ES2599103T3 - Producción de anticuerpos anti-beta-amiloide - Google Patents

Producción de anticuerpos anti-beta-amiloide Download PDF

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Yen-Tung Luan
James R. Mercer
Wenge Wang
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Abstract

Un procedimiento para producir un anticuerpo contra un fragmento Aß de la proteína precursora de amiloide en un cultivo celular de producción a gran escala que comprende las etapas de: proporcionar un cultivo celular que comprende; células de mamífero que contienen un gen que codifica el anticuerpo, cuyo gen se expresa en una condición de cultivo celular; y un medio que contiene glutamina y que tiene un medio característico seleccionado del grupo que consiste en: (i) una cantidad acumulada de aminoácidos por unidad de volumen mayor de aproximadamente 70 mM, (ii) una relación molar de glutamina acumulada con respecto a asparagina acumulada de menos de aproximadamente 2, (iii) una relación molar de glutamina acumulada con respecto a los aminoácidos totales acumulados de menos de aproximadamente 0,2, (iv) una relación molar de iones inorgánicos acumulados con respecto a los aminoácidos totales acumulados entre aproximadamente 0,4 a 1, (v) una cantidad acumulada de glutamina y asparagina combinadas por unidad de volumen mayor de aproximadamente 16 mM, y combinaciones de las mismas; mantener dicho cultivo en una fase de crecimiento inicial con un primer grupo de condiciones de cultivo durante un primer periodo de tiempo suficiente para permitir que dichas células se reproduzcan hasta una densidad celular viable en el intervalo de aproximadamente un 20 %-80 % de la densidad celular viable máxima posible si dicho cultivo se mantuviera en el primer grupo de condiciones de cultivo; cambiar al menos una de las condiciones del cultivo, de manera que se aplique un segundo grupo de condiciones de cultivo y se produzca un cambio metabólico en el cultivo, en el que dicho cambio metabólico se caracteriza por una reducción en la relación de una tasa específica de producción de lactato con respecto a la tasa específica de consumo de glucosa; mantener dicho cultivo durante un segundo periodo de tiempo con el segundo grupo de condiciones y durante un segundo periodo de tiempo de forma que se acumula el anticuerpo en el cultivo celular.

Description

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Produccion de anticuerpos anti-beta-amiloide Antecedentes de la invencion
Las protemas y polipeptidos se han vuelto cada vez mas importantes como agentes terapeuticos. En la mayona de los casos, las protemas y polipeptidos terapeuticos se producen en cultivos celulares, a partir de celulas que se han modificado y/o seleccionado para producir niveles extraordinariamente altos de la protema o polipeptido particular de interes. El control y optimizacion de las condiciones del cultivo celular es cnticamente importante para la produccion comercial satisfactoria de protemas y polipeptidos.
Muchas protemas y polipeptidos que se producen en cultivos celulares se fabrican en un proceso discontinuo o semi-continuo, en el que las celulas se cultivan durante un periodo de tiempo, y luego se termina el cultivo y se afsla la protema o polipeptido que se ha producido. La cantidad y calidad final de la protema o polipeptido que se produce pueden estar afectadas drasticamente por las condiciones del cultivo celular. Por ejemplo, los procesos de cultivo discontinuo o semi-continuo a menudo dan como resultado la produccion de productos metabolicos de desecho que tienen efectos perjudiciales sobre el crecimiento celular, viabilidad, y produccion o estabilidad de la protema o el polipeptido de interes. Aunque se han hecho esfuerzos para mejorar la produccion de protemas y polipeptidos en procesos de cultivo discontinuo o semi-continuo, sigue existiendo la necesidad de mejoras adicionales.
Adicionalmente, se ha dedicado un significativo esfuerzo al desarrollo de medios definidos (es decir, medios compuestos por componentes individuales conocidos y que carecen de suero u otros subproductos animales) para su uso en el cultivo de celulas, particularmente celulas de mairnfero. Las caractensticas del crecimiento celular pueden ser muy diferentes en medios definidos en comparacion con los derivados de medios con suero. Existe la necesidad particular de desarrollar sistemas mejorados para producir protemas y polipeptidos mediante cultivo celular en medios definidos.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona un sistema mejorado para la produccion de protemas y/o polipeptidos a gran escala en un cultivo celular. Por ejemplo, la presente invencion proporciona procedimientos de cultivo a escala comercial (por ejemplo, 500 l o mas) que utilizan un medio que se caracteriza por uno o mas de: i) una cantidad de aminoacidos acumulada por unidad de volumen mayor de aproximadamente 70 mM; ii) una relacion molar de glutamina acumulada respecto a asparagina acumulada menor de aproximadamente 2; iii) una relacion molar de glutamina acumulada con respecto a los aminoacidos totales acumulados menor de aproximadamente 0,2; iv) una relacion molar de iones inorganicos acumulados respecto a los aminoacidos totales acumulados entre aproximadamente 0,4 a 1; o v) una concentracion por unidad de volumen de la cantidad acumulada de glutamina y asparagina mayor de aproximadamente 16 mM. Un experto en la tecnica entendera que “acumulada”, como se ha utilizado anteriormente, se refiere a la cantidad total de un componente o componentes particulares anadidos durante el curso del cultivo celular, que incluye los componentes anadidos al principio del cultivo y los componentes anadidos posteriormente. En ciertas realizaciones preferidas de la invencion, es necesario minimizar las “alimentaciones” del cultivo a lo largo del tiempo, ya que es deseable maximizar las cantidades presentes inicialmente. Por supuesto, los componentes del medio se metabolizan durante el cultivo de forma que los cultivos con las mismas cantidades acumuladas de determinados componentes tendran niveles absolutos diferentes si estos componentes se anaden en diferentes momentos (por ejemplo, si estan todos presentes inicialmente frente a si algunos se anaden por alimentaciones).
De acuerdo con la presente invencion, el uso de dicho medio permite altos niveles de produccion proteica y disminuye la acumulacion de ciertos factores indeseables tales como amonio y/o lactato.
Un experto en la tecnica entendera que las formulaciones de medios de la presente invencion engloban medios definidos y no definidos. En ciertas realizaciones preferidas de la presente invencion, el medio de cultivo es un medio definido en el que la composicion del medio se conoce y esta controlada.
En ciertas realizaciones preferidas de la presente invencion, los procedimientos de cultivo incluyen el cambio de medio de cultivo con un primer grupo de condiciones de cultivo a un segundo grupo de condiciones de cultivo de forma que se consiga un cambio metabolico de las celulas. En algunas realizaciones, este cambio se lleva a cabo cuando el cultivo alcanza aproximadamente un 20-80 % de su densidad celular maxima. En algunas realizaciones, el cambio implica un cambio de la temperatura (o intervalo de temperaturas) a la que se mantiene el cultivo. Alternativa o adicionalmente, la presente invencion proporciona procedimientos ajustados de manera que, tras alcanzar un pico, los niveles de lactato y/o amonio en el cultivo descienden con el tiempo. En otras realizaciones, el cambio implica el cambio del pH, la osmolaridad o el nivel de inductores qmmicos, tales como los acidos alcanoicos o sus sales.
Los cultivos celulares de la presente invencion pueden suplementarse opcionalmente con nutrientes y/u otros componentes del medio que incluyen hormonas y/u otros factores de crecimiento, iones particulares (tales como sodio, cloruro, calcio, magnesio, y fosfato), tampones, vitaminas, nucleosidos o nucleotidos, elementos traza (compuestos inorganicos presentes habitualmente en concentraciones finales muy bajas), aminoacidos, lfpidos, o
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glucosa u otra fuente de energfa. En ciertas realizaciones de la presente invencion, puede ser beneficioso suplementar los medios con inductores qmmicos tales como hexametileno bis (acetamida) (“HMBA”) y butirato sodico (“NaB”). Estos suplementos opcionales se pueden anadir al principio del cultivo o se pueden anadir en un punto posterior con el fin de reponer nutrientes agotados o por otra razon. En general, es deseable seleccionar la composicion inicial del medio para minimizar la suplementacion de acuerdo con la presente invencion.
Se pueden controlar distintas condiciones de cultivo de acuerdo con la presente invencion, incluyendo el pH, densidad celular, viabilidad celular, niveles de lactato, niveles de amonio, osmolaridad, o tftulo del polipeptido o protema que se expresa.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra una comparacion del Medio 1 y el Medio 2 en matraces con agitado utilizando celulas anti- GDF-8.
La Figura 2 muestra el crecimiento celular y viabilidad de las celulas anti-GDF-8 en el Medio 1.
La Figura 3 muestra el crecimiento celular de los cultivos celulares de anti-GDF-8 en condiciones de cultivo de control y sin alimentacion de glutamina.
La Figura 4 muestra la viabilidad celular de los cultivos celulares de anti-GDF-8 en condiciones de cultivo de control y sin alimentacion de glutamina.
La Figura 5 muestra los niveles de amonio de los cultivos celulares de anti-GDF-8 en condiciones de cultivo de control y sin alimentacion de glutamina.
La Figura 6 muestra los niveles de lactato de los cultivos celulares de anti-GDF-8 en condiciones de cultivo de control y sin alimentacion de glutamina.
La Figura 7 muestra el tftulo de anti-GDF-8 en condiciones de cultivo de control y sin alimentacion de glutamina. La Figura 8 muestra la densidad celular de los cultivos celulares de anti-GDF-8 en condiciones de cultivo de control y alimentacion con privacion de glutamina.
La Figura 9 muestra la viabilidad celular de los cultivos celulares de anti-GDF-8 en condiciones de cultivo de control y alimentacion con privacion de glutamina.
La Figura 10 muestra los niveles de amonio de cultivos celulares de anti-GDF-8 en condiciones de cultivo de control y con privacion de glutamina.
La Figura 11 muestra los niveles de lactato de los cultivos celulares de anti-GDF-8 en condiciones de cultivo de control y con privacion de glutamina.
La Figura 12 muestra el tftulo de anti-GDF-8 en condiciones de cultivo de control y con privacion de glutamina.
La Figura 13 muestra la respuesta a la dosis de hierro de las celulas anti-GDF-8 en el Medio 1 y el Medio 2.
La Figura 14 muestra la densidad celular de cultivos alimentados con Glutamato y Glutamina.
La Figura 15 muestra la viabilidad celular de cultivos alimentados con Glutamato y Glutamina.
La Figura 16 muestra el tftulo de anti-Lewis Y en cultivos alimentados con Glutamato y Glutamina,
La Figura 17 muestra los niveles de lactato en cultivos alimentados con Glutamato y Glutamina.
La Figura 18 muestra los niveles de amonio en cultivos alimentados con Glutamato y Glutamina.
La Figura 19 muestra la osmolaridad de cultivos alimentados con Glutamato y Glutamina.
La Figura 20 muestra la densidad celular de celulas anti-Lewis Y. Cada punto es la media de dos cultivos en matraces con agitado utilizando las mismas condiciones.
La Figura 21 muestra la viabilidad celular de las celulas anti-Lewis Y. Cada punto es la media de dos cultivos en matraces con agitado utilizando las mismas condiciones.
La Figura 22 muestra el tftulo medio del cultivo de anti-Lewis Y. Cada punto es la media de dos cultivos en matraces con agitado utilizando las mismas condiciones.
La Figura 23 muestra los niveles de amonio de las celulas anti-Lewis Y. Cada punto es la media de dos cultivos en matraces con agitado utilizando las mismas condiciones.
La Figura 24 muestra un salto impulsor que se utiliza en los cultivos semi-continuos.
La Figura 25 muestra el crecimiento celular de celulas anti-GDF-8 con distintas condiciones experimentales.
La Figura 26 muestra la viabilidad de celulas anti-GDF-8 con distintas condiciones experimentales.
La Figura 27 muestra el tftulo de anti-GDF-8 con distintas condiciones experimentales.
La Figura 28 muestra los niveles de lactato de los cultivos de anti-GDF-8 con distintas condiciones
experimentales.
La Figura 29 muestra los niveles de amonio de los cultivos de anti-GDF-8 con distintas condiciones
experimentales.
La Figura 30 muestra el crecimiento celular de las celulas anti-GDF-8 con distintas condiciones experimentales.
La Figura 31 muestra el tftulo de anti-GDF-8 con distintas condiciones experimentales.
La Figura 32 muestra los niveles de lactato de los cultivos de anti-GDF-8 con distintas
experimentales.
La Figura 33 muestra los niveles de amonio de los cultivos de anti-GDF-8 con distintas
experimentales.
La Figura 34 muestra el crecimiento celular de anti-GDF-8 en el Medio 9 modificado que contiene distintos niveles de glutamina y asparagina.
La Figura 35 muestra la viabilidad celular de las celulas anti-GDF-8 en Medio 9 modificado que contiene distintos niveles de glutamina y asparagina.
condiciones
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La Figura 36 muestra los niveles de lactato de los cultivos de anti-GDF-8 en Medio 9 modificado que contiene distintos niveles de glutamina y asparagina.
La Figura 37 muestra los niveles de amonio de los cultivos de anti-GDF-8 en Medio 9 modificado que contiene distintos niveles de glutamina y asparagina.
La Figura 38 muestra los niveles de glutamina de los cultivos de anti-GDF-8 en Medio 9 modificado que contiene distintos niveles de glutamina y asparagina.
La Figura 39 muestra el tttulo de anti-GDF-8 en Medio 9 modificado que contiene distintos niveles de glutamina y asparagina.
La Figura 40 muestra la osmolaridad de los cultivos de anti-GDF-8 en Medio 9 modificado que contiene distintos niveles de glutamina y asparagina.
La Figura 41 muestra el crecimiento celular de celulas anti-GDF-8 en medios que contienen distintos niveles de asparagina y cistema.
La Figura 42 muestra los niveles de lactato de los cultivos de anti-GDF-8 en medios que contienen distintos niveles de asparagina y cistema.
La Figura 43 muestra los niveles de amonio de los cultivos de anti-GDF-8 en medios que contienen distintos niveles de asparagina y cistema.
La Figura 44 muestra los niveles de glutamina en los cultivos de anti-GDF-8 en medios que contienen distintos niveles de asparagina y cistema.
La Figura 45 muestra los niveles de glutamato de los cultivos de anti-GDF-8 en medios que contienen distintos niveles de asparagina y cistema.
La Figura 46 muestra el tttulo de anti-GDF-8 en medios que contienen distintos niveles de asparagina y cistema. La Figura 47 muestra la osmolaridad de los cultivos de anti-GDF-8 en medios que contienen distintos niveles de asparagina y cistema.
La Figura 48 muestra el crecimiento celular de las celulas anti-GDF-8 en medios que contienen varios niveles de aminoacidos y vitaminas.
La Figura 49 muestra los niveles de lactato de los cultivos de anti-GDF-8 en medios que contienen distintos niveles de aminoacidos y vitaminas.
La Figura 50 muestra los niveles de amonio de los cultivos de anti-GDF-8 en medios que contienen distintos niveles de aminoacidos y vitaminas.
La Figura 51 muestra los niveles de glutamina de los cultivos de anti-GDF-8 en medios que contienen distintos niveles de aminoacidos y vitaminas.
La Figura 52 muestra el tttulo de anti-GDF-8 en medios que contienen distintos niveles de aminoacidos y vitaminas.
La Figura 53 muestra el crecimiento celular de las celulas anti-GDF-8 en medios que contienen distintos niveles de vitaminas, elementos traza E, y hierro.
La Figura 54 muestra los niveles de lactato de los cultivos de anti-GDF-8 en medios que contienen distintos niveles de vitaminas, elementos traza E y hierro.
La Figura 55 muestra los niveles de amonio de los cultivos de anti-GDF-8 en medios que contienen distintos niveles de vitaminas, elementos traza E y hierro.
La Figura 56 muestra el tttulo de anti-GDF-8 en medios que contienen distintos niveles de vitaminas, elementos traza E y hierro.
La Figura 57 muestran el crecimiento celular de las celulas anti-GDF-8 en los Medios 1, 3 y 9.
La Figura 58 muestra el tttulo de anti-GDF-8 en los Medios 1, 3 y 9.
La Figura 59 muestra los tttulos de anti-GDF-8 extrapolados con distintos niveles de glutamina sola y el total de glutamina y asparagina combinadas.
La Figura 60 muestra el crecimiento celular de las celulas anti-ABeta con distintas condiciones de medios ensayadas.
La Figura 61 muestra la viabilidad celular de las celulas anti-ABeta con distintas condiciones de medios ensayadas.
La Figura 62 muestra los niveles de lactato en los cultivos de anti-ABeta con distintas condiciones de medios ensayadas.
La Figura 63 muestra los niveles de amonio en los cultivos de anti-ABeta con distintas condiciones de medios ensayadas.
La Figura 64 muestra el tttulo de anti-ABeta con distintas condiciones de medios ensayadas.
La Figura 65 muestra la osmolaridad de los cultivos de anti-ABeta con distintas condiciones de medios ensayadas.
La Figura 66 muestra el crecimiento celular de celulas que expresan TNFR-Ig con distintas condiciones experimentales.
La Figura 67 muestra la viabilidad de las celulas que expresan TNFR-Ig con distintas condiciones experimentales.
La Figura 68 muestra la glucosa residual en cultivos de celulas que expresan TNFR-Ig con distintas condiciones experimentales.
La Figura 69 muestra los niveles de glutamina en cultivos de celulas que expresan TNFR-Ig con distintas condiciones experimentales.
La Figura 70 muestra la concentracion de lactato en cultivos de celulas que expresan TNFR-Ig con distintas condiciones experimentales.
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La Figura 71 muestra los niveles de amonio en cultivos de celulas que expresan TNFR-Ig con distintas condiciones experimentales.
La Figura 72 muestra el tttulo relativo de TNFR-Ig con distintas condiciones experimentales.
La Figura 73 muestra las densidades celulares de las celulas anti-GDF-8 cultivadas en biorreactores 6000 l y 1 l. La Figura 74 muestra los tftulos de celulas anti-GDF-8 cultivadas en biorreactores 6000 l y 1 l.
La Figura 75 muestra los niveles de lactato de celulas anti-GDF-8 cultivadas en biorreactores 6000 L y 1 L.
La Figura 76 muestra los niveles de amonio de las celulas anti-GDF-8 cultivadas en biorreactores 6000 L y 1 L.
Definiciones
“Mas o menos”, “Aproximadamente”: Como se utiliza en el presente documento, los terminos “mas o menos” y “aproximadamente”, cuando se aplica a una o mas condiciones particulares de cultivo celular, se refiere a un intervalo de valores que son similares al valor de referencia establecido para esa condicion o condiciones de cultivo. En ciertas realizaciones, el termino “aproximadamente” se refiere a un intervalo de valores que se encuentra en un 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 porciento o menos del valor de referencia establecido para esa condicion o condiciones de cultivo.
“Aminoacido”: El termino “aminoacido” como se utiliza en el presente documento se refiere a cualquiera de los veinte aminoacidos de origen natural que se utilizan normalmente en la formacion de polipeptidos, o a los analogos y derivados de esos aminoacidos. Los aminoacidos de la presente invencion se proporcionan en un medio para cultivos celulares. Los aminoacidos proporcionados en el medio se pueden proporcionar como sales o en forma de hidrato.
“Anticuerpo”: El termino “anticuerpo” como se utiliza en el presente documento se refiere a una molecula de inmunoglobulina o una parte inmunologicamente activa de una molecula de inmunoglobulina, tal como un fragmento Fab o F(ab')2, que contiene uno o mas sitios de union al antfgeno que se unen (inmunorreaccionan con) un antfgeno. Las expresiones “anticuerpos monoclonales” y “composicion de anticuerpos monoclonales”, como se utilizan en el presente documento, se refieren a una poblacion clonica de moleculas de anticuerpo que contienen solo una especie de sitio de union al antfgeno capaz de inmunorreaccionar con un epttopo particular de un antfgeno, mientras que las expresiones “anticuerpos policlonales” y “composicion de anticuerpos policlonales” se refieren a una poblacion de moleculas de anticuerpo que contienen multiples especies de sitios de union al antfgeno capaces de interactuar con un antfgeno particular. La definicion de anticuerpos monoclonales incluye moleculas tanto clonicas derivadas por tecnologfas tradicionales asf como moleculas de secuencia definida derivadas por modificacion o mutacion de restos espedficos, por ejemplo, los anticuerpos humanizados.
“Cultivo discontinuo”: La expresion “cultivo discontinuo” como se utiliza en el presente documento se refiere a un procedimiento para cultivar celulas en el que todos los componentes que se utilizaran finalmente en el cultivo de las celulas, que incluyen el medio (vease la definicion de “medio” posteriormente) asf como las propias celulas, se proporcionan al principio del proceso de cultivo. Un cultivo discontinuo se detiene tfpicamente en un punto y las celulas y/o componentes del medio se recolectan y opcionalmente se purifican.
“Biorreactor”: El termino “biorreactor” como se utiliza en el presente documento se refiere a cualquier vaso que se utiliza para el crecimiento de una celula de mamffero en un cultivo. El biorreactor puede ser de cualquier tamano siempre que sea util para el cultivo de celulas de mairnfero. Tfpicamente, el biorreactor sera al menos de 1 litro y puede ser de 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10.000, 12.000 litros o mas, o de cualquier volumen entre estos. Las condiciones internas del biorreactor, incluyen, pero no se limitan al pH y la temperatura, y tfpicamente se controlan durante el periodo de cultivo. El biorreactor puede estar compuesto por cualquier material que sea adecuado para mantener cultivos de celulas de mamffero suspendidas en los medios en condiciones de cultivo de la presente invencion, que incluye cristal, plastico o metal. La expresion “biorreactor de produccion” como se utiliza en el presente documento se refiere al biorreactor final que se utiliza en la produccion del polipeptido o protema de interes. El volumen del biorreactor de produccion del cultivo celular a gran escala es tfpicamente al menos de 500 litros y puede ser de 1000, 2500, 5000, 8000, 10.000, 12.000 litros o mas, o cualquier volumen entre estos. Un experto en la tecnica es consciente y sera capaz de escoger biorreactores adecuados para su uso en la practica de la presente invencion.
“Densidad celular”: La expresion “densidad celular” como se utiliza en el presente documento se refiere al numero de celulas presentes en un determinado volumen de medio.
“Viabilidad celular”: La expresion “viabilidad celular” como se utiliza en el presente documento se refiere a la capacidad de las celulas para sobrevivir en un determinado grupo de condiciones de cultivo o variaciones experimentales. La expresion como se utiliza en el presente documento tambien se refiere a la porcion de celulas que estan vivas en un momento particular respecto al numero total de celulas, vivas y muertas, en el cultivo en ese momento.
“Cultivo”, “Cultivo celular” y “Cultivo de celulas de marnffero”: Estas expresiones como se utilizan en el presente documento se refieren a una poblacion de celulas de mamffero que se suspende en un medio (vease la definicion de “medio” posteriormente) en condiciones adecuadas para la supervivencia y/o el crecimiento de la poblacion celular.
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Como estara claro para los expertos habituados en la tecnica, estas expresiones como se utilizan en el presente documento se pueden referir a la combinacion que comprende la poblacion de celulas de mai^ero y el medio en el que la poblacion esta suspendida.
“Cultivo semi-continuo”: La expresion “cultivo semi-continuo” como se utiliza en el presente documento se refiere a un procedimiento para cultivar celulas en el que se proporcionan al cultivo componentes adicionales en un momento posterior al principio del proceso de cultivo. Un cultivo semi-continuo tfpicamente se detiene en algun momento y las celulas y/o componentes del medio se recolectan y opcionalmente se purifican.
“Fragmento”: El termino “fragmento” como se utiliza en el presente documento se refiere a los polipeptidos y se define como cualquier parte separada de un polipeptido determinado que es unica o caractenstica de ese polipeptido. El termino como se utiliza en el presente documento tambien se refiere a cualquier porcion separada de un determinado polipeptido que mantiene al menos una parte de la actividad del polipeptido de longitud completa. Preferentemente, la parte de actividad que se mantiene es al menos de un 10 % de la actividad del polipeptido de longitud completa. Mas preferentemente la parte de actividad que se mantiene es al menos del 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de la actividad del polipeptido de longitud completa. Mas preferentemente aun, la parte de actividad que se mantiene es al menos del 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la actividad del polipeptido de longitud completa. Mas preferentemente, la parte de actividad que se mantiene es del 100 % de la actividad del polipeptido de longitud completa. El termino como se utiliza en el presente documento tambien se refiere a cualquier parte de un polipeptido determinado que incluye al menos un elemento de secuencia establecido que se encuentra en el polipeptido de longitud completa. Preferentemente, la secuencia de elementos abarca al menos 4-5, mas preferentemente al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o mas aminoacidos del polipeptido de longitud completa.
“Gen”: El termino “gen” como se utiliza en el presente documento se refiere a cualquier secuencia de nucleotidos, ADN o ARN, al menos alguna parte de los cuales codifica un producto final distinto, tfpicamente, pero no limitado a, un polipeptido que funciona en algun aspecto del metabolismo o desarrollo celular. El termino no quiere decir que se refiera solamente a la secuencia codificante que codifica el polipeptido u otro producto final distinto, sino que tambien engloba regiones precedentes y siguientes de la secuencia codificante que modulan el nivel basal de expresion (vease la definicion de “elemento genetico de control” posteriormente), asf como las secuencias que intervienen (“intrones”) entre los segmentos codificantes individuales (“exones”).
“Elemento genetico de control”: La expresion “elemento genetico de control” como se utiliza en el presente documento se refiere a cualquier elemento de secuencia que modula la expresion de un gen al que esta unido operativamente. Los elementos geneticos de control pueden funcionar aumentando o disminuyendo los niveles de expresion y se pueden localizar, antes, en, o despues de la secuencia codificante. Los elementos geneticos de control pueden actuar en cualquier estadio de la expresion genetica regulando, por ejemplo, el inicio, elongacion o terminacion de la transcripcion, el corte y empalme del ARNm, la edicion del ARNm, la estabilidad del ARNm, la localizacion del ARNm en la celula, el inicio, elongacion o terminacion de la traduccion, o cualquier otro estadio de la expresion genetica. Los elementos geneticos de control pueden funcionar individualmente o en combinacion con otros.
“Hibridoma”: El termino “hibridoma” como se utiliza en el presente documento se refiere a una celula creada por la fusion de una celula inmortalizada derivada de un origen inmunologico y una celula productora de anticuerpos. El hibridoma resultante es una celula inmortalizada que produce anticuerpos. Las celulas individuales que se utilizan para crear el hibridoma pueden ser de cualquier origen mairnfero, incluyendo pero sin limitarse a rata, cerdo, conejo, oveja, cerdo, cabra y ser humano. El termino engloba tambien lmeas celulares de trioma, que resultan cuando se fusiona la progenie de un mieloma heterohubrido, que son el producto de una fusion entre celulas de ser humano y una lmea celular de mieloma murino, y posteriormente se fusionan con una celula plasmatica. Ademas, el termino, significa que incluye cualquier lmea celular hfbrida inmortalizada que produzca anticuerpos tal como, por ejemplo, cuadromas (vease, por ejemplo, Milstein y col., Nature, 537:3053 (1983)).
“Densidad integrada de celulas viables”: La expresion “densidad integrada celular viable” como se utiliza en el presente documento se refiere a la densidad media de celulas viables durante el curso del cultivo multiplicada por la cantidad de tiempo que dura el cultivo. Asumiendo que la cantidad de polipeptido y/o protema que se produce es proporcional al numero de celulas viables presentes durante el curso del cultivo, la densidad integrada de celulas viables es una herramienta util para estimar la cantidad de polipeptido y/o protema que se producen durante el curso del cultivo.
“Medio”, “Medio de cultivo celular”, “Medio de cultivo”: Estas expresiones como se utilizan en el presente documento se refieren a una solucion que contiene nutrientes que nutren las celulas de mamffero en crecimiento. Tfpicamente, estas soluciones proporcionan aminoacidos esenciales y no esenciales, vitaminas, fuentes de energfa, lfpidos y elementos traza necesarios para el crecimiento mmimo y/o la supervivencia de la celula. La solucion puede contener tambien componentes para aumentar el crecimiento y/o la supervivencia por encima de la tasa minima, que incluyen hormonas y factores de crecimiento. La solucion se formula preferentemente con un pH y concentracion de sales optimos para la supervivencia y proliferacion celular. El medio puede ser tambien un “medio definido” -un medio libre de suero que no contiene protemas, hidrolizados o componentes de composicion desconocida. Los medios definidos
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estan libres de componentes derivados de animales y todos los componentes tienen una estructura qmmica conocida.
“Producto metabolico de desecho”: La expresion “producto metabolico de desecho” como se utiliza en el presente documento se refiere a compuestos producidos por el cultivo celular como resultado de los procesos metabolicos normales o no normales que son de alguna manera perjudiciales para el cultivo celular, particularmente en relacion con la expresion o actividad de un polipeptido o protema recombinante que se desean. Por ejemplo, los productos metabolicos de desecho pueden ser perjudiciales para el crecimiento o la viabilidad del cultivo celular, puede disminuir la cantidad de polipeptido o protema producidos, puede alterar el plegamiento, estabilidad, glicosilacion u otra modificacion post-traduccional del polipeptido o protema que se expresa, o puede ser perjudicial para las celulas y/o la expresion o actividad del polipeptido o protema recombinantes de cualquier otras manera. Los productos metabolicos de desecho ejemplares incluyen lactato, que se produce como resultado del metabolismo de la glucosa, y amonio, que se produce como resultado del metabolismo de glutamina. Un objetivo de la presente invencion es ralentizar la produccion de, reducir o incluso eliminar los productos metabolicos de desecho en cultivos de celulas de mamftero.
“Osmolaridad” y “Osmolalidad”: “Osmolalidad” es una medida de la presion osmotica de las partmulas de soluto disueltas en una solucion acuosa. Las partmulas de soluto incluyen tanto iones como moleculas no ionizadas. La osmolalidad se expresa como la concentracion de partmulas activas osmoticamente (es decir, osmoles) disueltos en 1 kg de solucion (1 mOsm/kg de H2O a 38 °C es equivalente a una presion osmotica de 19 mm de Hg). “Osmolaridad”, por el contrario, se refiere al numero de partmulas de soluto disueltas en 1 litro de solucion. Cuando se utiliza en el presente documento, la abreviatura “mOsm” significa “miliosmoles/kg de solucion”.
“Cultivo de perfusion”: El termino “cultivo de perfusion” como se utiliza en el presente documento se refiere a un procedimiento para cultivar celulas en el que se proporcionan componentes adicionales continua o semi- continuamente al cultivo posteriormente al inicio del proceso de cultivo. Los componentes proporcionados comprenden tfpicamente suplementos nutricionales para las celulas, que se han agotado durante el proceso de cultivo. Una parte de las celulas y/o los componentes del medio se recolectan tfpicamente con una base continua o semi-continua y opcionalmente se purifican.
“Polipeptido”: El termino “polipeptido” como se utiliza en el presente documento se refiere a una cadena secuencial de aminoacidos que se unen entre ellos mediante enlaces peptfdicos. El termino se utiliza para referirse a una cadena de aminoacidos de cualquier longitud, pero un experto habituado en la tecnica entendera que el termino no se limita a cadenas largas y puede referirse a una minima cadena que comprende dos aminoacidos unidos entre ellos mediante un enlace peptfdico.
“Protema”: El termino “protema” como se utiliza en el presente documento se refiere a uno o mas polipeptidos que funcionan como una unidad independiente. Si un unico polipeptido es la unidad de funcionamiento independiente y no necesita la asociacion ffsica permanente con otros polipeptidos para formar la unidad de funcionamiento independiente, los terminos “polipeptido” y “protema” que se utilizan en el presente documento se utilizan de manera intercambiable. Si la unidad funcional independiente esta compuesta por mas de un polipeptido asociados ffsicamente entre ellos, el termino “protema” que se utiliza en el presente documento se refiere a los multiples polipeptidos que se acoplan ffsicamente y funcionan juntos como la unidad independiente.
“Polipeptido expresado recombinantemente” y “Polipeptido recombinante”: Estas expresiones como se utilizan en el presente documento se refieren a un polipeptido que se expresa a partir de una celula de mamffero huesped que se ha modificado geneticamente para que exprese el polipeptido. El polipeptido expresado recombinantemente puede ser identico o similar a polipeptidos que se expresan normalmente en la celula de mamffero huesped. El polipeptido expresado recombinantemente tambien puede ser ajeno a la celula huesped, es decir, heterologo con respecto a los peptidos que se expresan normalmente en la celula de mamfero huesped. De manera alternativa, el polipeptido expresado recombinantemente puede ser quimerico en el que unas partes del polipeptido contienen secuencias de aminoacidos que son identicas o similares a los polipeptidos que se expresan normalmente en la celula de mamfero huesped, mientras que otras partes son ajenas a la celula huesped.
“Sembrar”: El termino “sembrar” como se utiliza en el presente documento se refiere al proceso de proporcionar un cultivo celular a un biorreactor u otro vaso. Las celulas pueden haber sido propagadas previamente en otro biorreactor o vaso. De manera alternativa, las celulas pueden haberse congelado y descongelarse inmediatamente antes de proporcionarlas al biorreactor o el vaso. El termino se refiere a cualquier cantidad de celulas, incluyendo una unica celula.
“Tftulo”: El termino “tftulo” como se utiliza en el presente documento se refiere a la cantidad total de polipeptido o protema expresados recombinantemente producidos por un cultivo de celulas de mamffero dividida por una cantidad determinada de volumen de medio. El tftulo se expresa tfpicamente en unidades de miligramos de polipeptido o protema por mililitro de medio.
Descripcion detallada de ciertas realizaciones preferidas
La presente invencion proporciona sistemas mejorados para la produccion de protemas y/o polipeptidos por cultivo
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celular. En particular, la invencion proporciona sistemas que minimizan la produccion de uno o mas productos metabolicos perjudiciales para el crecimiento, viabilidad celular, y/o produccion o calidad de protemas. En una realizacion preferida de la presente invencion, el cultivo celular es un cultivo discontinuo o semi-continuo. Otras ciertas realizaciones preferidas se tratan en detalle posteriormente. Los expertos habituados en la tecnica entenderan, sin embargo, que las distintas modificaciones en estas realizaciones preferidas estan dentro del ambito de las reivindicaciones adjuntas. Son las reivindicaciones y equivalentes de las mismas las que definen el ambito de la presente invencion, que no esta ni debena estar limitada a o por la presente descripcion de ciertas realizaciones preferidas.
Anticuerpos
Debido al gran numero de anticuerpos que se utilizan actualmente o estan bajo investigacion como agentes farmaceuticos u otros agentes comerciales, la produccion de anticuerpos tiene un interes particular de acuerdo con la presente invencion. Los anticuerpos son protemas que tienen la capacidad de unirse espedficamente a un antigeno particular. Cualquier anticuerpo que pueda expresarse en una celula huesped se puede utilizar de acuerdo con la presente invencion. En una realizacion preferida, el anticuerpo que se va a expresar es un anticuerpo monoclonal.
En otra realizacion preferida, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimerico. Un anticuerpo quimerico contiene fragmentos de aminoacidos que se derivan de mas de un organismo. Las moleculas de anticuerpo quimerico pueden incluir, por ejemplo, un dominio de union al antigeno de un raton, rata, u otra especie, con regiones constantes humanas. Se ha descrito una variedad de estrategias para producir anticuerpos quimericos. Vease, por ejemplo, Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851 (1985); Takeda y col., Nature 314, 452 (1985), Cabilly y col., Patente de EE. UU. N° 4.816.567; Boss y col., Patente de EE. UU. N° 4.816.397; Tanaguchi y col., Publicacion de Patente Europea EP171496; Publicacion de Patente Europea 0173494, Patente del Reino Unido GB 2177096B.
En otra realizacion preferida, el anticuerpo monoclonal es un derivado de anticuerpo humano, por ejemplo, por medio del uso de bibliotecas de ribosomas de presentacion o fagos de presentacion (vease, por ejemplo, Winter y col., Patente de EE. UU. N° 6.291.159 y Kawasaki, Patente de EE. UU. N° 5.658.754) o el uso de un especie de xenoinjerto en la que los genes del anticuerpo nativo esten inactivados y sustituidos funcionalmente con genes de anticuerpo humano, mientras que se dejan intactos los otros componentes del sistema inmunitario nativo (vease, por ejemplo, Kucherlapati y col., Patente de EE. UU. N° 6.657.103).
En otra realizacion preferida, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado. Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo quimerico en el que la gran mayona de los restos de aminoacido se derivan de anticuerpos humanos, minimizando de esta manera cualquier reaccion inmunitaria potencial cuando se suministre a un sujeto humano. En los anticuerpos humanizados, los restos de aminoacido de las regiones determinantes de complementariedad se sustituyen, al menos en parte, con restos de una especie no humana que confiere una especificidad o afinidad deseada por el antfgeno. Tales moleculas de inmunoglobulina alteradas se pueden producir por una de las distintas tecnicas que se conocen en la tecnica, (por ejemplo, Teng y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 7308-7312 (1983); Kozbor y col., Immunology Today, 4, 7279 (1983); Olsson y col., Meth. Enzymol., 92, 3-16 (1982)), y preferentemente se hacen de acuerdo con las ensenanzas de la Publicacion PCT WO92/06193 o EP 0239400, las cuales se incorporan en el presente documento por referencia). Los anticuerpos humanizados se pueden producir comercialmente, por ejemplo, por Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Gran Bretana. Como referencias adicionales, vease Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), las cuales se incorporan en el presente documento por referencia.
En otra realizacion preferida, los anticuerpos monoclonales, quimericos, o humanizados que se han descrito anteriormente pueden contener restos de aminoacidos que no existen naturalmente en ningun anticuerpo en ninguna especie en la naturaleza. Estos restos ajenos se pueden utilizar, por ejemplo, para conferir una especificidad, afinidad, o funcion efectora nueva o modificada al anticuerpo monoclonal, quimerico o humanizado. En otra realizacion preferida, los anticuerpos que se han descrito anteriormente se pueden conjugar con farmacos para farmacoterapia sistemica, tales como toxinas, farmacos citotoxicos de bajo peso molecular, modificadores de la respuesta biologica, y radionuclidos (vease, por ejemplo, Kunz y col., Calicheamicin derivative-carrier conjugates, documento US20040082764 A1).
En la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo que se une espedficamente al fragmento Ap de la protema precursora de amiloide u otros componentes de una placa de amiloide, y es util para combatir la acumulacion de placas de amiloide en el cerebro lo que caracteriza la enfermedad de Alzheimer (Vease, por ejemplo, la Solicitud Provisional de EE. UU. 60/636,684).
En general, los que practiquen la presente invencion seleccionaran su polipeptido de interes, y sabran su secuencia de aminoacidos precisa. Las tecnicas de la presente invencion se han aplicado satisfactoriamente para la produccion de distintos polipeptidos incluyendo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano dirigido al factor de crecimiento y diferenciacion 8 (Ejemplos, 1, 3, 4, 7-14), el anticuerpo humanizado anti-Lewis Y (Ejemplos 5 y 6), anti-ABeta (Ejemplo 15) y una protema de fusion dimerica Fc-receptor del factor de necrosis tumoral (Ejemplo 16), indicando
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que la presente invencion sera util para la expresion de una variedad de polipeptidos y protemas diferentes. Cualquier protema determinada que se vaya a expresar de acuerdo con la presente invencion tendra sus propias caractensticas idiosincraticas y puede tener influencia sobre la densidad o viabilidad celular de las celulas cultivadas, y puede expresarse a niveles menores que otro polipeptido o protema que se cultiva en condiciones de cultivo identicas. Un experto habituado en la tecnica sera capaz de modificar apropiadamente las etapas y composiciones de la presente invencion con el fin de optimizar el crecimiento celular y/o la produccion de cualquier polipeptido o protema determinados que se expresen.
Elementos geneticos de control
Como estara claro para los expertos habituados en la tecnica, se pueden emplear elementos geneticos de control para regular la expresion genetica del polipeptido o protema. Dichos elementos geneticos de control se debenan seleccionar para que sean activos en la celula huesped relevante. Los elementos de control pueden ser activos constitutivamente o pueden ser inducibles en circunstancias definidas. Los elementos de control inducibles son particularmente utiles cuando la protema que se expresa es toxica o por otra parte tiene efectos perjudiciales para el crecimiento y/o viabilidad celular. En dichos ejemplos, la regulacion de la expresion del polipeptido o protema por medio de elementos de control inducibles puede mejorar la viabilidad celular, densidad celular y/o el rendimiento total del polipeptido o protema expresados. Se conoce un gran numero de elementos de control utiles en la practica de la presente invencion y estan disponibles en la tecnica.
Los promotores constitutivos mairnferos que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, el promotor hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), el promotor adenosina desaminasa, el promotor piruvato cinasa, el promotor beta-actina asf como otros promotores constitutivos conocidos por los expertos habituados en la tecnica. Adicionalmente, los promotores vmcos que han demostrado que dirigen la expresion constitutiva de secuencias codificantes en celulas eucariotas incluyen, por ejemplo, promotores vmcos de simios, promotores del virus del herpes simple, promotores del virus del papiloma, promotores adenovmcos, promotores del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), promotores del virus del sarcoma de Rous, promotores de citomegalovirus (CMV), las repeticiones del extremo largo (LTR) del virus de la leucemia murina de Moloney y otros retrovirus, el promotor timidina cinasa del virus del herpes simple, asf como otros promotores vmcos conocidos por los expertos habituados en la tecnica.
Los promotores inducibles dirigen la expresion de secuencias codificantes unidas operativamente en presencia de un agente inductor y tambien se pueden utilizar de acuerdo con la presente invencion. Por ejemplo, en celulas de mamffero, el promotor metalotionema induce la transcripcion de secuencias codificantes corriente abajo en presencia de ciertos iones metalicos. Otros promotores inducibles seran reconocidos por y/o conocidos por los expertos en la tecnica.
En general, la secuencia de expresion genetica tambien incluira secuencias 5' no de transcripcion y 5' no de traduccion implicadas con el inicio de la transcripcion y la traduccion, respectivamente, tal como un TATA box, una secuencia de sellado, una secuencia CAAT, y similares. Se pueden utilizar opcionalmente elementos amplificadores para aumentar los niveles de expresion de los polipeptidos o protemas que se van a expresar. Ejemplos de elementos amplificadores que han demostrado que funcionan en celulas de mamffero incluyen el amplificador genetico temprano SV40, como se describe en Dijkema y col., EMBO J. (1985) 4: 761 y el derivado amplificador/promotor de la repeticion del extremo largo (LTR) del virus del sarcoma de Rous (VSR), como se describe en Gorman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982b) 79:6777 y el citomegalovirus humano, como se describe en Boshart y col., Cell (1985) 41:521.
Los sistemas para unir los elementos de control a las secuencias codificantes se conocen bien en la tecnica (las tecnicas generales biologicas moleculares y de ADN recombinante se describen en Sambrook, Fritsch, y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, el cual se incorpora en el presente documento por referencia). Los vectores comerciales adecuados para insertar la secuencia codificante preferida para la expresion en distintas celulas de mamffero en una variedad de condiciones de cultivo e induccion tambien son bien conocidos en la tecnica.
Introduccion de secuencias codificantes y elementos de control relacionados en celulas huesped
Los procedimientos adecuados para la introduccion en los acidos nucleicos de las celulas huesped de mamffero suficientes para conseguir la expresion de los polipeptidos o protemas de interes se conocen bien en la tecnica. Vease por ejemplo, Gething y col., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei y col., Nature, 281:40-46 (1979); Levinson y col.; el documento EP 117,060; y el documento EP 117,058, que se incorporan en el presente documento por referencia.
Para las celulas de mamffero, los procedimientos preferidos de transformacion incluyen el procedimiento de precipitacion en fosfato calcico de Graham y van der Erb, Virology, 52:456-457 (1978) o la Lipofectamina™ (Gibco BRL) Procedimiento de Hawley-Nelson, Focus 15:73 (1193). Los aspectos generales de las transformaciones del sistema de celulas huesped de mamffero se han descrito por Axel en la Patente de EE. UU. N° 4.399.216 expedida el 16 de Ago., 1983. Para varias tecnicas de transformacion de celulas de mamffero, vease Keown y col., Methods in
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Enzymology (1989), Keown y col., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990), y Mansour y col., Nature, 336:348352 (1988). Ejemplos representativos no limitantes de vectores adecuados para la expresion de polipeptidos o protemas en celulas de mai^ero incluyen pCDNA1; pCD, vease Okayama, y col. (1985) Mol. Cell Biol. 5:11361142; pMClneo Poli-A, vease Thomas, y col. (1987) Cell 51:503-512; y un vector baculovmico tal como pAC 373 o pAC 610.
En realizaciones preferidas, el polipeptido o protema se transfecta establemente en la celulas huesped. Sin embargo, un experto en la tecnica reconocera que la presente invencion se puede utilizar con celulas de mairnfero transfectadas transitoria o establemente.
Celulas
Se puede utilizar cualquier celula o tipo celular susceptible a cultivo celular, y a la expresion de polipeptidos, de acuerdo con la presente invencion. Ejemplos no limitantes de celulas de mamffero que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invencion incluyen la lmea de mieloma del raton BALB/c (NSO/1, ECACC N° 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, Holanda)); lmea CV1 de rinon de mono transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); lmea de rinon embrionario humano (celulas 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspension, Graham y col., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); celulas de rinon de hamster recien nacido (BHK, ATCC CCL 10); celulas de ovario de hamster chino +/- DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); celulas de Sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); celulas de rinon de mono (CV1 ATcC CCL 70); celulas renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); celulas de carcinoma de cuello uterino humano (HeLa, ATCC CCL 2); celulas de rinon canino (MDCK, ATCC CCL 34); celulas hepaticas de rata bufalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); celulas de pulmon humano (W138, ATCC CCL 75); celulas de hngado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de raton (MMT 060562, AtCc CCL51); celulas tRi (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); celulas MRC 5; celulas FS4; y una lmea de hepatoma humano (Hep G2). En una realizacion particularmente preferida, la presente invencion se utiliza en el cultivo de y la expresion de polipeptidos y protemas en lmeas celulares CHO.
Adicionalmente, se puede utilizar cualquiera de las lmeas celulares de hibridoma disponibles comercial y no comercialmente que expresen polipeptidos o protemas de acuerdo con la presente invencion. Un experto en la tecnica apreciara que las lmeas celulares de hibridoma pueden tener diferentes necesidades nutritivas y/o pueden necesitar diferentes condiciones de cultivo para el crecimiento y la expresion de polipeptidos y protemas optimos, y seran capaces de modificar las condiciones segun sea necesario.
Como se ha senalado anteriormente, en muchos casos las celulas se seleccionaran o modificaran para que produzcan altos niveles de protemas y polipeptidos. A menudo, las celulas se modifican geneticamente para que produzcan altos niveles de protemas, por ejemplo, por la introduccion de un gen que codifica la protema o el polipeptido de interes y/o por la introduccion de elementos de control que regulen la expresion del gen (sea endogeno o introducido) que codifica el polipeptido de interes.
Ciertos polipeptidos pueden tener efectos perjudiciales para el crecimiento celular, la viabilidad celular o algunas otras caractensticas de las celulas que en ultimo termino limiten la produccion del polipeptido o protema de interes de alguna manera. Incluso entre una poblacion de celulas de un tipo particular modificado para que exprese un polipeptido espedfico, existe una variabilidad en la poblacion celular de manera que ciertas celulas individuales creceran mejor y/o produciran mas polipeptido de interes. En ciertas realizaciones preferidas de la presente invencion, la lmea celular la selecciona el facultativo por su crecimiento robusto en las condiciones particulares escogidas para cultivar las celulas. En realizaciones particularmente preferidas, las celulas individuales modificadas para que expresen un polipeptido particular se escogen para la produccion a gran escala basandose en el crecimiento celular, la densidad celular final, el porcentaje de viabilidad celular, el tttulo del polipeptido que se expresa o cualquier combinacion de estos o cualquiera de otras condiciones que el facultativo considere importantes.
Fase de cultivo celular
Los procedimientos tfpicos para producir un polipeptido de interes incluyen los cultivos discontinuos y los cultivos semi-continuos. Los procesos de cultivo discontinuo tradicionalmente comprenden inocular un cultivo de produccion a gran escala con un cultivo de siembra con una densidad celular particular, cultivar las celulas en condiciones que contribuyan al crecimiento y la viabilidad celular, recolectar el cultivo cuando las celulas alcancen una densidad celular espedfica, y purificar el polipeptido que se expresa. Los procedimientos de cultivo semi-continuo incluyen una etapa o etapas adicionales de suplementacion del cultivo discontinuo con nutrientes y otros componentes que se consumen durante el crecimiento de las celulas. Un problema persistente y sin resolver de los cultivos discontinuos y semi-continuos tradicionales es la produccion de productos metabolicos de desecho, que tienen efectos perjudiciales sobre el crecimiento celular, la viabilidad, y la produccion de los polipeptidos expresados. Dos productos metabolicos de desecho, que tienen particularmente efectos perjudiciales, son el lactato y el amonio, que se producen como resultado del metabolismo de la glucosa y glutamina, respectivamente. Ademas de la produccion enzimatica de amonio como resultado del metabolismo de la glutamina, el amonio tambien se acumula en los cultivos celulares como resultado de la degradacion no metabolica a lo largo del tiempo. La presente invencion
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proporciona un procedimiento mejorado de produccion a gran escala de polipeptidos que minimiza los efectos perjudiciales del amonio y el lactato ralentizando e incluso revirtiendo la acumulacion de estos productos de desecho en los cultivos celulares. Un experto habituado en la tecnica reconocera que la presente invencion se puede emplear en cualquier sistema en el que se cultivan celulas incluyendo, pero sin limitarse a, sistemas discontinuos, semi- continuos y de perfusion. En ciertas realizaciones preferidas de la presente invencion, las celulas se cultivan en sistemas discontinuos o semi-continuos.
Medios
Las formulaciones de medios tradicionales, que incluyen los medios disponibles en el mercado tales como el de Ham F10 (Sigma), Medio Mmimo Esencial ([MEM] Sigma), RPMI 1640 (Sigma) y Medio de Eagle modificado de Dulbecco ([DMEM], Sigma), contienen niveles relativamente altos de glucosa y glutamina en comparacion con otros aminoacidos. Se pensaba que estos componentes se necesitaban en abundancia ya que son fuentes primarias de energfa metabolica para las celulas. Sin embargo, el rapido consumo de estos nutrientes da lugar a la acumulacion de lactato y amonio como se ha descrito anteriormente. Adicionalmente, los altos niveles iniciales de glucosa y glutamina y la posterior acumulacion de lactato y amonio dan lugar a una alta osmolaridad, una condicion que en sf misma a menudo es perjudicial para el crecimiento celular, la viabilidad celular y la produccion de polipeptidos.
La presente invencion proporciona una variedad de formulaciones de medios que cuando se utilizan de acuerdo con otras etapas de cultivo descritas en el presente documento, minimizan e incluso revierten la acumulacion de lactato y amonio. Las formulaciones de los medios de la presente invencion que han demostrado que tienen efectos beneficiosos sobre el crecimiento y/o viabilidad celular o sobre la expresion del polipeptido o protema incluyen uno o mas de: i) una cantidad acumulada de aminoacidos por unidad de volumen mayor de aproximadamente 70 mM, ii) una relacion molar de glutamina acumulada respecto a asparagina acumulada de menos de aproximadamente 2, iii) una relacion de glutamina acumulada respecto a los aminoacidos totales acumulados de menos de aproximadamente 0,2, iv) una relacion de iones inorganicos acumulados con respecto a los aminoacidos totales acumulados de entre aproximadamente 0,4 a 1, y v) una cantidad acumulativa combinada de glutamina y asparagina por unidad de volumen mayor de aproximadamente 16 mM. Un experto en la tecnica entendera que “acumulada”, como se ha utilizado anteriormente, se refiere a la cantidad total de un componente o componentes particulares que se anaden durante el curso del cultivo celular, que incluyen los componentes anadidos al principio del cultivo y componentes anadidos posteriormente. Un experto en la tecnica entendera que las formulaciones de medios de la presente invencion engloban medios tanto definidos como no definidos.
Las formulaciones de medios tradicionales comienzan con un nivel relativamente bajo de aminoacidos totales en comparacion con las formulaciones de la presente invencion. Por ejemplo, el medio de cultivo tradicional conocido como DME-F12 (una mezcla 50:50 de medio de Eagle modificado de Dulbecco y medio de Ham F12) tiene un contenido total de aminoacidos de 7,29 mM, y el medio de cultivo tradicional conocido como RPMI-1640 tiene un contenido total de aminoacidos de 6,44 mM (vease, por ejemplo, H.J. Morton, In Vitro, 6:89-108 (1970), R.G. Ham, Proc. Nat. Assoc. Sci. (USA), 53:288-293 (1965), G.E. Moore y col., J. Am. Medical Assn., 199:519-24 (1967), que se incorporan en el presente documento por referencia). En ciertas realizaciones de la presente invencion, la concentracion de aminoacidos en los medios de cultivo es preferentemente mayor de aproximadamente 70 mM. Mas preferentemente, las formulaciones de medio de la presente invencion contienen concentraciones de aminoacidos mayores de aproximadamente 70 mM en el medio de partida. Se ha demostrado que cuando las concentraciones de aminoacidos en los medios de partida estan en este intervalo, la densidad celular y el tftulo aumentan a lo largo del periodo de crecimiento del cultivo (vease el Ejemplo 13).
Adicionalmente, en ciertas realizaciones de la presente invencion, la relacion molar de glutamina respecto a asparagina en los medios de cultivo esta reducida en comparacion con otros medios disponibles comercial o no comercialmente. Preferentemente la relacion molar de glutamina respecto a asparagina en los medios de cultivo es menor de aproximadamente dos.
Adicionalmente, en ciertas realizaciones de la presente invencion, la relacion molar de glutamina respecto a los aminoacidos totales en los medios de cultivo esta reducida en comparacion con otros medios disponibles comercial y no comercialmente. Preferentemente la relacion molar de glutamina con respecto a los aminoacidos totales en los medios de cultivo es menor de aproximadamente 0,2.
Un resultado interesante e inesperado de la disminucion de la relacion molar de glutamina respecto a asparagina o respecto a la concentracion total de aminoacidos en los medios de partida de acuerdo con la presente invencion era que ademas de observarse un descenso de la acumulacion de amonio, se vefa tambien un descenso de la acumulacion de lactato. En ciertas realizaciones, los niveles acumulados de amonio y lactato no solo eran mas bajos que los de los cultivos de control, sino que de hecho ahora descienden tras una acumulacion inicial (como ejemplo, vease los Ejemplos 3 y 7).
Boraston (Patente de EE. UU. Numero 5.871.999) ha desvelado un medio de cultivo en el que la relacion molar de los iones inorganicos totales respecto a los aminoacidos totales esta entre 1 y 10. Boraston demostraba que proporcionando un medio de cultivo en el que la relacion molar de iones inorganicos totales respecto a aminoacidos totales esta en este intervalo, disminuye la agregacion celulas CHO cultivadas en el medio. En otra realizacion de la
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presente invencion, la relacion molar de iones inorganicos totales con respecto a los aminoacidos totales en el medio de cultivo se reduce incluso mas, hasta aproximadamente entre 0,4 a 1. Como se muestra en el Ejemplo 13, la reduccion de esta relacion de 1,75 a aproximadamente 0,7 resulta en un marcado aumento de la densidad celular y la produccion del polipeptido o protema que se expresa a lo largo del periodo de crecimiento del cultivo.
En otra realizacion preferida de la presente invencion, el medio de cultivo contiene una concentracion combinada de glutamina y asparagina de entre aproximadamente 16 y 36 mM. Como se muestra en el Ejemplo 14, Tabla 22, los medios que contienen una concentracion combinada total de glutamina y asparagina en este intervalo presentan fftulos mayores del polipeptido que se expresa que los medios que contienen una glutamina y asparagina totales combinadas fuera de este intervalo. Un experto en la tecnica sera capaz de escoger la concentracion combinada exacta de glutamina y asparagina dentro de este intervalo con el fin de optimizar el crecimiento y/o viabilidad celular y para maximizar la produccion del polipeptido que se expresa.
Ademas, un experto habituado en la tecnica reconocera que cualquiera de las condiciones enumeradas anteriormente se pueden utilizar o solas o en varias combinaciones entre ellas. Utilizando la formulacion de medios que presentan una, algunas o todas las caracteffsticas anteriores, un experto habituado en la tecnica sera capaz de optimizar el crecimiento y/o viabilidad celular y para maximizar la produccion del polipeptido que se expresa.
Cualquiera de estas formulaciones de medios desveladas en la presente invencion se puede suplementar opcionalmente segun sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento, iones particulares (tales como sodio, cloruro, magnesio, y fosfato), tampones, vitaminas, nucleosidos o nucleotidos, elementos traza (compuestos inorganicos habitualmente presentes en concentraciones finales muy bajas), aminoacidos, lfpidos, hidrolizados proteicos, o glucosa u otra fuente de energfa. En ciertas realizaciones de la presente invencion, puede ser beneficioso suplementar los medios con inductores qmmicos tales como hexametileno-bis (acetamida) (“HMBA”) y butirato sodico (“NaB”). Estos suplementos opcionales se pueden anadir al comienzo del cultivo o se pueden anadir en un punto posterior con el fin de reponer los nutrientes agotados, o por otra razon. Un experto habituado en la tecnica sera consciente de cualquier suplemento deseable o necesario que se pueda incluir en las formulaciones de los medios desvelados.
Proporcionar un cultivo de celulas de mam^fero
Se conocen bien en la tecnica distintos procedimientos para preparar celulas de mairnfero para la produccion de protemas o polipeptidos por cultivo discontinuo y semi-continuo. Como se describe anteriormente, se puede introducir un acido nucleico suficiente para conseguir la expresion (ffpicamente un vector que contiene el gen que codifica el polipeptido o protema de interes y cualquiera de los elementos geneticos de control unidos operativamente) en la lmea celular huesped por medio de cualquiera de distintas tecnicas bien conocidas. Tfpicamente, se exploran las celulas para determinar si las celulas huesped han captado ya el vector y expresan el polipeptido o protema de interes. Los procedimientos tradicionales para detectar un polipeptido o protema de interes particular que se expresa en las celulas de marnffero incluyen pero no se limitan a inmunohistoqmmica, inmunoprecipitacion, citometffa de flujo, microscopfa de inmunofluorescencia, SDS-PAGE, transferencia de Western, ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA), tecnicas de cromatograffa lfquida de altas prestaciones (HPLC), ensayos de actividad biologica y cromatograffa de afinidad. Un experto habituado en la tecnica sera consciente de otras tecnicas apropiadas para detectar los polipeptidos o protemas que se expresan. Si multiples celulas huesped expresan el polipeptido o protema de interes, se pueden utilizar algunas o todas las tecnicas enumeradas para determinar cual de las celulas expresa ese polipeptido o protema con los niveles mas altos.
Una vez que se identifica la celula que expresa el polipeptido o protema de interes, la celula se propaga en un cultivo por cualquiera de una variedad de procedimientos bien conocidos por el experto habituado en la tecnica. La celula que expresa el polipeptido o protema de interes se propaga ffpicamente cultivandola a una temperatura y en un medio que contribuya a la supervivencia, crecimiento y viabilidad de la celula. El volumen del cultivo inicial puede ser de cualquier tamano, pero a menudo es mas pequeno que el volumen del cultivo de produccion en el biorreactor que se utiliza en la produccion final del polipeptido o protema de interes, y frecuentemente las celulas se pasan varias veces por biorreactores de volumenes crecientes antes de sembrar el biorreactor de produccion. El cultivo celular se puede agitar o remover para aumentar la oxigenacion del medio y la dispersion de los nutrientes a las celulas. De manera alternativa o adicionalmente, se pueden utilizar dispositivos de aireacion especiales que se conocen bien en la tecnica para aumentar y controlar la oxigenacion del cultivo. De acuerdo con la presente invencion, un experto habituado en la tecnica entendera que puede ser beneficioso controlar o regular ciertas condiciones internas del biorreactor, que incluyen pero no se limitan al pH, temperatura, oxigenacion, etc.
La densidad celular de partida en el biorreactor de produccion sera como mmimo una unica celula por volumen de cultivo. En realizaciones preferidas de la presente invencion, las densidades celulares de partida en el biorreactor de produccion pueden variar desde aproximadamente 2 x 102 celulas viables por ml a aproximadamente 2 x 103, 2 x 104, 2 x 105, 2 x 106, 5 x 106 o 10 x 106 celulas viables por ml y mayores.
Los cultivos celulares inicial e intermedio se pueden cultivar con cualquier densidad que se desee antes de sembrar el siguiente biorreactor intermedio o de produccion final. Se prefiere que la mayoffa de las celulas permanezcan vivas antes de la siembra aunque no se necesita una viabilidad total o casi total. En una realizacion de la presente
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invencion, las celulas se pueden retirar del sobrenadante, por ejemplo, por centrifugacion a baja velocidad. Tambien puede ser deseable lavar las celulas retiradas con un medio antes de la siembra del proximo biorreactor para eliminar cualquier producto metabolico de desecho o componentes del medio. El medio puede ser el medio en el que se cultivaron previamente las celulas o puede ser un medio diferente o una solucion de lavado que selecciona el facultativo de la presente invencion.
Las celulas se pueden entonces diluir hasta una densidad apropiada para la siembra del biorreactor de produccion. En una realizacion preferida de la presente invencion, las celulas se diluyen en el mismo medio que se utilizara en el biorreactor de produccion. De manera alternativa, las celulas se pueden diluir en otro medio o solucion, dependiendo de las necesidades y deseos del facultativo de la presente invencion para ajustarse a las necesidades de las propias celulas, por ejemplo, si se van a almacenar durante un corto periodo de tiempo antes de la siembra del biorreactor de produccion.
Fase de crecimiento inicial
Una vez que el biorreactor de produccion se ha sembrado como se ha descrito anteriormente, el cultivo celular se mantienen en la fase de crecimiento inicial en condiciones que contribuyan a la supervivencia, crecimiento y viabilidad del cultivo celular. Las condiciones precisas variaran dependiendo del tipo celular, el organismo a partir del cual se deriva la celula, y la naturaleza y caracter del polipeptido o protema que se expresa.
De acuerdo con la presente invencion, el biorreactor de produccion puede ser de cualquier volumen que sea apropiado para la produccion a gran escala de polipeptidos o protemas. En una realizacion preferida, el volumen del biorreactor de produccion es al menos de 500 litros. En otras realizaciones preferidas, el volumen del biorreactor de produccion es de 1000, 2500, 5000, 8000, 10.000, 12.000 litros o mas, o cualquier volumen entre estos. Un experto habituado en la tecnica sera consciente de y sera capaz de escoger un biorreactor adecuado para su uso en la practica de la presente invencion. El biorreactor de produccion se puede construir de cualquier material que contribuya al crecimiento y viabilidad celular que no interfiera con la expresion o estabilidad del polipeptido o protema que se produzca.
La temperatura del cultivo celular en la fase de crecimiento inicial se seleccionara basandose primariamente en el intervalo de temperaturas al que el cultivo celular se mantiene viable. Por ejemplo, durante la fase de crecimiento inicial, las celulas CHO crecen bien a 37 °C. En general, la mayona de las celulas de mairnfero crecen bien en un intervalo de aproximadamente 25 °C a 42 °C. Preferentemente, las celulas de mamffero crecen bien en el intervalo de 35 °C a 40 °C. Los expertos habituados en la tecnica seran capaces de seleccionar la temperatura o temperaturas adecuadas a las que crecen las celulas, dependiendo de las necesidades de las celulas y las necesidades de produccion del facultativo.
En una realizacion de la presente invencion, la temperatura de la fase de crecimiento inicial se mantiene a una unica temperatura constante. En otra realizacion, la temperatura de la fase inicial de crecimiento se mantiene en un intervalo de temperaturas. Por ejemplo, la temperatura puede aumentarse o disminuirse constantemente durante la fase inicial de crecimiento. De manera alternativa, la temperatura se puede aumentar o disminuir cantidades distintas en varios momentos durante la fase inicial de crecimiento. Un experto habituado en la tecnica sera capaz de determinar si se debenan utilizar una unica o multiples temperaturas, y si la temperatura se debena ajustar constantemente o en cantidades distintas.
Las celulas se pueden cultivar durante la fase inicial de crecimiento durante una cantidad de tiempo mayor o menor, dependiendo de las necesidades del facultativo y las necesidades propias de las celulas. En una realizacion, las celulas se cultivan durante un periodo de tiempo suficiente para conseguir una densidad celular viable que sea un porcentaje determinado de la densidad celular viable maxima que alcanzanan las celulas eventualmente si se les permitiera crecer sin molestias. Por ejemplo, las celulas se pueden cultivar durante un periodo de tiempo suficiente para que alcance la densidad celular viable que se desea de un 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 por ciento de la densidad celular viable maxima.
En otra realizacion se permite que las celulas crezcan durante un periodo de tiempo definido. Por ejemplo, dependiendo de la concentracion de partida del cultivo celular, la temperatura a la que se cultivan las celulas, y la tasa de crecimiento intrmseca de las celulas, las celulas se pueden cultivar durante 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o mas dfas. En algunos casos, se permite que las celulas crezcan durante un mes o mas. Las celulas se cultivanan durante 0 dfas en el biorreactor de produccion si su crecimiento en el biorreactor de siembra, a la temperatura de la fase inicial de crecimiento, fuera suficiente para que la densidad de celulas viables en el biorreactor de produccion en el momento de su inoculacion ya estuviera al porcentaje deseado de la densidad celular viable maxima. El facultativo de la presente invencion sera capaz de escoger la duracion de la fase inicial de crecimiento dependiendo las necesidades de produccion del polipeptido o protema y las necesidades propias de las celulas.
El cultivo celular se puede agitar o remover durante la fase inicial de cultivo con el fin de aumentar la oxigenacion y la dispersion de nutrientes a las celulas. De acuerdo con la presente invencion, un experto habituado en la tecnica entendera que puede ser beneficioso controlar o regular ciertas condiciones internas del biorreactor durante la fase
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inicial de crecimiento, incluyendo, pero sin limitacion, el pH, temperatura, oxigenacion, etc. Por ejemplo, se puede controlar el pH suplementando con una cantidad apropiada de un acido o una base y la oxigenacion se puede controlar con dispositivos de aireacion que se conocen bien en la tecnica.
Cambio de las condiciones de cultivo
De acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion, al final de la fase inicial de crecimiento, se puede cambiar al menos una de las condiciones del cultivo de forma que se aplica un segundo grupo de condiciones de cultivo y se produce un cambio metabolico en el cultivo. La acumulacion de metabolitos inhibidores, sobre todo principalmente amonio y lactato, inhibe el crecimiento. Un cambio metabolico se consigue, por ejemplo, por un cambio en la temperatura, pH, osmolalidad o nivel de inductores qmmicos del cultivo celular, se puede caracterizar por una reduccion en la relacion de la tasa espedfica de produccion de lactato con respecto a la tasa espedfica de consumo de glucosa. En una realizacion no limitante, las condiciones del cultivo se cambian cambiando la temperatura del cultivo. Sin embargo, como se conoce en la tecnica, el cambio de temperatura no es el unico mecanismo por el cual se puede conseguir un cambio metabolico apropiado. Por ejemplo, dicho cambio metabolico tambien se puede conseguir cambiando otras condiciones del cultivo que incluyen, pero no se limitan a, pH, osmolalidad, y niveles de butirato sodico. Como se ha tratado anteriormente, el momento del cambio de cultivo lo determinara el facultativo de la presente invencion, basandose en las necesidades de produccion del polipeptido o protema o las necesidades propias de las celulas.
Cuando se cambia la temperatura del cultivo, el cambio de temperatura puede ser relativamente gradual. Por ejemplo, puede tomar varias horas o dfas para completar el cambio de temperatura. De manera alternativa, el cambio de temperatura puede ser relativamente brusco. Por ejemplo, el cambio de temperatura puede completarse en menos de varias horas. Con el equipo de produccion y control apropiado, tal como es convencional en la produccion comercial de polipeptidos o protemas a gran escala, se puede completar el cambio de temperatura incluso en menos de una hora.
La temperatura del cultivo celular en la fase de crecimiento posterior se seleccionara basandose primariamente en el intervalo de temperaturas al que el cultivo celular se mantiene viable y expresa los polipeptidos o protemas recombinantes a niveles adecuados comercialmente. En general, la mayona de las celulas de mairnfero se mantienen viables y expresan polipeptidos o protemas recombinantes a niveles adecuados comercialmente en un intervalo de aproximadamente 25 °C a 42 °C. Preferentemente, las celulas de mamffero se mantienen viables y expresan polipeptidos o protemas recombinantes a niveles adecuados comercialmente en un intervalo de 25 °C a 35 °C. Los expertos habituados en la tecnica seran capaces de seleccionar una temperatura o temperaturas adecuadas en las que crecen las celulas, dependiendo de las necesidades de las celulas y las necesidades de produccion del facultativo.
En una realizacion de la presente invencion, la temperatura de la fase de crecimiento posterior se mantiene como una unica temperatura constante. En otra realizacion, la temperatura de la fase de crecimiento posterior se mantiene en un intervalo de temperaturas. Por ejemplo, la temperatura se puede aumentar o disminuir gradualmente durante la fase de crecimiento posterior. De manera alternativa, la temperatura se puede aumentar o disminuir en cantidades distintas en varios momentos durante la fase de crecimiento posterior. Un experto habituado en la tecnica entendera que los cambios individuales multiples se engloban en esta realizacion. Por ejemplo, la temperatura se puede cambiar una vez, las celulas se mantienen a esta temperatura o intervalo de temperaturas durante un cierto periodo de tiempo, tras el cual la temperatura se puede cambiar de nuevo -a una temperatura mayor o menor. La temperatura del cultivo despues de cada cambio individual puede ser constante o puede mantenerse en un cierto intervalo de temperaturas.
En el Ejemplo 16, se muestran datos que demuestran la eficacia del empleo de dos cambios de temperatura sucesivos, aunque se entendera por los expertos habituados en la tecnica que de acuerdo con la presente invencion, se pueden utilizar tres o mas cambios de temperatura sucesivos para aumentar la viabilidad o densidad celular y/o aumentar la expresion de polipeptidos o protemas recombinantes. La temperatura o intervalo de temperaturas del cultivo celular despues de cada cambio de temperatura sucesivo puede ser mayor o menor que la temperatura o intervalo de temperaturas que precedfa al cambio. En una realizacion de la presente invencion, cada temperatura o intervalo de temperaturas sucesivos es mas baja que la temperatura o intervalo de temperaturas precedente.
Fase de produccion posterior
De acuerdo con la presente invencion, una vez que se han cambiado las condiciones del cultivo celular como se ha tratado anteriormente, el cultivo celular se mantiene en la fase de produccion posterior en un segundo grupo de condiciones de cultivo que contribuyen a la supervivencia y viabilidad del cultivo celular y apropiado para la expresion del polipeptido o protema deseados a niveles adecuados comercialmente.
Como se ha tratado anteriormente, el cultivo se puede cambiar cambiando una o mas de varias condiciones de cultivo, que incluyen, pero no se limitan a, temperatura, pH, osmolalidad, y niveles de butirato sodico. En una realizacion, la temperatura del cultivo se cambia. De acuerdo con esta realizacion, durante la fase de produccion
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posterior, el cultivo se mantiene a una temperatura o intervalo de temperaturas que es menor que la temperatura o intervalo de temperaturas de la fase inicial de crecimiento. Por ejemplo, durante la fase de produccion posterior, las celulas CHO expresan bien los polipeptidos y protemas recombinantes en un intervalo de 25 °C a 35 °C. Como se ha tratado anteriormente, se pueden emplear multiples cambios individuales de temperatura para aumentar la densidad o viabilidad celular o para aumentar la expresion del polipeptido o protema recombinantes.
De acuerdo con la presente invencion, las celulas se pueden mantener en la fase de produccion posterior hasta que se alcance una densidad celular o un tftulo de produccion que se desee. En una realizacion, las celulas se mantienen en la fase de produccion posterior hasta que el tftulo del polipeptido o protema recombinantes alcanzan un maximo. En otras realizaciones, el cultivo se puede recolectar antes de este punto, dependiendo de las necesidades de produccion del facultativo o las necesidades propias de las celulas. Por ejemplo, las celulas pueden mantenerse durante un periodo de tiempo suficiente para alcanzar una densidad celular viable de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 por ciento de la densidad celular viable maxima. En algunos casos, puede ser deseable permitir que la densidad celular viable alcance un maximo, y luego se permite que la densidad celular viable decline hasta cierto nivel antes de recolectar el cultivo. En un ejemplo extremo, puede ser deseable permitir que la densidad celular viable se aproxime o alcance el cero antes de recolectar el cultivo.
En otra realizacion de la presente invencion, se permite que las celulas crezcan durante un periodo definido de tiempo durante la fase de produccion posterior. Por ejemplo, dependiendo de la concentracion del cultivo celular al inicio de la fase de crecimiento posterior, la temperatura a la que se cultivan las celulas, y la tasa de crecimiento intrmseco de las celulas, se pueden cultivar las celulas durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ll, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o mas dfas. En algunos casos, se permite que las celulas crezcan durante un mes o mas. El facultativo de la presente invencion sera capaz de escoger la duracion de la fase de produccion posterior dependiendo de las necesidades de produccion del polipeptido o la protema y las necesidades propias de las celulas.
En ciertos casos, puede ser necesario suplementar el cultivo celular durante la fase de produccion posterior con nutrientes u otros componentes del medio que se hayan agotado o metabolizado por las celulas. Por ejemplo, puede ser ventajoso suplementar el cultivo celular con nutrientes u otros componentes del medio que se haya observado que se han agotado durante el control del cultivo celular (vease, la seccion posterior 'Control de las condiciones de cultivo'). De manera alternativa o adicionalmente, puede ser beneficioso o necesario suplementar el cultivo celular antes de la fase de produccion posterior. Como ejemplos no limitantes, puede ser beneficioso o necesario suplementar el cultivo celular con hormonas y/u otros factores de crecimiento, iones particulares (tales como sodio, cloruro, calcio, magnesio, y fosfato), tampones, vitaminas, nucleosidos o nucleotidos, elementos traza (compuestos inorganicos presentes habitualmente en concentraciones finales muy bajas), aminoacidos, ftpidos, o glucosa u otra fuente de energfa.
Estos componentes suplementarios se pueden anadir al cultivo celular todos al mismo tiempo, o se pueden proporcionar al cultivo celular en una serie de adiciones. En una realizacion de la presente invencion, los componentes suplementarios se proporcionan al cultivo celular en multiples veces en cantidades proporcionales. En otra realizacion, puede ser deseable proporcionar solo ciertos de los componentes suplementarios inicialmente, y proporcionar los componentes restantes en un momento posterior. En otra realizacion mas de la presente invencion, el cultivo celular se alimenta continuamente con estos componentes suplementarios.
De acuerdo con la presente invencion, el volumen total que se anade al cultivo celular debena mantenerse optimamente en la cantidad minima. Por ejemplo, el volumen total del medio o solucion que contiene los componentes suplementarios que se anaden al cultivo celular puede ser del 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 % del volumen del cultivo celular antes de proporcionar los componentes suplementarios.
El cultivo celular se puede agitar o remover durante la fase de produccion posterior con el fin de aumentar la oxigenacion y la dispersion de nutrientes a las celulas. De acuerdo con la presente invencion, un experto habituado en la tecnica entendera que puede ser beneficioso controlar o regular ciertas condiciones internas del biorreactor durante la fase de crecimiento posterior, que incluyen pero no se limitan a pH, temperatura, oxigenacion, etc. Por ejemplo, el pH puede controlarse suplementando una cantidad apropiada de un acido o una base y la oxigenacion se puede controlar con dispositivos de aireacion que se conocen bien en la tecnica.
Control de las condiciones de cultivo
En ciertas realizaciones de la presente invencion, el facultativo puede encontrar beneficioso o necesario controlar periodicamente las condiciones particulares de crecimiento del cultivo celular. Controlar las condiciones del cultivo celular permite al facultativo determinar si el cultivo celular esta produciendo polipeptido o protema recombinante a niveles suboptimos o si el cultivo va a entrar en una fase de produccion suboptima. Con el fin de controlar ciertas condiciones del cultivo celular, sera necesario retirar pequenas aftcuotas del cultivo para analizarlas. Un experto habituado en la tecnica entendera que tal retirada potencialmente puede introducir contaminacion en el cultivo celular, y tendra que tener el cuidado apropiado para minimizar el riesgo de dicha contaminacion.
Como ejemplo no limitante, puede ser beneficioso o necesario controlar la temperatura, pH, densidad celular, viabilidad celular, densidad integrada de celulas viables, niveles de lactato, niveles de amonio, osmolaridad, o tftulo
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del polipeptido o protema que se expresa. Se conocen bien numerosas tecnicas en la tecnica que permitiran a un experto habituado en la tecnica medir estas condiciones. Por ejemplo, se puede medir la densidad celular utilizando un hemocitometro, un contador Coulter, o el examen de densidad celular (CEDEX). La densidad celular viable se puede determinar tinendo una muestra de cultivo con azul Tripano. Como solo las celulas muertas captan el azul tripano, se puede determinar la densidad celular viable contando el numero total de celulas, dividiendo el numero de celulas que captan el colorante por el numero total de celulas, tomar el redproco. Se puede utilizar una HPLC para determinar los niveles de lactato, amonio o el polipeptido o protema que se expresa. De manera alternativa, el nivel de polipeptido o protema que se expresa se puede determinar por tecnicas de biologfa molecular convencionales tales como la tincion con Coomassie de geles de SDS-PAGE, transferencia de Western, ensayos de Bradford, ensayos de Lowry, ensayos de Biuret, y absorbancia UV. Tambien puede ser ventajoso o necesario controlar las modificaciones post-traduccionales del polipeptido o protema que se expresa, incluyendo la fosforilacion y glicosilacion.
Aislamiento del polipeptido que se expresa
En general, ffpicamente sera deseable aislar y/o purificar las protemas o polipeptidos que se expresan de acuerdo con la presente invencion. En una realizacion preferida, el polipeptido o protema que se expresa se segrega en el medio y por lo tanto se pueden retirar las celulas y otros solidos, por centrifugacion o filtrado por ejemplo, como una primera etapa del proceso de purificacion. Esta realizacion es particularmente util cuando se utiliza de acuerdo con la presente invencion, ya que los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento dan como resultado un aumento de la viabilidad celular. Como resultado, pocas celulas mueren durante el proceso de cultivo, y se liberan menos enzimas proteoffticas en el medio que pueden disminuir potencialmente el rendimiento del polipeptido o protema que se expresa.
De manera alternativa, el polipeptido o protema que se expresa se une a la superficie de una celula huesped. En esta realizacion, los medios se retiran y las celulas huesped que expresan el polipeptido o protema se lisan como una primera etapa del proceso de purificacion. La lisis de las celulas huesped de mairfffero se puede conseguir por cualquiera de los distintos medios bien conocidos por los expertos habituados en la tecnica, incluyendo la destruccion ffsica con perlas de cristal y la exposicion a condiciones de alto pH.
El polipeptido o protema se puede aislar y purificar por procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, cromatograffa (por ejemplo, cromatograffa de intercambio ionico, afinidad, exclusion por tamano, e hidroxiapatita), filtracion centrifugacion en gel, o solubilidad diferencial, precipitacion en etanol o por cualquier otra tecnica disponible para la purificacion de protemas (Vease, por ejemplo, Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2a Edicion, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, S.J. y Hames, B.D. (eds.), Protein Expression : A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; y Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein Purification : Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol. 182), Academic Press, 1997, las cuales se incorporan en el presente documento por referencia). Para la cromatograffa de inmunoafinidad en particular, la protema se puede aislar uniendola a una columna de afinidad que comprende anticuerpos que se pueden generar contra esa protema y se fija en un soporte estatico. De manera alternativa, se pueden unir marcadores de afinidad tales como una secuencia de envoltura de gripe, poli-histidina, o glutation-S-transferasa a la protema por tecnicas recombinantes convencionales para permitir una facil purificacion por pasajes por la columna de afinidad apropiada. Se pueden anadir inhibidores de proteasas tales como fluoruro de fenil metil sulfonilo (PMSF), leupeptina, pepstatina o aprotinina en cualquiera o todos los estadios con el fin de reducir o eliminar la degradacion del polipeptido o protema durante el proceso de purificacion. Los inhibidores de proteasas se desean particularmente cuando las celulas se tienen que lisar con el fin de aislar y purificar el polipeptido o protema que se expresa. Un experto habituado en la tecnica apreciara que la tecnica de purificacion exacta variara dependiendo del caracter del polipeptido o la protema que se va a purificar, el caracter de las celulas en las que se expresa el polipeptido o protema, y la composicion del medio en el que se cultivan las celulas.
Formulaciones farmaceuticas
En ciertas realizaciones preferidas de la invencion, los polipeptidos o protemas producidos tendran una actividad farmacologica y seran utiles en la preparacion de productos farmaceuticos. Las composiciones inventivas que se describen anteriormente se pueden administrar en un sujeto o se pueden formular para suministrarse por cualquier via disponible que incluye, pero no se limita a las vfas parenteral (por ejemplo, intravenosa), intradermica, subcutanea, oral, nasal, bronquial, oftalmica, transdermica (topica), transmucosa, rectal y vaginal. Las composiciones farmaceuticas inventivas incluyen ffpicamente un polipeptido o protema purificados que se expresa en una lmea celular de mairfffero, un agente de suministro (es decir, un poffmero cationico, un transportador pepffdico molecular, un tensioactivo, etc., como se ha descrito anteriormente) en combinacion con un vehffculo farmaceuticamente aceptable. Como se utiliza en el presente documento la expresion “vehffculo farmaceuticamente aceptable” incluye disolventes, medios de dispersion, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y de absorcion retardada, y similares, compatibles con la administracion farmaceutica. Tambien se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones.
Una composicion farmaceutica se formula para que sea compatible con la via de administracion que se pretende. Las soluciones o suspensiones que se utilizan para la aplicacion parenteral, intradermica, o subcutanea pueden
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incluir los siguientes componentes: un diluyente esteril tal como agua para inyeccion, solucion salina, aceites no volatiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sinteticos; agentes antibacterianos tales como el alcohol bendlico o metilparabenos; antioxidantes tales como el acido ascorbico o bisulfito sodico; agentes quelantes tales como el acido etilendiaminotetraacetico; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como el cloruro sodico o dextrosa. El pH se puede ajustar con acidos o bases, tales como acido clorddrico o hidroxido sodico. La preparacion parenteral se puede meter en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis multiples fabricados en cristal o plastico.
Las composiciones farmaceuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen tfpicamente soluciones acuosas esteriles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. Para la administracion intravenosa, los vedculos adecuados incluyen solucion salina fisiologica, agua bacteriostatica, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solucion fosfato tamponada (PBS). En todos los casos, la composicion debena ser esteril y debena ser fluida hasta el extremo en que se pueda administrar con una jeringa. Las formulaciones farmaceuticas preferidas son estables en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y se deben conservar contra la accion contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. En general, el vedculo relevante puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol lfquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, por el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamano de partmula necesario en el caso de dispersion y por el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de microorganismos se puede conseguir mediante distintos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, los parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, sera preferible incluir en la composicion, agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro sodico. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr incluyendo en la composicion un agente que retarde la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables esteriles se pueden preparar incorporando el polipeptido o protema purificados en una cantidad necesaria en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de los ingredientes que se han enumerado anteriormente, segun se necesite, seguido por esterilizacion por filtracion. En general, las dispersiones se preparan incorporando el polipeptido o protemas purificados que se expresan a partir de una lmea celular de marnffero en un vedculo esteril que contienen un medio de dispersion basico y otros ingredientes necesarios de entre los que se han enumerado anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los procedimientos preferidos de preparacion son el secado al vado y el secado por congelacion que da como resultado un polvo del principio activo mas cualquier ingrediente adicional que se desee a partir de una solucion previamente esterilizada por filtracion del mismo.
Las composiciones orales incluyen un diluyente inerte o un vedculo comestible. Con el fin de la administracion terapeutica oral, el polipeptido o protema purificados se pueden incorporar con excipientes y utilizarse en forma de tabletas, trociscos, o capsulas, por ejemplo, capsulas de gelatina. Las composiciones orales tambien se pueden preparar utilizando un vedculo fluido para su uso como un enjuague bucal. Se pueden incluir agentes de union farmaceuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes como parte de la composicion. Los comprimidos, pfldoras, capsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como la celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidon o lactosa, un agente desintegrante tal como el acido algmico, Primogel, o almidon de mafz, un lubricante tal como el estearato magnesico o Esterotes; una sustancia de deslizamiento tal como dioxido de silicio coloidal, un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo, o saborizante de naranja. Las formulaciones para suministro oral pueden incorporar ventajosamente agentes para mejorar la estabilidad en el tracto gastrointestinal y/o aumentar la absorcion.
Para la administracion por inhalacion, las composiciones inventivas comprenden un polipeptido o protema purificados que se expresan a partir de una lmea celular de mamffero y un agente de suministro se suministran preferentemente en forma de un pulverizador en aerosol a partir de un envase presurizado o un dispensador que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como el dioxido de carbono, o un nebulizador. La presente invencion contempla particularmente el suministro de las composiciones que utiliza un pulverizador nasal, inhalador, u otro suministro directo en las vfas aereas superiores e inferiores. La administracion de vacunas ADN dirigidas contra los virus de gripe han demostrado que inducen respuestas de linfocitos T CD8, lo que indica que al menos algunas celulas en el tracto respiratorio pueden captar aDn cuando se suministra por esta via, y los agentes de suministro de la invencion aumentaran la captacion celular. De acuerdo con ciertas realizaciones de la invencion, las composiciones que comprenden un polipeptido purificado que se expresa a partir de una lmea celular de mairnfero y un agente de suministro se formulan como grandes partmulas porosas para la administracion en aerosol.
La administracion sistemica tambien puede ser por medio transmucoso o transdermico. Para la administracion transmucosa o transdermica, se utilizan en la formulacion, penetrantes apropiados para la barrera que se va a atravesar. Dichos penetrantes se conocen en general en la tecnica, e incluyen, por ejemplo, para la administracion transmucosa, detergentes, sales biliares, y derivados del acido fusfdico. La administracion transmucosa se puede conseguir por medio del uso de pulverizadores nasales o supositorios. Para la administracion transdermica, el polipeptido o protema purificados y los agentes de suministro se formulan en unguentos, pomadas, geles o cremas y
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se conocen en general en la tecnica.
Las composiciones se pueden preparar tambien en forma de supositorios (por ejemplo, con bases convencionales de supositorios tales como manteca de coco y otros gliceridos) o de enemas de retencion para suministro rectal.
En una realizacion, las composiciones se preparan con vehmulos que protegeran el polipeptido o protema contra la rapida eliminacion del cuerpo, tal como una formulacion de liberacion controlada, que incluye implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar polfmeros biocompatibles, biodegradables, tales como acetato de etileno vinilo, polianlddridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres, y acido polilactico. Los procedimientos para la preparacion de dichas formulaciones seran aparentes para los expertos en la tecnica. Los materiales se pueden obtener tambien comercialmente en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Tambien se pueden utilizar suspensiones liposomicas (que incluyen liposomas dirigidos a celulas infectadas con anticuerpos monoclonales contra antigenos vmcos) como vedculos farmaceuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo con los procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de EE. UU. N° 4.522.811.
Es ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificacion para facilitar la administracion y la uniformidad de la dosificacion. La forma de unidad de dosificacion como se utiliza en el presente documento se refiere a unidades ffsicamente separadas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se va a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del polipeptido o protema activos que se calcula para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vedculo farmaceutico necesario.
El polipeptido o protema que se expresa de acuerdo con la presente invencion se puede administrar en varios intervalos y durante diferentes periodos de tiempo segun se necesite, por ejemplo, una vez por semana durante entre aproximadamente 1 a 10 semanas, entre 2 a 8 semanas, entre aproximadamente 3 a 7 semanas, aproximadamente 4, 5, o 6 semanas, etc. El experto apreciara que hay ciertos factores que pueden tener influencia en la dosificacion y tiempo necesarios para tratar eficazmente a un sujeto, que incluyen pero no se limitan a la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades que esten presentes. En general, el tratamiento de un sujeto con un polipeptido o protema como se describe en el presente documento puede incluir un unico tratamiento o, en muchos casos, puede incluir una serie de tratamientos. Se entiende ademas que las dosis apropiadas pueden depender de la potencia del polipeptido o protema y puede opcionalmente hacerse a medida del receptor particular, por ejemplo, mediante la administracion de dosis crecientes hasta que se alcanza una respuesta deseada que se hada preseleccionado. Se entiende que el nivel de dosis espedfica para cualquier sujeto animal particular puede depender de una variedad de factores que incluyen la actividad del polipeptido o protema espedficos que se empleen, la edad, el peso corporal, la salud general, el genero y la dieta del sujeto, el tiempo de administracion, la via de administracion, la tasa de excrecion, cualquier combinacion farmacologica, y el grado de expresion o actividad que se va a modular.
La presente invencion incluye el uso de las composiciones inventivas para el tratamiento de animales no humanos. En consecuencia, las dosis y procedimientos de administracion se pueden seleccionar de acuerdo con los principios conocidos de farmacologfa y medicina veterinaria. Se puede encontrar una grna, por ejemplo, en Adams, R. (ed.), Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 8a edicion, Iowa State University Press; ISBN: 0813817439; 2001.
Las composiciones farmaceuticas inventivas se pueden incluir en un envase, paquete, o dispensador junto con instrucciones para la administracion.
Se tiene que entender que la descripcion anterior es solamente representativa y no pretende ser limitante. Seran evidentes para el experto en la tecnica procedimientos y materiales alternativos para implementar la invencion y tambien aplicaciones adicionales, y se pretende que se incluyan en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1: Medio 1 aumentado por un proceso semi-continuo de anti-GDF-8
Los procesos semi-continuos tradicionales para cultivar lmeas celulares tienen varios obstaculos que incluyen el tiempo y el esfuerzo necesarios para administrar las alimentaciones y la necesidad de equipamiento especial en los biorreactores a gran escala. El objetivo era desarrollar un medio discontinuo para la produccion de las protemas de interes en biorreactores a gran escala que necesite alimentaciones mmimas.
Materiales y procedimientos
CEPAS Y MEDIOS: Se modificaron celulas de ovario de hamster chino (“CHO”) para expresar un anticuerpo monoclonal contra el factor de crecimiento y diferenciacion 8 (celulas “anti-GDF-8”) (vease Veldman y col., Neutralizing Antibodies Against GDF-8 and Uses Therefor, documento US20040142382 A1). Las celulas anti-GDF-8 se utilizaron para ensayar un nuevo medio discontinuo. Se compararon el Medio 1 y el Medio 2 en cuanto a su capacidad para soportar una alta densidad y viabilidad celular. Las composiciones de estos medios, asf como el Medio 3 se enumeran en la Tabla 1. Los medios se prepararon anadiendo todos los componentes excepto FeSO4'7H2O. Los medios se ajustaron entonces a un pH de 7,25, se registro la osmolaridad y se anadio entonces el
FeSO4-7H2O.
CONDICIONES DE CULTIVO: Para los experimented en matraz, las celulas anti-GDF-8 se cultivaron en matraces con agitado y se hicieron tres pasajes. Para los experimented en biorreactor, las celulas anti-GDF-8 se cultivaron en los medios durante 12 dfas, se suplementaron diariamente con un 2% por volumen de 20x del medio de 5 alimentacion Medio 4 (Tabla 3) o un 3 % por volumen de 16x de Medio 4 (Tabla 4) despues del dfa 5. Los primeros 4 dfas, las celulas se cultivaron a 37 °C. El d^a 5, las celulas se cambiaron a 31 °C.
ANALISIS DE LAS MUESTRAS: Se tomaron muestras de los cultivos diariamente y se analizaron en cuanto a los niveles de aminoacidos, vitaminas, hierro, fosfato, glucosa y glutamina.
Tabla 1. Composiciones del Medio 1, Medio 2 y Medio 3.
Medio 1 Medio 2 Medio 3
Aminoacidos
mg/l mM mg/l mM mg/l mM
alanina
96,03 1,08 17,80 0,20 24,87 0,28
arginina
1186,99 6,82 347,97 2,00 423,43 2,43
asparaginaH2O
713,59 4,76 75,00 0,50 173,90 1,16
Acido aspartico
318,53 2,39 26,20 0,20 52,72 0,40
Cistema-HCl^O
70,01 0,40 70,19 0,40 70,01 0,40
cistina2HCl
297,09 0,95 62,25 0,20 62,09 0,20
Acido glutamico
158,59 1,08 29,40 0,20 41,08 0,28
glutamina
1892,40 12,96 1163,95 7,97 1162,40 7,96
glicina
95,88 1,28 30,00 0,40 35,92 0,48
HistidinaHClH2O
369,10 1,76 46,00 0,22 75,27 0,36
isoleucina
623,63 4,76 104,99 0,80 151,90 1,16
leucina
852,31 6,51 104,99 0,80 172,69 1,32
lisinaHCl
945,96 5,20 145,99 0,80 218,38 1,20
metionina
291,82 1,96 29,80 0,20 53,55 0,36
fenilalanina
428,62 2,60 65,99 0,40 98,81 0,60
prolina
372,25 3,24 68,99 0,60 96,40 0,84
serina
904,71 8,62 126,00 1,20 273,07 2,60
treonina
513,39 4,31 94,99 0,80 132,81 1,12
triptofano
159,32 0,78 16,00 0,08 28,99 0,14
tirosina-2Na-2H2O
560,81 2,15 103,79 0,40 145,10 0,56
valina
505,36 4,32 93,99 0,80 131,17 1,12
Vitaminas
mg/l pM mg/l pM mg/l pM
biotina
2,00 8,21 0,20 0,82 0,36 1,49
Pantotenato calcico
22,02 46,27 2,24 4,71 4,03 8,47
Cloruro de colina
87,67 630,74 8,98 64,60 16,11 115,92
Acido folico
25,95 58,84 2,65 6,01 4,76 10,80
inositol
123,39 685,47 12,60 69,99 22,64 125,79
Medio 1 Medio 2 Medio 3
Vitaminas
mg/l mm mg/l mM mg/l mM
nicotinamida
19,60 160,70 2,02 16,56 3,61 29,62
piridoxalHCI
1,99 9,83 2,00 9,85 1,99 9,83
piridoxinaHCI
18,06 87,67 0,03 0,15 1,67 8,10
riboflavina
2,20 5,85 0,22 0,59 0,40 1,06
tiaminaHCI
21,51 63,84 2,17 6,44 3,92 11,64
vitamina B12
6,93 5,12 0,78 0,58 1,34 0,99
Sales inorganicas
mg/l mM mg/l mM mg/l mM
CaCl2
115,78 1,04 116,09 1,05 115,78 1,04
KCl
310,94 4,17 311,77 4,18 310,94 4,17
Na2HPO4
70,81 0,50 70,99 0,50 70,81 0,50
NaCI
1104,96 18,92 5539,00 94,85 3704,96 63,44
NaH2PO4H2O
636,33 4,61 62,49 0,45 114,33 0,83
MgSO4
48,70 0,41 48,83 0,41 48,70 0,41
MgSO4-7H2O
0,03 95,00 8,60 95,00
MgCl2
28,53 0,30 28,61 0,30 28,53 0,30
NaHCO3
2000,00 23,81 2440,00 29,04 2440,00 29,04
Elementos traza
Mg/l nM Mg/l nM Mg/l nM
Selenito sodico
28,00 161,94 5,00 28,92 7,00 40,49
Fe(NO3)3'9H2O
49,86 123,42 50,00 123,75 49,86 123,42
CUSO4
2,69 16,80 0,80 5,00 0,97 6,06
CUSO45H2O
11,24 45,00 7,49 30,00
FeSO4-7H2O
2503,85 9006,64 839,96 3021,45 1542,85 5549,81
ZnSO4-7H2O
2734,77 9528,82 429,96 1498,12 1383,80 4821,59
MnSO4H2O
0,26 1,51 0,17 1,01
Na2SiO39H2O
210,00 739,27 140,00 492,84
(NH4)6MoyO24'4H2O
1,86 1,50 1,24 1,00
NH4VO3
0,98 8,33 0,65 5,56
NiSO46H2O
0,20 0,74 0,13 0,49
SnCI22H2O
0,18 0,80 0,12 0,53
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Medio 1 Medio 2 Medio 3
Otros Componentes
mg/l pM mg/l pM mg/l pM
Hidrocortisona
0,23 0,64 0,04 0,10 0,09 0,24
Putrescina2HCl
6,48 40,22 1,08 6,70 2,48 15,39
Acido linoleico
0,22 0,80 0,04 0,14 0,06 0,20
Acido tioctico
0,56 2,73 0,10 0,49 0,14 0,69
D-glucosa (Dextrosa)
16039,43 89107,92 6150,72 34170,64 11042,24 61345,76
PVA
2560,00 2400,00 2520,00
Insulina
54,00 10,00 14,00
Piruvato sodico
54,85 498,63 55,00 499,95 54,85 498,63
Resultados y conclusiones
La Figura 1 muestra que la tasa de crecimiento de las celulas anti-GDF-8 era similar tanto en el Medio 1 como en el Medio 2 en los experimented en matraz.
La Figura 2 muestra que en los biorreactores, el Medio 1 presentaba un aumento significativo en la densidad y viabilidad celular final sobre el Medio 3. El tttulo final tambien aumentaba significativamente, desde 551 mg/l para el proceso en plataforma a 976 mg/l con el Medio 1 (datos no mostrados). La temperatura se cambio de 37 °C a 31 °C el dfa 5. Debido al inesperado crecimiento celular, los cultivos se alimentaron diariamente despues del dfa 5 con o un 2% por volumen de 20x de Medio 4 o un 3% por volumen de 16x de Medio 4. Por lo tanto esto no es un verdadero experimento discontinuo como se pretendfa originalmente. Se suplemento con asparagina y tiamina en los medios de alimentacion comenzando el dfa 10.
En el desarrollo de un medio discontinuo concentrado, se tienen que considerar varios problemas. Primero, los nutrientes concentrados pueden ser toxicos para las celulas. En el medio desarrollado en el presente Ejemplo, todos los nutrientes y componentes se determinaron para que estuvieran por debajo de los lfmites de toxicidad (datos no mostrados).
Segundo, el medio discontinuo concentrado tiene necesariamente una osmolaridad mas alta que los medios no concentrados, la cual ha demostrado tener efectos perjudiciales sobre el crecimiento y viabilidad celulares. Este problema se puede sortear bajando la cantidad de NaCl en los medios de partida. Ademas, los medios discontinuos concentrados contienen niveles insuficientes de glucosa para sostener el crecimiento durante el periodo de cultivo completo. Por lo tanto, los cultivos se suplementaron diariamente tras el dfa 5 con una alimentacion de glucosa.
Tercero, la insulina y la glutamina son susceptibles a la degradacion durante el dfa 12 del periodo de cultivo. Por lo tanto, el cultivo se suplemento con estos componentes ademas de la glucosa.
Finalmente, el hierro precipitara fuera de una solucion que contenga altas concentraciones de fosfato y pH alto. Este problema puede sortearse anadiendo hierro al final del proceso de preparacion del medio, despues de que el pH se haya ajustado a un nivel apropiado.
Ejemplo 2: Desarrollo del medio de alimentacion concentrado (Medio 5) para las celulas anti-GDF-8 en un proceso semi-continuo
En el Ejemplo 1, se desarrollo un proceso discontinuo para cultivar las celulas anti-GDF-8 utilizando el Medio 1. Debido a la alta densidad celular que resultaba durante el proceso, se determino que sena ventajosa la suplementacion de nutrientes ademas de la glucosa y la glutamina. Sin embargo, la suplementacion del lote con 8x de Medio 4 resultana en una excesiva dilucion del cultivo. Se desarrollaron medios de alimentacion mas concentrados con el fin de sortear este problema.
Materiales y procedimientos y resultados
La tabla 2 enumera las composiciones del Medio 4A-1, Medio 4B, Traza B y Traza D que se utilizaron en las formulaciones de las Tablas 3-7.
Tabla 2. Composiciones del Medio 4A-1, Medio 4B, Traza B y Traza D que se utiliza en las formulaciones de las
Tablas 3-7.
Medio 4A-1 Medio 4B Elementos Traza B Elementos Traza D
Aminoacidos
mg/l mM mg/l mM mg/l mM mg/l mM
alanina
17,80 0,20
arginina
191,00 1,10
asparaginaH2O
135,00 0,90
Acido aspartico
66,50 0,50
Acido glutamico
29,40 0,20
glicina
15,00 0,20
HistidinaHClH2O
73,50 0,35
isoleucina
118,00 0,90
leucina
170,00 1,30 1,30
lisinaHCl
182,00 1,00
metionina
59,60 0,40
fenilalanina
82,50 0,50
prolina
69,00 0,60
serina
158,00 1,50
treonina
95,20 0,80
triptofano
32,60 0,16
tirosina-2Na-2H2O
104,00 0,40
valina
93,60 0,80
Vitaminas
mg/l mM mg/l mM mg/l mM mg/l mM
biotina
0,41 1,68
Pantotenato calcico
4,50 9,45
Cloruro de colina
17,90 128,78
Acido folico
5,30 12,02
inositol
25,20 140,00 140,00
nicotinamida
4,00 32,79
piridoxinaHCl
4,10 19,90
riboflavina
0,45 1,20
tiaminaHCl
4,40 13,06
vitamina B12
1,40 1,03
Medio 4A-1 Medio 4B Elementos Traza B Eiementos Traza D
Elementos traza
Mg/i nM mg/l mm Mg/i nM Mg/i nM
(NH4)aMoyO24-4H2O
1,24 1,00
CUSO4
0,43 2,69
CUSO45H2O
7,49 30,00
FeSO4-7H2O
834 3000
MnSO4H2O
0,17 1,01
Na2SiO3-9H2O
140,00 492,84
NH4VO3
0,65 5,56
MSO46H2O
0,13 0,49
SnCl2-2H2O
0,12 0,53
ZnSO4-7H2O
230,00 801,39 863 3007
Otros Componentes
Mg/i nM Mg/i nM Mg/i nM Mg/i nM
Acido linoleico
42,00 0,15
Acido tioctico
105,00 0,51
D-glucosa (Dextrosa)
1000000 5555,56
1. 20x de Medio 4
El primer medio concentrado se desarrollo como 20x de Medio 4. La formulacion del medio para el 20x de Medio 4 5 se proporciona en la Tabla 3.
Tabla 3. Hoja de trabajo del medio de alimentacion 20x de Medio 4.
Parte
Componente Cantidad Unidad
I
Medio 4A-1 31,120 g/l
Nucellin™ 40,000 ml/l
Materia prima H/P 20,000 ml/l
Materia prima Selenito 2,000 ml/l
PVA 2,400 g/l
NaH2PO4H2O 2,610 g/l
MgSO4-7H2O 0,430 g/l
Acido apartico 1,330 g/l
Acido glutamico 0,588 g/l
Acido linoleico 0,840 ml/l
Acido tioctico 2,100 ml/l
Tirosina 2Na (Pm 225) 1,790 g/l
Parte
Componente Cantidad Unidad
1000x de Traza B 6,000 ml/l
Glucosa 100,000 g/l
Glutamina 14,600 g/l
pH a 7,0
Osmolaridad registrada 1064,000 mOsm
II
Cistema (400 mM) Anadir 108 ml de Traza D, 0,25 g FeSO4-7H2O a 280 ml de Materia prima de Cistema
III
Acido folico 720 ml de acido folico 6 mM
Nota: Nucellin™ esta fabricado por Eli Lilly (Indianapolis, IN, USA); materia prima de H/P = 0,036 mg/ml de hidrocortisona, 1,08 mg/ml Putrescina 2HCl,
La formulacion del medio consiste en tres partes: I, II, III. La parte I es la version concentrada de 8x de Medio 4 con los componentes individuales del Medio 4B excepto el acido folico debido a los problemas de solubilidad de esta 5 vitamina. La Parte II es materia prima de hierro, Traza D y cistema acida, para evitar una posible precipitacion del hierro si se anade en la parte I. La parte III es materia prima de acido folico. La parte I se anade en un 2 % por volumen diariamente comenzando el dfa 5 y las partes II y III se anaden una vez el dfa 5 junto con la Parte I.
El pH final del medio de alimentacion se ajusto a 7,0 y la osmolaridad era aproximadamente de 1064 mOsm. Una alimentacion del 2 % dara como resultado un aumento de 2 g/l de glucosa, 2 mM de Glutamina y de la osmolaridad 10 de 14 mOsm en el cultivo
2. 16x de Medio 4
Para reducir el aumento de osmolaridad, el medio de alimentacion se cambio de 20x de Medio 4 (2 % por volumen diariamente) a 16x de Medio 4 (3 % por volumen diariamente). La formulacion del medio para 16x de Medio 4 se proporciona en la Tabla 4.
15 Tabla 4. Hoja de trabajo de medio de 16x de Medio 4.
Parte
Componente Cantidad Unidad
I
Medio 4A-1 24,896 g/l
Nucellin™ 32,000 ml/l
Materia prima H/P 16,000 ml/l
Materia prima Selenito 1,600 ml/l
PVA 2,400 g/l
NaH2PO4H2O 2,088 g/l
MgSO4-7H2O 0,344 g/l
Acido apartico 1,064 g/l
Acido glutamico 0,470 g/l
Acido linoleico 0,672 ml/l
Acido tioctico 1,680 ml/l
Tirosina 2Na (Pm 225) 1,432 g/l
1000x de Traza B 9,000 ml/l
Glutamina 6,280 g/l
Parte
Componente Cantidad Unidad
pH a 7,0
Osmolaridad registrada 295,000 mOsm
II
Cistema (400 mM) Anadir 108 ml de Traza D, 0,25 g FeSO4-7H2O a 280 ml de Materia prima de Cistema
III
Acido folico 720 ml de acido folico 6 mM
Nota: Nucellin™ esta fabricado por Eli Lilly (Indianapolis, IN, USA); materia prima de H/P = 0,036 mg/ml hidrocortisona, 1,08 mg/ml Putrescina2HCl,
En este 16x de Medio 4 modificado, tambien se elimino la glucosa para reducir adicionalmente la osmolaridad y dar alguna flexibilidad a la alimentacion con glucosa. La osmolaridad total del medio de alimentacion es ahora de 295 5 mOsm.
3. 16x de Medio 4
Se hicieron cambios en la formulacion de 16x de Medio 4. La solucion de materia prima de hierro se anadio en la alimentacion dando como resultado una adicion de 0,45 mM en cada alimentacion. Adicionalmente, se anadio glucosa de nuevo para dar una adicion de 1,5 g/l cada alimentacion. La formulacion del medio para este 16x de 10 Medio 4 modificado se proporciona en la tabla 5.
Tabla 5. Hoja de trabajo de medio de alimentacion 16x de Medio 4
Parte
Componente Cantidad Unidad
I
Medio 4A-1 24,896 g/l
Nucellin™ 32,000 ml/l
Materia prima H/P 16,000 ml/l
Materia prima Selenito 1,600 ml/l
PVA 2,400 g/l
NaH2PO4H2O 2,088 g/l
MgSO4-7H2O 0,344 g/l
Acido aspartico 1,064 g/l
Acido Glutamico 0,470 g/l
Acido linoleico 0,672 ml/l
Acido Tioctico 1,680 ml/l
Tirosina 2Na (Pm 225) 1,432 g/l
1000x Traza B 9,000 ml/l
Glucosa 50,000 g/l
Glutamina 7,300 g/l
pH to 7,0
FeSO4-7H2O (materia prima 1 mM) 15,000 ml/l
Osmolaridad registrada 607,000 mOsm
Parte
Componente Cantidad Unidad
II
Acido Folico 720 ml de Acido Folico 6 mM
III
Cistema (400 mM) Anadir 108 ml de Traza D, 0,25 g FeSO4'7H2O a 280 ml de Materia prima de Cistema
Nota: Nucellin™ esta fabricado por Eli Lilly (Indianapolis, IN, USA); materia prima de H/P = 0,036 mg/ml hidrocortisona, 1,08 mg/ml Putrescina-2HCl,
4. 16x de Medio 4
Aqm, el medio de alimentacion (16x de Medio 4) se produjo en medio combinado en vez de 3 alimentaciones 5 separadas como en los ultimos lotes distintos. Se hicieron los ensayos para asegurar que el acido folico se pudiera disolver a la concentracion necesaria y que ni el hierro ni el acido folico precipitaran en la solucion tras el almacenamiento ni a 4 °C ni a temperature ambiente durante 6 d^as. La formulacion del medio para 16x de Medio 4 combinado se proporciona en la Tabla 6.
Tabla 6. Hoja de trabajo del medio de alimentacion 16x de Medio 4.
Componente
Cantidad Unidad
Medio 4A-1
24,896 g/l
Nucellin™
32,000 ml/l
Materia prima H/P
16,000 ml/l
Materia prima Selenito
1,600 ml/l
PVA
2,400 g/l
NaH2PO4H2O
2,088 g/l
MgSO4-7H2O
0,344 g/l
Acido aspartico
1,064 g/l
Acido Glutamico
0,470 g/l
Acido linoleico
0,672 ml/l
Acido Tioctico
1,680 ml/l
Tirosina 2Na (Pm 225)
1,432 g/l
Glucosa
66,700 g/l
Glutamina
7,300 g/l
Acido Folico
70,560 mg/l
Cistema acida (400 mM)
6,250 ml/l
FeSO4'7H2O (materia prima 1 mM)
23,000 ml/l
1000x de Traza B
9,000 ml/l
1000x de Traza D
3,300 ml/l
pH esperado 6,11
Ajustado a 7,0
Osmolaridad registrada
724,000 mOsm
Nota: Nucellin™ esta fabricado por Eli Lilly (Indianapolis, IN, USA) ; materia prima de H/P = 0,036 mg/ml hidrocortisona, 1,08 mg/ml Putrescina 2HCl,
La osmolaridad final de los medios es de 724 mOsm, con una adicion diaria de glucosa de 2 g/l y una adicion de
glutamina de 1,5 mM.
5. 12x de Medio 4
Aqm, se hicieron varios cambios al medio de alimentacion. Se utilizo Medio 4B en polvo en vez de anadir cada 5 ingrediente individual en el Medio 4B. El Medio 4B en polvo se mezclo con glucosa y se disolvio por separado en condiciones basicas titulando la solucion a pH 10,25. Se anadieron asparagina y tiamina adicionales ya que el analisis de aminoacidos y vitaminas mostraba que estos dos componentes estaban agotados al final del proceso semi-continuo. El uso de 12x de Medio 4 reduda ademas el aumento de osmolaridad cuando se alimentaba el cultivo. La formulacion de 12x de Medio 4 se proporciona en la Tabla 7.
10 Tabla 7. Hoja de trabajo del medio de alimentacion 12x de Medio 4.
Componente
Cantidad Unidad
Medio 4A-1
18,672 g/l
Nucellin™
24,000 ml/l
Materia prima H/P
12,000 ml/l
Materia prima Selenito
1,200 ml/l
PVA
2,400 g/l
Asparagina.H2O
1,620 g/l
NaH2PO4H2O
1,566 g/l
MgSO4-7H2O
0,258 g/l
Glutamina
5,475 g/l
Tiamina
0,040 g/l
Medio 4B y glucosa predisueltos
-175 ml/l
Cistema acida (400 mM)
4,688 ml/l
Registro de pH
Ajuste del pH a 7,2 con HCl 5 N
FeSO4 (materia prima 1 mM)
17,250 ml/l
1000x de Traza B
6,750 ml/l
1000x de Traza D
2,475 ml/l
Registro de pH (esperado 7,18)
Registro de Osm
566,000
Medio 4B y glucosa predisueltos (para 1 l de medio de alimentacion)
Agua
150 ml
Mezcla de Medio 4B (14,5 g) con glucosa (38,3 g)
Anadido
Ajuste del pH utilizando un 25 % de NaOH hasta disolucion (pH aproximadamente de 10,25)
Nota: Nucellin™ esta fabricado por Eli Lilly (Indianapolis, IN, USA) ; materia prima de H/P = 0,036 mg/ml hidrocortisona, 1,08 mg/ml Putrescina 2HCl,
La osmolaridad final es de 566 mOsm. Una alimentacion diaria de un 4 % por volumen da un aumento de osmolaridad aproximada de 8,6, un aumento de glucosa de 2 g/l y un aumento de glutamina de 1,5 mM. La formulacion de medios de 12x Medio 4 tambien se conoce como Medio 5. El Medio 5 es facil de compararse con el 15 20x de Medio 4 o 16x de Medio 4, y es estable durante 10 dfas a temperatura ambiente o a 4 °C (datos no
mostrados).
5
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Ejemplo 3: Proceso semi-continuo con privacion de glutamina para el cultivo celular de anti-GDF-8
Las celulas necesitan glutamina en el medio de partida para sobrevivir. Tradicionalmente, los niveles iniciales de glutamina son altos y se alimenta con glutamina diariamente despues del d^a 5 hasta el final del proceso semi- continuo. Los procesos semi-continuos tradicionales normalmente dan como resultado altos niveles de lactato y amonio en los cultivos celulares, que se sabe que tienen efectos inhibidores sobre el crecimiento celular, densidad celular y expresion de la protema recombinante. Los procesos semi-continuos en los que se anade glucosa lentamente al cultivo han demostrado que disminuyen la produccion de lactato y mejoran el crecimiento celular, la densidad celular y la expresion de protema recombinante. Sin embargo, los procedimientos de la tecnica anterior para la manipulacion de la adicion de glucosa no son practicos para la fabricacion a gran escala. Aqm, utilizando un medio de cultivo con niveles de partida menores de glutamina y eliminando la glutamina de la alimentacion, se demuestra que se produdan menores niveles de amonio y lactato, dando lugar a un aumento de la viabilidad celular. De manera adicional, en los cultivos privados de glutamina, aumenta la expresion de protema recombinante y se reduce la osmolaridad final.
Materiales y procedimientos
CEPAS Y MEDIOS: Se cultivaron las celulas anti-GDF-8 en modo semi-continuo en Medio 1 en un Biorreactor de 1 l.
CONDICIONES DE CULTIVO: Las celulas se cultivaron durante doce dfas en Biorreactores de 1 l. Se cambio la temperatura de 37 °C a 31 °C en el dfa 4 o el dfa 5 dependiendo del crecimiento celular. Se ensayaron tres procesos semi-continuos: un proceso normal (de control), un proceso de alimentacion sin glutamina y un proceso de privacion de glutamina. Los detalles pertinentes de estos procesos se enumeran en la Tabla 8 y la Tabla 9.
Tabla 8. Proceso semi-continuo en Biorreactores de 1 l con un proceso de alimentacion sin glutamina
Proceso de Control Proceso de alimentacion sin glutamina
Glutamina del medio de partida (mM)
13 mM 13 mM
Alimentacion con glutamina
5 mM el Dfa 4 Sin alimentacion con glutamina
Medio de alimentacion
Medio 5 (con 37,5 mM de glutamina) Medio 5 sin glutamina
Programacion de la alimentacion
4 % diariamente desde el dfa 5 4 % diariamente desde el dfa 5
Cambio de temperatura a 31 °C
Dfa 4 Dfa 5
Tabla 9. Proceso semi-continuo en Biorreactores de 1 l con un proceso de privacion de glutamina
Proceso de Control Proceso con glutamina baja
Glutamina del medio de partida (mM)
13 mM 4 mM
Alimentacion con glutamina
5 mM el Dfa 4 Sin alimentar con glutamina
Medio de alimentacion
Medio 5 (con 37,5 mM de glutamina) Medio 5 sin glutamina
Programacion de la alimentacion
4 % diariamente desde el dfa 5 4 % diariamente desde el dfa 5
Cambio de temperatura a 31 °C
Dfa 4 Dfa 5
ANALISIS DE LAS MUESTRAS: Se tomaron muestras diarias de los cultivos y se analizaron en cuanto a la densidad celular, viabilidad celular, niveles de lactato, glutamina, y amonio. El tttulo del anticuerpo anti-GDF-8 expresado tambien se midio diariamente.
Resultados y Conclusiones
La Figura 3 muestra la densidad celular de los cultivos que se cultivan en condiciones de alimentacion sin glutamina o de control semi-continuo. En ambos casos, la densidad celular era similar durante el curso del experimento.
La Figura 4 muestra el porcentaje de viabilidad celular en cultivos que se cultivan en condiciones de alimentacion sin glutamina o de control semi-continuo. El cultivo de alimentacion sin glutamina presentaba una viabilidad marcadamente mayor al final del experimento, comenzando el dfa 6.
La Figura 5 muestra el porcentaje de viabilidad celular en cultivos que se cultivan en condiciones sin alimentacion con glutamina o de control semi-continuo. El cultivo de alimentacion sin glutamina presentaba una marcada disminucion de los niveles de amonio al final del experimento, comenzando el dfa 4.
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30
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40
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50
La Figura 6 muestra los niveles de lactato en los cultivos que se cultivan en condiciones sin alimentacion de glutamina o de control semi-continuo. Los niveles de lactato eran ligeramente menores en el cultivo de alimentacion sin glutamina a lo largo del curso del experimento.
La Figura 7 muestra el tftulo de anticuerpo anti-GDF-8 en los cultivos que se cultivan en condiciones sin alimentacion de glutamina o de control semi-continuo. El tftulo final de anticuerpo anti-GDF-8 era mayor en el cultivo de alimentacion sin glutamina.
La Figura 8 muestra la densidad celular de los cultivos que se cultivan en condiciones de privacion de glutamina o de control semi-continuo. En ambos casos, la densidad celular era similar durante el curso del experimento.
La Figura 9 muestra la viabilidad celular en los cultivos que se cultivan en condiciones de privacion de glutamina o de control semi-continuo. En ambos casos, la viabilidad celular era similar durante el curso del experimento.
La Figura 10 muestra los niveles de amonio en los cultivos que se cultivan en condiciones de privacion de glutamina o de control semi-continuo. El cultivo con privacion de glutamina presentaba una marcada disminucion de los niveles de amonio a lo largo del curso del experimento.
La Figura 11 muestra los niveles de lactato en los cultivos que se cultivan en condiciones de privacion de glutamina o de control semi-continuo. El cultivo con privacion de glutamina presentaba una disminucion marcada de los niveles de lactato a lo largo del experimento hacia el final, comenzando el dfa 4.
La Figura 12 muestra el tftulo de anticuerpo anti-GDF-8 en los cultivos que se cultivan en condiciones de privacion de glutamina o de control semi-continuo. El tftulo de anticuerpo anti-GDF-8 era mas alto en el cultivo con privacion de glutamina.
Colectivamente, estos resultados indican que la disminucion de los niveles de glutamina es beneficiosa para los cultivos celulares reduciendo la cantidad de produccion de amonio, aumentando la viabilidad celular y aumentando el tftulo del anticuerpo anti-GDF-8 que se expresa. Ademas, en los cultivos con privacion de glutamina, se observaron bajos niveles de lactato, posiblemente debidos a la disminucion de la tasa del consumo de glucosa. La disminucion de los niveles de amonio y lactato tambien tiene el efecto de reducir la osmolaridad total. Se sabe tambien que la osmolaridad elevada tiene efectos inhibidores sobre el crecimiento celular y la viabilidad. Los niveles iniciales de glutamina bajos junto con la eliminacion de la alimentacion de glutamina tambien tienen un efecto positivo en la reduccion del amonio que se produce como resultado de la degradacion de glutamina no enzimatica en los medios almacenados. La eliminacion de glutamina en la alimentacion tambien simplifica el proceso de cultivo de celulas anti-GDF-8.
Ejemplo 4. Respuesta a la dosis de hierro de las celulas anti-GDF-8 en el Medio 1 y el Medio 2
El Medio 1 esta mucho mas concentrado en nutrientes que el Medio 2. Los niveles optimos de hierro para el crecimiento celular en el Medio 1 se determinaron con el fin de evitar problemas de deficiencia de hierro durante el cultivo celular.
Materiales y procedimientos
Las celulas anti-GDF-8 se cultivaron en placas para un pasaje en Medio 1 o en Medio 2. Las concentraciones de estos medios se modificaron por adicion de diferentes cantidades de una solucion de materia prima de hierro. Las densidades celulares finales se midieron por CEDEX.
Resultados y conclusiones
La Figura 13 muestra la respuesta a la dosis de hierro de las celulas anti-GDF-8 en el Medio 1 y el Medio 2 que contienen diferentes concentraciones de hierro. En el Medio 2, la densidad celular era relativamente constante para concentraciones de hierro que variaban desde 3 pM a 15 pM. En el Medio 1, la densidad celular aumentaba con el aumento de la concentracion de hierro pero alcanzaba un maximo despues de aproximadamente 5 pM. Esta diferencia podna deberse al alto contenido en nutrientes del Medio 1, que puede reducir la disponibilidad del hierro a las celulas como consecuencia de la quelacion del hierro en el medio. Estos resultados indican que los niveles de hierro debenan mantenerse por encima de 5 pM para evitar problemas de deficiencia de hierro en el Medio 1.
Ejemplo 5. Sustitucion de glutamato por glutamina en el proceso en Biorreactor
Se llevaron a cabo tres experimentos para ensayar los efectos de la sustitucion de glutamato por glutamina en un proceso de cultivo celular de anti-Lewis Y.
Materiales y procedimientos
Se llevaron a cabo los experimentos en biorreactores de 10 l a un pH 7,1, un 30% de oxfgeno disuelto, y una temperatura de partida de 37 °C con un cambio a 31 °C el dfa 5. Los gases de aireacion y del espacio superior eran un 88 % de una mezcla de un 93 % de aire/7 % de CO2 y un 12 % de oxfgeno. El medio de partida era en todos los
5
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experimented el Medio 1, que contiene glutamina. Los medios de alimentacion y la programacion de alimentacion que incluye alimentaciones suplementarias de glucosa y glutamina se muestran en la Tabla 10. Las columnas marcadas con “Glutamato” se alimentaron con Medio 5 modificado, que no contema glutamina, pero contema una concentracion molar de glutamato igual a la concentracion molar de glutamina del Medio 5 convencional. Las columnas marcadas con glutamina se alimentaron con el Medio 5 convencional.
Tabla 10. Programacion de alimentacion.
Dfa
9040-44 9040-56 9040-64
Glutamato 1
Glutamina 1 Glutamato 2 Glutamina 2 Glutamato 3 Glutamina 3
0
1
2
3
4
5 mM gln 5 mM gln 3 g/l gluc3 7,7 mM gln 2,9 g/l gluc
5
3,6 g/ gluc 5 mM gln 5,5 g/l gluc 3,5 g/l gluc 5 mM gln 6 g/l gluc 3 g/l gluc 3 g/l gluc
6
12% 16x Medio 4 12% 16x Medio 4 17 % Medio 5 17% 16x Medio 4 29 % Medio 5 29 % Medio 5
7
4 mM gln
8
9
2,5 g/l gluc
10
10% 16x Medio 4 10% 16x Medio 4 8 % Medio 5 5 % 16x Medio 4
11
1 g/l gluc
12
13
1 g/l gluc
Resultados y conclusiones
En cada experimento, la densidad celular es similar como se muestra en la Figura 14. Las densidades celulares son bajas en los experimentos de Glutamina 2 y Glutamato 2 debido a una desviacion del pH a aproximadamente 6,7 el dfa 3 del proceso. La cafda en la densidad entre el dfa 6 y 7 en los experimentos de Glutamina 3 y Glutamato 3 es debido al 29 % de medio de alimentacion el dfa 6.
La Figura 15 muestra la viabilidad celular de los cultivos de alimentacion con glutamato y glutamina. Las viabilidades se mantemas mas altas durante la segunda mitad del proceso en los biorreactores que conteman cultivos de alimentacion con glutamato.
En el Experimento 1, el tttulo de anti-Lewis Y es similar entre los cultivos de alimentacion de glutamato y glutamina. La Figura 16 muestra que en los Experimentos 2 y 3, los tftulos de anti-Lewis Y son mas bajos en los reactores alimentados con glutamina. El tttulo de anti-Lewis Y mas bajo que se observa en estos reactores podna deberse a los altos niveles de lactato que se producen, como se muestra en la Figura 17.
Los biorreactores que funcionan con glutamato en el medio de alimentacion tienen una concentracion de amonio mas baja (Figura 18) y una menor osmolaridad (Figura 19).
Se utilizo el ensayo ELISA de union para ensayar la actividad de las muestras de los experimentos Glutamina 1 y Glutamato 1. Las actividades eran similares: el 110 % de la referencia para la muestra de Glutamina 1 y del 122 % de la referencia para la muestra de Glutamato 1 (datos no mostrados).
La sustitucion de glutamato por glutamina en estos experimentos no tema un efecto significativo sobre la densidad celular. Sin embargo, la viabilidad celular es menor en los Biorreactores alimentados con glutamina. El amonio, lactato y osmolaridad son menores en los Biorreactores alimentados con glutamato en comparacion de los alimentados con glutamina. Como media, el tftulo de anti-Lewis Y es mayor en los Biorreactores alimentados con glutamato y la actividad es esencialmente la misma en ambas condiciones.
10
15
Ejemplo 6. Sustitucion de glucosa y glutamina en el proceso de cultivo de celulas anti-Lewis Y
El proposito de este experimento era ensayar los efectos de la sustitucion de glucosa y glutamina con los medios de alimentacion enumerados en la Tabla 11 a continuacion, en el cultivo de celulas anti-Lewis Y (vease Bogheart y col., Antibody-targeted chemotherapy with the calicheamicin conjugate hu3S193-N-acetyl gamma calicheamicin dimethyl hydrazide targets Lewis y and eliminates Lewis-positive human carcinoma cells and xenografts, Clin. Can. Res. 10:4538-49 (2004)). Se midieron los niveles de densidad celular, viabilidad celular, tftulo de anti-Lewis Y y amonio.
Materiales y procedimientos
El experimento se llevo a cabo en matraces con agitado de 250 ml con un volumen de partida de 75 ml. Todos los matraces con agitado se sembraron con 0,25 x 10° celulas/ml en Medio 2. Los matraces se incubaron a 37 °C en una incubadora con un 7 % de CO2 durante 14 dfas. Los dfas 3 y 4, los matraces se alimentaron con un 5 % por volumen del medio de alimentacion Medio 6. La composicion del Medio 6 se enumera en la Tabla 11. Los dfas 5-13 los matraces se alimentaron con un 5 % por volumen de una de las soluciones enumeradas en la Tabla 12. Cada condicion se llevo a cabo por duplicado. Las muestras se tomaron diariamente para los recuentos celulares por CEDEX y los ensayos de amonio, glucosa, y lactato.
Tabla 11. Composicion del Medio 6
Aminoacidos
mg/l mM Elementos traza Mg/l nM
alanina
142,48 1,60 Selenito sodico 40,00 231,35
arginina
1528,84 8,79 CuSO4 3,44 21,51
asparagina^O
1080,60 7,20 CuSO4^5H2O 7,49 30,00
Acido aspartico
532,40 4,00 FeSO4^7H2O 2534 9115
cistina<2HCl
473,00 1,51 ZnSO4^7H2O 2704 9421
Acido glutamico
235,38 1,60 MnSO4^H2O 0,17 1,01
glutamina
4820,00 33,01 Na2SiO3^9H2O 140 492,84
glicina
120,07 1,60 (NH4>3MO7O24^4H2O 1,24 1,00
histidina^HCl^O
588,32 2,80 NH4VO3 0,65 5,56
isoleucina
944,52 7,21 NiSO4^6H2O 0,13 0,49
leucina
1360,75 10,39 SnCh^O 0,12 0,53
lisina^HCl
1456,80 8,00 AlCla^6H2O 1,20 4,97
metionina
477,06 3,20 AgNOa 0,17 1,00
fenilalanina
660,36 4,00 Ba(C2H3O2)2 2,55 9,98
prolina
552,31 4,80 KBr 0,12 1,01
serina
1264,70 12,04 CdC^2,5H2O 2,28 9,99
treonina
762,02 6,40 CoCl2^6H2O 2,38 10,00
triptofano
260,94 1,28 CrCl3 0,32 2,02
tirosina<2Na<2H2O
832,62 3,19 NaF 4,20 100,02
valina
749,21 6,40 GeO2 0,53 5,07
Kl 0,17 1,02
Vitaminas
mg/l mM RbCl 1,21 10,01
biotina
3,28 0,01 ZrOC^8H2O 3,22 9,99
Pantotenato calcico
36,02 0,08
Cloruro de colina
143,28 1,03 Otros componentes M9/1 nM
Acido folico
42,43 0,10 Hidrocortisona 288 0,79
inositol
201,71 1,12 Putrescina<2HCl 8000 49,66
nicotinamida
32,02 0,26 Acido linoleico 336,25 1,20
piridoxina^HCl
32,82 0,16 Acido tioctico 840,63 4,08
riboflavina
3,60 0,01
tiamina^HCl
35,22 0,10 Otros Componentes mg/l mM
vitamina B12
11,21 0,01 D-glucosa (Dextrosa) 33005,99 183,37
PVA 2400,00
Sales inorganicas
mg/l mM Nucellin™ 80,00
KH2PO4
1635,00 12,02
MgSOWH2O
171,98 0,70
Tabla 12. Alimentaciones los dfas 5-13. Medio 6 modificado que no contiene glucosa ni glutamina
GluGln
Medio 6 modificado + 43 g/l glucosa + 4,82 g/l glutamina (control)
Glu
Medio 6 modificado + 43 g/l glucosa + 4,82 g/l glutamato
GluAsp
Medio 6 modificado + 43 g/l glucosa + 4,36 g/l asparagina
GluGlyGln
Medio 6 modificado + 43 g/l glucosa + 6,71 g/l glicilglutamina
GluGlu
Medio 6 modificado + 43 g/l galactosa + 4,82 g/l glutamina
GalGlu
Medio 6 modificado + 43 g/l galactosa + 4,82 g/l glutamato
GalGln
Medio 6 modificado + 43 g/l galactosa + 4,36 g/l asparagina
GalGlyGln
Medio 6 modificado + 43 g/l galactosa + 6,71 g/l glicilglutamina
GalAsp
Medio 6 + 43 g/l glucosa
5 Resultados y conclusiones
La densidad celular mas alta se vio cuando el glutamato o glicilglutamina se sustitman por glutamina en presencia de glucosa o galactosa en el medio de alimentacion. La densidad celular era en general menor en los cultivos de alimentacion con glucosa/glutamina, galactosa/glutamina, o solo glucosa (Figura 20). La viabilidad final mas alta era la de los cultivos de alimentacion con solo glucosa, seguida por los cultivos de alimentacion con glucosa/glutamato. 10 La viabilidad mas baja se vio en los cultivos de alimentacion de glutamina o asparagina, combinada con glucosa o galactosa (Figura 21).
El tftulo del dfa 14 era mas alto en los cultivos de alimentacion de glucosa/glicilglutamina y glucosa/glutamato a aproximadamente 700 pg/ml. El tftulo era mas bajo en los cultivos de alimentacion de galactosa/glicilglutamina y galactosa/asparagina a aproximadamente 500 pg/ml. El tftulo en el control de glucosa/glutamina era 15 aproximadamente de 570 pg/ml (Figura 22).
Los niveles mas bajos de amonio se vieron en los matraces alimentados con glucosa/glutamato o solo glucosa. Los matraces alimentados con galactosa/glutamina, glucosa/glutamina, glucosa/glicilglutamina, y glucosa/asparagina
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
mostraban niveles intermedios de amonio. Los matraces alimentados con galactosa/asparagina, galactosa/glicilglutamina, y galactosa/glutamina teman los niveles mas altos de amonio (Figura 23).
Los niveles de glucosa se manteman por encima de 1 g/l en todos los matraces alimentados con galactosa hasta el dfa 11. A partir del d^a 11 hasta el dfa 14, la glucosa en estos cultivos no se llegaba a agotar completamente, permaneciendo entre 0,6 y 1 g/l, sin diferencias significativas entre los diferentes cultivos.
Los niveles de glucosa aumentaban en todos los matraces alimentados con glucosa o glucosa combinada con otro sustrato hasta el dfa 10. A partir del dfa 10 hasta el dfa 14 en estos cultivos, los niveles de glucosa se manteman practicamente constantes y similares entre ellos. El dfa 14 permanedan aproximadamente 8,4 g/l de glucosa en los cultivos alimentados con glucosa/glutamato y permanedan aproximadamente 10,8 g/l de glucosa en los cultivos alimentados solo con glucosa.
Los niveles de lactato alcanzaban una cantidad de aproximadamente 2,4 g/l el dfa 5, cuando las condiciones eran las mismas para todas las celulas, y cafan hasta esencialmente cero en todos los cultivos sobre el dfa 14. Los niveles de lactato eran mayores desde el dfa 10 hasta el dfa 14 en el control de glucosa/glutamina, pero estaban por debajo de 1 g/l durante este periodo (datos no mostrados).
Todas las condiciones que se ensayaron en este experimento daban como resultado una mayor densidad celular que en condiciones de control de glucosa/glutamina. Todas las condiciones ensayadas excepto la condicion de galactosa/asparagina daban como resultado una viabilidad final mas alta que con la condicion de alimentacion de control de glucosa/glutamina o la de galactosa/glutamina. El tftulo en el control de glucosa/glutamina era aproximadamente 570 pg/ml en comparacion con el mas alto de aproximadamente 700 pg/ml en la condicion de alimentacion de glucosa/glicilglutamina y la condicion de alimentacion glucosa/glutamato.
Ejemplo 7. Evaluacion de un Proceso discontinuo con privacion de glutamina para la produccion de anti- GDF-8
Los procedimientos de produccion semi-continuos tfpicos necesitan multiples alimentaciones durante el periodo de cultivo. Estas alimentaciones se disenan para remplazar nutrientes en el medio que se hayan agotado por las celulas, o se hayan podido degradar durante el lote. Estas alimentaciones, cuando el proceso se aumenta de escala para utilizarse en reactores mas grandes, crean complicaciones, tales como la necesidad de un salto impulsor (vease la Figura 24). Ademas, las alimentaciones diluyen la cantidad del anti-GDF-8 ya secretado en el cultivo y por lo tanto afectan al tftulo de recoleccion. El uso de un proceso discontinuo permitina la inoculacion del biorreactor a volumen completo en vez de un volumen parcial, de manera que se incluyeran las alimentaciones, eliminandose la necesidad de un salto impulsor y reducina enormemente cualquier efecto de dilucion de la productividad.
La glutamina es una de las razones mas importantes por las que se utiliza una estrategia semi-continua ya que no es estable a 37 °C y se ha pensado que es necesario que se reponga durante un cultivo discontinuo. Sin embargo, los resultados de los Ejemplos 2, 5, y 6, en los que se ensayo una estrategia de privacion de glutamina, demuestran un aumento significativo de productividad en comparacion con un reactor de control que se alimentaba con glutamina. Este resultado se combino con el proceso discontinuo para crear el proceso discontinuo con privacion de glutamina que se ensayo en este Ejemplo.
Materiales y procedimientos
Las celulas anti-GDF-8 se cultivaron en Biorreactores de 1 l durante 12 dfas de acuerdo con las siguientes cuatro condiciones de cultivo. Los parametros del biorreactor para todas las condiciones se mantuvieron iguales. El oxfgeno disuelto se mantuvo a no menos de un 23 % de saturacion de aire mediante aireacion con aire y el pH se mantuvo a 7,0 por la adicion de una solucion que contema bicarbonato sodico a 0,58 M y carbonato sodico a 0,71 M. La temperatura de todos los cultivos se mantuvo a 37 °C durante los primeros cuatro dfas del lote. El cuarto dfa del lote, la temperatura de todos los biorreactores se bajo a 31 °C y se mantuvo en este punto durante la duracion del lote. El control y los cultivos semi-continuos se alimentaron con un 8 %, 12 % y 8 % del volumen total del reactor con sus medios de alimentacion respectivos los dfas 5, 7, y 10, respectivamente.
1) Control
- Medio de inoculacion Medio 7 (vease la Tabla 13).
- Medio de alimentacion 8, alimentacion el dfa 5, 7, y 10 (vease la Tabla 13).
- Alimentacion de 5 mM de glutamina el dfa 4.
- Bajada de temperatura a 31 °C el dfa 4.
2) Semi-continuo con privacion de glutamina.
- Medio de inoculacion Medio 7 con solamente 4 mM de glutamina (vease la Tabla 13).
- Medio de alimentacion 8 sin glutamina, alimentacion los dfas 5, 7, y 10 (vease la Tabla 13).
- Sin alimentacion de glutamina el dfa 4.
- Disminucion de la temperatura a 31 °C el dfa 4.
3) Privacion de glutamina en discontinuo
- Medio de inoculacion nuevo medio discontinuo con solamente 4 mM de glutamina (vease la Tabla 13).
- Sin Medio de alimentacion.
- Sin alimentacion con glutamina.
5 - Disminucion de la temperature a 31 °C el dfa 4.
- Adicion de 5 g/l de glucosa el dfa 8.
4) Lote de privacion de glutamina suplementado el dfa 8.
- Medio de inoculacion nuevo medio discontinuo con solamente 4 mM de glutamina (vease la Tabla 13).
- Sin Medio de alimentacion.
10 -Sin alimentacion con glutamina.
- Disminucion de la temperatura a 31 °C el dfa 4.
- Adicion de 4 g de glucosa, 375 mg de asparagina, 3 ml materia prima de FeSO4 1 mM, 3,33 ml de Nucellin™ a 5 g/l, 2,57 ml de hidrocortisona a 36 mg/l y 1,0 g/l de materia prima de putrescina, 0,23 ml de materia prima de Selenito sodico a 50 mg/l, y 13,1 mg de tiamina el dfa 8.
15 Tabla 13. Composiciones de medios que se utilizan.
PM Medio 7 Medio 8 Medio discontinuo
Aminoacidos
mM mM mM
L-Alanina
89,0 1,08 2,4 0,2
L- Arginina
174,0 6,84 13,2 4
L-Asparagina^O
150,0 4,76 21,4 7,5
Acido l-Aspartico
133,0 2,40 6 1,65
L-Cistema^HCh H2O
176,0 0,40 0 0,4
L-Cistine^HCl
313 0,95 1,875 1
Acido L-Glutamico
147,0 1,08 2,4 1,08
L-Glutamina
146,0 13,00 37,5 4
Glicina
75,0 1,28 2,4 1,54
L -Histidina^HCl^O
210,0 1,76 4,2 1,76
L-isoleucina
131,0 4,76 10,8 2,83
L-leucina
131,0 6,52 15,6 4,7
lisina^HCl
182,0 5,20 12 5,2
L-Metionina
149,0 1,96 4,8 2,6
L-fenilalanina
165,0 2,60 6 2,2
L-prolina
115,0 3,24 7,2 4,1
L-serina
105,0 8,60 18 8,6
L-treonina
119,0 4,32 9,6 3,2
L-triptofano
204,0 0,78 1,92 1,04
L-tirosina 2Na<2H2O
261,0 2,16 4,8 1,75
L-valina
117,0 4,32 9,6 4
Vitaminas
uM uM uM
Biotina
244,0 8,31 20,4 11
D-Pantotenato calcico
476,0 46,06 112,8 46,06
Cloruro de colina
139,0 632,2 1548 840
Acido folico
441,0 58,8 144 58,8
I-inositol
180,0 686 1680 911
nicotinamida
122,0 161,7 396 215
piridoxina^HCl
206,0 88,15 240 88
piridoxahHCl
203,0 10 0 10
riboflavina
376,0 5,37 13,2 1,1
tiamina^HCl
337,0 63,7 274,7 117
vitamina B12
1355,0 4,9 12 7,8
Sales inorganicas
NaCl
58,5 18,8 mM
KCI
74,6 4,2 mM 4,19 mM
CaCl2
111 1,05 mM 1,05 mM
Selenito sodico
173 27 ug/l 60 ug/l 60 ug/l
NaH2PO4^H2O
142 4,68 mM 11 mM 4,68 mM
Na2HPO4
138 0,5 mM 0,3986 mM
MgSO4
120 1,15 mM 1,05 mM 1,15 mM
MgCl2
95 0,3 mM 0,3 mM
FeSO4^7H2O
278 9 uM 24,675 uM 9 uM
Fe(NO3)3^9H2O
404 0,125 uM 0,124 uM
ZnSO4^7H2O
287 9,2 uM 17 uM 9,2 uM
CUSO4
160 0,05 uM 0,074 uM 0,064 uM
NaHCO3
84 23,8 mM 23,8 mM
Otros
Glucosa
180 16 g/l 38,3 g/l 15 g/l
Alcohol polivimlico
2,56 g/l 2,4 g/l 2,56 g/l
Hidrocortisona
363 0,23 mg/l 0,43 mg/l 0,28 mg/l
Putrescina^2HCl
161 6,4 mg/l 12 mg/l 7,7 mg/l
Piruvato sodico
110 500 uM 500 uM
Acido linoleico
280 0,81 uM 1,8 uM 0,81 uM
Acido tioctico
206 2,7 uM 6 uM 2,7 uM
Nucellin™
54 mg/l 120 mg/l 50 mg/l
1000x Traza B
1,5 ml/l 6,75 ml/l 1,5 ml/l
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Resultados y conclusiones
El crecimiento celular de los primeros 4 d^as era similar en el control y los procesos discontinuos, mientras que el proceso semi-continuo con privacion de glutamina tema ligeramente menor densidad celular y permaneda un poco mas bajo en el resto de los lotes. Ambos procesos discontinuos manteman densidades celulares mas altas durante la duracion del lote, probablemente debido a la falta de una dilucion significativa (vease la Figura 25). Las viabilidades de todos los cultivos eran las mismas hasta el dfa 8. Sin embargo, es interesante senalar que el dfa 11, la viabilidad del proceso discontinuo que no se habfa suplementado era menor que en los otros tres biorreactores y terminaba significativamente menor en el ultimo dfa. Esto sugiere que el medio discontinuo podfa optimizarse mas ya que el proceso discontinuo suplementado tema una viabilidad que era la misma que los biorreactores semi- continuos (vease la Figura 26).
Las celulas cultivadas en un proceso discontinuo con privacion de glutamina o en el proceso semi-continuo con privacion de glutamina consegrnan mejores resultados que las mismas celulas cultivadas en el proceso semi- continuo de control en cuanto a la productividad. El proceso semi-continuo de control tema un tftulo de recoleccion al dfa de 685 mg/ml, como se esperaba, mientras que el proceso semi-continuo con privacion de glutamina tema un tftulo de recoleccion de 1080 mg/ml, aproximadamente un 58% mas alto que el control. Esto es similar a los resultados que se vefan anteriormente. El proceso discontinuo no suplementado con privacion de glutamina tema un tftulo de recoleccion al dfa de 960 mg/ml, un 40 % mas alto que el control, similar al proceso semi-continuo con privacion de glutamina, mientras que el proceso discontinuo con privacion de glutamina suplementado tema el tftulo mas alto con 1296 mg/ml. Esto es un 89 % de aumento por encima del control (vease la Figura 27).
Cuando los niveles inhibidores de las cuatro condiciones se analizaron, los resultados mostraban que los niveles de lactato y amonio para los tres procesos con privacion de glutamina eran significativamente menores que el control. De hecho, tras el dfa 4, las tres condiciones o paraban de producir o comenzaban a consumir lactato mientras que el control continuaba produciendo lactato a lo largo del lote (vease la Figura 8). Como se esperaba, los niveles de amonio eran mucho mas bajos en el proceso de privacion de glutamina y declinaban tras el dfa 4, mientras que el control continuaba produciendo amonio (vease la Figura 29).
En este Ejemplo, la combinacion de un proceso discontinuo con una estrategia de privacion de glutamina daba como resultado una mejora del 40 % en la productividad sobre el proceso semi-continuo de control para las celulas anti- GDF-8. Los datos sugieren tambien que con alguna optimizacion del medio discontinuo, se puede alcanzar al menos una mejora de 2 veces en la productividad. Esta mejora en la productividad se puede atribuir a dos factores. Primero, la privacion de glutamina aumenta la productividad directamente o manteniendo los niveles de amonio y lactato muy bajos. Segundo, debido a la ausencia de alimentaciones, el tftulo no se diluye durante el lote. El aumento de productividad junto con la facilidad de operacion inherente al proceso discontinuo hace que sea una opcion atractiva para producir polipeptidos recombinantes.
Ejemplo 8. Efectos de las concentraciones de glutamina y asparagina en un medio discontinuo sobre el proceso de cultivo de celulas anti-GDF-8
En los Ejemplos 2, 5 y 6, se habfa demostrado que la privacion de glutamina confena beneficios sobre los cultivos semi-continuos en dos lrneas celulares, incluyendo el aumento del crecimiento celular, la viabilidad celular y el tftulo asf como la disminucion de produccion de lactato y amonio. La asparagina tambien parece que tiene un papel en los medios discontinuos.
Materiales y procedimientos
Las celulas anti-GDF-8 se cultivaron durante doce dfas en Biorreactores de 1 l en Medio 9 modificado con diferentes concentraciones de glutamina y asparagina. La composicion del Medio 9 basico se enumera en la Tabla 14. Las variaciones experimentales de esta composicion basica se enumeran en la Tabla 15. Los cultivos se incubaron a 37 °C durante los primeros 5 dfas con la excepcion del Reactor 4 cuya temperatura era de 30 °C durante el primer dfa debido a problemas con el control de temperatura. Los cultivos se cambiaron a 31 °C el dfa 6. El dfa 7, los cultivos se alimentaron una vez con un 5 % por volumen de Medio 5 que careda de glutamina. Los cultivos se midieron diariamente en cuanto a densidad celular, tftulo de anti-GDF-8, niveles de lactato y amonio.
Tabla 14. Composicion del Medio 9
Aminoacidos
mg/l mM Elementos traza Mg/l nM
alanina
17,80 0,20 Selenito sodico 69,16 400,00
arginina
696,00 4,00 Fe(NOa^9H2O 50,00 123,76
asparagina^O
3000,00 20,00 CuSO4 10,24 64,00
Acido aspartico
219,45 1,65 CuSO4^5H2O 99,88 400,00
Aminoacidos
mg/l mM Elementos traza Mg/l nM
Cistema^HCl^O
70,40 0,40 FeSO4^7H2O 4170 15000
Cistema<2HCl
468,75 1,50 ZnSO4^7H2O 2640 9200
Glutamato monosodico
33,80 0,20 MnSO4^H2O 33,80 200,00
glutamina
584,00 4,00 Na2SiO3^9H2O 284,07 1000
glicina
115,50 1,54 (NH4>sMo7O24^4H2O 247,20 200,00
Histidina^HCl^O
474,60 2,26 NH4VO3 2,34 20,00
isoleucina
570,73 4,36 NiSO4^6H2O 5,26 20,00
leucina
1030,70 7,87 SnCh^O 0,90 4,00
Lisina^HCl
1401,40 7,70 AlCk^^O 0,97 4,00
metionina
387,40 2,60 KBr 0,48 4,00
fenilalanina
507,00 3,07 CrCla 15,83 100,00
prolina
539,50 4,69 NaF 0,17 4,00
serina
1052,00 10,02 GeO2 0,42 4,00
treonina
564,80 4,75 Kl 33,20 200,00
triptofano
274,16 1,34 RbCl 0,48 4,00
Tirosina<2Na^2H2O
745,75 2,86 H3BO3 12,37 200,00
valina
749,00 6,40 LiCl 0,17 4,00
Vitaminas
mg/l mM Otros componentes Mg/l nM
biotina
2,68 0,01 Hidrocortisona 540,00 1,49
Pantotenato calcico
21,92 0,05 Putrescina<2HCl 15000 93,11
Cloruro de colina
158,46 1,14 Acido linoleico 290,00 1,04
Acido folico
25,93 0,06 Acido tioctico 716,00 3,48
inositol
163,98 0,91
nicotinamida
26,23 0,22 Otros componentes mg/l mM
PiridoxahHCl
2,03 0,01 D-glucosa (Dextrosa) 15000,00 83,33
piridoxina^HCl
36,13 0,18 PVA 2560,00
riboflavina
2,41 0,01 Nucellin™ 50,00
Tiamina^HCl
39,43 0,12 Piruvato sodico 55,00 0,50
vitamina B12
21,17 0,02
Sales inorganicas
mg/l mM
CaCl2
116,55 1,05
KCl
312,90 4,19
Na2HPO4
56,60 0,40
NaCl
1100,00 18,80
NaH2PO4^H2O
645,84 4,68
MgSO4
138,00 1,15
MgCl2
28,50 0,30
NaHCOa
2000,00 23,81
Tabla 15. Condiciones de glutamina y asparagina ensayadas
Reactor 1 Reactor 2 Reactor 3 Reactor 4 Reactor 5 Reactor 6
Lmea celular
anti-GDF-8
Medio
Medio discontinuo (Medio 9)
Niveles de Glutamina
1 mM 1 mM 1 mM 4 mM 4 mM 4 mM
Niveles de Asparagina
8 mM 12 mM 20 mM 8 mM 12 mM 20 mM
Densidad de siembra (x106/ml)
0,3 a 0,35
Medio de alimentacion
Medio 5-Glutamina, 5 % el dfa 7
Dfas de cultivo
12
Cambio de temperatura (37-31 °C)
Dfa 6 Dfa 6 Dfa 6 Dfa 5 Dfa 5 Dfa 4
5 Resultados y conclusiones
Las Figuras 30, 31, 32, y 33 muestran el crecimiento de las celulas anti-GDF-8, tftulo de anti-GDF-8, niveles de lactato y amonio, respectivamente, a lo largo del curso de los experimented en distintas condiciones experimentales.
En todas las condiciones experimentales, 4 mM de glutamina es mejor que 1 mM de glutamina en todos los niveles de asparagina ensayados. A niveles de glutamina comparables, las condiciones de 12 mM y 20 mM de asparagina 10 son mejores que 8 mM. La disminucion de los niveles de lactato y NH4 se observo al final del cultivo en todas las condiciones ensayadas.
Ejemplo 9. Efectos de las concentraciones de glutamina y asparagina en medio discontinuo sobre el proceso de cultivo de celulas anti-GDF-8
En el Ejemplo 8 se demostro que el Medio 9 contema una concentracion inicial de 4 mM de glutamina actua mejor 15 que el medio que contema 1 mM de glutamina, independientemente de los niveles de asparagina. Este ejemplo demuestra el efecto del medio que contiene niveles de glutamina 13 mM y distintos niveles de asparagina.
Materiales y procedimientos
Las celulas anti-GDF-8 se cultivaron durante doce dfas en Biorreactores de 1 l en Medio 9 modificado con diferentes concentraciones de glutamina y asparagina como se enumera en la Tabla 16. Los cultivos se incubaron a 37 °C 20 durante los primeros 3 dfas. Los cultivos se cambiaron entonces a 31 °C el dfa 4. El dfa 7, los cultivos se alimentaron una vez con un 5 % por volumen del Medio 5 que carecfa de glutamina. Los cultivos se midieron periodicamente en cuanto a la densidad celular, viabilidad celular, niveles de lactato, amonio y niveles de glutamina, tftulo de anti-GDF- 8, y osmolaridad.
5
10
15
20
25
30
Tabla 16. Condiciones de glutamina y asparagina ensayadas
Reactor 1 Reactor 2 Reactor 3 Reactor 4 Reactor 5 Reactor 6
Lmea celular
anti-GDF-8
Medio
Medio discontinuo (Medio 9)
Niveles de Glutamina
4 mM 4 mM 13 mM 13 mM 13 mM 13 mM
Niveles de Asparagina
20 mM 20 mM 20 mM 12 mM 12 mM 8 mM
Densidad de siembra (x106/ml)
0,3 a 0,35
Medio de alimentacion
Medio 5-Glutamina, 5 % el dfa 7
Dfas de cultivo
12
Cambio de temperatura (37-31 °C)
Dfa 4 Dfa 4 Dfa 4 Dfa 4 Dfa 4 Dfa 4
Resultados y conclusiones
Las Figuras 34, 35, 36, 37, 38, 39 y 40 muestran el crecimiento celular de las celulas anti-GDF-8, el porcentaje de viabilidad de las celulas anti-GDF-8, los niveles de lactato, los niveles de amonio, niveles de glutamina, tftulo de anti- GDF-8, y osmolaridad, respectivamente, a lo largo del curso de los experimented en distintas condiciones experimentales.
Entre todas las condiciones ensayadas, solamente el Medio 9 que contema 13 mM de glutamina y 20 mM de asparagina mostraba efectos secundarios adversos significativos sobre el crecimiento celular y el tftulo. La glutamina se agoto en todos los cultivos a aproximadamente el mismo tiempo, independientemente de si el cultivo comenzaba con 4 mM o 13 mM de glutamina. El tftulo de anti-GDF-8 mas alto se obtema en cultivos que conteman 13 mM de glutamina y 12 mM de asparagina. Todas las condiciones de cultivo presentaban una disminucion de los niveles de lactato y amonio cerca del final del cultivo. Los niveles mas altos de amonio en el cultivo eran los del cultivo que contema 13 mM de glutamina y 20 mM de asparagina.
Ejemplo 10. Efecto de los niveles de asparagina y cistema sobre la disminucion que se observa en los niveles de lactato y amonio en celulas anti-GDF-8 cultivadas en Medio 9
En los Ejemplos 2, 5, y 6, se descubrio que los cultivos que se cultivaban en condiciones de privacion de glutamina presentaban una disminucion de los niveles de lactato y amonio al final del proceso de cultivo. Sin embargo, los cultivos que se cultivaban en Medio 9 en condiciones de no privacion de glutamina siguen presentando una disminucion de los niveles de lactato y amonio al final del proceso de cultivo. Este efecto no se observaba en otros medios tales como el Medio 1, en el que la privacion de glutamina parece necesaria para disminuir los niveles de lactato y amonio. El Medio 9 y el Medio 1 se diferencian en los niveles de asparagina (20 mM en el Medio 9 frente a 11 mM total en el Medio 1 mas la alimentacion) y cistema acida (1,5 mM en el Medio 9 frente a 0,95 mM en el Medio 1). Este ejemplo ensaya si estos dos componentes eran responsables de la disminucion que se observaba en los niveles de lactato y amonio al final del cultivo.
Materiales y procedimientos
Las celulas anti-GDF-8 se cultivaron en BioReactores de 1 l durante 12 dfas. Las celulas se cultivaron inicialmente a 37 °C y se cambiaron a 31 °C el dfa 4 o dfa 5 a 8-10 x 106/ml. La Tabla 17 enumera las distintas condiciones experimentales que se ensayaron. Las muestras se tomaron diariamente y se guardaron para el analisis de tftulo por HPLC de Protema A.
Tabla 17. Condiciones de asparagina y cistema ensayadas
Medio
Gln (mM) Asn (mM) Gln Total (mM) Asn Total (mM) Alimentacion
Medio 5, 30 % total
Medio 1
13 5 29 11 5 mM Gln, dfa 4
Medio 5-Gln, 30 % total
5
10
15
20
25
30
Medio
Gln (mM) Asn (mM) Gln Total (mM) Asn Total (mM) Alimentacion
Medio 1
4 5 4 11
Medio 5-Gln, 5 % dfa 7
Medio discontinuo (Medio 9)
4 20 4 21
Medio 1+ 5 mM Asn + 0,5 mM Cistema
Medio 5, 30 % total
13
10 29 16 5 mM Gln, dfa 4
Medio 5, 30 % total
Medio discontinuo (Medio 9)
13 20 29 21 5 mM Gln, dfa 4
Nota: Medio 5-Gln = Medio 5 que carece de glutamina.
Resultados y conclusiones
Las celulas anti-GDF-8 cultivadas en Medio 9 presentaban una disminucion de los niveles de lactato y amonio al final del proceso de cultivo, independientemente de si los cultivos se iniciaban con 4 mM o 13 mM de glutamina (vease las Figuras 42 y 43). Por el contrario, en Medio 1 solo presentaba la disminucion de lactato y amonio al final del proceso de cultivo cuando los cultivos se iniciaban con 4 mM de glutamina (vease las Figuras 42 y 43). La adiccion de asparagina y cistina extra al Medio 1 que contema 13 mM de glutamina no daba como resultado la disminucion de los niveles de amonio y lactato al final del proceso de cultivo (vease las Figuras 42 y 43).
Tambien se observo que los cultivos que presentaban una disminucion de los niveles de lactato y amonio al final del proceso de cultivo (Medio 1 con 4 mM de glutamina, Medio 9 con 4 mM de glutamina y Medio 9 con 13 mM de glutamina) teman una osmolaridad total menor al final del proceso de cultivo (vease la Figura 47).
El Medio 9 con 4 mM de glutamina presentaba el tttulo de anti-GDF-8 mas alto, seguido por el Medio 9 con 13 mM de glutamina alimentado el dfa 4 (vease la Figura 46). Teniendo en cuenta el efecto de la dilucion por la alimentacion, el Medio 9 que contema 4 mM de glutamina tema un tttulo de anti-GDF-8 equivalente al Medio 9 que contema 13 mM de glutamina.
Ejemplo 11. El efecto de los niveles de aminoacidos y vitaminas sobre la disminucion observada de los niveles de lactato y amonio en celulas anti-GDF-8 cultivadas en Medio 9
En el Ejemplo 10 se ensayo si la diferencia en los niveles de asparagina y cistema entre el Medio 1 y el Medio 9 era responsable de la disminucion observada en los niveles de lactato y amonio al final del proceso de cultivo en el Medio 9 que no se habfa privado de glutamina. Se determino que estos factores no eran responsables de la disminucion que se observaba. El Medio 1 y el Medio 9 tambien se diferencian en sus concentraciones de aminoacidos y vitaminas. Este ejemplo ensaya si las diferencias en las concentraciones de aminoacidos y vitaminas entre estos dos medios eran las responsables de la disminucion que se observaba.
Materiales y procedimientos
Las celulas anti-GDF-8 se cultivaron en BioReactores de 1 l durante 12 dfas. Las celulas se cultivaron inicialmente a 37 °C y se cambiaron a 31 °C el dfa 4 a 8-10 x 106/ml. La Tabla 18 enumera las distintas condiciones experimentales que se ensayaron. Se anadieron aminoacidos, vitaminas, hidrocortisona y putrescina, elementos traza E (composicion enumerada en la Tabla 19) y hierro a las distintas condiciones experimentales de Medio 1 de manera que los niveles de estos componentes eran iguales a los niveles del Medio 9. Las muestras se tomaron diariamente y se guardaron para los analisis del tttulo por Protema A HPLC.
Tabla 18. Condiciones de aminoacidos y vitaminas ensayadas
Gln Asn
Medio
(mM) (mM) Alimentacion Dia 5 Dia 7 Dia 10 Dia 11
Medio 5 30 % total 8 % 12 % 8 %
Medio 1
13 5 5 mM Gln, dfa 4 Medio 5 Medio 5 Medio 5
Medio 5 30 % total 8 % 12 % 8 %
Medio 1+AA
13 15 5 mM Gln, dfa 4 Medio 5 Medio 5 Medio 5
Medio
Medio 5 30 % total 8 % 12 % 8 % 4 g/l
1+ Vit,H/P,E,Fe
13 5 5 mM Gln, dfa 4 Medio 5 Medio 5 Medio 5 glucosa
Medio 5 30 % total 8 % 12 % 8 % 4 g/l
Medio 1 + todos
13 15 5 mM Gln, dfa 4 Medio 5 Medio 5 Medio 5 glucosa
Medio 9 con 13
Medio 5 30 % total 8 % 12 % 8 %
mM Gln
13 20 5 mM Gln, dfa 4 Medio 5 Medio 5 Medio 5
Nota: AA = Aminoacidos, H/P:
= 0.036 mg/ml hidrocortisona, 1.08 mg/ml Putrescina^2HCl, E: Elementos Traza E.
Tabla 19: Composicion de Elementos traza E
Elementos Traza
Hg/i nM
(NH4)6MoyO24^4H2O
123,60 100,00
AlCla^O
0,48 2,00
H3BO3
6,18 100,00
CrCls
7,92 50,00
CuSO4^5H2O
49,94 200,00
GeO2
0,21 2,00
KBr
0,24 2,00
Kl
16,60 100,00
LiCl
0,08 2,00
MnSO4^O
16,90 100,00
Na2SiO3^9H2O
142,03 500,00
NaF
0,08 2,00
NH4VO3
1,17 10,00
NiSO4^6H2O
2,63 10,00
RbCl
0,24 2,00
SnCh^O
0,45 2,00
Selenito sodico
34,58 200,00
5 Resultados y conclusiones
Todas las condiciones que se ensayaron presentaban una disminucion de los niveles de lactato y amonio al final del proceso de cultivo excepto en el Medio 1 que contema aminoacidos anadidos, indicando que el aumento de niveles de aminoacidos en el Medio 9 en comparacion con el Medio 1 no son responsables de la disminucion de los niveles de lactato y amonio (vease las Figuras 49 y 50). Sin embargo el Medio 1 que contema vitaminas, hidrocortisona y 10 putrescina, elementos traza E y hierro anadidos presentaba niveles mas bajos de lactato y amonio al final del proceso de cultivo en comparacion con el Medio 1 que contema aminoacidos anadidos (vease las Figuras 49 y 50). Esto indica que estos componentes pueden ser responsables de la disminucion que se observaba en el Medio 9.
Los cultivos que se cultivaron en Medio 1 que contema vitaminas, hidrocortisona, y putrescina, elementos traza E y hierro anadidos presentaban los niveles mas bajos de amonio a lo largo del experimento debido a la menor cantidad 15 total de asparagina y glutamina en el medio de partida (vease la Figura 50).
Ejemplo 12. Efecto de los niveles de vitaminas, elementos traza E y hierro en la disminucion de los niveles de lactato y amonio que se observa en las celulas anti-GDF-8 cultivadas en Medio 9
En el Ejemplo 11, se determino que el aumento de los niveles de vitaminas, hidrocortisona y putrescina, elementos traza E y hierro en el Medio 9 con respecto al Medio 1 podfa ser responsable de la disminucion de los niveles de 5 lactato y amonio que se observa al final del proceso de cultivo. Aqm, estos componentes se ensayaron individualmente y en combinacion, para determinar cual, si habfa alguno, era el responsable de la disminucion que se observaba.
Materiales y procedimientos
Las celulas anti-GDF-8 se cultivaron en BioReactores de 1 l durante 12 dfas. Las celulas se cultivaron inicialmente a 10 37 °C y se cambiaron a 31 °C el dfa 4 a 8-10 x 106 celulas/ml. La Tabla 20 enumera las distintas condiciones
experimentales ensayadas. La hidrocortisona y putrescina se anadieron en todas las condiciones del Medio 1 de manera que los niveles de estos componentes eran iguales a los niveles en el Medio 9. Las vitaminas, elementos traza E (composicion enumerada en la Tabla 19) y el hierro se anadieron a distintas condiciones experimentales del Medio 1 de manera que los niveles de estos componentes eran iguales a los niveles en el Medio 9. Las muestras se 15 tomaron diariamente y se guardaron para el analisis de tftulo por Protema A HPLC.
Tabla 20. Condiciones de aminoacidos y vitaminas ensayadas
Medio
Gln (mM) Asn (mM) Alimentacion Cambio de temperatura Dia 4 Dia 5 Dia 7 Dia 10
Medio 1+Fe
13 15 Medio 5 30 % total dfa 4 5 mM Gln, dfa 4 8 % Medio 5 12 % Medio 5 8 % Medio
Medio 1+E
13 15 Medio 5 30 % total dfa 4 5 mM Gln, dfa 4 8 % Medio 5 12 % Medio 5 8 % Medio
5 mM
Medio 1+Vit
13 15 Medio 5 dfa 4 Gln, dfa 8 % 12 % 8 %
30 % total
4 Medio 5 Medio 5 Medio
Medio 1+Fe+E
13 15 Medio 5 30 % total dfa 4 5 mM Gln, dfa 4 8 % Medio 5 12 % Medio 5 8 % Medio
Medio
13 15 Medio 5 dfa 4 5 mM Gln, dfa 4 8 % 12 % 8 %
1+Fe+Vit
30 % total Medio 5 Medio 5 Medio
Medio 1+E+Vit
13 15 Medio 5 30 % total dfa 4 5 mM Gln, dfa 4 8 % Medio 5 12 % Medio 5 8 % Medio
Medio 9 con 13 mM nir,
13 20 Medio 5 30 % total dfa 4 5 mM Gln, dfa 4 8 % Medio 5 12 % Medio 5 8 % Medio
Nota: E: Elementos Traza E.
Resultados y conclusiones
De todas las condiciones ensayadas, solamente el Medio 9 que contema 13 mM de glutamina y el Medio 1 que 20 contema elementos traza E presentaban una disminucion de los niveles de lactato y amonio al final del proceso de
cultivo (vease las Figuras 54 y 55). Debena senalarse que la disminucion de niveles que se observa en el Medio 1 que contiene elementos traza E podna ser debida al hecho de que la temperatura de este cultivo se cambio cuando las celulas estaban a aproximadamente 6 x 106 celulas/ml.
El Medio 9 que contema 13 mM de glutamina presentaba un mayor tftulo de anti-GDF-8 que cualquiera de las 25 formulaciones del Medio 1.
Ejemplo 13. Comparacion de los Medios 1, 3, y 9 sobre el crecimiento celular y el tftulo de anti-GDF-8
Este experimento se llevo a cabo para medir las diferencias de crecimiento celular y de tftulo de anti-GDF-8 utilizando los Medios 1, 3 y 9.
5
10
15
20
25
Materiales y procedimientos
Las celulas anti-GDF-8 se cultivaron en varios medios y en condiciones de alimentacion como se enumera en la Tabla 21. La informacion pertinente de los medios se enumera en la Tabla 22. Las celulas se cultivaron en BioReactores de 1 l durante 12 dfas y se cambiaron de 37 °C a 31 °C el dfa 4.
Tabla 21. Condiciones de medios y alimentacion ensayadas
Alimentacion
Medio
Asn Gln Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 10 Dia 11
Medio 3
14 mM 4 mM 3,3 % Medio 5-Gln 3,3 % Medio 5-Gln 3,3 % Medio 5-Gln 3,3 % Medio 5-Gln 10 % Medio 5-Gln 3,3 % Medio 5-Gln 3,3 % Medio 5-Gln
Medio 3
14 mM 4 mM 3,3 % Medio 5-Gln 3,3 % Medio 5-Gln 3,3 % Medio 5-Gln 3,3 % Medio 5-Gln 10 % Medio 5-Gln 3,3 % Medio 5-Gln 3,3 % Medio 5-Gln
Medio 1
14 mM 4 mM 8 % Medio 5-Gln 12 % Medio 5-Gln 8 % Medio 5-Gln
Medio 9
20 mM 4 mM 5 % Medio 5-Gln
Nota: Medio 5-Gln - Medio 5 que carece de glutamina.
Tabla 22. Sumario de medios
Medio
Asn Gln Alimentacion AA(de partida)/(Total) lon/Total AA
Medio 3
14 mM 4 mM 34 % Medio 5-Gln 34 mM / 64 mM 1,75
Medio 9
20 mM 4 mM 5 % Medio 5-Gln 91,4 mM / 94,3 mM 0,72
Medio 1
14 mM 4 mM 31,6% Medio 5-Gln 78 mM / 96,4 mM 0,74
Nota: Medio 5-Gln - Medio 5 que carece de glutamina.
Resultados y conclusiones
Las celulas anti-GDF-8 cultivadas en Medio 9 presentaban la densidad celular y tftulo de anti-GDF-8 mas altos, mientras que las celulas anti-GDF-8 cultivadas en Medio 3 presentan la densidad celular y tftulo de anti-GDF-8 mas bajos (vease las Figuras 57 y 58). El hecho de que el Medio 9 produzca resultados superiores que el Medio 1 indica que es mejor proporcionar los componentes del medio en el medio de partida que suplementarlos por medio de alimentaciones multiples. Adicionalmente, el hecho de que tanto el Medio 1 como el Medio 9 actuan mejor que el Medio 3 indica que proporcionando aminoacidos en concentraciones mayores de aproximadamente 70 mM se proporcionan mejores resultados que proporcionando aminoacidos en concentraciones menores de 70 mM. Finalmente, proporcionando aminoacidos en concentraciones mayores de 70 mM en los medios de partida dan como resultado mayores densidades celulares y tftulos (comparese el Medio 9 vs. Medio 1).
Ejemplo 14. Analisis estadistico de niveles de glutamina y asparagina totales optimos en Medio 9 para el cultivo de celulas anti-GDF-8 en Biorreactores
Materiales y procedimientos
Las celulas anti-GDF-8 se cultivaron en Biorreactores de 1 l y se cambiaron de 37 °C a 31 °C los dfas indicados en la Tabla 23. Los tftulos finales se sometieron a un ensayo T con el fin de determinar el nivel optimo de glutamina sola y el nivel optimo de glutamina y asparagina totales combinadas. La Tabla 23 resume algunas condiciones experimentales relevantes y los resultados finales para el cultivo de celulas anti-GDF-8 en Medio 9.
Tabla 23. Condiciones experimental relevantes y resultados finales para las celulas anti-GDF-8 cultivadas en
Medio 9
Medio
Gln (mM) Asn (mM) Dia de cambio Alimentacion Tftulo (ug/ml) Tftulo/1200 Total Gln Total Asn Total
Medio 9
1 8 6 5 % Medio 5-Gln 615,2 0,51 1 9
Medio 9
1 8 6 5 % Medio 5-Gln 857,1 0,71 4 9
Medio 9
1 12 6 5 % Medio 5-Gln 947 0,79 1 13
Medio 9
4 12 4 5 % Medio 5-Gln 1184 0,99 4 13
Medio 9
4 20 4 5 % Medio 5-Gln 769,6 0,64 1 21
Medio 9
4 8 5 5 % Medio 5-Gln 1262,6 1,05 13 9
Medio 9
4 20 4 5 % Medio 5-Gln 1198 1,00 4 21
Medio 9
4 20 4 5 % Medio 5-Gln 1321,1 1,10 4 21
Medio 9
4 20 4 5 % Medio 5-Gln 1162,4 0,97 4 21
Medio 9
13 20 4 5 % Medio 5-Gln 1436,6 1,20 4 21
Medio 9
15 12 4 5 % Medio 5-Gln 1638,6 1,37 13 13
Medio 9
13 12 4 5 % Medio 5-Gln 1606,7 1,34 13 13
Medio 9
13 20 4 5 % Medio 5-Gln 1075,91 0,90 13 21
Medio 9
13 20 4 5 % Medio 5-Gln 1058,4 0,88 13 21
Medio 9
13 20 4 5 % Medio 5-Gln 1075,91 0,90 15 21
Medio 9
13 5 4 Asn, Gln, 5 % Medio 5-Gln 974,52 0,81 28,5 11
Medio 9
13 20 4 Asn, Gln, 5 % Medio 5-Gln 831,81 0,69 28,5 26
Medio 9
13 20 4 Medio 5, 30 % total, 5 mM Gln dfa 4 975,4 0,81 28,5 26
Medio 9
13 20 4 Medio 5, 30 % total, 5 mM Gln dfa 4 973,5 0,81 28,5 26
Nota: Medio 5-Gln - Medio 5 que carece de glutamina.
Resultados y conclusiones
La Figura 59 muestra los tftulos de anti-GDF-8 extrapolados para varios niveles de glutamina sola y glutamina y asparagina totales combinadas. La Tabla 24 muestra los resultados de un ensayo T que compara el tftulo normalizado de los niveles de glutamina entre 2 y 15 mM con los niveles de glutamina fuera de este intervalo. La 5 Tabla 25 muestra los resultados de un ensayo T que compara el tftulo de los niveles de glutamina y asparagina combinadas entre 16 y 36 mM con los niveles de glutamina y asparagina combinadas fuera de este intervalo.
Ambos resultados del ensayo T indicaban diferencias significativas en los tftulos de anti-GDF-8 entre los dos grupos que se compararon. Los cultivos que se cultivan en Medio 9 que conteman entre 2 y 15 mM de glutamina y entre 16 y 36 mM de glutamina y asparagina combinadas presentaban mayores tftulos de anti-GDF-8 que los cultivos que se 10 cultivaban en medios con niveles de glutamina y de glutamina y asparagina combinadas que se encontraban fuera de estos intervalos. En todos los experimentos, los niveles de asparagina eran mayores de 9 mM.
Tabla 24. Resultados del ensayo T que comparan el tftulo normalizado en las condiciones de 2 mM<Gln<15 mM
frente a Gln>15 mM, Gln<2 mM
Tftulo normalizado
Gln>15, Gln <2 2<Gln<15
Media
0,724649917 1,033147493
Varianza
0,013326655 0,036834109
Observaciones
7 12
Varianza agrupada
0,028537361
Hipotesis de la diferencia media
0
df
17
t Stat
-3,839791986
P(T<=t) de una cola
0,000656219
t Crftica de una cola
1,739606432
P(T<=t) de dos colas
0,001312438
t Crftica de dos colas
2,109818524
15 Tabla 25. Resultados del ensayo T que compara el tftulo normalizado en condiciones de 16 mM<Gln+Asn<36 mM
frente a Gln+Asn>36 mM, Gln+Asn<16 mM
Tftulo normalizado
Asn+Gln>36, Asn+Gln<16 16<Asn+Gln<36
Media
0,735066584 1,027071104
Varianza
0,012061148 0,041504987
Observaciones
7 12
Varianza agrupada
0,031113044
Hipotesis de la diferencia media
0
df
17
t Stat
-3,480816823
P(T<=t) de una cola
0,001430281
t Crftica de una cola
1,739606432
P(T<=t) de dos colas
0,002860561
t Crftica de dos colas
2,109818524
Ejemplo 15. Efectos del Medio sobre el cultivo celular
Este ejemplo investigaba la actuacion de tres variaciones del medio de cultivo a escala intermedia utilizando cultivos 20 de siembra de alta densidad. Se esperaba que todos los medios ensayados presentaran mejoras por encima del
medio de Fase 1 (Medio 10 alimentado con medio de alimentacion Medio 11), basado en los datos de biorreactor a pequena escala.
Materiales y procedimientos
Se ensayaron celulas CHO que expresan un anticuerpo IgG1 monoclonal anti-peptido Abeta humanizado (“celulas 5 anti-ABeta”) en varios medios, como se muestra en la Tabla 26 (vease Basi y col., Humanized Antibodies that Recognize Beta Amyloid Peptide, documento WO02/46237). El punto mas bajo de pH fijado era 7,0 controlado con 0,95 M de Na2CO3 + 0,05 M de K2CO3, excepto en el Fase 1, que se controlo con una solucion que contema bicarbonato sodico a 0,58 M y carbonato sodico a 0,71 M. El oxfgeno disuelto se controlo a un 30 % por aireacion segun necesidades con aire, el agitado era a 60 rpm, y el medio de alimentacion era el Medio 5 (con o sin glutamina, 10 como se ha senalado). Todos los cultivos se cultivaron a una escala de 130 l excepto en 03P49B501, que se cultivaban a una escala de 500 l. En resumen, el Medio 1 se enriquecio con todos los nutrientes, sin considerar las tasas de captacion relativas, mientras que el Medio 12 se equilibro retirando los nutrientes aparentemente innecesarios de la version enriquecida indiscriminadamente. Las composiciones de los Medios 10, 11, y 12 se enumeran en la Tabla 27.
15 Tabla 26. Medio inicial, cantidades de alimentacion y fuentes de siembra para las ejecuciones Piloto
Lote N°
Descripcion Medio Inicial Cantidad de alimentacion ^Alimentacion con Gln? Fuente de siembra Densidad de siembra (Viables/ml)
1
Fase 1 Medio 10 38 % * Sf Bolsas con agitado 0,2 x 106
2
Medio rico, Gln alta (1) Medio 1 16 % Sf Bolsas con agitado 0,2 x 106
3
Med rico, Gln alta (2) Medio 1 16 % Sf Bolsas con agitado 0,2 x 106
4
Med rico, Gln baja Medio 1 15 % No Bolsas con agitado 0,2 x 106
5
Med equil., Gln baja (1) Medio 12 10 % No Bolsas con agitado 0,2 x 106
6
Med equil., Gln baja (2) Medio 12 9 % No Bolsas con agitado 0,2 x 106
7
Med equil., Gln baja, Siembra densa Medio 12 5 % No Biorreactor de alta densidad 2,0 x 106
* El proceso de Fase 1 se alimento con Medio 12, que no es tan rico como el Medio 5.
Tabla 27. Composiciones de Medios 10, 11 y 12
Medio 10 Medio 11 Medio 12
Aminoacidos
mg/l mM mg/l mM mg/l mM
alanina
24,87 0,28 142,48 1,60 17,80 0,20
arginina
423,43 2,43 1528,84 8,79 696,00 4,00
asparaginaH2O
173,90 1,16 1080,60 7,20 1500,00 10,00
Acido aspartico
52,72 0,40 532,40 4,00 219,45 1,65
cistema^HCl^O
70,01 0,40 70,40 0,40
cistema<2HCl
62,09 0,20 470,00 1,50 312,50 1,00
Acido glutamico
41,08 0,28 235,38 1,60
Glutamato monosodico
33,80 0,20
Medio 10 Medio 11 Medio 12
Aminoacidos
mg/l mM mg/l mM mg/l mM
glutamina
1162,40 7,96 6000,00 41,10 584,00 4,00
glicina
35,92 0,48 120,07 1,60 115,50 1,54
HistidinaHClH2O
75,27 0,36 588,32 2,80 369,60 1,76
isoleucina
151,90 1,16 944,52 7,21 370,73 2,83
leucina
172,69 1,32 1360,75 10,39 615,70 4,70
lisinaHCl
218,38 1,20 1456,80 8,00 946,40 5,20
metionina
53,55 0,36 477,06 3,20 387,40 2,60
fenilalanina
98,81 0,60 660,36 4,00 363,00 2,20
prolina
96,40 0,84 552,31 4,80 471,50 4,10
serina
273,07 2,60 1264,70 12,04 903,00 8,60
treonina
132,81 1,12 762,02 6,40 380,80 3,20
triptofano
28,99 0,14 260,94 1,28 212,16 1,04
tirosina-2Na-2H2O
145,10 0,56 832,62 3,19 456,75 1,75
valina
131,17 1,12 749,21 6,40 468,00 4,00
Vitaminas
mg/l pM mg/l pM mg/l pM
biotina
0,36 1,49 3,28 13,45 2,68 11,00
Pantotenato calcico
4,03 8,47 36,02 75,67 21,93 46,06
Cloruro de colina
16,11 115,92 143,28 1030 116,76 840,00
Acido folico
4,76 10,80 42,43 96,22 25,93 58,80
inositol
22,64 125,79 201,71 1120 163,98 911,00
nicotinamida
3,61 29,62 32,02 262,44 26,23 215,00
piridoxahHCl
1,99 9,83 2,03 10,00
piridoxinaHCl
1,67 8,10 32,82 159,31 18,13 88,00
riboflavina
0,40 1,06 3,60 9,58 0,41 1,10
tiaminaHCl
3,92 11,64 35,22 104,51 39,43 117,00
vitamina B12
1,34 0,99 11,21 8,27 10,57 7,80
Sales inorganicas
mg/l mM mg/l mM mg/l mM
CaCl2
115,78 1,04 113,27 1,02 116,55 1,05
KCl
310,94 4,17 312,90 4,19
KH2PO4
1640,00 12,06
Na2HPO4
70,81 0,50 56,60 0,40
Medio 10 Medio 11 Medio 12
Sales inorganicas
mg/l mM mg/l mM mg/l mM
NaCl
3704,96 63,44
NaH2PO4^H2O
114,53 0,83 645,84 4,68
MgSO4
48,70 0,41 138,00 1,15
MgSO4^7H2O
8,60 0,03 170,00 0,69
MgCl2
28,53 0,30 28,50 0,30
NaHCO3
1220,00 14,52 2000,00 23,89
Elementos traza
Mg/l nM Mg/l nM Mg/l nM
Selenito sodico
7,00 40,49 40,00 231,35 53,65 310,27
Fe(NO3)3^9H2O
49,86 123,42 50,00 123,76
CUSO4
0,97 6,06 3,44 21,51 10,00 62,50
CuSO4^5H2O
7,49 30,00 7,49 30,00 49,94 200,00
FeSO4^7H2O
1542 5549 2534 9115 3366 12000
ZnSO4^7H2O
1383 4821 2704 9421 2640 9198
MnSO4^H2O
0,17 1,01 0,17 1,01 16,90 100,00
Na2SiO3^9H2O
140 492,84 140,00 492,84 142,03 500,00
(NH4>3M07O24^4H2O
1,24 1,00 1,24 1,00 123,60 100,00
NH4VO3
0,65 5,56 0,65 5,56 1,17 10,00
NiSO4^6H2O
0,13 0,49 0,13 0,49 2,63 10,00
SnCh^O
0,12 0,53 0,12 0,53 0,45 2,00
ACla^HuO
1,20 4,97 0,48 2,00
AgNO3
0,17 1,00
Ba(C2H3O2)2
2,55 9,98
KBr
0,12 1,01 0,24 2,00
CdCl2^2,5H2O
2,28 9,99
CoCl2^6H2O
2,38 10,00
CrCl3
0,32 2,02 7,92 50,00
NaF
4,20 100,02 0,08 2,00
GeO2
0,53 5,07 0,21 2,00
KI
0,17 1,02 16,60 100
RbCl
1,21 10,01 0,24 2,00
ZrOCfe^HuO
3,22 9,99
H3BO3
6,18 100,00
LiCI
0,08 2,00
5
10
15
20
25
30
35
Otros Componentes
pg/l pM pg/l pM pg/l pM
Hidrocortisona
86,40 ,24 288,00 0,79 360,00 0,99
Putrescina^2HCl
2480 15,39 8000 49,66 10000 62,07
Acido linoleico
56,69 0,20 336,25 1,20 290,00 1,04
Acido tioctico
141,71 0,69 840,63 4,08 716,00 3,48
Otros Componentes
mg/l mM mg/l mM mg/l mM
D-glucosa (Dextrosa)
11042,24 61,35 43005,99 238,92 15000,00 83,33
PVA
2520,00 2400,00 2560,00
Nucellin™
14,00 80,00 50,00
Piruvato sodico
54,85 0,50 55,00 0,50
Resultados y conclusiones
Los cambios de medio dan lugar a una mejora constante a lo largo del curso de estos experimented. En terminos de crecimiento celular, viabilidad, reduccion de niveles de lactato, reduccion de niveles de amonio, y tttulo, los niveles de glutamina reducidos eran mejores que los elevados (vease las Figuras 60-64) y el medio equilibrado (discontinuo) era mejor que el medio rico (Medio 1, vease las Figuras 60-64). Los cultivos que comenzaban con un inoculo de alta densidad presentaban un tttulo final mas alto que los cultivos que comenzaban con inoculos de densidad mas baja (vease la Figura 64).
A diferencia de lo que se habfa observado en los biorreactores a pequena escala, el primer medio (Medio 1 con Gln alta), daba como resultado tttulos mas bajos que los del proceso original (vease la Figura 64). Tampoco habfa cambio en la captacion de lactato tras el cambio de temperatura (vease la Figura 62). Esto sugiere que hay alguna sensibilidad a la escala en este medio. Esta conclusion esta apoyada por las ejecuciones paralelas a pequena escala (2 l) que se hicieron junto con estos experimentos a escala intermedia (datos no mostrados). Las ultimas formulaciones de medio que contienen menos glutamina no eran sensibles a la escala al menos en estos experimentos (vease las Figuras 60-65), aumentando la confianza de todos los datos recopilados en esta campana.
Ejemplo 16. Produccion de TNFR-Ig utilizando el medio 9
Materiales y procedimientos
Las celulas CHO que expresan una protema de fusion dimerica que consiste en la parte de union al ligando extracelular del receptor del factor de necrosis tumoral humano (TNFR) de 75 kilodaltons (p75) unida a la parte Fc de IgG1 (“celulas TNFR-Ig”), se sembraron con alta densidad a partir de un biorreactor de perfusion y se diluyeron a 3 x 106 celulas viables/ml en Medio 9 para la etapa del biorreactor de produccion.
Resultados y conclusiones
Las Figuras 66, 67, 68, 69, 70, 71 y 72 muestran el crecimiento celular, la viabilidad celular, la glucosa residual, los niveles de glutamina, la concentracion de amonio, y el tttulo relativo de producto, respectivamente. En la variacion de modificaciones menores en el proceso, todas las condiciones produdan un buen crecimiento celular, alta viabilidad celular, y un alto tttulo final total.
Para todas las condiciones de este experimento, el subproducto metabolico inhibidor lactato o era consumido o se estabilizaba la concentracion, sugiriendo que la produccion de lactato se detema. De manera similar, para el metabolito inhibidor amonio, los niveles aumentaban inicialmente, pero en algun momento tras el cambio de temperatura el amonio comenzaba a consumirse por las celulas. En este Ejemplo, los cultivos de celulas TNFR-Ig se sometieron a los inductores qmmicos butirato sodico y HMBA.
Ejemplo 17. Comparacion de las condiciones de cultivo a gran y pequena escala
Materiales y procedimientos
Para determinar si el tamano del cultivo afectaba las caractensticas de cultivo relevantes, se cultivaron las celulas
anti-GDF-8 a pequena escala en biorreactores de 1 l o a gran escala en biorreactores de 6000 litros. Las celulas se cultivaron a 37 °C y se cambiaron a 31 °C el d^a 4.
Resultados y conclusiones
Como se puede ver en las Figuras 73, 74, 75 y 76 (que muestran la densidad celular, tftulo, niveles de lactato y 5 niveles de amonio, respectivamente) no habfa diferencias relevantes entre los cultivos a gran escala de 6000 litros y a pequena escala de 1 litro para estas caractensticas. Tanto los niveles de lactato como de amonio empezaban a disminuir tras el cambio de temperature el dfa 4. Este ejemplo demuestra que el tamano del cultivo no afecta a la densidad celular, viabilidad celular, niveles de lactato y niveles de amonio cuando los cultivos se sometfan a las mismas condiciones de cultivo.
10

Claims (48)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para producir un anticuerpo contra un fragmento Ap de la protema precursora de amiloide en un cultivo celular de produccion a gran escala que comprende las etapas de:
    proporcionar un cultivo celular que comprende;
    celulas de mairnfero que contienen un gen que codifica el anticuerpo, cuyo gen se expresa en una condicion de cultivo celular; y
    un medio que contiene glutamina y que tiene un medio caractenstico seleccionado del grupo que consiste en:
    (i) una cantidad acumulada de aminoacidos por unidad de volumen mayor de aproximadamente 70 mM, (ii) una relacion molar de glutamina acumulada con respecto a asparagina acumulada de menos de aproximadamente 2, (iii) una relacion molar de glutamina acumulada con respecto a los aminoacidos totales acumulados de menos de aproximadamente 0,2, (iv) una relacion molar de iones inorganicos acumulados con respecto a los aminoacidos totales acumulados entre aproximadamente 0,4 a 1, (v) una cantidad acumulada de glutamina y asparagina combinadas por unidad de volumen mayor de aproximadamente 16 mM, y combinaciones de las mismas;
    mantener dicho cultivo en una fase de crecimiento inicial con un primer grupo de condiciones de cultivo durante un primer periodo de tiempo suficiente para permitir que dichas celulas se reproduzcan hasta una densidad celular viable en el intervalo de aproximadamente un 20 %-80 % de la densidad celular viable maxima posible si dicho cultivo se mantuviera en el primer grupo de condiciones de cultivo;
    cambiar al menos una de las condiciones del cultivo, de manera que se aplique un segundo grupo de condiciones de cultivo y se produzca un cambio metabolico en el cultivo, en el que dicho cambio metabolico se caracteriza por una reduccion en la relacion de una tasa espedfica de produccion de lactato con respecto a la tasa espedfica de consumo de glucosa;
    mantener dicho cultivo durante un segundo periodo de tiempo con el segundo grupo de condiciones y durante un segundo periodo de tiempo de forma que se acumula el anticuerpo en el cultivo celular.
  2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho medio contiene una relacion molar de glutamina acumulada respecto a asparagina acumulada de menos de aproximadamente 2; y
    dicho medio tiene dos caractensticas de medio seleccionadas del grupo que consiste en: (i) un medio que contiene una cantidad de aminoacidos acumulados por unidad de volumen mayor de aproximadamente 70 mM, (iii) una relacion molar de glutamina acumulada con respecto a los aminoacidos totales acumulados de menos de aproximadamente 0,2, (iv) una relacion molar de iones inorganicos acumulados con respecto a los aminoacidos totales acumulados entre aproximadamente 0,4 y 1, (v) una cantidad acumulada de glutamina y asparagina combinadas por unidad de volumen mayor de aproximadamente 16 mM, y combinaciones de las mismas.
  3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicha condicion de cultivo celular en dicha etapa de cambio de al menos una de las condiciones de cultivo se selecciona de entre el grupo que consiste en: (i) temperatura, (ii) pH, (iii) osmolalidad, (iv) nivel de inductor qmmico, y combinaciones de los mismos.
  4. 4. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la concentracion inicial de glutamina de dicho medio es menor o igual a 10 mM.
  5. 5. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la concentracion inicial de glutamina de dicho medio es menor o igual a 4 mM.
  6. 6. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la cantidad total acumulada por unidad de volumen de glutamina de dicho medio es menor o igual a 10 mM.
  7. 7. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la cantidad total acumulada por unidad de volumen de glutamina de dicho medio es menor o igual a 4 mM.
  8. 8. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la glutamina solo se proporciona en el medio inicial al principio del cultivo celular.
  9. 9. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la densidad inicial de dichas celulas de mamffero es al menos de 2 x 105 celulas/ml.
  10. 10. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la densidad inicial de dichas celulas de mamffero es al menos de 2 x 106 celulas/ml.
  11. 11. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la etapa de provision comprende proveer al menos aproximadamente 1000 l de cultivo.
  12. 12. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la etapa de provision comprende proveer al menos aproximadamente 10.000 l de cultivo.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
  13. 13. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho primer grupo de condiciones comprende un primer intervalo de temperaturas que es aproximadamente de 30 a 42 grados Celsius.
  14. 14. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho primer grupo de condiciones comprende un primer intervalo de temperaturas que es aproximadamente de 37 grados Celsius.
  15. 15. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho segundo grupo de condiciones comprende un segundo intervalo de temperaturas que es aproximadamente de 25 a 41 grados Celsius.
  16. 16. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho segundo grupo de condiciones comprende un segundo intervalo de temperaturas que es aproximadamente de 29 a 35 grados Celsius.
  17. 17. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho segundo grupo de condiciones comprende un segundo intervalo de temperaturas que es aproximadamente de 31 grados Celsius.
  18. 18. El procedimiento de la reivindicacion 1, que comprende ademas una segunda etapa de cambio posterior al dicho
    primer cambio de al menos una de las condiciones de cultivo que comprende el cambio de al menos una de las
    condiciones de cultivo, de manera que se aplica un tercer grupo de condiciones al cultivo.
  19. 19. El procedimiento de la reivindicacion 18, en el que la segunda etapa de cambio comprende el cambio de al menos una condicion de cultivo seleccionada del grupo que consiste en: (i) temperatura, (ii) pH, (iii) osmolalidad, (iv) nivel de inductor qmmico, y combinaciones de los mismos.
  20. 20. El procedimiento de la reivindicacion 18, en el que dicho tercer grupo de condiciones comprende un tercer intervalo de temperaturas que es aproximadamente de 27 a 37 grados Celsius.
  21. 21. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho primer periodo de tiempo es entre 1-7 dfas.
  22. 22. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho primer periodo de tiempo es aproximadamente de 4 dfas.
  23. 23. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el total de dicho primer periodo de tiempo y dicho segundo periodo de tiempo es al menos de 5 dfas.
  24. 24. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que en la etapa de mantenimiento segundo periodo de tiempo, el nivel de lactato disminuye despues de que el nivel alcanzado un nivel maximo.
  25. 25. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que en la etapa de mantenimiento segundo periodo de tiempo, el nivel de amonio disminuye despues de que el nivel alcanzado un nivel maximo.
  26. 26. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicha cantidad total de dicho anticuerpo que se produce es al menos 1,5 veces mayor que la cantidad de anticuerpo que se produce en condiciones por lo demas identicas en un medio por lo demas identico que carece de dichas caractensticas de medio.
  27. 27. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicha cantidad total de dicho anticuerpo que se produce es al menos 2 veces mayor que la cantidad de anticuerpo que se produce en condiciones por lo demas identicas en un medio por lo demas identico que carece de dichas caractensticas de medio.
  28. 28. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho cultivo celular se proporciona ademas con componentes suplementarios.
  29. 29. El procedimiento de la reivindicacion 28, en el que dichos componentes suplementarios se proporcionan en intervalos multiples.
  30. 30. El procedimiento de la reivindicacion 28, en el que dichos componentes suplementarios se seleccionan de entre el grupo que consiste en hormonas y/u otros factores de crecimiento, iones particulares (tales como sodio, cloruro, calcio, magnesio, y fosfato), tampones, vitaminas, nucleosidos o nucleotidos, oligoelementos (compuestos inorganicos presentes habitualmente a muy bajas concentraciones finales), aminoacidos, lfpidos, o glucosa u otras fuentes de energfa.
  31. 31. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho cultivo no se suplementa con componentes adicionales durante el curso de la produccion de dicho anticuerpo.
  32. 32. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que se sustituye la glicilglutamina por glutamina en dicho cultivo.
  33. 33. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la cantidad total acumulada de histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina, y prolina por unidad de volumen en dicho medio es mayor de aproximadamente 25 mM.
    de dicho cultivo durante un de lactato en el cultivo ha
    de dicho cultivo durante un de amonio en el cultivo ha
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
  34. 34. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la cantidad total acumulada de histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina, y prolina por unidad de volumen en dicho medio es mayor de aproximadamente 35 mM.
  35. 35. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho medio tiene una caractenstica de medio seleccionada del grupo que consiste en:
    (i) una cantidad total acumulada de histidina por unidad de volumen mayor de aproximadamente 1,7 mM;
    (ii) una cantidad total acumulada de isoleucina por unidad de volumen mayor de aproximadamente 3,5 mM;
    (iii) una cantidad total acumulada de leucina por unidad de volumen mayor de aproximadamente 5,5 mM;
    (iv) una cantidad total acumulada de metionina por unidad de volumen mayor de aproximadamente 2,0 mM;
    (v) una cantidad total acumulada de fenilalanina por unidad de volumen mayor de aproximadamente 2,5 mM;
    (vi) una cantidad total acumulada de prolina por unidad de volumen mayor de aproximadamente 2,5 mM;
    (vii) una cantidad total acumulada de triptofano por unidad de volumen mayor de aproximadamente 1,0 mM; y
    (viii) una cantidad total acumulada de tirosina por unidad de volumen mayor de aproximadamente 2,0 mM.
  36. 36. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la cantidad total acumulada de serina por unidad de volumen en dicho medio es mayor de aproximadamente 10 mM.
  37. 37. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la cantidad total acumulada de asparagina por unidad de volumen en dicho medio es mayor de aproximadamente 8 mM.
  38. 38. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la cantidad total acumulada de asparagina por unidad de volumen en dicho medio es mayor de aproximadamente 12 mM.
  39. 39. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la cantidad total acumulada de fosforo por unidad de volumen en dicho medio es mayor de aproximadamente 5 mM.
  40. 40. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la cantidad total acumulada de glutamato por unidad de volumen en dicho medio es menor de aproximadamente 1 mM.
  41. 41. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la cantidad total acumulada de pantotenato calcico por unidad de volumen en dicho medio es mayor de aproximadamente 20 mg/l.
  42. 42. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la cantidad total acumulada de nicotinamida por unidad de volumen en dicho medio es mayor de aproximadamente 25 mg/l.
  43. 43. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la cantidad total acumulada de piridoxina y piridoxal por unidad de volumen en dicho medio es mayor de aproximadamente 35 mg/l.
  44. 44. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la cantidad total acumulada de riboflavina por unidad de volumen en dicho medio es mayor de aproximadamente 2,0 mg/l.
  45. 45. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la cantidad total acumulada de unidad de volumen en dicho medio es mayor de aproximadamente 35 mg/l.
  46. 46. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el procedimiento comprende purificacion del anticuerpo que se produce, siendo util dicho anticuerpo en la farmaceuticos.
  47. 47. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que:
    los niveles de lactato son menores que los niveles que se observan en condiciones por lo demas identicas en un medio por lo demas identico que carece de dicha caractenstica del medio;
    los niveles de amonio son menores que los niveles que se observan en condiciones por lo demas identicas en un medio por lo demas identico que carece de dicha caractenstica del medio; y
    la cantidad total del anticuerpo que se produce es al menos tan alta como la que se observa en condiciones por lo demas identicas en un medio por lo demas identico que carece de dicha caractenstica del medio.
  48. 48. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-47, en el que dicho medio es un medio definido.
    hidrocloruro de tiamina por
    ademas el aislamiento y/o preparacion de productos
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