TWI374935B

TWI374935B - Production of α-abeta

Info

Publication number: TWI374935B
Application number: TW094129074A
Authority: TW
Inventors: Denis Drapeau; Yen-Tuang Luan; James R Mercer; Wenge Wang; Daniel Lasko
Original assignee: Pfizer Ireland Pharmaceuticals
Priority date: 2004-08-27
Filing date: 2005-08-25
Publication date: 2012-10-21
Also published as: JP2012095671A; JP2008511328A; CA2578137A1; EP1781803B1; MX2007002382A; ECSP077351A; PE20100147A1; JP2015133980A; UA89644C2; ZA200702487B; ES2599103T3; WO2006026408A3; CN101048512A; EP2348126A3; US7335491B2; RU2418858C2; EG25848A; AR050471A1; KR100998857B1; AU2005280090A1

Description

1374935 • · 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明提供一種用於在細胞培養物中大規模生產蛋白及/或TNFR-Ig的改良系統，特別是在具有一項以上下列特性的培養基進行：i)累計胺基酸濃度高於約70 mM; ii)累計麩醯胺酸對累計天冬醯胺酸之莫耳比率低於約2; iii)累計麩醯胺酸對累計總胺基酸之莫耳比率低於約0.2〖iv)累計無機離子對累計總胺基酸之莫耳比率介於約0.4至1之 ^ 間：或v)累計麩醯胺酸和累計天冬醯胺酸之合倂濃度介於約1 6和3 6 mM之間。本發明提供一種這類系統使高含量之 TNFR_Ig生產並減少一些不理想因子（如銨及/或乳酸鹽）累積的用途。此外，本發明提供一種包括溫度轉換的培養方法，一般係包括當培養物達到其最大細胞密度之約 2 0- 8 0%時將溫度降低。或者，或說此外，本發明提供一種方法，使培養物中之乳酸鹽及/或銨含量達到頂峰之後隨著時間降低。 •【先前技術】作爲治療劑的蛋白和多胜肽已變得越來越重要。在多數例子當中，治療性蛋白和多胜肽係在細胞培養物中從已進行工程處理及/或經篩選而用以產生不尋常高含量之特定興趣蛋白或多胜肽的細胞來加以生產。對成功的蛋白和多胜肽商業生產來說，細胞培養條件的控制和最適化是非常重要的》許多在細胞培養物中生產的蛋白和多胜肽係在批式方 1374935 • · 法或批式供給方法製造出來，其係將細胞培養一段時間，之後終止培養並分離所生產之蛋白或多胜肽。所生產之蛋白或多胜肽最終的量與質可能會大大受到細胞培養條件所影響。舉例來說，傳統批式方法和批式供給培養方法常會產生對細胞生長、存活率、和興趣蛋白或多胜肽之生產或穩定性具有不良效用的代謝廢物。在已努力改善蛋白和多胜肽在批式方法和批式供給培養方法中之生產的同時，也仍有對於其他改良的需要。此外，已有許多心力投入用於培養細胞（特別是哺乳類細胞）之限定培養基（即由已知之個別組分所組成且缺乏血清或其他動物副產物之培養基）的發展。比較在限定培養基和在血清不足（serum-derived)之培養基中的細胞生長特性，兩者是相當不同的。爲了藉由細胞培養物在限定培養基中生產蛋白和多胜肽，特別需要經改良系統的發展。【發明內容】發明槪述本發明提供一種用於在細胞培養中大規模生產蛋白及 /或多胜肽的改良系統。舉例來說，本發明提供一種利用具有一種以上下列特性之培養基的商業規模（如5 00 L以上）培養方法：i)每單位體積累計胺基酸量高於約70 mM ; ii) 累計麩醯胺酸對累計天冬醯胺酸之莫耳比率低於約2 ; iii) 累計麩醯胺酸對累計總胺基酸之莫耳比率低於約0.2 ; iv) 累計無機離子對累計總胺基酸之莫耳比率介於約0.4至1 1374935

之間：或V)每單位體積麩醯胺酸和天冬醯胺酸濃度之合倂累計量高於約16 mM。具有通常知識者當可了解：上文中所用之「累.計」係指特定組分（可爲多種）在細胞培養過程中所加入的總量，包括在培養開始時加入的組分和其後加入的組分。在本發明的一些較佳具體例中，將培養物之「供給」在培養時間內最小化是理想的，因此，將其初始表現量最大化是理想的。當然，培養基組分會在培養期間被代謝掉，因此，如果那些組分是在不同時間加入（如： ® 所有在初始即表現者與某些藉由供給物來加入者的比較）’則帶有特定組分之相同累計量的培養物會有不同的絕對含量。根據本發明，這類培養基的使用會使蛋白生產之含量高’且會減少一些不理想因子（如銨及/或乳酸鹽）的累積。具有通常知識者當可了解：本發明之培養基配方係涵括限定和非限定培養基兩者。在本發明的一些較佳具體例中’該培養物之培養基爲限定培養基，其中在該培養基中 ® 之組成物係爲已知且在控制之下。在本發明的一些較佳具體例中，該培養方法包括將培養物從第一組培養條件改變爲第二組培養條件，從而達到細胞的代謝轉換。在有些具體例中，是在培養物達到其最大細胞密度的約20-80 %時來進行此一改變。在有些具體例中’這項改變涉及改變培養物所維持的溫度（或溫度範圍）。或者’或說此外’本發明提供一種方法，係進行調整而使培養物中之乳酸鹽及/或銨含量在達到頂峰之後隨著 1374935 • · 時間降低。在其他具體例中，該轉換係涉及轉換pH、滲透壓値或化學誘導劑（如烷酸或其鹽）之含量。本發明之細胞培養可選擇性地補充營養物及/或其他培養基組分，其包括激素及/或其他生長因子、特定離子（如鈉、氯化物、鈣、鎂、和磷酸鹽）、緩衝劑、維生素、核苷或核苷酸、稀有元素（無機化合物所表現出來的最終濃度通常非常低）、胺基酸、脂質、或葡萄糖或其他能量來源。在本發明的一些具體例中，對培養基補充化學誘導劑如六 Φ 亞甲基-貳（乙醯胺）（“HMBA”）和丁酸鈉（“NaB”）可能是有利的。爲了補入耗盡的營養物或其他理由，這些選擇性補充物可在培養開始時加入或可在稍後的時點加入。一般來說，理想的情形.是藉由選擇初始培養基組成物，來將根據本發明之補充降到最小。可依照本發明來監測各種培養條件，包括p Η、細胞密度、細胞存活率、乳酸鹽含量、銨含量 '滲透濃度、或所表現之多胜肽或蛋白的滴定度。 ®定義「約」、「大約j :「約」和.「大約」二詞用於此處時’ 如施用於一個以上之特定細胞培養條件時，係指一與用於培養條件(可爲多種）規定參考値相似的數値範圍。在一些具體例中，「約」一詞係指一落在用於培養條件（可爲多種）規定參考値之 25、20、19、18、17、16、15、14、13、 12、 11、 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2、 1 百分比以下的數値範圍。 . ⑧ -9- 1374935 • · 「胺基酸」：「胺基酸」一詞用於此處時，係指任一種一般用於形成多胜肽、或那些胺基酸之類似物或衍生物的二十種天然胺基酸。本發明之胺基酸係在培養基中提供至細胞培養物中。在培養基中所提供之胺基酸可能係以鹽或水合物形式來提供。「抗體」：「抗體」一詞用於此處時，係指一免疫球蛋白分子或一免疫球蛋白分子之免疫活性部（如 Fab或 F(ab’）2片段），其含有一個以上會特異地與—抗原結合（與 ^之進行免疫反應）之抗原結合位置。「單株抗體」和「單株抗體組成物」二詞用於此處時，係指僅包含一類可與抗原之特定抗原決定部位（epitope)進行免疫反應之抗原結合位置的抗體分子選殖族群，而「多株抗體」和「多株抗體組成物」二詞係指含有多種可與特定抗原進行交互作用之抗原結合位置的抗體分子族群。單株抗體的定義包括藉由傳統技術所得到的選殖分子、以及藉由特定殘餘物之操控 ' 或變異所得到之特定序列的分子（舉例來說，人類化抗體） ®兩者。「批式培養」：「批式培養」一詞用於此處時，係指一種培養細胞之方法，其中所有最後會被用於培養細胞的組分（包括培養基（見下文「培養基」之定義）以及細胞本身）均在培養方法一開始的時候便提供了。一般會將批式培養在某個時點上停止，收取在培養基中之細胞及/或組分，並將之選擇性純化。「生物反應器」：「生物反應器」一詞用於此處時，係 ⑧ -10- 1374935

指任何用於哺乳類細胞培養物之生長的容器。生物反應器可以是任何大小，只要可用於培養哺乳類細胞即可。一般來說，生物反應器爲至少1公升，且可爲10、100、250、 500、 1000' 2500' 5000、 8000、 10,000、 12,0000 公升以上、或任何介於其間的體積。生物反應器之內部條件（包括但不限於pH和溫度）一般係在培養期間受到控制。生物反應器可由任何適合在本發明之培養條件下盛裝懸浮於培養基中之哺乳類細胞培養物的材料所構成，包括玻璃、塑 Φ 膠或金屬。「生產生物反應器」一詞用於此處時，係指在興趣多胜肽或蛋白之生產中所使用的最終生物反應器。大規模細胞培養之生產生物反應器的體積一般爲至少5 00公升，且可爲 1000、 2500、 5000' 8000' 10,000、 12,0000 公升以上、或任何介於其間的體積。具有通常知識者當可察覺並當可選擇用以實施本發明的合適生物反應器。「細胞密度」：「細胞密度」一詞用於此處時，係指在特定培養基體積中出現的細胞數量。 ® 「細胞存活率」：「細胞存活率」一詞用於此處時，係指培養物中的細胞在一組特定培養條件或實驗變因之下活存的能力。當此語詞用於此處時，亦指於特定時間點上活著的細胞部分，其係與在該時間點上培養物中的細胞（活著或已死的）總數有關。「培養物」、「細胞培養物」和「哺乳類細胞培養物」：此三詞用於此處時，係指在適合細胞族群活存及/或生長的條件下，懸浮在培養基（見下文「培養基」之定義）中之 ⑧ • 11 - 1374935

哺乳類細胞族群。對具有通常知識者來說將十分清楚的是：當此等語詞用於此處時，其可指含有哺乳類細胞族群和有該族群懸浮其內之培養基的組合物。「批式供給培養」：「批式供給培養」一詞用於此處時，係指一種培養細胞之方法，其係在培養方法開始之後的某些時間將額外的組分提供到培養物中。所提供之組分一般係包含在培養方法期間已被耗盡之細胞用營養補充物。一般會將批式供給培養在某個時點上停止，收取在培養基中 • 之細胞及/或組分，並將之選擇性純化。「片段」：「片段」一詞用於此處時，係指多胜肽且定義爲特定多胜肽的任何個別部分，其係該多胜肽之獨特之處或特徵。當此語詞用於此處時，亦指一保留了至少一部分全長多胜肽活性之特定多胜肽的任何個別部分。其所保留之活性分量較佳爲全長多胜肽活性的至少10%。其所保留之活性分量更佳爲全長多胜肽活性的至少20%、30%、 4 0 %、5 0 %、6 0 %、7 0 %、8 0 %或9 0 %。其所保留之活性分量 ® 又更佳爲全長多胜肽活性的至少9 5 %、9 6 %、9 7 %、9 8 %或 99%。其所保留之活性分量最佳爲全長多胜肽活性的 1 0 0%。當此語詞用於此處時，亦指包括至少一個在全長多胜肽中發現之既定序列因數（sequence element)的特定多胜肽的任何部分。該序列因數較佳係橫跨全長多胜肽之至少4-5個胺基酸，更佳爲橫跨全長多胜肽之至少約1 0、1 5、 20、25、30、35' 40、45、50 以上個胺基酸。「基因」：「基因」一詞用於此處時，係指任何核苷酸 ⑧ -12- 1374935 • · 序列、DN A或RN A、至少帶有一個別最終產物之基因密碼的某個部分，其一般爲（但不限於）一種會作用在某些細胞代謝或發育方面的多胜肽。此語詞不僅只意指帶有該多胜肽或其他個別最終產物之密碼的密碼序列’亦可涵括位於該密碼序列之前和之後且會調節基本表現量的區域（見下文「基因控制因數」之定義）、以及插在獨立密碼段（外顯子（exon))中間的序列（內含子（intron))。「基因控制因數（genetic control element)」··「基因 ® 控制因數」一詞用於此處時，係指任何會調節基因表現、且與該基因有操作性連結的序列因數。基因控制因數可藉由增加或減少表現含量來作用，且可位於密碼序列之前、之中、或之後。基因控制因數可藉由調控如轉錄之起始、延長或終止、mRNA拼接（mRNA splicing)、mRNA剪輯 (mRNA editing )、mRN A穩定性、mRNA在細胞內之定位、轉譯之起始、延長或終止、或任何其他基因表現時期，而作用在任何基因表現時期。基因控制因數可獨自作用或與 ®另一個因數組合作用。「融合瘤」：「融合瘤」一詞用於此處時，係指一種藉由將一取自免疫來源之不死細胞與一抗體生產細胞融合而得到的細胞。所得融合瘤爲一會生產抗體的不死細胞。用來創製融合瘤之個別細胞可來自任何哺乳類來源，其包括但不限於：大鼠、豬、兔子、綿羊、豬、山羊和人類。該詞語亦涵括三融合瘤（trioma )細胞株，其係得自異雜種骨髓瘤（herterohybrid myeloma)融合之後代，爲將人類 ⑧ -13- 1374935 • · 細胞和鼠骨髓瘤細胞株融合後再與漿細胞融合的產物。再者，該詞語意圖包括任何會生產抗體之不死雜種細胞株’ 如，舉例來說，四融合瘤（quadroma)(如見Milstein ef α/.， Nature，537:30 53 (1983))。「整體存活細胞密度」：「整體存活細胞密度」一詞用於此處時，係指在培養過程中隨著培養物所進行之時間量而增殖的存活細胞平均密度。假定所生產之多胜肽及/或蛋白量係與在培養過程中能存活的細胞成一定比例，則對於 ® 估算在培養過程中所生產之多胜肽及/或蛋白的量來說，整體存活細胞密度就是一種有用的工具。「培養基」、「細胞培養之培養基」、「培養物之培養基」：此三詞用於此處時，係指一含有會滋養哺乳類細胞生長之營養物的溶液。一般來說，這些溶液提供了細胞最小生長及/或活存所需之必須和非必須胺基酸、維生素、能量來源、脂質、和微量元素。該溶液亦可含有會以高於最小速率增進生長及/或活存的組分，包括激素和生長因子。該 ® 溶液較佳係配製爲最適合細胞活存和增生之pH和鹽濃度。該培養基亦可爲一「限定培養基」：不含蛋白、水解物或未知組成物之組分的無血清培養基。限定培養基內沒有取自動物之組分，且所有組分都具有已知的化學結構。「代謝廢物」：「代謝廢物」一詞用於此處時，係指一種由細胞培養物正常或不正常代謝方法結果所生產之化合物，從某方面來說，其係對細胞培養有不良影響，特別是有關想要的重組多胜肽或蛋白之表現或活性。舉例來說， •14- 1374935 • · 代謝廢物可能對細胞培養物之生長或存活率不利、可能降低所生產之重組多胜肽或蛋白的量、可能改變所表現之多胜肽或蛋白的摺疊（folding)、穩定性、糖基化作用或其他轉譯後修飾、或可能在許多其他方面對細胞及/或重組多胜肽或蛋白之表現或活性不利。代謝廢物之範例包括乳酸鹽 (葡萄糖代謝之結果所產生）和銨（麩醯胺酸代謝之結果所產生）。本發明之一項目標是延緩代謝廢物在哺乳類細胞培養物中的生產、或使之減少、甚至將之完全消除。「滲透濃度」和「滲透壓値」：「滲透壓値」爲溶解的溶質顆粒在水溶液中之滲透壓的測定値。該溶質顆粒包括離子和非離子化之分子兩者》滲透壓値係表現爲滲透活性顆粒溶解於lkg溶液中之濃度（即滲透壓莫耳（osmole)) (於38°C爲1 mOsm/kg之H20相當於19 mmHg之滲透壓）。相對來說，「滲透濃度」係指溶解於1公升溶液中之溶質顆粒數量。當其用於此處時，縮寫「mOsm」意爲「毫滲透壓莫耳/kg溶液」。「灌注培養」：「灌注培養」一詞用於此處時，係指一種在培養方法開始之後對培養物連續或半連續地提供額外組分的細胞培養方法。所提供之組分一般係包含已在培養方法中被細胞耗盡之營養補充物。在培養基中之細胞及/或組分的一部分一般係以連續或半連續基準來收取，並選擇性加以純化。「多胜肽」：「多胜肽」一詞用於此處時，係指經由胜肽鍵連接在一起之胺基酸序列鏈。此語詞係被用指任何長 ⑧ -15- 1374935 • · 度之胺基酸鏈，但具有通常知識者當可了解：此語詞不受鏈長度的限制，且可指一含有經由一胜肽鍵連接在一起之兩個胺基酸的最小鏈》「蛋白」：「蛋白」一詞用於此處時，係指一個以上用作個別單位的多胜狀。若單一多胜肽爲個別功能單位，且需要與其他多胜肽有永久物理性結合來形成該個別功能單位，則當「多胜肽」和「蛋白」二詞用於此處時，係可互相替換使用。若個別功能性單位被包括在一個以上彼此物 • 理性連接的多胜肽內，則「蛋白」一詞用於此處時，係指多個經物理性偶合且能一起作爲個別單位來作用的多胜肽。「經重組表現之多胜肽」和「重組多胜狀」：此二詞用於此處時，係指一種由哺乳類宿主細胞表現的多胜肽，且該細胞係已經過工程處理來表現該多胜肽者。該經重組表現之多胜肽可能與正常情況下會表現在哺乳類宿主細胞中的多胜肽相同或相似。該經重組表現之多胜肽對宿主細胞 ® 來說也可能是外來物，亦即，對正常情況下會表現在哺乳類宿主細胞中的胜肽而言是異源（heter〇1〇g〇us)的。或者’ 該經重組表現之多胜肽可能是嵌合到該含有與正常情況下會表現在哺乳類宿主細胞中的多胜肽相同或相似之胺基酸序列的多胜肽部分中，而其他部分對宿主細胞來說則是外來物。「種入」：「種入」一詞用於此處時，係指將細胞培養物提供到一生物反應器或另一容器的方法。細胞可能已在 ⑧ -16 - 1374935

另一個生物反應器或容器中繁殖；或者，細胞可能是冷凍的，並在解凍之後立刻將它們提供到生物反應器或容器內。此語詞係指任何數量的細胞，包括單個細胞。「滴定度」：「滴定度」一詞用於此處時，係指用特定量之培養基體積加以分隔之哺-乳類細胞培養物所生產的經重組表現之多胜肽或蛋白總量。滴定度一般係以每毫升培養基之毫克多胜肽或蛋白爲單位來表現。一些較佳具體例之詳細描述 ® 本發明提供一種藉由細胞培養來生產蛋白及/或多胜肽之改良系統。特定言之，本發明提供一種會將一種以上對細胞生長、存活率、及/或蛋白生產或質有不良作用之代謝產物的生產最小化的系統。在本發明的一較佳具體例中，細胞培養爲批式或批式供給培養。以下詳細討論本發明之一些其他較佳具體例。然而，具有通常知識者當可了解：這些較佳具體例的各種修正係在所附申請專利範圍之範圍內。定義本發明之範圍的是申請專利範圍與其同等文 ® 件，其不會且不應限制或受限於這些較佳具體例之描述。 - 多胜肽任何可在宿主細胞中表現之多胜肽均可根據本發明來生產。該多胜肽可從一對宿主細胞而言爲內生性的基因來表現，或從一透過基因工程引入宿主細胞之基因來表現。該多胜肽可以是天然的，或者也可具有以人手進行工程或加以選擇的序列。一段經工程改造的多胜肽可能是將其他在獨立的天然多胜肽段落組合起來，或可能包括一種以上 ⑧ -17- 1374935

非天然的段落。可根據本發明而理想地表現出來的多胜肽常常是根據某種有趣的生物或化學活性而選出來的。舉例來說，本發明可用於表現任何醫藥或商業上有關的酶、受器、抗體、激素、調控因子、抗原、黏結劑等。 - 抗體考慮到目前作爲醫藥或其他商業藥劑來使用或硏究的多種抗體，特別感興趣之抗體的生產係根據本發明爲之。 • 抗體是有能力與特定抗原作特異結合的蛋白。任何可以在宿主細胞中表現的抗體都可以依照本發明來使用。在一較佳具體例中，要表現的抗體爲一單株抗體。在另一較佳具體例中，該單株抗體爲一嵌合抗體，一種含有取自多於一種生物之胺基酸片段的嵌合抗體。舉例來說，嵌合抗體分子可包括小鼠、大鼠或其他物種抗體的抗原結合功能區（antigen binding domain)與人類的恆定區（constant region)。多種製作嵌合抗體方法現已有所描述，如見 Morrison ei a/·，Proc. iVa". Jcad. 5c z·. t/U. 81， 6 8 5 1 ( 1 9 8 5 ) ； Takeda et al. , Nature 3 1 4, 452 ( 1 985)；

Cabilly ei a/.，美國專利第 4,816,567 號；Boss ei ，美國專利第4,816,397號；Tanaguchi " at/·，歐洲專利公開案 EP 1 7 1 4 96 ;歐洲專利公開案 0 1 734 94，英國專利 GB 2177096B 。在另一較佳具體例中，該單株抗體係人類抗體，如，其係透過核糖體顯示庫或噬菌體顯示庫的使用（如見

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Winter eia/_’ 美國專利第 6,291，159 號；和 Kawasaki，美國專利第5,65 8，754號）或透過異種移植物種的使用（如見 Kucherlapati d α/.，美國專利第 6,657,103 號）來得到，異種移植物種係將其中自然抗體基因去活化並以人類抗體基因進行功能性取代 '但天然免疫系統之其他組分則保持完整者。在另一較佳具體例中，該單株抗體爲一人類化抗體。人類化抗體爲嵌合抗體，其中大部分的胺基酸殘基係來自 # 人類抗體，因此當遞送到人類患者時，會將任何可能的免疫反應最小化。在人類化抗體中，在互補性決定區中的胺基酸殘基至少會有部分被來自非人物種且獲得理想抗原特異性或親和力的殘基所取代。這類被改變的免疫球蛋白分子可藉由該項技藝數種已知的技術（如Teng ei or/., _Proc. Natl. Acad. Sc i. U.S.A. , 80， 7 3 0 8 -7 3 1 2 ( 1 9 8 3 ); Kozbor et al. , Immunology Today, 4， 72 79 ( 1 983); Olsson et al.,

MeiA•五《zywo/.，92，3- 1 6 ( 1 982))當中的任一種來製作， ® 且較佳爲依照PCT公開案WO 92/06193或EP 0239400之教示來製作，其均合倂於本文而作爲參考文獻）。人類化抗體可爲商業生產，舉例來說，由Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham，Middlesex, Great Britain 戶斤生產者。進一步的參考文獻可見 J ο n e s e ί α /.，jV a i w r e 3 2 1 : 5 2 2 - 5 2 5 ( 1 9 8 6); Riechmann et al., Nature 332:323-329 ( 1 988)；和 Presta， Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 -5 96 ( 1 992)，其均合倂於本文而作爲參考文獻。

(T -19- 1374935

在另一較佳具體例中，上述單株、嵌合或人類化抗體可包含不會在自然界任何物種之任何抗體中天然存在的胺基酸殘基。舉例來說，可以利用這些外來殘基在單株、嵌合或人類化抗體獲得新穎或經改質的特異性、親和力或效用子的功能。在另一較佳具體例中，上述抗體可共軛至用作系統性藥物治療的藥物上，其如毒素、低分子量細胞毒性藥物、生物反應改質劑、和放射核種（見如Kunz ^ α/.， Calicheamicin derivative-carrier conjugates, • US20040082764A1)。在一具體例中，該抗體是一種會與澱粉樣蛋白前趨物蛋白之Αβ片段、或與澱粉樣蛋白斑塊之其他組分進行特異結合的抗體，且可用於對抗腦部的澱粉樣蛋白斑塊累積，這是阿兹海默症（Alzheimer’s disease)的特徵（如見US 臨時申請案60/63 6,684 )。在一其他具體例中，本發明之抗體會對抗在增生性疾病（如癌症）標的細胞及/或組織上表現的T細胞表面抗原。 ® 在一具體例中，該抗體爲一 IgGl抗-路易斯Y抗體。路易斯 Y 是一種帶有 Fucql — 2Galfll — 4[Fuc$l — 3]GlcNacBl—3R結構的碳水化合物抗原（Abe ei αί· (1983) J. Biol. Chem.，258 11793-11797)。60 % 至 90 % 人類上皮腫瘤（包括那些乳房、直腸、肺臟和前列腺的上皮腫瘤）的表面會表現路易斯Y抗原，其中至少4 0%會過度表現此抗原，而其在正常組織中的表現則是有限的。爲了找出Ley標的並有效地找出腫瘤標的，理想上需

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1374935 要一種對抗原具有獨占特異性的抗體。因此’本發明之抗路易斯Y抗體較佳爲不與第1型結構（即乳糖系列血型（Lea 和Leb))產生交互作用’且較佳爲不與其他第2型抗原決定部位（即新乳糖結構，如Lex和H-2型結構）結合。— 較佳之抗-路易斯Y抗體的實例稱爲hu3S 193 (見美國專利第 6,310，185、6,518,415、5,874,060 號，以其整體合倂於本文）。人類化抗體 hu3S193 ( Attia, M.A·，w fl/. 1787-1800)係藉由 CDR 移植（CDR-grafting)從 3S193 生 ® 成的，其中3S193爲鼠單株抗體，係對抗腺癌細胞、且帶有對 Ley 之非凡特異性（Kitamura，K.，12957-12961)» Hu3S193不僅保有3S193對Ley之特異性，也得到了中介補體依存性之細胞毒性（complement dependent cytotoxicity，以下稱爲CDC)的能力和中介抗體依存性之細胞的細胞毒性（antibody dependent cellular cytoxicity，以下稱爲 ADCC) ( Attia，M.A.，ei αΛ 1787-1800)。這種以在裸鼠中有Ley表現之異種移植物爲標的的抗體係以用 ® 1251、lllln或18F或其他需要螯合劑的放射標示如min、 99mTc或90Y加以標示之hu3S193的生物分布硏究來加以測定（Clark，ei αί. 4804-4811)。在一其他具體例中，該抗體是名爲Myo29、My〇28和 My〇22之人類抗-GDF-8抗體、以及從抗體與抗原結合片段得出者當中的一種。這些抗體可結合具有高親和力之成熟 GDF-8 ’且如說明所述，其會抑制生物體外和生物體內的 GDF-8活性（舉例來說，藉由ActRIIB結合的抑制和報導 -21- 1374935

基因測定法來進行），且可抑制骨骼肌質量和骨密度之負調控有關之GDF-8活性，如見Veldman，ei α/，美國專利申請案第 20040 1 42 3 8 2 號。 - 受器另一類業已顯示出能作爲醫藥及/或商業藥劑的多胜肽係包括受器。受器~般係穿透膜之糖蛋白，其可藉由辨識細胞外傳訊配位體來作用。受器除了具有配位體辨識功能區以外，一般還具有蛋白激酶功能區，其會藉由在與配 ® 位體結合時將標的細胞內分子磷酸化而開啓傳訊路徑，而造成細胞內之發育性或代謝性改變。在一具體例中，係將興趣受器加以改質而移除穿透膜之功能區及/或細胞內功能區（可爲多個）’取代可能選擇性連接在Ig-功能區上的東西。在一較佳具體例中，要根據本發明而生產之受器爲受器酪胺酸激酶（RTK)。RTK家族包括對多種細胞類型之多種功能來說爲非常重要的受器（如見Yarden and Ullrich， Ann. Rev. B i o c h e m . 57:433-478, 1 9 8 8; Ullrich and 胃 Schlessinger，Ce// 61:243-254，1990,其合倂於本文而作爲參考文獻）。RTK之非限制性實例包括纖維母細胞生長因子 (FGF)受器家族的成員、上皮生長因子受器（EGF)家族的成員、血小板源生長因子（PDGF)受器、帶有免疫球蛋白和EGF同源功能區- l(TIE-l)和TIE-2的酪胺酸激酶受器（Sato ei α/·，376(6535):70-74 (1995)’ 合倂於本文作爲參考文獻）和c_Met受器；有人認爲其中有一些會直接或間接地促進血管生成（Mustonen and Alitalo，J. ⑧ -22- 1374935

Ce// 5i〇/. 129:895-898，1995)。RTK 之其他非限制性實例包括胎肝激酶1 ( FLK-l)(有時稱爲含激酶插入功能區之受器（Κ ύ R) (T e r m a n e ί α Λ，0 n c 〇 g e n e 6 : 1 6 7 7 - 8 3，1 9 9 1)或血管內皮細胞生長因子受器2(VEGFR-2) )，fms樣酪胺酸激酶 -1 ( Fit- 1 ) ( DeVries et al. Science 2 5 5 ;9 8 9-99 1 , 1 992;

Shibuya " a/·，Oncogene 5:5 1 9-524, 1 990 )，有時稱爲血管內皮細胞生長因子受器1 (VEGFR-1)、神經纖毛蛋白-1 (neuropilin-Ι )、內皮因子（endoglin)、內皮唾酸蛋白 • ( endosialin)、和Axl。具有通常知識者當可察覺其他可根據本發明而有較佳表現之受器。在一特佳具體例中，腫瘤壞死因子α和β受器形式之腫瘤壞死因子抑制劑（TNFR-1，ΕΡ 4 1 7,563，1991年3月 20 日公開；和 TNFR-2，ΕΡ 417,014，1991 年 3 月 20 曰公開）係根據本發明來表現（文獻回顧見Nai smith and Sprang， ·/ /«//ο/«π. 47(1-2):1-7 (1995-96)，其合倂於本文而作爲參考文獻）。根據一具體例，腫瘤壞死因子抑制劑包含一可溶 ® 性TNF受器，且較佳爲一TNFR-Ig。在一具體例中，本發明之較佳TNF抑制劑爲TNFRI和TNFRII之可溶性形式、以及可溶性TNF結合蛋白。在另一具體例中，TNFR-Ig融合爲TNFR : Fc，當這個詞語用於此處時，係指「依那西普 (etanercept)」，其爲p75 TNF-.α .受器之兩個細胞外部份分子的二聚物，其中各分子係由人類IgG. sub .1之235個胺基酸的Fc部所構成。 - 生長因子和其他傳訊分子 ⑧ -23-

1374935 另一類業已顯示出有作爲醫藥及/或商業藥劑效果的多胜肽包括生長因子和其他傳訊分子。生長因子一般爲糖蛋白，其係由細胞所分泌，且會結合至其他細胞上的受器並將之活化，以會在受器細胞中引發代謝或發育上的改變。在一具體例中，興趣蛋白爲一 ActRIIB融合多胜肽，其包含ActRIIB受器之細胞外功能區和抗體之Fc部（如見 Wolfman, et al., ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor，US2004/0223 966 Al)。在一其他具體例中，生長 • 因子可爲一經改質之 GDF-8原胜肽（propeptide)(見如

Wolfman, e t al. , Modifed and stabilized GDF propolypeptides and uses thereof, US2003/0 1 04406 Al)° 或者，興趣蛋白可爲一含有卵泡抑素（follistatin)功能區之蛋白（如見 Hill, ei a/·，GASP1: a follistatin domain containing protein, US 2003/0 1 627 1 4 Al, Hill, et al., GASP1: a follistatin domain sontaining protein, US 2005/0106154 A1 , Hill, e t al. , Follistatin domain • contai nin g p ro teins，U S 2 0 0 3/0 1 8 0 3 0 6 A 1 )。哺乳類生長因子和其他傳訊分子的非限制性實例包括細胞激素：上皮生長因子（EGF );血小板源生長因子 (PDGF);纖維母細胞生長因子（FGF)如aFGF和bFGF; 轉化生長因子（TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-βΙ、 TGF-P2、TGFj3、TGF-P4、或 TGF-P5;胰島素樣生長因子-I 和- II(IGF-I 和 IGF-II); des(l-3)-IGF-I (腦 IGF-I); 胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白如CD-3、CD-4、CD_8 ⑧ -24-

1374935 和CD-19;紅血球生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成蛋白（BMP):干擾素，如干擾素-α、-β和-γ ;群落刺激因子（colony stimulating factor, CSF)’ 如 M-CSF、GM-CSF 和G-CSF;介白素（TL)，如IL-1至IL-10;腫瘤壞死因子 (TNF)a和β ;胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；促濾泡成熟激素；降鈣素；黄體化激素；昇糖素；凝血因子，如第VIIIC因子、第IX因子、組織因子、和凡威勒伯氏因子（von Willebrands factor);抗凝血因子，如蛋白C;血管促尿因子（atrial natriuretic factor);肺界面活性劑；胞漿素原活化劑，如尿激酶或人類尿液或組織型胞漿素原活化劑（t-PA);蛙皮素（bombesin );凝血酶、造血生長因子；腦啡狀酶；RANTES (Regulated on Activation Normally T cell Expression and Secretion，正常地調整T細胞表現與分泌之活化的因子）；人類巨噬細胞發炎蛋白（MIP-1-α); 穆勒管抑制用受質（mullerian-inhibiting substance);鬆驰素Α·鏈；鬆弛素B -鏈；鬆弛素原；小鼠性腺激素相關胜肽； ^ 嗜神經因子，如骨源嗜神經因子（BDNF)、神經營養素 (neurotrophin ) -3、-4、-5、或-6 ( NT-3、NT-4、NT-5、或NT-6)、或神經生長因子如NGF-β。具有通常知識者當可察覺其他可根據本發明而表現的生長因子或傳訊分子。 -G-蛋白偶合受器另一類業已顯示出有作爲醫藥及/或商業藥劑效果之多胜肽包括生長因子和其他傳訊分子。G-蛋白偶合受器 (GPCR )是具有七個穿透膜之功能區的蛋白。一旦結合到 (S) -25- 1374935

GPCR之配位體上，訊號會在細胞內進行轉換，而生物或生理性質上的改變。伴隨著G-蛋白和作用器（藉由G-蛋白來調節的酶和通道）的 GPCR爲一模組式傳訊系統 signaling system)的組分，會將細胞內第二信使至細胞外的輸入。這些基因和基因產物是疾病的物。在視紫紅質基因和V2血管加壓素受器基因 • 缺損業已顯示其會引起各種形式體染色體顯性與隱性的視網膜色素變性、腎性尿崩症。這些受器經系統和周邊生理性突出都極爲重要。GPCR蛋白現已含有超過250種的旁系同源物（par alogue，因複製（或其他方法）產生之會表現出變異的受器系同源物係與直系同源物（orthologues，來自不相同受器）相對。這個超級家族可分成五個家族族，近年來代表200個以上獨特成員的受器，其 ® 紅質和β2-腎上腺素受器爲其典型受器；第II家來的特徵爲副甲狀腺激素/降鈣素/腸泌素受器家ί 家族，即在哺乳類中之代謝型麩胺酸受器家族：族，即cAMP受器家族，在黏菌（D. 性和發育是十分重要的；以及第V家族，即真菌蒙受器，如STE2。 GPCR包括對生物胺之受器、對發炎之脂質胜肽激素、和感覺訊號中介物之受器。當受器與造成細胞之細胞內 (modular 狀態連結潛在致病中的特定體染色體對中樞神超級家族即藉由基 )，其中旁同物種之 :第I家中以視紫族，近年疾；第III 第IV.家 !)的趨化交配費洛中介物、其細胞外 ⑧ -26- 1374935

配位體結合時，GPCR會被活化。配位體-受器交互作用在 GPCR所引起的構型改變會影響G蛋白對GPCR細胞內功能區的結合親和力。這會使GTP以加強的親和力與G蛋白結合。藉由GTP活化G蛋白會造成G蛋白α次單元與腺苷酸環化酶或其他第二信使分子生成物產生交互作用。此交互作用會調整腺苷酸環化酶之活性，從而生產第二信使分子 cAMP。cAMP會調整其他細胞內蛋白之磷酸化作用和活化 # 作用。或者，其他第二信使分子（如cGMP或類二十碳酸 (eicosinoids))之細胞含量可能會因GPCR活性而向上或向下調整。G蛋白α次單元會藉由GTP酶將GTP水解而去活化，且α、 β和γ次單元會再次聚集，之後異三聚型之G蛋白會從腺苷酸環化酶或其他第二信使分子生成物解離出來。GPCR之活性亦可藉由細胞內和細胞外功能區或環區 (loop )之磷酸化作用來加以調整》麩胺酸受器會形成一群在神經傳導方面十分重要的 ® GPCR。麩胺酸是在CNS中的主要神經傳導物質，咸信其在神經可塑性、認知、記憶、學習和一些神經病症（如癲癇症 '中風、和神經退化性病症）方面扮演重要角色（Watson， S. and S. Arkinstall (1 994) The G- Protein Linked Receptor Facts Book，Academic Press, San Diego C A, pp. 13 0- 132)。麩胺酸的這些效用是由兩種不同種類之受器來介中以卩 m 型通謝子 ^,7 離和性 } 生 1C內 P 一 ο I otr有 on含 i SP (受型型子子隹 0 〇爲器稱受其0 ⑧ -27- 1374935

道，並會中介麩胺酸的快速興奮作用。代謝型受器則是調節性的’會藉由抑制具有鈣依存性之鉀傳導度，來增加神經元的膜興奮度，且會抑制以及增加離子型受器之興奮傳導。代謝型受器廣泛地分布在腦組織中，可根據激動劑藥理學和訊息傳遞路徑將之分爲五種亞型。血管活性腸多胜肽（VIP)家族是一群其作用亦藉由 GPCR來加以中介的相關多胜肽。此家族之重要成員是VIP 本身、腸泌素、和生長激素釋放因子（GRF)。VIP具有廣 • 泛的生理作用，包括平滑肌之放鬆、各種組織之分泌情形的刺激或抑制、各種免疫細胞活性之調節、以及在CNS中各種興奮活性和抑制活性。腸泌素會刺激在胰臟和小腸中之酶和離子的分泌，且在腦中也有少量的表現。GRF是一種重要的神經內泌素，會調控生長激素從腦下垂體前葉之合成和釋出（Watson, S. and S· Arkinstall supra，ρρ. 278-283)。在配位體結合至GPCR上之後，會將一種構型上的改 ® 變傳送給G蛋白，其會使a-次單元將結合的GDP分子與 GTP分子互換，而從βγ_次單元上解離。α-次單元之GTP 結合形式一般係作爲調節效用子的部分，而產生第二信使’如環形AMP (如藉由腺苷酸環化酶之活化）、二醯基甘油或肌醇磷酸鹽。目前在人類當中已知的α·次單元有20 種以上不同的類型，其會與較小群的β和γ次單元結合在一起。哺乳類G蛋白之實例包括Gi、Go ' Gq、Gs和Gt。G 蛋白在以下文獻中有廣泛的描述：Lodish H. ei d. ⑧ -28- 1374935

Molecular Cell Biology, ( Scientific American Books Inc., New York，N.Y.，1 995 )，其內容合倂於本文而作爲參考文獻。 GPCR是藥物作用和發展之主要標的。事實上，受器已在目前已知藥物之半數以上站在先導地位（Drews， Nature Biotechnology, 1996, 14: 1516)，而 GPCR 則爲治療性干預最重要的標的，其中臨床所開立的藥物有30%是會拮抗或促進 GPCR 者（Milligan, G. and Rees，S·，（ 1 999) # TIPS, 20:118-124)。此係說明：使用這些受器來作爲治療標的的歷史業已確立並已經過驗證。一般來說，本發明之實施人會選擇他們感興趣之多胜肽，而且會知道它的精確胺基酸序列。本發明之技術已成功地應用到多種多胜肽之生產，舉例來說，該多胜肽包括針對生長及分化因子8之人類單株抗體（實施例1、3、4、 7-14 )、人類化抗-路易斯Y抗體（實施例5和6 )、抗- ABeta (實施例15 )以及腫瘤壞死因子受器之二聚性Fc-融合蛋 ® 白（實施例16)，表示本發明將可用於多種不同多胜肽和有度件會密條都胞養白細培蛋的同定胞相特細在何之種任養一之培另現所比表響會來影能月匕匕 Ϊ | 口發可量本且含據，現根性表要特其。特且現獨，表的率之己活白自存蛋它或當多適定可特將何者任識之知現常表通所有使具以 ο > 少物得成來組白和蛋驟或步肽之胜明多發之本長變生改下地化適最產生或 // 及長生胞細的白蛋或肽胜數因制控因基 -29.- 1374935 • · 對具有通常知識者來說將十分清楚的是’可用基因控制因數來調整多胜肽或蛋白之基因表現。應選擇這類基因控制因數，使之在相關宿主細胞中有活性。控制因數在限定環境下可能持續有活性或可能是誘導性的。在所表現之蛋白有毒或對細胞生長及/或存活率會有有害的效用時，誘導性控制因數特別好用。在這樣的例子當中，透過誘導性控制因數來調控多胜肽或蛋白之表現可能會改善細胞存活率、細胞密度及/或所表現之多胜肽或蛋白的總產率。大多 ® 數可用於實施本發明之控制因數係在該項技藝中爲已知或可用者。可依照本發明而使用之代表性持續性哺乳類啓動子包括但不限於：次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶（HPTR)啓動子、腺苷脫胺酶啓動子、丙酮酸酯激酶啓動子、P-肌動蛋白啓動子、以及其他具有通常知識者已知的持續性啓動子。此外，舉例來說，業已顯示會在真核細胞中驅動密碼序列之持續表現的病毒啓動子包括：猴病毒啓動子、簡單疱疹病 ® 毒啓動子、乳突病毒啓動子、腺病毒啓動子、人類免疫不全病毒（HIV)啓動子、勞氏肉瘤病毒（Rous Sarcoma virus) 啓動子、巨細胞病毒（CM V )啓動子、莫洛尼鼠血癌病毒 (Moloney murine leukemia virus)和其他反轉錄病毒之長端重複（LTR)、簡單疱疹病毒之胸苷激酶啓動子、以及其他具有通常知識者已知的病毒啓動子。誘導性啓動子會在誘導劑存在的情況下驅動以操控方式連結之密碼序列的表現，亦可根據本發明來加以使用。

-30- 1374935 • · 舉例來說，在哺乳類細胞中，金屬硫蛋白啓動子會在一些金屬離子存在的情況下誘導下游密碼序列的轉錄。其他誘導性啓動子則會被具有通常知識者辨識出來及/或爲具有通常知識者已知者。一般來說，基因表現序列亦會包括分別涉及開始轉錄和轉譯的 5’非轉錄序列和5’非轉譯序列，如TATA盒子 (T AT A box)' 蓋帽序歹 lj ( capping sequence)、 CAAT 序歹 lj 等。也可選擇性使用增強子因數來增加要表現之多胜肽或 # 蛋白的表現含量。已顯示會在哺乳類細胞作用之增強子因數實例包括如 Dijkema d β/·，EMBO J. (1985) 4: 761 所描述之 SV40早期基因增強子、Gorman ei α/.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982b) 79:6777所描述之取自勞氏肉瘤病毒（RSV )長端重複（LTR)的增強子/啓動子、和如Boshart «/·，Cell ( 1 9 8 5) 4 1:5 2 1所描述之人類巨細胞病毒。用來將控制因數連接至密碼序列的系統係在該項技藝中眾所周知者（一般分生和重組DNA技術係於Sambrook， Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY，1989 有所描述，其係合倂於本文而作爲參考文獻）。在多種生長和誘導條件下適用於插入較佳密碼序列而在各種哺乳類細胞中有所表現的商業載體亦爲在該項技藝中眾所周知者。 - 將密碼序列和相關控制因數引入宿主細胞適用於將足以達成興趣多胜肽或蛋白表現之核酸引入 d> -31 - 1374935

哺乳類宿主細胞的方法爲在該項技藝中眾所周知者。舉例來說，見 G e t h i n g e ί cr /.，W α ί w r e，2 9 3 : 6 2 0 - 6 2 5 ( 1 9 8 1 ); M ante i e t al.，Nature, 281 :40-46 ( 1 9 7 9) ； Levinson e t al.; EP 117,060和EP 117,058,均合倂於本文而作爲參考文獻。對哺乳類細胞來說，較佳的轉化方法包括Graham and van der Erb, Wro/og;；，5 2:4 5 6-4 5 7 ( 1 97 8)之磷酸鈣沉澱法、或 Ha w 1 ey-Ne1sοη， Focus 15:73 (1193)之 lipofectamineTM ( GibCO BRL)法。哺乳類細胞宿主系統轉 # 化的一般觀點係已在Axel於1983年8月16日獲准之美國專利第4,399,2 1 6號有所描述。對將哺乳類細胞轉化的各種技術來說’見 Keown ¢/ a/·，Me ί A 〇 d j /« 五《 w σ / σ 发/ ( 1 9 8 9 )， Keown e t al. , Methods in Enzymol ogy, 185:527-537 (1990)，和 Mansour e t al. , Nature, 336:348-352 (1988)° 用來在哺乳類細胞中表現多胜肽或蛋白之合適載體的非限制性代表實例包括 pCDNAl'pCD(見 Okayama, ei αΛ (1985) Mol. Cell Biol. 5:1 1 3 6- 1 1 42; p M C1 n e ο P ο 1 y - A，見 Thomas, ® ei fl/. (1987) Ce// 51:503-512 )、以及桿狀病毒載體，如 PAC 373 或 pAC 610。在較佳具體例中，係將多胜肽或蛋白永久地轉染至宿主細胞中。然而，具有通常知識者將會承認：本發明可使用暫時性或永久性轉染的哺乳類細胞。 - 細胞任何對細胞培養和多胜肽之表現敏感的哺乳類細胞或細胞類型都可根據本發明來加以利用。可依照本發明而使 ⑧ -32- 1374935

用之哺乳類細胞的非限制性實例包括BALB/c小鼠骨髓瘤細胞株（NSO/1，ECACC No: 8 5 1 1 05 03 );人類視網膜母細胞（PER.C6 (CruCell，Leiden, The Netherlands))；藉由 SV40轉化之猴腎臟 CV1細胞株（COS-7，ATCC CRL 1651);人類胚胎腎臟細胞株（293或將293個細胞進行次選殖而在懸浮培養物中生長，Graham " d.，J. Gen Virol.， 36:59 (1977));幼倉鼠腎臟細胞（BHK，ATCC CCL 10); 中國倉鼠卵巢細胞 +/-DHFR( CHO，Urlaub and Chasin, Proc • Natl. Acad· Sci. USA, 77:4216 (1980));小鼠支援細胞

(sertoli cell) ( TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 ( 1 9 80));猴腎臟細胞（CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎臟細胞（VERO-76，ATCC CRL-1 587);人類子宮頸癌細胞 (HeLa，ATCC CCL 2);犬腎臓細胞（MDCK，ATCC CCL 34 );布法羅大鼠（buffalo rat )肝臟細胞（BRL 3 A，ATCC CRL 1 442 )；人類肺臟細胞（W138，ATCC CCL 75);人類肝臟細胞（Hep G2，HB 8 06 5 );小鼠乳房腫瘤（MMT • 060562，ATCC CCL51); TRI 細胞(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.，383:44-68 (1982)); MRC 5 細胞；FS4 細胞；和人類肝癌瘤細胞株（Hep G2 )。在一特佳具體例中，本發明係用於由CHO細胞株培養和表現多胜肽和蛋白。此外，許多會表現多胜肽或蛋白之商業上可購得與不可購得的融合瘤細胞株可根據本發明來加以利用。熟習該項技藝者當可察知：爲了有最適生長和最適多胜肽或蛋白表現’融合瘤細胞株可能有不同的營養需求及/或可能需要 ⑧ -33- 1374935 • · 不同培養條件’且可能會根據其需要來改變條件。如上所記，在許多例子當中，細胞會經過選擇或經過工程處理，來生產高含量之蛋白或多胜肽。通常，細胞係經過基因工程來生產高含量之蛋白，例如藉由引入一帶有興趣蛋白或多胜肽密碼之基因及/或藉由引入一會調整帶有該興趣多胜肽密碼之基因表現的控制因數（無論是內生性或引入者均可）。一些多胜肽可能會對細胞生長、細胞存活率或一些其 ® 他從某方面來說最後會限制興趣多胜肽或蛋白之細胞生產的特性有不良效用。甚至在一特定類型經工程處理而表現出一特定多胜肽之細胞族群中，細胞族群內也有變異存在，如一些個別細胞會長得較好及/或生產更多興趣多胜肽。在本發明的一些較佳具體例中，細胞株係由實施人依照經驗來加以選擇，而在選來培養細胞之特定條件下健康地生長。在特佳具體例中，係基於細胞生長、最終細胞密度、細胞存活率百分比、所表現之多胜肽的滴定度、或任 ® 何此等之組合 '或任何其他被實施人視爲重要的條件者，將經工程處理而表現出一特定多胜肽之個別細胞選出來做' 大規模生產。 - 細胞培養相生產興趣多胜肽之一般程序包括批式培養和批式供給培養。批式培養方法傳統上包括：將在特.定細胞密度之種培養物接種至大規模生產培養物中，使細胞在有助於細胞生長和存活率的條件下生長，在細胞達到一特定細胞密度 -34- 1374935

時收取培養物，以及純化所表現之多胜肽。批式供給培養程序另外包括一個或多個對批式培養物補充營養物、和其他在細胞生長期間被消耗掉之組分的步驟。傳統批式和批式供給培養有個懸而未決的問題，即代謝廢物的生產，其對細胞生長、存活率、和所表現之多胜肽的生產有不良效用。有兩種效用特別不良的代謝廢物，即乳酸鹽和銨，其生產分別是葡萄糖和麩醯胺酸代謝的結果。除了銨的酵素性生產（其爲麩醯胺酸代謝結果）之外，銨也會在細胞培 # 養物中累積（這是整個時間當中非代謝分解的結果）。本發明提供一種多胜肽之大規模生產的改良方法，其係藉由延緩、甚至逆化銨和乳酸鹽在細胞培養物中之累積，來將這些廢物的不良效用最小化。具有通常知識者將會承認：本發明可被用於任何將細胞培養在包括但不限於批式、批式供給和灌注系統中的系統》在本發明的一些較佳具體例中，細胞係在批式或批式供給系統中生長。 - 培養基 ® 傳統培養基配方，包括商業上可購得之培養基如

Ham's F10 ( Sigma)、最小必須培養基（[MEM]，Sigma)、 RPMI-1640 ( Sigma)和 Dulbecco's Modified Eagle's 培養基（[DMEM]，Sigma)，均含有與其他胺基酸相較之下相對含量較高之葡萄糖和麩醯胺酸。由於這些組分是細胞的基本代謝能量來源，現已認爲它們會有大量需求。然而，這些營養物的快速消耗會導致上述之乳酸鹽和銨的累積。此外，葡萄糖和麩醯胺酸之初始含量高、和後來乳酸鹽和銨

-35- 1374935 • · 的累積會造成高滲透濃度，這個條件本身常常會對細胞生長、細胞存活率、和多胜肽之生產有不良效果。本發明提供多種培養基配方，在依據其他在此處所描述之培養步驟來使用時，其會使乳酸鹽和銨的累積達到最小、甚至逆化。在細胞生長及/或存活率方面、或在多胜肽或蛋白之表現方面已顯示出具有有利效用之本發明培養基配方包括一種以上之下列特性：i)每單位體積累計胺基酸量高於約70 mM，ii)累計麩醯胺酸對累計天冬醯胺酸之莫 φ 耳比率低於約2，iii)累計麩醯胺酸對累計總胺基酸之莫耳比率低於約0.2，iv)累計無機離子對累計總胺基酸之莫耳比率介於約0.4至1之間，和v)每單位體積麩醯胺酸和天冬醯胺酸的合倂累計量高於約16 mM»具有通常知識者當可了解：如上文中所用之「累計」，係指在細胞培養的過程中加入之特定組分或各組分的總量，包括在開始培養時加入之組分、和後續加入之組分。具有通常知識者當可了解：本發明之培養基配方包括限定和非限定培養基兩者。 # 與本發明之培養基配方相較之下，傳統培養基配方一開始的總胺基酸相對含量較低。舉例來說，被稱爲DME-F 12 (Dulbecco's Modified Eagle's 培養基和 Ham's F12 培養基之5 0 : 5 0混合物）之傳統細胞培養的培養基，其總胺基酸含量爲7.29 mM;而被稱爲RPMI-1640之傳統細胞培養的培養基，其總胺基酸含量爲6.44 mM(如見H.J. Morton，/η vitro, 6:89-108 (1970), R.G. Ham, Proc. Nat. Assoc. Sci. (USA), 5 3:2 88 -2 93 ( 1 965 ), G.E. Moore et al., J. Am. -36- 1374935 • ·

Medical Assn·，199:519-24 (1967)，均合倂於本文而作爲參考文獻）。在本發明的一些具體例中，在培養物之培養基中之胺基酸濃度較佳係高於約70 mM。又更佳者，本發明之培養基配方包含在起始培養基中的胺基酸濃度高於約70 mM。現已顯示，當起始培養基之胺基酸濃度在此範圍內時，細胞密度和滴定度在培養的生長期間會增加（見實施例 1 3 )。此外，在本發明之一些具體例中，相較於其他商業上 # 可購得與不可購得之培養基，在培養物之培養基中麩醯胺酸對天冬醯胺酸的莫耳比率會降低。在培養物之培養基中麩醯胺酸對天冬醯胺酸的莫耳比率較佳係低於約2。此外，在本發明之一些具體例中，相較於其他商業上可購得與不可購得之培養基，在培養物之培養基中麩醯胺酸對總胺基酸的莫耳比率會降低。在培養物之培養基中麩醯胺酸對總胺基酸的莫耳比率較佳係低於約0.2。根據本發明而降低在起始培養基中麩醯胺酸對天冬醯 ® 胺酸或對胺基酸總濃度之莫耳比率的一項有趣而出乎意料的結果是：除了觀察到銨之累積降低以外，也看到乳酸鹽之累積降低。在一些具體例中的銨和乳酸鹽累積含量不僅低於對照培養物的累積含量，事實上，其量在初始的累積之後確實有所降低（舉例來說，見實施例3和7 )。

Boraston(美國專利編號5,871，999)業已揭示一種其中總無機離子對總胺基酸之莫耳比率介於1和1 〇之間的培養物之培養基。Boraston顯示：對總無機離子對總胺基酸 -37- ⑧ 1374935

之莫耳比率在此範圍之內的培養物提供該培養基，則生長在該培養基中之CHO細胞的群聚情形會降低。在本發明的另一較佳具體例中，在此培養物之培養基中的總無機離子對總胺基酸之莫耳比率甚至會被降得更低，降到介於約0.4 至1之間。如在實施例1 3中所示，將此比率從1.7 5降至大約0.7會造成所表現之多胜肽或蛋白在細胞密度和生產方面於培養物生長期間有明顯增加。在本發明的另一較佳具體例中，該培養物之培養基所 Φ 含的麩醯胺酸和天冬醯胺酸之合倂濃度介於約16和36 mM 之間。如在實施例1 4、表22中所示，於所含麩醯胺酸和天冬醯胺酸之合倂總濃度在此範圍內之培養基中，所表現之多胜肽會展現出比於所含總麩醯胺酸和天冬醯胺酸合倂濃度在此範圍外之培養基中更高的滴定度。具有通常知識者當可選擇麩醯胺酸和天冬醯胺酸之合倂總濃度確實在此範圍內者’以使細胞生長及/或存活率最適化、並使所表現之多胜狀的生產達到最大。 ® 再者’具有通常知識者將會承認：以上所列的任何條件均可單獨使用或與另一項條件作各種合倂而使用。藉由利用其中有一項、某幾項、或所有之上述特性條件的培養基配方，具有通常知識者將可使細胞生長及/或存活率最適化，並使所表現之多胜肽的生產達到最大。在本發明所揭示之任何這些培養基配方可選擇性補充作爲必須品之下列物質：激素及/或其他生長因子、特定離子（如鈉、氯化物、鈣、鎂、和磷酸鹽）、緩衝劑、維生素、 -38- ⑧ 1374935 • · 核苷或核苷酸、稀有元素（無機化合物之最終濃度常低）、胺基酸、脂質、蛋白水解物、或葡萄糖或其來源。在本發明的一些具體例中，對培養基補充化劑如六亞甲基-貳（乙醯胺）（“ Η Μ B A ”）和丁酸鈉（‘ 可能是有利的。這些選擇性補充物可在開始培養時或可在之後的時點加入，以添補耗盡的營養物或達目的。具有通常知識者當可察覺可能會被包括在所養基配方中之任何理想或必須的補充物。 •-提供哺乳類細胞培養物多種藉由批式和批式供給培養來製備各種用來白或多胜肽之哺乳類細胞的方法係在該項技藝中眾者。如上所述，可藉由多種眾所周知之技術來將足表現的核酸（一般來說，係內含帶有興趣多胜肽或碼之基因、且與基因控制因數有任何操作性連結的 ’引入宿主細胞株。一般來說，細胞會經過篩選，以一種宿主細胞會確實地將載體攝入並表現興趣多胜 • 白。偵測由哺乳類細胞所表現之特定興趣多胜肽或傳統方法包括但不限於免疫組織化學、免疫沉澱、胞儀、免疫螢光顯微鏡、SDS-PAGE、西方墨點法、免疫吸附測定法（ELISA )、高效液相層析（HPLC ) 生物活性測定法、和親和力層析法。具有通常知識察覺：其他用來偵測所表現之多胜肽或蛋白的適當若有多個宿主細胞會表現興趣多胜肽或蛋白，可使出之技術當中的幾項或所有技術，以決定哪一個細通常非他能量學誘導 N a B ’，）加入，到其他揭示培生產蛋所周知以達成蛋白密載體）決定哪狀或蛋蛋白的流式細酶標記技術、者當可技術。用所列胞會表 ⑧ -39- 1374935

現出最高含量之多胜肽或蛋白。一旦鑑定出會表現興趣多胜肽或蛋白的細胞，就會藉由多種具有通常知識者所周知之方法當中任何一種來在培養物中繁殖細胞。會表現興趣多胜肽或蛋白之細胞一般係藉由使它在有益於細胞活存、生長和存活的溫度和培養基下生長而加以繁殖。初始培養物體積可能是任何大小，但常常小於在最終生產興趣多胜肽或蛋白時所用之生產生物反應器的培養物體積’且細胞常常在種入生產生物反應器 • 之前於體積逐漸增加之生物反應器中進行數次繼代培養。可攪拌或搖盪細胞培養物，以增加培養基的氧合作用 (oxygenation )與營養物對細胞的分散度。或者，或說此外，可使用係該項技藝中眾所周知之特殊噴灑裝置來增加並控制培養物之氧合作用。根據本發明，具有通常知識者當可了解：控制或調整一些生物反應器之內部條件（包括但不限於pH、溫度、氧合作用等）可能是有利的。在生產生物反應器中的起始細胞密度可由具有通常知 ® 識者來加以選擇。根據本發明，在生產生物反應器中的起始細胞密度可低至在每培養體積只有單一細胞。在本發明的較佳具體例中，在生產生物反應器中的起始細胞密度範圍可從每毫升約2χ102存活細胞至每毫升約2x103、2x104、 2χ105、2χ106、5xl06 或 ΙΟχΙΟ6 存活細胞以上。在種入下一個中間或最終生產生物反應器之前，可使初始和中間細胞培養物生長至任何理想密度。雖然不需要全數存活或近於全數存活，但較佳爲多數細胞在種入之前 •40- 1374935

維持活著的狀態。在本發明的一具體例中，可藉由如低速離心來將細胞從上清液中移除。在種入下一個生物反應器之前，先將所移除之細胞以培養基加以清洗而移除任何不要的代謝廢物或培養基組分亦是理想的。該培養基可能是細胞先前所生長的培養基、或可能是由本發明之實施人所選擇之不同培養基或清洗溶液。之後可將細胞稀釋至用來種入生產生物反應器的適當密度。在本發明的一較佳具體例中，係將細胞稀釋到會在 Φ 生產生物反應器中使用之相同培養基內。或者，可依照本發明之實施人的需要或想法、或爲了適應細胞本身之特定需求（舉例來說，如果它們在'種入生產生物反應器之前儲存了一段短時間的話），而將細胞稀釋至另一培養基或溶液內。 - 初始生長相 —旦在生產生物反應器中如上所述地種入細胞，則將細胞培養物在有助於細胞培養物活存、生長和存活率的條 ® 件下維持在初始生長相。明確的條件會根據細胞類型、取得該細胞的生物體、和所表現之多胜肽或蛋白的性質和特性而有所改變。根據本發明，生產生物反應器可爲任何適用於大規模生產多胜肽或蛋白的體積。在一較佳具體例中，生產生物反應器之體積爲至少5 00公升。在其他較佳具體例中，生產生物反應器之體積爲1000、2500、5000、8000、10,000、 1 2,000公升以上、或任何介於其間的體積。具有通常知識 -41 - ⑧ 1374935

者當可察覺且當可選擇一在實施本發明中使用的合適生物反應器。生產生物反應器可以用任何有助於細胞生長和存活率、且不會干擾所生產之多胜肽或蛋白表現或穩定性的材料來加以建構。細胞培養在初始生長相之溫度主要係基於會使細胞培養物保持存活之溫度範圍來加以選擇。舉例來說，在初始生長相期間，CHO細胞係於37°C時生長良好。一般來說，多數哺乳類細胞在約25 °C至42 °C之範圍內生長良好。較佳 ® 者，哺乳類細胞在約35 °C至40 °C之範圍內生長良好。具有通常知識者當可選擇使細胞生長之適當溫度（可爲多種溫度），其係視細胞的需要和實施人之生產需求而定。在本發明的一具體例中，初始生長相之溫度係維持在單一恆溫。在一其他具體例中，初始生長相之溫度係維持在一溫度範圍內。舉例來說，溫度可在初始生長相期間持續地增加或減少；或者，溫度可在初始生長相期間的各個時間點依照個別量來增加或減少。具有通常知識者將可決 ® 定是否應該使用單一或多個溫度，以及是否應該持續地調整溫度或依照個別量來加以調整。可使細胞在初始生長相生長一段較長或較短的時間，其係取決於實施人的需要和細胞本身的需求。在一具體例中，係使細胞生長一段足以使其存活細胞密度達到最大存活細胞密度之特定百分比的時間，其中最大存活細胞密度係使細胞在不受干擾的情況下生長最後會達到的密度。舉例來說，可能使細胞生長一段足以達到一理想存活細胞密 -42- 1374935

度的時間，其中該理想存活細胞密度係最大存活細胞密度之 1、5、1〇、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95 或 99 百分比。在另一具體例中，係使細胞生長一限定時期。舉例來說’視細胞培養物的起始濃度、細胞生長之溫度、和細胞內部生長率而定，可使細胞生長〇、1、2、3、4、5、6、7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17' 18、 19、 20 天以上》在某些例子當中，可使細胞生長一個月以上。若細鲁胞於初始生長相溫度在種生物反應器內的生長足以使生產生物反應器中之存活細胞密度於接種時已爲最大存活細胞密度之理想百分比，則細胞在生產生物反應器中生長0 天。本發明之實施人當可依據多胜肽或蛋白之生產需求和細胞本身的需要來選擇初始生長相期間的長短。可在初始培養相期間攪拌或搖盪細胞培養物，以增加氧合作用和營養物對細胞之分散度。根據本發明，具有通常知識者當可了解：在初始生長相期間控制或調整一些生 ® 物反應器的內部條件可能是有利的，其條件包括但不限於 pH、溫度、氧合作用等。舉例來說，PH可藉由提供適量之酸或鹼來加以控制，而氧合作用可用該項技藝中眾所周知之噴灑裝置來加以控制。 - 轉換培養條件根據本發明之教示，在初始生長相終止時，可轉換至少一項培養條件，從而施用第二組培養條件，且代謝轉換係在培養物中進行。抑制性代謝物（特別是乳酸鹽和氨） -43- 1374935 • · 會抑制生長。藉由改變如細胞培養之溫度、pH、滲透壓値或化學誘導劑含量而達成之代謝轉換，其特性爲特定乳酸鹽生產速率對特定葡萄糖消耗速率的比率會減少。在一非限制性具體例中，培養條件係藉由轉換培養物之溫度而加以轉換。然而，如該項技藝中已知者，轉換溫度不是唯一可達成適當代謝轉換的機制。舉例來說，這類代謝轉換亦可藉由轉換其他培養條件而達成，其條件包括但不限於： pH、滲透壓値、和丁酸鈉含量。如上述討論，培養物轉換 # 的時間點會由本發明之實施人基於多胜肽或蛋白生產需求或細胞本身的需要來加以決定。當轉換培養物的溫度時，溫度轉換可能是相對上很緩慢的。舉例來說，可能要花上數小時或數天來完成這項溫度改變。或者，該溫度轉換可能是相對上很突然的，舉例來說，這項溫度改變可能會在數小時以內便完成》倘若是適當的生產和控制儀器（如多胜肽或蛋白的商業大規模生產標準），這項溫度改變可能甚至會在一小時內便即完成。 • 在後續成長相中之細胞培養溫度會基於使細胞培養物維持存活且表現出商業上足量之重組多胜肽或蛋白的溫度範圍來加以選擇。一般來說，多數哺乳類細胞維持存活且表現出商業上足量之重組多胜肽或蛋白是在約25°C至42 °C之範圍內。哺乳類細胞維持存活且表現出商業上足量之重組多胜肽或蛋白較佳是在約2 5 °C至3 5 °C之範圍內。具有通常知識者將可選擇使細胞生長的適當溫度或溫度，其係取決於細胞的需要和實施人的生產需求。 -44- 1374935

在本發明的一具體例中，後續生長相之溫度係維持在單一恆溫。在一其他具體例中，後續生長相之溫度係維持在一溫度範圍內。舉例來說，可使溫度在後續成長相期間持續地增加或減少。或者，可使溫度在後續成長相期間的各段時間個別增加或減少一定量。具有通常知識者當可了解：此具體例係包含多個個別溫度轉換。舉例來說，可將溫度轉換一次，將細胞維持在此溫度或溫度範圍一段時間，而後可將該溫度再次轉換到較高或較低的溫度。在各 • 次個別轉換後，培養物之溫度可爲恆定、或可維持再一定溫度範圍內。在實施例16中，顯示的數據說明：雖然具有通常知識者根據本發明將可了解使用兩次連續溫度改變的效率，但可使用三次以上連續溫度改變來增加細胞存活率或密度及 /或增加重組多胜肽或蛋白表現。在各連續的溫度轉換之後，細胞培養物之溫度或溫度範圍可能會高於或低於在轉換之前的溫度（可爲多個）或溫度範圍（可爲多個）》在本 ® 發明的一較佳具體例中，各連續溫度或溫度範圍係低於先前的溫度或溫度範圍。 - 後續生產相根據本發明，一旦細胞培養的條件已有如上述討論之轉換，細胞培養物係在後續生產相中維持在有助於細胞培養物之活存和存活率、且有助於表現出商業上足量之重組多胜狀或蛋白的第二組培養條件下。如上述討論，該培養物可藉由轉換許多培養條件當中 -45- 1374935 • · 一個以上的條件來進行轉換，其條件包括但不限於：键 pH '滲透壓値、和丁酸鈉含量。在一具體例中，所轉是培養物之溫度。根據此一具體例，該培養物在後續相期間係維持在一低於初始生長相之溫度或溫度範圍度或溫度範圍。舉例來說，在後續生產相期間，CHO 在25 °C至35 °C之範圍內的重組多胜狀和蛋白表現良茫上述討論，可使用多次個別溫度轉換來增加細胞密度活率、或增加重組多胜肽或蛋白之表現。 • 根據本發明，可將細胞維持在後續生產相中，直到理想細胞密度或生產滴定度爲止。在一具體例中，細胞維持在後續生產相中，直到對重組多胜肽或蛋白定度達到最大爲止。在其他具體例中，培養物可在此之前收取，視實施人的生產需求或細胞本身的需要而舉例來說，可能將細胞維持一段足以達到一存活細胞的時間，其中該存活細胞密度係最大存活細胞密度之 10、15、20、25' 30' 35、40、45、50、55、60、65、 Φ 75、80、85、90、95或99百分比。在某些例子當中使存活細胞密度達到最大之後再使存活細胞密度在收養物之前降到某個程度可能是理想的。在一極端的實中，在收取培養物之前使存活細胞密度趨近或達到〇是理想的。在本發明之另一具體例中，係使細胞在後續生產間生長一限定時期。舉例來說，視細胞培養物在後續相開始時的濃度 '細胞生長之溫度 '和細胞內部生長 .度、換的生產的溫細胞 :。如或存到達係將之滴時點定。密度卜5、 70、，在取培施例可能相期成長率而 -46- 1374935

定’可使細胞生長 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20 天以上。在某些例子當中，可使細胞生長一個月以上。本發明之實施人當可依據多胜肽或蛋白生產需求和細胞本身的需要來選擇後續生產相的期間的長短。在一些例子當中’在後續生產相期間對細胞培養物補充會被細胞耗盡或代謝掉的營養物或其他培養基組分可能是有利或必須的。舉例來說，在監測細胞培養物期間（見 β 下文「監測培養條件」段落）對細胞培養物補充已觀察到被耗盡之營養物或其他培養基組分可能是有利的。或者，或說此外，在後續生產相之前對細胞培養物進行補充可能是有利或必須的。作爲非限制性實例者，係對細胞培養物補充激素及/或其他生長因子、特定離子（如鈉、氯化物、鈣、鎂、和磷酸鹽）、緩衝劑、維生素、核苷或核苷酸、稀有元素（無機化合物所表現出來的最終濃度通常非常低）、胺基酸、脂質、或葡萄糖或其他能量來源可能是有利或必籲須的。可將這些補充組分一次全部加入細胞培養物中，或可藉由一系列的加入來提供到細胞培養物裡。在本發明的一具體例中，補充組分係在多個時間點以定比例提供到細胞培養物裡。在一其他具體例中，一開始僅提供一些補充組分、並在之後時點提供維持用的組分可能是理想的。在本發明之又一具體例中，係將這些補充組分連續地供給到該細胞培養物中。 -47- 1374935 • · 根據本發明，加入細胞培養物中之總體積應適當地保持在最小量。舉例來說，含有加入細胞培養物中之補充組分的培養基或溶液總體積可爲在提供該補充組分前之細胞培養物體積的 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 2Q、 25、 30、 35、 40、 45 或 50%。細胞培養物可在後續生產相期間攪拌或搖盪，以增加氧合作用和營養物對細胞的分散度。根據本發明，具有通常知識者當可了解：在後續成長相期間控制或調整一些生 ® 物反應器的內部條件可能是有利的，其條件包括但不限於 pH'溫度、氧合作用等。舉例來說，pH可藉由提供適量之酸或鹼來加以控制，而氧合作用可用該項技藝中眾所周知之噴灑裝置來加以控制》 - 監測培養條件在本發明的一些具體例中，實施人可能會發現：週期性地監測細胞培養生長的特定條件是有利或必須的。監測細胞培養條件讓實施人得以決定細胞培養物是否以不那麼 ® 理想的含量來生產重組多胜肽或蛋白、或該培養物是否就快要進入不那麼理想的生產相。爲了監測一些細胞培養條件’必須從培養物移出小分量來進行分析。具有通常知識者當可了解這類移除可能會將污染引入細胞培養物中，並適度小心地將這類污染的風險最小化。作爲非限制性實例者，監測溫度、pH、細胞密度、細胞存活率、整體存活細胞密度、乳酸鹽含量、銨含量、滲透濃度、或所表現之多胜狀或蛋白的滴定度可能是有利或 -48- ⑧ 1374935 • · 必須的。該項技藝中眾所周知之多種技術會使具有通常知識者得以測量這些條件。舉例來說，可使用血球計數器、寇特計數器（Coulter counter)、或細胞密度檢驗（CEDEX) 來測量細胞密度。存活細胞密度可藉由以錐藍（Trypan blue )將培養物樣品染色來測定。由於只有死細胞會吸收錐藍，故可藉由計算細胞總數來測定存活細胞密度、將吸收了染料之細胞數量除以細胞總數並取其倒數。可用HP LC 來測定乳酸鹽、銨或所表現之多胜肽或蛋白的含量。或者，鲁所表現之多胜肽或蛋白的含量可藉由標準分生技術來測定，該技術係如 SDS-PAGE膠之考馬斯染色（coomassie staining)、西方墨點法、布拉福測定法（Bradford assays)、勞威測定法（Lowry assays)、布瑞特測定法（Biuret assays )、和UV吸收。監測所表現之多胜肽或蛋白的轉譯後修飾（包括磷酸化作用和糖基化作用）也可能是有利或必須的。 - 所表現之多胜肽的分離 ® —般來說，通常較理想的是將根據本發明所表現之蛋白或多胜肽加以分離及/或純化。在一較佳具體例中，所表現之多胜肽或蛋白係分泌到培養基中，因此可將細胞和其他固體移除（舉例來說，如藉由離心或過濾來移除），作爲純化方法中的第一步驟。由於此處所描述之方法和組成物 .會造成細胞存活率增加，此具體例在根據本發明來使用的時候特別有用。結果是，有少數細胞在培養方法中死亡，且有少量蛋白水解酶被釋入培養基中，其可能會降低所表 -49- 1374935 • · 現之多胜肽或蛋白的產出。或者，所表現之多胜肽或蛋白係連結到宿主細胞表面。在此具體例中，會將培養基移除，且表現出多胜肽或蛋白的宿主細胞會在純化方法中的第一步驟被溶解。哺乳類宿主細胞的溶胞作用可能係藉由多種對具有通常知識者爲已知的手段來達成，包括藉由玻璃珠作物理破裂，以及暴露在高pH條件下。多胜肽或蛋白可藉由標準方法加以分離並純化，其方 ^ 法包括但不限於：層析法（如離子交換、親和力、尺寸排除、和羥磷灰石層析法）、凝膠過濾、離心、或溶解度差異、乙醇沉澱，或藉由任何其他用於蛋白純化之可用技術來進 ί了 (如見 Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Yerlag, New York, 1 9 8 7; Higgins, S . J . and Hames, B . D . (e d s .), Protein Expression : Λ Practical Approach, Oxford U n i v Press, 1 999; and Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide t 〇 Protein Purification : Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vo 1 182), Academic Press, 1 997，均合倂於本文而作爲參考文獻）。特別是對免疫親和力層析法來說，該蛋白可藉由將之結合到含有針對此蛋白而生且固定在靜態支持物上之抗體的親和力管柱上而加以分離。或者’可將親和力標記（如流行性感冒病毒外鞘序列、多個組胺酸、或麩胱甘肽-S-轉移酶）藉由標準重組技術連接到蛋白上，使之能藉由通過適當的親和力管柱而簡單純化。 -50- 1374935

爲了降低或消除多胜肽或蛋白在純化方法期間的降解，可在任何或所有階段加入蛋白酶抑制劑如苯基甲基磺醯胺基氟化物（PMSF)、留培丁（ leupeptin)、培斯特'丁（ pepstatin) 或阿波丁寧（aprotinin)。分離並純化所表現之多胜肽或蛋白而必須將細胞溶解的時候，特別需要蛋白酶抑制劑。具有通常知識者當可察知：正確的純化技術係取決於要純化之多胜肽或蛋白的特徵、該多胜肽或蛋白所表現之細胞、與有該細胞生長其內之培養基中的組成物。修-醫藥配方在本發明的一些較佳具體例中，所生產之多胜肽或蛋白會有藥理活性，且可用於醫藥的製備。如上所述之發明性組成物可藉由任何可用途徑來對患者給藥、或可一開始便將之配製成可藉由任何途徑來遞送之用，其遞送途徑包括但不限於非經口（如靜脈內）、真皮內、皮下、口服、經鼻、氣管、眼、經皮（局部）、經黏膜、直腸、和陰道途徑。發明性醫藥組成物一般係包括在哺乳類細胞株表現之純化 • 多胜肽或蛋白、遞送劑（即陽離子性聚合物、胜肽分子轉運子、界面活性劑等，如上述）與醫藥可接受載劑的合倂物。用於此處時，「醫藥可接受載劑」一詞包括溶劑、分散介質、塗覆物、抗細菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲用劑等，其與醫藥給藥相容。亦可將補充性活性化合物合倂到組成物內。醫藥組成物係經配製而可與其預期給藥途徑相容。用於非經口、皮膚內或皮下應用之溶液或懸浮液可包括下列 -51- 1374935 • ·、組分：無菌稀釋劑，如注射用水、鹽溶液、不揮發油（fixed oil)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑，如苄基醇、或對羥基苯甲酸甲酯類；抗氧化劑，如抗壞血酸、或二硫化鈉；螯合劑，如伸乙二胺四乙酸；緩衝液，如乙酸鹽類、檸檬酸鹽類、或磷酸鹽類；和用來調整張性（tonicity )之藥劑，如氯化鈉或右旋糖。pH可用酸或鹼（如氫氯酸或氫氧化鈉）來調整。非經口製劑可盛裝於針藥管（ampoule )、拋棄式注射筒、或由玻璃或塑膠所 Φ製成之多劑管。醫藥組成物適用於可注射之用途，其一般係包括無菌水溶液（在此爲水溶性者）或分散液、和用於即席製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。用於靜脈注射給藥之合適載劑包括生理食鹽水、抑菌水、Cremophor EL™( BASF， Parsippany，NJ )或磷酸鹽緩衝鹽溶液（PBS )。在所有例子當中，該組成物必須爲無菌、且應爲具有容易注射性質程度的流體。較佳醫藥配方係在製造和儲存的條件下爲安定 ^ 者，且必須能夠抵抗微生物（如細菌和真菌）作用之污染而加以保存。一般來說，相關載劑可爲含有下列物質之溶劑或分散介質，舉例來說，其含有水、乙醇、多元醇（舉例來說，甘油、丙二醇、和液態聚乙二醇等）、和其合適的混合物。舉例來說，恰當的流動性可藉由藉由使用被覆物 (如卵磷脂）來維持，在分散液的例子當中則係藉由維持所需顆粒大小來維持，且可藉由使用界面活性劑來維持。預防微生物作用可藉由各種抗細菌劑和抗真菌劑（舉例來 -52- ⑧ I374935

說，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等）而達成。在許多例子當中，較佳係包括包括等張化劑 (舉例來說，在組成物中之糖類、多元醇（如甘露糖醇、山梨糖醇）或氯化鈉）。可注射組成物之延長吸收可藉由將一種會延遲吸收之藥劑（舉例來說，單硬脂酸鋁和明膠）包含在組成物內而達成。無菌之可注射溶液可藉由將所需量之經純化的多胜肽或蛋白在適當溶劑中如其需要與一種上列成分或多種成分 • 之組合合倂、而後過濾滅菌來加以製備。一般來說，分散液係藉由將一從哺乳類細胞株表現之經純化的多胜肽或蛋白合倂到一含有鹼性分散介質和其他在上前文中列出的必須成分的無菌賦形劑來加以製備。在用以製備無菌可注射溶液之無菌粉末的例子當中，較佳之製備方法爲會產出活性成分粉末之真空乾燥和冷凍乾燥，再加上任何來自預先無菌過濾之溶液的額外理想成分。口服組成物一般包括一惰性稀釋劑或一可食用載劑》 ® 爲了達到口服治療性給藥之目的，可將經純化之多胜肽或蛋白與賦形劑合倂並以錠劑、片劑、或膠囊（如明膠膠囊）之形式來使用。口服組成物也可使用一用作漱口水之流體載劑來加以製備。醫藥可相容黏結劑及/或佐劑材料可包括在內而作爲組成物的一部分。錠劑、九劑、膠囊、片劑等可包含下列任一成分或性質相近的化合物：黏結劑，如微晶纖維素、黄蓍膠或明膠；賦形劑，如澱粉或乳糖；崩散劑，如藻酸、培莫膠（Primogel )或玉米澱粉；潤滑劑， -53- ⑧ 1374935

如硬脂酸鎂或硬脂酸類潤滑劑（Sterotes );助滑劑，如膠體二氧化矽；甜味劑，如蔗糖或糖精；或風味劑，如薄荷、水楊酸甲酯或柑橘風味。用於口服遞送之配方可有利地與藥劑合倂，以改善在消化道內之穩定性及/或增強吸收。對藉由吸入的給藥來說，含有由哺乳類細胞株所表現之經純化多胜肽或蛋白和遞送劑的發明性組成物較佳係以含有合適推進劑（如氣體，例如二氧化碳）或噴霧化劑之加壓容器或分配器以氣化噴霧劑噴霧形式來遞送。本發明 • 特別期待的是使用鼻用噴霧、吸入器、或其他方式直接遞送至上呼吸道及/或下呼吸道的方式來進行遞送的組成物。對抗流行性感冒病毒之DN A疫苗的鼻內給藥業已顯示出會引發CD8T細胞反應，表示呼吸道中至少某些細胞會在藉由此途徑遞送時將DNA攝入，且本發明之遞送劑會增強細胞的吸收。根據本發明之一些具體例，含有從哺乳類細胞株所表現之經純化多胜肽和遞送劑的組成物係配製爲用於氣化噴霧劑給藥之大多孔性顆粒。 ® 系統性給藥亦可藉由經黏膜或經皮手段來進行。對經黏膜或經皮給藥來說，適合用來滲透障壁的穿透物質會在配方中使用。這類穿透物質係該項技藝一般所知者，舉例來說，其包括用於經黏膜給藥之清潔劑、膽鹽、和梭鏈孢酸（fusidic acid)衍生物。經黏膜給藥可透過使用鼻用噴霧或栓劑而達成。對經皮給藥來說，係將經純化之多胜肽或蛋白和遞送劑配製到該項技藝一般所知之軟膏、膏藥、凝膠、或乳霜中。 -54- 1374935 • · 組成物亦可製備爲用於直腸遞送之栓劑（如帶有習用栓劑基底物質（如可可脂和其他甘油酯類））或閉鎖灌腸形式。在一具體例中，該組成物係與會保護多胜肽或蛋白而使之不會在身體內被快速排除的載劑一起製備，其載劑如控制釋出配方，包括植入物和微封囊遞送系統。可使用生物可分解、生物可相容之聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚正酯、和聚乳酸。這類配 • 方之製備方法對熟習該項技藝者來說將至爲顯明。該材料亦可從 Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. 購得。脂體性懸浮液（包括脂質體（liposome)，其會找出帶有對抗病毒抗原之單株抗體的感染細胞標的）亦可用作醫藥可接受載劑。這些可根據熟習該項技藝者已知之方法來加以製備，舉例來說，其方法係如美國專利第4,522,8 1 1 號所述者。由於給藥容易、且劑量統一，故以劑量單位形式來配 ® 製口服或非經口組成物是有利的。用於此處時，劑量單位形式係指調整成用於要接受治療之患者的單位劑量的物理性個別單位，各單位係含有經過計算而會生產理想治療性效用之預定量的活性多胜肽或蛋白、與所需之醫藥載劑。如本發明所表現之多胜肽或蛋白可依所需而以各種時程或在不同時期內來給藥，如每週給藥持續一段時間：介於約1至1 〇週間、介於2至8週間、介於約3至7週間，約4、5、或6週等。熟習該項技藝者當可察知：一些因子 -55- ⑧ 1374935 可能會影響要有效治療患者所需的劑量和時點，其包括但不限於疾病或病症的嚴重程度、先前的治療、患者的—般健康狀況及/或年齡、和其他疾病。一般來說，對患者以帶有如此處所描述之多胜肽或蛋白進行的治療可包括單一治療，或在許多例子當中可包括一系列的治療。可進一步了解，適當的劑量可能取決於多胜肽或蛋白的潛能，且可能選擇性地對特定接受者量身訂做，舉例來說，給藥劑量逐漸增加，直到達到預先選擇之理想反應爲止。當可了解， φ用於任何特定動物患者之特定劑量含量可視多種因子而定，包括所用之特定多胜肽或蛋白的活性、患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄率 '任何一種合倂藥物、和表現程度或要加以調節的活性。本發明包括一種用於非人類動物治療之發明性組成物的用途。據此，給藥之劑量和方法可根據獸醫藥理學與醫學之已知原則來加以選擇。舉例苹說，可在Adams, R. (ed.)， Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 8th edition,

Iowa State University Press; ISBN: 08 1 3 8 1 7439; 200 1 當中找到指示。發明性醫藥組成物可包括在一個與給藥說明放在一起的容器、包裝、或分配器內。前文描述僅會被理解爲代表性敘述，而非意圖形成限制。要履行本發明和其他應用，其可選擇之方法和材料對熟習該項技藝者來說將至爲顯明，且意圖將之包括於後附 ⑧ •56- 1374935 • · 之申請專利範圍內。【實施方式】實施例實施例1:用於抗-GDF-8批式供給方法之富集培養基1 用來培養細胞株之傳統批式供給方法有幾項缺點，包括要給予供給物所需的時間和心力、並需要用於大規模生物反應器中的特殊儀器。其課題係發展出一用於在大規模生物反應器中生產興趣蛋白而需要最少供給物的批式培養 •基。 - 材料與方法細胞株和培養基：經工程而表現一對抗生長及分化因子8之單株抗體的中國倉鼠卵巢（“CHO”）細胞（“抗- GDF-8 細胞”）（見 Veldman ei a/.，Neutralizing Antibodies Against GDF-8 an d U s e s Th e re for, U S 2 0 0 4 0 1 4 2 3 8 2 A 1 )。使用抗- GDF-8細胞來測試新的批式培養基。比較培養基i和培養基2支持高細胞密度和存活率的能力。這些培養基以 ® 及培養基3的組成物係列於表1。藉由加入Fes〇4,7H20之外的所有組分來製作培養基，之後將該培養基調整至pH 7.25，記錄滲透濃度’之後加入FeS〇c7H20。培養條件：在燒瓶實驗中，使抗-GDF-8細胞在搖盪燒瓶中生長並繼代培養三次。在生物反應器實驗中，使抗 -GDF-8細胞在培養基中生長12天，毎日補充2體積％之 20X培養基4供給培養基（表3)或在第5天後補充3體積 %之16X培養基4(表4)。在前4天中，使細胞於37°C生 -57- ⑧ 1374935

長；在第5天上樣本分析：基酸、維生素、，將細胞轉換至3 1 t。每曰從各培養物中取出樣本，並分析其胺鐵、磷酸鹽、葡萄糖和麩醯胺酸之含量。表1 .培養基1、培養基2和培養基3之組成物。

培養基1 培養基2 培養基3 胺基酸 mg/L mM mg/L mM mg/L mM 丙胺酸 96.03 1.08 17.80 0.20 24.87 0.28 精胺酸 1186.99 6.82 347.97 2.00 423.43 2.43 天冬醯胺酸·η2ο 713.59 4.76 75.00 0.50 173.90 1.16 天冬胺酸 318.53 2.39 26.20 0.20 52.72 0.40 半胱胺酸·ηοη2ο 70.01 0.40 70.19 0.40 70.01 0.40 胱胺酸.2HCI 297.09 0.95 62.25 0.20 62.09 0.20 麩胺酸 158.59 1.08 29.40 0.20 41.08 0.28 麩醯胺酸 1892.40 12.96 1163.95 7.97 1162.40 7.96 甘胺酸 95.88 1.28 30.00 0.40 35.92 0.48 組胺酸·ηοη2ο 369.10 1.76 46.00 0.22 75.27 0.36 異白胺酸 623.63 4.76 104.99 0.80 151.90 1.16 白胺酸 852.31 6.51 104.99 0.80 172.69 1.32 離胺酸*HCI 945.96 5.20 145.99 0.80 218.38 1.20 甲硫胺酸 291.82 1.96 29.80 0.20 53.55 0.36 苯丙胺酸 428.62 2.60 65.99 0.40 98.81 0.60 脯胺酸 372.25 3.24 68.99 0.60 96.40 0.84 絲胺酸 904.71 8.62 126.00 1.20 273.07 2.60 酥胺酸 513.39 4.31 94.99 0.80 132.81 1.12 色胺酸 159.32 0.78 16.00 0.08 28.99 0.14 酪胺酸·2Ν3·2Η20 560.81 2.15 103.79 0.40 145.10 0.56 纈胺酸 505.36 4.32 93.99 0.80 131.17 1.12 維生素 mg/L μΜ mg/L μΜ mg/L μΜ 生物素 2.00 8.21 0.20 0.82 0.36 1.49 泛酸鈣 22.02 46.27 2.24 4.71 4.03 8.47 氯化膽鹼 87.67 630.74 8.98 64.60 16.11 115.92 葉酸 25.95 58.84 2.65 6.01 4.76 10.80 肌醇 123.39 685.47 12.60 69.99 22.64 125.79 菸鹼醯胺 19.60 160.70 2.02 16.56 3.61 29.62 吡哆醛·Ηα 1.99 9.83 2.00 9.85 1.99 9.83 吡哆醇·Η(：Ι 18.06 87.67 0.03 0.15 1.67 8.10 核黃素 2.20 5.85 0.22 0.59 0.40 1.06 噻胺·Ηα 21.51 63.84 2.17 6.44 3.92 11.64 維生素Β12 6.93 5.12 0.78 0.58 1.34 0.99 無機鹽 mg/L mM mg/L mM mg/L mM CaC!2 115.78 1.04 116.09 1.05 115.78 1.04 KCI 310.94 4.17 311.77 4.18 310.94 4.17 ⑧ -58- 1374935

Na2HP04 70.81 0.50 70.99 0.50 70.81 0.50 NaCI 1104.96 18.92 5539.00 94.85 3704.96 63.44 NaH2P〇4-H20 636.33 4.61 62.49 0.45 114.33 0.83 MgS04 48.70 0.41 48.83 0.41 48.70 0.41 MgS04*7H20 0.03 95.00 8.60 95.00 MgCI2 28.53 0.30 28.61 0.30 28.53 0.30 NaHC03 2000.00 23.81 2440.00 29.04 2440.00 29.04 誠元素 M9/L nM pg/L nM pg/L nM 亞硒酸鈉 28.00 161.94 5.00 28.92 7.00 40.49 Fe(N03)3.9H20 49.86 123.42 50.00 123.75 49.86 123.42 CuS04 2.69 16.80 0.80 5.00 0.97 6.06 CuS04-5H20 11.24 45.00 7.49 30.00 FeS04.7H20 2503.85 9006.64 839.96 3021.45 1542.85 5549.81 ZnS04-7H20 2734.77 9528.82 429.96 1498.12 1383.80 4821.59 MnS〇4*H2〇 0.26 1.51 0.17 1.01 Na2Si03-9H20 210.00 739.27 140.00 492.84 (NH4)6Mo7〇24*4H2 0 1.86 1.50 1.24 1.00 NH4VO3 0.98 8.33 0.65 5.56 NiS04*6H20 0.20 0.74 0.13 0.49 SnCI2.2H20 0.18 0.80 0.12 0.53 其他組分 mg/L μΜ mg/L μΜ mg/L μΜ 氫基可體松 0.23 0.64 0.04 0.10 0.09 0.24 腐胺·2Ηα 6.48 40.22 1.08 6.70 2.48 15.39 亞麻油酸 0.22 0.80 0.04 0.14 0.06 0.20 類脂酸 0.56 2.73 0.10 0.49 0.14 0.69 D-葡甸糖（右旋糖） 16039.43 89107.92 6150.72 34170.64 11042.24 61345.76 PVA 2560.00 2400.00 2520.00 胰島素 54.00 10.00 14.00 丙酮酸鈉 54.85 498.63 55.00 499.95 54.85 498.63

- 結果與結論第1圖顯示：在燒瓶實驗中，抗-GDF-8細胞在培養基 1和培養基2兩者當中的生長率是相似的。第2圖顯示：在生物反應器中，培養基1在最終細胞密度和存活率上展現出較培養基3更明顯的增加。最終滴定度也有明顯的增加，係從平台方法的551 mg/L增加至帶有培養基1的97 6 mg/L (數據未顯示）。溫度在第5天從 3 7 °C轉換至3 1 °C。由於細胞生長出乎意料地高，在第5天 ⑧ -59- 1374935

後，對培養物每日供給2體積％之20X培養基4或3體積％之16X培養基4。因此，這並不像一開始所設想的那樣是個真正的批式實驗。從第10天開始，將天冬醯胺酸和噻胺補充到供給培養基中。在濃縮批式培養基的發展過程中，需要考慮幾項可能很重要的事。第一，可能證明濃縮營養物對細胞是有毒的。在此實施例所發展之培養基中，所有營養物和組分均經測定爲低於毒性限値（數據未顯示）。第二，濃縮批式培養基的滲透濃度必然較非濃縮培養基爲高，這一點業已顯示對細胞生長和存活率有不良效用。這個問題可藉由降低起始培養基中的NaCl量來加以規避。再者，該濃縮批式培養基所含之葡萄糖含量不足以支持整個培養期的生長。因此，培養物在第5天後每日補充葡萄糖供給物。第三，胰島素和麩醯胺酸在1 2天培養期間容易降解。因此.，會對培養物補充葡萄糖以及這些組分。最後，鐵會在含有高濃度磷酸鹽之高pH溶液中沉澱出來。此問題可藉由在培養基製備方法結束、且已將pH 調整至適當値之後加入鐵來加以規避。實施例2:在批式供給方法中用於抗-GDF_8細胞之濃縮供給培養基（培養基5)的發展在實施例1中，發展出一種使用培養基1來培養抗 -GDF-8細胞的批式方法。由於在此方法中會產生高細胞密度，故認定補充葡萄糖.和麩醯胺酸以外的營養物仍是有利 ⑧ -60- 1374935

的。然而，對該批式法補充8X培養基4供給培養基會造成培養物的過度稀釋。因此發展一種更濃縮的供給培養基來規避此一問題。 - 材料與方法和結果表2列示了在表3-7之配方中所使用的培養基4Α-1、培養基4Β、微量Β和微量D的組成物表2.在表3-7之配方中所使用之培養基4Α-1、培養基 4Β、微量Β和微量D的組成物。

培養基4A-1 培養基4Β 微量元素B 微量元素D 胺基酸 mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM 丙胺酸 17.80 0.20 精胺酸 191.00 1.10 天冬醯胺酸·η2ο 135.00 0.90 天冬胺酸 66.50 0.50 麩胺酸 29.40 0.20 甘胺酸 15.00 0.20 組胺酸·ηοη2ο 73.50 0.35 異白胺酸 118.00 0.90 白胺酸 170.00 1.30 離胺酸.HCI 182.00 1.00 甲硫胺酸 59.60 0.40 苯丙胺酸 82.50 0.50 脯胺酸 69.00 0.60 絲胺酸 158.00 1.50 酥胺酸 95.20 0.80 色胺酸 32.60 0.16 酪胺酸.2Na.2H20 104.00 0.40 纈胺酸 93.60 0.80 維生素 mg/L μΜ mg/L μΜ mg/L mM mg/L mM 生物素 0.41 1.68 泛酸鈣 4.50 9.45 氯化膽鹼 17.90 128.78 葉酸 5.30 12.02 肌醇 25.20 140.00 菸鹼醯胺 4.00 32.79 吡哆醇*HCI 4.10 19.90 核黃素 0.45 1.20 噻胺.HCI 4.40 13.06 維生素B12 1.40 1.03 ⑧ -61 - 1374935

總元素 nM mg/L μΜ MQ/L nM mq/l nM (ΝΗ4)6Μο7024·4Η2 0 1.24 1.00 CuS04 0.43 2.69 CuS04.5H20 7.49 30.00 FeS04.7H20 834 3000 MnS04*H20 0.17 1.01 Na2Si03*9H20 140.00 492.84 nh4v〇3 0.65 5.56 NiS04*6H20 0.13 0.49 SnCI2.2H20 0.12 0.53 ZnS04*7H20 230.00 801.39 863 3007 其讎分 μο/L nM M9/L nM MQ/L nM pg/L nM 亞麻油酸 42.00 0.15 類脂酸 105.00 0.51 D-葡萄糖(右旋糖） 100000 0 5555.5 6 1 . 2 Ο X培養基4 第一濃縮培養基係如20Χ培養基4 —般來發展。20Χ 培養基4之培養基配方係提供於表3。表3. 20Χ培養基4供給培養基作業計畫單。部分組分量單位 I 培養基4A-1 31,120 叭 Nucellin™ 40.000 ml/L H/P原液 20.000 ml/L 亞硒酸鹽原液 2.000 ml/L PVA 2.400 g/L NaH2P04H20 2.610 g/L MgS04*7H20 0.430 g/L 天冬胺酸 1.330 g/L 麩胺酸 0.588 g/L 亞麻油酸 0.840 ml/L 類脂酸 2.100 ml/L 酪胺酸.2Na (Mw225) 1.790 g/L 1000X微量B 6.000 ml/L 葡萄糖 100.000 g/L 麩醯胺酸 14.600 g/L pH 至 7.0 記錄滲透濃度 1064.000 mOsm II 半胱胺酸（400 mM) 將108ml微量D、0.25 g FeS04.7H20加至280ml半胱胺酸原液 III 葉酸 720 ml 6 mM 葉酸註：NucellinTM係由 Eli Lilly (Indianapolis, IN, USA )製造；Η/P 原液=0.036mg/mL 氫基可體松，1.08mg/mL 腐胺·2Ηα。 ⑧ -62- 1374935

該培養基配方由3個部分所構成：I、π、πΐ。第I部分是帶有培養基4B中除了葉酸（由於此維生素之溶解度的考量）以外之獨立組分的8X培養基4濃縮版。第π部分是鐵原液、微量D和酸性半胱胺酸，若將之加入第I部分，會避免可能的鐵沉濺。第III部分是葉酸原液。第Ϊ部分是在第5天開始以每日2體積％加入，第π和第m部分則是在第5天與第I部分一起加入一次。將供給培養基的最終pH調整至7.0，且滲透濃度爲約 1064 〇1〇5111。2%供給物會使培養物有2£/1^葡萄糖、2 1111^ ® 麩醯胺酸和14mOsm滲透濃度的增加。 2. 16X培養基4 爲了減少滲透濃度的增加，將供給培養基從2〇χ培養基4(每日2體積％ )改變爲1 6X培養基4(每日3體積％ )。 16X培養基4之培養基配方係提供於表4。表4· 1 6X培養基4供給培養基作業計畫單。部分組分量單位 I 培養基4A-1 24.896 g/L Nucellin™ 32.000 ml/L Η/P原液 16.000 ml/L 亞硒酸鹽原液 1.600 ml/L PVA 2.400 g/L NaH2P04*H20 2.088 g/L MgS04-7H20 0.344 g/L 天冬胺酸 1.064 麩胺酸 0.470 g/L 亞麻油酸 0.672 ml/L 類脂酸 1.680 ml/L 酪胺酸.2Na (Mw225) 1.432 g/L 1000X微量B 9.000 ml/L 麩醯胺酸 6.280 g/L pH 至 7.0 記錄滲透濃度 295.000 mOsm II 半胱胺酸（400 mM) 將108m丨微量D、0.25 g FeS04.7H20加至280ml半胱胺酸原液 III 葉酸 720 ml 6 mM 葉酸註：NucellinTM係由 Eli Liliy (Indianapolis, ΓΝ，USA)製造；Η/P 原液=0.〇36mg/mL 氫基可體松，1.08mg/mL 腐胺.2HC1 »

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此改質16X培養基4中也排除了葡萄糖，以進一步降低滲透濃度，並給予葡萄糖供給物一些彈性。供給培養基之總滲透濃度現爲295 mOsm。 3 . 1 6 X培養基4 改變1 6X培養基4配方。將鐵原液溶液加至供給物中，造成各供給物有0.45 μΜ的加入量。此外，將葡萄糖加回去，以使每供給物中有1 . 5 g/L的加入量。用於此經改質之16X培養基4的培養基配方係提供於表5。 • 表5 . 1 6X培養基4供給培養基作業計畫單。部分組分量單位 I 培養基4A-1 24.896 g/L Nucellin™ 32.000 ml/L Η/P原液 16.000 ml/L 亞硒酸鹽原液 1.600 ml/L PVA 2.400 g/L NaH2P04H20 2.088 MgS04*7H20 0.344 g/L 天冬胺酸 1.064 g/L 麩胺酸 0.470 g/L 亞麻油酸 0.672 ml/L 類脂酸 1.680 ml/L 酪胺酸_2Na (Mw225) 1.432 g/L 1000X 繼 B 9.000 ml/L 葡萄糖 50.000 g/L 麩醯胺酸 7300 g/L pH 至 7.0 FeS04_7H20 ( 1 mM 原液） 15.000 ml/L 記錄滲透濃度 607.000 mOsm II 葉酸 720 ml 6 mM 葉酸 III 半胱胺酸（4G0mM) 將108ml微量D、0.25 g FeS04.7H20加至280 ml半胱胺酸原液註：Nucellin™係由 Eli Lilly (Indianapolis, IN, USA)製造；Η/P 原液=0.036mg/mL 氫基可體松，1.08mg/mL 腐胺·2Ηα。 4 . I 6 X培養基4 在此，係將供給培養基（1 6X培養基4 )作成合倂培養基，而非在最後數批當中的3次個別供給。進行測試， ⑧ -64- 1374935

以確保葉酸溶解到所需濃度，且確保於4 °C或於室溫儲存6 天之後鐵和葉酸都不會從溶液中沉澱出來。合倂16X培養基4之培養基配方係提供於表6。表6. 16X培養基4供給培養基作業計畫單。組分量單位培養基4A-1 24.896 g/L Nucellin™ 32.000 ml/L Η/P原液 16.000 ml/L 亞硒酸鹽原液 1.600 ml/L PVA 2.400 g/L NaH2P04*H20 2.088 g/L MgS04-7H20 0.344 g/L 天冬胺酸 1.064 g/L 麩胺酸 0.470 g/L 亞麻油酸 0.672 ml/L 類脂酸 1.680 ml/L 酪胺酸.2Na (Mw225) 1.432 g/L 葡萄糖 66.700 g/L 麩醯胺酸 7.300 g/L 葉酸 70.560 mg/L 酸性半胱胺酸（400 mM) 6.250 ml/L FeS04 原液（1 mM) 23.000 ml/L 1000X微量B 9.000 ml/L 1000X微量D 3.300 ml/L 預測pH爲6.11 調整至7.0 記錄滲透濃度 724.000 mOsm 註：Nucellin™係由 Eli Lilly (Indianapolis, IN, USA)製造；Η/P 原液=0.036mg/mL 氫基可體松 ’ 1.08mg/mL 腐胺.2HC1。

培養基之最終滲透濃度爲724 mOsm，其每日葡萄糖加入量爲2 g/L，且麩醯胺酸加入量爲1.5 mM。 5 . 1 2 X培養基4 在此，對供給培養基做了幾項改變。使用培養基4B 粉末來代替培養基4B中各個獨立成分的加入。將培養基 4B粉末與葡萄糖混合，並藉由將溶液滴定至pH 10.25而使之分別在鹼性條件下溶解。由於胺基酸和維生素分析結果 -65- ⑧ 1374935 • · 顯示天冬醯胺酸和噻胺在批式供給方法結束前均已耗盡，再加入這兩種組分。1 2X培養基4的使用會在供給到培養物時進一步降低滲透濃度的增加。1 2X培養基4之培養基配方係提供於表7中。表7 . 1 2X培養基4供給培養基作業計畫單。組分丨量丨單运

培養基 4A-1 18.672 g/L

Nucellin™ 24.000 ml/L Η/P原液 12.000 ml/L 亞硒酸鹽原液 1,200 ml/L PVA 2.400 g/L 天冬醯胺酸.H20 1.620 g/L NaH2P04.H20 1.566 g/L MgS04.7H20 0.258 g/L 麩醯胺酸 5.475 g/L 噻胺 0.040 g/L 預溶解之培養基4B&葡萄糖 ~175 ml/L 酸性半胱胺酸（4〇〇mM) 4.688 ml/L 記錄pH 以5N HC1將pH調整至7.2 FeS04 原液（1 mM) 17.250 ml/L 1000X微量B 6.750 ml/L 1000X微量D 2.475 ml/L 記錄pH (預測値7_18) 記錄Osm 566.000 預溶解之培養基4B&葡萄糖*(用於1 L供給培養基）水 150 ml 將培養基4B (14.5g)與葡甸糖（38.3g)混合加入用25%NaOH來調整pH，直到溶解爲止（pH約10.25) 註：Nucellin™係由 Eli Lilly (Indianapolis, IN, USA)製造；Η/P 原液=0.036mg/mL 氫基可體松 ’ l_08mg/mL 腐胺.2HCM。最終滲透濃度爲566 mOsm。每日4體積％的供給物會使滲透濃度大約增加8.6、葡萄糖增加2 g/L、且麩醯胺酸增加1.5 mM。12X培養基4培養基配方亦如培養基5爲已知。相較於20X培養基4或16X培養基4，培養基5很容易製作，且於室溫或於4 °C時在10天內是安定的（數據未 1374935

顯示）。實施例 3 :用於抗-GDF-8細胞培養物之去除麩醢胺酸 (glutamine starvation)的批式供給方法 CHO細胞需要起始培養基中之麩醯胺酸才能活存。傳統上，初始麩醯胺酸含量高，且麩醯胺酸在第5天後會每曰供給，直到批式供給方法結束爲止。傳統批式供給方法正常會在細胞培養物中造成乳酸鹽和銨含量高，其係已知會對細胞生長、細胞密度和重組蛋白表現造成抑制效用。 ® 將葡萄糖慢慢加入培養物中之批式供給方法業已顯示其會降低乳酸鹽生產，並改善細胞生長、細胞密度和重組蛋白表現。然而，用來操控葡萄糖加入之先前技藝方法對大規模產製來說並不實用。在此，藉由利用帶有較低麩醯胺酸起始含量的培養物培養基、以及從供給物中排除麩醯胺酸’其會顯示出所生產之銨和乳酸鹽含量下降，造成細胞存活率增加。此外，在去除麩醯胺酸的培養物中，重組蛋白表現會增加，而最終滲透濃度會降低。 •-材料與方法細胞株和培養基：抗-GDF-8細胞係在批式供給模式於 1 L生物反應器內之培養基丨中培養。培養條件：使細胞在1 L生物反應器中生長十二天，在第4天或第5天（取決於細胞生長）使溫度從37°C轉換至3 1 °C。測試三種批式供給方法：正常（對照組）方法、無麩醯胺酸供給之方法、和去除麩醯胺酸方法。這些方法的相關細節係列於表8和表9。 -67- 1374935 • · 表8.在1 L生物反應器中以無麩醯胺酸供給之方法進行的批式供給方法。對照組方法無麩醯胺酸供給之方法起始培養基麵胺酸(mM) 13 mM 13 mM 麩赚酸供給在第4天爲5 mM 不供給麩醯胺酸供給培養基培養基5 (帶有37_5 mM麩醯胺酸）無麩醯胺酸之培養基5 供給時間表從第5天起每日4°/。從第5天起每曰4% 溫度轉換至31。。第4天第5天表9.在1 L生物反應器中以去除麩醯胺酸之方法進行的批式供給方法。對照組方法低麩醯胺酸方法起始培養基麩醯胺酸(福） 13 mM 4 mM 麩醯胺酸供給在第4天爲5 mM 不供給麩醯胺酸供雜養基培養基5 (帶有37.5 mM麩醯胺酸）無麩醯胺酸之培養基5 供給時間表從第5天起每曰4% 從第5天起每日4% 溫度轉換至3It 第4天第5天樣本分析：每曰從各培養物中取出樣本，並分析其細胞密度、細胞存活率、乳酸鹽、麩醯胺酸 '和銨含量。其所表現的抗-GDF-8抗體滴定度亦每曰進行測量。 - 結果與結論第3圖顯示在無麩醯胺酸供給或對照組之批式供給條件中生長之培養物的細胞密度。在兩個例子當中’細胞密度在實驗過程中是相似的。第4圖顯示在在無麩醯胺酸供給或對照組之批式供給條件中生長之培養物的細胞存活率百分比。無麩醯胺酸供給之培養物顯示從第6天開始到實驗結束有顯著較高的細胞存活率。第5圖顯示在無麩醯胺酸供給或對照組之批式供給條件中生長之培養物的銨含量。無麩醯胺酸供給之培養物顯示錢含量從第4天開始到實驗，結束有顯著降低1 ° ⑧ -68- 1374935 • · 第6圖顯示在無麩醯胺酸供給或對照組之批式供給條件中生長之培養物的乳酸鹽含量。在整個實驗過程中，無麩醯胺酸供給之培養物的乳酸鹽含量有輕微降低。第7圖顯示在無麩醯胺酸供給或對照組之批式供給條件中生長之培養物的抗-GDF-8抗體滴定度。在無麩醯胺酸供給之培養物中，最終抗-GDF-8抗體滴定度較高。第8圖顯示培養物在去除麩醯胺酸或對照組之批式供給條件中生長的細胞密度。在兩個例子當中，細胞密度在 ®實驗過程中是相似的。第9圖顯示培養物在去除麩醯胺酸或對照組之批式供給條件中生長的細胞存活率。在兩個例子當中，細胞存活率在實驗過程中是相似的。第1 〇圖顯示培養物在去除麩醯胺酸或對照組之批式供給條件中生長的銨含量。去除麩醯胺酸之培養物顯示銨含量在整個實驗過程中有顯著降低。第 Π圖顯示培養物在去除麩醯胺酸或對照組之批式 ® 供給條件中生長的乳酸鹽含量。去除麩醯胺酸之培養物顯示乳酸鹽含量從第4天開始到實驗結束有顯著降低。第12圖顯示培養物在去除麩醯胺酸或對照組之批式供給條件中生長的抗-GDF-8抗體滴定度。在去除麩醯胺酸之培養物中，最終抗-GDF-8抗體滴定度較高》綜合這些結果表示：降低麩醯胺酸含量有利於細胞培養物，其係藉由降低銨產量、增加細胞存活率、並增加所表現之抗- GDF-8抗體的滴定度來達成。此外，在去除麩醯 1374935

胺酸之培養物中觀察到乳酸鹽含量低的情形，這可能是由於葡萄糖消耗率降低的緣故。銨和乳酸鹽含量降低也有降低總滲透濃度的效用。亦已知滲透濃度升高會對細胞生長和存活率有抑制效用。初始麩醯胺酸含量低再加上排除麩醯胺酸供給也會有降低銨生產的正面效用，其係在儲存培養基中之非酶性麩醯胺酸降解的結果。在供給物中排除麩醯胺酸也簡化了培養抗-GDF-8細胞的方法。實施例4:抗- GDF-8細胞在培養基1和培養基2中之鐵劑 ®量反應培養基1的營養物較培養基2濃縮許多。在培養基1 中用於細胞生長之最適鐵含量的決定是爲了避免在細胞培養期間產生缺鐵的問題。 - 材料與方法抗-GDF-8細胞係在培養盤中於培養基1或培養基2內作一次繼代培養。這些培養基的鐵濃度係藉由加入不同量之鐵原液來加以控制。最終細胞密度係以CEDEX來測量。 ® -結果與結論第13圖顯示在含有不同鐵濃度之培養基1和培養基2 中，抗-GDF-8細胞之Fe劑量反應。在培養基2中，細胞密度的鐵濃度係相對恆定，其範圍爲從3 μΜ至15 μΜ。在培養基1中，細胞密度會與鐵濃度的增加一起增加’但所達之最大値爲大約5 μΜ。這個差異可能是在培養基1中之高營養物含量所造成的’其可能會降低細胞對鐵的利用率，這是在培養基中鐵之螯合的結果。這些結果表示：應 ⑧ -70- 1374935

將鐵含量保持在高於5 μΜ，以避免培養基1中缺鐵的問題。實施例5:在生物反應器方法中以麩胺酸取代麩醯胺酸進行三項實驗來測試以麩胺酸取代麩醯胺酸在抗-路易斯γ細胞培養方法中的效用。 - 材料與方法這些實驗係在10 L生物反應器中於pH 7.1、3 0%溶氧、和起始溫度37°C下進行，並在第5天轉換至31 t。噴灑和頂部空間的氣體爲8 8 %的9 3 %空氣/ 7 % C Ο 2混合物與 ® 12%的氧。在所有實驗中之起始培養基爲培養基1，其含有麩醯胺酸。供給培養基和供給時間表包括補充性葡萄糖和麩醯胺酸供給，顯示於表1 0。標示「麩胺酸」之欄位係供給改質培養基5，其係在標準培養基5中不含麩醯胺酸但含其莫耳濃度等於麩醯胺酸之莫耳濃度的麩胺酸。標示麩醯胺酸之欄位則供給標準培養基5。 ⑧ 表10.供給時間表》天數 9040-44 9040-56 9040-64 魅胺酸1 麩_酸1 mmi 麩醯胺酸2 麩胺酸3 麩醯胺酸3 0 1 2 3 4 5 mM gin 5 mM gin 3 g/L gluc3 7.7 mM gin 2.9g/l glue 5 3.6 g/ glue 5 mM gin 5.5 g/Lgluc 3.5 g/L glue 5 mM gin 6 g/L rIuc 3 g/L glue 3 g/L glue 6 12% 16X培養基4 12% 16X培養基4 17% 培養基5 17% 16X培養基4 29% 培養基5 29% 培養基5 7 4 mM gin 8 9 2.5 g/L glue 10 10% 16X培養基4 10% 16X培養基4 8% 培養基5 5% 16X培養基4 11 1 g/L glue 12 13 1 g/L glue * 結果與結論 -71 - 1374935 • · 在各實驗中，細胞密度係與在第丨4圖中所示類似。在麩醯胺酸2和麩胺酸2實驗中，由於在該等方法中第3天的pH會偏差至約6.7,故細胞密度低。由於在第6天有29% 培養基供給，在麩醯胺酸3和麩胺酸3實驗中，密度會在第6天和第7天之間驟降。第15圖顯示供給麩胺酸和麩醯胺酸之培養物的細胞存活率。在含有供給麩胺酸之培養物的生物反應器中，存活率在該方法之後半維持在較高。在實驗1中，抗-路易斯Y滴定度在供給麩胺酸和麩醯胺酸之培養物之間是相似的。第1 6圖顯示：在實驗2和3 中，在供給麩醯胺酸之反應器中的抗-路易斯 Y滴定度較低。在這些反應器中所觀察到之較低抗-路易斯Y滴定度可能是由高含量之所生產的乳酸鹽引起，如在第17圖中所示。在供給培養基中之麩胺酸一起運作之生物反應器中，銨濃度較低（第18圖），且滲透濃度較低（第19圖）。使用結合ELISA測定法測試來自麩醯胺酸1和麩胺酸 1實驗之樣品的活性。這些活性是相似的··在麩醯胺酸1 樣品之參考値爲1 1 0°/。，且麩胺酸1樣品之參考値爲1 22% (數據未顯示）。在這些實驗中，用麩胺酸取代麩醯胺酸對細胞密度沒有顯著的效用。然而，細胞存活率在供給麩醯胺酸之生物反應器中是較低的。相較於那些供給麩醯胺酸之生物反應器’銨、乳酸鹽和滲透濃度在供給麩胺酸之生物反應器中 -72- 1374935

是較低的。平均來說，抗-路易斯γ滴定度在供給麩胺酸之生物反應器中是較高的，而在這兩種條件下，其活性本質上是相同的。實施例6:葡荀糖和麩醯胺酸在抗-路易斯Υ細胞培養方法中取代作用此實驗之目的是要在抗-路易斯Υ細胞的培養中，測試以列示於下表 U的供給培養基來取代葡萄糖和麩醯胺酸的效用（見 Bogheart e t al. , Antibody-targeted chemotherapy with the c a 1 i c h e am i c i n conjugate hu3Sl 93-N-acetyl gamma calicheamicin dimethyl hydrazide targets Lewisy and eliminates Lewisy-positive human carcinoma cells and xenografts, Clin. Can. Res. 10:453 8 -49 (20 04))。測量細胞密度、細胞存活率、抗-路易斯Y滴定度和銨含量。 - 材料與方法本實驗係在25 0 ml搖盪燒瓶進行，起始體積爲75 ml»在所有搖盪燒瓶種入在培養基2中之〇.25xl06個細胞 /ml。將該燒瓶於37°C在7% C02培養箱培養1 4天。在第3 和第4天，對該燒瓶供給5體積％之培養基6供給培養基。培養基6之組成物係列於表1 1。在第5 -1 3天，對該燒瓶供給5體積％列示於表1 2當中的一種供給溶液。各條件係以兩組重複來進行。每天採取樣本，以C E D E X進行細胞計數，並測定銨、葡萄糖和乳酸鹽。 -73- 1374935

表1 1 .培養基6之組成物。

胺基酸 mg/L mM 元素 pg/L nM 丙胺酸 142.48 1.60 亞硒酸鈉 40.00 231.35 精胺酸 1528.84 8.79 CuS04 3.44 21.51 天冬醯胺酸·η2ο 1080.60 7.20 CuS〇4*5H2 0 7.49 30.00 天冬胺酸 532.40 4.00 FeS04-7H20 2534 9115 胱胺酸.2HCI 473.00 1.51 ZnS04.7H20 2704 9421 麩胺酸 235.38 160 MnS04-H20 0.17 1.01 麩醯胺酸 4820.00 33.01 Na2Si03*9H2 〇 140 492.84 甘胺酸 120.07 160 (NH4)6M〇7〇2 4-4H?0 1.24 1.00 組胺酸·ηοη2ο 588.32 2.80 NH4VO3 0.65 5.56 異白胺酸 944.52 7.21 NiS04«6H20 0.13 0.49 白胺酸 1360.75 10.39 SnCI2.2H20 0.12 0.53 離胺酸，HCI 1456.80 8.00 AICI3.6H20 1.20 4.97 甲硫胺酸 477.06 3.20 AgN03 0.17 1.00 苯丙胺酸 660.36 4.00 Ba(C2H3〇2)2 2.55 9.98 脯胺酸 552.31 4.80 KBr 0.12 1.01 絲胺酸 1264.70 12.04 CdCI2-2.5H2 〇 2.28 9.99 酥胺酸 762.02 6.40 CoCI2*6H20 2.38 10.00 色胺酸 260.94 1.28 CrCI3 0.32 2.02 酪胺酸.2Na.2H20 832.62 3.19 NaF 4.20 100.02 纈胺酸 749.21 6,40 Ge〇2 0.53 5.07 Kl 0.17 1.02 維生素 mg/L mM RbCI 1.21 10.01 生物素 3.28 0.01 ZrOCI2-8H2 0 3.22 9.99 泛酸鈣 36.02 0.08 氯化膽鹼 143.28 1.03 其讎分 Mg/L nM 葉酸 42.43 0.10 氫基可體松 288 079 肌醇 201.71 1.12 腐胺.2HCI 8000 49.66 菸鹼醯胺 32.02 0.26 亞麻油酸 336.25 1.20 吡哆醇*HCI 32.82 0.16 類脂酸 840.63 4.08 核黃素 3.60 0.01 噻胺·Η(：Ι 35.22 0.10 其他組分 mg/L mM 維生素Β12 1121 0.01 D-葡萄糖（右旋糖） 33005.99 183.37 PVA 2400.00 無機鹽 mg/L mM Nucellin™ 80.00 ΚΗ2Ρ〇4 1635.00 12.02 MgS04*7H2〇 171.98 0.70 ⑧ -74- 1374935 • · 表12.在第5-13天的供給。改質培養基6不含葡萄糖或麩 1 藤胺酸。 GluGIn 改質培養基6 + 43 g/L葡萄糖+ 4.82 g/L麩醯胺酸（對照組） Glu 改質培養基6 + 43 g/L葡萄糖+ 4.82 g/L麩胺酸 GluAsp 改質培養基6 + 43 g/L葡萄糖+ 4.36 g/L天冬醯胺酸 GluGlyGI η 改質培養基β + 43 g/L葡萄糖+ 6.71 g/L甘胺醯麩醯胺酸 GluGlu 改質培養基6 + 43 g/L半乳糖+ 4.82 g/L麩醢胺酸 GalGlu 改質培養基6 + 43 g/L半乳糖+ 4.82 g/L麩胺酸 GalGIn 改質培養基6 + 43 g/L半乳糖+ 4.36 g/L天冬醯胺酸 GalGlyGI n 改質培養基6 + 43 g/L半乳糖+ 6.71 g/L甘胺醯麩醯胺酸 GalAsp 培養基6+ 43 g/L葡萄糖 - 結果與結論零當在供給培養基中的麩胺酸或甘胺醯麩醯胺酸在葡萄糖或半乳糖存在的情況下被取代爲麩醯胺酸時，會見到最高細胞密度。在供給葡萄糖/麩醯胺酸、半乳糖/麩醯胺酸、或僅供給葡萄糖的培養物中，細胞密度一般是較低的（第 2 〇圖）僅供給葡萄糖之培養物的最終存活率是最高的，再來則是供給葡萄糖/麩胺酸的培養物。最低存活率則可見於供給麩醯胺酸或天冬醯胺酸與葡萄糖或半乳糖合併物的培養物（第2 1圖）。在第14天，滴定度在供給葡萄糖/甘胺醯麩醯胺酸和 # 葡萄糖/麩胺酸的培養物中是最高的，爲約700 pg/ml ;滴定度在供給半乳糖/甘胺醯麩醯胺酸和半乳糖/天冬醯胺酸的培養物中是最低的，爲約500 Hg/ml。在葡萄糖/麩醯胺酸對照組中之滴定度爲約5 7 0 Hg/ml (第22圖）。最低敍含量係見於供給葡萄糖/麩胺酸或僅供給葡萄糖之燒瓶中。供給半乳糖/麩胺酸、葡萄糖/麩醯胺酸、葡萄糖/甘胺醯麩醯胺酸、和葡萄糖/天冬醯胺酸之燒瓶顯示出中等含量的銨。供給半乳糖/天冬醯胺酸、半乳糖/甘胺醯麩醯胺酸、和半乳糖/麩醯胺酸之燒瓶則有最高含量的銨 (第23圖）。 ⑧ -75- 1374935 • · 直到第π天爲止，在所有供給半乳糖之燒瓶中的葡萄糖含量均維持在高於lg/L。從第11天到第14天，在這些培養物中的葡萄糖都未完全耗盡，維持在介於0.6和1 g/L 之間，在不同培養物之間並無明顯的差異。在所有供給葡萄糖或葡萄糖與另一受質之合倂物的燒瓶中，葡萄糖含量會增加到第10天爲止。從第10天到第 14天，在這些培養物中的葡萄糖含量係維持完全恆定，且彼此是相似的。在第14天，供給葡萄糖/麩胺酸的培養物 ® 的葡萄糖維持在約8.4 g/L，而僅供給葡萄糖的培養物的葡萄糖維持在約10.8 g/L。當對所有細胞來說條件相同的時候，乳酸鹽含量在第 5天達到約2.4 g/L高，並在所有培養物中於第14天之前掉到本質上爲零。乳酸鹽含量係於從第1 〇天到第1 4天時在葡萄糖/麩醯胺酸對照組中最高，但在這段時間當中，其値低於1 g/L (數據未顯示）。此實驗所有測試條件都會使細胞密度較在對照組之葡 ® 萄糖/麩醯胺酸條件下時來得高。除了半乳糖/天冬醯胺酸條件以外，所有測試條件都會使最終存活率較在供給葡萄糖/麩醯胺酸對照組或半乳糖/麩醯胺酸之條件下來得高。相較於在供給葡萄糖/甘胺醯麩醯胺酸之條件和供給葡萄糖/麩胺酸之條件下爲約7 00 gg/ml的高値，葡萄糖/麩醯胺酸對照組中之滴定度爲約5 70 Hg/ml。實施例7:用於抗- GDF-8之生產之去除麩醯胺酸的批式方法評估 ⑧ -76- 1374935

典型批式供給生產方法在培養期間需要多種供給物。這些供給物係設計來取代培養基中可能已經被細胞耗盡、或可能已經在批式法期間被分解的營養物。當將此方法的規模向上調整到在較大的反應器如需要葉輪泵者（見第24 圖）當中使用時，這些供給物會使情況變得複雜。再者，供給物會稀釋已分泌到培養物中之抗-GDF-8的量，從而影響收取滴定度。批式方法的使用可使生物反應器以全體積來進行接種，不用爲了順應供給物而以部分體積來進行接種，而這會將葉輪泵的必要性去除，且大大地降低任何生產力方面的稀釋效用。由於麩醯胺酸於37 °C下是安定的，且一般認爲在批式培養期間需要添補它，所以麩醯胺酸是採用批式供給辦法最重要理由之一。然而，實施例2、5和6的結果（其中測試了去除麩醯胺酸的策略）顯示，與供給麩醯胺酸之對照組反應器相較之下，其於生產力方面有顯著的增加。將此結果與批式方法合倂，便產生了此實施例所測試的去除麩醯胺酸批式方法。 - 材料與方法抗-G D F - 8細胞係根據下列四項生長條件在1 L生物反應器中生長12天。用於所有條件之生物反應器參數係維持爲相同。溶氧係藉由噴灑空氣而維持在不低於空氣飽和度的 23%，且pH係藉由加入一含有0.58 Μ碳酸氫鈉和0.71 Μ碳酸鈉的溶液而維持在7 . 〇〇。所有培養物之溫度在批式法的前四天都維持於37 °C。在批式法的第四天’將所有生物反 -77-

1374935 應器之溫度降至3 1 °C，並在批式法期間維持在這個點上。在第5、7和1 0天分別對對照組和批式供給培養物供給總反應器體積之8%、12%和8%的供給培養基。 1 )對照組 -接種培養基爲培養基7(見表13)。 -供給培養基8，在第5、7和10天供給（見表1 3 )。 -在第4天供給5 mM麩醯胺酸。 -在第4天將溫度降至31 °C。 ® 2)去除麩醯胺酸之批式供給 - 接種培養基爲僅帶有4 mM麩醯胺酸之培養基7(見表 1 3 )。 - 供給無麩醯胺酸之培養基8，係在第5、7和1 0天供給（見表1 3 )。 - 在第4天無麩醯胺酸供給》 - 在第4天將溫度降至31 °C。 3) 去除麩醯胺酸之批式法 ® ·接種培養基爲僅帶有4 mM麩醯胺酸之新穎批式培養基（.見表13 )。 - 無供給培養基。 - 無麩醯胺酸供給。 - 在第4天將溫度降至31 °C。 - 在第8天加入5 g/L葡萄糖。 4) 在第8天進行補充之去除麩醯胺酸的批式法 -78- 1374935

-接種培養基爲僅帶有4 mM麩醯胺酸之新穎批式培養基（見表13 h - 無供給培養基》 - 無麩醯胺酸供給。 • 在第4天將溫度降至31χ：。 -在第8天加入4g之葡萄糖、375mg之天冬醯胺酸、 3mL 之 1 mMFeS04 原液、3.33mL 之 5 g/LNucellin™ 原液、2.57mL之36mg/L氫基可體松和i.〇g/L腐胺原液溶液、〇.23mL之50 mg/L亞硒酸鈉原液、和 13.1mg之噻胺。表1 3 ·所用培養基之組成物。

MW 培養基7 培養基β 批式培養基胺基酸 mM mM mM L催酸 89,0 1.08 2.4 0.2 L-精胺酸 174.0 6.84 13.2 4 L-天冬醯胺酸·Η20 150.0 4.76 21.4 7.5 L-天冬胺酸 133.0 2.40 6 1.65 L-半腕胺酸·ΗΟ Η20 176.0 0.40 0 0.4 L-胱胺酸·2Ηα 313 0.95 1.875 1 L-麩胺酸 147.0 1.08 2.4 1.08 L-麩醯胺酸 146.0 13.00 37.5 4 甘胺酸 75.0 1.28 2.4 154 L-雛酸·ΗΟΗ20 210.0 1.76 4.2 1.76 卜異白胺酸 131.0 476 10.8 2.83 L-白胺酸 131.0 6.52 15.6 4.7 離胺酸*HCI 182.0 5.20 12 5.2 L-甲硫胺酸 149,0 1.96 4.8 2.6 卜苯丙胺酸 165.0 2.60 6 2.2 L·脯胺酸 115.0 3.24 7.2 4.1 L·絲胺酸 105.0 8.60 18 8.6 L-酥胺酸 119.0 4.32 9.6 3.2 L-色胺酸 204.0 0.78 1.92 1.04 酪胺酸2Na.2H20 261.0 2.16 4.8 1.75 L-纈胺酸 117.0 4.32 9.6 4 維生素 uM uM uM

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生物素 244.0 8.31 20.4 11 D-泛酸鈣 476.0 46.06 112.8 46.06 氯化膽鹼 139.0 632.2 1548 840 葉酸 441.0 58.8 144 58.8 1-肌醇 180.0 686 1680 911 菸鹼醯胺 122.0 161.7 396 215 吡哆醇*HCI 206.0 88.15 240 88 吡哆醛·Η〇Ι 203.0 10 0 10 核黃素 376.0 5.37 13.2 1.1 噻胺.HCI 337.0 63.7 274.7 117 維生素Β12 1355.0 4.9 12 7.8 NaCI 58.5 18.8 mM KCI 74.6 4.2 mM 4.19 mM CaCI〗 111 105 mM 1.05 mM 亞硒酸鈉 173 27 ug/L 60 ug/L 60 ug/L NaH2P〇4*H20 142 4.68 mM 11 mM 4.68 mM Na2HP04 138 0.5 mM 0.3986 mM MgS04 120 1.15 mM 1.05 mM 1.15 mM MgCI2 95 0.3 mM 0.3 mM FeS04.7H20 278 9 uM 24.675 uM 9 uM Fe(N03)3-9H20 404 0.125 uM 0.124 um ZnS04*7H20 287 9.2 uM 17 uM 9.2 um CuS04 160 0.05 uM 0.074 uM 0.064 um NaHC03 84 23.8 mM 23.8 mM 其他葡萄糖 180 16g/L 38.3 g/L 15 g/L 聚乙嫌醇 2.56 g/L 2.4g/L 2.56 g/L 氫基可體松 363 0.23 mg/L 0.43 mg/L 0.28 mg/L 腐胺.2HCI 161 6.4 mg/L 12 mg/L 7.7 mg/L 丙酮酸鈉 110 500 uM 500 uM 亞麻油酸 280 0.81 uM 1.8 uM 0.81 uM 類脂酸 206 2.7 uM 6uM 2.7 uM Nucellin™ 54 mg/L 120 mg/L 50 mg/L 1000X微量B 1.5 ml/L 675 ml/L 1.5 ml/L - 結果與結論對照組和批式方法的細去除麩醯胺酸之批式供給方式法仍爲稍低。兩種批式方胞生長在前4 法的細胞密度法的細胞密度天是相似的，而稍低，且其他批都會在批式法期 ⑧ -80- 1374935 • · 間維持在較高的程度，可能是由於缺乏任何大量稀釋的緣故（見第25圖）。所有培養物的存活率到第8天都是相同的。然而，有趣的是，在第Π天時，沒有進行補充之批式方法的存活率低於其他三個生物反應器’且最後在最終日之前有顯著的下降。由此可知，由於經補充之批式方法與批式供給生物反應器的存活率相同，仍可將批式培養基最適化（見第26圖）。在去除麩醯胺酸之批式方法中、或在去除麩醯胺酸之批式供給方法中所培養的細胞在生產力方面較在對照批式供給方法中培養的相同細胞要來得優越。對照批式供給方法的收取日滴定度爲 6 8 5 pg/mL，如預期；而去除麩醯胺酸之批式供給方法的收取滴定度爲1 080 pg/rnL，比對照組高約5 8 %。這和先前看到的結果相似。去除麩醯胺酸之非補充性批式方法的收取日滴定度爲960 gg/mL，比對照組高約4 0 %，與去除麩醯胺酸的批式供給方法相似；而有補充之去除麩醯胺酸的批式方法的最高滴定度爲1296 μ g / m L，相對於對照組，其有8 9 °/〇的增力[| (見第2 7圖）》分析用於這四個條件的抑制劑含量，結果顯示：三個去除魅醯胺酸之方法的乳酸鹽和氨含量全部顯著低於對照組。事實上，在第4天後，那三個條件會停止生產乳酸鹽或開始消耗乳酸鹽’而對照組在該批式法過程中會持續生產乳酸鹽（見第28圖）。正如所料，在去除麩醯胺酸之方法中，氨含量會在第4天後大大下降，而對照組則持續生產氨（見第29圖）。 . ⑧ -81 - 1374935 • · 在此實施例中，將批式方法與去除麩醯胺酸策略合倂，會造成在生產力方面較之用於抗- GDF-8細胞之對照批式供給方法有40 %的改善。這項數據亦暗示其可得到該批式培養基的某些最適化情形，在生產力方面幾乎有2倍的改善。這項在生產力方面的改善可歸因於兩個因子。第一，去除麩醯胺酸會直接或藉由將氨和乳酸鹽含量保持在非常低而增加生產力。第二’因爲沒有供給物，該批式法的滴定度不會被稀釋。生產力增加，再加上批式方法原本就容 ® 易操作，使得這個方法成爲用來生產重組多胜狀之一個很有吸引力的選擇。實施例8:麩醯胺酸和天冬酿胺酸濃度在批式培養基中對於抗- GDF-8細胞培養方法的效用在實施例2、5和6中，係說明：在批式供給培養中，去除麩醯胺酸會給兩種細胞株好處，包括細胞生長、細胞存活率和滴定度增加以及乳酸鹽和銨的生產降低。天冬酿胺酸似乎也在批式培養基中扮演某種角色。 ® -材料與方法使抗-GDF-8細胞在1 L生物反應器於帶有不同濃度麩醯胺酸和天冬醯胺酸的改質培養基9中培養十二天。基底培養基9組成物係列於表1 4，在此基底組成物上之實驗變因係列於表1 5。培養物前5天係於3 7 °C培養’但反應器4 例外，由於溫度控制問題，它的溫度在第一天是3 0 °C。在第6天將培養物轉換至3 1 °C。在第7天上，對培養物供給 —次5體積％缺乏麩醯胺酸的培養基5。每日測量培養物的 -82- ⑧ 1374935

細胞密度、抗-GDF-8滴定度、乳酸鹽和銨含量。表1 4 .培養基9之組成物。

胺基酸 mg/L mM 微量元素 M9/L nM 丙胺酸 17.80 0.20 亞硒_ 69.16 400.00 精胺酸 696.00 4.00 Fe(N03)3.9 H20 50.00 123.76 天冬醯胺酸·η20 3000.00 20.00 CuS04 10.24 64.00 天冬胺酸 219.45 1,65 CuS〇4*5H2 0 99.88 400.00 半腕胺酸·ηοη2ο 70.40 0.40 FeS04-7H2 0 4170 15000 半胱胺酸·2Ηα 468.75 1.50 ZnS04*7H2 0 2640 9200 麩胺酸單鈉 33.80 0.20 MnS04*H20 33.80 200.00 麩醯胺酸 584.00 4.00 Na2Si03-9H2 0 284.07 1000 甘胺酸 115.50 1.54 (NH4)6Mo70 24·4Η?0 247.20 200.00 組胺酸.hci.h2o 474.60 2.26 nh4vo3 2.34 20.00 異白胺酸 570.73 4,36 NiS04-6H20 5.26 20.00 白胺酸 1030.70 7.87 SnCI2-2H20 0.90 4.00 離胺酸，HCI 1401.40 7.70 AICI3*6H20 0.97 4.00 甲硫胺酸 387.40 2,60 KBr 0.48 4.00 苯丙胺酸 507.00 3.07 CrCI3 15.83 100.00 脯胺酸 539.50 4.69 NaF 0.17 4.00 絲胺酸 1052.00 10.02 Ge〇2 0.42 4.00 酥胺酸 564.80 4.75 Kl 33.20 200.00 色胺酸 274.16 1.34 RbCI 0.48 4.00 酪胺酸·2Ν3·2Η20 745.75 2,86 h3bo3 12.37 200.00 纈胺酸 749.00 6.40 LiCI 0.17 4.00 維生素 mg/L mM 其讎分 yg/L nM 生物素 2.68 0.01 氫基可體松 540.00 1.49 泛酸鈣 21.92 0.05 腐胺.2HCI 15000 93.11 氯化膽鹼 158.46 1.14 亞麻油酸 290.00 1.04 葉酸 25.93 0.06 類脂酸 716.00 3.48 肌醇 163.98 0.91 菸鹼醯胺 26.23 0.22 其他組分 mg/L mM 吡哆醛·Ηα 2.03 0.01 D-葡萄糖(右旋糖） 15000.00 83.33 吡哆醇·Ηα 36.13 0.18 PVA 2560.00 核黃素 2.41 0.01 Nucellin™ 50.00 噻胺.HCI 39.43 0.12 丙酮酸鈉 55.00 0.50 維生素Β12 21.17 0.02 無機鹽 mg/L mM -83- ⑧ 1374935

〇3〇2 116.55 1.05 KCI 312.90 4.19 Na2HP04 56.60 0.40 NaCI 1100.00 18.80 NaH2P04*H20 645.84 4.68 MgS04 138.00 1.15 MgC!2 28.50 0.30 NaHC03 2000.00 23.81 表1 5 ·所測試的麩醯胺酸和天冬醯胺酸條件。反應器1 I反應器2 |反應器3 |反應器4 |反應器5 反應器6 細胞株抗-GDF-8 培養基批式培養基（培養基9)~~' 麩醯胺酸含量 1 mM 1 mM 1 mM 4 mM 4 mM 4 mM 天冬醯胺酸含量 8 mM 12 mM 20 mM 8 mM 12mM 20 mM 種入密度（xl〇e/ml) 0.3 至 0_35 供給培養基第7天，5%培養基5-麩醯胺酸培養天數 12 溫度轉換（37-3 It) 第6天第6天第6天第5天輋5天第4天 - 結果與結論第30、31、32和33圖分別顯示在各種實驗條件下、於各實驗過程中之抗-GDF-8細胞的細胞生長、抗-GDF-8 滴定度、乳酸鹽含量和銨含量。在所有實驗條件下，在所有經測試之天冬醯胺酸含量中，4mM麩醯胺酸係優於1 mM麩醯胺酸。而在同樣的麩 • 醯胺酸含量中，1 2 mM和20 mM天冬醯胺酸條件係優於8 mM天冬醯胺酸條件。在所有測試條件中，在培養終止時會觀察到乳酸鹽和NH4含量降低。實施例9:麩醯胺酸和天冬醯胺酸濃度在批式培養基中對於抗-GDF-8細胞培養方法的效用在實施例8中，係說明：無論天冬醯胺酸含量爲何，含有初始濃度爲4 mM之麩醯胺酸的培養基9表現得比含有】mM麩醯胺酸的培養基來得好。此實施例說明了含有 13 mM麩醯胺酸含量和各種天冬醯胺酸含量之培養基的效 ⑧ -84 - 1374935

用。 -材料與方法使抗-GDF-8細胞在1 L生物反應器於帶有如表16所列之不同濃度麩醯胺酸和天冬醯胺酸的改質培養基9中培養十二天。培養物前3天係於3«TC培養，之後在第4天將培養物轉換至3 1 °C。在第7天上，對培養物供給一次5體積％缺乏麩醯胺酸的培養基5。週期性地測量培養物的細胞密度、細胞存活率、乳酸鹽、銨含量和麩醯胺酸含量、抗 -GDF-8滴定度、和滲透濃度。表1 6 .所測試的麩醯胺酸和天冬醯胺酸條件。反應器1 反應器2 反應器3 反應器4 反應器5 反應器6 細胞株抗-GDF-8 培養基批式培養基（培養基9) 麩醯胺酸含量 4 mM 4 mM 13 mM 13 mM 13 mM 13 mM 天冬醯胺酸含量 20 mM 20 mM 20 mM 12 mM 12 mM 8 mM 種入密度（xl〇6/ml) 0.3 至 0_35 供給培養基第7天，5%缺乏麩醯胺酸的培養基5 培養天數 12 溫度轉換（37-31 °C ) 第4天第4天第4天第4天第4天第4天 - 結果與結論第34、35、36、37、38、39和40圖分別顯示在整個實驗過程中、於各種實驗條件下之抗- GDF-8細胞的細胞生長、抗-GDF-8細胞之百分比存活率、乳酸鹽含量、銨含量、麩醯胺酸含量、抗-GDF-8滴定度、和滲透濃度。在所有測試條件中，僅含有1 3 m Μ麩醯胺酸和2 0 m Μ 天冬醯胺酸之培養基9在細胞生長和滴定度方面顯示出顯著的負面效用。無論培養物是否是從4 mM或13 mM麩醯胺酸開始培養’麩醯胺酸在所有培養物中都於大約相同的時間耗盡。最高抗- GDF-8滴定度係於含有13 mM麩醯胺酸 ⑧ -85- 1374935 • · 和12 mM天冬醯胺酸之培養物中得出°所有培養條件在接近培養終止時都展現出乳酸鹽和銨含量降低情形。在含有 13 mM麩醯胺酸和20 mM天冬醯胺酸之培養物中，銨含量爲最高。實施例10:天冬醯胺酸和半胱胺酸含量在於培養基9所培養的抗-GDF-8細胞內對於所觀察到之乳酸鹽和銨含量降低情形之效用在實施例2、5和6中，發現：於去除麩醯胺酸條件下 • 生長的培養物在培養終止時展現出乳酸鹽和銨含量降低情形。然而，在培養基9中於非去除麩醯胺酸條件下生長的培養物在培養終止時仍展現出乳酸鹽和銨含量降低情形。此效用不會在其他培養基（如培養基1)中觀察到，其中去除麩醯胺酸顯示乳酸鹽和銨含量降低情形是必然的。培養基9和培養基1在天冬醯胺酸（培養基9中有20 mM，而培養基1中加上供給總共有1 1 mM )和酸性胱胺酸（培養基9中有1.5 mM，而培養基1中有0.95 mM)含量上是 m 不同的。此實施例係測試這兩個組分是否是在培養終止時所觀察到之乳酸鹽和銨含量降低情形的原因。 - 材料與方法將抗- GDF-8細胞在1 L生物反應器中培養12天。細胞初始係於3 7 °C培養，之後在第4天或第5天於 8-l〇xl06/mi轉換至31°C。表17列出了所測試的各種實驗條件。每日從各培養物中取出樣本並保存，以藉由蛋白A HPLC分析其滴定度。 -86- ⑧ 1374935

表1 7 .所測試的天冬醯胺酸和半胱胺酸條件》培養基 Gin (mM) Asn (mM) 總Gin (mM) 總Asn (mM) 供_ 培養基5 培養基1 13 5 29 11 總量30% 5 mM Gin，第 4 天培養基5-Gln 培養基1 4 5 4 11 總量30% 5%培養基批式培養基（培養基9) 4 20 4 21 5-Gln，第 7 天培養基1 + 5 mM Asn 培養基5 + 0.5 mM半胱胺酸 13 10 29 16 總量30% 5 mM Gin，第 4 天培養基5 批式培養基（培養基9) 13 20 29 21 總量30% 5 mM Gin，第 4 天註：培養基5-Gln=缺乏麩g 職酸的培; 赛基5 —' - 結果與結論無論培養物是否是從4 mM或13 mM魅醯胺酸開始培養，在培養基9中生長的抗-GDF-8細胞在培養終止時展現出乳酸鹽和銨含量降低情形（見第42和43圖）。相對來說，只有在培養物從4 mM麩醯胺酸開始培養時，培養基〗才會在培養終止時展現出乳酸鹽和銨含量降低情形（見第4 2 和43圖）。將額外的天冬醯胺酸和胱胺酸加入含有13 mM 麩醯胺酸之培養基1不會在培養終止時導致乳酸鹽和銨含量降低情形（見第4 2和4 3圖）。在培養終止時展現出乳酸鹽和銨含量降低情形之培養物（帶有4 mM麩醯胺酸之培養基1、帶有4 mM麩醯胺酸之培養基9、和帶有13 mM麩醯胺酸之培養基9)也會觀察到在培養終止時有總滲透濃度下降情形（見第47圖）。帶有4 mM麩醯胺酸之培養基 9會展現出最高抗 -GDF-8滴定度，再來是在第4天供給13 mM麩醯胺酸之培養基9 (見第46圖）。將供給物之稀釋效用列入考慮，則含有4 mM麩醯胺酸之培養基9與含有13 mM麩醯胺酸之 -87- ⑧ 1374935 • · 培養基9的抗-GDF-8滴定度相等。實施例11:胺基酸和維生素含量在於培養基9所培養的抗 •GDF-8細胞內對於所觀察到之乳酸鹽和銨含量降低情形之效用實施例1 0係測試：培養基1和培養基9之間在天冬醯月安酸和半胱胺酸的差異是否會造成在未去除麩醯胺酸之培 #基9中於在培養終止時所觀察到之乳酸鹽和銨含量降低情形。其判定這些因子不會造成所觀察到之降低情形。培養基1和培養基9的胺基酸和維生素濃度也不同。此實施例係測試：胺基酸和維生素濃度在這兩種培養基之間的差異是否就是所觀察到之降低情形的原因。 - 材料與方法將抗- GDF-8細胞在1 L生物反應器中培養12天。細胞初始係於37°C培養，之後在第4天於8-10xl06/ml轉換至3 1 °C。表1 8列出了所測試的各種實驗條件。將胺基酸' 維生素、氫基可體松和腐胺、微量元素E(列在表19中之組成物）和鐵加至各種實驗培養基1條件，使這些組分之含量等於在培養基9中之含量。每日從各培養物中取出樣本並保存，以藉由蛋白A H PLC分析其滴定度。 -88- 1374935

表1 8 .所測試的胺基酸和維生素條件。培養基 Gin (mM) Asn (mM) 培養基1 13 5 培養基1 +AA 13 15 培養基1 + Vit、Η/P、E、Fe 13 5 培養基1 ·•所有 13 15 帶有13 mM Gin之培養基9 13 20 供給物第5天第7天第10天第11天培養基 5 5 mM Gin 8% 12% 8% 激量30%第4天培養基5培養基5培養基5 培養基 5 5 mM Gin 8% 12% 8% 森量30%第4天培養基5培養基5培養基5 培養基 5 5 mM Gin 8% 12% 8% 4g/L 總量30%第4天培養基5培養基5培養基5葡萄糖培養基 5 5 mM Gin 8% 12% 8% 4g/L 總童30%第4天培養基5培養基5培養基5葡萄糖培養基 5 5 mM Gin 8% 12% 8% 總量30%第4天培養基5培養基5培養基5 表1 9 .微量元素E之組成物。

註：AA=胺基酸，H/P=0.036mg/mL氫基可體松、L08mg/mL腐胺·2Ηα，E=微量元素E M元素 ua/L nM (ΝΗ4)6Μο7〇24·4Η20 123.60 100.00 AICI3*6H20 0.48 2.00 h3b〇3 6.18 100.00 CrCI3 7.92 50.00 CuS04-5H20 49.94 200.00 Ge〇2 0.21 2.00 KBr 0.24 2.00 Kl 16.60 100.00 LiCI 0.08 2.00 MnS04.H20 16.90 100.00 Na2Si03-9H20 142.03 500.00 NaF 0.08 2.00 NH4VO3 1.17 10.00 NiS04-6H20 2.63 10.00 RbCI 0.24 2.00 SnCI2-2H2〇 0.45 2.00 亞硒酸鈉 34.58 200.00 - 結果與結論除了含有所加入之胺基酸的培養基1以外，所有測試條件都會在培養終止時展現出乳酸鹽和銨含量降低情形，表示在培養基9中的胺基酸含量相較於培養基1而言較高一事不是爲乳酸鹽和銨含量降低情形的原因（見第49和 50圖）。然而，相較於含有所加入之胺基酸培養基1來說，含有所加入之維生素、氫基可體松和腐胺、微量元素E和 ⑧ -89- 1374935 • · 鐵的培養基1會在培養終止時展現出乳酸鹽和銨含量降低的情形（見第49和50圖），這表示這些組分可能是在培養基9中所觀察到之降低情形的原因。由於在起始培養基中之天冬醯胺酸和麩醯胺酸的總量較低，在含有所加入之維生素 '氫基可體松和腐胺、微量元素E和鐵的培養基1中生長的培養物會在整個實驗當中展現出銨的最低含量（見第50圖）。實施例12:維生素、微量元素E和鐵含量在於培養基9所鲁培養的抗-GDF-8細胞內對於所觀察到之乳酸鹽和銨含量降低情形之效用在實施例1 1中，係決定：相對於在培養基1中的情形，在培養基9中的維生素、氫基可體松和腐胺、微量元素E 和鐵含量有所增加，這可能是在培養終止時所觀察到之乳酸鹽和銨含量降低情形的原因。在此，將這些組分係獨自或以其等之組合來進行測試，以測定出哪一個（若有任一個的話）是所觀察到之降低情形的原因。 ® -材料與方法將抗-GDF - 8細胞在1 L生物反應器中培養1 2天。細胞初始係於37 °C培養，之後在第4天於8-10x1 06個細胞/ml 轉換至31 °C，但含有微量元素E之培養基1是在第4天於約6x1 〇6個細胞/ml轉換。表20列出了所測試的各種實驗條件。在所有培養基1條件中加入氫基可體松和腐胺，以使這些組分之含量等於其在培養基9中之含量。在各種實驗性培養基1條件中加入維生素、微量元素E (列在表1 9 ⑧ -90- 1374935

中之組成物）和鐵，以使這些組分之含量等於其在培養基 9中之含量。每日從各培養物中取出樣本並保存，以藉由蛋白A HPLC分析其滴定度。表2 0 ·所測試的胺基酸和維生

培錄 Gin (mM) Asn (mM) 供給物培養基1 + Fe 13 15 培養基5 總量30% 培養1 + E 13 15 培養基5 總量30% 培養基1 + Vit 13 15 培養基5 總量30% 培養基1 + Fe+E 13 15 培養基5 總量30% 培養基1 + Fe+Vit 13 15 培養基5 總量30% 培養基1 + E+Vit 13 15 培養基5 總量30% 帶有13 mM Gin之 13 20 培養基5 培養基9 總量30% 註：E=微量元素E 素條件。__ 溫度轉換第4天第5天第7天第10天第4壬 5mMGIn 8% 12% 8% 第4天培養基5培養基5培養基5 笛4甲 5mMGIn 8% 12% 8% 第4天培養基5培養基5培養基5 第4壬 5mMGIn 8% 12% 8% 第4天培養基5培養基5培養基5 第4天 5mMGIn 8% 12% 8% 第4天培養基5培養基5培養基5 笛4 子 5mMGIn 8% 12% 8% 第4天培養基5培養基5培養基5 笛4 壬 5mMGIn 8% 12% 8% ^ ^ 第4天培養基5培養基5培養基5 笛4；5? 5mMGIn 8% 12% 8% 第4天培養基5培養基5培養基5 - 結果與結論在所有測試條件中，僅含有1 3 mM麩醯胺酸之培養基 9和含有微量元素E之培養基1在培養終止時展現出乳酸鹽和銨含量降低情形（見第54和55圖）。應注意：觀察到 • 含有微量元素E之培養基1有含量降低情形可能是因爲此培養物在細胞爲約6x1 06個細胞/mL時進行了溫度轉換的關係。含有1 3 mM麩醯胺酸之培養基9展現出的抗-GDF-8 滴定度較任何培養基1配方來得高。實施例13.培養基1、3和9在細胞生長和抗-GDF-8滴定度上的比較進行此實驗’以測量使用培養基1 ' 3和9在細胞生長和抗- GDF-8滴定度上的不同。 -91- ⑧ 1374935

- 材料與方法抗-G D F - 8細胞係在各種培養基和在如表2 1所列示之供給條件下進行培養。相關培養基資訊係列於表22。細胞在〗L生物反應器中生長12天，並在第4天從371轉換至 3 1 〇C 。表2 1 .所測試的培養基和供給條件。供_ 培錄 Asn Gin 第3天第4天第5天第6天第7天第ίο天第11天培養基3 14 mM 4 mM 3.3%培養基 5-Gln 3.3%培養基 5-Gln 3.3%培養基 5-Gln 3.3%培養基 5-Gln 10%培養基 5-Gln 3.3%培養基 5-Gln 3.3%培養基 5-Gln 培養基3 14 mM 4 mM 3.3%培養基 5-Gln 3.3°/。培養基 5-Gln 3.3%培養基 5-Gln 3.3%培養基 5-Gln 10%培養基 5-Gln 3.3%培養基 5-Gln 3.3%培養基 5-Gln 培養基1 14 mM 4 mM 8%培養基 5-Gln 12°/。培養基 5-Gln 8%培養基 5-Gln 培養基9 20 mM 4 mM 5%培養基 5-Gln 註：培養基5-Gln-缺乏麩醯胺酸的培養基5 表22.培養基槪述》培養基 Asn Gin 供獅 AA(起始議量} 離子/總AA 培養基3 14 mM 4 mM 34%培養基5-Gln 34 mM/64 mM 1.75 培養基9 20 mM 4 mM 5%培養基5-Gln 91.4 mM/94.3 mM •72 培養基1 14 mM 4 mM 31.6%培養基 5-Gln 78 mM / 96.4 mM .74 註：培養基5-Gln-^乏麩醯胺酸的培養基5 結果與結論在培養基9中培養的抗-GDF-8細胞展現出最高細胞密度和抗-GDF-8滴定度，而在培養基3中培養的抗-GDF-8 細胞則展現出最低細胞密度和抗-GDF_8滴定度（見第57 和58圖）。培養基9會產生優於培養基1的結果’表示較佳爲在起始培養基中提供培養基組分’而非將之分成多次供給來提供。此外’培養基1和培養基9兩者皆表現得比培養基3好，表示提供濃度高於約7〇的胺基酸會優於提供濃度低於約70 mM的胺基酸°最後：’在起始培養基中 1374935

提供濃度高於約70 mM的胺基酸會產生最高細胞密度和滴定度（比較培養基9與培養基1 )。實施例14·對在生物反應器中之抗_GDF-8細胞培養物來說，在培養基9中總麩醯胺酸和天冬醯胺酸之最適含量的統計分析 - 材料與方法使抗-GDF-8細胞在1 L生物反應器中生長，並在表23 所示之天數從37 °C轉換至31 °C。使最終滴定度接受T檢 # 定，以測定單計麩醯胺酸之最適含量 '和總計合倂之麩醯胺酸和天冬醯胺酸的最適含量。表23槪括了某些相關實驗條件和抗-GDF-8細胞在培養基9中生長的最終結果。表23.在培養基9中生長之抗-GDF-8細胞的相關實驗條件和最終結果。培養基 Gin (mM) Asn (mM) 進行轉換的天數供給物滴趙 (ug/ml) 滴定度/1200 總 Gin 總 Asn 總 Gln+Asn 培養基9 1 8 6 5%培養基5-Gln 615.2 0.51 1 9 10 培養基9 1 δ 6 5%培養基5-Gln 857.1 0.71 4 9 13 培養基9 1 12 6 5%培養i 5-Gln 947 0,79 1 13 14 培養基9 4 12 4 5%培養* 5-Gln 1184 0.99 4 13 17 培養基9 4 20 4 5%培養基5-Gln 769.6 0.64 1 21 22 培養基9 4 8 5 5%培養基5-Gln 1262.6 1.05 13 9 22 培養基9 4 20 4 5%培養基5-Gln 1198 1.00 4 21 25 培養基9 4 20 4 5%培養基5-Gln 1321.1 1.10 4 21 25 培養基9 4 20 4 5%培養基5-Gln 1162.4 0.97 4 21 25 培養基9 13 20 4 5%培養墓5-Gln 1436.6 1.20 4 21 25 培養基9 15 12 4 5%培養基5-Gln 1638.6 1.37 13 13 26 培養基9 13 12 4 5%培養基5-Gln 1606.7 1.34 13 13 26 _培養基9 13 20 4 5%培養基5-Gln 1075.91 0.90 13 21 34 培養基9 13 20 4 5%培養基5-Gln 1058.4 0.88 13 21 34 培養基9 13 20 4 5%培養基5-Gln 1075.91 0.90 15 21 36 培養基9 13 5 4 Asn、Gin、 5%培養基5-Gln 974.52 0.81 28.5 11 .39.5 培養基9 13 20 4 Asn、Gin、 5%培養基5-Gln 831.81 0.69 28.5 26 54.5 培養基9 13 20 4 培養基5，總量30% 5 mM Gin，第 4 天 975.4 0.81 28.5 26 54.5 培養基9 13 20 4 培養基5，總量30% 5 mM Gin > 第 4 天 973*5 0.81 28.5 26 54.5 註：培養基5-Gln-缺乏麩醯胺酸的培養基5 ⑧ -93- 1374935

- 結果與結論第5 9圖顯示對各種含量之單計麩醯胺酸、與總計合倂之麩醯胺酸和天冬醯胺酸所推估的抗- GDF-8滴定度。表24 顯示了比較麩醯胺酸含量介於2和1 5 mM之間和麩醯胺酸含量超出此範圍外之標準化滴定度的T檢定結果。表25 顯示了比較合倂麩醯胺酸和天冬醯胺酸含量介於16和36 mM之間和合倂麩醯胺酸和天冬醯胺酸含量超出此範圍外之標準化滴定度的T檢定結果。兩個T檢定結果都表示，在所比較之兩個組群之間的抗- GDF-8滴定度有顯著差異。在含有介於2和15 mM之間的麩醯胺酸和介於1 6和3 6 mM之間的合倂麩醯胺酸和天冬醯胺酸之培養基9中生長的培養物會展現出比在麩醯胺酸和合倂麩醯胺酸和天冬醯胺酸含量超出這些範圍外之培養基中生長的培養物更高的抗-GDF-8滴定度。在所有實驗中，天冬醯胺酸含量高於9 mM。

條件之標準化滴定度的T檢定結果。

表 24.比較 2 mM<Gln<15 mM 條件對 Gln>15 mM、Gln<2 mM 標準化滴定度 Gln>15、Gln<2 2<Gln<15 平均値 0.724649917 1.033147493 變異度 0.013326655 0.036834109 觀察 7 12 綜合變異度 0.028537361 假設平均差 0 df 17 t統計量 -3.839791986 單尾p値（T<=t) 0.000656219 單尾臨界t値 1.739606432 雙尾p値（T<=t) 0.001312438 雙尾臨界t値 2.109818524 -94- 1374935

表 25.比較 16 mM<Gln + Asn<36 mM 條件對 Gln + Asn>36 mM、Gln + Asn<16 mM條件之標準化滴定度的T檢定結果。標準化滴趙 Asn+Gln>36、Asn+Gln<16 16<Asn+Gln<36 平均値 0.735066584 1.027071104 變異度 0.012061148 0.041504987 觀察 7 12 綜合變異度 0.031113044 假設平均差 0 df 17 t統計量 3.480816823 單尾P值（T<=t) 0.001430281 單尾臨界t値 1.739606432 雙尾P值（T<=t) 0.002860561 雙尾臨界t値 2.109818524 實施例15.培養基在細胞培養上的效用此實施例硏究的是：在中等規模利用高密度種入培養物的三種細胞培養基之變因的表現。基於小規模生物反應器數據計，預期所測試之所有培養基在第1相培養基（供給了供給培養基1 1的培養基1 0 )顯示出有改善的情形。 - 材料與方法將表現出一人類化抗-Abeta胜肽IgGl單株抗體的CHO ® 細胞（“抗-ABeta細胞”）在如表26所示之各種培養基中進 ίτ 測試（見 Basi e t al., Humanized Antibodies that recognize Beta Amyloid Peptide, WO02/46237 )。pH的低端設定點係以0.95 M Na2C03 + 0.05 M K2C03控制在7.0，但在第1相中，則是以一含有0.5 8 M碳酸氫鈉和0.7 1 M碳酸鈉的溶液來加以控制。溶氧係藉由下列方式來控制在3 0% : 依其要求噴灑空氣、於60rpm攪動，且供給培養基爲培養基 5(帶有或不帶有麩醯胺酸，如註解）。除了 03P49B501是在 ⑧ -95- 1374935

5 〇 0 L的規模下生長外，所有培養物均在1 3 0 L規模下生長。簡而言之，培養基1係富集了所有營養物，而未考慮其相對吸收率；而培養基1 2則藉由自該無差別富集的版本中移除顯然非必須之營養物而加以均衡。培養基1 〇、1 1和1 2 之組成物係列於表2 7。表2 6 .用於試驗性測試之初始培養基、供給量和種源。批次編號描述初始培養基供給量是否供給 Gin? 種源種入密度 (存活數 /mL) 1 第1相培養基10 38% * 有 Wave培養袋 0.2 X 106 2 富集培養基，高Gin (1) 培養基1 16% 有 Wave培養袋 0.2x10® 3 富集培養基，高Gin (2) 培養基1 16% 有 Wave培養袋 0.2x10® 4 富集培養基，減量Gin 培養基1 15% yfrrr 無 Wave培養袋 0.2x10® 5 均衡培養基，低Gin (1) 培養基12 10% 無 Wave培養袋 0.2 x106 6 均衡培養基，低Gin (2) 培養基12 9% 無 Wave培養袋 0.2x10® 7 均衡培養基，低Gin，密集種入培養基12 5% 並 >ιν\ 高密度生物反應器 2.0x106 *第1 B方法係供給不如培養基5富養的培養基12。

表2 7 .培養基1 0、1 1和1 2之組成物。培養基10 培養基11 培養基12 胺基酸 mg/L mM mg/L mM mg/L mM 丙胺酸 24.87 0.28 142.48 1.60 17.80 0.20 精胺酸 423.43 2.43 1528.84 8.79 696.00 4.00 天冬醯胺酸·η20 173.90 1.16 1080.60 7.20 1500.00 10.00 天冬胺酸 52.72 0.40 532.40 4.00 219.45 1.65 半胱胺酸·ηοη2ο 70.01 0.40 70.40 0.40 半胱胺酸·2Ηα 62.09 0.20 470.00 1.50 312.50 1.00 麩胺酸 41.08 0.28 235,38 1.60 麩胺酸單鈉 33.80 0.20 麩醯胺酸 1162.40 7.96 6000.00 41.10 584.00 4.00 甘胺酸 35.92 0.48 120.07 1.60 115.50 1.54 組胺酸·ηοη2ο 75.27 0.36 588.32 2.80 369.60 176 異白胺酸 151.90 1.16 944.52 7.21 370.73 2.83 白胺酸 172.69 1.32 1360.75 10.39 615.70 470 離胺酸*HCI 218.38 1.20 1456.80 8.00 946.40 5.20 ⑧ -96- 1374935

甲硫胺酸 53.55 0.36 477.06 3.20 387.40 2.60 苯丙胺酸 98.81 0.60 660.36 4.00 363.00 2.20 脯胺酸 96.40 0.84 552.31 4.80 471.50 4.10 絲胺酸 273.07 2.60 1264.70 12.04 903.00 8.60 酥胺酸 132.81 1.12 762.02 6.40 380.80 3.20 色胺酸 28.99 0.14 260.94 1.28 212.16 1.04 酪胺酸·2Ν3·2Η20 145.10 0.56 832.62 3.19 456.75 1.75 . 纈胺酸 131.17 1.12 749.21 6.40 468.00 4.00 維生素 mg/L μΜ mg/L μΜ mg/L μΜ 生物素 0.36 1.49 3.28 13.45 2.68 11.00 泛酸鈣 4.03 8.47 36.02 75.67 21.93 46.06 氯化膽鹼 16.11 115.92 143.28 1030 116.76 840.00 葉酸 4.76 10.80 42.43 96.22 25.93 58.80 肌醇 22.64 125.79 201.71 1120 163.98 911.00 菸鹼醯胺 3.61 29.62 32.02 262.44 26.23 215.00 吡哆醛*HCI 1.99 9.83 2.03 10.00 吡哆醇·Ηα 1.67 8.10 32.82 159.31 18.13 88.00 核黃素 0.40 1.06 3.60 9.58 0.41 1.10 噻胺.HCI 3.92 11.64 35.22 104.51 39.43 117.00 維生素Β12 1.34 0.99 11.21 8.27 10.57 7.80 無機鹽 mg/L mM mg/L mM mg/L mM 〇3〇2 115.78 1.04 113.27 1.02 116.55 1.05 KCI 310.94 4.17 312.90 4.19 ΚΗ2Ρ〇4 1640.00 12.06 Na2HP04 70.81 0.50 56.60 0.40 NaCI 3704.96 63.44 NaH2P04*H20 114.53 0.83 645.84 4.68 MgS04 48.70 0.41 138.00 1.15 MgS04-7H20 8.60 0.03 170.00 0.69 MgCI2 28.53 0.30 28.50 0.30 NaHC03 1220.00 14.52 2000.00 23.81 微量元素 μο/L nM pg/L nM mq/l nM 亞硒酸鈉 7.00 40.49 40.00 231.35 53.65 310.27 Fe(N03)3*9H20 49.86 123.42 50.00 123.76 CuS04 0.97 6.06 3.44 21.51 10.00 62.50 CuS04-5H20 7.49 30.00 7.49 30.00 49.94 200.00 FeS04*7H20 1542 5549 2534 9115 3366 12000 ZnS04*7H20 1383 4821 2704 9421 2640 9198 MnS04*H20 0.17 1.01 0.17 1.01 16.90 100.00 Na2Si03-9H20 140 492.84 140.00 492.84 142.03 500.00 (ΝΗ4)6Μο7024·4Η2 〇 1.24 1.00 1.24 1.00 123.60 100.00 ⑧ -97- 1374935

NH4V〇3 0.65 5.56 0.65 5.56 1.17 10.00 NiS04*6H20 0.13 0.49 0.13 0.49 2.63 10.00 SnCI2-2H20 0.12 0.53 0.12 0.53 0.45 2.00 AICI3.6H20 1.20 4.97 0.48 2.00 AgN03 0.17 1.00 Ba(C2H3〇2)2 2.55 9.98 KBr .12 1.01 0.24 2.00 CdCI2*2.5H2〇 2.28 9.99 C〇CI2.6H20 2.38 10.00 CrCI3 0.32 2.02 7.92 50.00 NaF 4.20 100.02 0.08 2.00 Ge〇2 0.53 5.07 0.21 2.00 Kl 0.17 1.02 16.60 100 RbCI 1.21 10.01 0.24 2.00 Zr0CI2.8H20 3.22 9.99 H3B03 6.18 100.00 LiCI 0.08 2.00 其讎分 pg/L μΜ pg/L μΜ mq/l μΜ 氫基可體松 86.40 .24 288.00 0.79 360.00 0.99 腐胺·2Ηα 2480 15.39 8000 49.66 10000 62.07 亞麻油酸 56.69 0,20 336.25 1.20 290.00 1.04 類脂酸 141.71 0.69 840.63 4.08 716.00 3.48 其讎分 mg/L mM mg/L mM mg/L mM D-葡萄糖（右旋糖） 11042.24 61.35 43005.99 238.92 15000.00 83.33 PVA 2520.00 2400.00 2560.00 Nucellin™ 14.00 80.00 50.00 丙酮酸鈉 54.85 0.50 55.00 0.50 ® -結果與結論培養基的改變會在這些實驗的過程中產生穩定的改善。在細胞生長、存活率、降低乳酸鹽含量、降低銨含量、和滴定度方面，降低麩醯胺酸含量要比升高其含量來得好 (見第60-64圖），且均衡（批式）培養基要比富集培養基來得好（培養基1，見第60-64圖）。從高密度接種物開始的培養物所展現之最終滴定度會比從密度較低之接種物開始的培養物來得高（見第64圖）。 ⑧ -98- 1374935 • · 和在小規模生物反應器中所觀察到者不同的是，第一培養基（帶有高Gin之培養基1)會造成滴定度比原始方法來得低（見第64圖），在溫度改變之後，乳酸鹽吸收也沒有轉換（見第62圖）。由此可知，此培養基可能有一些規模方面的敏感度》這項結論受到與這些中等規模實驗同時進行之小規模（2L)平行實驗的支持（數據未顯示）。後者那種含有較少麩醯胺酸之培養基配方對於規模大小並不敏感，至少在這些實驗當中不敏感（見第60-65圖）。以兩組重覆方式進行的方法（批式法2和3、與批式法5和6) 在各次進行之間的再現性極佳（見第60-65圖），而使所有在此活動中所收集之數據的可信度增加。實施例16.使用培養基9製造TNFR-Ig - 材料與方法將會表現出由與IgGl之Fc部鍵結之人類75仟道耳吞 (P75)腫瘤壞死因子受器（TNFR)的細胞外配位體結合部位所構成之二聚體融合蛋白的CHO細胞（“TNFR-Ig細胞”）以來自灌注生物反應器之高密度種入，並在培養基9 中稀釋至3xl06存活細胞/ml，以用於生產生物反應器步驟。 - 結果與結論第66、67、68、69、70' 71和72圖分別顯示細胞生長、細胞存活率、殘餘葡萄糖、麩醯胺酸含量、乳酸鹽濃度、銨濃度、和相對產物滴定度。在對此方法作出輕微改質之範圍內，所有條件均會產出良好的細胞生長、高細胞存活率、且所有最終滴定度都很高。 ⑧ -99- 1374935

對此實驗之所有條件來說，代謝抑制性副或者被消耗掉、或者保持一定濃度；這是說，產會受到阻礙。同樣地，對抑制性代謝物銨來 —開始初始會上升，但在溫度轉換後的同時，細胞消耗掉。在此實施例中，TNFR-Ig細胞培化學誘導劑丁酸鈉和HMBA的處理。實施例17.大規模和小規模培養條件的比較物乳酸鹽酸鹽的生，其含量便開始被物係接受 - 材料與方法爲了決定培養物的大小是否會影響相關培養使抗-GDF-8細胞在小規模1公升生物反應器或大公升生物反應器中生長。使細胞於37 °C生長，並轉換至3 1 t：。 - 結果與結論如在第73、74、75和76圖（其分別顯示紐滴定度、乳酸鹽含量、和銨含量）可見，這些特公升大規模和1公升小規模培養物之間並無相關酸鹽和銨兩者的含量在第4天溫度轉換之後開好實施例說明，當使培養物接受相同的生長條件時的大小不會影響細胞密度、細胞存活率、乳酸鹽物特性，規模6 0 0 0 在第4天胞密度、性在6 0 0 0 差異。乳下降。此，培養物含量和銨含量。【圖式簡單說明】第1圖顯示培養基1和培養基2於搖盪燒 -GDF-8細胞的比較。第2圖顯示抗- GDF-8細胞在培養基1中的中使用抗胞生長和 ⑧ -100- 1374935

存活率。第3圖顯示抗-GDF-8細胞培養物在對照組和無麩醯胺酸供給之培養條件下的細胞生長》第4圖顯示抗-GDF-8細胞培養物在對照組和無麩醯胺酸供給之培養條件下的細胞存活率。第5圖顯示抗-GDF-8細胞培養物在對照組和無麩醯胺酸供給之培養條件下的銨含量。第6圖顯示抗-GDF-8細胞培養物在對照組和無麩醯胺 φ 酸供給之培養條件下的乳酸鹽含量。第7圖顯示在對照組和無麩醯胺酸供給之培養條件下的抗-GDF-8滴定度。第8圖顯示抗-GDF-8細胞培養物在對照組和去除麩醯胺酸供給（starved )之培養條件下的細胞密度。第9圖顯示抗-GDF-8細胞培養物在對照組和去除麩醯胺酸供給之培養條件下的細胞存活率。第10圖顯示抗-GDF-8細胞培養物在對照組和去除麩醯 φ 胺酸之培養條件下的銨含量。第1 1圖顯示抗-G D F - 8細胞培養物在對照組和去除麩醯胺酸之培養條件下的乳酸鹽含量。第1 2圖顯示在對照組和去除麩醯胺酸之培養條件下的抗-GDF-8滴定度。第13圖顯示抗-GDF-8細胞在培養基1和培養基2中的鐵劑量反應。第14圖顯示供給麩胺酸和麩醯胺酸之培養物的細胞密度。 -101 - ⑧

Claims

㈣日修正本|修正本專利案 1374935 ί—：- . 公告本第 094 1 29074 號「"α-aBeta 之製法 . (2012年5月24日修正）十、申請專利範圍： ~ 1. 一種以大規模生產性細胞培養物來生產抗 -ABeta(anti-amyloid beta antibody)之方法，其包括下列步驟：提供一細胞培養物，其包括：帶有抗-A B et a( an t i - am y 1 〇 i d beta antibody)密碼 φ 之基因的哺乳類細胞，其基因會於細胞培養條件下 . 表現；以及 —種含有麩醯胺酸且具有一種選自下列組群之培養基特性的培養基：（i)每單位體積累計胺基酸量高於70 mM，（ii)累計麩醯胺酸對累計天冬醯胺酸之莫耳比率低於2，（iii)累計麩醯胺酸對累計總胺基酸之莫耳比率低於0.2，（iv)累計無機離子對累計總胺基酸之莫耳比率介於0.4至1之間，（v)每單 0 位體積麩醯胺酸和天冬醯胺酸的合倂累計量高於 1 ό mM，及其等特性之組合；若將該培養物維持於第一組培養條件下，將該在初始生長相中的培養物於第一組培養條件下維持一段足以使該、細胞繁殖至在最大可能存活細胞密度之 20%-80%範圍內之存活細胞密度的第—時期；改變至少一項培養條件，從而施-用第二組培養條件’且於培養基中發生代謝轉換； 1374935 修正本將該培養物於第二組條件下維持一段第二時期，從而在第二時期中使抗-ABetaUnti-amyloid beta antibody)在細胞培養物中累積。 2. 一種以大規模生產性細胞培養物來生產抗 -ABeta(anti-amyloid beta antibody)之方法，其包括下列步驟：提供一細胞培養物，其包括：帶有抗- ABeta(anti-amyloid beta antibody)密碼 φ 之基因的哺乳類細胞，其基因會於細胞培養條件下表現；以及一種含有每單位體積累計胺基酸量高於70 mM 的培養基；以及該培養基含有麩醯胺酸；且該培養基具有兩種選自下列組群之培養基特性：（i)累計麩醯胺酸對累計天冬醯胺酸之莫耳比率低於2，（ii)累計麩醯胺酸對累計總胺基酸之莫耳 • 比率低於〇·2，（iii)累計無機離子對累計總胺基酸之莫耳比率介於0.4至1之間，（iv)每單位體積麩醯胺酸和天冬醯胺酸的合倂累計量高於16 mM，及其等特性之組合；若將該培養物維持於第一組培養條件下，將該在初始生長相中的培養物於第一組培養條件下維持一段足以使該細胞繁殖至在最大可能存活細胞密度之 2 0%-8 0%範圍內之存活細胞密度的第一時期； 1374935 修正本改變至少一項培養條件，從而施用第二組培養條件，且於培養基中發生代謝轉換；將該培養物於第二組條件下維持一段第二時期，從而在第二時期中使抗-ABeta(anti-amyloid beta antibody)在細胞培養物中累積。 3. 一種以大規模生產性細胞培養物來生產抗 -ABeta(anti-amyloid beta antibody)之方法，其包括下列步驟： φ 提供一細胞培養物，其包括：帶有抗-ABeta(anti-amyloid beta antibody)密碼之基因的哺乳類細胞，其基因會於細胞培養條件下表現；以及一種包含累計麩醯胺酸對累計天冬醯胺酸之莫耳比率低於2的培養基；以及該培養基含有麩醯胺酸；且該培養基具有兩種選自下列組群之培養基特 φ 性：（i)—種含有每單位體積累計胺基酸量高於70 mM的培養基，（ii)累計麩醯胺酸對累計總胺基酸之莫耳比率低於0.2，（iii)累計無機離子對累計總胺基酸之莫耳比率介於0.4至1之間’（iv)每單位體積麩醯胺酸和天冬醯胺酸的合倂累計量高於16 mM，及其等特性之組合；若將該培養物維持於第一組培養條件下’將該在初始生長相中的培養物於第一組培養條件下維持一段足 1374935 修正本以使該細胞繁殖至在最大可能存活細胞密度之 2 0%-8 0%範圍內之存活細胞密度的第一時期；改變至少一項培養條件，從而施用第二組培養條件，且於培養基中發生代謝轉換；將該培養物於第二組條件下維持一段第二時期’從而在第二時期中使抗-ABeta(anti-amyl〇id beta antibody)在細胞培養物中累積。

一種以大規模生產性細胞培養物來生產抗 -A B e t a ( a n t i - a m y 1 〇 i d b e t a a n t i b o d y )之方法，其包括下列步驟：提供一細胞培養物，其包括：帶有抗- ABeta(anti-amyloid beta antibody)密碼之基因的哺乳類細胞，其基因會於細胞培養條件下表現；以及一種包含累計麩醯胺酸對累計胺基酸之莫耳比率低於0.2的培養基；以及該培養基含有麩醯胺酸；且該培養基具有兩種選自下列組群之培養.基特性：（i)一種含有每單位體積累計胺基酸量高於70 mM的培養基，（ii)累計麩醯胺酸對累計天冬醯胺酸之莫耳比率低於2，（iii)累計無機離子對累計總胺基酸之莫耳比率介於0.4至1之間，（iv)每單位體積麩醯胺酸和天冬醯胺酸的合倂累計量高於16 mM，及其等特性之組合；修正本若將該培養物維持於第一組培養條件下，將該在初始生長相中的培養物於第一組培養條件下維持一段足以使該細胞繁殖至在最大可能存活細胞密度之 20%-80%範圍內之存活細胞密度的第—時期；改變至少一項培養條件，從而施用第二組培養條件，且於培養基中發生代謝轉換；將該培養物於第二組條件下維持一段第二時期，從而在第二時期中使抗-A B e t a ( a n t i - a m y 1 〇 i d beta antibody)在細胞培養物中累積。一種以大規模生產性細胞培養物來生產抗 -ABeta(anti-amyloid beta antibody)之方法，其包括下列步驟：提供一細胞培養物，其包括：帶有抗- ABeta(anti-amyloid beta antibody)密碼之基因的哺乳類細胞，其基因會於細胞培養條件下表現；以及一種包含累計無機離子對累計總胺基酸之莫耳比率介於0.4至1之間的培養基；以及該培養基含有麩醯胺酸；且該培養基具有兩種選自下列組群之培養基特性：（i)一種含有每單位體積累計胺基酸量高於70 mM的培養基，（ii)累計麩醯胺酸對累計天冬醯胺酸之莫耳比率低於2，（iii)累計麩醯胺酸對累計總胺基酸之莫耳比率低於0.2，（iv)每單位體積麩醯胺 1374935 修正本酸和天冬醯胺酸的合併累計量高於1 6 mM，及其等特性之組合；若將該培養物維持於第一組培養條件下，將該在初始生長相中的培養物於第一組培養條件下維持一段足以使該細胞繁殖至在最大可能存活細胞密度之 2 0 % - 8 0 %範圍內之存活細胞密度的第一時期；改變至少一項培養條件，從而施用第二組培養條件，且於培養基中發生代謝轉換；將該培養物於第二組條件下維持一段第二時期，從而在第二時期中使抗-ABeta(anti-amyl〇id beta antibody)在細胞培養物中累積。 6. 一種以大規模生產性細胞培養物來生產抗 -ABeta(anti-amyloid beta antibody)之方法，其包括下列步驟：提供一細胞培養物，其包括：帶有抗-ABeta(anti-amyloid beta antibody)祖碼之基因的哺乳類細胞，其基因會於細胞培養條件下表現；以及一種含有每單位體積麩醯胺酸和天冬醯胺酸之合倂累計量高於1 6 m Μ的培養基；以及該培養基含有麩醯胺酸；且該培養基具有兩種選自下列組群之培養基特性：（i)一種含有每單位體積累計胺基酸量高於7〇 ιηΜ的培養基，（Π)累計麩醯胺酸對累計天冬醯胺酸 1374935 修正本之莫耳比率低於2，（ i i i)累計麩醯胺酸對累計總胺基酸之莫耳比率低於0.2 ’（iv)累計無機離子對累計總胺基酸之莫耳比率介於0·4至1之間，及其等特性之組合；若將該培養物維持於第一組培養條件下，將該在初始生長相中的培養物於第一組培養條件下維持一段足以使該細胞繁殖至在最大可能存活細胞密度之 2 0%-8 0%範圍內之存活細胞密度的第一時期； φ 改變至少一項培養條件，從而施用第二組培養條件，且於培養基中發生代謝轉換；將該培養物於第二組條件下維持一段第二時期，從而在桌—時期中使抗-A B e t a (a n t i - am y 1 〇 i d beta antibody)在細胞培養物中累積。 7 · 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該改變至少一項培養條件步驟中的該細胞培養條件係選自下列組群：（0溫度，（ii)pH，（iii)滲透壓値，（iv)化學誘導劑 φ 含量，及其等特性之組合。 8 _如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養基之初始麩醯胺酸濃度低於或等於〗3 m Μ。 9 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養基之初始麩醯胺酸濃度低於或等於〗〇 m Μ。 10.如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養基之初始麩醯胺酸濃度低於或等於7 mM。 1374935 修正本 11. 如申請專利範圍第1項之方法’其中該培養基之初始魅酶胺酸濃度低於或等於4 mM。 12. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養基之麩醯胺酸的每單位體積總累計量低於或等於1 3 m Μ。 1 3 ·如申請專利範圍第1項之方法’其中該培養基之麩醯胺酸的每單位體積總累計量低於或等於1 0 mM。 14.如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養基之鍵醯胺酸的每單位體積總累計量低於或等於7 mM。 φ 15.如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養基之麩醯胺酸的每單位體積總累計量低於或等於4 mM。 16. 如申請專利範圍第1項之方法，其中僅於細胞培養開始時在初始培養基中提供麩醯胺酸。 17. 如申請專利範圍第1項之方法，其中可溶性鐵在培養基中之濃度高於5 μΜ。 18. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養物之存活細胞密度係以週期性基準進行測量。 φ 19.如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養物之存活率係以週期性基準進行測量。 20.如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養物之乳酸鹽含量係以週期性基準進行測量。 2 1 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養物之銨含量係以週期性基準進行測量。 22.如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養物之滴定度係以週期性基準進行測量。 1374935 修正本 23. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養物之滲透濃度係以週期性基準進行測量。 24. 如申請專利範圍第18至23項中任一項之方法，其中該測量係於每日進行。 2 5 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該哺乳類細胞之初始密度爲至少2xl02個細胞/mL。 26.如申請專利範圍第1項之方法，其中該哺乳類細胞之初始密度爲至少2xl03個細胞/mL。 • 2 7.如申請專利範圍第1項之方法，其中該哺乳類細胞之初始密度爲至少2 X 1 04個細胞/m L。 2 8.如申請專利範圍第1項之方法，其中該哺乳類細胞之初始密度爲至少2xl05個細胞/mL。 29·如申請專利範圍第1項之方法，其中該哺乳類細胞之初始密度爲至少2 X 1 0 6個細胞/m L。 3 0 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該哺乳類細胞之初始密度爲至少5 X 1 06個細胞/mL。 ® 3 1 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該哺乳類細胞之初始密度爲至少1 ο X 1 0 6個細胞/m L。 3 2.如申請專利範圍第1項之方法，其中該提供步驟包括提供至少1 〇〇〇 L之培養物。 33·如申請專利範圍第1項之方法，其中該提供步驟包括提供至少25〇0 L之培養物。 3 4 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該提供步驟包括提供至少5000 L之培養物。 1374935 修正本 35. 如申請專利範圍第1項之方法’其中該提供步驟包括提供至少8000 L之培養物》 36. 如申請專利範圍第1項之方法’其中該提供步驟包括提供至少10,000 L之培養物。 3 7 ·如申請專利範圍第1項之方法’其中該提供步驟包括提供至少1 2,0 〇〇 L之培養物。 38.如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一組條件包括在攝氏30至42度之第一溫度範圍。 φ 39.如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一組條件包括在攝氏32至40度之第一溫度範圍。 .40·如申B靑專利範圍第1項之方法’其中該第一組條件包括在攝氏34至38度之第一溫度範圍。 4 1 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一組條件包括在攝氏36至37度之第一溫度範圍。 4 2.如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一組條件包括在攝氏37度之第一溫度範圍。 # 4 3 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該第二組條件包括在攝氏25至41度之第二溫度範圍。 4 4.如申請專利範圍第1項之方法，其中該第二組條件包括在攝氏27至38度之第二溫度範圍。 4 5.如申請專利範圍第1項之方法，其中該第二組條件包括在攝氏29至35度之第二溫度範圍。 46·如申請專利範圍第1項之方法，其中該第二組條件包括在攝氏29至33度之第二溫度範圍。 -10- 1374935 修正本 47·如申請專利範圍第1項之方法’其中該第二組條件包括在攝氏30至32度之第二溫度範圍。 48 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該第二組條件包括在攝氏31度之第二溫度範圍。 49 如申請專利範圍第1項之方法，其中在第—次該改變至少一項培養條件之後進一步包含一項第二改變步驟’該步驟包含改變至少一項培養條件，從而對培養物施用第三組條件。 • 50.如申g靑專利範圍第49項之方法，其中該第二改變步驟包含改變至少一項選自下列組群之培養條件：（i)溫度’（ii)pH，（iii)滲透壓値，（iv)化學誘導劑含量，及其等特性之組合。 5 1 ·如申請專利範圍第4 9項之方法，其中該第三組條件包括在攝氏25至4〇度之第三溫度範圍。 5 2 .如申請專利範圍第4 9項之方法，其中該第三組條件包括在攝氏27至37度之第三溫度範圍。 # 5 3 .如申請專利範圍第4 9項之方法，其中該第三組條件包括在攝氏29至34度之第三溫度範圍。 5 4 ·如申請專利範圍第4 9項之方法，其中該第三組條件包括在攝氏30至32度之第三溫度範圍。 5 5.如申請專利範圍第丨項之方法，其中該第一時期係介於0-8天之間。 56.如申請專利範圍第丨項之方法，其中該第一時期係介於1 - 7天之間。 -11 - 1374935 修正本 57·如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一時期係介於2-6天之間。 5 8 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一時期係介於3-5天之間。 59.如申請專利範圍第1項之方法’其中該第一時期爲4 天。 60·如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一時期爲5 天。 ^ 61.如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一時期爲6 天。 62.如申請專利範圍第1項之方法’其中該第一時期和該第二時期總計爲至少5天。 6 3.如申請專利範圍第1項之方法’其中在將該培養物維持在第二時期的步驟中’乳酸鹽含量係在培養物中之乳酸鹽含量達到最大含量之後降低。 64. 如申請專利範圍第1項之方法’其中在將該培養物維 φ 持在第二時期的步驟中，銨含量係在培養物中之銨含量達到最大含量之後降低。 65. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該所生產之抗 -ABeta(anti-amyloid beta antibody)總量較在其他條件都相同的情況下於缺乏該培養基特性但其他方面均相同之培養基中所生產的抗- ABeta(anti-amyl〇id beta antibody)量高出至少1.5倍。 -12- 1374935 修正本 66. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該所生產之抗 -ABeta(anti-amyloid beta antibody)總量較在其他條件都相同的情況下於缺乏該培養基特性但其他方面均相同之培養基中所生產的抗- ABeta(anti-amyloid beta antibody)量高出至少2倍。 67. 如申請專利範圍第1項之方法，其中進一步在該培養物中提供補充組分，其中該補充組分係選自於由激素及/或其他生長因子、特定離子（如鈉、氯化物、鈣、鎂、和磷酸鹽）、緩衝劑、維生素、核苷或核苷酸、稀有元素（無機化合物所表現出來的最終濃度通常非常低）、胺基酸、脂質、或葡萄糖或其他能量來源所組成之組群。 6 8 .如申請專利範圍第6 7項之方法，其中該補充組分係以多個時間間隔來提供。 6 9. —種以大規模生產性細胞培養物來生產抗 -ABeta(anti-amyloid beta antibody)之方法，其包括下列步驟·‘ 提供一細胞培養物，其包括：帶有抗-ABeta(anti-amyloid beta antibody)密碼之基因的哺乳類細胞，其基因會於細胞培養條件下表現；以及一種含有麩醯胺酸且具有至少兩種選自下列組群之培養基特性的限定培養基：i)起始胺基酸濃度高於70 mM，ii)麩醯胺酸對天冬醯胺酸之莫耳比率 -13- 1374935 修正本低於2 ’ iii)麩醯胺酸對總胺基酸之莫耳比率低於〇-2，iv)無機離子對總胺基酸之莫耳比率介於0.4 至1之間’和v)麩醯胺酸和天冬醯胺酸之合倂濃度高於16 mM ; 若將該培養物維持於第一組培養條件下，將該在初始生長相中的培養物於第一組培養條件下維持一段足以使該細胞在最大可能存活細胞密度之2 0 % - 8 0 %範圍內繁殖的第一時期；改變至少一項培養條件，從而施用第二組培養條件，且於培養基中發生代謝轉換；將該培養物於第二組條件下維持一段第二時期，從而在弟—時期中使抗-ABeta(anti-amyloid beta antibody)在細胞培養物中累積。 70. —種以大規模生產性細胞培養物來生產抗 -ABeta(anti-amyloid beta antibody)之方法，其包括下列步驟：提供一細胞培養物，其包括：帶有抗- ABeta(anti-amyloid beta antibody)密碼之基因的哺乳類細胞，其基因會於細胞培養條件下表現；以及一種含有麩醯胺酸且具有至少三種選自下列組群之培養基特性的限定培養基：i)起始胺基酸濃度高於70 mM’ii)麩醯胺酸對天冬醯胺酸之莫耳比率低於2，i i i)麩醯胺酸對總胺基酸之莫耳比率低於 -14 - 1374935 修正本〇·2 ’ iv)無機離子對總胺基酸之莫耳比率介於〇 4 至1之間，和ν)麩醯胺酸和天冬醯胺酸之合倂濃度高於16 mM ; 若將該培養物維持於第一組培養條件下，將該在初始生長相中的培養物於第一組培養條件下維持一段足以使該細胞在最大可能存活細胞密度之20 %- 80 %範圍內繁殖的第一時期；改變至少一項培養條件，從而施用第二組培養條件，且於培養基中發生代謝轉換；將該培養物於第二組條件下維持一段第二時期，從而在第二時期中使抗-ABeta(anti-amyloid beta antibody)在細胞培養物中累積。 7 1. —種以大規模生產性細胞培養物來生產抗 -ABeta(anti-amyloid beta antibody)之方法，其包括下列步驟：提供一細胞培養物，其包括：帶有抗-ABeta(anti-amyloid beta antibody)密碼之基因的哺乳類細胞，其基因會於細胞培養條件下表現；以及一種含有麩醯胺酸且具有至少四種選自下列組群之培養基特性的限定培養基：i)起始胺基酸濃度高於70 mM’ii)麩醯胺酸對天冬醯胺酸之莫耳比率低於2，iii)麩醯胺酸對總胺基酸之莫耳比率低於 0.2，iv)無機離子對總胺基酸之莫耳比率介於0.4 -15- 1374935 修正本至1之間，和v)麩醯胺酸和天冬醯胺酸之合倂濃度高於1 6 mM ; 若將該培養物維持於第一組培養條件下，將該在初始生長相中的培養物於第一組培養條件下維持一段足以使該細胞在最大可能存活細胞密度之2 0 % - 8 0 %範圍內繁殖的第一時期；改變至少一項培養條件，從而施用第二組培養條件，且於培養基中發生代謝轉換；將該培養物於第二組條件下維持一段第二時期，從而在第一時期中使抗-A B e t a (an t i - am y 1 o i d beta antibody)在細胞培養物中累積。 72·—種以大規模生產性細胞培養物來生產抗 -ABeta(anti-amyloid beta antibody)之方法，其包括下列步驟：提供一細胞培養物，其包括：帶有抗-ABeta(anti-amyl〇id beta antibody)密碼之基因的哺乳類細胞，其基因會於細胞培養條件下表現；以及一種含有麩醯胺酸之限定培養基，其具有下列特性：i)起始胺基酸濃度高於70 mM，ii)麩醯胺酸對天冬醯胺酸之莫耳比率低於2，i i i)麩醯胺酸對總胺基酸之莫耳比率低於0.2，iv)無機離子對總胺基酸之莫耳比率介於〇 · 4至1之間，和v)麩醯胺酸和天冬醯胺酸之合倂濃度高於1 6 mM ; -16- 1374935 修正本若將該培養物維持於第一組培養條件下，將該在初始生長相中的培養物於第一組培養條件下維持一段足以使該細胞在最大可能存活細胞密度之2 0 % - 8 0 %範圍內繁殖的第一時期；改變至少一項培養條件，從而施用第二組培養條件’且於培養基中發生代謝轉換；將該培養物於第二組條件下維持一段第二時期，從而在第—時期中使抗-A B e t a ( an t i - am y 1 〇 i d beta φ antibody)在細胞培/養物中累積。 73. —種以大規模生產性細胞培養物來生產抗 -ABeta(anti-amyloid beta antibody)之方法，其包括下列步驟：提供一細胞培養物，其包括：帶有抗- ABeta(anti-amyloid beta antibody)密碼之基因的哺乳類細胞，其基因會於細胞培養條件下表現；以及 • 一含有麩醯胺酸且每單位體積麩醯胺酸和天冬醯胺酸之合倂累計量高於1 6 mM的培養基；若將該培養物維持於第一組培養條件下，將該在初始生長相中的培養物於第一組培養條件下維持一段足以使該細胞在最大可能存活細胞密度之20%-80%範圍內繁殖的第一時期；改變至少一項培養條件，從而施用第二組培養條件，且於培養基中發生代謝轉換； -17- 1374935 • 修正本將該培養物於第二組條件下維持一段第二時期，從而在第二時期中使抗-ABeta(anti-amyloid beta antibody)在細胞培養物中累積。 74. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養基包含一種含有麩醯胺酸且具有一種選自下列組群之培養基特性的培養基： (i)起始胺基酸濃度高於70mM，（ii)起始麩醯胺酸對起始天冬醯胺酸之莫耳比率低於2,（iii)起始麩醯胺酸對 φ 起始總胺基酸之莫耳比率低於0.2，（iv)起始無機離子對起始總胺基酸之莫耳比率介於0.4至1之間，（v)起始麩醯胺酸和起始天冬醯胺酸之合併濃度高於16 mM，及其等特性之組合。 75. 如申請專利範圍第1至6與69至74項中任一項之方法，其中：乳酸鹽含量低於那些在其他條件都相同的情況下於缺乏該培養基特性但其他方面均相同之培養基中所觀 φ 察到的含量；銨含量低於那些在其他條件都相同的情況下於缺乏該培養基特性但其他方面均相同之培養基中所觀察到的含量；且所生產之抗- ABeta(anti-amyloid beta antibody)總量至少和在其他條件都相同的情況下於缺乏該培養基特性但其他方面均相同之培養基中所觀察到者一樣闻0 -18- 1374935 修正本 76.如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養物不會在生產該抗- ABeta(anti-amyl〇id beta antibody)的過程中另外補充組分，其中該補充組分係選自於由激素及/ 或其他生長因子、特定離子（如鈉、氯化物、鈣、鎂、和磷酸鹽）、緩衝劑、維生素、核苷或核苷酸、稀有元素（無機化合物所表現出來的最終濃度通常非常低）、胺基酸、脂質、或葡萄糖或其他能量來源所組成之組群。 φ 77.如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養物不會在生產該抗-ABeta(anti-amyloid beta antibody)的過程中另外補充麩醯胺酸。 78. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養物中之麩醯胺酸濃度於該改變爲第二組培養條件的步驟之前即實質上耗盡》 79. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養物中之麩醯胺酸濃度於該改變爲第二組培養條件的步驟的同 φ 時即實質上耗盡。 8 0.如申請專利範圍第1項之方法，其中以甘胺醯麩醯胺酸來取代在該培養物中的麩醯胺酸。 81.如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養基含有： (i)每單位體積累計胺基酸量高於70 mM，（ii)累計鍵醯胺酸對累計天冬醯胺酸之莫耳比率低於2，（ i i i)累計魅醯胺酸對累計總胺基酸之莫耳比率低於Ο.2，（iv)累計無機離子對累計總胺基酸之莫耳比率介於〇 ·4至1之 -19- 1374935 修正本間，和（V)每單位體積麩醯胺酸和天冬醯胺酸的合倂累計量高於16 mM。 82.如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養基含有： (i)每單位體積累計胺基酸量高於70 mM，（ii)累計麩醢胺酸對累計總胺基酸之莫耳比率低於0.2，（iii)累計無機離子對累計總胺基酸之莫耳比率介於0.4至間，和（iv)每單位體積麩醯胺酸和天冬醯胺酸的合倂Μ 計量高於16 mM。 φ 83.如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中胃單位體積組胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸' # 丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、和脯胺酸的累計總量高於 2 5 m Μ 0 84.如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中® 單位體積組胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸 '苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、和脯胺酸的累計總量高於 3 5 mM。 φ 85.如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積組胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、和脯胺酸的初始總量高於 2 5 m Μ 〇 86.如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積組胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、和脯胺酸的初始總量高於 3 5 m Μ。 -20- 1374935 • 修正本 87.如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養基具有選自下列組群之培養基特性： ⑴ 每單位體積組胺酸的累計總量高於1 . 7 mM ; (ϋ) 每單位體積異白胺酸的累計總量高於3 . 5 mM ; (iii) 每單位體積白胺酸的累計總量高於5.5 mM; (iv) 每單位體積甲硫胺酸的累計總量高於2.0 mM ; (v) 每單位體積苯丙胺酸的累計總量高於2.5 mM ; (Vi) 每單位體積脯胺酸的累計總量高於2.5 mM ; • (vii) 每單位體積色胺酸的累計總量高於1 . 〇 mM ;以及 (viii)每單位體積酪胺酸的累計總量高於2.0 mM。 88.如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養基具有選自下列組群之培養基特性： ⑴ 每單位體積組胺酸的初始量高於1 . 7 mM ; (ϋ) 每單位體積異白胺酸的初始量高於3.5 mM; (iii) 每單位體積白胺酸的初始量高於5 . 5 mM ; • (iv) (v) 每單位體積甲硫胺酸的初始量高於2.0 mM ; 每單位體積苯丙胺酸的初始量高於2.5 mM ; (vi) 每單位體積脯胺酸的初始量高於2.5 mM ; (νϋ) 每單位體積色胺酸的初始量高於1 . 〇 mM ;以及 (viii)每單位體積酪胺酸的初始量高於2.0 mM。 8 9.如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積絲胺酸的累計總量高於7 mM。 -21 - 1374935 修正本 90. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積絲胺酸的累計總量高於1 〇 mM。 91. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積天冬醯胺酸的累計總量高於8 mM。 92. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積天冬醯胺酸的累計總量高於1 2 mM。 93. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積天冬醯胺酸的初始總量高於8 mM。 φ 94.如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積天冬醯胺酸的初始總量高於1 2 mM。 95. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積磷的累計總量高於2.5 mM。 96. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積磷的累計總量高於5 mM。 97. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積麩胺酸的累計總量低於1 mM。 φ 98.如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積泛酸鈣的累計總量高於8 mg/L。 99. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積泛酸鈣的累計總量高於20 mg/L。 100. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積菸鹼醯胺的累計總量高於7 mg/L。 1 0 1 .如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積菸鹼醯胺的累計總量高於25 mg/L。 -22- 1374935 修正本 102. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積吡哆醇和吡哆醛的累計總量高於5 mg/L。 103. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積吡哆醇和吡哆醛的累計總量高於3 5 mg/L。 104. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積核黃素的累計總量高於1.0 mg/L。 105. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積核黃素的累計總量高於2.0 mg/L。 1 06 .如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積噻胺氫氯酸鹽的累計總量高於7 mg/L。 107.如申請專利範圍第1項之方法，其中在該培養基中每單位體積噻胺氫氯酸鹽的累計總量高於3 5 mg/L。

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