ES2657504T3

ES2657504T3 - Péptidos inmunogénicos y su uso en trastornos inmunitarios

Info

Publication number: ES2657504T3
Application number: ES11187012.7T
Authority: ES
Inventors: Jean-Marie Saint-Remy
Original assignee: Katholieke Universiteit Leuven; Life Sciences Research Partners vzw
Current assignee: Katholieke Universiteit Leuven; Life Sciences Research Partners vzw
Priority date: 2006-08-11
Filing date: 2007-08-13
Publication date: 2018-03-05
Anticipated expiration: 2027-08-13
Also published as: US20160194367A1; CA2660605C; US20100303866A1; PT2476436T; EP2476435A2; ES2601432T3; EP2476437B1; WO2008017517A1; EP2059256A1; EP2476436B1; EP2476436A2; PL2476436T3; AU2007283731B2; US11718650B2; ES2657480T3; DK2059256T3; US20200317742A1; EP2476435A3; EP2476435B1; PL2476435T3

Abstract

Un péptido inmunogénico aislado con una longitud de entre 12 y 50 aminoácidos de un autoantígeno implicado en la diabetes de tipo 1, comprendiendo el péptido: un epítopo de linfocitos T del MHC de clase II de dicho autoantígeno; y un motivo redox C-X(2)-C, estando dicho motivo adyacente a dicho epítopo o separado de dicho epítopo por un máximo de 7 aminoácidos.

Description

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terminales del epítopo se numeran P+1, P+2 y así sucesivamente, como se ilustra en la Figura 3A.

El término “homólogo” como se usa en el presente documento en referencia a los epítopos usados en el contexto de la invención, se refiere a moléculas que tienen al menos 50 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el epítopo de origen natural, manteniendo de este modo la capacidad del epítopo para unirse con un anticuerpo o receptor de superficie celular de un linfocito B y/o T. Las realizaciones particulares de homólogos de un epítopo corresponden al epítopo natural modificado en como máximo tres, más particularmente más particularmente como máximo 2, más particularmente en un aminoácido.

El término “derivado” como se usa en el presente documento en referencia a los péptidos de la invención se refiere a moléculas que contienen al menos la parte activa del péptido (es decir capaces de inducir actividad de linfocitos T CD4+ citolíticos) y, además de la misma, comprenden una parte complementaria que puede tener diferentes fines tales como estabilizar los péptidos o alterar las propiedades farmacocinéticas o farmacodinámicas del péptido.

La expresión “identidad de secuencia” de dos secuencias como se usa en el presente documento se refiere al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la secuencia más corta, cuando las dos secuencias se alinean. En realizaciones particulares, dicha identidad de secuencia es del 70% al 80%, del 81% al 85%, del 86% al 90%, del 91% al 95%, del 96% al 100% o del 100 %.

La expresión “polinucleótido (o ácido nucleico) que codifica péptido” como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando se expresa en un ambiente apropiado, da como resultado la generación de la secuencia peptídica relevante o un derivado u homólogo de la misma. Dichos polinucleótidos o ácidos nucleicos incluyen las secuencias normales que codifican el péptido, así como derivados y fragmentos de estos ácidos nucleicos capaces de expresar un péptido con la actividad requerida. De acuerdo con una realización, el ácido nucleico que codifica los péptidos de acuerdo con la invención o fragmento del mismo es una secuencia que codifica el péptido o fragmento del mismo que se origina de un mamífero o correspondiente a un mamífero, más particularmente un fragmento peptídico humano.

La expresión “compuesto orgánico que tiene una actividad reductora” se refiere en el contexto de la presente invención a compuestos, más en particular secuencias de aminoácidos, con una actividad reductora para enlaces disulfuro en proteínas. La expresión “trastornos inmunitarios” o “enfermedades inmunitarias” se refiere a enfermedades en las que una reacción del sistema inmunitario es responsable de o sostiene una disfunción o situación no fisiológica en un organismo. Se incluyen en los trastornos inmunitarios, entre otros, trastornos alérgicos y enfermedades autoinmunitarias.

Las expresiones “enfermedades alérgicas” o “trastornos alérgicos” como se usan en el presente documento se refieren a enfermedades caracterizadas por reacciones de hipersensibilidad del sistema inmunitario a sustancias específicas denominadas alérgenos (tales como polen, picaduras, fármacos o alimentos). La alergia es el conjunto de señales y síntomas observados siempre que un paciente individual atópico se encuentre con un alérgeno al que se ha sensibilizado, lo que puede dar como resultado el desarrollo de diversas enfermedades, en particular enfermedades y síntomas respiratorios tales como asma bronquial. Existen diversos tipos de clasificaciones y la mayoría de trastornos alérgicos tienen diferentes nombres dependiendo de la parte del cuerpo del mamífero en que se produzca. La “hipersensibilidad” es una reacción indeseable (perjudicial, que produce incomodidad y en ocasiones es letal) producida en un individuo tras exposición a un antígeno al que se ha sensibilizado; la “hipersensibilidad inmediata” depende de la producción de anticuerpos IgE y es por lo tanto equivalente a la alergia.

Las expresiones “enfermedad autoinmunitaria” o “trastorno autoinmunitario” se refieren a enfermedades que resultan de una respuesta inmunitaria aberrante de un organismo contra sus propias células y tejidos debido a una incapacidad del organismo de reconocer sus propias partes constituyentes (hasta el nivel submolecular) como “propias”. El grupo de enfermedades puede dividirse en dos categorías, enfermedades específicas de órganos y sistémicas.

Un “alérgeno” se define como una sustancia, habitualmente una macromolécula o una composición proteica que induce la producción de anticuerpos IgE en pacientes individuales predispuestos, particularmente genéticamente dispuestos (atópicos). Se presentan definiciones similares en Liebers y col. (1996) Clin. Exp. Allergy 26, 494-516.

La expresión “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a una cantidad del péptido de la invención o derivado del mismo, que produce el efecto terapéutico o preventivo deseado en un paciente. Por ejemplo, en referencia a una enfermedad o un trastorno, es la cantidad que reduce en algún grado uno o más síntomas de la enfermedad o el trastorno, y más particularmente devuelve a la normalidad, parcial o completamente, los parámetros fisiológicos o bioquímicos asociados con o causantes de la enfermedad o el trastorno. De acuerdo con una realización particular de la presente invención, la cantidad terapéuticamente eficaz es la cantidad del péptido de la invención o derivado del mismo que conducirá a una mejora o una restauración de la situación fisiológica normal. Por ejemplo, cuando se usa para tratar terapéuticamente a un mamífero afectado por un trastorno inmunitario, es

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una cantidad diaria de péptido/kg de peso corporal de dicho mamífero. Como alternativa, cuando la administración es mediante terapia génica, la cantidad de ADN desnudo o vectores víricos se ajusta para asegurar la producción local de la dosificación relevante del péptido de la invención, derivado u homólogo del mismo.

El término “natural” cuando hace referencia a un péptido o a una secuencia en el presente documento se refiere al hecho de que la secuencia es idéntica a una secuencia de origen natural. A diferencia de este, el término “artificial” se refiere a una secuencia o un péptido que, como tal, no aparece en la naturaleza. Opcionalmente, una secuencia artificial se obtiene de una secuencia natural por modificaciones limitadas tales como cambio de uno o más aminoácidos dentro de la secuencia de origen natural o añadiendo aminoácidos en el extremo N o C terminal de una secuencia de origen natural. Los aminoácidos se denominan en el presente documento por su nombre completo, su abreviatura de tres letras o su abreviatura de una letra.

Los motivos de secuencias de aminoácidos se escriben en el presente documento de acuerdo con el formato de Prosite. El símbolo X se usa para una posición en la que se acepte cualquier aminoácido. Las alternativas se indican enumerando los aminoácidos aceptables para una posición dada, entre corchetes (‘[ ]’). Por ejemplo: [CST] significa un aminoácido seleccionado de Cys, Ser o Thr. Los aminoácidos que se excluyen como alternativas se indican enumerándolos entre llaves (‘{ }’). Por ejemplo: {AM} significa cualquier aminoácido excepto Ala y Met. Los diferentes elementos en un motivo se separan entre sí por un guion -. La repetición de un elemento idéntico dentro de un motivo puede indicarse colocando detrás de ese elemento un valor numérico o un intervalo numérico entre paréntesis. Por ejemplo: X(2) corresponde a X-X, X (2, 4) corresponde a X-X o X-X-X o X-X-X-X, A (3) corresponde a A-A-A.

La presente invención se basa en el hallazgo de que un péptido, que comprende un epítopo de linfocitos T y una secuencia peptídica, que tiene actividad reductora es capaz de generar una población de linfocitos T reguladores que tienen un efecto citotóxico en células presentadoras de antígenos.

En consecuencia, en su sentido más amplio, la invención se refiere a péptidos que comprenden al menos un epítopo de linfocitos T de un antígeno (propio o no propio) con potencial para desencadenar una reacción inmunitaria, acoplado con un compuesto orgánico que tiene una actividad reductora, tal como un motivo de secuencia de tiorreductasa. El epítopo de linfocitos T y el compuesto orgánico se separan opcionalmente por una secuencia de engarce. En realizaciones opcionales adicionales el péptido comprende adicionalmente una secuencia de dirección a endosoma y/o secuencias “flanqueantes” adicionales.

Los péptidos de la invención pueden representarse de forma esquemática como A-L-B o B-L-A, en los que A representa un epítopo de linfocitos T de un antígeno (propio o no propio) con potencial para desencadenar una reacción inmunitaria, L representa un engarce y B representa un compuesto orgánico que tiene una actividad reductora.

La actividad reductora de un compuesto orgánico puede ensayarse con respecto a su capacidad para reducir un grupo sulfhidrilo tal como en el ensayo de solubilidad de insulina descrito en los ejemplos del presente documento en los que la solubilidad de insulina se altera tras la reducción, o con una insulina marcada con fluorescencia. El compuesto orgánico reductor puede acoplarse en el lado amino terminal del epítopo de linfocitos T o en el extremo carboxilo terminal del epítopo de linfocitos T.

En general el compuesto orgánico con actividad reductora es una secuencia peptídica. Se encuentran fragmentos peptídicos con actividad reductora en tiorreductasa que son pequeñas enzimas reductoras de disulfuro que incluyen glutarredoxinas, nucleorredoxinas, tiorredoxinas y otras tiol/disulfuro oxidorreductasas (Holmgren (2000) Antioxid Redox Signal 2, 811-820; Jacquot y col. (2002) Biochem Pharm 64, 1065-1069). Son multifuncionales, ubicuas y se encuentran en muchos procariotas y eucariotas. Ejercen actividad reductora para enlaces disulfuro en proteínas (tales como enzimas) mediante cisteínas redox activas dentro de secuencias consenso de dominio activo conservadas: C-X(2)-C, C-X(2)-S, C-X(2)-T, S-X(2)-C, T-X(2)-C (Fomenko y col. (2003) Biochemistry 42, 1121411225; Fomenko y col. (2002) Prot. Science 11: 2285-2296), en las que X significa cualquier aminoácido. Dichos dominios también se encuentran en proteínas mayores tales como la proteína disulfuro isomerasa (PDI) y fosfolipasa C específica de fosfoinositida (Tabla 1).

Tabla 1: Aparición del motivo CST-X(2)-CST en proteínas reductoras representativas

Organismo Longitud de la Posición de C-X(2)-S en C-X(2)-S en la estructura secundaria y Descripción proteína la proteína flanqueante #

D. pteronyssinus E. coli K12: 129 115 21-25 30-35 b-CHGS-coil b-CGFS-a Alérgeno Der p 2 Glutarredoxina

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Organismo: Longitud de la Posición de C-X(2)-S en C-X(2)-S en la estructura secundaria y Descripción

proteína: la proteína flanqueante #

E. coli K12 104 14-18 b-CGTS-a Arsenato reductasa

S. 203 108-112 b-CPYS-a homólogo de cerevisiae glutarredoxina

S. 231 136-140 b-CSYS-a homólogo de cerevisiae glutarredoxina

S. 517 62-66 b-CLHS-a proteína disulfuro cerevisiae isomerasa

H. sapiens 793 72-78 b-CGHS-a homólogo de tiorredoxina

# b: cadena beta ; a: hélice alfa

En consecuencia, en realizaciones particulares, los péptidos de acuerdo con la presente invención comprenden el motivo de secuencia de tiorreductasa [CST]-X (2)-[CST] en el que al menos uno de [CST] es Cys; por lo tanto el motivo es [C]-X (2)-[CST] o [CST]-X (2)-[C]. En la presente solicitud dicho tetrapéptido se denominará “el motivo”. En realizaciones particulares los péptidos de la invención contienen el motivo de secuencia [C]-X (2)-[CS] o [CS]-X (2)[C]. En más realizaciones particulares los péptidos contienen el motivo de secuencia C-X (2)-S, S-X (2)-C o C-X (2)-

C.

Como se explica en detalle posteriormente, los péptidos de la presente invención pueden prepararse por síntesis química, lo que permite la incorporación de aminoácidos no naturales. En consecuencia, en el motivo de compuestos reductores de acuerdo con realizaciones particulares de la presente invención, C representa cisteína u otros aminoácidos con un grupo tiol tales como mercaptovalina, homocisteína u otros aminoácidos naturales o no naturales con una función tiol. Para tener actividad reductora, las cisteínas presentes en el motivo no deberían aparecer como parte de un enlace disulfuro de cistina. No obstante, el motivo puede comprender cisteínas modificadas tales como cisteína metilada, que se convierte en cisteína con grupos tiol libres in vivo.

El aminoácido X en el motivo [CST]-X (2)-[CST] de realizaciones particulares de los compuestos reductores de la invención puede ser cualquier aminoácido natural, incluyendo S, C o T o puede ser un aminoácido no natural. En realizaciones particulares X es un aminoácido con una cadena lateral pequeña tal como Gly, Ala, Ser o Thr. En realizaciones particulares adicionales, X no es un aminoácido con una cadena lateral voluminosa tal como Tyr. En realizaciones particulares adicionales al menos una X en el motivo [CST]-X (2)-[CST] es His o Pro.

En los péptidos de la presente invención que comprenden el motivo descrito anteriormente como el compuesto reductor, el motivo se localiza de modo que, cuando el epítopo se ajuste al surco de MHC, el motivo permanezca fuera del surco de unión del MHC. El motivo se coloca bien inmediatamente adyacente a la secuencia de epítopo dentro del péptido, o bien separado del epítopo de linfocitos T por un engarce. Más particularmente, el engarce comprende una secuencia de aminoácidos de 7 aminoácidos o menos. Más particularmente, el engarce comprende 1, 2, 3 o 4 aminoácidos. Como alternativa, un engarce puede comprender 6, 8 o 10 aminoácidos. En las realizaciones particulares de los péptidos de la invención en las que la secuencia de motivo está adyacente a la secuencia de epítopo esta se indica como posición P-4 a P-1 o P+1 a P+4 en comparación con la secuencia de epítopo.

Aparte de un engarce peptídico pueden usarse otros compuestos orgánicos como engarce para unir las partes del péptido entre sí (por ejemplo el motivo con la secuencia de epítopo de linfocito T).

Los péptidos de la presente invención pueden comprender además secuencias de aminoácidos cortas adicionales en dirección N o C terminal de la secuencia (artificial) que comprende el epítopo de linfocito T y el compuesto reductor (motivo). Dicha secuencia de aminoácidos se denomina en general en el presente documento “secuencia flanqueante”. Una secuencia flanqueante puede situarse entre el epítopo y una secuencia de dirección endosómica y/o entre el compuesto reductor (por ejemplo motivo) y una secuencia de dirección endosómica. En realizaciones adicionales, que no comprenden una secuencia de dirección endosómica, puede estar presente una secuencia de aminoácidos corta en dirección N y/o C terminal del compuesto reductor y/o secuencia de epítopo en el péptido. Más particularmente, una secuencia flanqueante es una secuencia de entre 1 y 7 aminoácidos, más particularmente una secuencia de 2 aminoácidos.

En realizaciones particulares de los péptidos de la invención, el motivo se localiza en dirección N terminal del

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o menor de una proteína, que facilita la captación en el endosoma tardío sin superar la respuesta de linfocitos T hacia el antígeno, es decir epítopo de linfocitos T derivado de alérgeno o autoantígeno.

La secuencia de dirección a endosoma tardío puede localizarse en el extremo amino terminal o en el extremo carboxilo terminal del péptido derivado de autoantígeno o alérgeno para captación y procesamiento eficaz y también puede acoplarse mediante una secuencia flanqueante, tal como una secuencia peptídica de hasta 10 aminoácidos. Cuando se usa un epítopo de linfocitos T menor para fines de dirección, este último se localiza típicamente en el extremo amino terminal del péptido derivado de autoantígeno o alérgeno.

En consecuencia, la presente invención prevé péptidos de proteínas antigénicas y su uso en la inducción de reacciones inmunitarias específicas. Los péptidos de la presente invención pueden corresponder a fragmentos de proteínas que comprenden, dentro de su secuencia, los elementos de la presente invención, es decir un compuesto reductor y un epítopo de linfocitos T separado por como máximo 10, preferentemente 7 aminoácidos o menos. Como alternativa, y para la mayoría de proteínas antigénicas, los péptidos de la invención se generan acoplando un compuesto reductor, más particularmente un motivo reductor como se describe en el presente documento, en dirección N terminal o C terminal de un epítopo de linfocitos T de la proteína antigénica (bien directamente adyacente al mismo o con un engarce de como máximo 10, más particularmente como máximo 7 aminoácidos) para obtener los elementos característicos de la invención. Además la secuencia de epítopo de linfocitos T de la proteína y/o el motivo puede modificarse y/o pueden introducirse (o modificarse) una o más secuencias flanqueantes y/o una secuencia de dirección, en comparación con la secuencia de origen natural. Por lo tanto, dependiendo de si los elementos de la presente invención pueden encontrarse o no dentro de la secuencia de la proteína antigénica de interés, los péptidos de la presente invención pueden comprender una secuencia que es “artificial” o “de origen natural”.

La longitud de los péptidos de la presente invención puede variar sustancialmente. En realizaciones particulares, en las que el compuesto reductor corresponde al motivo como se describe en el presente documento, la longitud de los péptidos varía de 12-13 aminoácidos, es decir que consiste en un epítopo de 8-9 aminoácidos y adyacente al mismo el motivo como se describe en el presente documento de 4 aminoácidos, hasta 50 o más aminoácidos. Por ejemplo, un péptido de acuerdo con la invención puede comprender una secuencia de dirección endosómica de 40 aminoácidos, una secuencia flanqueante de aproximadamente 2 aminoácidos, un motivo como se describe en el presente documento de 4 aminoácidos, un engarce de 4 aminoácidos y un péptido de epítopo de linfocitos T de 9 aminoácidos.

En consecuencia, en realizaciones particulares, los péptidos completos consisten en entre 12 aminoácidos y 20 hasta 25, 30, 50, 75, 100 o 200 aminoácidos. En realizaciones más particulares, los péptidos consisten en entre 10 y 20 aminoácidos. Más particularmente, cuando el compuesto reductor sea un motivo como se describe en el presente documento, la longitud de la secuencia (artificial o natural) que comprende el epítopo y motivo opcionalmente conectado por un engarce (denominado en el presente documento secuencia de “epítopo-motivo”), sin la secuencia de dirección endosómica, es crítica. El “epítopo-motivo” más particularmente tiene una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 aminoácidos, óptimamente de 18 aminoácidos o menos. Dichos péptidos de 12 o 13 a 18 aminoácidos pueden acoplarse opcionalmente con una señal de dirección endosómica de la que el tamaño es menos crítico.

Como se ha detallado anteriormente, en realizaciones particulares, los péptidos de la presente invención comprenden un motivo reductor como se describe en el presente documento ligado a una secuencia de epítopo de linfocitos T. De acuerdo con una realización particular los péptidos son péptidos de proteínas que no comprenden dentro de su secuencia natural nativa una secuencia de aminoácidos con propiedades redox cercanas (es decir dentro de una secuencia de 11 aminoácidos en dirección N o C terminal) del epítopo de interés, más específicamente que no comprenden en su secuencia natural nativa una secuencia consenso de tiorredoxina, glutarredoxina o tiorreductasas u homólogos de las mismas, cerca del epítopo de interés. Más particularmente, la invención abarca la generación de péptidos inmunogénicos de proteínas antigénicas que no comprenden una secuencia seleccionada de C-X(2)-S, S-X(2)-C, C-X(2)-C, S-X(2)-S, C-X( 2)-T, T-X(2)-C, o cualquier otra secuencia consenso que sea típica de secuencias consenso de tiorredoxina, glutarredoxina o tiorreductasas cerca del epítopo de interés, es decir dentro de una secuencia de 11 aminoácidos en dirección N o C terminal de la secuencia de epítopo. En realizaciones particulares adicionales, la presente invención proporciona péptidos inmunogénicos de proteínas antigénicas que no comprenden las secuencias de aminoácidos anteriormente descritas con propiedades redox dentro de su secuencia. En realizaciones particulares adicionales, la proteína antigénica no comprende de forma natural la secuencia C-H-G-S dentro de una secuencia de 11 aminoácidos en dirección N o C terminal de la secuencia de epítopo. Más particularmente la presente invención reivindica péptidos distintos de péptidos que comprenden el epítopo EPCIIHRGKP [SEQ ID NO: 1] del péptido p21-35 de Der p 2 (CHGSEPCIIHRGKPF [SEQ ID NO: 2]) y el motivo C-H-G-S [SEQ ID. NO: 3], en particular los péptidos en los que este motivo se localiza en dirección N terminal de la secuencia de epítopo, ya que dichos péptidos corresponden a péptidos generados en la técnica anterior y usados para inducir una respuesta inmunitaria en el contexto del mapeo de epítopos de Der p 2 (Wu y col. 2002, J. Immunol. 169, 2430-2435).

En realizaciones particulares adicionales, los péptidos de la invención son péptidos que comprenden epítopos de linfocitos T que no comprenden una secuencia de aminoácidos con propiedades redox dentro de su secuencia natural.

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Para tratar las enfermedades anteriores, se generan péptidos de acuerdo con la invención a partir de las proteínas antigénicas o alérgenos conocidos o que se cree que son un factor causante de la enfermedad. Los alérgenos que pueden usarse para la selección de epítopos de linfocitos T son típicamente alérgenos que se seleccionan del grupo que consiste en:

-alérgenos alimentarios presentes en cacahuetes, pescado por ejemplo bacalao, clara de huevo, crustáceos por

ejemplo gambas, leche por ejemplo leche de vaca, trigo, cereales, frutas de la familia de las rosáceas (manzana,

ciruela, fresa), verduras de las familias de liliáceas, crucíferas, solanáceas y umbelíferas, frutos secos, sésamo,

cacahuete, soja y otros alérgenos de la familia de las legumbres, especias, melón, aguacate, mango, higo,

plátano, etc. -alérgenos de ácaros del polvo domésticos obtenidos de Dermatophagoides spp o D. pteronyssinus, D. farinae y

D. microceras, Euroglyphus maynei o Blomia sp., -alérgenos de insectos presentes en cucarachas o himenópteros, -alérgenos del polen, especialmente pólenes de árboles, hierba y pasto, -alérgenos de animales, especialmente en gatos, perros, caballos y roedores, -alérgenos de hongos, especialmente de Aspergillus, Alternaria o Cladosporium, y -alérgenos ocupacionales presentes en productos tales como látex, amilasa, etc.

El epítopo de linfocitos T correspondiente a una proteína antigénica (o inmunógeno) adecuado para su uso en el contexto de la presente invención es típicamente un epítopo de linfocitos T universal o promiscuo (es decir un epítopo de linfocitos T capaz de unirse con una mayoría de las moléculas del MHC de clase II), más particularmente presente en un alérgeno portado por el aire o un alérgeno portado por alimentos. En realizaciones particulares, dicho alérgeno se selecciona del grupo que consiste en alérgenos de rinosinusitis, alérgenos de asma bronquial alérgica y alérgenos de dermatitis atópica.

Los alérgenos también pueden ser alérgenos principales presentes en mohos o diversos fármacos tales como hormonas, antibióticos, enzimas, etc. (véase también la definición en Clin. Exp. Allergy 26, 494-516 (1996) y en Molecular Biology of Allergy and Immunology, Ed. R. Bush (1996)). Otros alérgenos relacionados con enfermedades alérgicas específicas también se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse en Internet, por ejemplo en www.allergome.org.

Se clasifican ampliamente enfermedades autoinmunitarias en dos categorías, enfermedades específicas de órganos y sistémicas. No se ha identificado la etiología precisa de enfermedades autoinmunitarias sistémicas. Por el contrario, las enfermedades autoinmunitarias específicas de órganos están relacionadas con una respuesta inmunitaria específica incluyendo linfocitos B y T, que se dirige al órgano y de este modo induce y mantiene un estado crónico de inflamación local. Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias específicas de órganos incluyen diabetes de tipo 1, miastenia grave, tiroiditis y esclerosis múltiple. En cada una de estas afecciones, se ha identificado un único autoantígeno o un número pequeño de autoantígenos, incluyendo insulina, el receptor muscular de acetilcolina, peroxidasa tiroidea y proteína básica principal, respectivamente. Está bien reconocido que la supresión de esta respuesta inmunitaria específica de órgano es beneficiosa y conduce a recuperación parcial o completa de la función orgánica. No hay, sin embargo, ninguna terapia que suprima dicha respuesta inmunitaria de una manera específica de antígeno. La terapia actual hace uso en su lugar de la supresión no específica obtenida por el uso de corticosteroides y agentes inmunosupresores, que muestran todos efectos secundarios significativos relacionados con su ausencia de especificidad, limitando de este modo su uso y su eficacia general. La Tabla 2 muestra una lista no limitante de ejemplos de autoantígenos conocidos que están ligados a trastornos autoinmunitarios específicos de órgano y que se prevén dentro del contexto de la presente invención.

Tabla 2. Autoantígenos representativos y enfermedades ligadas con los mismos

Enfermedad antígeno

enfermedades tiroideas tiroglobulina peroxidasa tiroidea receptor de TSH

diabetes de tipo 1 insulina (proinsulina) ácido glutámico descarboxilasa (GAD) tirosina fosfatasa IA-2 proteína de choque térmico HSP65 proteína relacionada con la subunidad catalítica de la glucosa-6-fosfatasa específica de islotes (IGRP)

adrenalitis 21-OH hidroxilasa

síndromes poliendocrinos 17-alfa hidroxilasa histidina descarboxilasa triptófano hidroxilasa tirosina hidroxilasa

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Enfermedad antígeno

gastritis y anemia perniciosa factor intrínseco de H+/K+ ATPasa

esclerosis múltiple glucoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG)

proteína básica de mielina (MBP)

proteína proteolipídica (PLP)

miastenia grave receptor de acetilcolina

enfermedades oculares proteína de unión a retinol (RBP)

enfermedades del oído interno colágeno de tipo II y tipo IX enfermedad celíaca transglutaminasa tisular enfermedades inflamatorias del proteína de histona H1 pANCA intestino ateroesclerosis proteína de choque térmico HSP60

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan péptidos inmunogénicos que comprenden un epítopo de linfocitos T de un antígeno (propio o no propio) con potencial para desencadenar una reacción inmunitaria, tal como un alérgeno o un autoantígeno, tal como los descritos en la Tabla 2. En una realización particular, el epítopo de linfocitos T es un epítopo de linfocitos T dominante.

En consecuencia, en realizaciones particulares, los procedimientos de tratamiento y prevención de la presente invención comprenden la administración de un péptido inmunogénico como se describe en el presente documento, en el que el péptido comprende un epítopo de linfocitos T de una proteína antigénica que desempeña un papel en la enfermedad para tratar (por ejemplo tal como las descritas en la Tabla 2 anterior). En realizaciones particulares adicionales, el epítopo usado es un epítopo dominante.

La identificación y selección de un epítopo de linfocitos T de dichas proteínas antigénicas, más en particular de alérgenos o autoantígenos, para uso en el contexto de la presente invención es conocida por un experto en la materia.

Para identificar un epítopo adecuado para su uso en el contexto de la presente invención, se ensayan secuencias peptídicas aisladas de una proteína antigénica, por ejemplo, mediante técnicas de biología de linfocitos T, para determinar si las secuencias peptídicas inducen una respuesta de linfocitos T. Las secuencias peptídicas que se ha descubierto que inducen una respuesta de linfocitos T se definen como poseedoras de actividad estimulante de linfocitos T.

La actividad estimulante de linfocitos T humanos puede ensayarse adicionalmente cultivando linfocitos T obtenidos de un individuo sensible a, por ejemplo, un alérgeno de ácaros (es decir un individuo que tiene una respuesta inmunitaria mediada por IgE a un alérgeno de ácaros) con un péptido/epítopo derivado del alérgeno y determinar si se produce proliferación de linfocitos T en respuesta al péptido/epítopo como se mide, por ejemplo, por captación celular de timidina tritiada. Los índices de estimulación para respuestas por linfocitos T a péptidos/epítopos pueden calcularse como la CPM máxima en respuesta a un péptido/epítopo dividido por la CPM de control. Un índice de estimulación (I.E.) de linfocitos T igual a o mayor de dos veces el nivel de fondo se considera “positivo”. Se usan resultados positivos para calcular el índice de estimulación medio para cada péptido/epítopo para el grupo de péptidos/epítopos ensayado.

Los epítopos de linfocitos T no naturales (o modificados) pueden opcionalmente ensayarse adicionalmente con respecto a su afinidad de unión por moléculas del MHC de clase II. Esto puede realizarse de diferentes maneras. Por ejemplo, se obtienen moléculas del HLA de clase II solubles mediante lisis de células homocigotas para una molécula de clase II dada. Esta última se purifica por cromatografía de afinidad. Se incuban moléculas de clase II solubles con un péptido de referencia marcado con biotina producido de acuerdo con su afinidad de unión fuerte por esa molécula de clase II. Los péptidos para evaluar con respecto a unión a clase II se incuban después a diferentes concentraciones y su capacidad para desplazar el péptido de referencia de su unión a clase II se calcula por la adición de neutravidina. Pueden encontrarse procedimientos por ejemplo en Texier y col., (2000) J. Immunology 164, 3177-3184).

De acuerdo con la presente invención, las propiedades inmunogénicas de epítopos de linfocitos T se aumentan ligándolos a un compuesto reductor. Particularmente, los péptidos de la presente invención que comprenden al menos un epítopo de linfocitos T y el compuesto reductor como se describe en el presente documento tienen un índice de estimulación de linfocitos T medio de más de o igual a 2,0. Un péptido que tiene un índice de estimulación de linfocitos T de más de o igual a 2,0 se considera útil como un agente terapéutico. Más particularmente, los péptidos de acuerdo con la invención tienen un índice de estimulación de linfocitos T medio de al menos 2,5, al menos 3,5, al menos 4,0 o incluso al menos 5,0. Además, los péptidos tienen típicamente un índice de positividad (I.P.) de al menos aproximadamente 100, al menos 150, al menos aproximadamente 200 o al menos aproximadamente 250. El índice de positividad para un péptido se determina multiplicando el índice de estimulación

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moléculas de ADN pueden incorporarse en vectores de expresión, incluyendo plásmidos, que se adaptan para la expresión del ADN y producción del polipéptido en un hospedador adecuado tal como bacteria, por ejemplo Escherichia coli, célula de levadura, célula animal o célula vegetal.

Las propiedades físicas y químicas de un péptido de interés (por ejemplo solubilidad, estabilidad) se examinan para determinar si el péptido es/sería adecuado para su uso en composiciones terapéuticas. Típicamente esto se optimiza ajustando la secuencia del péptido. Opcionalmente, el péptido puede modificarse después de la síntesis (modificaciones químicas por ejemplo adición/supresión de grupos funcionales) usando técnicas conocidas en este campo.

Se cree que los epítopos de linfocitos T por sí solos desencadenan acontecimientos tempranos en el nivel de linfocito T auxiliar uniéndose con una molécula del HLA apropiada en la superficie de una célula presentadora de antígenos y estimulando la subpoblación de linfocitos T relevante. Estos acontecimientos conducen a la proliferación de linfocitos T, secreción de linfocinas, reacciones inflamatorias locales, el reclutamiento de células inmunitarias adicionales al sitio, y activación de la cascada de linfocitos B que conduce a la producción de anticuerpos. Un isotipo de estos anticuerpos, IgE, es fundamentalmente importante en el desarrollo de síntomas alérgicos y su producción está influida pronto en la cascada de acontecimientos, al nivel del linfocito T auxiliar, por la naturaleza de las linfocinas secretadas. Un epítopo de linfocitos T es el elemento básico o unidad más pequeña de reconocimiento por un receptor de linfocitos T en el que el epítopo comprende restos de aminoácidos esenciales para el reconocimiento de receptores, que son contiguos en la secuencia de aminoácidos de la proteína.

Sin embargo, tras la administración de los péptidos de acuerdo con la invención (que comprenden un epítopo de linfocitos T acoplado a una secuencia redox) o composiciones de los mismos, se cree que se producen los siguientes acontecimientos:

•: activación de linfocitos T específicos de antígeno (es decir alérgeno o autoantígeno) resultante de la interacción afín con el péptido derivado de antígeno (es decir alérgeno o autoantígeno) presentado por moléculas del MHC de clase II;

•: la secuencia consenso de reductasa reduce proteínas de superficie de linfocitos T, tales como la molécula CD4 (y también CD3), cuyo segundo dominio contiene un enlace disulfuro restringido. Esto transduce una señal a linfocitos T. Entre una serie de consecuencias relacionadas con la ruta oxidativa aumentada, son acontecimientos importantes el aumento del flujo de entrada de calcio y la translocación del factor de transcripción NF-κB al núcleo. Esto último da como resultado el aumento de la transcripción de IFN gamma y granzimas, lo que permite que las células adquieran propiedades citotóxicas;

•: la citotoxicidad afecta a células que presentan el péptido por un mecanismo, que implica secreción de granzima B, e interacciones Fas-FasL. La destrucción de las células diana presentadoras de antígenos evita la activación de otros linfocitos T específicos para epítopos localizados en el mismo antígeno, o para un antígeno no relacionado que se procesaría por la misma célula presentadora de antígenos;

•: una consecuencia adicional de la activación de linfocitos T es suprimir la activación de linfocitos T testigos por un mecanismo dependiente del contacto célula-célula. En tal caso, los linfocitos T activados por un antígeno presentado por una célula presentadora de antígenos diferente también se suprimen siempre que los linfocitos T tanto citotóxicos como testigos estén en proximidad estrecha.

El mecanismo de acción anteriormente postulado está fundamentado en datos experimentales (véase ejemplos anteriores). Algunos experimentos también han sugerido, además, la implicación de la ruta de la perforina y/o la activación de la indoleamina oxidasa en células diana, lo que da como resultado aumento del catabolismo de triptófano, un aminoácido esencial para supervivencia celular, así como la producción de micropartículas por Treg activados.

Los experimentos en modelos in vivo descritos posteriormente han demostrado que la administración (es decir inyección) de un péptido de acuerdo con la invención o una composición del mismo puede prevenir o suprimir una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Como ejemplo, en un modelo de ratón de asma debido a la sensibilización de un alérgeno, Der p 2, la preinmunización con un péptido de acuerdo con la invención descrito anteriormente evita la infiltración de células inflamatorias de pulmón, que es una característica del asma. La hiperreactividad de las vías respiratorias no específica, como se mide por inhalación de dosis creciente de metacolina, se previene esencialmente por el mismo protocolo experimental. También se previene completamente la migración de células al fluido broncoalveolar (véase ejemplo 4). Además, la transferencia adoptiva de clones de linfocitos T (derivados de animales inmunizados con la composición) previene y suprime completamente tanto la infiltración de células inflamatorias como la hiperreactividad de las vías respiratorias en receptores. Dichos clones de linfocitos T que son inducidos por la administración de los péptidos de acuerdo con la invención presentan varias características fenotípicas, que los hacen distintos de los Treg actualmente identificados, bien Treg naturales o bien Treg adaptativos. Por lo tanto, los Treg citotóxicos muestran aumento de la expresión de marcadores de superficie incluyendo CD103, CTLA-4, FasL e ICOS (tras la activación). Son CD25alto incluso en reposo y CD127bajo (IL7-R). La expresión del factor de transcripción incluye T bet pero no el represor de la transcripción Foxp3, considerado como un distintivo de los Treg naturales. Aparte de la alta producción de IFN gamma, dichos clones no secretan o secretan solamente cantidades traza de IL-10, IL-4, IL-5, IL-13 o TGF beta. Las características anteriores no son exclusivas, sino que se proporcionan como una ilustración del hecho de que dichos Treg citotóxicos son distinguibles

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-expresión del factor de transcripción T-bet y egr-2 (Krox-20) pero no del represor de la transcripción Foxp3, -una alta producción de IFN-gamma y ninguna cantidad o solamente cantidades traza de IL-10, IL-4, IL-5, IL-13 o

TGF-beta.

Más particularmente, los procedimientos de la presente invención comprenden determinar que las células expresan CD4, que no expresan IL-10 o TGF-beta, que expresan Krox-20 y producen granzimas y ligando de Fas. Más particularmente estas células se seleccionan adicionalmente de forma funcional como células que no responden a la activación por reconocimiento de TCR. En realizaciones particulares adicionales, los procedimientos abarcan determinar todas las características descritas anteriormente.

Durante los últimos años se ha realizado un gran progreso en la caracterización de linfocitos T reguladores (Treg) en condiciones tanto fisiológicas como patológicas. Más particularmente, se ha analizado el potencial del uso de Treg para la terapia de algunas enfermedades. La presente invención se refiere al desarrollo de un subconjunto de nueva definición de Treg adoptivos específicos de antígeno que difiere de los Treg previamente indicados por el procedimiento usado para inducción in vitro o in vivo y por propiedades específicas. Los Treg pertenecen a dos categorías amplias, es decir Treg naturales y Treg inducidos (o adaptativos). Los Treg naturales se han descrito por primera vez en el ratón en 1995, y se definen como un subconjunto de linfocitos T CD4+ seleccionados de forma activa en el timo. Dichas células se caracterizan por la expresión de varios marcadores de superficie, incluyendo CD25 en células en reposo, GITR, CTLA-4 y LAG-3. Más recientemente, los Treg naturales se han definido adicionalmente por la falta de expresión de CD127 (IL-7R). El represor de la transcripción Foxp3 desempeña un papel determinante en la selección de Treg naturales. Las mutaciones de Foxp3 dan como resultado la ausencia de Treg naturales, con una desregulación inmunitaria ligada a X con poliendocrinopatía, enteropatía, manifestaciones atópicas e infecciones letales. Dichos Treg naturales suprimen diversos procesos inflamatorios incluyendo síndromes gastrointestinales. A nivel molecular, Foxp3 se combina con el factor de transcripción de NFAT en competición con AP1, y de este modo regula la transcripción de varias citocinas. El mecanismo de acción de Treg naturales se está sometiendo a un escrutinio intenso. In vitro, dichas células producen IL-10 y TGF-beta. In vivo, sin embargo, la neutralización de IL-10 y/o TGF-b no supera la supresión, lo que indica que están actuando otros mecanismos. In vitro, los Treg naturales suprimen una respuesta adaptativa de una manera dependiente de contacto celular. Resulta interesante que los Treg naturales expresan granzimas proteasas tales como granzima A (GZ-A) y granzima B (GZ-B). Aunque aún es controvertido, un mecanismo adicional o alternativo de acción para Treg naturales parece basarse en su capacidad para lisar células diana por exocitosis de granzimas. Los Treg deficientes en GZ-B pierden parcialmente su capacidad para suprimir la respuesta inmunitaria. Los Treg adaptativos constituyen una familia heterogénea de linfocitos T que tienen en común que son específicos de antígeno, que ejercen una actividad supresora en linfocitos T testigos y que son inducidos en la periferia. Los linfocitos Th3 se producen principalmente por administración oral de antígeno y se encuentran en ganglios linfáticos mesentéricos. Dichas células ejercen su actividad supresora produciendo altos niveles de TGF-beta con cantidades variables de IL-4 e IL

10. Los linfocitos Tr1 producen altas concentraciones de IL-10 y cantidades variantes de TGF-beta. Estos se inducen in vitro por la exposición de linfocitos T CD4+ sin tratamiento previo a altas concentraciones de IL-10 o activación combinada mediante anticuerpos anti CD3 y anti CD46. No se ha establecido la relación precisa entre linfocitos Th3 y Tr1, en ausencia de marcadores fenotípicos específicos. No solamente parece existir un solapamiento entre estos dos Treg adaptativos, sino que también se definen probablemente subconjuntos adicionales en los próximos años. Los Treg adaptativos no expresan el factor represor Foxp3. Aparte de la producción de citocinas supresoras tales como IL-10 y/o TGF-beta, se ha indicado que pueden inducirse linfocitos T CD4+CD25(-) para expresar granzimas, principalmente GZ-B, por estimulación de anticuerpos anti CD3 y anti CD46. No resulta evidente si estos Treg inducidos in vitro, no específicos, ejercen una actividad citotóxica debido a la secreción de granzimas. Los péptidos de la invención inducirán, tras su administración a un animal vivo, típicamente un ser humano, linfocitos T específicos que ejercen una actividad supresora en linfocitos T testigos. Los péptidos activan aparentemente el metabolismo oxidativo de linfocitos T tras interacción afín y reducen el enlace disulfuro restringido del segundo dominio extracelular de la molécula CD4.

Este mecanismo también implica y los resultados experimentales muestran que los péptidos de la invención, aunque comprenden un epítopo de linfocitos T específico de un cierto antígeno, pueden usarse para la prevención o el tratamiento de trastornos inducidos por una reacción inmunitaria contra otros epítopos de linfocitos T del mismo antígeno o en ciertas circunstancias incluso para el tratamiento de trastornos inducidos por una reacción inmunitaria contra otros epítopos de linfocitos T de otros antígenos diferentes si se presentaran mediante el mismo mecanismo por moléculas del MHC de clase II cerca de linfocitos T activados por péptidos de la invención.

Un aspecto particular adicional de la presente invención se refiere por lo tanto a un tipo celular, que son linfocitos T, más en particular Treg o linfocitos T supresores, caracterizado porque expresan CD4, que no expresan IL-10 o TGFbeta (mientras que otros linfocitos T adaptativos producen IL-10 y/o TGF beta), que expresan Krox-20 y producen granzimas y ligando de Fas. Más particularmente estas células se seleccionan adicionalmente de forma funcional como células que no responden a la activación mediante reconocimiento por TCR. Más particularmente, se proporcionan en el presente documento poblaciones del tipo celular Treg que tienen las características descritas en el presente documento, por el que la respuesta anérgica es específica de antígeno.

En realizaciones particulares adicionales, los linfocitos Treg de la invención se caracterizan porque tienen:

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-expresión de CD25, CD4, ICOS, CTLA-4, GITR, y no tienen expresión de CD127 (IL7-R), expresión del factor de

transcripción T-bet y egr-2 (Krox-20) pero no de Foxp3, -una expresión aumentada de marcadores incluyendo FasL y granzimas (B y C) tras su activación, -una alta producción de IFN-gamma.

En una realización particular adicional la invención proporciona un tipo celular, que son linfocitos T, más en particular Treg o linfocitos T supresores, caracterizado porque tiene:

-expresión de CD25, CD4, ICOS, CTLA-4, GITR y no tiene expresión de CD127 (IL7-R), expresión del factor de

Más particularmente los linfocitos Treg o poblaciones celulares de la invención se caracterizan por que tienen:

-una expresión aumentada de marcadores de superficie incluyendo CD103, CTLA-4, FasL e ICOS tras su

activación, -alta expresión de CD25, mientras que otros linfocitos T adaptativos son CD25 negativos, expresión de CD4,

ICOS, CTLA-4, GITR y expresión baja o nula de CD127 (IL7-R), -expresión del factor de transcripción T-bet y egr-2 (Krox-20) pero no del represor de la transcripción Foxp3,

mientras que otros linfocitos T adaptativos son Foxp3 positivos, -una alta producción de IFN-gamma y ninguna cantidad o solamente cantidades traza de IL-10, IL-4, IL-5, IL-13 o

TGF-beta, -una expresión aumentada de marcadores incluyendo FasL y granzimas (B y C) tras su activación.

Más particularmente, la presente invención proporciona poblaciones de células aisladas del tipo celular que tiene las características descritas anteriormente, que, además, son específicas de antígeno, es decir, capaces de suprimir una respuesta inmunitaria específica de antígeno. En consecuencia, la presente invención proporciona linfocitos Treg específicos de antígeno aislados, caracterizados como se ha descrito anteriormente. Más particularmente la presente invención proporciona linfocitos Treg específicos de antígeno distintos de los inducidos por Der p 2.

Los péptidos de acuerdo con la invención, también pueden usarse en procedimientos de terapia génica bien conocidos en la técnica y la terminología usada en el presente documento que explica el uso de péptidos de acuerdo con la invención también incluye el uso de ácidos nucleicos que codifican o expresan péptidos inmunogénicos de acuerdo con la invención.

En consecuencia, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican los péptidos de la presente invención y procedimientos para su uso.

Dentro del contexto de la presente invención se prevén diferentes procedimientos para conseguir, por medio de terapia génica, niveles de péptidos, homólogos o derivados de los mismos de acuerdo con la invención en un mamífero in vivo.

Pueden usarse moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican secuencias de proteínas como ADN desnudo o en liposomas u otros sistemas lipídicos para el suministro a células diana. Los expertos en la materia conocen bien otros procedimientos para la transferencia directa de ADN plasmídico a células para su uso en terapia génica humana e implican la dirección del ADN a receptores en células formando complejo del ADN plasmídico con proteínas. En su forma más sencilla, la transferencia génica puede realizarse simplemente inyectando cantidades mínimas de ADN al núcleo de una célula, mediante un proceso de microinyección. Una vez que se han introducido genes recombinantes en una célula, estos pueden ser reconocidos por los mecanismos normales de las células para transcripción y traducción, y se expresará un producto génico. También se han intentado otros procedimientos para introducir ADN en mayores números de células. Estos procedimientos incluyen: transfección, en la que se precipita el ADN con fosfato cálcico y se capta en células por pinocitosis; electroporación, en la que se exponen células a pulsos de alta tensión para introducir agujeros en la membrana); lipofección/fusión de liposomas, en la que se empaqueta ADN en vesículas lipófilas que se fusionan con una célula diana; y bombardeo de partículas usando ADN unido a proyectiles pequeños. Otro procedimiento para introducir ADN en células es acoplar el ADN a proteínas modificadas químicamente. Las proteínas de adenovirus son capaces de desestabilizar endosomas y potenciar la captación de ADN en células. La mezcla de adenovirus con soluciones que contienen ADN completa, o la unión de ADN con polilisina unida covalentemente a adenovirus usando agentes de reticulación de proteínas mejora sustancialmente la captación y expresión del gen recombinante. También pueden usarse vectores de virus adenoasociados para el suministro génico a células vasculares. Como se usa en el presente documento, “transferencia génica” significa el proceso de introducir una molécula de ácido nucleico ajena en una célula, que se realiza habitualmente para permitir la expresión de un producto particular codificado por el gen. Dicho producto puede incluir una proteína, un polipéptido, ADN o ARN antisentido o ARN enzimáticamente activo. Puede realizarse transferencia génica en células cultivadas o mediante administración directa a mamíferos.

En otra realización, se proporciona un vector que comprende una secuencia de molécula de ácido nucleico que codifica un péptido de acuerdo con la invención. En realizaciones particulares, el vector se genera de modo que la

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transporte o manipulación sin alterar su eficacia. Estos incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos (por ejemplo fenol, ácido sórbico, clorobutanol), agentes isotónicos (tales como azúcares o cloruro sódico) y similares. Pueden incluirse ingredientes adicionales para controlar la duración de acción del principio activo del anticuerpo monoclonal en la composición. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser un sólido o un líquido o un gas que se ha comprimido para formar un líquido, es decir las composiciones de la presente invención pueden usarse convenientemente como concentrados, emulsiones, soluciones, granulados, polvos finos, pulverizaciones, aerosoles, suspensiones, pomadas, cremas, comprimidos, microgránulos o polvos. Los expertos en la materia conocen bien vehículos farmacéuticos adecuados para su uso en dichas composiciones farmacéuticas y su formulación, y no hay ninguna restricción particular para su selección dentro de la presente invención. También pueden incluir aditivos tales como agentes humectantes, agentes de dispersión, adherentes, adhesivos, agentes emulsionantes, disolventes, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos (por ejemplo fenol, ácido sórbico, clorobutanol), agentes isotónicos (tales como azúcares o cloruro sódico) y similares, siempre que estos sean coherentes con la práctica farmacéutica, es decir vehículos y aditivos que no creen daño permanente a los mamíferos. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden prepararse de cualquier manera conocida, por ejemplo mezclando de forma homogénea, revistiendo y/o moliendo los principios activos, en un procedimiento de una etapa o multietapa, con el material vehículo seleccionado y, cuando sea apropiado, los otros aditivos tales como agentes tensioactivos. También pueden prepararse por micronización, por ejemplo para obtenerlos en forma de microesferas que tengan habitualmente un diámetro de aproximadamente 1 a 10 μm, concretamente para la fabricación de microcápsulas para liberación controlada o sostenida de los principios activos.

Son agentes tensioactivos adecuados, también conocidos como emulgentes o emulsionantes, para usar en las composiciones farmacéuticas de la presente invención materiales no iónicos, catiónicos y/o aniónicos que tengan buenas propiedades emulsionantes, de dispersión y/o humectantes. Los tensioactivos aniónicos adecuados incluyen jabones solubles en agua y agentes tensioactivos sintéticos solubles en agua. Son jabones adecuados sales de metales alcalinos o alcalinotérreos, sales de amonio no sustituidas o sustituidas de ácidos grasos superiores (C10-C22), por ejemplo las sales de sodio o potasio de ácido oleico o esteárico, o de mezclas de ácidos grasos naturales que pueden obtenerse de aceite de coco o aceite de sebo. Los tensioactivos sintéticos incluyen sales de sodio o calcio de ácidos poliacrílicos; sulfonatos y sulfatos grasos; derivados de bencimidazol sulfonado y alquilarilsulfonatos. Los sulfonatos o sulfatos grasos están habitualmente en forma de sales de metales alcalinos o alcalinotérreos, sales de amonio no sustituidas o sales de amonio sustituidas con un radical de alquilo o acilo que tiene de 8 a 22 átomos de carbono, por ejemplo la sal de sodio o calcio de ácido lignosulfónico o ácido dodecilsulfónico o una mezcla de sulfatos de alcohol graso obtenidos de ácidos grasos naturales, sales de metales alcalinos o alcalinotérreos de ésteres de ácido sulfúrico o sulfónico (tales como lauril sulfato sódico) y ácidos sulfónicos de aductos de óxido de etileno/alcohol graso. Los derivados de bencimidazol sulfonado adecuados típicamente contienen de 8 a 22 átomos de carbono. Son ejemplos de alquilarilsulfonatos las sales de sodio, calcio o alcanolamina de ácido dodecilbencenosulfónico o ácido dibutilnaftalenosulfónico o un producto de condensación de ácido naftaleno sulfónico/formaldehído. También son adecuados los fosfatos correspondientes, por ejemplo sales de éster de ácido fosfórico y un aducto de p-nonilfenol con óxido de etileno y/o propileno, o fosfolípidos. Son fosfolípidos adecuados para este fin los fosfolípidos naturales (que se originan de células animales o vegetales) o sintéticos del tipo cefalina o lecitina tales como por ejemplo fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerina, lisolecitina, cardiolipina, dioctanilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina y sus mezclas.

Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen derivados polietoxilados y polipropoxilados de alquilfenoles, alcoholes grasos, ácidos grasos, aminas o amidas alifáticas que contienen al menos 12 átomos de carbono en la molécula, alquilarensulfonatos y dialquilsulfosuccinatos, tales como derivados de poliglicoléter de alcoholes alifáticos y cicloalifáticos, ácidos grasos saturados e insaturados y alquilfenoles, conteniendo dichos derivados típicamente de 3 a 10 grupos de glicol éter y de 8 a 20 átomos de carbono en el resto de hidrocarburo (alifático) y de 6 a 18 átomos de carbono en el resto de alquilo del alquilfenol. Son tensioactivos no iónicos adecuados adicionales aductos solubles en agua de óxido de polietileno con polipropilenglicol, etilendiaminopolipropilenglicol que contiene de 1 a 10 átomos de carbono en la cadena de alquilo, cuyos aductos contienen de 20 a 250 grupos de etilenglicoléter y/o de 10 a 100 grupos de propilenglicoléter. Dichos compuestos contienen habitualmente de 1 a 5 unidades de etilenglicol por unidad de propilenglicol. Son ejemplos representativos de tensioactivos no iónicos nonilfenol-polietoxietanol, éteres poliglicólicos de aceite de ricino, aductos de óxido de polipropileno/polietileno, tributilfenoxipolietoxietanol, polietilenglicol y octilfenoxipolietoxietanol. Los ésteres de ácidos grasos de polietilensorbitán (tales como polioxietilensorbitán trioleato), glicerol, sorbitán, sacarosa y pentaeritritol también son tensioactivos no iónicos adecuados. Los tensioactivos catiónicos adecuados incluyen sales de amonio cuaternario, particularmente haluros, que tienen 4 radicales de hidrocarburo opcionalmente sustituidos con halo, fenilo, fenilo sustituido o hidroxi; por ejemplo sales de amonio cuaternario que contienen como sustituyente N al menos un radical de alquilo C8C22 (por ejemplo cetilo, laurilo, palmitilo, miristilo, oleílo y similares) y, como sustituyentes adicionales, alquilo inferior no sustituido o halogenado, bencilo y/o radicales de hidroxialquilo inferior.

Puede encontrarse una descripción más detallada de agentes tensioactivos adecuados para este fin por ejemplo en “McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers Annual” (MC Publishing Crop., Ridgewood, Nueva Jersey, 1981), “Tensid-Taschenbucw’, 2ª ed. (Hanser Verlag, Viena, 1981) y “Encyclopaedia of Surfactants, (Chemical Publishing Co., Nueva York, 1981). Pueden administrarse péptidos, homólogos o derivados de los mismos de acuerdo con la

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invención (y sus sales o composiciones farmacéuticas fisiológicamente aceptables todas incluidas en la expresión “principios activos”) mediante cualquier vía apropiada para la afección para tratar y apropiada para los compuestos, aquí las proteínas y fragmentos para administrar. Las vías posibles incluyen regional, sistémica, oral (forma sólida o de inhalación), rectal, nasal, tópica (incluyendo ocular, bucal y sublingual), vaginal y parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intraarterial, intratecal y epidural). La vía preferida de administración puede variar según por ejemplo la afección del receptor o las enfermedades para tratar. Como se describe en el presente documento, el vehículo o los vehículos son óptimamente “aceptables” en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no deletéreos para el receptor de los mismos. Las formulaciones incluyen las adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intraarterial, intratecal y epidural). Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Dichos procedimientos incluyen la etapa de poner en asociación el principio activo con el vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general las formulaciones se preparan poniendo de forma uniforme e íntimamente en asociación el principio activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es necesario, moldeando el producto. Las formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, obleas o comprimidos que contienen cada una una cantidad predeterminada del principio activo; como un polvo o gránulos; como solución o una suspensión en un líquido acuoso o un líquido no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite. El principio activo también puede presentarse como una embolada, un electuario o una pasta. Puede prepararse un comprimido por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes adyuvantes. Pueden prepararse comprimidos en forma comprimida comprimiendo en una máquina adecuada el principio activo en una forma que fluye libremente tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, tensioactivo o agente dispersante. Pueden prepararse comprimidos moldeados moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecida con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden estar opcionalmente revestidos o ranurados y pueden formularse de modo que proporcionen liberación lenta o controlada del principio activo en los mismos.

Para tratamientos locales por ejemplo en la piel, tal como de la articulación, las formulaciones se aplican opcionalmente como una pomada tópica o crema que contiene el principio o los principios activos en una cantidad de, por ejemplo, 0,075 a 20 % p/p (incluyendo principio o principios activos en un intervalo entre 0,1 % y 20 % en incrementos de 0,1 % p/p tales como 0,6 % p/p, 0,7 % p/p, etc.), particularmente de 0,2 a 15 % p/p y más particularmente de 0,5 a 10 % p/p. Cuando se formulan en una pomada, los principios activos pueden emplearse con una base de pomada parafínica o una miscible en agua. Como alternativa, los principios activos pueden formularse en una crema con una base de crema de aceite en agua. Si se desea, la fase acuosa de la base de crema puede incluir, por ejemplo, al menos 30 % p/p de un alcohol polihídrico, es decir un alcohol que tiene dos o más grupos hidroxilo tales como propilenglicol, butano 1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol y polietilenglicol (incluyendo PEG400) y mezclas de los mismos. Las formulaciones tópicas pueden incluir convenientemente un compuesto que potencie la absorción o penetración del principio activo a través de la piel u otras áreas afectadas. Los ejemplos de dichos potenciadores de la penetración dérmica incluyen dimetilsulfóxido y análogos relacionados. La fase oleosa de las emulsiones de la presente invención puede constituirse a partir de ingredientes conocidos de una manera conocida. Aunque la fase puede comprender únicamente un emulsionante (conocido de otro modo como un emulgente), convenientemente comprende una mezcla de al menos un emulsionante con una grasa o un aceite o tanto con una grasa como con un aceite. Opcionalmente, se incluye un emulsionante hidrófilo junto con un emulsionante lipófilo que actúa como un estabilizador, típicamente incluyendo tanto un aceite como una grasa. Juntos, el emulsionante o emulsionantes con o sin estabilizador o estabilizadores componen la denominada cera emulsionante, y la cera junto con el aceite y la grasa componen la denominada base de pomada emulsionante que forma la fase dispersada oleosa de las formulaciones de crema.

La elección de aceites o grasas adecuados para la formulación se basa en la consecución de las propiedades cosméticas deseadas, ya que la solubilidad del compuesto activo en la mayoría de aceites probablemente usado en formulaciones de emulsiones farmacéuticas es muy baja. Por lo tanto la crema debería opcionalmente ser un producto no graso, que no manche y lavable con consistencia adecuada para evitar la fuga de tubos u otros recipientes. Pueden usarse alquilésteres mono o dibásicos de cadena sencilla o ramificada tales como diisoadipato, isocetil estearato, diéster de propilenglicol de ácidos grasos de coco, isopropil miristato, decil oleato, isopropil palmitato y particularmente butil estearato, 2-etilhexil palmitato o una mezcla de ésteres de cadena ramificada conocidos como Crodamol CAP. Estos pueden usarse solos o en combinación dependiendo de las propiedades requeridas. Como alternativa, pueden usarse lípidos de alto punto de fusión tales como parafina blanda blanca y/o parafina líquida u otros aceites minerales. Las formulaciones adecuadas para administración tópica al ojo también incluyen colirios en los que el principio activo se disuelve o suspende en un vehículo adecuado, especialmente un disolvente acuoso para el principio activo. El principio activo está opcionalmente presente en dichas formulaciones en una concentración de 0,5 a 20 %, provechosamente de 0,5 a 10 % particularmente aproximadamente de 1,5 % p/p. Las formulaciones adecuadas para administración tópica en la boca incluyen pastillas para chupar que comprenden el principio activo en una base aromatizada, habitualmente sacarosa y goma arábiga o de tragacanto; pastillas que comprenden el principio activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga; y colutorios que comprenden el principio activo en un vehículo líquido adecuado. Las formulaciones para

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administración rectal pueden presentarse como un supositorio con una base adecuada que comprende por ejemplo manteca de cacao o un salicilato. Las formulaciones adecuadas para administración nasal en las que el vehículo es un sólido incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula por ejemplo en el intervalo de 20 a 500 micrómetros (incluyendo tamaños de partículas en un intervalo entre 20 y 500 micrómetros en incrementos de 5 micrómetros tales como 30 micrómetros, 35 micrómetros, etc.), que se administra de la misma manera en que se toma el rapé, es decir mediante inhalación rápida a través del orificio nasal de un recipiente del polvo mantenido cerca de la nariz. Las formulaciones adecuadas en las que el vehículo es un líquido, para administración como, por ejemplo, una pulverización nasal o como gotas nasales, incluyen soluciones acuosas u oleosas del principio activo. Pueden prepararse formulaciones adecuadas para administración oral de acuerdo con procedimientos convencionales y pueden suministrarse con otros agentes terapéuticos. Las formulaciones adecuadas para administración vaginal pueden presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en pulverización que contienen además del principio activo vehículos tales como los que se conocen en la técnica que son apropiados. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estéril acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacterioestáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del receptor pretendido; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo ampollas selladas y viales, y pueden almacenarse en una condición liofilizada (criodesecada) que requiere solamente la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse soluciones y suspensiones de inyección extemporánea a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo previamente descrito.

Son formulaciones de dosificación unitaria típicas las que contienen una dosis diaria o subdosis diaria unitaria, como se ha indicado anteriormente en el presente documento, o una fracción apropiada de las mismas, de un principio activo. Debería entenderse que además de los ingredientes particularmente mencionados anteriormente las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica teniendo en cuenta el tipo de formulación en cuestión, por ejemplo las adecuadas para administración oral pueden incluir agentes saporíferos. Pueden usarse péptidos, homólogos o derivados de los mismos de acuerdo con la invención para proporcionar formulaciones farmacéuticas de liberación controlada que contienen como principio activo uno o más compuestos de la invención (“formulaciones de liberación controlada”) en los que la liberación del principio activo puede controlarse y regularse para permitir dosificación de menor frecuencia o para mejorar el perfil de farmacocinética o toxicidad de un compuesto dado de la invención. Pueden prepararse formulaciones de liberación controlada adaptadas para administración oral en las que unidades discretas comprenden uno o más compuestos de la invención de acuerdo con procedimientos convencionales. Pueden incluirse ingredientes adicionales para controlar la duración de acción del principio activo en la composición. Pueden conseguirse de este modo composiciones de liberación controlada seleccionando vehículos poliméricos apropiados tales como por ejemplo poliésteres, poliaminoácidos, polivinilpirrolidona, copolímeros de etileno-vinilacetato, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, sulfato de protamina y similares. La tasa de liberación de fármaco y duración de acción también pueden controlarse incorporando el principio activo en partículas, por ejemplo microcápsulas, de una sustancia polimérica tal como hidrogeles, ácido poliláctico, hidroximetilcelulosa, polimetil metacrilato y los otros polímeros anteriormente descritos. Dichos procedimientos incluyen sistemas de suministro de fármacos coloidales como liposomas, microesferas, microemulsiones, nanopartículas, nanocápsulas y así sucesivamente. Dependiendo de la vía de administración, la composición farmacéutica puede requerir revestimientos protectores. Las formas farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de las mismas. Los vehículos típicos para este fin incluyen por lo tanto tampones acuosos biocompatibles, etanol, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares y mezclas de los mismos. A la vista del hecho de que, cuando se usan varios principios activos en combinación, no aportan necesariamente su efecto terapéutico conjunto directamente en el mismo momento en el mamífero para tratar, la composición correspondiente también puede estar en forma de un kit o envase médico que contenga los dos ingredientes en depósitos o compartimentos separados pero adyacentes. En este último contexto, cada principio activo puede formularse por lo tanto de una manera adecuada para una vía de administración diferente de la del otro ingrediente, por ejemplo uno de ellos puede estar en forma de una formulación oral o parenteral mientras que el otro está en forma de una ampolla para inyección intravenosa o un aerosol.

La parte experimental de la presente invención muestra un subconjunto de linfocitos T específicos de antígeno, inducidos in vivo y fáciles de expandir con propiedades reguladoras. Estos últimos incluyen: (1) inducción de apoptosis de APC después de activación afín dependiente del MHC de clase II, que afecta tanto a células dendríticas como a linfocitos B, y demostrada in vitro e in vivo, y; (2) supresión de linfocitos T testigos por mecanismo dependiente de contacto en ausencia de IL-10 y/o TGF-β. La presente invención desvela además procedimientos para distinguir Treg citolíticos inducidos de Treg tanto naturales como adaptativos. Basándose en la caracterización de 15 clones, el fenotipo de superficie se define como CD25hi, CTLA-4hi, GITR+ e ICOS+, pero CD127(-). Dichos clones expresan bajos niveles de CD62L y CD103 pero no CCR7. La producción de citocinas se limitó a IFN-gamma, sin TGF-beta o IL-10. Todos los clones fueron Foxp3(-) pero fuertemente positivos para T-bet y Egr-2, junto con altos niveles de transcrito para la granzima B. Los Treg naturales se definen por la expresión de Foxp3 y ausencia de CD127, producen altos niveles de IL-10, al menos in vitro, y son específicos para autoantígenos. Entre los numerosos linfocitos T adaptativos descritos hasta la fecha, la mayoría comparten la producción de IL-10 (y TGF-beta en algunos casos tales como en linfocitos Th3) y son Foxp3 y CD25 negativos. Es

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central para Treg citolíticos la fuerte expresión de T-bet. T-bet se induce por IFN-γ mediante una ruta dependiente de STAT1 y ejerce diferentes actividades, incluyendo supresión de la transcripción de IL-2, inducción de transcripción de granzima y es un factor de maduración para diferenciación de Th1.

No se descubrió ningún transcrito para IL-2 en los clones de linfocitos T de la presente invención y resulta interesante que IL-2 exógena no restauró la transcripción de IL-2, incluso después de ciclos de estimulación repetidos in vitro. Esto sugiere que los Treg citolíticos han experimentado una alteración epigenética, que mantendría su actividad reguladora tanto in vitro como in vivo. Aunque se requiere T-bet para la maduración del subconjunto de Th1, su expresión no clasifica necesariamente las células como pertenecientes a dicho linaje. La inducción de granzima B por T-bet se ha observado con linfocitos T citolíticos CD8+. Los Treg descritos en el presente documento son anérgicos en el sentido de que fueron incapaces de proliferar y/o producir IL-2 tras reticulación de su antígeno receptor. Resulta interesante que este estado anérgico podría superarse por la adición de IL-2. Se observó una alta expresión del factor de transcripción Egr-2 (Krox-20), que regula positivamente inhibidores del ciclo celular tales como p21cip1 y p27kip. Se sabe que IL-2 puede invalidar la supresión mediada por Egr-2, posiblemente mediante activación de NF-κB. Esta última regula positivamente la transcripción de granzima, lo que podría actuar de forma sinérgica con T-bet para la producción de granzima. Se debería ser consciente de que las propiedades reguladoras no se pierden cuando las células se estimulan mediante la adición de IL-2. En una realización particular, esta es una propiedad de los Treg citolíticos presentes, un subconjunto de células aparentemente estable que ejerce su actividad reguladora sobre la activación dependiente de IL-2. La inducción de la apoptosis es el mecanismo en la base de la actividad reguladora. Esto se demostró tanto al nivel de APC como al nivel de linfocitos T testigos por mostrar activación de caspasa 3 y/o unión de anexina V. Se ha mostrado que las dos rutas principales que conducen a la apoptosis se activaron en Treg citolíticos. Se indujo producción tanto de GrB como de perforina por la activación de Treg, con transcripción aumentada para GrB pero no granzima A. GrB, a diferencia de GrA, induce la apoptosis por al menos dos mecanismos, concretamente activación directa e indirecta de procaspasa 3, esta última mediante la liberación de citocromo C por mitocondrias y activación de caspasa 9. Los inhibidores específicos de GrB mostraron reducción significativa de la inducción de apoptosis, y solamente a concentraciones cercanas a la citotoxicidad celular. Es dudoso que se requiera perforina para dicha actividad, ya que EGTA no bloqueó la apoptosis en ningún grado significativo. La segunda ruta por la que puede inducirse apoptosis es la ruta de Fas-FasL. Resulta interesante que FasL está presente en gránulos de exocitosis junto con granzimas, y se ancla a la membrana tras la activación celular, que constituye la principal ruta para expresión de FasL en linfocitos T. FasL señaliza a través de Fas lo que conduce a activación de caspasa 8, con una activación corriente abajo de caspasa 3 y caspasa 9 a través de liberación mitocondrial del citocromo C, actuando de este modo de forma sinérgica con GrB. Se obtuvo inhibición parcial de la apoptosis usando un anticuerpo específico de FasL. La participación relativa de las rutas de GrB y FasL está dictada por el grado de expresión de FasL. Por lo tanto, las células Wehi, que tienen una expresión constitutiva alta de Fas, se lisan fácilmente por Treg, en comparación por ejemplo con células dendríticas. No se ha establecido completamente si la acción combinada de GrB y FasL explica toda la actividad citolítica, ya que experimentos preliminares han mostrado que la combinación de los dos inhibidores no anuló la apoptosis de células diana. Se sabe que algunos Treg secretan Granzimas. Por lo tanto, la granzima B está implicada en el mecanismo por el que los Treg naturales controlan respuestas inmunitarias, tanto en ser humano como en el ratón. Los ratones GrB KO tienen un defecto de regulación. Es, sin embargo, difícil establecer en qué medida los Treg inducidos usan granzimas para ejercer su actividad reguladora. Un informe muestra que una proporción de Treg de tipo Tr1 activados por anticuerpos anti CD3 y anti CD46 expresan GrB. Una dificultad aún no resuelta con las granzimas es la falta de inhibidores específicos y eficaces. Los inhibidores químicos o peptídicos, tales como los usados en la presente invención (Ejemplo 11), requerían altas concentraciones para estar activos. El uso de la ruta de Fas-FasL no se ha indicado previamente en Treg adaptativos, y muy pocos datos indican que los Treg CD4+CD25+ podrían usar también Fas-L como mecanismo. Es notable que la inducción de apoptosis se observa con células dendríticas y con linfocitos B, lo que sugiere que pueden regularse las respuestas inmunitarias tanto primaria como secundaria. Además, los Treg que reconocen un único epítopo de linfocitos T de antígenos incluso complejos tienen la capacidad de suprimir la respuesta a la proteína completa eliminando la célula presentadora de antígenos. Esto se ilustra bien por los datos in vivo, en los que la respuesta hacia un alérgeno completo, Der p 2, se suprime después de la transferencia adoptiva de un único clon de Treg. Este efecto es reforzado por la supresión de linfocitos T testigos incluso cuando estos últimos se activan mediante interacción con una APC diferente, siempre que el contacto celular sea posible entre Treg y linfocitos T efectores. Resulta interesante que los Treg pueden regular linfocitos T efectores en diversos estadios de maduración, Th0, Th1 o Th2. Resulta importante que los Treg citolíticos inducen apoptosis en células diana y no en necrosis. La APC apoptótica puede desempeñar un papel en la supresión. Se ha demostrado de hecho que las células apoptóticas captadas por células presentadoras de antígenos inducen tolerancia, mientras que las células necróticas inducen más bien inflamación. In vivo, la supresión casi completa de inflamación dentro de los pulmones debería considerarse ciertamente una señal de apoptosis de células diana en lugar de necrosis. Un aspecto de la presente invención es la demostración de que también se produce apoptosis de linfocitos B in vivo. Por lo tanto, los ratones a los que se ha transferido de forma adoptiva linfocitos B transgénicos que expresan p21-35 seguido de Treg citolíticos de especificidad correspondiente muestran desaparición completa de linfocitos B, como se detecta en el bazo. Es poco probable que los linfocitos B transgénicos hayan migrado a otros sitios. No se ha descubierto ninguna prueba de dichas células en pulmones o en el hígado. Las propiedades funcionales de células transgénicas p21-35 son idénticas a las de linfocitos B incubados con el péptido en un ensayo de carga convencional. Se ha mostrado aquí que se induce la apoptosis de linfocitos B transgénicos in vitro mediante cocultivo con Treg citolíticos, lo que indica

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Se inmunizaron grupos de ratones BALB/c por vía subcutánea (20 μg) con el péptido experimental [SEQ ID NO: 10]

o el péptido de control [SEQ ID NO: 11] adsorbido en hidróxido de aluminio. Se realizaron tres inyecciones a intervalos de 2 semanas. Diez días después de la última inmunización, se sacrificaron los ratones y se prepararon linfocitos T CD4+ del bazo usando perlas magnéticas. Después se estimularon linfocitos T CD4+ (2x106 células) in vitro por el epítopo de linfocitos T Der p 1 (20 μg) presentado por células del bazo adherentes que actúan como células presentadoras de antígenos.

Diez días después de la estimulación se calculó el número de líneas de linfocitos T específicas obtenidas en cada grupo por análisis de dilución limitante. Cada línea celular se evaluó por su capacidad para lisar células WEHI, una línea de linfocitos B seleccionada por su eficacia en la presentación de antígenos por determinantes del MHC de clase II, como se describe en el Ejemplo 6. Solamente células obtenidas de animales inmunizados con el péptido que contenía la secuencia consenso de glutarredoxina habían adquirido la capacidad para lisar células WEHI, y la lisis se produce solamente en presencia del epítopo de linfocitos T Der p 1 afín.

La Figura 10 muestra que podrían obtenerse clones de linfocitos T con propiedades de Treg solamente de ratones que recibieron la construcción hecha del epítopo de Der p 1 ligado a un motivo redox de tipo glutarredoxina y gp75, pero no de ratones que recibieron el péptido de control. Todos los clones de linfocitos T obtenidos después del tratamiento con la construcción y reestimulados in vitro fueron citotóxicos.

Ejemplo 10: Uso de un epítopo de linfocitos T dominante de proteína MOG en un modelo in vivo paraesclerosis múltiple

Puede inducirse esclerosis múltiple en modelos experimentales por inmunización con el péptido de Glucoproteína de Oligodendrocitos de Mielina (MOG) VGWYRSPFSRVVHLYR [SEQ ID. NO: 12], que corresponde a los restos de aminoácidos 37-52 de la proteína MOG. Este péptido contiene un epítopo de linfocitos T dominante. La posición P1, es decir el primer aminoácido anclado en el surco del MHC de clase II es Y40 (la secuencia P1-P9 está subrayada). Los 3 aminoácidos del extremo amino terminal del péptido se reemplazan por la secuencia CGPS [SEQ ID. NO: 13], que corresponde a la secuencia de tiorredoxina humana, los restos 21 a 24, dando como resultado el péptido CGPSYRSPFSRWHLYR [SEQ ID. NO: 14]. El péptido experimental [SEQ ID. NO: 14] y el péptido de control [SEQ ID. NO: 12] se unen por la secuencia enlazadora SGGSGGSGG [SEQ ID. NO: 8] en el extremo amino terminal de la secuencia VSVSAVTLGLGLIIFSLGVIS WRRAGHSSYTPLPGSNYSEGWHIS [SEQ ID. NO: 15] correspondiente al dominio transmembrana y la cola citosólica de la proteína HLA-DMβ, para dirigir el epítopo de linfocitos T al endosoma tardío (el motivo de péptido basado en tirosina está subrayado). Las secuencias del péptido diana son: VSVSAVTLGLGLIIFSLGVISWRRAGHSSYTPLPGSNYSEGWHIS SGGSGGSGG CGPS YRSPFSRWHLYR [SEQ ID. NO: 16] y

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Se transfiere a un grupo de ratones C57BL/6 de forma adoptiva un clon de linfocito T efector específico de MOG CD4+ siguiendo un protocolo que se pretende que induzca un síndrome de esclerosis múltiple. Esto implica la administración del péptido de MOG en adyuvante completo de Freund y 2 inyecciones de toxina de Pertussis. Este protocolo induce una expansión del clon de linfocito T efector, que da como resultado el desarrollo de señales compatibles con esclerosis múltiple en un periodo de 12 días después de la administración de péptido de MOG. Se transfiere de forma adoptiva a un segundo grupo de ratones C57BL/6 un clon de linfocito T regulador específico de MOG (obtenido usando los péptidos [SEQ ID NO: 16 y 17] descritos anteriormente), seguido después de 1 día del protocolo completo de inducción de enfermedad. Se observa que la puntuación clínica desarrollada por ratones pretratados con un clon de linfocito T citolítico se reduce significativamente en comparación con ratones que reciben solamente el clon de linfocito T efector.

Procedimientos y materiales

Ratones. Se obtuvieron ratones BALB/c de seis a ocho semanas de edad de instalaciones internas. Los estudios in vivo fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Leuven.

Reactivos. Se sintetizaron péptidos derivados de alérgeno de Dermatophagoides pteronyssinus grupo 2 (Der p 2) Der p 1 y toxoides de tétanos (pureza, >85 %). Las secuencias son: p21-35, CHGSEPCIIHRGKPF [SEQ ID. NO: 2]; p114-128 (aminoácidos 114-128 de Der p 1), SNYCQIYPPNANKIR [SEQ ID. NO: 5]; p830 (aminoácidos 830-844 del toxoide del tétanos), QYIKANSKFIGITEL [SEQ ID. NO: 18]; mp21-35 QYIKANSKFIGITELGGCHGSEPCIIHRGKPF [SEQ ID. NO: 19]; mp21-35Asn QYIKANSKFIGITELGGCHGSEPCNIHRGKPF [SEQ ID. NO: 20]. Se produjo Der p 2 de longitud completa recombinante en Pichia pastoris.

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