ES2589079T3 - Tecnología de amplificación de ácido nucleíco acelerado isotérmicamente - Google Patents

Abstract

Un método para sintetizar a un ácido polinucleico donde dicho método comprende los pasos de a) Suministrar a una plantilla objetivo que comprende de por lo menos una primera y una 2ª regiones de enlace de cebadores recíprocos; b) Suministrar a un primer cebador que tiene a un primer y 2º segmentos, donde el primer segmento es sustancialmente complementario a la primera región de enlace de cebadores recíprocos en la plantilla y el 2º segmento tiene una secuencia que es sustancialmente complementaria a otra región en el primer cebador o a una región en el amplicón generado a partir del primer segmento del primer cebador de tal forma que el 2º segmento es capaz de formar un bucle, donde, cuando el primer cebador comprende a un 2º segmento que es sustancialmente complementario a una región en el amplicón generado a partir del primer segmento del primer cebador, la primera región de enlace de cebadores recíprocos también abarca a la región en la plantilla que es sustancialmente idéntica al 2º segmento del primer cebador; c) Suministrar un 2º cebador que comprende a un primer y opcionalmente a un 2º segmentos, donde el primer segmento es sustancialmente complementario a la 2ª región de enlace de cebadores recíprocos en la plantilla y el 2º segmento opcional comprende a una secuencia que es sustancialmente complementaria a otra región en el 2º cebador o a una región en el amplicón generado a partir del primer segmento del 2º cebador de tal forma que la 2ª región está disponible para formar a un bucle, donde, cuando el 2º cebador comprende a un 2º segmento que es sustancialmente complementario a una región en el amplicón generado a partir del primer segmento del 2º cebador, la 2ª región de enlace de cebadores recíprocos también abarca a la región en la plantilla que es sustancialmente idéntica al 2º segmento del 2º cebador; d) Suministrar por lo menos un cebador madre que sea capaz de enlazarse a la región entre la primera y la 2ª regiones de enlace de cebadores recíprocos, donde dichas cebador es (i) Un cebador simple, que es complementario a un lugar de enlace de cebadores en un ácido polinucleico y que contiene menos de 5 nucleótidos 3' o 5' de la región de cebadores que es sustancialmente complementario al lugar de enlaces de cebadores; (ii) Un cebador que forma bucles, que comprende a un primer y a un 2º segmentos, donde el primer segmento es sustancialmente complementario a una región de enlace de cebadores en la plantilla y el 2º segmento comprende a una secuencia que es sustancialmente complementaria a una región en el amplicón generado a partir del primer segmento del primer cebador de tal forma que el 2º segmento puede formar a un bucle; (iii) Un cebador tipo horquilla, que es un cebador que comprende a un primer y a un 2º segmentos, donde el primer segmento es sustancialmente complementario a una región de enlace de cebadores en una plantilla y el 2º segmento comprende a una secuencia que es sustancialmente complementaria a otra región en el cebador; (iv) Un cebador suministrador de bucles, que es un cebador tipo horquilla en el cual las repeticiones invertidas son separadas por una región enlazadora; o (v) Un cebador quimérico; e) Suministrar los reactivos y condiciones necesarias para realizar la síntesis del ácido polinucleico; f) Realizar la síntesis del ácido polinucleico.

Description

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Tecnologfa de amplificacion de acido nuclefco acelerado isotermicamente

Descripcion

AREA DEL INVENTO

[0001] Este invento se refiere al campo de la amplificacion de acidos nucleicos. En particular, se refiere a un metodo que mejora la amplificacion rapida y especifica y la deteccion de una muestra de prueba.

ANTECEDENTES

[0002] La tecnologia de amplificacion de acidos nucleicos (NAAT - nucleic acid amplification technology) es una herramienta invaluable y poderosa en muchas areas de investigacion y de diagnostico. Las tecnicas NAAT permiten la deteccion y cuantificacion de un acido nucleico en una muestra con una alta sensibilidad y especificidad, asi como un analisis cuantitativo de acidos nucleicos en una muestra.

[0003] La amplificacion de acidos nucleicos podria utilizarse para determinar la presencia de un acido nucleico tipo plantilla especifico en una muestra, tal como es indicado por la presencia de un producto de amplificacion despues de la implementacion de una NAAT especifica. Por otro lado, la ausencia de cualquier producto de amplificacion indica la ausencia del acido nucleico tipo plantilla en la muestra. Aquellas tecnicas son de gran importancia en las aplicaciones de diagnostico, por ejemplo, para determinar si un patogeno esta presente en una muestra.

[0004] Inventos previos en la industria han descrito una variedad de tecnicas de termociclado y tecnicas isotermicas para la amplificacion de acidos nucleicos. Las tecnicas de termociclado, tales como la reaccion en cadena de polimerasas (PCR - polymerase chain reaction), utiliza reciclado de temperaturas para controlar los ciclos repetidos de la sintesis de ADN que conllevan a montos grandes de ADN nuevo que se esta siendo sintetizado proporcionalmente al monto original del ADN plantilla. Varias tecnicas isotermicas tambien han sido desarrolladas las cuales no se basan en termociclados para controlar la reaccion de amplificacion. Las tecnicas isotermicas que utilizan a polimerasas de ADN con actividades de desplazamiento de hebras han sido desarrolladas para reacciones de amplificacion que no involucran a un paso de sintesis de ARN. Asimismo, para reacciones de amplificacion que no involucran a un paso de sintesis de ARN, se han desarrollado tecnicas isotermicas que podrian usar transcriptasas en reversa, RNasas H y/o polimerasas de ARN que dependen de ADN (refierase, por ejemplo, a Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies - A Review. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids (Tecnologias de Amplificacion Isotermicas de Acidos Nucleicos - Una Revision: Nucleosidos, Nucleotidos y Acidos Nucleicos), volumen 27, ejemplar 3, marzo de 2008, paginas 224 - 243).

[0005] El acido polinucleico producido por la tecnologia de amplificacion utilizada es denominado generalmente como un amplicon. La naturaleza del amplicon producido varia significativamente dependiendo de la NAAT que se esta practicando. Por ejemplo, NAATs tales como la PCR podrian producir a un amplicon que es sustancialmente de tamano identico y de secuencia identica. Otras NAATs producen amplicones de tamanos muy variados donde el amplicon se compone de numeros diferentes de secuencias repetidas de tal forma que el amplicon es una coleccion de concatemeros de longitud diferente. La secuencia repetitiva proveniente de aquellos concatemeros reflejara la secuencia del acido polinucleico que es sujeto al ensayo que se esta realizando.

[0006] Puesto que las NAATs son de una importancia vital en muchas areas, por ejemplo, en aplicaciones de diagnostico, existe una necesidad continua en la industria de suministrar NAATs que tengan una velocidad, una sensibilidad y una especificidad mejoradas. Este invento suministra metodos sencillos y ahorradores para lograr esta meta. Ademas, este invento tiene la ventaja de que los incrementos logrados por el metodo de este invento pueden contrarrestar las reducciones de la tasa de amplificacion causadas por problemas que dependen de secuencias que causan que los disenos de cebadores para una NAAT especifica no sean optimos. Aquellos incrementos de tasas pueden reducir aun mas el costo de un ensayo basandose en una NAAT especifica puesto que sistemas costosos alternos para incrementar la tasa de amplificacion pueden evitarse.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS SECCIONES PREFERI DAS

[0007] Este invento suministra un metodo mejorado de amplificacion de acidos polinucleicos. Por lo tanto, en una seccion, este invento suministra un metodo para sintetizar a un acido polinucleico donde dicho metodo comprende los pasos de:

a) suministrar una plantilla objetivo que comprende a por lo menos una primera y 2a region de enlace de cebadores reciprocos;

b) suministrar un primer cebador que comprende a un primer y 2° segmentos, donde el primer segmento es sustancialmente complementario a la primera region de enlace de cebadores reciprocos en la plantilla y el 2° segmento comprende a una secuencia que es sustancialmente complementaria a otra region en el primer cebador o a una region en el amplicon generado a partir del primer segmento del primer cebador de tal forma que el 2° segmento pueda formar a un bucle,

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donde, cuando el primer cebador comprende a un 2° segmento que es sustancialmente complementario a una region en el amplicon generado a partir del primer segmento del primer cebador, la primera region de enlace de cebadores reclprocos tambien abarca a la region en la plantilla que es sustancialmente identica a 2° segmento del primer cebador;

c) suministrar a un 2° cebador que comprende a un primer, y opcionalmente, un 2° segmento, donde el primer segmento es sustancialmente complementario a la 2a region de enlace cebadores reclprocos en la plantilla y el 2° segmento opcional comprende a una secuencia que es sustancialmente complementaria a otra region en el 2° cebador o a una region en el amplicon generado a partir del primer segmento en el 2° cebador de tal forma que la 2a region es capaz de formar un bucle, donde, cuando el 2° cebador comprende a un 2° segmento que es sustancialmente complementario a la region en el amplicon generado a partir del primer segmento del 2° cebador, la 2a region de enlace de cebadores reclprocos tambien abarca a la region en la plantilla que es sustancialmente identica al 2° segmento del 2° cebador;

d) suministrar por lo menos un cebador que es capaz de enlazarse a la region entre la primera y la 2a regiones de enlaces de cebadores reclprocos, donde por lo menos un cebador madre es

(i) un cebador sencillo, que es complementario a un lugar de enlace de cebadores en un acido polinucleico y que contiene menos de 5 nucleotidos 3' o 5' de la region de cebado que es sustancialmente complementaria al lugar de enlace de cebadores;

(ii) un cebador que forma bucles, que es un cebador que comprende a un primero y 2° segmentos, donde el primer segmento es sustancialmente complementario a una region de enlace de cebadores en la plantilla y el 2° segmento comprende a una secuencia que es sustancialmente complementaria a una region en el amplicon generado a partir del primer segmento del primer cebador de tal forma que el 2° segmento es capaz de formar a un bucle;

(iii) un cebador tipo horquilla, que comprende a un primero y 2° segmentos, donde el primer segmento es sustancialmente complementario a la region de enlaces de cebadores en una plantilla y el 2° segmento comprende a una secuencia que es sustancialmente complementaria a otra region en el cebador;

(iv) un cebador que suministra bucles; que es un cebador tipo horquilla en el cual las repeticiones invertidas son separadas por una region enlazadora; o

(v) un cebador quimerico;

e) suministrar los reactivos y condiciones necesarias para realizar la slntesis del acido polinucleico;

f) realizar la slntesis del acido polinucleico.

[0008] El principio subyacente de este invento es que se ha descubierto sorpresivamente que la provision de uno o mas “cebadores madre”, es decir, cebadores que se enlazan a la region entre las regiones de enlace de cebadores reclprocos en reversa, mejora significativamente la velocidad y la sensibilidad de ciertas NAATs.

[0009] Los terminos “lugar de enlaces de cebadores reclprocos hacia adelante” y “lugar de enlaces de cebadores reclprocos en reversa” se refiere a las regiones en el ADN plantilla y/o en el amplicon al cual se enlazan reclprocamente los cebadores hacia adelante y en reversa. El termino “cebador reclproco” o “cebadores reclprocos” tal como se utiliza en este documento se refiere a 2 o mas cebadores que actuan para delimitar la region del oligonucleotido plantilla original que es amplificado exponencialmente durante la amplificacion (figura 1a y 1b). En algunas secciones, cebadores adicionales podrlan enlazarse a la region 5' del cebador reclproco hacia delante y/o del cebador reclproco en reversa. En los casos en los cuales aquellos cebadores adicionales son utilizados, el lugar de enlaces de cebadores reclprocos hacia adelante y/o el lugar de enlaces de cebadores reclprocos en reversa podrla abarcar a las regiones de enlace de estos cebadores adicionales, as! como las regiones de enlace de los cebadores reclprocos en si. Por ejemplo, en algunas secciones, el metodo podrla utilizar a uno o mas cebadores adicionales que se enlazan a la region que esta a 5' de la region enlazadora de cebadores reclprocos hacia adelante y/o en reversa. Un metodo como este fue presentado, por ejemplo, en WO0028082 que divulga el uso de “cebadores de desplazamiento” o “cebadores externos”.

[0010] WO0028082 describe el uso de cebadores que forman bucles (LFPs - loop-forming primers), donde se comprende que un LFP comprende a un primer y 2° segmentos, donde el primer segmento es sustancialmente complementario a una region de enlaces de cebadores en la plantilla y el 2° segmento comprende a una secuencia que es sustancialmente complementaria a una region en el amplicon generado a partir del primer segmento del primer cebador para que el 2° segmento pueda formar un bucle, y se menciona que la NAAT usa dos “cebadores externos” adicionalmente a los LFPs. Estos cebadores se caracterizan en que el “primer cebador externo” se enlaza a 3' del lugar “F2” en la plantilla (es decir, el primer cebador externo se enlaza en el lugar “F3”, figura 14b) y el “2° cebador externo” se enlaza a 3' de la region de enlaces del 2° LFP, el lugar “R2c” (es decir, el 2° cebador externo se enlaza en el lugar “R3c”, figura 14b). Por lo tanto, estos cebadores no se enlazan en la region madre del amplicon, que esta a 5' de los lugares enlazadores de cebadores de los LFPs.

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[0011] La region entre las regiones de enlace de cebadores reclprocos hacia adelante y en reversa representa a una region que garantiza formar parte del amplicon, pero no suministra convencionalmente en si a ningun lugar de enlace de cebadores. Esta region es denominada en este documento como la “region madre” del amplicon. Cebadores que se enlazan a la region madre son denominados en este documento como “cebadores madre” (figura 1c; figuras 2a- 2e). Los cebadores madre pueden ser definidos como cebadores que se enlazan a la region madre. Ellos podrlan ser definidos ademas como cebadores que se enlazan a la region 3' de la region de enlace de cebadores reclprocos hacia adelante en la hebra hacia adelante y a 3' del lugar de enlace de cebadores reclprocos en reversa en la hebra en reversa. Se entiende que los lugares de enlaces de cebadores reclprocos y los lugares de enlace de los cebadores madre no se superponen significativamente. Se prefiere que los lugares de enlaces de cebadores reclprocos y los lugares de enlaces de los cebadores madre no se superpongan en lo absoluto.

[0012] El termino “significativamente” en el contexto de regiones superpuestas de enlace de cebadores significa que los lugares de enlace de cebadores se superponen menos de 10 nucleotidos, menos de 9 nucleotidos, menos de 8 nucleotidos, menos de 7 nucleotidos, menos de 6 nucleotidos, menos de 5 nucleotidos, menos de 4 nucleotidos, menos de 3 nucleotidos, menos de 2 nucleotidos o menos de un nucleotido. Se prefiere que no se superpongan en lo absoluto. Los cebadores madre podrlan ser definidos ademas como cebadores que se enlazan a la region 3' de la region enlazadora de cebadores reclprocos hacia adelante en la hebra hacia adelante y la region 3' del lugar de enlace de cebadores reclprocos en reversa en la hebra en reversa pero donde las regiones enlazadoras de cebadores no se superponen sustancialmente con ninguna estructura secundaria intra - molecular generada como una consecuencia directa de los cebadores utilizados por una NAAT especlfica, especialmente un LFP (figura 1d).

[0013] Se ha descubierto sorpresivamente que el uso de cebadores madre incrementa significativamente la tasa de amplificacion. Esto tiene la ventaja distintiva que las pruebas de diagnostico, por ejemplo, pueden entregar resultados de pruebas en un perlodo mas corto de tiempo, algo de valor comun entre los usuarios de pruebas de diagnostico. Un beneficio adicional de la amplificacion mas rapida es que puede reducir la posibilidad de falsos resultados positivos y por lo tanto incrementa la especificidad de una prueba. La experiencia de los inventores indica que NAATs que utilizan polimerasas de desplazamiento de hebras se vuelven cada vez mas propensas a amplificaciones que no son especlficas puesto que la duracion de tiempo requerida para la amplificacion se incrementa. Como tal, una amplificacion mas rapida tambien puede conllevar a resultados mas precisos.

[0014] Los cebadores madre no solamente suministran una amplificacion mas rapida pero tambien suministran por lo menos 2 beneficios clave adicionales. Primero, el uso de cebadores madre para incrementar la tasa de amplificacion de las NAATs tales como la Amplificacion Exotermica Regulada por Bucles (LAMP - Loop-mediated Isothermal Amplification), la Amplificacion de Re-cebado por medio de Plantillas (TRA - Template Re-priming Amplification), la Amplificacion Auto - Extensible (SEA - Self Extending Amplification) y el Proceso de Amplificacion Inteligente (SMAP - SMart Amplification Process), que seran cubiertos en mayor detalle mas adelante, evitan alternativas costosas para lograr una amplificacion mas rapida, tal como el uso de mas polimerasas o mas dNTPs. Por ejemplo, a precios de 2009, doblar el monto de la polimerasa de ADN de Bst en una reaccion LAMP incrementa el costo de un ensayo por un 60%, doblar dNTPs incrementa el costo de un ensayo por un 20% pero el agregar 2 cebadores madre incrementa el costo de un ensayo por unicamente un 4%, puesto que los cebadores generalmente no son muy caros.

[0015] Segundo, los cebadores madre suministran una mayor flexibilidad en la seleccion de cebadores para una plantilla objetivo especlfica. Por ejemplo, para detectar a una familia particular de patogenos que tienen variaciones significativas en sus secuencias de acidos nucleicos, los cebadores seran disenados para regiones del genoma de la familia de patogenos que muestra la menor variacion secuencial. Sin embargo, esto podrla requerir que uno o mas cebadores esten ubicados en un lugar que no sea optimo. Esto puede ser un problema particular con NAATs tales como LAMP, lo cual sera mencionado mas adelante, en los casos en los que las posiciones de hasta 6 diferentes cebadores necesitan ser organizados de cierta forma. Puesto que los cebadores madre pueden ser colocados en formas muy diferentes a otros cebadores usados en las NAATs, una persona puede utilizar a los lugares de enlaces de cebadores madre en una plantilla objetivo especlfica que de otra forma serla diflcil de utilizar.

[0016] De hecho, generalmente, la utilization de cebadores madre podrla permitir la omision de otros cebadores utilizados en el metodo LAMP (o SMAP). Por ejemplo, para una plantilla objetivo especlfica, podrla ser diflcil encontrar lugares optimos de enlaces para uno de los denominados 'cebadores de desplazamiento' (es decir, los cebadores que ocupan las posiciones R3 y F3 en la figura 14b, c y e) lo cual hace que el rendimiento de las pruebas sea afectado adversamente. Sin embargo, si se dispusiese de lugares enlazadores de cebadores madre adecuados en la plantilla objetivo, la adicion de cebadores madre puede actuar para rescatar la perdida de rendimiento producto de la perdida del cebador de desplazamiento (figura 19) este principio puede ser aplicado similarmente a otros cebadores especlficos utilizados en LAMP o SMAP.

[0017] El metodo del invento puede ser practicado en cualquier NAAT siempre y cuando dicho NAAT resulte en la formation de concatemeros. El termino “concatemeros” tal con se utiliza en este documento se refiere a un acido polinucleico que tiene sustancialmente secuencias similares de nucleotidos enlazadas alternativamente en una cadena de una sola hebra. Estas secuencias organizadas podrlan ser repeticiones simples entre si, repeticiones invertidas entre si o sus combinaciones.

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[0018] Las MAATs que son adecuadas para la generacion de concatemeros son conocidas en la industria y generalmente incluyen a tecnicas “isotermicas” de amplificacion. Esto significa que la amplification del acido polinucleico no requiere un cambio en la temperatura de incubation, lo cual es contrario a tecnicas conocidas de termociclado, tales como la reaction en cadena de polimerasas.

[0019] Algunas tecnicas de amplificacion isotermica dependen de transcripciones como parte del proceso de

amplificacion, por ejemplo, la Amplificacion que se Basa en Secuencias de Acidos Nucleicos (NASBA - Nucleic Acid Sequence Based Amplification; US5409818) y la Amplificacion Mediada por Transcripciones (TMA - Transcription Mediated Amplification) mientras que otras dependen de la action de una helicasa o recombinasa por ejemplo la Amplificacion de que Depende de Helicasas (HDA - Helicase

Dependent Amplification; WO2004027025) y la Amplificacion de Polimerasas de Recombinasas (RPA - Recombinase polymerase amplification; WO03072805) respectivamente, otros metodos todavla dependen de la actividad de desplazamiento de hebras de ciertas polimerasas de ADN, por ejemplo, la Amplificacion de Desplazamiento de Hebras (SDA - Strand Displacement Amplification; US5455166), la Amplificacion Isotermica Mediada por Bucles (LAMP - Loop-mediated Isothermal Amplification; WO0028082, WO0134790, WO0224902), la Reaccion de Desplazamiento de Quimeras (RDC; WO9794126), la Amplificacion de Clrculos Rodantes (RCA - Rolling Circle Amplification; Lizardi, P. M. et al. Nature Genetics (Genetica Natural), (1998) 19.225-231), la Amplificacion Quimerica Exotermica de Acidos Nucleicos (ICAN - Isothermal Chimeric Amplification of Nucleic Acids; WO0216639, el Proceso de Amplificacion Inteligente (SmAP - SMart Amplification Process; WO2005063977), la Amplificacion de Multimerizacion Isotermica Lineal (LIMA - Linear Isothermal Multimerization Amplification; Isothermal amplification and multimerization of DNA by Bst DNA polymerase (Amplificacion y Multimerizacion Isotermica de ADN Mediante Polimerasas de ADN de Bst) , Hafner G. J., Yang I. C., Wolter L. C., Stafford M. R., Giffard P. M, BioTechniques (Tecnicas Biologicas), 2001, vol. 30, no4, pp. 852-867) tambien los metodos tal como son descritos en US6743605 (denominado en este documento como 'Amplificacion de Re-cebado de Plantillas' o TRA - Template Re-priming Amplification) y WO9601327 (denominada en este documento como 'Amplificacion Auto - Extensible' o SEA - Self Extending Amplification).

[0020] Una caracterlstica de estas NAATs es que suministran indicaciones para la copia de un acido polinucleico mediante la accion de un cebador o un conjunto de cebadores y para la replica de dicha copia mediante un cebador reclproco o un conjunto de cebadores reclprocos. Esto permite la generacion de copias del acido polinucleico original a una tasa exponencial.

[0021] En referencia a las NAATs, en general, es util el diferenciar entre la pieza flsica de acido nucleico, que esta siendo detectado por el metodo, de su primera copia hecha a partir de este acido nucleico original, de la primera copia de la copia hecha a partir de este acido nucleico original, de copias adicionales de esta copia de una copia. Para propositos de claridad, las siguientes definiciones seran adheridas a este documento: el acido nucleico cuyo origen es de la muestra que esta siendo analizada en si sera denominado la 'Plantilla Objetivo' (figura 3a); la primera copia de la plantilla objetivo que depende del cebador mediante la NAAT que esta siendo practicada sera denominada como un 'Amplicon Principal' (figura 3a); la primera copia del Amplicon Principal mediante la NAAT que se esta practicando sera denominada como 'Amplicon de Primera Generacion' (figura 3b); copias adicionales del Amplicon de Primera Generacion (y copias de estas copias) seran denominadas colectivamente como 'Amplicon de la Siguiente Generacion' (figura 3c). El Amplicon Principal, el Amplicon de Primera Generacion y el Amplicon de la Siguiente Generacion son todos subconjuntos del amplicon. Es posible para amplicones de doble hebra el conformarse de combinaciones de los subconjuntos ya mencionados o con la plantilla objetivo en si. Ademas, es posible que el Amplicon de la Siguiente Generacion sea identico al Amplicon de la Primera Generacion. Ademas, es posible generar a moleculas de acidos polinucleicos que sean identicas al Amplicon de Primera Generacion a partir del Amplicon de la Siguiente Generacion.

[0022] El sujeto de este invento tiene una referencia particular al Amplicon de la Siguiente Generacion, en que suministra mecanismos adicionales por los cuales se puede propagar en una forma que suministre re-copias adicionales de la copia resultante.

[0023] Los subconjuntos de amplicones ya descritos comunmente tienen caracterlsticas diferentes. El Amplicon principal podrla ser de una longitud muy variable puesto que la plantilla objetivo puede ser copiada del primer lugar de cebado mas alla de la region delineada de acidos nucleicos por los cebadores utilizados en una NAAT especlfica. En general, una caracterlstica clave de la NAAT sera el suministrar un metodo por el cual este Amplicon Principal puede ser facilitado a otro cebador reclproco utilizado por la NAAT en relation a la generacion del Amplicon de Primera Generacion. El Amplicon de Primera Generacion que resulta del cebado que depende de cebadores del Amplicon Principal sera de una longitud discreta delineada por los cebadores utilizados. Nuevamente, una caracterlstica clave de la NAAT sera el suministrar un metodo por el cual este Amplicon de Primera Generacion puede ser facilitado para cebados adicionales mediante un cebador reclproco para generar al Amplicon de la Siguiente Generacion. Nuevamente, una caracterlstica clave del NAAT en cuestion sera el suministrar un metodo para la re-copia adicional del Amplicon de la Siguiente Generacion. Para algunas NAATs, el Amplicon de la Siguiente Generacion podrla ser sustancialmente diferente al Amplicon de Primera Generacion, en particular, el Amplicon de la Siguiente Generacion podrla ser un concatemero del Amplicon de Primera Generacion.

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[0024] Metodos que producen a amplicones en la forma de concatemeros directamente a partir de plantillas objetivo lineales incluyen a LAMP, TRA, Sea y SMAP (SMAP es un hibrido de LAMP y SEA). En cada caso, los concatemeros surgen de procesos que involucran al amplicon de primera generation (figura 3b). Por lo tanto, se prefiere que la sintesis del acido polinucleico sea realizada utilizando una NAAT seleccionada de un grupo que consiste de LAMP, TRA, SEA y SMAP. En cada caso, por lo tanto, el invento esta asociado con una NaAt que suministra uno o mas cebadores con la capacidad de producir a concatemeros directamente a partir de una plantilla objetivo lineal.

[0025] RCA tambien produce concatemeros. Sin embargo, en este caso, se requiere la ligation especifica de la plantilla objetivo de una sonda para formar a una molecula de ADN circular covalentemente cerrada. Puesto que aquel amplicon sera de una naturaleza concatemerica sin la ayuda de ningun cebador reciproco o sin el requerimiento de cualquier cebador que comprende a un primer y a un 2° segmentos, donde el primer segmento es sustancialmente complementario a la primera region de enlace de cebadores reciprocos en la plantilla y el 2° segmento comprende a una secuencia que es sustancialmente complementaria a otra region en el primer cebador o una region en el amplicon generado a partir del primer segmento del primer cebador de tal forma que el 2° segmento es capaz de formar un bucle. Como tal, la RCA per se, no es un sujeto de este invento.

[0026] Una caracteristica comun de LAMP, TRA, SMAP y SEA, es, por lo tanto, que del cebado que depende del amplicon de primera generacion, es decir, en los casos en que el amplicon de primera generacion actua como un cebador en si, ya sea mediante un evento intra-molecular o un evento inter-molecular, que conlleva al amplicon de la siguiente generacion (este termino es utilizado en este documento para referirse a copias adicionales del amplicon de primera generacion ((y copias de estas copias); figura 3c) que es de un tamano mas grande que el amplicon de primera generacion y que es de una naturaleza concatemerica. De hecho, es una caracteristica de estas NAATs que un amplicon cada vez mas largo es generado de un amplicon mas corto de tal forma que el numero de lugares de enlaces para los cebadores madre se incrementa exponencialmente durante el proceso de amplification y, por lo tanto, los cebadores madre tienen la capacidad de acelerar la amplificacion. Una apreciacion de los mecanismos de action de los cebadores que generan a los concatemeros en estas NAATs es util para entender como los cebadores madre tienen su efecto. Ademas, una persona con conocimiento en la industria que este consciente de los mecanismos que conllevan a la generacion de un concatemero sera capaz de identificar facilmente otras NAATs adecuadas que pueden ser utilizadas en los metodos de este invento.

[0027] Los detalles del proceso por el cual LAMP forma estructuras concatemericas se muestra en la figura 4. Se anticipa que el metodo TRA forma a un amplicon concatemerico mediante un mecanismo identico. Las figuras 4b y 4c muestran que, en efecto, existen por lo menos 2 mecanismos por los cuales se pueden formar a concatemeros, siendo uno mediante un mecanismo intra-molecular (figura 4b) y otro es mediante un mecanismo inter-molecular (figura 4c). De hecho, tal como se muestra en este documento, cualquier mecanismo genera resultados identicos en terminos de la estructura del amplicon de primera generacion y de la siguiente generacion (compare la figura 4b(iv) y la figura 4c (iv)). Se debe entender que el proceso senalado en la figura 4, que unicamente hace referencia a la region de enlaces de cebadores reciprocos, aplica por igual a la region enlazadora de cebadores reciprocos en reversa. Ademas, se entiende que el proceso debe ser repetido por los amplicones de la siguiente generacion para que concatemeros cada vez mas largos puedan formarse. La generacion de concatemeros por medio de SEA es esencialmente identico a aquel de LAMP y de TRA excepto en que la repetition invertida necesaria es inherente inmediatamente en el cebador y en vez de requerir una extension del cebador en un polinucleotido para formar a la repeticion invertida tal como en LAMP y TRA. La figura 5a-c muestra un mecanismo correspondiente para SEA asi como para LAMP/TRA.

[0028] Muchas NAATs utilizan lo que se domina en este documento como “cebadores simples” (figura 6a). El termino “cebador simple” tal como se utilizan este documento se refiere a un cebador que es sustancialmente complementario a un lugar de enlaces de cebadores en un acido polinucleico y donde el cebador no contiene un numero sustancial de nucleotidos adicionales, es decir, nucleotidos 3' o 5' de la region de cebadores que es sustancialmente complementaria a la region enlazadora de cebadores. El termino “sustancial” en este contexto significa que el cebador simple contiene menos que alrededor de 20, menos que alrededor de 15, menos que alrededor de 10, menos que alrededor de 5 nucleotidos adicionales.

[0029] Un cebador utilizado en LAMP y en TRA (y por referencia en SMAP) genera bucles aislados sencillos en el amplicon y, por lo tanto, es denominado en este documento como “cebador que forma bucles” (LFP - loop forming primer). Los LFPs, tal como se utilizan este documento, se refieren a cebadores que comprenden a un primer y 2° segmentos, donde el primer segmento es sustancialmente complementario a la region enlazadora de cebadores en la plantilla y el 2° segmento comprende a una secuencia que es sustancialmente complementaria a una region en el amplicon generado a partir del primer segmento del primer cebador de tal forma que 2° segmento es capaz de formar un bucle. La estructura general de los LFPs se muestra en la figura 6b. El amplicon de primera (y de la siguiente) generacion que resulta del cebado de la plantilla objetivo mediante un LFP contiene a un bucle de un solo polinucleotido aislado flanqueado por un polinucleotido de doble hebra formado a partir del emparejamiento de bases de Watson-Crick de la secuencia de repeticion invertida. Se entiende que el bucle de una sola hebra del polinucleotido esta disponible para enlaces por un cebador adicional utilizado por la NAAT en cuestion, pero no especificamente por un cebador madre.

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[0030] Los cebadores utilizados en SEA (y por referenda SMAP, puesto que es un hlbrido entre SEA y LAMP) se muestran en la figura 6c. Puede observarse que estos cebadores contienen una repeticion invertida arbitraria en su extremo 5'. Como consecuencia, el amplicon de primera generacion resultante del cebado de una plantilla objetivo por dichos cebadores formara a un bucle tipo horquilla ajustado que causara al amplicon de primera generacion el auto-cebarse potencialmente (observar a un amplicon similar). Aquellos cebadores son denominados en este documento como “cebadores tipo horquillas”. El termino “cebador tipo horquilla” tal como es utilizado en este documento se refiere a un cebador que comprende a un primer y a un 2° segmentos, donde el primer segmento es sustancialmente complementario a la region de enlace de cebadores en la plantilla y el 2° segmento comprende a una secuencia que es sustancialmente complementaria a otra region en el primer cebador. Los cebadores tipo horquilla no suministran usualmente a bucles de una sola hebra de oligonucleotidos en el amplicon de primera o de la siguiente generacion que esten disponibles para enlaces mediante un polinucleotido adicional utilizado por la NAAT en cuestion. Sin embargo, los inventores han reconocido que es posible suministrar a cebadores tipo horquilla en casos en que las repeticiones invertidas en el 2° segmento del cebador esten separadas por una region enlazadora. El enlazador podrla ser de por lo menos 10 nucleotidos, de por lo menos l5 nucleotidos, de por lo menos 20 nucleotidos o de por lo menos 30, de por lo menos 40 nucleotidos, de por lo menos 50 nucleotidos o de por lo menos 60 nucleotidos de largo. Un cebador como estos puede formar a un bucle de una sola hebra y permitir enlaces de cebadores adicionales durante la amplificacion (refierase tambien a la figura 6d y tambien a la figura 8c). Los cebadores tipo horquilla que contienen a secuencias enlazadoras como estas entre las repeticiones invertidas son denominados en este documento como “cebadores que suministran bucles” (LPPs - loop-providing primers). Aquellos cebadores no han sido descritos previamente en la industria y forman un aspecto preferido de este invento.

[0031] Los metodos LAMP, SMAP y SEA son expllcitos acerca del uso de cebadores que generan a una repeticion invertida en el amplicon de primera generacion que permite un cebado intra-molecular del amplicon de primera generacion. Como resultado, el amplicon de primera generacion copia una seccion de si mismo y de esa forma genera a un concatemero. El mecanismo descrito para TRA no es expllcito acerca del mecanismo ya mencionado. Sin embargo, TRA produce concatemeros y posiblemente lo hace mediante el mismo mecanismo que el metodo LAMP (refierase al ejemplo 1 y a la figura 7 correspondiente). El cebado intra-molecular ya mencionado no es el unico mecanismo disponible para que los cebadores utilizados en estos metodos generen concatemeros, pero sin importar el mecanismo preciso, una explicacion logica es aparente para el efecto beneficioso de los cebadores madres.

[0032] Tal como fue explicado para los LFPs utilizados en LAMP, TRA y SMAP para auto-cebados intra- (figura 8a) o inter-(figura 8b) moleculares del amplicon de primera generacion, el amplicon resultante de la siguiente generacion facilita a regiones de una sola hebra capaces de enlazarse a los cebadores originales utilizados para generar al amplicon a partir de la plantilla objetivo. Debe tomarse en cuenta que la hebra reclproca de los bucles formados de una sola hebra es capaz de enlazarse a los “cebadores tipo bucles” mencionados mas adelante. Cebadores tipo horquillas tal como son descritos en los metodos SEA y SMAP no generan aquellos bucles de una sola hebra en el amplicon. Sin embargo, tal como se menciono anteriormente, los inventores se han dado cuenta que al utilizar una variacion del cebador del metodo SEA que contiene a una region enlazadora entre las repeticiones invertidas (los LPPs mostrados en la figura 6d), el cebador tipo horquilla podrla generar bucles de una sola hebra, tal como fue presentado en la figura 8c.

[0033] La capacidad de los LFPs y de los LPPs para generar regiones estables de una sola hebra de amplicones es crltico para propagar rapidamente a amplicones adicionales y representa un aspecto clave de las tecnologlas que utilizan a estos cebadores. Esto significa que un amplicon concatemerico puede contener muchos lugares nuevos de cebado para los cebadores utilizados por la NAAT en cuestion. En los metodos LAMP y TRA (y por lo tanto en el metodo SMAP), los LFPs que generan repeticiones invertidas en el amplicon tambien facilitan a regiones de una sola hebra del amplicon que pueden enlazarse y de esa forma pueden iniciar replicas adicionales del amplicon, y, por lo tanto, pueden propagar aun mas a la amplificacion. En los metodos LAMP y SMAP, cebadores adicionales podrlan ser utilizados adicionalmente a los LFPs, los cuales tambien se enlazarlan a estas regiones de una sola hebra del amplicon para ayudar a propagar a la amplificacion (conocidos como cebadores tipo bucles). Una faceta de este invento es que los cebadores madre no se enlazan a dichos bucles estables de una sola hebra generados por los LFPs y/o por los LPPs, pero aceleran la amplificacion por medio de un mecanismo distinto.

[0034] Para los metodos LAMP, TRA y SEA (y por referencia para el metodo SMAP), puede demostrarse que el proceso de copiado de los amplicones de la siguiente generacion, ya sea por medio de auto- (sin importar si esto se logra intra- o inter-molecularmente), enlaces y extensiones de un cebador adicional a partir de una region de una sola hebra de amplicones o las acciones de otros cebadores que se enlazan a regiones enlazadoras de cebadores reclprocos hacia adelante o en reversa, hacia la region madre del amplicon de la siguiente generacion que transitoriamente es de una sola hebra. Se anticipa que en relacion a los mecanismos sugeridos de LAMP, TRA y SEA (y SMAP) que dicha region madre de una sola hebra se convertira rapidamente a un polinucleotido de doble hebra ya sea por la accion de auto-cebado y re-copia de amplicones, o por la accion de cebadores que se enlazan a lugares expuestos de enlace para cebadores dirigidos a las regiones de enlace de cebadores reclprocos hacia adelante o en reversa. Se espera que la region madre sea transitoriamente de una sola hebra y que no sea de una sola hebra en una forma estable. Por lo tanto, no se espera que la region madre suministre lugares utiles de enlace de cebadores para la amplificacion. Sin embargo, se ha demostrado ahora, sorpresivamente, que los cebadores dirigidos a la

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region madre en efecto incrementan inmensamente la tasa de amplification. El mecanismo a traves del cual los cebadores madre pueden enlazarse al amplicon se ilustra en las figuras 9 y 10.

[0035] Mientras que se anticipa que la action de los cebadores madre sera expuesta transitoriamente en polinucleotidos expuestos de una sola hebra que resultan de la re-copia de amplicones, es posible que otro mecanismo tambien pueda ser responsable de la tasa incrementada de amplificacion vista en los cebadores madre. Por ejemplo, es posible que en una estructura concatemerica como una hebra de polinucleotidos pueda 'salirse del bucle' tal como en un deslizamiento de replication, lo cual es especialmente posible puesto que las estructuras concatemericas de polinucleotidos, debido a su naturaleza, sean capaces de formar estructuras secundarias entre secuencias repetidas. Los bucles generados de polinucleotidos de una sola hebra, podrlan facilitar, por ejemplo, lugares de enlace para los cebadores madre. Otros mecanismos tambien podrlan explicar potencialmente el efecto de los cebadores madre, pero se anticipa que el principio de los cebadores madre es el factor comun que actua en secuencias concatemericas de polinucleotidos.

[0036] Tal como fue mencionado antes, cebadores reclprocos adecuados podrlan comprender a un primer y un 2° segmento donde el primer segmento es sustancialmente complementario a las regiones de enlace de cebadores reclprocos en la plantilla, tal como fue definido en las reivindicaciones. Mientras que este aspecto del invento es explicado aqul en mayor detalle en relation al primer cebador, debe entenderse que el mismo principio aplica mutatis mutandis al 2° cebador.

[0037] El termino “sustancialmente complementarios” se refiere a que el primer segmento tiene una suficiente complementariedad para enlazarse a la region de enlaces de cebadores reclprocos en la plantilla y/o en el amplicon bajo condiciones que son utilizadas comunmente durante las NAATs. Esto requiere que el primer segmento del cebador reclproco tenga por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 99% o por lo menos un 100% de complementariedad en relacion a la region de enlaces de cebadores reclprocos en la plantilla. El primer segmento del cebador reclproco podrla ser de por lo menos 5 nucleotidos, de por lo menos 10 nucleotidos, de por lo menos 20 nucleotidos, de por lo menos 30 nucleotidos, de por lo menos 40 nucleotidos, de por lo menos 50 nucleotidos, de por lo menos 60 nucleotidos, o incluso de por lo menos 70 nucleotidos de largo.

[0038] En los casos en que cebadores reclprocos contienen ademas a un 2° segmento, el 2° segmento comprende a una secuencia que es sustancialmente complementaria en relacion a otros segmentos en el primer cebador o en una region en el amplicon generado a partir del primer segmento del primer cebador de tal forma que la region es capaz de formar un bucle. El termino “un amplicon generado a partir del primer segmento del primer cebador” se refiere a la primera copia de la plantilla que es generada cuando el primer cebador se extiende por medio de una polimerasa. Dicho amplicon incluye la secuencia del primer cebador en su extremo 5'.

[0039] En algunas secciones, el 2° segmento es sustancialmente identico a una region en la plantilla objetivo y/o al amplicon al cual el cebador se enlaza. Aquellos cebadores son denominados LFPs. El termino “sustancialmente identico” significa que el 2° segmento tiene por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 99% o por lo menos un 100% de identidad en relacion a la region en la plantilla objetivo y/o al amplicon. Tambien se cree que solamente una parte de la 2a region muestra una identidad sustancial con una region en la plantilla objetivo. Sin importar si todo o solamente una parte del 2° segmento del cebador reclproco muestra una identidad sustancial en relacion a la region en la plantilla objetivo, la region del 2° segmento que es sustancialmente identica a una region en la plantilla objetivo y/o al amplicon es de por lo menos 5 nucleotidos, de por lo menos 10 nucleotidos, de por lo menos 20 nucleotidos, de por lo menos 30 nucleotidos, de por lo menos 40 nucleotidos, de por lo menos 50 nucleotidos, de por lo menos 60 nucleotidos, o incluso de por lo menos 70 nucleotidos de largo. En este aspecto del invento, una vez que el primer segmento del cebador reclproco ha sido extendido para formar a un primer amplicon, el 2° segmento es capaz de enlazarse a una region complementaria dentro de la misma hebra y, por lo tanto, puede formar un bucle.

[0040] El 2° segmento tambien podrla comprender a una region que es sustancialmente complementaria a otra region en el 2° segmento. Aquellos cebadores fueron denominados anteriormente como cebadores tipo horquilla o cebadores que suministran bucles. El termino “sustancialmente complementarios” significa que las 2 regiones en el 2° segmento tienen por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 99% o por lo menos un 100% de complementariedad entre si. Preferiblemente, la region de complementariedad sera de por lo menos 5 nucleotidos, de por lo menos 10 nucleotidos, de por lo menos 20 nucleotidos, de por lo menos 30 nucleotidos, de por lo menos 40 nucleotidos, de por lo menos 50 nucleotidos, de por lo menos 60 nucleotidos, o de por lo menos 70 nucleotidos de largo. En los casos en que el cebador es un cebador tipo horquilla, se prefiere que las 2 regiones de complementariedad en el 2° segmento esten separadas por una region enlazadora corta (es decir, menos de 10 nucleotidos) para facilitar el enlace de las 2 regiones entre si. La longitud de la region enlazadora permite que una persona con conocimiento en la industria distinga entre los LPPs con una region enlazadora que tiene por lo menos 10 nucleotidos de largo, y cebadores tipo horquilla cuyas regiones enlazadoras son menores a los 10 nucleotidos de largo. El primer y 2° segmentos del cebador podrlan conectarse por medio de una region enlazadora. En algunas secciones, la region enlazadora es sustancialmente identica al primer segmento de dichos cebadores para permitir el enlace de cebadores adicionales al complemento de la region

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enlazadora una vez que haya sido copiada (figura 6d). El termino “sustancialmente identico” significa que el primer segmento tiene por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 99% o por lo menos un 100% de identidad en relacion a la region enlazadora que conecta al primer y 2° segmentos del cebador.

[0041] Los metodos del invento pueden ser practicados utilizando cebadores reclprocos hacia adelante y en reversa del mismo tipo, por ejemplo, LFPs o cebadores tipo horquilla. Cuando se menciona al termino “el mismo tipo de cebadores”, significa que todos los cebadores son sencillos, LFPs, LPPs o cebadores tipo horquilla. El termino “diferente tipo de cebadores” en esa misma forma, se refiere a una combinacion de 2 o mas cebadores donde por lo menos uno de los cebadores no es del mismo tipo que los otros cebadores. Por ejemplo, cuando el metodo utiliza 4 cebadores reclprocos de los cuales 3 son LFPs y uno es un LPP, los cebadores serlan considerados como de tipos diferentes. Por lo tanto, se cree que se debe usar cebadores reclprocos hacia adelante y en reversa que no son del mismo tipo. Por ejemplo, un cebador reclproco hacia adelante podrla ser utilizado, es decir, una combinacion en un LFP con un cebador reclproco en reversa que es un LPP o un cebador tipo horquilla. Tambien es posible combinar a LFPs o a cebadores tipo horquilla con cebadores simples siempre y cuando la combinacion de cebadores resulte en la formacion de un concatemero. En los casos en los que la NAAT utilizada para la amplificacion usa mas de un (es decir, 2 o mas) cebador reclproco hacia adelante y/o en reversa, tambien es posible combinar el mismo tipo o diferentes tipos de cebadores en el mismo lugar de enlace de cebadores reclprocos. En un aspecto de este invento, los 2 o mas cebadores reclprocos hacia adelante y/o en reversa son todos LFPs. Combinaciones adecuadas de cebadores seran evidentes para aquellas personas con conocimiento en la industria. Por ejemplo, sera evidente para una persona con conocimiento en la industria que la combinacion de cebadores reclprocos hacia adelante y en reversa los cuales son cebadores sencillos no suministrarla un mecanismo para facilitar la formacion de un concatemero y, por lo tanto, aquella combinacion no es adecuada para su uso en este invento.

[0042] Debe entenderse que, en general, los cebadores reclprocos, o los conjuntos de cebadores, actuan en diferentes hebras de la plantilla objetivo. Ademas, los cebadores reclprocos (o uno de cada conjunto de cebadores reclprocos) actuara para delimitar la region del polinucleotido original copiado y re-copiado. Por lo tanto, una amplificacion exponencial requiere el acoplamiento de las actividades entre por lo menos 2 regiones enlazadoras de cebadores, una region enlazadora de cebadores reclprocos hacia adelante y una region enlazadora de cebadores reclprocos en reversa (figura 1a). Las regiones enlazadoras de cebadores hacia adelante y en reversa podrlan comprender cada una a un solo lugar de enlaces para un cebador por el cual los lugares reclprocos estan en hebras sentido opuestas, es decir, un lugar de enlace de cebadores esta en la “hebra hacia adelante”, y la otra en la “hebra en reversa” (tal como se muestra en la figura 1a). Las regiones de cebadores reclprocos hacia adelante y en reversa tambien podrlan comprender lugares de enlaces para 2 o mas cebadores cada una, donde mas de 2 cebadores son utilizados por una nAaT particular. En este caso, es posible que 2 o mas lugares enlazadores de cebadores en las regiones enlazadoras de cebadores reclprocos hacia adelante y/o en reversa esten todas ubicadas en la misma hebra de la plantilla objetivo y/o del amplicon o en diferentes hebras de la plantilla objetivo y/o del amplicon ((o sus copias), figura 1b).

[0043] Los cebadores madre del invento podrlan colocarse en cualquier lugar entre las regiones de enlace de cebadores reclprocos hacia adelante y en reversa siempre y cuando los lugares de enlace de los cebadores madres no se superpongan significativamente con el lugar de enlace reclproco hacia adelante o en reversa. Debe entenderse que en los casos en los cuales un LFP es utilizado, en los casos en los que el LFP es un cebador hacia adelante, la region enlazadora de cebadores reclprocos hacia adelante abarca no solamente al lugar F2 (es decir, la region enlazadora de cebadores reclprocos hacia adelante) pero tambien abarca al lugar F1 (es decir, la region en la hebra hacia delante que es sustancialmente identica al 2° segmento del LFP), y cuando el LFP es un cebador en reversa, la region enlazadora de cebadores reclprocos en reversa abarca no solamente al lugar R2c (es decir, la region enlazadora de cebadores reclprocos en reversa) pero tambien al lugar R1c, es decir, la region en la hebra en reversa que es sustancialmente identica al 2° segmento del LFP (figura 1e y figura 14). De esta forma, los cebadores madre podrla ser ubicados en cualquier lugar entre los lugares R1(c) y F1(c) en los casos en los que 2 LFPs son utilizados (tal como en los metodos LAMP y TRA); en los casos en que solamente un LFP es utilizado en una NAAT especlfica, los cebadores madre podrlan enlazarse entre un lugar R1(c) o F1(c) y otra region de enlace de cebadores reclprocos que no sea ocupada por LFPs.

[0044] Es posible utilizar unicamente un cebador madre que se enlace a la hebra de polinucleotidos hacia adelante o en reversa tal como se muestra en la figura 2a. Alternamente, 2 o mas cebadores madre pueden ser utilizados, los cuales pueden enlazarse a hebras reclprocas del amplicon (figura 2b) o a la misma hebra (figura 2d). Los metodos de este invento podrlan ser practicados con 1, 2, 3, 4 o mas cebadores madre que podrlan ser utilizados en cualquier combinacion espacial en la cual se puedan enlazar a la hebra en reversa o hacia delante siempre y cuando los lugares de enlaces para los cebadores madre no se superpongan significativamente con las regiones de enlace de cebadores reclprocos hacia adelante o en reversa o no se superpongan en lo absoluto (figura 2e). Los cebadores madre podrlan enlazarse adicionalmente a cualquier parte dentro de la region madre. Por lo tanto, los cebadores madre podrlan tener un lugar de enlace que esta en una proximidad cercana a la region de enlace de cebadores reclprocos hacia adelante o en reversa (figura 2c). El termino “proximidad cercana” significa que la region de enlace del cebador madre y de la region de enlace de cebadores reclprocos no tendra mas de 10bp, 50bp, 100bp, 200bp, 300bp, 400bp, 500bp, 600bp, 700bp, 800bp, 900bp o 1000bp de separacion.

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[0045] Los cebadores madre de acuerdo a este invento pueden ser de por lo menos 5 nucleotidos, de por lo menos 10 nucleotidos, de por lo menos 20 nucleotidos, de por lo menos 30 nucleotidos, de por lo menos 40 nucleotidos, de por lo menos 50 nucleotidos, de por lo menos 60 nucleotidos, de por lo menos 70 nucleotidos, de por lo menos 80 nucleotidos o de por lo menos 90 nucleotidos de largo.

[0046] Los cebadores madre podrlan ser cebadores sencillos. Sin embargo, se planifica usar cebadores madre que sean LFPs, cebadores tipo horquilla, LPPs, o cebadores quimericos. En los casos en los que mas de un cebador es utilizado, los cebadores madre podrlan ser del mismo tipo o podrlan ser una combinacion de diferentes tipos de cebadores. Cuando se usa el termino “el mismo tipo de cebadores”, esto significa que los cebadores son todos cebadores simples, LFPs, LPPs o cebadores tipo horquilla. El termino “diferentes tipos de cebadores” en ese mismo sentido se refiere a una combinacion de 2 o mas cebadores donde por lo menos uno de los cebadores no es del mismo tipo que los otros cebadores. Por ejemplo, los cebadores madres utilizados podrlan ser todos simples o podrlan ser una combinacion de cebadores simples, LFPs y/o cebadores tipo horquilla. De hecho, se cree que los cebadores madre podrlan ser utilizados en una forma util en derivados de los metodos LAMP, TRA, SMAP o SEA que podrlan utilizar una variedad de variaciones de cebadores a aquellas utilizadas actualmente, tal como se muestra en el ejemplo de la figura 20.

[0047] Tal como se indica en la literatura asociada con los metodos TRA y SMAP, as! como en otras fuentes, existe una gran variedad de combinaciones posibles de “cebadores simples”, LFPs, cebadores tipo horquilla, cebadores que contienen ARN, cebadores que contienen lugares de nickasa y otros cebadores nuevos que podrlan ser utilizados en combinaciones nuevas para generar derivados de los metodos NAAT senalados. En los casos en que dichas combinaciones resultan en metodos que generan a amplicones concatemericos capaces de auto-replicarse para generar concatemeros mas largos, se anticipa que los cebadores madre seran aplicables.

[0048] Por ejemplo, los inventores notaron que una debilidad principal de los cebadores de desplazamiento utilizados en el metodo LAMP (los cuales son disenados para que operen en la plantilla objetivo y en el amplicon principal pero no en un amplicon de primera generacion o en un amplicon de la siguiente generacion) es que, si un cebador de desplazamiento se enlazase o se extendiese desde su lugar antes de que el LFP asociado se haya vinculado y extendido en la plantilla objetivo, el amplicon principal generado a partir del cebador de desplazamiento obstruirla y bloquearla a los enlaces del LFP que son esenciales para la amplificacion exponencial y, por lo tanto, esto inhibirla la amplificacion. Los inventores han demostrado que este efecto puede ser, hasta cierto punto, mitigado si en vez de usar a una estructura de 'cebador simple' para el cebador de desplazamiento, se utiliza a un LFP como el cebador de desplazamiento (ejemplo 5, figura 15a y b). Se cree que esto sucede porque los LFPs pueden permitir, hasta cierto punto, el re-cebado del lugar de cebadores (tal como se describio en la patente asociada con la tecnologla TRA) pero principalmente porque un LFP puede ser capaz de actuar en amplicones de primera y de la siguiente generacion, as! como en la plantilla objetivo y en el amplicon principal, mientras que se espera que los cebadores 'simples' de desplazamiento actuen principalmente en la plantilla objetivo y en el amplicon principal unicamente. Un metodo como este, tal como se describe en el ejemplo 5, es, por lo tanto, completamente consistente con el uso de cebadores madre. Asimismo, un cebador quimerico tal como se describe en iCAN y RDC podrla ser utilizado como un cebador de desplazamiento (en vez de un cebador simple) para permitir el re-cebado del lugar de cebadores de desplazamiento reduciendo, de esa forma, la posibilidad de obstruir al lugar de enlaces de los LFPs.

[0049] Ademas, puesto que los cebadores madre actuan para incrementar la tasa de amplificacion de los metodos utilizando LFPs mediante el acoplamiento de procesos que ocurren en las regiones de enlace reclprocas hacia adelante y en reversa y puesto que se ha ensenado en la literatura que el metodo LAMP tiene un llmite superior que corresponde al numero de nucleotidos que separan a los lugares de enlace reclprocos hacia adelante y reversa para los LFPs utilizados (Notomi et al. Loop-mediated isothermal amplification of dNa (Amplificacion isotermica de ADN mediada por bucles), Nucleic Acids Research (Investigacion de Acidos Nucleicos), (2000) Vol 28., No. 12, e63), el uso de cebadores madre puede permitir claramente a los lugares de enlaces reclprocos hacia adelante y en reversa que se ubiquen mas lejos en la secuencia que lo que se consideraba practico previamente (especialmente si algunos cebadores madre son utilizados). Esto puede crear un gran beneficio cuando se desea demostrar que 2 regiones de secuencias ocurren en conjunto en un polinucleotido excepto en los casos en los cuales la distancia entre las 2 regiones es muy lejana para permitir que cada region respectiva pueda ser utilizada efectivamente como una region de enlaces reclprocos hacia adelante y reversa en las NAATs aqul descritas.

[0050] Puesto que el uso de cebadores madre puede permitir que las regiones de enlaces reclprocos hacia adelante y en reversa esten mucho mas alejadas que en su ausencia permitiendo aun a una amplificacion efectiva, puede establecerse la presencia de 2 lugares distintos en un polinucleotido. Por lo tanto, el invento suministra un metodo para la amplificacion de un acido polinucleico en donde las regiones enlazadoras de cebadores reclprocos hacia adelante y en reversa estan ubicadas a una distancia tal que la slntesis de un acido polinucleico podrla ocurrir unicamente en la presencia de los cebadores madre. Esta distancia puede definirse experimentalmente al realizar 2 NAATs separadas en paralelo donde las NAATs, los reactivos y las condiciones de amplificacion utilizadas son identicas excepto en que se agregan cebadores madre a una reaccion, pero no a la otra. En los casos en los que la slntesis del acido polinucleico ocurre unicamente en la presencia de los cebadores madre, se considera que los lugares de enlaces de cebadores reclprocos estan ubicados a una distancia tal que la slntesis de un acido polinucleico puede ocurrir unicamente en la presencia de los cebadores madre.

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[0051] Por ejemplo, el gen mecA presente en el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA - Methicillin- resistant Staphylococcus aureus) podria ubicarse a una distancia significativa de la secuencia orfX conservada que es asociada con el lugar de insercion para el elemento movil genetico SCCMec el cual es asociado con el MRSA (refierase a WO02/099034). El uso de cebadores madres puede ayudar a detectar a MRSA al permitir que el gen mecA y que la secuencia orfX actuen como lugares de enlaces reciprocos para amplificaciones, incluso si estan muy distantes en la secuencia para utilizar metodos tales como LAMP. Por lo tanto, en un aspecto, este invento suministra un metodo para la deteccion de MRSA en una muestra.

[0052] Los cebadores madre podrian contener exclusivamente a acidos nucleicos que ocurren naturalmente. Sin embargo, se planea utilizar cebadores que contengan a bases modificadas. Ejemplos de aquellas bases modificadas incluyen, pero no se limitan a, N4-metilcitosina, inosina, ribonucleotidos, bases fluorescentes, bases que pueden fotolisarse o bases universales. Tambien se planea usar acidos nucleicos que han sido marcados con una particula que le permita detectar al cebador madre y/o al amplicon al cual el cebador madre marcado se enlaza. Por ejemplo, el acido nucleico podria ser marcado en una forma fluorescente. Los cebadores madre podrian ser marcados en una forma alterna con particulas de captation (por ejemplo, la biotina).

[0053] En una forma importante, los cebadores madre no son directamente responsables de amplificaciones exponenciales del amplicon, lo cual es regulado por los cebadores que se enlazan a los lugares de enlace de cebadores reciprocos hacia adelante y reversa, pero simplemente incrementan la tasa de amplification. Esto se da debido a que se cree que los cebadores madre funcionan en los productos de amplificacion de otros cebadores utilizados por una NAAT especifica. Por lo tanto, los cebadores madre funcionan al incrementar la tasa de amplificacion de la reaction mediada por los cebadores reciprocos hacia adelante y reversa. Esto se muestra en la figura 1c, donde puede observarse que en los casos en los que el cebador madre ceba y se extiende desde la plantilla objetivo, la copia parcial de la plantilla objetivo contendria unicamente a la region enlazadora de cebadores reciprocos hacia adelante o a la region de cebadores reciprocos en reversa, pero no a ambos. Por lo tanto, el amplicon principal generado a partir de un cebador madre no permitiria una replica reciproca y por lo tanto no contribuiria a la amplificacion exponencial de la plantilla objetivo (esto se muestra en mayor detalle en la figura 21). El mismo argumento aplica para cebadores madre que copian a un amplicon principal generado por otros cebadores utilizados por la NAAT especifica y similarmente para amplicones de primera generation.

[0054] Se anticipa que los cebadores madre incrementan significativamente la tasa de amplificacion de una plantilla objetivo si el amplicon de la siguiente generacion (es decir, copias adicionales del amplicon de primera generacion (y copias de estas copias)) es de una naturaleza concatemerica. El requerimiento de cebadores madre para que estos trabajen en concatemeros viene del requerimiento que para que un acido nucleico especifico contribuya a la amplificacion exponencial, debe contener regiones capaces de actuar como regiones de enlace de cebadores reciprocos hacia adelante y reversa. Puede verse claramente a partir de la figura 21, que copias de una estructura concatemerica por medio de un cebador madre, pueden producir a una copia de polinucleotidos que, tiene lugares de enlace de cebadores reciprocos hacia adelante y en reversa, mientras que la copia de una estructura no concatemerica no. Por lo tanto, los inventores esperan que el uso de cebadores madre sean beneficiosos para los metodos de amplificacion que tienen como resultado la formation de concatemeros.

[0055] Se ha descubierto que los cebadores madre funcionan en una forma acoplada con los otros cebadores utilizados en la NAAT en esta interaction, lo cual es critico para obtener los grandes incrementos observados en la tasa de amplificacion. Las tasas incrementadas de amplificacion que fueron observadas utilizando a los cebadores madre no pueden ser explicadas debido a que los cebadores madre participan en un proceso de amplificacion adicional pero distinto por el cual el amplicon que es producido por medio de un cebador madre no actua como una plantilla para todos los otros cebadores que estan siendo utilizados en la NAAT especifica para re-copiar al amplicon. Los inventores han demostrado experimentalmente y teoricamente que las tasas incrementadas observadas de amplificacion deben resultar de un solo proceso de amplificacion acoplado y no de 2 o mas procesos distintos de amplificacion debido a que el amplicon producido de un proceso no puede actuar como una plantilla para el amplicon producido de otro proceso. Ejemplos de los tipos de tasas sustancialmente muy incrementadas de amplificacion para la tecnologia de amplificacion tRa son demostradas en el ejemplo 2 para una variedad de conjuntos de cebadores con diferente cinetica de amplificacion. En cada caso, los cebadores madre incrementan significativamente la tasa de amplificacion y, al hacerlo, se incrementa la sensibilidad de la prueba dentro del periodo de tiempo en el cual las pruebas son realizadas (figura 11). Por lo tanto, los cebadores madre podrian reducir el tiempo requerido para detectar a un tipo y monto especifico de la plantilla objetivo en por lo menos un minuto, en por lo menos 2 minutos, en por lo menos 3 minutos, en por lo menos 5 minutos, en por lo menos 10 minutos, en por lo menos 20 minutos, en por lo menos 30 minutos o en por lo menos 60 minutos en comparacion a la reaccion de control en la cual no se ha agregado ningun cebador madre.

[0056] Una manifestation de TRA ha sido descrita, por ejemplo, la cual utiliza a un cebador simple en conjunto con un LFP donde se entiende que cada cebador, se enlaza, reciprocamente, ya sea a las regiones enlazadoras de cebadores reciprocos hacia adelante o en reversa (US6743605). La combination es referida en este documento como TRA asimetrica o ATRA (Asymmetric TRA). Como tal, cuando los cebadores madre son agregados a la TRA, una persona podria argumentar que ahora existen 3 procesos separados de amplificacion combinados en el ensayo, uno siendo la TRA y 2 amplificaciones ATRA separadas (figura 12a). Podria entonces ser tentador el sugerir que los

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cebadores madre no incrementan la tasa de amplificacion de la TRA per se, pero que simplemente agregan 2 amplificaciones ATRA al mismo ensayo. Sin embargo, si este fuese el caso, entonces la tasa general observada de amplificacion serla la suma de la tasa de amplificacion de sistema TRA mas aquella de ambos sistemas ATRA. Sin embargo, los inventores han demostrado que el uso de cebadores madre causa un incremento en la tasa de amplificacion que es mayor que la que se esperarla de la suma de sistemas de amplificacion sustancialmente independientes. En el ejemplo 3, la tasa de amplificacion es medida con diferentes combinaciones de cebadores madre y LFPs. Las manifestaciones que utilizan a un solo cebador madre y a un solo LFP son equivalentes a ATRA. Puede observarse que la tasa de amplificacion utilizando 2 posibles combinaciones de cebadores madre y de LFPs (es decir, las 2 manifestaciones de ATRA) producen elementos cineticos extremadamente lentos (figura 12b (i e ii)). Los elementos cineticos cuando los 2 LFPs son utilizados en conjunto (es decir, un sistema TRA) son mas rapidos que los 2 sistemas ATRA (figura 12b (iii)). Cuando los cebadores madre y los LFPs son combinados entre si, la tasa de amplificacion es sustancialmente mas rapida que cualquiera de las manifestaciones anteriores de TRA o de ATRA (figura 12b (iv)). Dada la lentitud que han demostrado los resultados cineticos de ATRA (y recordando la naturaleza exponencial de la amplificacion), no es razonable el suponer que la tasa incrementada de amplificacion mostrada en la figura 12b (iv) es simplemente la suma de las tasas de las reacciones de los 2 sistemas ATRa y TRA combinadas. Esto resalta el hecho que los cebadores madre estan actuando en una forma acoplada con los otros cebadores involucrados en la amplificacion exponencial y, nuevamente, esto puede explicarse por la accion de los cebadores madre en los concatemeros lo cual produce copias de amplicones que retienen a una region enlazadora de cebadores reclprocos hacia adelante y en reversa.

[0057] El ejemplo emplrico ya mencionado puede ser modelado. En el ejemplo 4, 3 procesos separados de amplificacion son modelados con tasas de amplificacion definidas matematicamente. El modelo genera los resultados de acuerdo a la curva BART (refierase a secciones posteriores de este documento). Los parametros utilizados reflejaron el rango de resultados que obtuvieron los inventores para las diferentes manifestaciones tasas de las diferentes NAATs isotermicas. Puede observarse que si, por ejemplo, 2 procesos muy lentos de amplificacion son sumados a un proceso de amplificacion mucho mas rapido, no se observa el tipo de amplificacion significativamente mas rapido que se observa cuando los cebadores madre son agregados a los metodos LAMP, LAMP + cebadores tipo bucle o TRA (compare los resultados del modelo en la figura 13a con los resultados emplricos que se muestran las figuras 11, 12b, 15, 16 y 17 de los ejemplos 2, 3, 5, 6 y 7 respectivamente). Ademas, la figura 13b, que muestra el resultado de sumar a un proceso de amplificacion rapido con 2 procesos de amplificacion moderadamente rapidos, demuestra que aun bajo aquellas condiciones, el tipo de tasas sustancialmente incrementadas de amplificacion general observadas al utilizar a cebadores madre no se observan en el modelo. En efecto, tal como es evidente en la figura 13c, incluso cuando 3 procesos de amplificacion rapida son sumados, la tasa de amplificacion general es unicamente ligeramente mas rapida que cualquiera de los procesos individuales: esto refleja la naturaleza exponencial de la amplificacion (compare a las figuras 11, 12b, 15, 16 y 17 de los ejemplos 2, 3, 5, 6 y 7 respectivamente).

[0058] La tasa incrementada de amplificacion que los cebadores madre pueden suministrar se ha demostrado con, o se anticipa que funcionen con, algunas NAATs isotermicas. Ejemplos de casos en los cuales se pueden implementar a los cebadores madre en relacion a los otros cebadores utilizados en una NAAT especlfica se muestran en la figura 14a-g. Los ejemplos 5, 6 y 7 muestran datos emplricos para algunas de las manifestaciones de NAATs que se muestra en la figura 14. En cada caso, pueden observarse incrementos significativos en la tasa de amplificacion (figuras 15-17).

[0059] Una utilidad adicional de los cebadores madre en las NAATs que forman concatemeros podrlan ser su uso como sondas para su implementacion en sistemas fluorescentes, quimioluminiscentes, electro - qulmicos o de otro tipo como un metodo para dar seguimiento al grado de amplificacion en 'tiempo real'. Los cebadores madre podrlan tener beneficios como cebadores que contienen sondas por sobre, por ejemplo, LFPs o cebadores tipo horquillas puesto que no requieren generar repeticiones invertidas en los amplicones lo cual afectarla a ciertos tipos de sondas.

[0060] La plantilla objetivo utilizada en este invento podrla ser cualquier acido polinucleico que comprende a regiones enlazadoras adecuadas de cebadores reclprocos que permitan la amplificacion de un acido polinucleico de interes. Una persona con conocimiento en la industria entendera que los lugares de enlaces de cebadores reclprocos hacia adelante y en reversa necesitan estar ubicados en una forma tal que la plantilla objetivo permita que la region enlazadora de cebadores reclprocos hacia adelante y la region enlazadora de cebadores reclprocos en reversa esten ubicadas a 5' de la secuencia que debe ser amplificada en la hebra sentido y antisentido, respectivamente.

[0061] La plantilla objetivo podrla ser de una sola hebra o de doble hebra. En los casos en que la plantilla objetivo es un acido polinucleico de una sola hebra, una persona con conocimiento en la industria entendera que la plantilla objetivo comprendera inicialmente unicamente a una region de enlace de cebadores reclprocos. Sin embargo, el enlace del primer cebador resultara en la slntesis de una hebra complementaria que contendra entonces a la 2a region enlazadora de cebadores reclprocos.

[0062] La plantilla objetivo podrla derivarse de una molecula de ARN, en cuyo caso la ARN necesita ser transcrita al ADN antes de practicar el metodo del invento. Reactivos adecuados para la transcripcion del ARN son bien conocidos en la industria e incluyen, pero no se limitan a, transcriptasas en reversa.

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[0063] Adicionalmente a las regiones de enlaces de cebadores reclprocos hacia adelante y en reversa, la plantilla objetivo necesita tener a una region madre que necesita tener una longitud suficiente para permitir los enlaces de uno o mas cebadores madre del invento. Por lo tanto, se prefiere que la region madre tenga una longitud de por lo menos 5 nucleotidos, de por lo menos 10 nucleotidos, de por lo menos 15 nucleotidos, de por lo menos 20 nucleotidos, de por lo menos 30 nucleotidos, de por lo menos 50 nucleotidos, de por lo menos 100 nucleotidos, de por lo menos 200 nucleotidos, de por lo menos 300 nucleotidos, o de por lo menos 500 nucleotidos.

[0064] Una persona con conocimiento en la industria estara consciente que, adicionalmente a los cebadores necesarios para la amplificacion, las NAATs requeriran reactivos adicionales para poder sintetizar a un acido polinucleico. Los reactivos requeridos seran evidentes para una persona con conocimiento en la industria, pero generalmente incluiran a amortiguadores adecuados, dNTPs adecuados, una polimerasa adecuada, etcetera.

[0065] Una persona con conocimiento en la industria apreciara, que despues de la adicion de todos los componentes necesarios para realizar la NAAT en cuestion, es necesario suministrar condiciones adecuadas para la slntesis del acido polinucleico. Esto puede lograrse al suministrar una temperatura adecuada de incubacion, por ejemplo. Se prefiere que la amplificacion ocurra bajo condiciones isotermicas. Esto significa que durante la amplificacion las temperaturas deben mantenerse a un nivel constante. El termino “constante” significa que la temperatura no variara por mas de ± 10 °C. Sin embargo, metodos que abarcan a un solo cambio de temperatura de mas de 10 °C, a 2 cambios de temperatura de mas de 10 °C, a 3 cambios de temperatura de mas de 10 °C, a 4 cambios de temperatura de mas de 10 °C o a 5 cambios de temperatura de mas de 10 °C durante el proceso de amplificacion tambien estan dentro del enfoque de este invento.

[0066] La amplificacion del acido polinucleico de acuerdo al invento podrla detectarse por metodos conocidos para aquellas personas con conocimiento en la industria. Metodos adecuados incluyen, pero no se limitan a, el uso de colorantes fluorescentes de intercalacion, sondas o cebadores fluorescentes, la medicion de turbiedades, sondas electro - qulmicas, senales bioluminiscentes y sondas quimioluminiscentes.

[0067] La amplificacion del acido polinucleico podrla detectarse utilizando metodos en tiempo real, es decir, metodos que pueden detectar al acido polinucleico en la medida en que esta siendo amplificado. Ejemplos de aquellos sistemas de deteccion incluyen, pero no se limitan a, sondas de fluorescencia (por ejemplo, sondas fluorescentes que son agregadas durante la amplificacion), sondas de senales bioluminiscentes y sondas electro - qulmicas. En un aspecto, los cebadores madre en si son marcados con una partlcula detectable, por ejemplo, una marcacion fluorescente, una marcacion quimioluminiscencia o una marcacion electroqulmica, que permite la deteccion del amplicon al cual los cebadores madres se enlazan. Por lo tanto, una utilidad adicional de los cebadores madre en NAATs que forman concatemeros podrla ser como sondas para su uso en un sistema reportador fluorescente, de quimioluminiscencia o electroqulmico como un medio para hacer seguimiento de la magnitud de amplificacion en 'tiempo real'. Otros sistemas reportadores adecuados seran evidentes para aquellas personas con conocimiento en la industria. Los cebadores madre podrlan tener beneficios como cebadores que contienen sondas por sobre, por ejemplo, LFPs o cebadores tipo horquilla puesto que los cebadores madre no necesitan generar a repeticiones invertidas en el amplicon lo cual podrla afectar a ciertos tipos de sondas. Alternamente, el producto de amplificacion podrla detectarse utilizando mediciones al final del proceso, es decir, mediciones que ocurren despues de que la amplificacion del acido polinucleico haya sido completada.

[0068] La amplificacion del acido polinucleico tambien puede detectarse mediante otros metodos de deteccion utilizados en la deteccion de NAATs. Ejemplos adecuados incluyen, pero no se limitan a, detecciones mediante formaciones geneticas, tiras de flujos laterales, electroforesis, espectroscopla de masa y deteccion acustica.

[0069] En una seccion, el sistema reportador de Formaciones Bioluminiscentes en Tiempo Real (BART - Bioluminescent Assay in Real-Time) es utilizado para detectar la slntesis del acido polinucleico. Este sistema ha sido explicado en detalle en WO2004/062338 y WO2006/010948. BART es un ejemplo de un sistema reportador disenado para NAATs isotermicas que genera un tipo simple de senales de una muestra: una senal bioluminiscente. BART utiliza la deteccion que depende de la luciferasa de la luciernaga de pirofosfato inorganico: esto es producido en grandes cantidades cuando las secuencias 'objetivo' son amplificadas utilizando una NAAT. Como tal, el diagnostico molecular puede lograrse con BART simplemente al medir a la luz emitida de los tubos cerrados, en un ensayo de fase homogenea. BART ha demostrado con diferentes NAATs, el operar entre 50-63 °C. El reportador BART es un metodo particularmente efectivo para hacer seguimiento de la tasa de amplificacion de una NAAT puesto que la emision de luz representa a una medida de la tasa instantanea de amplificacion (mientras que, por ejemplo, las emisiones fluorescentes muestran la acumulacion de una senal y, por lo tanto, las mediciones deben diferenciarse para obtener las tasas de amplificacion). En forma de ejemplo, la figura 22 muestra que BART esta siendo utilizada en conjunto con el metodo LAMP para detectar una serie de diluciones de una molecula objetivo de ADN. Debe tomarse en cuenta que en la medida en que el monto de ADN objetivo en la muestra se reduce, la fase de latencia para alcanzar el tiempo de incremento maximo de luz (el cual es proporcional a la fase de latencia para alcanzar la amplificacion maxima) se incrementa. Puesto de otra forma, el tiempo necesario para alcanzar al pico caracterlstico de luz asociado con muestras positivas en BART se incrementa en una forma inversamente proporcional al monto del acido polinucleico objetivo en la muestra. Se enfatiza que mientras que los ejemplos utilizan al sistema reportador BART, este invento no se limita al uso de BART y es igualmente aplicable a metodos tales como metodos de

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medicion a traves de fluorescencia, turbidez, u otras tecnicas espectroscopicas o electro - qulmicas sin importar si estos metodos son utilizados para mediciones en tiempo real de la amplificacion o como mediciones al final del proceso.

[0070] Preferiblemente, el metodo del invento es realizado en contenedores vaclos. Esto es de gran utilidad puesto que reduce o incluso previene la posibilidad de que la muestra se contamine. Ademas, reduce o incluso previene la posibilidad de que el laboratorio se contamine. Esto es particularmente importante puesto que incluso si solo una copia del acido polinucleico plantilla o del amplicon en el laboratorio escapase, esto podrla contaminar potencialmente a otras muestras que esten siendo probadas y podrla generar resultados de falsos positivos. Por lo tanto, la capacidad de prevenir la contaminacion es de una importancia particular en los casos en que un metodo del invento es utilizado en una aplicacion de diagnostico.

[0071] Una aplicacion adicional de un metodo de acuerdo al invento es para determinar si una secuencia particular de acidos polinucleicos esta presente en un codigo genetico de un organismo. Por ejemplo, podrla usarse para determinar si el acido nucleico del cual se origina el acido nucleico plantilla ha sido modificado geneticamente, para deteccion de ADN asociado con una variedad especlfica, modificada en una forma no genetica, de plantas o de una planta modificada geneticamente, para la deteccion de ADN asociado con razas pedigrl de animales o para aplicaciones diagnosticas medicas o veterinarias tales como pruebas geneticas o para aplicaciones forenses. Los metodos de este invento tambien son adecuados para la deteccion de polimorfismos de nucleotidos individuales (SNPs - single-nucleotide polymorphisms).

[0072] Un metodo de acuerdo al invento podrla ser utilizado en aplicaciones de diagnostico. En particular, el metodo permite la identificacion y cuantificacion de organismos en un paciente y en otras muestras. El organismo podrla ser cualquier microorganismo, tal como virus, bacterias, micoplasmas y hongos. El microorganismo puede ser patogenico, pero tambien podrla ser un microorganismo no patogenico. El microorganismo podrla ser un organismo modificado geneticamente (GMO - genetically modified organism) ademas, los metodos de este invento pueden ser utilizados para identificar a vegetales y animales modificados geneticamente, para la deteccion de un estado de enfermedad; para la prediccion de una reaccion adversa de un producto de una terapia y tambien para la prediccion de una susceptibilidad para un estado de enfermedad.

[0073] El termino “muestra del paciente” se refiere a cualquier muestra tomada de un paciente y puede incluir a sangre, deposiciones, hisopos, esputo, lavado broncoalveolar, muestras de tejidos, orina y fluidos espinales. Otras muestras adecuadas de pacientes y metodos para extraerlos son conocidos para aquellas personas con conocimiento en la industria. Un “paciente” o “sujeto” del cual se toma la muestra podrla ser un animal humano o no humano. Cuando una muestra no es referida especlficamente como una muestra de pacientes, el termino tambien podrla comprender muestras tomadas de otras fuentes. Ejemplos incluyen hisopos de superficies, muestras de agua (por ejemplo, aguas residuales, aguamarina, agua de lago, agua para beber), muestras de comidas, productos cosmeticos, productos farmaceuticos, productos fermentados, cultivos celulares y de microorganismos y otras muestras en las cuales la deteccion de un microorganismo es deseable.

[0074] En un aspecto adicional, se facilita el uso de un botiquln para realizar un metodo de acuerdo al invento.

[0075] Preferiblemente dicho botiquln comprende a todos los componentes necesarios para practicar el metodo del invento, excepto el acido ploinucleico objetivo que debe ser probado, a menos que el acido polinucleico objetivo forme parte de un control positivo suministrado.

[0076] Un botiquln para su uso en un metodo de acuerdo al invento comprende preferiblemente a una polimerasa de acidos polinucleicos, el sustrato para la polimerasa del acido nucleico y cebadores adecuados para amplificaciones isotermicas del acido polinucleico objetivo, tal como fue descrito anteriormente. Mas preferiblemente, el botiquln comprende ademas reactivos amortiguadores, tales como una fuente de iones de magnesio, o aditivos conocidos en la industria por mejorar el rendimiento de una NAAT tal como la betalna o aditivos conocidos por mejorar la vida util de reactivos del botiquln tales como la trehalosa o aditivos conocidos por ayudar a preservar a reactivos tales como la azida de sodio. Alternamente, un botiquln para su uso en un metodo de acuerdo al invento podrla comprender unicamente algunos de estos componentes y/o componentes adicionales. La muestra y cualquier otro componente que haya sido omitido del botiquln podrla ser agregado entonces al botiquln durante su uso.

[0077] Cuando BART es utilizado para la deteccion de acidos polinucleicos, una luciferasa termoestable, luciferina y una enzima que convierte a pirofosfato inorganico (PPi) a ATP, tal como la sulfuirilasa de ATP, y cualquier otro sustrato o cofactor requerido de la enzima que convierta al PPi a ATP, tal como el fosfosulfato 5' de adenosina, podrla ser incluido en el botiquln. Por lo tanto, en una seccion, un botiquln para su uso con BART comprende a polimerasas de acidos nucleicos, b) por lo menos un cebador madre, c) por lo menos 2 cebadores reclprocos adecuados para amplificaciones isotermicas de la muestra de prueba, d) una luciferasa termoestable, e) luciferina, f) sulfurilasa de ATP, y g) fosfosulfato 5' de adenosina.

[0078] Preferiblemente, por lo menos uno de los componentes del botiquln es liofilizado o esta en otra forma que sea adecuada para el almacenamiento del botiquln. Mas preferiblemente, todos los componentes de botiquln estan

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General

[0079] El termino “aproximadamente” en relacion al valor numerico x es opcional y significa, por ejemplo, x ± 10%.

[0080] El termino “comprende” abarca a “incluyendo” as! como “que consiste de”, por ejemplo, una composicion “que comprende a” X podrla consistir exclusivamente de X o podrla incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y.

[0081] BART se refiere a un metodo para determinar el monto del acido polinucleico plantilla presente en una muestra donde la presencia de fosfato inorganico que se deriva de la reaccion de amplificacion es detectada e indica el monto del acido polinucleico plantilla en la muestra.

[0082] Varios aspectos y secciones de este invento seran descritos ahora en mayor detalle en forma de ejemplos. Se apreciara que modificaciones del detalle podrlan realizarse sin apartarse de la cobertura de las reivindicaciones.

DESCRIPCION DE FIGURAS

[0083]

La figura 1 muestra las 2 regiones, en un polinucleotido, requeridas generalmente para la amplificacion exponencial ya sea usando solo 2 cebadores (figura 1a) o algunos cebadores (figura 1b). En relacion a estas regiones, la region madre del polinucleotido, el sujeto de este invento, es definido en la figura 1c. La figura 1d muestra expllcitamente la region madre para las NAATs referidas en este documento como LAMP y TRA en amplicones esperados de primera generation formados por estos metodos; esto muestra que la region madre esta entre las regiones del amplicon involucrado en la formation de bucles intra-moleculares. Debe tomarse en cuenta que, en efecto, mientras que los metodos LAMP y TRA representan a su primera generacion en una forma diferente (en sus aplicaciones asociadas de patentes) las estructuras son de hecho identicas. La figura 1e muestra expllcitamente la region madre para las NAATs referidas en este documento como LAMP y TRA en la plantilla objetivo.

La figura 2 muestra varias formas por las cuales 1, 2 o mas cebadores madre pueden ser colocados en la region madre.

La figura 3 muestra la generacion de varios tipos de amplicones tal como se refieren en este documento, incluyendo la generacion de amplicones principales (figura 3a), amplicones de primera generacion (figura 3b) y amplicones de la siguiente generacion (figura 3c).

La figura 4 muestra el proceso por el cual LFPs pueden formar estructuras concatemericas. En la primera ocasion, se forma a un amplicon principal que tiene una repetition invertida en su extremo 5'(figura 4a), por lo tanto, la inspection de la figura 4a (ii) muestra que a partir del extremo 5' del amplicon principal, existe una region F1, y mas alla en el amplicon existe ahora, en la misma hebra, un complemento a esta region, F1c (la pequena c en esta y las siguientes figuras denotara al complemento de una region enlazadora de cebadores). Los mecanismos suministrados por una NAAT especlfica para elaborar al amplicon principal de una sola hebra y que esta disponible para ser copiado por otro cebador no son hechas expllcitamente en la figura 4a pero estan representadas por las 2 flechas negras que conllevan a la figura 4a (iii) donde se muestra al amplicon resultante de primera generacion. El amplicon de primera generacion formado por LFPs puede actuar, en si, como un cebador para generar amplicones adicionales. Al hacerlo de esa forma, se pueden formar estructuras concatemericas. Estos son 2 mecanismos generales por los cuales se pueden formar a los concatemeros, uno mediante un evento intra-molecular, tal como se mostro en la figura 4b, y, el otro, por un evento intra-molecular, tal como se muestra en la figura 4c. Debe tomarse en cuenta que, en ambos casos, el proceso genera regiones de una sola hebra de amplicones dentro del concatemero, refierase a la region F2 en las figuras 4b (ii) y (iii) y 4c (ii) y (iii). Estas pueden enlazarse a LFPs adicionales. Refierase a la figura 8 para los pasos subsiguientes.

La figura 5 muestra un proceso identico que en la figura 4 excepto que la repeticion invertida necesaria para la formacion de concatemeros ya es inherente en los cebadores tipo horquilla y no se requiere a una extension de hebras para la formacion tal como lo requerla los LFPs.

La Figura 6 muestra la naturaleza de varios cebadores mencionados en este documento. En la figura 6a se muestra a un “cebador simple” en el cual una mayorla sustancial o todo el cebador esta involucrado en el emparejamiento de bases de Watson-Crick con la plantilla de polinucleotidos. En la figura 6b se muestra como los LFPs difieren de los cebadores simples y que tienen una region 5' adicional que es sustancialmente identica a la region 3' en el lugar de enlaces para el extremo 3' de dicho cebador. Una consecuencia de esto es que la extension de este cebador genera a una repeticion invertida entre la region 5' del cebador y el producto de extension (refierase ademas a la figura 4a (ii)). En la figura 6c se muestran los cebadores tipo horquilla utilizados en el metodo SEA. La region 5' de estos cebadores contiene a una repeticion invertida de tal forma que se espera que la region 5' se pliegue en una estructura tipo horquilla. Se espera que la horquilla sea ajustada y que contenga muy pocos nucleotidos de una sola hebra y por lo tanto

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esta region de una sola hebra posiblemente no este disponible para enlazar a otro cebador. Sin embargo, si la horquilla es alargada para formar a un bucle sustancial tal como en la figura 6d, entonces el enlace de un cebador a este bucle serla posible.

La figura 7 muestra a un gel de agarosa coloreado con bromuro de etidio donde los resultados de 2 tecnologlas diferentes de amplificacion se muestran al ejecutarse lado a lado, siendo una la tecnologla LAMP y la otra la tecnologla TRA. Para el metodo LAMP la aplicacion usa cebadores de desplazamiento y LFPs (pero no cebadores tipo bucle). En el metodo TRA la aplicacion usa a los mismos LFPs tal con el metodo LAMP, pero sin ningun otro cebador presente.

Puede observarse facilmente que ambos metodos LAMP y TRA generan a amplicones concatemericos. Ademas, los tamanos de los amplicones son aparentemente identicos. Esto sugiere que los metodos TRA y LAMP comparten a un mecanismo en comun para la concatemerizacion.

Figura 8. El efecto de enlazar LFPs adicionales a los bucles que estos generaron previamente se muestra en la figura 8. La figura 8a muestra a LFPs que se enlazan a bucles formados a partir de auto-enlaces intra- moleculares del Amplicon de Primera Generation (o para amplicones de la siguiente generation), la figura 8b muestra a lo mismo para bucles formados inter-molecularmente. En ambos casos, la extension de los LFPs enlazados recientemente causa que la hebra opuesta se vuelva de una sola hebra (figura 8a (ii) y figura 8b (ii)). La figura 9 muestra como los cebadores madre pueden enlazarse a estas regiones. La figura 8c enfatiza que si una modification de un cebador tipo horquilla (figura 8c (i)) es hecha para suministrar a un bucle intrlnseco de una sola hebra que contiene a la misma secuencia que el extremo 3' del cebador (tal como se muestra en la figura 8c (ii)), entonces el Amplicon resultante de la Siguiente Generacion suministrara a un bucle de una sola hebra para enlazarse a un cebador tipo horquilla adicional (figura 8c (iii)).

Figura 9. Ya sea para la formation intra- (figura 9a (i)) o inter- figura 9a (ii)) molecular de Amplicones de la Siguiente Generacion, una region del vastago del amplicon es expuesta como de una sola hebra y esta disponible para enlaces de cebadores madre. Este tambien es el caso para el bucle reclproco que es formado por LFPs (es decir, la hebra reclproca del bucle mostrado en la figura 8a el cual tambien es generado), este bucle no puede enlazarse a un LFP puesto que esta en el mismo sentido que los LFPs, pero puede enlazarse a uno de los denominados 'cebadores tipo bucle' (figura 9b (i)) si fuese utilizado. La extension del cebador tipo bucle tambien vuelve a una region del vastago del amplicon en de una sola hebra y por lo tanto esta disponible para enlazarse a un cebador madre (figura 9b (ii)).

La figura 10 muestra como para el metodo SEA, la re-copia de Amplicones de la Siguiente Generacion por medio de la auto-extension de Amplicones, tambien facilita a una region del vastago de amplicones para enlazarse a un cebador madre.

La figura 11 muestra el incremento de tasa usando cebadores madre en el metodo TRA seguido por BART para 3 conjuntos diferentes de cebadores en un sistema de listeria monocytogenes. La ubicacion esquematica de LFPs y de cebadores madre es presentada en la figura 11 (i). Las figuras 11 (ii)-11 (iv) muestran a la comparacion BART de las tasas en la ausencia de cebadores madre (paneles izquierdos) con aquellos en la presencia de cebadores madre (paneles derechos) para conjuntos lentos, medios y rapidos de LFPs, correspondientemente. En cada grafico el primer pico representa un numero de copias mas alto (108) y el pico posterior, si es que existiese, representa 104 copias del objetivo. Ningun control de plantilla se muestra en un color gris claro.

La figura 12 resalta como el uso de cebadores madre en el metodo TRA en el sistema de listeria monocytogenes (figura 12a (i)) podrla ser separado en 3 procesos y permite la amplificacion, siendo uno de dichos metodos a TRA y los otros 2 ATRA (figura 12a (ii)). La comparacion BART de tasas para ambos metodos ATRA, TRA y una combination completa de los cebadores se muestra en la figura 12b (i)-(iv), respectivamente. En cada grafico el primer pico representa a un numero de copias mas alto (108) y el pico posterior, si existiese, representa a 104 copias del objetivo. Ningun control de plantilla se muestra en un color gris claro.

La figura 13 muestra modelos cineticos de BART en los casos en los que 3 reacciones diferentes de amplificacion son combinados. En la figura 13a, una NAAT rapida es combinada con 2 NAATs muy lentas. Puede observarse que la tasa general de amplificacion (es decir, la suma de las 3 tasas de reacciones de amplificacion) genera a un pico BART identico en tiempo al mas rapido de los 3 NAATs; la figura 13b es lo mismo que para la figura 13a excepto que una NAAT rapida es combinada con 2 NAATs ligeramente mas rapidas. En este caso la tasa general de amplificacion es afectada muy ligeramente y el pico BART ocurre unicamente unos pocos minutos antes; la figura 13c es tal como para las figuras 13a y b excepto que las NAATs denominadas mas lentas ahora son tan rapidas como la NAAT mas rapida: la tasa general combinada de amplificaciones es afectada aun, solamente en una forma ligera, y el pico BART ocurre solamente unos pocos minutos antes. La figura 13 refleja que cuando un numero de procesos exponenciales diferentes ocurren simultaneamente, no se observa un pico BART significativamente mas temprano, tal como se observa con la utilization de cebadores madre. Esto resalta el hecho que los cebadores madre actuan para incrementar fundamentalmente y significativamente la tasa intrlnseca de amplificacion cuando se los implementa con una NAAT especlfica en vez de agregar procesos separados mas lentos o de velocidad similar.

Figura 14. Para cada parte (a) a la (g) de la figura 14, la parte (i) de cada figura muestra, para plantillas de doble hebra, la posicion de los lugares enlazadores de cebadores para los cebadores utilizados por una variedad de NAATs. Los cebadores asociados con la region enlazadora reclproca hacia delante son

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denotados con una F y aquellos con la region enlazadora reclproca en reversa son denotados con R. La parte (ii) de cada figura muestra donde los varios cebadores utilizados por una NAAT especlfica se enlazan con las hebras respectivas; una ubicacion potencial para el enlace de cebadores madre tambien se muestra, pero la posicion exacta del cebador madre y el numero de cebadores madre utilizados puede variar significativamente tal como se detalla en la figura 2. La figura 14a muestra a cebadores madre que actuan en el metodo TRA; la figura 14b muestra a cebadores madre que actuan en el metodo LAMP; la figura 14c muestra a cebadores madre que actuan en una manifestation mejorada del metodo LAMP que tambien usa a cebadores tipo bucle; la figura 14d muestra a cebadores madre que actuan en el metodo SEA; la figura 14e muestra a cebadores madre que actuan en el metodo SMAP, la figura 14f muestra a cebadores madre que actuan en el metodo ATRA y la figura 14g muestra a cebadores madre que actuan en una version del metodo TRA con LFPs anidados.

La figura 15 muestra el efecto de anidar LFPs en la presencia y en la ausencia de cebadores madre en el metodo TRA en el sistema de Salmonella enteritidis.

La figura 15a suministra una comparacion del metodo TRA acelerado con cebadores madre (figura 15a (i)) con el metodo LAMP acelerado con cebadores madre (figura 15a (ii)) y el metodo TRA anidado acelerado con cebadores madre (figura 15a (iii)). En cada grafico el primer pico representa un numero mas alto de copias (108) y el pico posterior, si existiese, representa a 104 copias del objetivo. Ningun control de plantilla se muestra en color gris claro.

La figura 15b (i-iv) muestra una comparacion de las tasas BART para el metodo TRA con LFPs internos, LFPs externos, ambos LFPs internos y externos en la ausencia de cebadores madre y en la presencia de cebadores madre, respectivamente. En cada grafico, el primer pico representa un numero mas alto de copias (108) y el pico posterior, si existiese, representa a 104 copias del objetivo. Ningun control de plantilla se muestra en color gris claro.

La figura 16 muestra el incremento de tasa utilizando cebadores madre en el metodo LAMP seguido por BART en un sistema de listeria monocytogenes. Se presenta una ubicacion esquematica de todos los cebadores en la figura 16 (iii) y una comparacion BART de las tasas en la ausencia y en la presencia de cebadores madre tal como se muestra en la figura 16 (i) y en la figura 16 (ii), respectivamente. En cada grafico el primer pico representa un numero mas alto de copias (108) y el pico posterior representa a 104 copias del objetivo. Ningun control de plantilla se muestra en color gris claro.

La figura 17 muestra el incremento de tasa utilizando a los cebadores madre en el metodo TRA seguido por BART en un sistema de listeria monocytogenes donde los cebadores madre estan ubicados en regiones diferentes del vastago en comparacion de los ejemplos ya mencionados. La ubicacion esquematica de todos los cebadores es presentada en la figura 17 (iii) y una comparacion BART de las tasas en la ausencia y en la presencia de cebadores madre se muestra en la figura 17 (i) y en la figura 17 (ii), respectivamente. En cada grafico el primer pico representa un numero de copia mas alto (108) y el pico posterior representa a 104 copias del objetivo. Ningun control de plantilla se muestra en color gris claro.

La figura 18 muestra los niveles mas altos de libertad para el posicionamiento de un cebador madre en comparacion a un cebador tipo bucle en el metodo LAMP, por ejemplo. Los cebadores tipo bucle son limitados estrictamente a estar entre los lugares F1 y F2 o entre los lugares R1 y R2. Si la secuencia no le permitiese ubicar a uno o ambos cebadores tipo bucle eficientemente debido a que el bucle no es lo suficientemente largo o a que el cebador tipo bucle causara posiblemente amplificaciones no especlficas a traves de dlmeros cebadores, no quedarla otra alternativa que un diseno alterno de cebadores bucle. Los cebadores madre pueden ser ubicados en cualquier lugar en el vastago y pueden tener una orientation que les permita una amplia selection de disenos y optimizaciones posibles con la eficiencia mas alta mientras se evita cualquier dimerization no especlfica de cebadores.

La figura 19 muestra (i) una secuencia hipotetica de polinucleotidos en la cual lugares adecuados de enlace de cebadores se muestran como regiones con cuadros. Sin embargo, las regiones de color gris son lugares de enlace sustancialmente mas preferidos que las regiones de color blanco, tal vez debido a una mejor conservation secuencial en esta parte del genoma de un organismo (lo cual tiene importancia cuando se disenan nuevas diagnosis para, por ejemplo, un patogeno que tiene una variation secuencial significativa entre diferentes variedades). En la figura 19 (ii), y en relation al metodo LAMP tal como se utiliza con cebadores tipo bucle, las regiones diferentes son asignadas a los cebadores utilizados en esta manifestacion del metodo LAMP. Debe tomarse en cuenta que 4 de los cebadores deben estar ubicados en lugares de enlace no optimos y un lugar de enlace optimo no se utiliza en absoluto. Esto claramente no es ideal. Una alternativa serla ubicar a los cebadores tal como se muestra la figura 19 (iii), donde todos los lugares optimos ahora son utilizados. Sin embargo, en esta manifestacion los lugares R2 y R1 estan muy cerca entre si lo que significa que se pierde totalmente un lugar para el cebador R tipo bucle; los inventores tambien han observado que cuando los lugares R1 y R2 estan muy cerca entre si (o los lugares reclprocos F1 y F2) podrla ocurrir una amplification que no es optima, tal vez debido a un obstaculo esterico en el bucle formado. Los inventores han observado ademas que cebadores tipo bucle en general incrementan la tasa de amplificacion mas que los cebadores de desplazamiento. Consecuentemente, se espera la asignacion de cebadores en la figura 19 (iii) no sea particularmente ideal. Sin embargo, en la figura 19 (iv), al aplicar el uso de un cebador madre, todos los lugares optimos de enlace pueden ser utilizados y los sitios de los cebadores tipo bucle y de desplazamiento pueden ser utilizados. Por lo tanto, los cebadores madre incrementaron la flexibilidad del diseno de cebado.

La figura 20 muestra que, para los cebadores de desplazamiento, los cebadores tipo bucle y los cebadores

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madre, es posible utilizar varios tipos de cebadores aparte de los 'cebadores simples'. 3 de muchas combinaciones posibles se muestran en la figura 20 (i) a (iii) donde unicamente se muestran la region de enlace de cebadores reclprocos hacia adelante y la region madre. En (i) se utiliza una combination de LFPs, un cebador tipo horquilla y un cebador simple; en (ii) el cebador tipo bucle es representado por un cebador simple modificado que contiene una region de ARN o un lugar de division para una nickasa; en (iii) se muestra una combinacion adicional posible de LFP, cebador tipo horquilla y cebadores simples divisibles. Muchas otras posibles combinaciones son claramente evidentes.

La figura 21 muestra que la action de los cebadores madre genera unicamente a amplicones exponencialmente aplicables si actuan en un concatemero. A la izquierda de la figura 21, se muestra la accion del cebador madre en el Amplicon de Primera Generation: puede observarse que el amplicon resultante contiene unicamente a las regiones de enlace de cebadores reclprocos hacia atras y no en reversa que se requiere para una amplification exponencial. A la derecha de la figura 21, en contraste, una persona observa que cuando el cebador madre puede extenderse a traves de un concatemero, tal como es verdad para el cebador madre 2 mostrado, pero no es de esa forma para el cebador madre 1, el amplicon resultante tiene regiones de enlace de cebadores reclprocos hacia adelante y en reversa y por lo tanto es un sustrato para una amplificacion exponencial.

La figura 22 es un ejemplo de BART-NAAT tal como se muestra resaltando a la naturaleza cualitativa de la tecnica. La tecnologla BART representa un metodo efectivo para hacer seguimiento de la tasa de amplificacion en una NAAT puesto que los resultados bioluminiscentes reflejan la tasa instantanea de amplificacion.

La figura 23 muestra (i) una representation de parte de la cinta SCCmec asociada con MRSA. El elemento genetico movil SCCmec se integra a una region conservada en el gen OrfX del Staphylococcus aureus que transmite resistencia a la Meticilina antibiotica a traves del gen MecA. El gen MecA y el gen OrfX pueden variar altamente entre diferentes versiones de SCCmec (y por lo tanto diferentes variedades de MRSA). Consecuentemente, ha sido tecnicamente diflcil utilizar a los genes MecA y OrfX como regiones enlazadoras de cebadores reclprocos para una NAAT especlfica en un ensayo de diagnostico para MRSA. Por ejemplo, si los genes MecA y OrfX tienen una separation de mas de 500 parejas base, es diflcil que el metodo LAMP sea capaz de amplificar a ningun producto, si los genes MecA y OrfX, fuesen usados como lugares de enlace de cebadores reclprocos hacia adelante y en reversa (ii). Sin embargo, puesto que los cebadores madre mejoran dramaticamente la capacidad de las NAATs, tales como el metodo LAMP, para amplificar a objetivos y, puesto que el 'vastago' de un amplicon usando MecA y OrfX como lugares de enlace de cebadores reclprocos hacia adelante y en reversa podrlan ser usados como objetivos por algunos cebadores madre, y puesto que los cebadores madre han demostrado funcionar en una forma acoplada con los cebadores reclprocos hacia adelante y en reversa, los cebadores madre pueden, por lo tanto, permitir una orientation directa del MRSA usando una NAAT apropiada, tal como el metodo LAMP (iii). Una variedad de cebadores madre puede utilizarse para abordar las variaciones en la region entre los genes MecA y OrfX.

El uso de cebadores madres, tal como se ha descrito anteriormente, tiene el beneficio, en comparacion de tecnicas existentes que se basan unicamente en OrfX y las regiones del SCCmec aparte de MecA, para indicar la presencia de MRSA. Esto se debe a que algunos Staphylococcus aureus contienen una insertion SCCmec que no contiene al gen MecA y, por lo tanto, no son, realmente, MRSA. Puesto que este metodo requiere que ambos OrfX y MecA esten en la misma hebra de ADN, no existe la posibilidad de obtener un positivo falso a partir de las hebras que contienen a SCCmec pero que no contienen a el gen MecA.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Comparacion de los metodos LAMP y TRA que muestra que los amplicones resultantes son, en ambos casos, concatemeros aparentemente identicos.

[0084] Un fragmento de 2-kb del gen de invasion A de Salmonella enteritidis (un numero de copias que varla entre 108 y 102 por reaction) fue amplificado en LAMP-BART y TRA-BART a 60 °C en un sistema de equipos de toma de imagenes personalizado Lucy (Lumora) bajo condiciones identicas a aquellas en el ejemplo 2 con la exception de que se usaron 0.32 unidades/microlitro de polimerasa de ADN de Bst (NEB) y 11.2 microgramos/mililitro de luciferasa de luciernaga. La mezcla de la reaccion contenla a los cebadores R-LFP(6) y F-LFP(6) con 0.8 pM cada uno y cebadores de desplazamiento RD(2) y FD(2) con 0.2 pM. El volumen total de cada reaccion fue de 20 pl. Las regiones fueron ejecutadas durante 100 minutos.

Conjunto 6 de cebadores LFP (R-LFP se enlaza a R2c y F-LFP se enlaza a F2 en la secuencia objetivo).

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R-LFP(6) 5'-aac ctt gta gag cat att cgt ggt ttt ccg cca ttg gcg aat tta tg

F-LFP(6) 5'-tct ctt ggc gcc cac aat gtt ttt aag cga acg tgt ttc cg

Conjunto 2 de cebadores de desplazamiento (Rd se enlaza a R3c y FD se enlaza a F3 en la secuencia objetivo)

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RD(2) 5'- cat tac tgc tcg taa ttc

FD(2) 5'- ata tct gaa gtt ttg cag c

[0087] El patron en el gel no depende de la presencia/ausencia de los cebadores de desplazamiento RD y FD y se define unicamente por LFPs (figura 7). Ambas aplicaciones LAMP y TRA resultan en escaleras de exactamente el mismo patron indicando significativamente que ocurren a traves de un mecanismo similar. Los cebadores de desplazamiento podrlan tener una participacion significativa en la etapa de iniciacion de la amplification LAMP, pero no muestran ningun efecto en la etapa subsiguiente de propagation del amplicon.

Ejemplo 2

Efecto de cebadores madre en el metodo TRA con listeria monocytogenes conservadores del metodo LAMP con eficacias diferentes

[0088] El plasmido pLS que contiene a un fragmento del gen de internalina A de listeria monocytogenes fue purificado utilizando un botiquln QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) y fue amplificado utilizando a TRA-BART a 55 °C en un sistema de equipos de toma de imagenes personalizados Lucy (Lumora). La mezcla de la reaction contenla: 1, 2 o 3 cebadores R-LFP y 1, 2 o 3 cebadores F-LFP a 0.8 pM cada uno (lento, medio o rapido), 0.8 pM de cebadores madre R y 0.8 pM de cebadores madre F (Eurofins MWG), 0.8 mM de dNTPs (total) (Invitrogen), 0.16 U/ml de polimerasas de ADN de Bst (NEB), 0.1 mg/ml de luciferina (Europa Bioproducts), 0.25 mM de 5'-fosfosulfato de adenosina (Biolog), 5.6 mg/ml de luciferasa de luciernaga (UltraGlow, Promega), 0.375 U/ml de ATP-sulfurilasa (NEB) en 1x de amortiguador de Thermopol (NEB) con algunos estabilizadores y aditivos y un monto alto o bajo de plasmidos: 108 o 104. El volumen total de cada reaccion fue de 20 pl. Se ejecutaron pruebas durante 100 minutos. La orientation relativa de los cebadores en la plantilla objetivo se muestra en la figura 11 (i). Sin embargo, tal como puede observarse a partir de la secuencia a continuation, los cebadores usados realmente difieren significativamente en la secuencia de las regiones de enlace B2c y F2.

(Los R-LFPs se enlazan a R2c y los F-LFPs se enlazan a F2 en la secuencia objetivo)

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R-LFP(1)

F-LFP(1)

R-LFP(2)

F-LFP(2)

R-LFP(3)

F-LFP(3)

Madre(1)

MadreR(1)

Conjunto 1 de LFPs lentos

5'-cct tct ttt aca ggc tta gct ggt ttt tca aag aaa caa cca aag aag tgg 5'-gga att tca gta cgg ata aaa tgc cgt ttt att atc aaa cgt tgc tgt gta gc Conjunto 2 de LFPs medios

5'-cct tct ttt aca ggc tta gct ggt ttt atg cta agt ttc atg tgg acg 5'-gga att tca gta cgg ata aaa tgc cgt ttt gtt tga gat gtt gtt aca ccg tc Conjunto 3 de LFPs rapidos

5'-cct tct ttt aca ggc tta gct ggt ttt gga agc tgg gaa ttt att gag tg 5'-gga att tca gta cgg ata aaa tgc cgt ttt gcg cat ata aat cga tgt cat ttg Conjunto 1 de cebadores madre 5'-tca aac cac cca aca aat g 5'-aac cgg cgg aac taa at

[0090] En la presencia de cebadores madre la aplicacion ocurrio mucho mas rapido para cualquier conjunto de cebadores LFP o para cualquier monto objetivo presente. Para los conjuntos de cebadores LFPs lentos y medios (figura 11 (ii) y (iii) respectivamente) solo 108 copias del objetivo fueron detectables en la ausencia de cebadores madre teniendo picos a los 92 y 73 minutos respectivamente, mientras que en su presencia 108 copias tuvieron un pico a los 39 y 40 minutos y 104 fueron detectables tambien dentro del tiempo del ensayo con picos a los 55 y a los 62 minutos. En el caso del conjunto 3 de cebadores rapidos (figura 11 (iv)) ambos numeros altos y bajos de copias tuvieron picos a los 39 y a los 60 minutos, mientras que en la presencia de los cebadores madre estos fueron detectados mucho mas rapido con picos a los 22 y a los 24 minutos. El ejemplo demuestra que una aceleracion esencial de la amplificacion puede lograrse al agregar a cebadores madre a los conjuntos de cebadores LFP de diferentes eficiencias, longitudes, ubicaciones, Tms, riqueza de GC, tamano del bucle que se esta formando y otros parametros.

Ejemplo 3

Comparacion del metodo TRA simetrico, asimetrico y simetrico acelerado por medio de cebadores madre con listeria monocytogenes.

[0091] Los pLS-plasmidos que contienen a un fragmento de gen de internalina A de listeria monocytogenes (IlnA) fue amplificado a 55 °C en un sistema de equipos de toma de imagenes personalizados Lucy (Lumora) bajo condiciones identicas a aquellas del ejemplo 2 con un monto alto o bajo de plasmidos: 108 o 104 usando diferentes combinaciones

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de cebadores R-LFP(3), F-LFP(3), MadreB(1) y MadreF(1) con 0.8 |jM cada uno.

Conjunto 3 de cebadores LFP (los R-LFPs se enlazan a R2c y los F-LFPs se enlazan a F2 en la secuencia objetivo) R-LFP(3) 5'-cct tct ttt aca ggc tta gct ggt ttt gga agc tgg gaa ttt att gag tg

F-LFP(3) 5'-gga att tca gta cgg ata aaa tgc cgt ttt gcg cat ata aat cga tgt cat ttg

Conjunto 1 de cebadores madre MadreF(1) 5'-tca aac cac cca aca aat g MadreR(1) 5'-aac cgg cgg aac taa at

[0092] Ambas aplicaciones asimetricas fueron muy lentas y se detecto unicamente un numero alto de copias del objetivo InlA de listeria con picos a los 84 y a los 75 minutos, respectivamente. El metodo TRA simetrico el cual involucra al mismo conjunto de LFPs mostro tasas mas altas de amplificacion con picos a los 38 minutos para 108 copias y 56 minutos para 104 copias. Cuando los cebadores madre fueron agregados a la manifestation simetrica del metodo TRA, el numero alto de copias tuvo un pico a los 23 minutos y el numero bajo de copias tuvo un pico a los 34 minutos, demostrando, de esa forma, un incremento significativo en comparacion con las tasas observadas en su ausencia (figura 12b). La adicion simple de 3 tasas mas lentas no serla suficiente para explicar un incremento tan significativo en la tasa de amplificacion tal como se ha demostrado tambien mediante modelos matematicos (ejemplo 4).

Ejemplo 4

[0093] Curvas cineticas simuladas de BART fueron generadas en Microsoft Excel utilizando las formulas estandar de la curva de Richard para modelar procesos exponenciales (figura 13). Los elementos geneticos de amplificacion fueron modelados para procesos separados de amplificacion con diferentes elementos cineticos. El efecto de combinar a procesos separados de amplificacion de elementos cineticos diferentes, similares o identicos, tambien se muestra en la figura 13. Puede observarse a partir de una comparacion de las figuras 13a, b y c, que el efecto general de combinar a procesos separados y distintos de amplificacion en la tasa general de amplificacion es sorpresivamente pequeno, aun cuando 3 procesos rapidos de amplificacion son combinados (figura 13c). Esto enfatiza que el efecto de los cebadores madre incrementa fundamentalmente la tasa de amplificacion en vez de simplemente sumar los procesos adicionales de amplificacion.

Ejemplo 5

(A) Comparacion del efecto de cebadores de desplazamiento y de cebadores externos que forman bucles en el metodo TRA acelerado con celulas madre de listeria monocytogenes

[0094] pLS-plasmidos que contienen un fragmento del gen InlA de listeria monocytogenes fue amplificado en LAMP- BART a 55 °C en un sistema de equipos de toma de imagenes personalizado Lucy (Lumora) bajo condiciones identicas a aquellas en el ejemplo 2 con un monto alto o bajo de plasmidos: 108 o 104. El volumen total de cada reaction fue de 20 pl. Pruebas fueron ejecutadas durante 100 minutos. Se realizo una comparacion entre las reacciones que contenlan a R-LFP(3), F-LFP(3), MadreF(1) y MadreR(1) a 0.8 jM cada uno y agregandose a ExternoR(1) y ExternoF(1) o R-LFP(7) externo y F-LFP(7) externo a 0.8 jM cada uno.

Conjunto 3 de cebadores LFP

R-LFP(3) 5'-cct tct ttt aca ggc tta gct ggt ttt gga agc tgg gaa ttt att gag tg

F-LFP(3) 5'-gga att tca gta cgg ata aaa tgc cgt ttt gcg cat ata aat cga tgt cat ttg

Conjunto 1 de cebadores madre MadreF(1) 5'-tca aac cac cca aca aat g

MadreR(1) 5'-aac cgg cgg aac taa at

Conjunto 1 de cebadores desplazamiento RD(1) 5'-taa tgc taa gtt tca tgt g FD(1) 5'-ata atc tac tgt ttg aga tg conjunto 7 de cebadores LFP externos R-LFP(7) 5'-ctt ctt tgg ttg ttt ctt tgc ctt ttt gct aag ttt cat gtg gac

F-LFP(7) 5'-gta tta aca gct aca cag caa cgt ttt gag atg ttg tta cac cgt c

[0095] El metodo TRA acelerado con cebadores madre en este ejemplo resulta en una amplificacion rapida del gen InlA con 108 y 104 numero de copias con picos a los 23 y a los 35 minutos, respectivamente. La adicion de 2 conjuntos diferentes de cebadores de externos redujo los tiempos de los picos para los numeros alto y bajo de copias a 18 y 31 minutos, respectivamente (figura 15a). Cuando los cebadores desplazamiento son reemplazados por LFPs, la reaccion de amplificacion sucede mas rapido (figura 15a (iii)).

(B) El metodo de TRA anidado de Salmonella enteritidis acelerado con cebadores madre

[0096] pLS-plasmidos que contenlan un fragmento del gen de invasion A (InvA) de Salmonella enteritidis fueron

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purificados utilizando un botiquln QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) y fueron amplificados en TRA-BART a 55 °C utilizando el sistema de equipos de toma de imagenes personalizado Lucy (Lumora). La mezcla de la reaccion contenla: LFPs en reversa y hacia adelante internos y/o externos tal como se indica mas adelante con 0.8 pM cada uno, 0.8 pM de cebadores MadreB y 0.8 pM de cebadores MadreF (Eurofins MWG), 1.6 mM de dNTps (total) (Invitrogen), 0.16 U/ml de polimerasas de ADN de Bst (NEB), 0.1 mg/ml de luciferina (Europa Bioproducts), 0.25 mM de 5'-fosfosulfato de adenosina (Biolog), 5.6 microgramos/microlitro de luciferasa de luciernaga (Ultra Glow, Promega), 0.375 U/ml de ATP-sulfurilsa (NEB) en 1x de amortiguador de Thermopol (NEB) con algunos estabilizadores y aditivos y un monto alto o bajo de plasmidos: 108 o 104. El volumen total de cada reaccion fue de 20 pl. Se ejecutaron pruebas durante 100 minutos.

Conjunto 4 de cebadores LFP internos R-LFP(4) 5'-gga gca atg gcg cgt tat att tgt ttt cgc cat tgg cga att tat g

F-LFP(4) 5'-cac aat gcg agc gct tcc ttt tta agc gaa cgt gtt tcc g

Conjunto 5 de cebadores LFP externos R-LFP(5) 5'-cga att acg agc agt aat ggt ttt tca tcc tca act tca gca g

F-LFP(5) 5'-caa acg ctg caa aac ttc agt ttt tta aag aag tgc tca gac atg

Conjunto 2 de cebadores madre MadreF(2) 5'-cct tgt gga gca tat tcg MadreB(2) 5'-gac atc ttt ttc tct tgg cg

[0097] En este Sistema TRA de InvA de Salmonella enteritidis ambos conjuntos de LFPs utilizados individualmente fueron tan lentos que no pudieron detectar ni siquiera el numero mas alto de copias objetivo 108 en los 100 minutos del ensayo. En el metodo TRA anidado en la ausencia de cebadores madre, la amplificacion fue lo suficientemente rapida como para detectar unicamente el numero alto de copias objetivo que tuvo un pico a los 68 minutos. Cuando los cebadores madre fueron agregados hubo un incremento en la velocidad y las copias objetivo altas y bajas se volvieron detectables con picos a los 34 y 61 minutos respectivamente (figura 15). Este ejemplo demuestra que se observo una aceleracion de amplificacion con los cebadores madre para objetivos diferentes y para manifestaciones diferentes de LFPs.

Ejemplo 6

Metodo LAMP de listeria monocytogenes acelerado con cebadores madre

[0098] pLS-plasmidos que contenlan un fragmento del gen de Internalina A de listeria monocytogenes se amplifico en LAMP-BART a 55 °C en un sistema de equipos de toma imagenes personalizado Lucy (Lumora) bajo condiciones identicas a aquellas del ejemplo 2 con un monto alto o bajo de plasmidos: 108 o 104. El volumen total de cada reaccion fue de 20 pl. Las pruebas fueron ejecutadas durante 100 minutos. Se realizo una comparacion entre las reacciones que contienen a cebadores de LAMP completos (0.8 pM de cada LFP, 0.4 pM de cada cebador tipo bucle, 0.2 pM de cada cebador de desplazamiento y una adicion de 0.8 pM de cada cebador MadreR y 0.8 pM de cada cebador madre).

Conjunto 1 de cebadores LFP

R-LFP(1) 5'-cct tct ttt aca ggc tta gct ggt ttt tca aag aaa caa cca aag aag tgg

F-LFP(1) 5'-gga att tca gta cgg ata aaa tgc cgt ttt att atc aaa cgt tgc tgt gta gc

Cebadores tipo bucle

BucleRc 5'-cag tca ata aat tcc cag c

BucleF 5'-cat cga ttt ata tgc gca at Conjunto 1 de cebadores de desplazamiento RD(1) 5'-taa tgc taa gtt tca tgt g FD(1) 5'-ata atc tac tgt ttg aga tg Conjunto 1 de cebadores madre MadreR(1) 5'-tca aac cac cca aca aat g MadreR(1) 5'-aac cgg cgg aac taa at

[0099] Este es un ejemplo de la amplificacion LAMP la cual detecto muy rapidamente un numero alto y bajo de copias del objetivo InlA de listeria monocytogenes. En la ausencia de cebadores madre, 108 copias tuvieron un pico a los 17 minutos y 104 copias tuvieron un pico a los 26 minutos. La adicion de cebadores madre acelero la reaccion aun mas y redujo el tiempo de los picos a 13 minutos para las 108 copias y 19 minutos para las 104 copias (figura 16). En este caso la aceleracion se logro en el metodo LAMP, que es uno de los sistemas de amplificacion isotermicos mas eficientes desarrollados hasta ahora. La reduccion del tiempo de deteccion es de una importancia enorme para aplicaciones en el punto de uso, en general, y en particular, para pruebas en el punto de cuidado de diagnostico medico.

Ejemplo 7

Metodo TRA acelerado de listeria monocytogenes con una orientacion diferente de los cebadores madre

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0100] pLS-plasmidos que contenlan a un fragmento del gen de internalina A de listeria monocytogenes fue amplificado en TRA-BART a 55 °C en un sistema de equipos de toma de imagenes personalizado Lucy (Lumora) bajo condiciones identicas a aquellas en el ejemplo 2 con un monto alto o bajo de plasmidos: 108 o 104. La comparacion fue hecha entre las reacciones ejecutadas con los cebadores R-LFP(3) y F-LFP(3) unicamente en la ausencia y presencia de los cebadores MadreR(3) y MadreF(3) agregados a 0.8 pM cada uno.

Conjunto 3 de cebadores LFP

R-LFP(3) 5'-cct tct ttt aca ggc tta gct ggt ttt gga agc tgg gaa ttt att gag tg

F-LFP(3) 5'-gga att tca gta cgg ata aaa tgc cgt ttt gcg cat ata aat cga tgt cat ttg

Conjunto 3 de cebadores madre MadreF(3) 5'-agt tcc gcc ggt ttg

MadreR(3) 5'-aca ttt gtt ggg tgg ttt g

[0101] En este ejemplo se demostro el efecto acelerador de los cebadores madre de ubicacion diferente en el vastago del amplicon en comparacion a aquella mostrada en el ejemplo 2. TRA-BART detecto a las copias objetivo altas y bajas incluso en la ausencia de los cebadores madre con tiempos de pico a los 39 y 69 minutos respectivamente. La adicion de cebadores madre acelero significativamente la reaccion y redujo el tiempo de los picos a 22 y a 79 minutos. En contraste con los cebadores tipo bucle, cuando la ubicacion es dictada estrictamente por los bucles que se forman por los LFPs y la orientacion es fijada, los cebadores madre pueden ser ubicados en cualquier lugar entre las regiones internas F1-B1 y pueden estar orientadas en cualquier direccion. El efecto de aceleracion es observado independientemente de la posicion u orientacion de los cebadores madre (figura 17).

SECUENCIAS

Fragmento del gen IlnA de listeria (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 1)

[0102]

GGCAATrrnfAATGCTAAGn^reATOl’GGACGGCAAAGAAACAACCAAAGA

agtggaagctgggaatttattgactgaaccagctaagcctgtaaaagaagg

rrATACATTTGTTGGGTGGTTTGAtGCceAAACCGGCGGAACTAAAKlGAAT TTCAGTACGGATA AAATGCCGACA AATGACATCGATTTATATGCGCAAr IT A OTTATT A ACACCTAC AC A C 5CAACGTTTG ATA ATG ACGGTGTA ACA A C ATCTC A AACAGT AGA IT Alt’A

Fragmento genetico de InvA de la salmonella (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 2)

[0103]

TTTGCGAATAACATCCTCAACTTCAGCAGATACCATTACTGCTCGTAATTCGC CGCCATTGGCGAATTTATGACAAATATA ACGCGCCATTGCTCGACGAATATG CTCCACAAGGTTAATGA C ATdTTTT CT CTT GGCGCCC ACA ATCCGAGCGCTT CCATAATTAACTTCATA n'ACGCACGGAAACACGITCGCTTAACAAACGCTG CAAAACrn'CAGATATACGTTGTACCGTCpGCATGTCTGAGCACTTCTTTAAGT A A ATC AGGA AA TTT CGCTTCC: AGTTGGTCC AGCA TATGTJTtGT ITCCTGAA' I ACC

LISTAS DE SECUENCIAS

[0104]

<110> LUMORA LTD TISI, Laurence Carlo GANDELMANN, Olga KIDDLE, Guy

MCELGUNN, Cathal Joseph <120> AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS <130> P053146WO <140> PCT/GB2010/.....

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<141 > 2010-06-15 <150> GB0910302.9 <151 > 2009-06-15 <160> 44

<170> Seqwin99, version 1.02 <210> 1 <211> 273 <212> ADN

<213> Listeria monocytogenes <400> 1

ggcoattitt tgggaat tea gtttqatgcc tgacatcgat cggtgtaaca

aatqctaaqt

ttgactgfcic

caaactqgeti

Liacaigcgc

acatotcaaa

ttfdtrjtgga

cagctaagcc

gaactaaatg

aatttagtat

caytagatia

tygcaaigaa

tgtaaaagaa

yajULtcagl

taacagctac

tea

acaaccaaag

qqrtai&tat

acggiiaaaa

atageaacgt

aagtggaagc ttgctggotg tgccgacaaa tttidtaa tgj

<210>2 <211> 318 <212> ADN

<213> Salmonella enteritidis

<400>2

tttgegaata acatcctcaa ettcageaga tateaitact gctcgiaait cgccgccatt gqcqaattta tgd(.aaatai aacgcgccat tgctccacga atatyrtcca taaqquaat gacaictutt tetcttggcg cccar aatqt gagcjcttcc alaatiaaci neatattaeg [.qL.qqaiaLd cqtt.cgcEia a caara ege tg enaaaettea gatataegtt qtateqtqgt atgtctgagc acttctttaa gtaaatragq aaat.ttLgei. iccagttggt ccagcatatg

ttttgttrcc tgaatace

frO

120

]50

240

273

bU 120 JS0 240 300 3 IS

<210>3 <211> 47 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 3

aaccttgtag agcatattcg tggttttccg ccattggcga atttatg 47 <210> 4 <211> 41 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 4

tctcttggcg cccacaatgt ttttaagcga acgtgtttcc g 41 <210> 5 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 5

cattactgct cgtaattc 18 <210> 6 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 6

atatctgaag ttttgcagc 19 <210> 7 <211> 51 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 7

ccttctttta caggcttagc tggtttttca aagaaacaac caaagaagtg g 51

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210>8 <211> 53 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 8

ggaatttcag tacggataaa atgccgtttt attatcaaac gttgctgtgt agc 53 <210>9 <211> 48 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 9

ccttctttta caggcttagc tggttttatg ctaagtttca tgtggacg 48 <210> 10 <211> 53 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 10

ggaatttcag tacggataaa atgccgtttt gtttgagatg ttgttacacc gtc 53 <210> 11 <211> 50 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 11

ccttctttta caggcttagc tggttttgga agctgggaat ttattgagtg 50 <210> 12 <211 > 54 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 12

ggaatttcag tacggataaa atgccgtttt gcgcatataa atcgatgtca tttg 54 <210> 13 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 13

tcaaaccacc caacaaatg 19 <210> 14 <211> 17 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 14

aaccggcgga actaaat 17 <210> 15 <211> 50 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 15

ccttctttta caggcttagc tggttttgga agctgggaat ttattgagtg 50 <210> 16 <211> 54

5

10

15

20

25

30

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40

45

50

55

60

65

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 16

ggaatttcag tacggataaa atgccgtttt gcgcatataa atcgatgtca tttg 54 <210> 17 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 17

tcaaaccacc caacaaatg 19 <210> 18 <211> 17 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 18

aaccggcgga actaaat 17 <210> 19 <211> 50 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 19

ccttctttta caggcttagc tggttttgga agctgggaat ttattgagtg 50 <210> 20 <211 > 54 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 20

ggaatttcag tacggataaa atgccgtttt gcgcatataa atcgatgtca tttg 54 <210> 21 <211 > 19 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 21

tcaaaccacc caacaaatg 19 <210> 22 <211 > 17 <212> ADN

<213> Secuencia de cebadores <400> 22

aaccggcgga actaaat 17 <210> 23 <211 > 19 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 23

taatgctaag tttcatgtg 19 <210> 24 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 24

ataatctact gtttgagatg 20 <210> 25 <211> 45 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 25

cttctttggt tgtttctttg cctttttgct aagtttcatg tggac 45 <210> 26 <211> 46 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 26

gtattaacag ctacacagca acgttttgag atgttgttac accgtc 46 <210> 27 <211> 46 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 27

ggagcaatgg cgcgttatat ttgttttcgc cattggcgaa tttatg 46 <210> 28 <211> 40 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 28

cacaatgcga gcgcttcctt tttaagcgaa cgtgtttccg 40 <210> 29 <211> 43 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 29

cgaattacga gcagtaatgg tttttcatcc tcaacttcag cag 43 <210> 30 <211> 45 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 30

caaacgctgc aaaacttcag ttttttaaag aagtgctcag acatg 45 <210> 31 <211 > 18 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 31

ccttgtggag catattcg 18 <210> 32 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 32

gacatctttt tctcttggcg 20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 33 <211> 51 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 33

ccttctttta caggcttagc tggtttttca aagaaacaac caaagaagtg g 51 <210> 34 <211> 53 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 34

ggaatttcag tacggataaa atgccgtttt attatcaaac gttgctgtgt agc 53 <210> 35 <211 > 19 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 35

cagtcaataa attcccagc 19 <210> 36 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 36

catcgattta tatgcgcaat 20 <210> 37 <211 > 19 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 37

taatgctaag tttcatgtg 19 <210> 38 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 38

ataatctact gtttgagatg 20 <210> 39 <211 > 19 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 39

tcaaaccacc caacaaatg 19 <210> 40 <211 > 17 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 40

aaccggcgga actaaat 17 <210> 41 <211> 50

5

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 41

ccttctttta caggcttagc tggttttgga agctgggaat ttattgagtg 50 <210> 42 <211 > 54 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 42

ggaatttcag tacggataaa atgccgtttt gcgcatataa atcgatgtca tttg 54 <210> 43 <211 > 15 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 43

agttccgccg gtttg 15 <210> 44 <211 > 19 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de cebadores <400> 44

acatttgttg ggtggtttg 19

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

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   30

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   40

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   55

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   65

   Reivindicaciones

   1. Un metodo para sintetizar a un acido polinucleico donde dicho metodo comprende los pasos de

   a) Suministrar a una plantilla objetivo que comprende de por lo menos una primera y una 2a

   regiones de enlace de cebadores reclprocos;

   b) Suministrar a un primer cebador que tiene a un primer y 2° segmentos, donde el primer

   segmento es sustancialmente complementario a la primera region de enlace de cebadores

   reclprocos en la plantilla y el 2° segmento tiene una secuencia que es sustancialmente complementaria a otra region en el primer cebador o a una region en el amplicon generado a partir del primer segmento del primer cebador de tal forma que el 2° segmento es capaz de formar un bucle, donde, cuando el primer cebador comprende a un 2° segmento que es sustancialmente complementario a una region en el amplicon generado a partir del primer segmento del primer cebador, la primera region de enlace de cebadores reclprocos tambien abarca a la region en la plantilla que es sustancialmente identica al 2° segmento del primer cebador;

   c) Suministrar un 2° cebador que comprende a un primer y opcionalmente a un 2° segmentos, donde el primer segmento es sustancialmente complementario a la 2a region de enlace de cebadores reclprocos en la plantilla y el 2° segmento opcional comprende a una secuencia que es sustancialmente complementaria a otra region en el 2° cebador o a una region en el amplicon generado a partir del primer segmento del 2° cebador de tal forma que la 2a region esta disponible para formar a un bucle, donde, cuando el 2° cebador comprende a un 2° segmento que es sustancialmente complementario a una region en el amplicon generado a partir del primer segmento del 2° cebador, la 2a region de enlace de cebadores reclprocos tambien abarca a la region en la plantilla que es sustancialmente identica al 2° segmento del 2° cebador;

   d) Suministrar por lo menos un cebador madre que sea capaz de enlazarse a la region entre la primera y la 2a regiones de enlace de cebadores reclprocos, donde dichas cebador es

   (i) Un cebador simple, que es complementario a un lugar de enlace de cebadores en un acido polinucleico y que contiene menos de 5 nucleotidos 3' o 5' de la region de cebadores que es sustancialmente complementario al lugar de enlaces de cebadores;

   (ii) Un cebador que forma bucles, que comprende a un primer y a un 2° segmentos, donde el primer segmento es sustancialmente complementario a una region de enlace de cebadores en la plantilla y el 2° segmento comprende a una secuencia que es sustancialmente complementaria a una region en el amplicon generado a partir del primer segmento del primer cebador de tal forma que el 2° segmento puede formar a un bucle;

   (iii) Un cebador tipo horquilla, que es un cebador que comprende a un primer y a un 2° segmentos, donde el primer segmento es sustancialmente complementario a una region de enlace de cebadores en una plantilla y el 2° segmento comprende a una secuencia que es sustancialmente complementaria a otra region en el cebador;

   (iv) Un cebador suministrador de bucles, que es un cebador tipo horquilla en el cual las repeticiones invertidas son separadas por una region enlazadora; o

   (v) Un cebador quimerico;

   e) Suministrar los reactivos y condiciones necesarias para realizar la slntesis del acido polinucleico;

   f) Realizar la slntesis del acido polinucleico.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, donde la slntesis es realizada utilizando a una tecnica de amplificacion de acidos nucleicos seleccionada de un grupo que consiste de la Amplificacion Isotermica Mediada por Bucles (LAMP - Loop-mediated Isothermal Amplification), la Amplificacion de Re-cebado de Plantillas (TRA - Template Re-priming Amplification), la Amplificacion de Auto Extenciones (SEA - Self Extending Amplification) y el Proceso de Amplificacion Inteligente (SMAP - SMart Amplification Process).

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   65
3. 3. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde las regiones de enlace de cebadores reclprocos hacia adelante y/o en reversa comprende a lugares de enlace para 2 o mas cebadores, y opcionalmente, por el cual los 2 o mas lugares de enlace estan situados en la misma hebra de la plantilla objetivo y/o del amplicon, o estan situados en diferentes hebras de la plantilla objetivo y/o del amplicon.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 3 donde los 2 o mas cebadores que se enlazan a las regiones de enlace de cebadores reclprocos hacia adelante y/o en reversa son:

   (a) Del mismo tipo, donde opcionalmente los 2 o mas cebadores son cebadores que forman bucles; o

   (b) De diferente tipo.
5. 5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde:

   (a) Los cebadores que se enlazan a las regiones de enlace de cebadores reclprocos hacia adelante y/o en reversa son cebadores que suministran bucles (LPPs - loop-providing primers); y/o

   (b) Los lugares de enlace de cebadores hacia adelante y en reversa estan ubicados a una distancia tal que la slntesis de un acido polinucleico puede ocurrir unicamente en la presencia de los cebadores madre.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 5 (b), donde el metodo es utilizado para detectar Staphylococcus aureus resistente a la Meticilina (MRSA - Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) en una muestra, por ejemplo, donde el MRSA es detectado utilizando a un gen mecA y a la secuencia orfX.
7. 7. El metodo de las reivindicaciones 1-6, donde en el paso (d):

   (i) Un solo cebador madre es utilizado, o

   (ii) 2 o mas cebadores madre son utilizados los cuales opcionalmente son del mismo tipo o son de diferente tipo.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 7 (ii) donde los 2 o mas cebadores madre son utilizados en el paso (d) y se enlazan con hebras reclprocas del amplicon o a la misma hebra del amplicon.
9. 9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde los cebadores madre:

   (a) Contienen bases modificadas, por ejemplo, bases modificadas que son seleccionados de un grupo que consiste de N4-metilcitosina, inosina, ribonucleotidos, bases fluorescentes, bases que pueden foto-lisarse y bases universales; y/o

   (b) Contienen acidos nucleicos que han sido marcados con una partlcula detectable, por ejemplo, una marcacion fluorescente, una marcacion quimioluminiscente o una marcacion electroqulmica; y/o

   (c) Contienen acidos nucleicos que han sido marcados con una partlcula de captura, por ejemplo, biotina; y/o

   (d) Son cebadores que contienen un lugar de nickasa.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 9 (b), donde los cebadores madre marcados son utilizados como sondas en un sistema reportador fluorescente, quimioluminiscente o electroqulmico.
11. 11. El metodo de las reivindicaciones 1-10 donde:

    (a) La amplificacion del acido polinucleico es detectada mediante un metodo seleccionado de un grupo que consiste de formaciones geneticas, tiras de flujos laterales, electroforesis, espectroscoplas de masa y detection acustica; o

    (b) La slntesis del acido nucleico es detectada utilizando mediciones en tiempo real o mediciones al final del proceso.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 11 (b) donde la amplificacion del acido polinucleico es detectada con un

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    60

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    sistema de deteccion seleccionado de un grupo que consiste de mediciones de fluorescencia, bioluminiscencia, turbidez o mediciones electroqulmicas, por ejemplo, cuando la slntesis del acido nucleico es detectada utilizando un sistema reportador de Ensayos Bioluminiscentes en Tiempo Real (BART - Bioluminescent Assay in Real-Time).
13. 13. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores:

    (a) Donde el metodo es realizado en un contenedor sellado; o

    (b) Para determinar la presencia de una secuencia de acidos polinucleicos especlfica en el codigo genetico de un organismo; o

    (c) Para la deteccion de polimorfismos de un solo nucleotido (SNPs - single-nucleotide polymorphisms);

    (d) Para su uso en aplicaciones de diagnostico; o

    (e) Para su uso en la deteccion o cuantificacion de un organismo en una muestra; o

    (f) Para identificar vegetales modificados geneticamente, para identificar animales modificados geneticamente, para detectar a un estado de enfermedad, para predecir una reaccion adversa causada por terapias o para predecir una susceptibilidad a un estado de enfermedad.
14. 14. El metodo de la reivindicacion 13 (d), donde el organismo es:

    (a) Un microorganismo; y/o

    (b) Un microorganismo seleccionado de un grupo que consiste de virus, bacterias, micoplasmas y hongos; y/o

    (c) Donde el microorganismo es opcionalmente un organismo modificado geneticamente (GMO - genetically modified organism).
15. 15. El uso de un botiquln realizando el metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el botiquln comprende a por lo menos un cebador madre y donde el botiquln comprende opcionalmente ademas a una luciferasa termoestable, luciferina y una enzima que convierte al pirofosfato inorganico (PPi - inorganic pyrophosphate) a ATP y cualquier otro sustrato o cofactor requerido de la enzima que convierte al pirofosfato inorganico (PPi - inorganic pyrophosphate) a ATP.