ES2588279T3 - Beta-lactamasas modificadas y métodos y usos relacionados con las mismas - Google Patents

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Abstract

Una beta-lactamasa que comprende una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, caracterizada por que la beta-lactamasa tiene un residuo aminoacídico hidrófilo distinto de ácido aspártico (D) en una posición correspondiente a la posición 276 de acuerdo con la clasificación de Ambler y dicho aminoácido hidrófilo se selecciona de entre arginina (R), histidina (H), lisina (K), asparagina (N), glutamina (Q), serina (S) y treonina (T), e hidroliza penicilinas y/o cefalosporinas.

Description

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NH2, puede comprender una o más deleciones, sustituciones y/o inserciones de aminoácidos adicionales, siempre que tenga actividad beta-lactamasa. Dichas modificaciones pueden ser variaciones o mutantes de origen natural, o modificaciones artificiales introducidas, por ejemplo, por tecnología génica.
5 Se han descubierto en formas truncadas aminoterminalmente de forma diferente en el medio de crecimiento de B. licheniformis. Dichas exoformas se incluyen también en el presente documento. Matagne y col. han descrito diversas extensiones de microheterogeneidad en las formas extracelulares producidas por el huésped natural B. licheniformis 749/C (Matagne A. y col., 1991. Biochem J. 273: 503-510). Se identificaron las siguientes cinco exoformas secretadas diferentes con diferentes residuos aminoacídicos N-terminal:
10 SQPAEKNEKTEMKDD..... KALNMNGK
EKTEMKDD..... KALNMNGK
15 KTEMKDD..... KALNMNGK
EMKDD..... KALNMNGK
MKDD..... KALNMNGK
20 Los residuos aminoacídicos iniciales se presentan en negrita. Los residuos aminoacídicos C-terminales se indican a la derecha. La exoforma que parte de serina (S) se denomina la "forma secretada grande" de beta-lactamasa de B. licheniformis, y la única que parte de lisina (K) se denomina la "forma secretada pequeña".
25 La primera hélice alfa (hélice 1) empieza en ácido aspártico (D) (presentado en cursiva) y el final de la última hélice alfa (hélice 11) termina en asparagina (N) (presentada en cursiva). De acuerdo con una realización de la divulgación, la beta-lactamasa comprende al menos los aminoácidos 1-258 de la SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos 7264 de la SEQ ID NO: 3, que participan en la estructura secundaria de la proteína (Knox J.R. y col., 1991. J. Mol Biol. 220: 435-455). De acuerdo con otra realización de la divulgación, uno o más de dichos aminoácidos 1-258 de la
30 SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos 7-264 de la SEQ ID NO: 3 se han eliminado o reemplazado.
De acuerdo con otra realización más de la divulgación, el terminal amino de la beta-lactamasa comienza con NH2-KTEMKDD (aminoácidos 4-10 de la SEQ ID NO: 3). Esta exoforma denominada ES-betaL puede carecer adicionalmente de hasta 21 residuos contiguos como se describe por Gebhard y col. (Gebhard L.G. y col., 2006, J.
35 Mol. Biol. 21: 358(1)280-288). De acuerdo con otra realización de la divulgación, el terminal amino comienza con ácido glutámico (E) de la SEQ ID NO: 3, y especialmente comienza con NH2-EMKDD (aminoácidos 6-10 de la SEQ ID NO: 3), o como alternativa, comienza con NH2-MKDD (aminoácidos 7-10 de la SEQ ID NO: 3 o aminoácidos 1-4 de la SEQ ID NO: 1).
40 La región variable en la secuencia amino terminal de la beta-lactamasa no tiene una estructura rígida que justifique la constancia de los parámetros enzimáticos de diversas formas de beta lactamasa.
Los cuatro últimos aminoácidos en el extremo carboxílico de la beta-lactamasa, MNGK-COOH (aminoácidos 265268 de la SEQ ID NO: 3), no forman parte de la estructura secundaria y, por lo tanto, pueden también eliminarse sin
45 perder actividad. En otra realización, pueden eliminarse hasta nueve aminoácidos C-terminales. Las formas Ctruncadas de la proteína se han descrito por Santos y col. (Santos J. y col., 2004. Biochemistry 43: 1715-1723).
Todas las diferentes formas de la beta-lactamasa que se han expuesto anteriormente se incluyen por la presente divulgación, junto con otras formas de la proteína que tienen actividad beta-lactamasa.
50 Un polinucleótido de la invención puede comprender o tener una secuencia de una cualquiera de la SEQ ID NO: 2 o 4, o una degeneración de la misma. Un polinucleótido que es una degeneración de una secuencia mostrada en una cualquiera de las SEQ ID NO:s 2 o 4, se refiere a un polinucleótido que tiene uno o más nucleótidos diferentes en comparación con las SEQ ID NO:s 2 o 4, pero codifica el mismo aminoácido. Preferiblemente, el triplete nucleotídico
55 nnn de la SEQ ID NO: 2 o 4 codifica un aminoácido hidrófilo, mucho más preferiblemente N o R. Un "polinucleótido", como se usa en el presente documento, es una secuencia de nucleótidos tales como una secuencia de ADN o ARN, y puede ser un ácido polinucleico monocatenario o bicatenario. El término polinucleótido incluye ADN genómico, ADNc y ARNm.
8
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guanidinio básico de arginina 244 o arginina 220 para contribuir a la unión de beta-lactama o la química de inactivación de los inhibidores "suicidas", tal como ácido clavulánico (Matagne y col., 1998, Biochem J. 330: 582-598; Perez-Llarena y col., 2008, J Antimicrobiol Chemother, 61: 792-797). En B. licheniformis PenP, el residuo Arg-244 forma un enlace de sal con ácido aspártico 276 (Herzberg, O. 1991, J Mol Biol. 217: 701-719; Knox, J.R., y P.C.
5 Moews, 1991, J Mol Biol. 220: 435-555).
En una realización preferida de la invención, la beta-lactamasa comprende adicionalmente al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Leu220 y Arg244 de acuerdo con la clasificación de Ambler, que corresponde a Leu189 y Arg212, respectivamente de la SEQ ID NO: 1.
10
Beta-lactamasa de Bacillus licheniformis (PenP, P1A)
La beta-lactamasa de la invención se origina a partir de la cepa 749/C de Bacillus licheniformis. La beta-lactamasa de B. licheniformis 749/C (PenP; penicilina amido-beta-lactamhidrolasa, EC3.5.2.6) pertenece a un subgrupo 2a en 15 la clasificación funcional de beta-lactamasas de clase A (Bush K. y col., 1995, Antimicrob Agents Chemother 39: 1211-1233). La beta-lactamasa de B. licheniformis puede considerarse como una penicilinasa, que tiene una elevada capacidad hidrolítica para degradar, por ejemplo, penicilina, ampicilina, amoxicilina o piperacilina, y se inhibe generalmente por los inhibidores de beta-lactamasa dirigidos al sitio activo, tales como ácido clavulánico, sulbactam
o tazobactam (Bush K. y col., 1995, Antimicrob Agents Chemother. 39: 1211-1233).
20 La beta-lactamasa de Bacillus licheniformis 749/C se expresa como una pre-proteína de 307 residuos aminoacídicos. Después de la traslocación y la eliminación de su secuencia señal de 26 residuos aminoacídicos de largo, se convierte en una lipoproteína anclada a membrana en la que la cisteína aminoterminal (C27) forma un enlace tioéter con una diacilglisérida. La beta-lactamasa de B. licheniformis también se encuentra como formas
25 secretadas (extracelulares) que son productos proteolíticos de la forma de lipoproteína (Izui K. y col., 1980, Biochemistry 19: 1882-1886; Matagne A. y col., 1991, Biochem J, 273: 503-510). La región del gen de betalactamasa de Bacillus licheniformis 749/C que codifica la forma secretada pequeña (forma exo pequeña; P1A) de los residuos aminoacídicos 43-307 se ha escogido como un fragmento de ADN para la adaptación del sistema de producción de Bacillus subtilis del vector huésped (documento WO 2008065247).
30
Función
Las beta-lactamasas hidrolizan los antibióticos betalactámicos que comprenden un anillo beta-lactámico, tales como penicilinas, cefalosporinas, clavamas (u oxapenamas), cefamicinas y carbapenemas. En una realización preferida de
35 la invención, la beta-lactamasa hidroliza penicilinas y/o cefalosporinas. Las "penicilinas" se refieren a varias variantes naturales o semisintéticas de penicilina, que se obtienen originariamente de Penicillium. Las penicilinas incluyen, pero sin limitación, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, hetacilina, oxacilina, mezlocilina, penicilina G, penicilina V, y piperacilina.
40 En las cefalosporinas, el anillo beta-lactámico se condensa con un anillo dihidrotiazina de seis miembros en lugar de con el anillo tiazolidina de cinco miembros encontrado en las penicilinas. En base a su actividad biológica, las cefalosporinas se dividen en seis generaciones, pero algunas cefaloporinas no se han agrupado en una generación particular. En una realización específica de la invención, la beta-lactamasa tiene una mejor eficiencia catalítica sobre las cefalosporinas en comparación con las beta-lactamasas de tipo silvestre. De acuerdo con la presente invención,
45 la beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, en la que el ácido aspártico (Asp, D) en la posición 276, numerado de acuerdo con la clasificación de Ambler, está sustituido con un residuo aminoacídico hidrófilo, tal como una asparagina (N) o arginina (R), muestra una actividad extendida a antibióticos betalactámicos, tales como cefalosporinas.
50 En una realización de la invención, las cefalosporinas se seleccionan del grupo que consiste en cefoperazona, ceftriaxona y cefazolina.
Como se usa en el presente documento, la eficiencia catalítica de las beta-lactamasas se refiere a la capacidad para hidrolizar antibióticos betalactámicos. La eficiencia catalítica mejorada puede medirse mediante cualquier método in
55 vitro, ex vivo o in vivo convencional a partir de cualquier muestra biológica o un sujeto.
Métodos para producir y modificar beta-lactamasas
La beta-lactamasa de la invención puede producirse modificando la enzima con cualquier método convencional de
11
ingeniería genética. Pueden utilizarse en la producción métodos, tales como diseño racional, mutagénesis aleatoria, barajado de ADN (recombinación aleatoria), visualización de fagos, barajado del genoma completo, heteroduplexación, quimeragénesis aleatoria en un conjunto de plantillas transitorias de oligonucleótidos diseñados, reensamblado mutagénico y unidireccional, barajado de exones, barajado de bloqueo basado en ligadura Y,
5 recombinación no homóloga, diseño racional de combinación con evolución dirigida. Además, las enzimas mutantes pueden obtenerse empleando mutagénesis dirigida a sitio y splicing mediante técnicas de extensión de solapamiento.
En una realización de la divulgación, un método de modificación de una beta-lactamasa comprende una etapa de
10 modificar la beta-lactamasa que comprende una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 60 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 reemplazando un aminoácido en una posición de la SEQ ID NO: 1 correspondiente a la posición 276 de acuerdo con la clasificación de Ambler con un aminoácido hidrófilo. El aminoácido hidrófilo puede ser cualquier aminoácido hidrófilo, por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en arginina (R), histidina (H), lisina (K), asparagina (N), glutamina (Q), serina (S) y treonina (T).
15 En una realización de la invención, un aminoácido no hidrófilo se reemplaza con un aminoácido hidrófilo en una posición de la SEQ ID NO: 1 correspondiente a la posición 276 de acuerdo con la clasificación de Ambler.
La beta-lactamasa de la invención también puede producirse, por ejemplo, mediante métodos sintéticos, por
20 ejemplo, síntesis peptídica, o por producción recombinante en una célula huésped. En una realización preferida de la invención, la enzima es recombinante. Como se usa en el presente documento, material genético "recombinante" se refiere a un material, que es típicamente una combinación de material genético, por ejemplo, hebras de ADN de diverso origen, y se ha producido combinando o insertando las secuencias. El polinucleótido de la invención puede insertarse, por ejemplo, bajo el control de cualquier regulador endógeno o exógeno, tales como promotores. La
25 proteína recombinante se obtiene a partir del ADN recombinante.
Puede aislarse al menos un polinucleótido o fragmento polinucleotídico de interés de una célula o producirse sintéticamente. Este polinucleótido o fragmento polinucleotídico puede transformarse en una célula huésped. Una célula huésped adecuada para la producción de cualquier péptido de la invención puede ser cualquier célula
30 eucariota o procariota, preferiblemente bacterias, mucho más preferiblemente la cepa Bacillus spp., tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilis, o Bacillus amyloliquefaciens.
Como se usa en el presente documento, "transformación" se refiere a una alteración genética de una célula por material genético foráneo, preferiblemente ADN, dando como resultado la expresión de este material genético. El 35 material genético foráneo puede introducirse como tal o según se incorpora en cualquier otro material genético, tal como vectores, plásmidos, etc. Puede usarse cualquier método de ingeniería genética o cualquier método de clonación molecular, para transformar una célula huésped con el polinucleótido de la invención. Existen diversos métodos de introducción del material foráneo en una célula eucariota. Se han usado materiales, tales como polímeros (por ejemplo, DEAE-dextrano o polietilenimina), liposomas y nanopartículas (por ejemplo, oro) como
40 vehículos para la transformación. El material genético también puede introducirse en las células usando, por ejemplo, virus o vectores como vehículos. Otros métodos para introducir material foráneo en una célula incluye, pero sin limitación, nucleofección, electroporación, conjugación, transfección, sonoporación, choque térmico y magnetofección.
45 Después de que una célula huésped haya producido el péptido de la invención en las condiciones apropiadas, el péptido puede purificarse, por ejemplo, de la célula o puede recuperarse una forma secretada del péptido, por ejemplo, del medio de cultivo. En una realización preferida de la invención, la beta-lactamasa se secreta.
Composición farmacéutica
50 La composición farmacéutica de la invención comprende la beta-lactamasa de la invención. La composición puede comprender únicamente una beta-lactamasa o más, tal como al menos dos, tres, cuatro, etc. beta-lactamasas diferentes.
55 Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden comprender cualquier otro principio activo en lugar de las beta-lactamasas de la invención.
Las composiciones farmacéuticas pueden usarse, por ejemplo, en forma sólida, semisólida o líquida, tal como en forma de comprimidos, gránulos, cápsulas, soluciones, emulsiones o suspensiones. Preferiblemente, la composición
12
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imagen10
Ejemplo 3. Secuencia nucleotídica del gen de beta-lactamasa mutante D276R (penP)
Para confirmar la sustitución deseada de ácido aspártico por arginina en la posición 276 (clasificación de Ambler) en
5 el gen beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, la construcción de expresión se aisló de un clon positivo y la secuencia nucleotídica de la inserción se secuenció de manera similar al ejemplo 2. De acuerdo con la secuencia nucleotídica obtenida, la secuencia aminoacídica deducida contiene la sustitución D276R deseada y la enzima mutante D276R madura está compuesta por 268 residuos aminoacídicos (figura 3).
10 Ejemplo 4. Análisis bioquímico de la beta-lactamasa mutante D276N (P3A)
La pureza del preparado enzimático se estimó en más del 95 por ciento por análisis SDS-PAGE (datos no mostrados).
15 Los parámetros cinéticos de las beta-lactamasas de tipo silvestre (P1A) y D276N (P3A) mutantes de B. licheniformis se determinaron para la hidrólisis de diversos tipos de beta-lactamas y se resumen en la Tabla 3. Las reacciones enzimáticas se realizaron en tampón fosfato 20 mM (pH 7) a 30 ºC usando una concentración enzimática apropiada y diversas concentraciones de sustratos de penicilina o cefalosporina. Los valores kcat y Km se obtuvieron con la ayuda del método de linealización de Hanes. Los resultados principales se describen a continuación.
20
(i) Penicilinas
El efecto de la sustitución D276N en la hidrólisis de las penicilinas (ampicilina, amoxicilina o piperacilina) no fue drástico con eficiencias enzimáticas del 51-80 por ciento de las de la enzima de tipo silvestre. En consecuencia, los
25 valores kcat/Km de la enzima mutante D276N para las penicilinas se redujeron como un máximo de dos veces o menos.
(ii) Cefalosporinas
30 Como se esperaba, relacionada con las penicilinas, la beta-lactamasa de tipo silvestre tenía eficiencias enzimáticas deficientes para diversas cefalosporinas, incluyendo las cefalosporinas de la primera (cafazolina), la segunda (cefuroxima), y la tercera generación (ceftriaxona, cefotaxima, ceftadizima, cefoperazona y cefepima) (Tabla 1). Sorprendentemente, las eficiencias enzimáticas de la enzima mutante D276N para ciertas cefalosporinas, preferiblemente para cefoperazona y, más preferiblemente para ceftriaxona, se mejoraron básicamente en
35 comparación con las obtenidas con las enzimas de tipo silvestre. Las constantes Km para ceftriaxona y cefoperazona se disminuyeron y, de forma concomitante, el número de rotación (kcat) para ceftriaxona y cefoperazona se aumentó en comparación con el de la enzima de tipo silvestre (P1A). Por lo tanto, el ácido aspártico -sustitución de asparagina en la posición 276 de la beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, contribuye a la extensión del perfil de sustrato de la beta-lactama en la beta-lactamasa de Bacillus licheniformis.
40
15
Tabla 3. Parámetros cinéticos para la hidrólisis de sustratos de beta-lactama mediante enzimas de tipo silvestre (P1A) y mutantes D276N de beta-lactamasas de Bacillus licheniformis.
Beta-lactamasa de tipo silvestre (P1A)
Mutante D276N
Beta-lactama
Km (µM) kcat (s-1) kcat/Km (µM-1 s-1) Km (µM) kcat (s-1) kcat/Km (µM-1 s-1) Eficiencias catalíticas relativas (%)(1
Ampicilina
157 3369 21,45 161 2160 13,42 63
Piperacilina
49 939 19,16 53 816 15,40 80
Amoxicilina
119 2956 24,84 219 2789 12,74 51
Ceftriaxona
400 0,045 0,00013 38 83 2,18 1676923
Cefotaxima
363 246 0,67 213 36 0,17 25
Ceftadizima
0 0 0 1505 2,74 0,0018
Cefepima
0 0 0 1357 133 0,1
Cefazolina
22 93 4,22 37 192 5,19 123
Cefoperazona
7 10 1,43 2 17 8,2 573
Cefuroxima
107 233 2,18 277 35 0,13 6
(1Eficiencia catalítica relativa (kcat/Km) de D276N en comparación con la de la enzima de tipo silvestre (P1A). 5
Ejemplo 5. Caracterización bioquímica de la enzima mutante D276R
La enzima mutante D276R se construyó para evaluar si Asp-276 tolera sustituciones y evalúa la contribución de la sustitución D276R a la extensión de la actividad de beta-lactamasa observada en la enzima D276N.
10 Las muestras de enzimas en bruto de D276R y D276N obtenidas de los sobrenadantes de cultivo, se emplearon como materiales de ensayo. La pureza y la cantidad de muestras de enzimas se estimaron realizando análisis SDS-PAGE. La tasa de hidrólisis de las enzimas mutantes D276R y D276N para diversas beta-lactamas se realizó determinando los valores Vmáx. Los resultados obtenidos se presentan como actividades relativas (%) en
15 comparación con los de la enzima D276N en la Tabla 4.
En general, las eficiencias catalíticas de la beta-lactamasa D276R tanto para las penicilinas como para las cefalosporinas son comparables con las de la enzima D276N. En comparación con la enzima D276N, la enzima D276R tiene una actividad reducida para la ceftriaxona y una actividad mejorada para la cefoperazona. Este estudio 20 mostró que el espectro extendido de las beta-lactamas puede conseguirse sustituyendo un residuo aminoacídico hidrófilo, tal como arginina o asparagina para ácido aspártico en la posición 276 en la beta-lactamasa de Bacillus licheniformis. También indica que puede conseguirse una modificación enzimática deseada sustituyendo otro residuo aminoacídico hidrófilo tal como glutamina (Q), lisina (K), serina (S) o treonina (T), por ácido aspártico en la posición
276. 25
Tabla 4. Actividades relativas (%) de la enzima mutante D276R en comparación con las de la enzima mutanteD276N
Beta-lactama
Actividades relativas
Ampicilina
82
Piperacilina
84
Amoxicilina
71
Ceftriaxona
50
Cefotaxima
105
Ceftadizima
-
Cefepima
74
Cefazolina
84
Cefoperazona
232
Cefuroxima
99
30 Ejemplo 6. Estudio in vivo de la beta-lactamasa D276N La capacidad de la enzima beta-lactamasa mutante D276N de Bacillus licheniformis para inactivar la ceftriaxona 16

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