JP6106732B2 - ステム加速等温核酸増幅技術 - Google Patents
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Description
本発明は、ポリ核酸の改善された増幅方法を提供する。したがって、一実施形態では、本発明は、ポリ核酸を合成する方法であって、
a)少なくとも第1および第2の相互(reciprocal)プライマー結合領域を含む標的鋳型を提供する工程、
b)第1および第2のセグメントを含む第1のプライマーを提供する工程であって、第1のセグメントが鋳型上の第1の相互プライマー結合領域と実質的に相補的であり、第2のセグメントがループを形成することができるように、第2のセグメントが、第1のプライマーの別の領域または第1のプライマーの第1のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含む、工程、
c)第1のセグメントを含み第2のセグメントを含んでもよい第2のプライマーを提供する工程であって、第1のセグメントが鋳型上の第2のプライマー結合領域に実質的に相補的であり、第2の領域がループを形成することができるように、含まれてもよい第2のセグメントが第2のプライマー中の別の領域または第2のプライマーの第1のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含む、工程、
d)第1および第2の相互プライマー結合領域の間の領域に結合することができる少なくとも1個のプライマーを提供する工程、
e)ポリ核酸の合成を実施するために必要な試薬および条件を提供する工程、
f)ポリ核酸の合成を実施する工程
を含む方法を提供する。
数字の値xに関して「約」という用語は任意で、例えば、x±10%を意味する。
得られたアンプリコンがいずれもコンカテマーで、見かけ上同一であることを示すLAMPとTRAの比較
サルモネラ・エンテリティディス侵入性A遺伝子の2kb断片は(コピー数は反応によって108から102の間で変化した)、特注の画像処理ハードウェアシステムであるLucy(Lumora)によって、LAMP−BARTおよびTRA−BARTにおいてBst DNAポリメラーゼ(NEB)0.32U/μlおよびホタルルシフェラーゼ11.2μg/μlを使用すること以外は実施例2と同一の条件下で60℃で増幅した。反応混合物は、R−LFP(6)およびF−LFP(6)プライマーそれぞれ0.8μMおよび置換プライマーRD(2)およびFD(2)0.2μMを含有した。各反応の全量は20μlであった。反応は100分行った。
R−LFP(6) 5’−aac ctt gta gag cat att cgt ggt ttt ccg cca ttg gcg aat tta tg
F−LFP(6) 5’−tct ctt ggc gcc cac aat gtt ttt aag cga acg tgt ttc cg
置換プライマーセット2(RDは標的配列上のR3cに結合し、FDはF3に結合する)
RD(2) 5’−cat tac tgc tcg taa ttc
FD(2) 5’−ata tct gaa gtt ttg cag c
異なる効果のLampプライマーとステムプライマーのリステリア・モノサイトゲネスTRAに対する効果
リステリア・モノサイトゲネスインターナリン(internalin)A遺伝子の断片を含有するpLS−プラスミドは、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)を使用して精製し、特注の画像処理ハードウェアシステムであるLucy(Lumora)によってTRA-BARTを55℃で使用して増幅した。反応混合物は以下を含有した。数種の安定化剤および添加物および多量または少量のプラスミド、108または104を含む1×Thermopol緩衝液(NEB)中の、R−LFP、1、2もしくは3およびF−LFP1、2または3プライマーそれぞれ0.8μM(遅い、中程度または速い)、ステムRプライマー0.8μMおよびステムFプライマー0.8μM(Eurofins MWG)、dNTP(合計)0.8mM(Invitrogen)、Bst DNAポリメラーゼ0.16U/μl(NEB)、ルシフェリン0.1mg/ml(Europa Bioproducts)、アデノシン5’−ホスホスルフェート0.25mM(Biolog)、ホタルルシフェラーゼ5.6μg/μl(UltraGlow、Promega)、ATP-スルフリラーゼ0.375U/ml(NEB)。各反応の全量は20μlであった。試験は100分行った。標的鋳型に対するプライマーの相対的方向を図11(i)に示すが、以下に挙げた配列から分かるように、実際に使用したプライマーは、B2cおよびF2結合領域の配列が大きく異なる。
遅いLFPセット1
R−LFP(1) 5’−cct tct ttt aca ggc tta gct ggt ttt tca aag aaa caa cca aag aag tgg
F−LFP(1) 5’−gga att tca gta cgg ata aaa tgc cgt ttt att atc aaa cgt tgc tgt gta gc
中程度のLFPセット2
R−LFP(2) 5’−cct tct ttt aca ggc tta gct ggt ttt atg cta agt ttc atg tgg acg
F−LFP(2) 5’−gga att tca gta cgg ata aaa tgc cgt ttt gtt tga gat gtt gtt aca ccg tc
速いLFPセット3
R−LFP(3) 5’−cct tct ttt aca ggc tta gct ggt ttt gga agc tgg gaa ttt att gag tg
F−LFP(3) 5’−gga att tca gta cgg ata aaa tgc cgt ttt gcg cat ata aat cga tgt cat ttg
ステムプライマーセット1
ステムF(1) 5’−tca aac cac cca aca aat g
ステムR(1) 5’−aac cgg cgg aac taa at
対称、非対称およびステムによって加速された対称リステリア・モノサイトゲネスTRAの比較
リステリア・モノサイトゲネスインターナリンA(IlnA)遺伝子の断片を含有するpLSプラスミドを55℃で、特注の画像処理ハードウェアシステムであるLucy(Lumora)において、実施例2の条件と同一の条件で、多量または少量、108または104のプラスミドを用い、R−LFP(3)、F−LFP(3)、StemB(1)およびステムF(1)プライマーそれぞれ0.8μMの異なる組み合わせを使用して増幅した。
(R−LFPは標的配列上のR2cに結合し、F−LFPはF2に結合する)
R−LFP(3) 5’−cct tct ttt aca ggc tta gct ggt ttt gga agc tgg gaa ttt att gag tg
F−LFP(3) 5’−gga att tca gta cgg ata aaa tgc cgt ttt gcg cat ata aat cga tgt cat ttg
ステムプライマーセット1
ステムF(1) 5’−tca aac cac cca aca aat g
ステムR(1) 5’−aac cgg cgg aac taa at
シミュレートしたBART速度曲線は、モデル化した指数関数的方法のための標準的リチャード曲線(Richard's curve)式を使用してマイクロソフトエクセルで作成した(図13)。増幅の速度論は、異なる速度論を有する別の増幅方法のためにモデル化した。異なる、類似したまたは同一の速度論の別個の増幅方法を組み合わせる効果も、図13に示す。図13a、bおよびcの比較から分かることは、別個の異なる増幅方法を組み合わせることの増幅の全体速度に対する全体的効果は、3種類の速い増幅方法を組み合わせても、驚くほど小さいことである(図13c)。これは、ステムプライマーの効果が、付加的な増幅方法を単純に付加するよりも増幅速度を根本的に増加することであることを強調している。
(A)リステリア・モノサイトゲネスのステムによって加速されたTRAに対する置換プライマーおよび外部ループ形成プライマーの効果の比較
リステリア・モノサイトゲネスInlA遺伝子の断片を含有するpLSプラスミドを55℃で、TRA-BARTで、特注の画像処理ハードウェアシステムであるLucy(Lumora)において、実施例2の条件と同一の条件で、多量または少量、108または104のプラスミドを用いて増幅した。各反応の全量は20μlであった。試験は100分行った。R−LFP(3)、F−LFP(3)、ステムF(1)およびステムR(1)それぞれ0.8μMを含有する反応とOuterR(1)およびOuterF(1)またはOuterR−LFP(7)およびOuterF−LFP(7)をそれぞれ0.8μM添加した反応の比較を行った。
R−LFP(3) 5’−cct tct ttt aca ggc tta gct ggt ttt gga agc tgg gaa ttt att gag tg
F−LFP(3) 5’−gga att tca gta cgg ata aaa tgc cgt ttt gcg cat ata aat cga tgt cat ttg
ステムプライマーセット1
ステムF(1) 5’−tca aac cac cca aca aat g
ステムR(1) 5’−aac cgg cgg aac taa at
置換プライマーセット1
RD(1) 5’−taa tgc taa gtt tca tgt g
FD(1) 5’−ata atc tac tgt ttg aga tg
OuterLFPプライマーセット7
R−LFP(7) 5’−ctt ctt tgg ttg ttt ctt tgc ctt ttt gct aag ttt cat gtg gac
F−LFP(7) 5’−gta tta aca gct aca cag caa cgt ttt gag atg ttg tta cac cgt c
サルモネラ・エンテリティディス侵入性A(InvA)遺伝子の断片を含有するpLS−プラスミドは、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)を使用して精製し、TRA-BARTで、55℃で、特注の画像処理ハードウェアシステムであるLucy(Lumora)を使用して増幅した。反応混合物は以下を含有した。数種の安定化剤および添加物および多量または少量のプラスミド、108または104を含む1×Thermopol緩衝液(NEB)中の、以下に示したような内部および/または外部リバースおよびフォワードLFPそれぞれ0.8μM、StemB0.8μMおよびステムFプライマー0.8μM(Eurofins MWG)、dNTP(合計)1.6mM(Invitrogen)、Bst DNAポリメラーゼ0.16U/μl(NEB)、ルシフェリン0.1mg/ml(Europa Bioproducts)、アデノシン5’−ホスホスルフェート0.25mM(Biolog)、ホタルルシフェラーゼ5.6μg/μl(Ultra Glow、Promega)、ATP-スルフリラーゼ0.375U/ml(NEB)。各反応の全量は20μlであった。試験は100分行った。
R−LFP(4) 5’−gga gca atg gcg cgt tat att tgt ttt cgc cat tgg cga att tat g
F−LFP(4) 5’−cac aat gcg agc gct tcc ttt tta agc gaa cgt gtt tcc g
外部LFPプライマーセット5
R−LFP(5) 5’−cga att acg agc agt aat ggt ttt tca tcc tca act tca gca g
F−LFP(5) 5’−caa acg ctg caa aac ttc agt ttt tta aag aag tgc tca gac atg
ステムプライマーセット2
ステムF(2) 5’−cct tgt gga gca tat tcg
ステムB(2) 5’−gac atc ttt ttc tct tgg cg
ステムによって加速されたリステリア・モノサイトゲネスLAMP
リステリア・モノサイトゲネスインターナリンA遺伝子の断片を含有するpLSプラスミドを55℃で、TRA-BARTで、特注の画像処理ハードウェアシステムであるLucy(Lumora)において、実施例2の条件と同一の条件で、多量または少量、108または104のプラスミドを用いて増幅した。各反応の全量は20μlであった。試験は100分行った。完全なLAMPプライマーミックス(各LFP0.8μM、各ループプライマー0.4μM、各置換プライマー0.2μM)を含有する反応とステムRプライマー0.8μMおよびステムFプライマー0.8μMを添加した反応とを比較した。
R−LFP(1) 5’−cct tct ttt aca ggc tta gct ggt ttt tca aag aaa caa cca aag aag tgg
F−LFP(1) 5’−gga att tca gta cgg ata aaa tgc cgt ttt att atc aaa cgt tgc tgt gta gc
ループプライマー
ループRc5’−cag tca ata aat tcc cag c
ループF 5’−cat cga ttt ata tgc gca at
置換プライマーセット1
RD(1) 5’−taa tgc taa gtt tca tgt g
FD(1) 5’−ata atc tac tgt ttg aga tg
ステムプライマーセット1
ステムF(1) 5’−tca aac cac cca aca aat g
ステムR(1) 5’−aac cgg cgg aac taa at
ステムプライマーの異なる方向によって加速したリステリア・モノサイトゲネスTRA
リステリア・モノサイトゲネスインターナリンA遺伝子の断片を含有するpLSプラスミドを、55℃で、特注の画像処理ハードウェアシステムであるLucy(Lumora)において、実施例2の条件と同一の条件で、多量または少量、108または104のプラスミドを用いてTRA−BARTで増幅した。各0.8μMで添加したステムR(3)およびステムF(3)プライマーの存在下および非存在下でのみ、R−LFP(3)およびF−LFP(3)プライマーを用いて実施した反応の比較を行った。
R−LFP(3) 5’−cct tct ttt aca ggc tta gct ggt ttt gga agc tgg gaa ttt att gag tg
F−LFP(3) 5’−gga att tca gta cgg ata aaa tgc cgt ttt gcg cat ata aat cga tgt cat ttg
ステムプライマーセット3
ステムF(3) 5’−agt tcc gcc ggt ttg
ステムR(3) 5’−aca ttt gtt ggg tgg ttt g
リステリアIlnA遺伝子断片(配列番号1)
GGCAATTTTTAATGCTAAGTTTCATGTGGACGGCAAAGAAACAACCAAAGAAGTGGAAGCTGGGAATTTATTGACTGAACCAGCTAAGCCTGTAAAAGAAGGTTATACATTTGTTGGGTGGTTTGATGCCCAAACCGGCGGAACTAAATGGAATTTCAGTACGGATAAAATGCCGACAAATGACATCGATTTATATGCGCAATTTAGTATTAACAGCTACACAGCAACGTTTGATAATGACGGTGTAACAACATCTCAAACAGTAGATTATCA
サルモネラInvA遺伝子断片(配列番号2)
TTTGCGAATAACATCCTCAACTTCAGCAGATACCATTACTGCTCGTAATTCGCCGCCATTGGCGAATTTATGACAAATATAACGCGCCATTGCTCCACGAATATGCTCCACAAGGTTAATGACATCTTTTTCTCTTGGCGCCCACAATGCGAGCGCTTCCATAATTAACTTCATATTACGCACGGAAACACGTTCGCTTAACAAACGCTGCAAAACTTCAGATATACGTTGTACCGTGGCATGTCTGAGCACTTCTTTAAGTAAATCAGGAAATTTCGCTTCCAGTTGGTCCAGCATATGTTTTGTTTCCTGAATACC
Claims (22)
- ポリ核酸の合成方法であって、
a)少なくとも第1および第2の相互プライマー結合領域を含む標的鋳型を提供する工程、
b)第1および第2のセグメントを含む第1のプライマーを提供する工程であって、第1のセグメントが鋳型上の第1の相互プライマー結合領域と実質的に相補的であり、第2のセグメントがループを形成することができるように、第2のセグメントが、第1のプライマーの別の領域、または第1のプライマーの第1のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含み、ここに、第1のプライマーが第1のプライマーの第1のセグメントから生成したアンプリコン中の領域と実質的に相補的な第2のセグメントを含む場合、第1の相互プライマー結合領域はまた、第1のプライマーの第2のセグメントと実質的に同一の鋳型上の領域を含む、工程、
c)第1のセグメントを含み、第2のセグメントを含んでもよい第2のプライマーを提供する工程であって、第1のセグメントが鋳型上の第2の相互プライマー結合領域に実質的に相補的であり、第2のセグメントがループを形成することができるように、前記含まれてもよい第2のセグメントが、第2のプライマー中の別の領域または第2のプライマーの第1のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含み、ここに、第2のプライマーが第2のプライマーの第1のセグメントから生成したアンプリコン中の領域と実質的に相補的な第2のセグメントを含む場合、第2の相互プライマー結合領域はまた、第2のプライマーの第2のセグメントと実質的に同一の鋳型上の領域を含む、工程、
d)第1および第2の相互プライマー結合領域の間の領域に結合することができる少なくとも1個のステムプライマーを提供する工程、ここに、前記少なくとも1個のステムプライマーが、
(i)ポリ核酸上のプライマー結合部位に相補的であるプライマーであって、該プライマー結合部位に実質的に相補的なプライマー領域の3’または5’に5個未満のヌクレオチドを含む、単純プライマー、
(ii)第1および第2のセグメントを含むプライマーであって、第1のセグメントは、鋳型上のプライマー結合領域に実質的に相補的であり、第2のセグメントは、第2のセグメントがループを形成することができるように、第1のプライマーの第1のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的な配列を含む、ループ形成プライマー、
(iii)第1および第2のセグメントを含むプライマーであって、第1のセグメントは、鋳型上のプライマー結合領域に実質的に相補的であり、第2のセグメントは、該プライマーの別の領域に実質的に相補的な配列を含む、ヘアピンプライマー、
(iv)逆方向反復の間にリンカー配列を含有するヘアピンプライマーである、ループ提供プライマー、または
(v)キメラプライマーである、工程
e)ポリ核酸の合成を実施するために必要な試薬および条件を提供する工程、
f)ポリ核酸の合成を実施する工程
を含む方法。 - 前記少なくとも1個のステムプライマーが、
(i)単純プライマー;
(ii)第2のセグメントは、第1のプライマーの第1のセグメントから生成したアンプリコン中の領域に実質的に相補的であり、第2のセグメントがループを形成することができるように、標的鋳型中の領域と実質的に同一である配列を含む、ループ形成プライマー;
(iii)ヘアピンプライマー;または
(iv)ループ提供プライマーである、請求項1に記載の方法。 - 前記少なくとも1個のステムプライマーがキメラプライマーである、請求項1に記載の方法。
- 合成が、ループ媒介等温増幅(LAMP)、鋳型リプライミング増幅(TRA)、自己伸長増幅(SEA)およびSMart増幅法(SMAP)からなる群から選択される核酸増幅技法を使用して実施される、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- フォワードおよび/またはリバース相互プライマー結合領域が2個以上のプライマーの結合部位を含み、ここに、該2個以上の結合部位が全て標的鋳型および/またはアンプリコンの同じ鎖上に位置していてもよく、または標的鋳型および/またはアンプリコンの異なる鎖上に位置していてもよい、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- フォワードおよび/またはリバース相互プライマー結合領域に結合する前記2個以上のプライマーが、
(a)同じ種類であり、ここに、該2個以上のプライマーはループ形成プライマーであってもよく、または
(b)異なる種類である、
請求項5に記載の方法。 - (a)フォワードおよび/またはリバース相互プライマー結合領域に結合するプライマーがループ提供プライマー(LPP)であり、および/または
(b)フォワードおよびリバース相互プライマー結合部位が、ポリ核酸の合成がステムプライマー(複数可)の存在下においてのみ生じ得るように離れて位置する、
請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 - 前記(a)および(b)であるか、または前記(b)であり、試料中のメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)を検出するために使用される、請求項7に記載の方法。
- 前記(a)および(b)であるか、または前記(b)であり、試料中のメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)を検出するために使用され、mecA遺伝子およびorfX配列を用いてMRSAが検出される、請求項7または8に記載の方法。
- 工程(d)において、
(i)1個のステムプライマーが使用されるか、または
(ii)同じ種類または異なる種類であってもよい2個以上のステムプライマーが使用される、
請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。 - 前記(ii)において、工程(d)において使用される前記2個以上のステムプライマーがアンプリコンの相互鎖またはアンプリコンの同じ鎖に結合する、請求項10に記載の方法。
- 前記ステムプライマー(複数可)が、
(a)改変塩基を含有し、および/または
(b)検出可能な部分で標識された核酸を含有し、および/または
(c)捕捉部分で標識された核酸を含有し、および/または
(d)ニッカーゼ部位含有プライマー
である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ステムプライマー(複数可)が、
(a)改変塩基を含有し、該改変塩基が、N4−メチルシトシン、イノシン、リボヌクレオチド、蛍光塩基、光分解塩基またはユニバーサル塩基からなる群から選択される、および/または
(b)検出可能な部分で標識された核酸を含有し、および/または
(c)捕捉部分で標識された核酸を含有し、および/または
(d)ニッカーゼ部位含有プライマー
である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ステムプライマー(複数可)が、
(a)改変塩基を含有し、および/または
(b)検出可能な部分で標識された核酸を含有し、該検出可能な部分が、蛍光標識、化学発光標識または電気化学的標識である、および/または
(c)捕捉部分で標識された核酸を含有し、および/または
(d)ニッカーゼ部位含有プライマー
である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ステムプライマー(複数可)が、
(a)改変塩基を含有し、および/または
(b)検出可能な部分で標識された核酸を含有し、および/または
(c)捕捉部分で標識された核酸を含有し、該捕捉部分がビオチンである、および/または
(d)ニッカーゼ部位含有プライマー
である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。 - 前記(b)において、前記標識されたステムプライマーが、蛍光、化学発光または電気化学的レポーター系においてプローブとして使用される、請求項12〜15のいずれか1項に記載の方法。
- (a)ポリ核酸の増幅が、遺伝子アレイ、ラテラルフローストリップ、電気泳動、質量分析および音波検出からなる群から選択される方法によって検出されるか、または
(b)核酸の合成が、リアルタイム測定または終点測定を使用して検出される、
請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。 - 前記(b)において、ポリ核酸の増幅が、蛍光、生物発光、濁度または電気化学的測定からなる群から選択される検出系によって検出される、請求項17に記載の方法。
- 前記(b)において、ポリ核酸の増幅が、蛍光、生物発光、濁度または電気化学的測定からなる群から選択される検出系によって検出され、該核酸の合成がリアルタイムでの生物発光アッセイ(BART)レポーター系を使用して検出される、請求項17または18に記載の方法。
- 請求項1〜19のいずれかに記載の方法であって、
(a)該方法が密封された容器中で実施されるか、または
(b)生物の遺伝子コード中の特定のポリ核酸配列の存在を決定するための方法であるか、または
(c)一塩基多型(SNP)の検出のための方法であるか、または
(d)診断用途で使用するための方法であるか、または
(e)試料中の生物の検出または定量において使用するための方法であるか、または
(f)遺伝子改変穀物を同定するため、遺伝子改変動物を同定するため、疾患状態を検出するため、治療による有害反応を予測するため、もしくは疾患状態感受性を予測するための方法。 - 前記(e)において、前記生物が、
(a)微生物である、および/または
(b)ウイルス、細菌、マイコプラズマおよび真菌からなる群から選択される微生物である、および/または
(c)ここに、前記微生物は遺伝子改変生物(GMO)であってもよい、
請求項20に記載の方法。 - 請求項1〜21のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、少なくとも1個のステムプライマーを含むキットであって、さらに、熱安定性ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよび無機ピロリン酸(PPi)をATPに変換する酵素および無機ピロリン酸(PPi)をATPに変換する酵素に必要な任意の他の基質または補因子を含んでいてもよい、キット。
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