulmones, y para descartar un posible artefacto relacionado con la toxicidad inherente del marcaje fluorescentes, se llevo a cabo la transferencia adoptiva de Treg a ratones BALB/c. En estos experimentos, se uso el hecho de que las celulas citolfticas expresaban Vp8.1 y se conto la proporcion de celulas positivas en toda la poblacion CD4+ que se acumulaba en los pulmones despues de instilacion nasal con alergeno. En dichas condiciones, se sabe que muy pocos linfocitos estan unidos a los pulmones en el modelo de asma de Der p 2. En el grupo de ratones a los que se transfirio el clon de linfocitos T citolfticos, mas de 90% de las celulas CD4+ expresaban Vp8.1, mientras que solo se detectaron 25% y 20% de dichas celulas en el grupo tratado con la lmea celular de control Vp8.1.+, y en un grupo de control de ratones que recibieron Der p 2 por inhalacion, pero no linfocitos T, respectivamente (figura 15c).
Por lo tanto, se concluye que Treg citolfticos se acumulan en los pulmones tras la estimulacion con alergeno por instilacion nasal.
Los clones de Treg citolfticos previenen y suprimen el asma experimental
Los experimentos descritos antes sugenan que los clones de linfocitos T citolfticos podnan ser valiosos para el control de las respuestas inmunitarias espedficas in vivo. El requisito de la interaccion cognada de MHC de clase II y
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
la induccion de apoptosis de APC podna proporcionar la oportunidad de suprimir la respuesta entera hacia antfgenos individuales. Ademas, su acumulacion en tejidos pulmonares podna favorecer su actividad reguladora en algunas de las caractensticas asociadas con el asma.
Esto se ensayo mediante la transferencia adoptiva de linfocitos T citolfticos especfticos de p21-35 tanto en marcos preventivos como supresores. Se uso el modelo de asma experimental de Der p 2 como se ha descrito antes. Se usaron dos lmeas de linfocitos T citolfticos, obtenidas de ratones BALB/c inmunizados con mp21-35Asn.
Los resultados de los experimentos de prevencion se muestran en la figura 16(a-f). Puede verse que la transferencia de linfocitos T citolfticos antes de la induccion de sensibilizacion con Der p 2 reducfa el numero de celulas recuperadas del BALF a valores observados en animales sin tratamiento previo (no se muestra en la figura 16a), sin practicamente celulas salvo macrofagos. La lmea de celulas de control no tema efecto en la recuperacion de celulas en el BALF comparado con el grupo de control positivo. Los dos clones de celulas citolfticas produdan esencialmente el mismo efecto. La produccion de TGF-p en el BALF era indetectable con los dos Treg, mientras que la produccion de IL-10 era suprimida con el segundo clon. Se observo una reduccion significativa de infiltracion de eosinofilos pulmonares e hiperplasia de celulas calciformes. Ademas, la hiperreactividad de las vfas aereas medida por inhalacion de dosis crecientes de metacolina se redujo practicamente a niveles observados en ratones sin tratamiento previo (sin trat. previo).
Cuando se usaron las mismas dos lmeas celulares citolfticas despues de la sensibilizacion con Der p 2, se observo mejora similar de los parametros biologicos y funcionales (figura 16(g-I)). Una notable excepcion era, sin embargo, la hiperplasia de celulas calciformes. Es interesante que la reactividad de las vfas aereas a la metacolina era comparable a la de los animales sin tratamiento previo. En ensayos adicionales estos ultimos resultados se verificaron por mediciones de distensibilidad dinamica, que proporcionaron esencialmente los mismos resultados.
Ejemplo 12: Inmunizacion de ratones BALB/c con peptido derivado de Der p 1.
Se inmunizaron dos grupos de ratones BALB/c por via subcutanea o con 20 |jg del peptido con una secuencia de epftopo de linfocito T del alergeno Der pi (SNyCqIYPPNANKIR [SEQ ID. NO: 5]) o con una version modificada del mismo CGFS SNYCQIYPPNANKIR [SEQ ID. NO: 7] que tiene en el extremo N la secuencia CGFS [SEQ ID. NO: 6].
Los aminoacidos de Der p 1 que residen en la hendidura son S114 (o N115) a P122 (o P123) (donde estan implicados 9 aminoacidos de union a halotipos de MHC de clase II en la hendidura). Por lo tanto, la secuencia SNYC que esta presente en el Der p 1 no esta accesible y no puede interaccionar con otras protemas y llevar a cabo su actividad reductora.
Despues de 3 inyecciones, los ratones se sacrificaron y los linfocitos T CD4+ se purificaron de los bazos y se clonaron por dilucion limitante. Los clones de linfocitos T obtenidos de ratones inmunizados con el peptido SNYCQIYPPNANKIR [SEQ ID. NO: 5] produdan linfocitos T efectores CD4+ caracterizados por la proliferacion y secrecion de citoquinas seguido de interaccion cognada con presentacion por MHC de clase II del peptido. Los ratones inmunizados con el peptido CGFS SNYCQIYPPNANKIR [SEQ ID. NO: 7] produdan clones de linfocitos T con propiedades citolfticas, determinado en un ensayo similar al descrito en el ejemplo 10.
Para determinar si los linfocitos T con propiedades citolfticas (como se muestra en el ejemplo 10) teman la capacidad de inducir apoptosis de linfocitos T efectores, se prepararon celulas presentadoras de anftgeno (APC) a partir de celulas esplenicas adherentes. Las APC se incubaron con el alergeno Der p 1 para la presentacion en los determinantes de MHC de clase II.
Como se muestra en la figura 17, las celulas efectoras CD4+ proliferaban facilmente cuando se anadfan a APC cargadas con anftgeno. La adicion de linfocitos T citolfticos induda la muerte de celulas efectoras CD4 (7-AAD tincion positiva (FL3-H)). La figura 17 muestra la apoptosis en 73 % de las celulas efectoras y la anulacion fuerte de la proliferacion de celulas efectoras CD4.
Ejemplo 13: La transferencia adoptiva de clones de linfocitos T con actividad citolftica previene completamente y suprime el asma producido por la instilacion nasal del alergeno Der p 1.
Ratones BALB/c se sometieron a 2 series de 3 instilaciones nasales diarias separadas por 1 semana, usando 100 jg del alergeno Der p 1. El dfa despues de la instilacion nasal, los ratones se sacrificaron y se comprobo la presencia de alteraciones caractensticas del asma alergico en el espacio broncoalveolar y pulmon.
En dos grupos adicionales de ratones se lleva a cabo la transferencia adoptiva con clones de linfocitos T citolfticos obtenidos como se describe en el ejemplo 11, usando el peptido de Der p 1 con el motivo, sea antes o despues de la primera serie de instilaciones nasales.
Se llevaron a cabo los recuentos de celulas diferenciales en el BALF 4 dfas despues de la ultima serie de instilaciones nasales (6 BALB/c por grupo). Las celulas se obtuvieron por lavado broncoalveolar de los pulmones y se identificaron en aparatos Cytospin como macrofagos, neutrofilos, eosinofilos o linfocitos. Los ratones recibieron 2 series de 3 instilaciones nasales con 100jg de Der p 1 (modelo) o NaCl (negativo). La figura 18A y B muestra que
5
10
15
20
25
30
35
40
cuando se administran linfocitos T citolfticos antes o despues de la primera serie de instilaciones nasales, esto da como resultado la abolicion de infiltracion de eosinofilos en los bronquios. Como puede verse, el numero total de celulas recuperadas en el fluido de lavado esta dentro del intervalo de lo obtenido de animales sin tratamiento previo.
Se ensayo en los fluidos de lavado broncoalveolar la presencia de citoquinas (Tabla 6). Los ratones que recibieron un clon de citoquina mostraron recuperacion de citoquinas muy baja, incluyendo la concentracion de IL-10 que es significativamente mayor en el modelo.
Tabla 6: Determinacion de las citoquinas del BAL de ratones tratados con el peptido de Der p 1 modificado [SEQ ID. NO: 7] (3 dfas despues de la instilacion nasal).
TNF-alfa IFN-gamma IL-5 IL-4 IL-2 IL-10 IL-13 TGF-beta
Prevencion
0,7 0 0,3 0 0,7 10 0,2 5,8
Supresion
0 0 0,5 0,7 0,8 2 0,3 0
Modelo
0 0 0 0 0 44 4 1
Neg.
6 1 0,5 2 0 0 0 0
Los resultados representan las concentraciones medias obtenidas de 6 BALB/c (pg/ml).
Ejemplo 14: Efecto del aumento de la potencia redox de peptidos modificados en la capacidad de activar linfocitos T reguladores citolfticos
Las celulas presentadoras de antigeno se cargaron con p21-35 en su configuracion natural [SEQ ID. NO: 2] o p2135 en el que la serina en la posicion 24 se sustituye por cistema, CHGCEPCIIHRGKPF [SEQ ID. NO: 29]. Esta sustitucion crea un resto redox del tipo C-x-x-C.
Se incubaron varios clones de linfocitos T reguladores con actividad citolftica con las APC. La figura 19 muestra que el peptido que lleva la secuencia redox C-x-x-C induce un grado mayor de activacion de linfocitos T, evaluado por la produccion de citoquinas, que su homologa C-x-x-S. Tambien se muestra que la secuencia C-x-x-C induce la transcripcion del ARNm tanto para FasL como granzimas, mas que sus homologas C-x-x-S. Las granzimas son dos de los jugadores clave en la induccion de apoptosis de celulas diana.
Ejemplo 15: Prevencion y supresion de alergia por beta-lactoglobulina
La beta-lactoglobulina bovina (BLG) es un alergeno principal en la alergia humana a la leche. Se usa un modelo de raton para determinar si los peptidos modificados podnan alterar la respuesta espedfica hacia BLG. Se sintetiza el peptido CHGC AQKKIIAEK [sEq ID. NO: 30] que abarca la secuencia del motivo tioredox C-H-G-C [SEQ ID. NO: 31] unida a un epftopo de linfocito T of BLG.
Se inmunizan ratones BALB/c mediante 2 inyecciones SC con 20 |jg del peptido de secuencia CHGC AQKKIIAEK [SEQ ID. NO: 30] en alumbre. A esto le sigue 15 dfas mas tarde la sensibilizacion intraperitoneal a BLG (5 jg en alumbre), en 2 ocasiones en un intervalo de catorce dfas. Alternativamente, la administracion del peptido se da 15 dfas despues de la sensibilizacion IP a BLG.
La hipersensibilidad a la BLG se verifica en el raton evaluando la hiperreactividad bronquial despues de administracion intranasal de BLG. Todos los ratones se someten a administracion intranasal de 10 jg de BLG en solucion salina 10 dfas despues de las ultimas inyecciones. Se incluye un grupo de control en el que la sensibilizacion intraperitoneal se lleva a cabo sin inmunizacion con peptido.
Los ratones a los que se inyecto el epftopo de peptido modificado antes o despues de la sensibilizacion habfan perdido completamente la capacidad de reaccionar frente a la instilacion nasal de BLG. Esto se muestra por la falta de eosinofilos en el fluido de lavado broncoalveolar y en ausencia de hiperreactividad tras la estimulacion con dosis crecientes de metacolina, comparado con el grupo de control, en el que se observan tanto eosinofilos como hiperreactividad.
Ejemplo 16: Prevencion y supresion de esclerosis multiple
Se inmunizaron grupos de ratones C57BL/6 por via subcutanea (20 jg) con el peptido (CHGS YRSPFSRWHLYR [SEQ ID. NO: 32], que contiene el motivo de secuencia C-X(2)-S) o peptido control (YRSPFSRWHLYR [SEQ ID. NO: 33] adsorbido sobre hidroxido de aluminio. Se realizan tres inyecciones en intervalos de 2 semanas. Diez dfas despues de la ultima inmunizacion, los ratones se sacrifican y se preparan los linfocitos T CD4+ (2x106 celulas) del
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
bazo usando perlas magneticas. Despues los linfocitos T CD4+ se estimulan in vitro por el epftopo de linfocito T de MOG (20 pg/ml) presentado por celulas de bazo adherentes (2x106 celulas).
Despues de 4 reestimulaciones, se ensaya una lmea de linfocitos T en un ensayo de supresion inespedfica con, como celulas diana, celulas CD4+CD25- policlonales obtenidas de animales en los que la EAE (encefalomielitis autoinmunitaria experimental) era efectiva. Solo las celulas obtenidas de animales inmunizados con el peptido que contema el motivo de secuencia C-X(2)-S teman la capacidad de inducir la muerte en celulas diana, comparado con el control que consistfa en CD4+CD25- efectoras de animales de EAE, como se muestra en la figura 20.
Se lleva a cabo transferencia adoptiva en un grupo de ratones C57BL/6 con un clon de linfocitos T reguladores espedficos de MOG CD4+ seguido 1 dfa despues de un protocolo previsto para inducir un smdrome de tipo esclerosis multiple. Esto implica la administracion del peptido MOG en adyuvante completo de Freund y 2 inyecciones de toxina Pertussis. Este protocolo produce una expansion del clon de linfocitos T efectores, que da como resultado el desarrollo de senales compatibles con la esclerosis multiple, en el plazo de 12 dfas despues de la administracion del peptido MOG. Se observo que la puntuacion clmica desarrollada por ratones previamente tratados con el clon de linfocitos T citolfticos se reduda significativamente comparado con ratones que recidan solo el protocolo completo de induccion de enfermedad (figura 21).
Se observa que la puntuacion clmica desarrollada por ratones previamente tratados con el clon de linfocitos T citolfticos se reduce significativamente comparado con ratones que reciben solo el clon de linfocitos T efectores, como se muestra en la figura 21.
Ejemplo 17: Prevencion de esclerosis multiple por inmunizacion con peptido
En el grupo modelo, 3 ratones C57BL/6 recibieron, el dfa 0, inyeccion SC de 100 pg de peptido MOG/400 pg de Mycobacterium butyricum en CFA e inyeccion ip de 300 ng de Bortetella pertussis en NaCl. El dfa +2, se les dio una segunda inyeccion de B. pertussis.
En el grupo de prevencion, 5 ratones C57BL/6 se inmunizan mediante 5 inyecciones con 20 pg de peptido CSMOG (CHGS YRSPFSRWHLYR [SEQ ID. NO: 32]), que contiene el motivo de secuencia C-X(2)-S, en IfA en intervalo de 14 dfas antes de la induccion de la enfermedad como en el grupo modelo. Los experimentos de control se llevan a cabo con el peptido [SEQ ID. NO: 33] que careda del motivo en su extremo N.
Las puntuaciones se establecieron como 0: sin enfermedad, 1: cola flacida, 2: cola flacida y perdida de peso mayor de 10%, 3: paralisis parcial de las extremidades traseras.
La figura 22 muestra que el pretratamiento con peptido modificado [SEQ ID. NO: 32] anula completamente el desarrollo del smdrome.
Ejemplo 18: Prevencion y supresion de diabetes dependiente de insulina espontanea con peptidos derivados de GAD65.
Los ratones con diabetes no obesos (NOD) constituyen un modelo animal adecuado para la diabetes dependiente de insulina espontanea.
En dichos animales, como en los seres humanos, se observa una respuesta inmunitaria temprana al autoantfgeno acido glutamico descarboxilasa (GAD65) en el momento en el que se puede ver insulitis, a partir de la cual la respuesta se extiende por expansion intramolecular e intermolecular. La induccion de tolerancia a la GAD por administracion de la protema a neonatos previene la aparicion de la diabetes.
La region carboxi terminal de GAD65, y en particular el fragmento 524-543 SRLSK528VAPVIKARMMEYGTT [SEQ ID. NO: 34], es reconocido por linfocitos T espedficos. Algunos de dichos linfocitos T son patogenos, tales como los que reconocen el fragmento 530-543, mientras que otros no producen la enfermedad, tales como los que reconocen el fragmento 524-538.
Lys528 constituye un resto de anclaje a P1. Para la generacion de un peptido de acuerdo con la invencion, los restos de serina P-4 y P-1 se sustituyen por una cistema, lo que da como resultado CRLC KVAPVIKARMM [SEQ ID. NO: 35].
Se producen linfocitos Treg citotoxicos por inmunizacion con el peptido anterior modificado que comprende el epftopo de linfocito T de la protema GAD65. Los linfocitos T obtenidos del bazo de ratones NOD de 20 semanas de edad, en el momento en el que la insulitis esta presente asf como la diabetes sintomatica, se expanden in vitro con el peptido 524-543 con el fin de generar clones de linfocitos T patogenos.
Los ratones NOD se inmunizan con peptido que contiene la secuencia consenso de tiorredoxina en IFA (adyuvantes de Freund incompletos) desde la edad de 2 semanas. Los linfocitos T se expanden in vitro para generar clones con propiedades reguladoras.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Las celulas policlonales purificadas de ratones con la secuencia consenso de tiorredoxina inducen la apoptosis en celulas CD4 policlonales obtenidas de ratones NOD inmunizados con el peptido 524-543 cuando se estimulaban con celulas presentadoras de antigenos cargadas con el peptido 524-543 (vease la figura 23). La tabla en la figura 23 representa el porcentaje de celulas doble positivas (celulas muertas) despues de restar los valores de fondo obtenidos sin la poblacion reguladora.
La transferencia adoptiva de Treg a la edad de 2 semanas en ratones NOD, en concreto antes de la aparicion de insulitis (3 semanas de edad) se muestra que previene completamente la aparicion de diabetes.
Se muestra que la inmunizacion de ratones NOD con el peptido CRLC KVAPVIKARMM [SEQ ID. NO: 35]. desde las 2 semanas de edad previene completamente la diabetes y lesiones de insulitis.
En un marco de supresion, se muestra que la transferencia adoptiva de Treg a diferentes edades entre 6 y 20 semanas, suprime la diabetes e insulitis en ratones NOD. Se muestra que la inmunizacion con el peptido CRLC KVAPVIKARMM [SEQ ID. NO: 35] despues de la edad a la que la insulitis ya es destacada (15 semanas de edad) suprime la diabetes y la insulitis.
Ejemplo 19: Prevencion y supresion de diabetes dependiente de insulina espontanea con peptidos derivados de insulina.
Se producen Treg con propiedades citolfticas por inmunizacion de ratones NOD con el epftopo de linfocito T de la insulina unido al motivo C-X(2)-C con y sin un conector de glicina.
Los peptidos que se sintetizan son:
EALYVCGERG CGPC [SEQ ID. NO: 36]
EALYVCGERG G CGPC [SEQ ID. NO: 37]
EALYVCGERG GG CGPC [SEQ ID. NO: 38]
EALYVCGERG GGG CGPC [SEQ ID. NO: 39]
EALYVCGERG GGGG CGPC [SEQ ID. NO: 40]
Los linfocitos Treg obtenidos con estos peptidos inducen la apoptosis de linfocitos T patogenos espedficos de insulina en un sistema in vitro, en el que tanto las celulas patogenas como reguladoras son activadas por la presentacion de insulina. Previenen o suprimen ademas la aparicion de diabetes e insulitis despues de la transferencia adoptiva de Treg antes de (2 semanas de edad) o despues (6 semanas de edad) la aparicion espontanea de insulitis, respectivamente.
Los linfocitos Treg obtenidos con estos peptidos tambien previenen o suprimen la aparicion de diabetes e insulitis cuando se producen in vivo tras inmunizacion con peptido de secuencia que contiene la secuencia consenso de tiorredoxina, empezando a la edad de 2 semanas para la prevencion o 15 semanas para la supresion, respectivamente.
Ejemplo 20: Prevencion y supresion de tiroiditis autoinmunitaria con peptidos derivados de tiroperoxidasa
La tiroiditis autoinmune en el hombre esta asociada con la produccion de anticuerpos contra la peroxidasa tiroidea. Los anticuerpos y linfocitos T espedficos contra TPO producen la destruccion de celulas tiroideas por una combinacion de mecanismos citotoxicos y citolfticos, conduciendo al hipotiroidismo. La inmunizacion a proposito de ratones C57BI/6 con TPO produce una enfermedad identica a la patologfa humana y por lo tanto se considera un modelo adecuado para la tiroiditis autoinmunitaria.
El fragmento 540-559 (QGQLM544NEELTERLFVLSNV [SEQ ID. NO: 41] de TPO abarca un epftopo de linfocito T dominante de TPO reconocido por ratones C57BI/6.
El uso de diferentes algoritmos identificaba restos Met544 como el primer resto de anclaje en determinantes MHC de clase II. Los aminoacidos P-4 a P-1 se sustituyen por la secuencia de isomero D de CGPC [SEQ ID. NO: 42], que genera la secuencia (CGPC)D-isomero MNEELTERL [SEQ ID. NO: 43].
Se inmunizaron ratones C57BI/6 con el peptido experimental [SEQ ID. NO: 43] o el peptido de control [SEQ ID. NO: 41] o QGQLM544NEELTERL [SEQ ID. No 48] en CFA/IFA. Diez dfas despues de la inmunizacion, los ratones se sacrifican y se preparan los linfocitos T del bazo. Los linfocitos T CD4+ se expanden in vitro usando celulas presentadoras de antfgeno cargadas con la secuencia 540-559. Los clones de linfocitos T se obtienen por dilucion limitante.
Se ensaya in vitro la capacidad de los clones de linfocitos T con el peptido experimental (CGPC)D-isomero MNEELTERL [SEQ ID. NO: 43] para suprimir la activacion de los linfocitos T efectores por inmunizacion con el
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
peptido de secuencia 540-559. En la presente memoria, las celulas presentadoras de antigeno se cargan con el peptido 540-559. La adicion del clon de linfocitos T efectores da como resultado la activacion y proliferacion de dichas celulas, medido por incorporacion de timidina. Cuando se anade un clon de linfocitos T con actividad reguladora al sistema, junto con el clon de efectores, se inhibe completamente la activacion y proliferacion de estos ultimos.
La transferencia adoptiva de linfocitos T reguladores a ratones C57BI/6 antes de la inmunizacion con el peptido 540559 prevema o supriirfta, respectivamente, la induccion de tiroiditis, evaluado por evaluacion de la infiltracion linfodtica del tiroides.
Ejemplo 21: Prevencion y supresion de tiroiditis autoinmunitaria con peptidos derivados de tiroglobulina
Una respuesta inmunitaria contra la tiroglobulina es una caractenstica comun de la tiroiditis autoinmunitaria humana. Se ha obtenido la induccion de dicha respuesta en la tiroiditis experimental tras inyeccion de peptidos que abarcan epftopos de linfocitos T en animales geneticamente predispuestos tales como ratones H2k.
El fragmento de tiroglobulina 2340-2359 (QVA2342ALTWVQTHIRGFGGDPR [SEQ ID. NO: 44]) abarca un epftopo de linfocito T dominante de tiroglobulina reconocido por ratones AKR/J. El uso de diferentes algoritmos identifica restos Ala2342 como el primer resto de anclaje en determinantes MHC de clase II. Los aminoacidos P-4 a P-1 se sustituyeron por la secuencia CGPS [SEQ ID. NO: 13], que genera la secuencia CGPS AALTWVQTH [SEQ ID. NO: 45].
Los ratones AKR/J se inmunizan dos veces con el peptido experimental [SEQ ID. NO: 45] y el peptido de control LDQVAALTWVQTH [SEQ ID. NO: 49] en CFA/IFA. Diez dfas despues de la inmunizacion, los ratones se sacrifican y se preparan los linfocitos T del bazo. Los linfocitos T CD4+ se expanden in vitro usando celulas presentadoras de antfgeno cargadas con el fragmento 2340-2359. Los clones de linfocitos T se obtuvieron por dilucion limitante.
Se ensayo in vitro la capacidad de los clones de linfocitos T generados con el peptido CGPS AALTWVQTH [SEQ ID. NO: 45] para suprimir la activacion de los linfocitos T efectores por inmunizacion con el peptido de secuencia 23402359. Por lo tanto, las celulas presentadoras de antfgeno se cargaron con el peptido 2340-2359. La adicion del clon de linfocitos T efectores daba como resultado la activacion y proliferacion de dichas celulas, medido por incorporacion de timidina. Cuando se anade un clon de linfocitos T con actividad reguladora al sistema, junto con el clon de efectores, se inhibe completamente la activacion y proliferacion de estos ultimos.
La transferencia adoptiva de linfocitos T reguladores a ratones AKR/j antes de la inmunizacion con el peptido - 23592340 previene o suprime, respectivamente, la induccion de tiroiditis, evaluado por evaluacion de la infiltracion linfodtica del tiroides.
Ejemplo 22: Prevencion y supresion de alergia al polen con peptidos derivados del alergeno del polen de abedul
La sensibilidad al polen de abedul es una causa comun de rinitis y asma. Sin embargo, aproximadamente 60% de los sujetos sensibilizados al polen de abedul desarrollan smtomas tras la ingestion de frutas de la familia de las rosaceas, tales como manzanas, peras, ciruelas y cerezas. La reactividad cruzada entre Bet v 1 (el principal alergeno del polen de abedul) y dicho alimento se ha demostrado tanto a nivel de anticuerpos IgE espedficos como de linfocitos T. En particular, un epftopo de linfocito T situado en el extremo carboxi terminal de la molecula Bet v 1, que se conserva entre varias isoformas, mostraba un grado alto de homologfa con la secuencia de un alergeno de la manzana equivalente (Mal d 1). Los linfocitos T efectores que reconocen el fragmento 142-156 de Bet v 1 son fuertemente activados cuando se exponen al epftopo correspondiente de Mal d 1.
El peptido LRAVESYLLAH [SEQ ID. NO: 46] que corresponde a los restos 144-154 de Bet v 1, y que contiene un epftopo de linfocito T, se modifica por adicion de la secuencia (CGPC)D-isomero [SEQ ID. NO: 42], en su extremo amino terminal dando como resultado (CGPC)D-isomero LRAVESYLLAH [SEQ ID. nO: 47].
Este peptido se adsorbe sobre hidroxido de aluminio usando 50 |jg del peptido por 1 mg de alumbre. Se llevaron a cabo tres inyecciones SC de 50 jg de peptido en intervalos de 2 semanas. Dos semanas despues de la ultima inyeccion, se extrae sangre de una vena periferica y se purifican los linfocitos T CD4+ por separacion de celulas en perlas magneticas. Los linfocitos T cD4+ se anadieron al medio de cultivo en el que celulas dendrfticas histocompatibles, usadas como celulas presentadoras de antfgeno, se incubaron con el antfgeno Bet v 1, o con toxoide tetanico como control, durante 2 h a temperatura ambiente. Despues las celulas se lavaron y se anadieron los linfocitos T CD4+ al medio de cultivo. Dichos linfocitos T CD4+ indudan apoptosis de celulas dendrfticas que presentaban el antfgeno Bet v 1, pero no de celulas dendrfticas que presentaban la protema de toxoide tetanico. La incubacion de linfocitos T CD4+ con celulas dendrfticas cargadas con el antfgeno Mal d 1 dio como resultado la apoptosis de celulas dendrfticas.
Los pacientes que presentaban smtomas alergicos tras la exposicion al polen de abedul junto con una alergia orofarmgea a la ingestion de manzana y tratados con 3 inyecciones SC del peptido CGPC LRAVESYLLAH [SEQ ID. NO: 47] no reaccionaron ni a la exposicion al polen ni al contacto con la manzana en la mucosa orofarmgea.
La vacunacion con un peptido que contiene un epftopo de linfocito T del alergeno Bet v 1 del polen de abedul modificado para contener un resto redox, produce linfocitos T reguladores citolfticos que eliminan los smtomas relacionados con la exposicion al polen de abedul y los que resultan de la ingestion de frutas que llevan un epftopo de linfocito T homologo.

Claims (26)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Un peptido inmunogeno aislado, con una longitud de entre 12 y 50 aminoacidos, que comprende:
    - un epftopo de linfocito T de un alergeno o autoantigeno, cuyo epftopo encaja en la hendidura de una protema MHC
    II, y
    - un motivo C-X(2)-C, estando dicho motivo adyacente a dicho epftopo o separado de dicho epftopo por como maximo 7 aminoacidos, en donde dicho alergeno o autoantfgeno no comprende un motivo C-X(2)-C dentro de una secuencia de 11 aminoacidos N o C terminales de dicha secuencia de epftopo. .
  2. 2. El peptido segun la reivindicacion 1, en donde el peptido comprende ademas una secuencia que dirige al endosoma tardm.
  3. 3. El peptido segun la reivindicacion 1 o 2, en donde el motivo esta situado N terminal del epftopo.
  4. 4. El peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el peptido tiene una longitud de entre 12 y 30 aminoacidos
  5. 5. El peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el epftopo y el motivo estan separados por como maximo 4 aminoacidos.
  6. 6. Un peptido inmunogeno aislado con una longitud de entre 12 y 50 aminoacidos, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende:
    - un epftopo de linfocito T de un alergeno, cuyo epftopo encaja en la hendidura de una protema MHC II, y
    - un motivo C-X(2)-C, estando dicho motivo adyacente a dicho epftopo, o separado de dicho epftopo por como maximo 7 aminoacidos, para usar en el tratamiento y prevencion de una afeccion alergica.
  7. 7. El peptido segun la reivindicacion 6, para usar en el tratamiento y prevencion de una afeccion alergica, en donde el antigeno alergenico se selecciona del grupo que consiste en alergenos alimentarios, alergenos de acaros del polvo domesticos, alergenos de insectos, alergenos de polen, alergenos de animales, alergenos de hongos y alergenos ocupacionales.
  8. 8. Un peptido inmunogeno aislado, con una longitud de entre 12 y 50 aminoacidos, que comprende:
    - un epftopo de linfocito T de un autoantfgeno, cuyo epftopo encaja en la hendidura de una protema MHC II, y
    - un motivo C-X(2)-[CST] o [CST]-X(2)-C, estando dicho motivo adyacente a dicho epftopo, o separado de dicho epftopo por como maximo 7 aminoacidos, para usar en el tratamiento y prevencion de un trastorno autoinmunitario.
  9. 9. El peptido segun la reivindicacion 8, para usar en el tratamiento y prevencion de una enfermedad autoinmunitaria, en donde el motivo es C-X(2)-C.
  10. 10. El peptido segun la reivindicacion 8 o 9, para usar en el tratamiento y prevencion de una enfermedad autoinmunitaria seleccionada del grupo que consiste en enfermedad tiroidea, diabetes de tipo 1, esclerosis multiple y miastenia grave.
  11. 11. El peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para usar en el tratamiento y prevencion de una enfermedad autoinmunitaria, en donde para la enfermedad tiroidea el autoantfgeno se selecciona de tiroglobulina, peroxidasa tiroidea y receptor de TSH, en donde para la diabetes de tipo 1 el autoantfgeno se selecciona del grupo que consiste en insulina, proinsulina, acido glutamico descarboxilasa (GAD), tirosina fosfatasa IA-2, protema de choque termico HSP65 o protema relacionada con la subunidad catalftica de la glucosa 6-fosfatasa espedfica de los islotes (IGRP), en donde para la esclerosis multiple el autoantfgeno se selecciona del grupo que consiste en glucoprotema oligodendrocftica de la mielina (MOG), protema basica de la mielina (MBP) y protema proteolipfdica (PLP) y en donde para la miastenia grave el autoantfgeno es el receptor de acetilcolina.
  12. 12. El peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, para usar en el tratamiento y prevencion de la diabetes.
  13. 13. El peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, para usar en el tratamiento y prevencion de la diabetes en donde el autoantfgeno implicado en la diabetes es GAD.
  14. 14. El peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, para usar en el tratamiento y prevencion de la esclerosis multiple.
  15. 15. El peptido segun la reivindicacion 10, para usar en el tratamiento y prevencion de la esclerosis multiple, en donde el autoantfgeno implicado en la esclerosis multiple es la glucoprotema oligodendrocftica de la mielina (MOG).
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
  16. 16. El peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, para usar en el tratamiento o prevencion de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, en donde el peptido tiene una longitud de entre 12 y 30 aminoacidos.
  17. 17. El peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 16, para usar en el tratamiento o prevencion de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 16, en donde el motivo y el epftopo estan separados por como maximo 4 aminoacidos.
  18. 18. Un metodo in vitro para preparar un peptido inmunogeno de entre 12 y 50 aminoacidos, capaz de producir actividad de linfocitos T CD4+ citolfticos, que comprende las etapas de:
    - a) identificar en una secuencia de una protema antfgena la secuencia de un epftopo de linfocito T que encaja en la hendidura de una protema MHC II,
    - b) producir un peptido que comprende la secuencia de dicho epftopo de linfocito T identificada y que comprende un motivo [CST]-X(2)-C o C-X(2)-[CST], de modo que dicho epftopo de linfocito T y dicho motivo estan adyacentes entre sf o separados por como maximo 7 aminoacidos, en el peptido producido,
    - en donde (i) el motivo en el peptido producido es un motivo [CST]-X(2)-C o C-X(2)-[CST] y dicha protema antigena no tiene un motivo C-X(2)-[CST] o [CST]-X(2)-C dentro de una region de 11 aminoacidos N terminales o C terminales de dicho epftopo de linfocito T en dicha protema antfgena, o
    - en donde (ii) el motivo en el peptido producido es un motivo C-X(2)-C y dicha protema antfgena no tiene un motivo C-X(2)-C dentro de una region de 11 aminoacidos N terminales o C terminales de dicho epftopo de linfocito T en dicha protema antfgena.
  19. 19. El metodo segun la reivindicacion 18, que ademas comprende la etapa de ensayar la capacidad reductora de dicho peptido producido.
  20. 20. El metodo segun la reivindicacion 18 o 19, que ademas comprende la etapa de determinar la capacidad de dicho peptido producido para inducir linfocitos T espedficos de antfgeno con propiedades citotoxicas.
  21. 21. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en donde la protema antfgena es un alergeno o autoantigeno.
  22. 22. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en donde el punto (i) del motivo en el peptido producido es C-X(2)-C.
  23. 23. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, en donde el peptido producido tiene una longitud de entre 12 y 30 aminoacidos.
  24. 24. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23, que ademas comprende la etapa de formular el peptido producido en una composicion farmaceutica.
  25. 25. Un metodo in vitro para obtener una poblacion de linfocitos T citolfticos espedficos de antfgeno, comprendiendo el metodo las etapas de:
    - proporcionar celulas de sangre periferica,
    - poner en contacto dichas celulas con un peptido inmunogeno con una longitud entre 12 y 50 aminoacidos, que comprende:
    - un epftopo de linfocito T de una protema antfgena, cuyo epftopo encaja en la hendidura de una protema MHC II, y
    - un motivo C-X(2)-[CT] o [CST]-X(2)-C, estando dicho motivo adyacente a dicho epftopo, o separado de dicho epftopo por como maximo 7 aminoacidos, y
    - ampliar dichas celulas en presencia de IL-2.
  26. 26. La poblacion in vitro de linfocitos T citolfticos espedficos de antfgeno contra celulas presentadoras de antfgeno, producidos por un peptido que comprende un epftopo de linfocito T de una protema antfgena, cuyo epftopo encaja en la hendidura de una protema MHC II, y un motivo C-X(2)-[CT] o [CST]-X(2)-C, estando dicho motivo adyacente a dicho epftopo, o separado de dicho epftopo por como maximo 7 aminoacidos, y que se puede obtener por el metodo de la reivindicacion 25, para el tratamiento y/o prevencion de una afeccion alergica o un trastorno autoinmunitario.
ES07801643.3T 2006-08-11 2007-08-13 Péptidos inmunógenos y su uso en trastornos inmunitarios Active ES2601432T3 (es)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0615966 2006-08-11
GB0615966A GB0615966D0 (en) 2006-08-11 2006-08-11 Novel therapy for immune disorders
GB0710081A GB0710081D0 (en) 2007-05-25 2007-05-25 Novel cellular therapy for immune disorders
GB0710081 2007-05-25
GB0711403A GB0711403D0 (en) 2007-06-13 2007-06-13 Therapy for immune disorders
GB0711403 2007-06-13
PCT/EP2007/007165 WO2008017517A1 (en) 2006-08-11 2007-08-13 Immunogenic peptides and their use in immune disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2601432T3 true ES2601432T3 (es) 2017-02-15

Family

ID=38626589

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11187013.5T Active ES2657480T3 (es) 2006-08-11 2007-08-13 Péptidos inmunogénicos y su uso en trastornos inmunitarios
ES11187012.7T Active ES2657504T3 (es) 2006-08-11 2007-08-13 Péptidos inmunogénicos y su uso en trastornos inmunitarios
ES07801643.3T Active ES2601432T3 (es) 2006-08-11 2007-08-13 Péptidos inmunógenos y su uso en trastornos inmunitarios
ES11187014T Active ES2709176T3 (es) 2006-08-11 2007-08-13 Péptidos inmunogénicos y su uso en trastornos inmunitarios

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11187013.5T Active ES2657480T3 (es) 2006-08-11 2007-08-13 Péptidos inmunogénicos y su uso en trastornos inmunitarios
ES11187012.7T Active ES2657504T3 (es) 2006-08-11 2007-08-13 Péptidos inmunogénicos y su uso en trastornos inmunitarios

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11187014T Active ES2709176T3 (es) 2006-08-11 2007-08-13 Péptidos inmunogénicos y su uso en trastornos inmunitarios

Country Status (10)

Country Link
US (4) US9249202B2 (es)
EP (4) EP2476436B1 (es)
JP (2) JP5750600B2 (es)
AU (1) AU2007283731B2 (es)
CA (2) CA2660605C (es)
DK (3) DK2476436T3 (es)
ES (4) ES2657480T3 (es)
PL (3) PL2476436T3 (es)
PT (3) PT2476435T (es)
WO (1) WO2008017517A1 (es)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2657480T3 (es) 2006-08-11 2018-03-05 Life Sciences Research Partners Vzw Péptidos inmunogénicos y su uso en trastornos inmunitarios
US20140105980A1 (en) * 2012-10-11 2014-04-17 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating multiple sclerosis and related disorders
US9340580B2 (en) * 2007-08-15 2016-05-17 Circassia Limited Peptide with multiple epitopes
WO2009100505A1 (en) * 2008-02-14 2009-08-20 Life Sciences Research Partners Vzw Immunogenic peptides and their use in transplantati
WO2009101206A2 (en) * 2008-02-14 2009-08-20 Life Sciences Research Partners Vzw Strategies to prevent and/or treat immune responses to soluble allofactors
AU2014259586B2 (en) * 2008-02-14 2017-01-05 Katholieke Universiteit Leuven CD4+ T-cells with cytolytic properties
EP2623125A1 (en) * 2008-02-14 2013-08-07 Life Sciences Research Partners VZW Elimination of immune responses to viral vectors
ES2627882T3 (es) 2008-02-14 2017-07-31 Life Sciences Research Partners Vzw Control inmunogénico de tumores y células tumorales
AU2009214042B2 (en) 2008-02-14 2014-02-13 Katholieke Universiteit Leuven Immunotherapy targeting intracellular pathogens
WO2009101207A1 (en) * 2008-02-14 2009-08-20 Life Sciences Research Partners Vzw Cd4+ t-cells with cytolytic properties
GB201002730D0 (en) * 2010-02-18 2010-04-07 Uni I Oslo Product
JP5942296B2 (ja) * 2010-03-29 2016-06-29 サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィクＣｅｎｔｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅ Ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ 少なくとも１つのｃｘｘｃモチーフを含むポリペプチドと異種抗原とを含む医薬組成物、及びその使用
EP2378287A1 (en) * 2010-04-15 2011-10-19 TXCell New method for isolating Tr1 cells
US9511151B2 (en) 2010-11-12 2016-12-06 Uti Limited Partnership Compositions and methods for the prevention and treatment of cancer
US10023847B2 (en) * 2010-11-25 2018-07-17 Imnate Sarl Immunogenic peptides for use in the prevention and/or treatment of infectious diseases, autoimmune diseases, immune responses to allofactors, allergic diseases, tumors, graft rejection and immune responses against viral vectors used for gene therapy or gene vaccination
WO2013083140A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 N.V. Nutricia Beta-lactoglobulin peptides for treating cow's milk protein allergy
GB201201511D0 (en) 2012-01-30 2012-03-14 Univ Leuven Kath Modified epitopes for boosting CD4+ T-cell responses
US10988516B2 (en) 2012-03-26 2021-04-27 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating inflammation
JP2015518376A (ja) 2012-04-30 2015-07-02 イムシス・ソシエテ・アノニムＩｍｃｙｓｅ Ｓａ 抗原特異的な調節性ｔ細胞を誘導するための方法
US9603948B2 (en) 2012-10-11 2017-03-28 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating multiple sclerosis and related disorders
AU2014239557B2 (en) * 2013-03-15 2019-01-03 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Compositions and methods of enhancing immune responses to enteric pathogens
GB201309469D0 (en) 2013-05-28 2013-07-10 Imcyse Sa Detection of CD4+ T lymphocytes
EP3065771B1 (en) 2013-11-04 2019-03-20 UTI Limited Partnership Methods and compositions for sustained immunotherapy
CA2933552A1 (en) * 2013-12-23 2015-07-02 Alk-Abello A/S Peptide combinations and uses thereof in treating dust mite allergy
EP2982746A1 (en) * 2014-08-07 2016-02-10 TXCell Regulatory T cells with therapeutic potential
GB201418433D0 (en) * 2014-10-17 2014-12-03 Imcyse Sa Novel immunogenic peptides
SG10201913957PA (en) 2015-05-06 2020-03-30 Uti Lp Nanoparticle compositions for sustained therapy
US10729791B2 (en) 2015-05-18 2020-08-04 Imcyse Sa Animal models for evaluating pharmaceutical compounds
WO2019113342A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute Compositions and methods for treating nervous system injuries
US10653797B2 (en) * 2015-09-02 2020-05-19 Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute Compounds and compositions for targeting brain injuries and methods of use thereof
EP3939606A3 (en) * 2015-09-25 2022-04-20 ImCyse SA Improved methods and compounds for eliminating immune responses to therapeutic agents
IL262286B2 (en) 2016-04-19 2023-12-01 Imcyse Sa Novel immunogenic peptides that bind CD1D
JP7122002B2 (ja) * 2017-03-01 2022-08-19 国立大学法人北海道大学 疾患モデル非ヒト動物の製造方法、疾患モデル非ヒト動物、該動物を用いた薬剤のスクリーニング方法及び疾患リスク判定方法
AU2018229741B2 (en) * 2017-03-09 2021-09-02 Imcyse Sa Peptides and methods for the treatment of diabetes
EP3388447A1 (en) 2017-04-14 2018-10-17 Imnate Sarl Methods to produce peptides, polypeptides or cells for modulating immunity
BR112019028280A2 (pt) 2017-07-04 2020-07-14 Curevac Ag moléculas de ácido nucleico
MX2020003995A (es) 2017-10-19 2020-07-22 Curevac Ag Nuevas moleculas de acido nucleico artificiales.
CN110317246B (zh) * 2018-03-28 2022-08-02 深圳市安群生物工程有限公司 人mog抗原表位肽、抗原、抗体、应用及化学发光试剂盒
US20210401976A1 (en) 2018-11-12 2021-12-30 Imcyse Sa Immunogenic peptides with improved oxidoreductase motifs
TW202039534A (zh) 2018-12-14 2020-11-01 美商美國禮來大藥廠 KRAS變體mRNA分子
CN113906046A (zh) 2019-05-16 2022-01-07 易姆赛斯股份公司 具有包含经修饰半胱氨酸的氧化还原酶基序的免疫原性肽
EP3756648A1 (en) * 2019-06-27 2020-12-30 Imnate Sarl Improved vaccine formulations
CN114746111A (zh) 2019-11-27 2022-07-12 易姆赛斯股份公司 用于对糖尿病患者进行分层的方法
CN115867567A (zh) 2020-05-06 2023-03-28 易姆赛斯股份公司 具有新氧化还原酶基序的免疫原性肽
WO2021144478A2 (en) 2020-05-06 2021-07-22 Imcyse Sa Combination treatment for fumarate-related diseases
MX2022013911A (es) 2020-05-06 2022-11-30 Imcyse Sa Peptidos y metodos para el tratamiento de esclerosis multiple.
JP2023525276A (ja) 2020-05-06 2023-06-15 アンシス・エスア 延長された酸化還元酵素モチーフを有する免疫原性ペプチド
EP3915575A1 (en) 2020-05-29 2021-12-01 Imnate Sarl Vaccine formulations
IL308571A (en) 2021-05-26 2024-01-01 Imcyse Sa Methods for the treatment or prevention of autoimmune diseases
KR20240015672A (ko) 2021-06-01 2024-02-05 임시스 에스에이 면역원성 펩티드를 사용한 개선된 치료 방법
AR126654A1 (es) 2021-06-29 2023-11-01 Imcyse Sa Péptidos y métodos para el tratamiento de neuromielitis óptica

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4599231A (en) 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
AU579148B2 (en) 1984-03-09 1988-11-17 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis b virus vaccine including both t cell and b cell determinants
US4886782A (en) * 1987-02-26 1989-12-12 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Malarial immunogen
US5433948A (en) 1990-02-13 1995-07-18 Thomas; Wayne R. Cloning and sequencing of allergens of dermatophagoides (house dust mite)
HU9300877D0 (en) 1990-09-27 1993-06-28 Syntello Vaccine Dev Kb Method for producing proteines applicables by injection and inducing anti-bodies having neutralizing effect against virus of human immun insufficiency
US5912170A (en) 1991-03-07 1999-06-15 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by protein-tyrosine kinase chimeras
HU220462B1 (hu) 1991-10-16 2002-02-28 Immulogic Pharmaceutical Corp. A Dermatophagoides nemzetség allergénjéből származó peptidek, ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények és eljárás házi poratka-érzékenység kimutatására
US7252829B1 (en) 1998-06-17 2007-08-07 Idm Pharma, Inc. HLA binding peptides and their uses
US5589582A (en) 1992-10-27 1996-12-31 Biotransplant, Inc. Polynucleotides en coding porcine cytokines
US5633234A (en) 1993-01-22 1997-05-27 The Johns Hopkins University Lysosomal targeting of immunogens
EP0735893B1 (en) 1993-09-14 2008-11-26 Pharmexa Inc. Pan dr-binding peptides for enhancement of the immune response
US5824315A (en) 1993-10-25 1998-10-20 Anergen, Inc. Binding affinity of antigenic peptides for MHC molecules
US8791237B2 (en) 1994-11-08 2014-07-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of non-hodgkins lymphoma
US7157089B1 (en) 1996-11-26 2007-01-02 Stressgen Biotechnologies Corporation Immune responses using compositions containing stress proteins
WO1999021979A1 (en) 1997-10-28 1999-05-06 Maxygen, Inc. Human papillomavirus vectors
NO315238B1 (no) 1998-05-08 2003-08-04 Gemvax As Peptider som stammer fra leserammeforskyvingsmutasjoner i TBF<beta>II- eller BAX-genet, og farmasöytiske sammensetninger inneholdende disse,nukleinsyresekvenser som koder for slike peptider, plasmider og virusvektoreromfattende slikenukleinsy
AR020102A1 (es) * 1998-07-30 2002-04-10 Ucb Sa Compuesto para la prevencion y/o tratamiento de la alergia; composicion farmaceutica, composicion cosmetica, composicion en forma de bebida, alimento y/oalimento para animales domesticos que lo comprende y uso de dicho compuesto o dicha composicion farmaceutica para la fabricacion de un alimento
US20030152581A1 (en) * 1998-07-30 2003-08-14 Jean-Marie Saint-Remy Compound and method for the prevention and/or the treatment of allergy
US6656471B1 (en) 1998-11-17 2003-12-02 Board Of Regents, The University Of Texas System HIV-specific T-cell induction
US7780882B2 (en) 1999-02-22 2010-08-24 Georgetown University Simplified and improved method for preparing an antibody or an antibody fragment targeted immunoliposome for systemic administration of a therapeutic or diagnostic agent
US7157091B1 (en) * 1999-06-18 2007-01-02 Ludwig Institute For Cancer Research MAGE-A1 peptides presented by HLA class II molecules
WO2001055393A2 (en) 2000-01-28 2001-08-02 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mhc class ii restricted t cell epitopes from the cancer antigen ny-eso-1
GB0006437D0 (en) * 2000-03-17 2000-05-10 Leuven Res & Dev Vzw Compounds for the modulation of allergen sensitivity by antigens sharing T cell epitopes with allergens
AU2001272491A1 (en) 2000-06-26 2002-01-08 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Triple fusion proteins comprising ubiquitin fused between thioredoxin and a polypeptide of interest
JP4588296B2 (ja) * 2001-04-05 2010-11-24 ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ キメラワクチン
US7049413B2 (en) 2001-05-18 2006-05-23 Ludwig Institute For Cancer Research MAGE-A3 peptides presented by HLA class II molecules
US20040173778A1 (en) 2001-05-30 2004-09-09 Roncarolo Maria Grazia Ex-vivo isolated cd25+cd4+ t cells with immunosuppressive activity and uses thereof
DE60231417D1 (de) 2001-10-03 2009-04-16 Unilever Nv Kohlenhydratbindungsdomäne enthaltende fusionsproteine zur verabreichung von therapeutischen und anderen stoffen und zusammensetzungen in denen die fusionsproteine enthalten sind
US20100183652A1 (en) 2002-02-21 2010-07-22 Mark Page STABILIZED HBc CHIMER PARTICLES AS THERAPEUTIC VACCINE FOR CHRONIC HEPATITIS
WO2003072731A2 (en) 2002-02-21 2003-09-04 Apovia, Inc. STABILIZED HBc CHIMER PARTICLES HAVING MENINGOCCOCAL IMMUNOGENS
CA2478930A1 (en) * 2002-04-01 2003-10-16 Euro-Celtique, S.A. Epitope constructs comprising antigen presenting cell targeting mechanisms
TW200413406A (en) * 2002-08-26 2004-08-01 Kirin Brewery Peptides and drugs containing the same
ES2327040T3 (es) * 2002-09-12 2009-10-23 Oncotherapy Science, Inc. Peptidos kdr y vacunas que los contienen.
JP2004147649A (ja) 2002-10-11 2004-05-27 Kumamoto Technology & Industry Foundation 頭頚部癌の抗原
JP2003289887A (ja) * 2003-02-13 2003-10-14 Univ Harvard 免疫調節ペプチド
WO2005012502A2 (en) 2003-03-28 2005-02-10 Idm Pharma, Inc. Methods of identifying optimal variants of peptide epitopes
US7651855B2 (en) * 2003-04-17 2010-01-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regulatory T cells and their use in immunotherapy and suppression of autoimmune responses
WO2005037190A2 (en) 2003-09-03 2005-04-28 Dendritherapeutics, Inc. Multiplex vaccines
GB0324265D0 (en) * 2003-10-16 2003-11-19 Medical Res Council Peptide
US20070184023A1 (en) 2003-10-30 2007-08-09 Pharmexa A/S Method for down-regulation of vegf
AU2005265182B2 (en) 2004-06-17 2012-06-21 Mannkind Corporation Epitope analogs
JP2008044848A (ja) * 2004-11-30 2008-02-28 Univ Kurume Ｈｌａ−ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチド
US8252893B2 (en) 2005-01-31 2012-08-28 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas CD8 T cell epitopes in HPV 16 E6 and E7 proteins and uses thereof
US8486411B2 (en) 2005-08-30 2013-07-16 Children's Hospital & Research Center At Oakland Methods for identifying an epitope of a polypeptide, chlamydial antigenic polypeptides identified thereby, and methods of use thereof
US10183986B2 (en) 2005-12-15 2019-01-22 Industrial Technology Research Institute Trimeric collagen scaffold antibodies
GB0603081D0 (en) 2006-02-15 2006-03-29 Dynal Biotech Asa Oslo Method
FR2898275B1 (fr) 2006-03-10 2012-12-14 Genethon Cellules t regulatrices cd4+cd25+specifiques pour la greffe de cellules hematopoietiques et la tolerance immunitaire
WO2007135684A2 (en) 2006-05-22 2007-11-29 Hadasit Medical Research Services & Development Limited Method of treatment of anti-cd4 autoimmunity
ES2657480T3 (es) 2006-08-11 2018-03-05 Life Sciences Research Partners Vzw Péptidos inmunogénicos y su uso en trastornos inmunitarios
ES2602610T3 (es) 2007-05-31 2017-02-21 Medigene Ag Proteína estructural mutada de un parvovirus
US8546137B2 (en) 2007-09-27 2013-10-01 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Inhibition of dendritic cell-driven regulatory T cell activation and potentiation of tumor antigen-specific T cell responses by interleukin-15 and MAP kinase inhibitor
AU2009214042B2 (en) 2008-02-14 2014-02-13 Katholieke Universiteit Leuven Immunotherapy targeting intracellular pathogens
WO2009101207A1 (en) 2008-02-14 2009-08-20 Life Sciences Research Partners Vzw Cd4+ t-cells with cytolytic properties
EP2623125A1 (en) 2008-02-14 2013-08-07 Life Sciences Research Partners VZW Elimination of immune responses to viral vectors
WO2009100505A1 (en) 2008-02-14 2009-08-20 Life Sciences Research Partners Vzw Immunogenic peptides and their use in transplantati
ES2627882T3 (es) 2008-02-14 2017-07-31 Life Sciences Research Partners Vzw Control inmunogénico de tumores y células tumorales
WO2009101206A2 (en) 2008-02-14 2009-08-20 Life Sciences Research Partners Vzw Strategies to prevent and/or treat immune responses to soluble allofactors
WO2009101201A2 (de) 2008-02-15 2009-08-20 Chemetall Gmbh Mischungen aus metallhydriden und ionischen flüssigkeiten und verwendungen solcher mischungen
EP2254592B1 (en) 2008-02-28 2019-06-05 Dako Denmark A/S Mhc multimers in borrelia diagnostics and disease
KR101022649B1 (ko) 2008-08-07 2011-03-22 삼성모바일디스플레이주식회사 헤테로고리 화합물 및 이를 이용한 유기 전계 발광 장치
US20110318380A1 (en) 2008-10-01 2011-12-29 Dako Denmark A/S MHC Multimers in Cancer Vaccines and Immune Monitoring
EP2413964B1 (en) 2009-04-01 2019-11-13 University of Miami Vaccine compositions and methods of use thereof
JP5942296B2 (ja) 2010-03-29 2016-06-29 サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィクＣｅｎｔｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅ Ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ 少なくとも１つのｃｘｘｃモチーフを含むポリペプチドと異種抗原とを含む医薬組成物、及びその使用
US10023847B2 (en) 2010-11-25 2018-07-17 Imnate Sarl Immunogenic peptides for use in the prevention and/or treatment of infectious diseases, autoimmune diseases, immune responses to allofactors, allergic diseases, tumors, graft rejection and immune responses against viral vectors used for gene therapy or gene vaccination
GB201201511D0 (en) 2012-01-30 2012-03-14 Univ Leuven Kath Modified epitopes for boosting CD4+ T-cell responses
CN110075283A (zh) 2012-02-15 2019-08-02 洛桑聚合联合学院 红细胞结合性治疗剂
GB201309469D0 (en) 2013-05-28 2013-07-10 Imcyse Sa Detection of CD4+ T lymphocytes
GB201319160D0 (en) 2013-10-30 2013-12-11 Imcyse Sa Methods for induction of antigen-specific regulatory t cells
GB201418433D0 (en) 2014-10-17 2014-12-03 Imcyse Sa Novel immunogenic peptides
US10729791B2 (en) 2015-05-18 2020-08-04 Imcyse Sa Animal models for evaluating pharmaceutical compounds
EP3939606A3 (en) 2015-09-25 2022-04-20 ImCyse SA Improved methods and compounds for eliminating immune responses to therapeutic agents
IL262286B2 (en) 2016-04-19 2023-12-01 Imcyse Sa Novel immunogenic peptides that bind CD1D
AU2018229741B2 (en) 2017-03-09 2021-09-02 Imcyse Sa Peptides and methods for the treatment of diabetes
US20210401976A1 (en) 2018-11-12 2021-12-30 Imcyse Sa Immunogenic peptides with improved oxidoreductase motifs
CN113906046A (zh) 2019-05-16 2022-01-07 易姆赛斯股份公司 具有包含经修饰半胱氨酸的氧化还原酶基序的免疫原性肽
JP2023525276A (ja) 2020-05-06 2023-06-15 アンシス・エスア 延長された酸化還元酵素モチーフを有する免疫原性ペプチド
WO2021144478A2 (en) 2020-05-06 2021-07-22 Imcyse Sa Combination treatment for fumarate-related diseases
CN115867567A (zh) 2020-05-06 2023-03-28 易姆赛斯股份公司 具有新氧化还原酶基序的免疫原性肽
MX2022013911A (es) 2020-05-06 2022-11-30 Imcyse Sa Peptidos y metodos para el tratamiento de esclerosis multiple.

Also Published As

Publication number Publication date
EP2476436A9 (en) 2014-07-23
CA2660605C (en) 2016-05-17
ES2657480T3 (es) 2018-03-05
CA2926004A1 (en) 2008-02-14
EP2476437B1 (en) 2018-11-28
US20240034759A1 (en) 2024-02-01
EP2476435A3 (en) 2014-01-01
DK2059256T3 (en) 2016-12-05
EP2476436B1 (en) 2017-11-29
EP2059256B1 (en) 2016-08-03
EP2059256A1 (en) 2009-05-20
US20200317742A1 (en) 2020-10-08
EP2476436A2 (en) 2012-07-18
US11718650B2 (en) 2023-08-08
EP2476437A2 (en) 2012-07-18
PT2476435T (pt) 2018-03-05
US10662232B2 (en) 2020-05-26
DK2476435T3 (en) 2018-03-05
EP2476436A3 (en) 2014-01-01
JP2010500308A (ja) 2010-01-07
EP2476437A3 (en) 2014-01-01
EP2476435A2 (en) 2012-07-18
PT2059256T (pt) 2016-11-08
CA2660605A1 (en) 2008-02-14
US20160194367A1 (en) 2016-07-07
PL2059256T3 (pl) 2017-02-28
ES2709176T3 (es) 2019-04-15
PT2476436T (pt) 2018-02-23
JP2015142578A (ja) 2015-08-06
US9249202B2 (en) 2016-02-02
US20100303866A1 (en) 2010-12-02
AU2007283731A1 (en) 2008-02-14
ES2657504T3 (es) 2018-03-05
DK2476436T3 (en) 2018-02-05
PL2476435T3 (pl) 2018-05-30
EP2476435B1 (en) 2017-12-20
WO2008017517A1 (en) 2008-02-14
JP5750600B2 (ja) 2015-07-22
PL2476436T3 (pl) 2018-05-30
AU2007283731B2 (en) 2013-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2601432T3 (es) Péptidos inmunógenos y su uso en trastornos inmunitarios
ES2751605T3 (es) Nuevos péptidos inmunógenos
Offner et al. Recombinant human β-galactoside binding lectin suppresses clinical and histological signs of experimental autoimmune encephalomyelitis
ES2626115T3 (es) Péptidos inmunogénicos y su uso en trasplante
KR20220132023A (ko) 신규 면역원성 CD1d 결합 펩티드
RU2761653C2 (ru) Пептиды и способы для лечения диабета
ES2703236T3 (es) Mediador soluble
EP3030259B1 (en) Peptides
AU2014200368A1 (en) Immunogenic peptides and their use in immune disorders