CN114075560A - 一种β-内酰胺酶的稳定组合物 - Google Patents
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本发明属于酶制剂技术领域，尤其涉及一种β‑内酰胺酶的稳定组合物，其包括活性成分β‑内酰胺酶、维生素C、甘露醇、甘氨酸、甘油、表面活性剂和缓冲盐。本发明的β‑内酰胺酶组合物经过辐照灭菌，既能保持酶活性的稳定，又可以达到无菌检测用酶的无菌保证水平。
Description
技术领域
本发明属于酶制剂技术领域，尤其涉及一种β-内酰胺酶的稳定组合物。
背景技术
病原微生物侵入人体引起的感染性疾病一直严重威胁人类的健康。1928年英国细菌学家弗莱明首先发现了世界上第一个抗生素——青霉素。自此人类可以利用抗生素杀灭和抑制侵入人体内的致病菌，使感染得以控制，使机体最终恢复健康。世界抗生素市场的平均年增长率为8％左右，市场份额约为250亿～260亿美元。在中国医药市场中，抗感染药物已经连续多年位居销售额第1位，年销售额为200多亿元，占全国药品销售额的30％，全国6700国家药品生产企业中，有1000多家在生产各类抗生素。
β-内酰胺抗生素是一类杀菌性抗生素，这类抗生素不仅能够抑制细菌的生长和繁殖，并且能够杀死静止期细菌。以青霉素为代表的β-内酰胺类抗生素，在人类征服细菌感染的近百年历史中起着不可或缺的重要作用。β-内酰胺抗生素经过多年的发展，已成为抗生素中的最主要类型之一。由于具有良好的抗菌效力，较低的毒副作用，在临床上广泛应用，其发展非常迅速。现全世界耗用量已过万吨，预计今后还会增长。
β-内酰胺酶是耐药细菌产生的水解抗生素的一类酶，该类酶水解破坏β-内酰胺环的酰胺键从而使β-内酰胺抗生素失活。针对不同的β-内酰胺抗生素，耐药菌产生不同的β-内酰胺酶，主要有青霉素酶，头孢菌素酶，金属β-内酰胺酶等。
β-内酰胺抗生素作为临床治疗药物，其质量标准需控制无菌。在该类抗生素的无菌检测过程中必须消除产品β-内酰胺抗生素对污染的微生物的抑制作用。《中国药典》2010年版一部附录XI H无菌检查法中规定了β-内酰胺酶为抗生素无菌检查的中和剂。
作为无菌检查使用的β-内酰胺酶，其本身在保持酶活性的同时必须保证无菌以确保检验方法的可靠性。酶制剂的热敏感性限制了高温高压灭菌方法的使用。酶制剂生产比较常用的是薄膜过滤方法，采用0.22μm孔径的滤膜过滤。这种无菌过滤技术理论上的除菌效率可以达到10-7水平，但是，由于人员操作及环境因素的影响，产品最终的无菌保证一般只能达到10-3水平，远远低于除菌过滤本身的水平。此外除菌过滤器不能将病毒或支原体全部滤除。
利用辐射源产生的γ射线以及加速器产生的高能电子束辐照样品，杀死其中微生物的冷灭菌方法称为辐照灭菌。这是20世纪50年代发展起来的灭菌方法，由于具有穿透力强、灭菌彻底，可对包装后的产品进行灭菌。在常温下处理，特别适合于热敏材料的灭菌处理。辐照杀菌技术是利用α或者γ射线、电子束的穿透性，杀死被照射物体表面或内部的各种微生物，或者抑制某些害虫生理活动的进程，从而起到延迟贮藏保鲜时间的效果。其应用最多的是医疗用品的辐射灭菌，医疗用品的辐射灭菌相比较于干热灭菌、湿热灭菌、环氧乙烷灭菌法主要有以下优点：灭菌均匀彻底，成本较低，无污染，无残留，操作简便，效率高，穿透能力强。在医疗行业，医疗用品辐射灭菌所要求的剂量一般是25kGy。
钴-60γ射线对微生物的作用可以分为直接作用与间接作用。射线作用于微生物后产生了康普顿效应，这时康普顿效应产生的次级电子，具有很高的能量，微生物接收这些能量后，细胞被大量电离，细胞器被破坏，渗透压升高，细胞膜破裂造成微生物直接死亡。这种作用是在辐射剂量够大且被照物含水分时发生。研究表明几乎所有的细胞活动进程都需要酶的参与，而高能量的次级电子打在酶的表面会使其活性降低甚至是失去活性，使微生物不能进行正常的生理过程而产生潜伏期、发病期、死亡期或恢复期，这种情况是在照射剂量不够大的时候发生的。
实验证实，凡是干的药物经辐照灭菌后，极大多数是稳定的，油膏制剂也是稳定的。而水剂极大多数是不稳定的，药效丧失或大量丧失。辐照对灭菌成分的影响复杂，对低分子糖类进行辐照时，不管是固体状态还是水溶液，随着辐照剂量的增加都会出现强光度降低、褐变、还原性和吸收光谱变化等现象，而且在辐照过程中还会有H2、CO、CO2，CH4等气体生成，多糖类经辐照后会发生熔点降低，旋光度降低、吸收光谱变化、褐变和结构变化等现象，直链淀粉经20KGy的剂量辐照后其平均聚合度从1700降至350；支链淀粉的链长会减少到15个葡萄糖单位以下，淀粉的糖度下降要比经过热处理的显著。辐照对脂类所产生的影响可分为三个方面：整个理化性质的变化、受辐照感应而发生自动氧化变化和发生非自动氧化性辐照分解。
灭菌剂量是指达到所需灭菌保证水平的吸收剂量。灭菌保证水平是指通过有效的灭菌过程使产品处于有菌状态的最大期望儿率。辐射灭菌，其灭活的微生物数目遵循指数灭活定律，这意味着，无论辐照多大的剂量，微生物始终能以有效的几率存活。对给定的剂量，微生物的存活是由微生物的数目、灭活微生物的种类、辐照剂量及辐照时微生物所处的环境决定的。灭菌保证水平的选择是以产品的使用目的来确定的：与受损伤组织接触的用品，选择10-6；不与受损伤组织接触的用品，选择10-3。25kGy是一种有效的灭菌剂量，一般认为，这种剂量能够提供10-6的灭菌保证水平。
β-内酰胺酶如果经过辐照杀菌能保持酶活性，则无菌保证水平就可以达到较高的10-6，应用于β-内酰胺抗生素的无菌检测就能确保方法的可靠性。
因此，有必要研发一种既能耐受辐照灭菌保留酶活性又稳定的β-内酰胺酶组合物。
发明内容
本发明针对β-内酰胺酶组合物经过辐照灭菌能够保持β-内酰胺酶的酶活性稳定而提出的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，可耐受辐照灭菌的β-内酰胺酶组合物。
本发明的目的在于提供一种β-内酰胺酶的稳定组合物，本发明的组合物包括β-内酰胺酶、维生素C、甘露醇、甘氨酸、甘油、表面活性剂和缓冲盐。
本发明所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，由以下组分组成：
本发明所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，β-内酰胺酶是青霉素酶、头孢菌素酶或者金属β-内酰胺酶。
本发明所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，维生素C是L-抗坏血酸、抗坏血酸钠、异维生素C及其水合物。
本发明所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，表面活性剂是吐温-80或吐温-20，缓冲盐是TRIS或者磷酸缓冲盐。
本发明所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，pH范围6.0～9.0，优选pH范围为7.0～8.5。
本发明所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，该组合物由以下组分组成：
本发明所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，该组合物由以下组分组成：
本发明所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，该组合物由以下组分组成：
本发明所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，该组合物是无菌的。
由于采用上述技术方案，本发明的β-内酰胺酶组合物经过钴60或者电子束辐照既能保持β-内酰胺酶的酶活性稳定，可以达到无菌检测用酶的无菌保证水平要求。
具体实施例
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但是并非限定本发明。
实施例一 不同青霉素酶组合物辐照筛选
用20mmol/L Tris-HCL，pH7.5溶液配制的青霉素酶溶液酶活性2200万单位/ml，经过Co-60γ射线辐照后酶活性降低95.4％(残留酶活性102万单位/ml)，因此根据文献以甘露醇、甘氨酸为保护剂进行组合物筛选。青霉素酶溶液基础配方：20mmol/L Tris-HCL(2.42mg/ml)，15mg/ml甘露醇，15mg/ml甘氨酸，pH7.5，根据表1，按不同的添加剂配制不同的青霉素酶组合物溶液，进行Co-60γ射线辐照，辐照剂量8KGy。辐照过程中样品加冰袋保持低温，辐照结束，按青霉素酶活性测定方法测定酶活性，结果见表1。
表1，不同添加物筛选
| 组合物 | 添加物 | 添加量 | 辐照前酶活性 | 辐照后酶活性 | 酶活性保留 |
| 1 | / | / | 2226万单位/ml | 1080万单位/ml | 48.5％ |
| 2 | 甘油 | 300mg/ml | 2226万单位/ml | 1408万单位/ml | 63.3％ |
| 3 | 吐温-80 | 1mg/ml | 2226万单位/ml | 1552万单位/ml | 69.7％ |
| 4 | Vit C | 10mg/ml | 2226万单位/ml | 2159万单位/ml | 97.0％ |
| 5 | BSA | 1mg/ml | 2226万单位/ml | 1410万单位/ml | 63.3％ |
| 6 | BME | 5mM | 2226万单位/ml | 1725万单位/ml | 77.5％ |
| 7 | DTT | 5mM | 2226万单位/ml | 1706万单位/ml | 76.6％ |
| 8 | GSH | 5mM | 2226万单位/ml | 1683万单位/ml | 75.6％ |
| 9 | 蔗糖 | 50mg/ml | 2226万单位/ml | 1239万单位/ml | 55.7％ |
从表1结果可看出，含有维生素C的青霉素酶组合物溶液经过辐照后酶活性保留达到95％以上，和其他添加物比，具有明显的防止青霉素酶辐照失活的作用。
实施例二 不同维生素C含量的青霉素酶组合物
青霉素酶溶液基础配方：20mmol/L Tris-HCL(2.42mg/ml)，15mg/ml甘露醇，15mg/ml甘氨酸，pH7.5，25％甘油，0.1％吐温-80，添加不同量的维生素C，根据表2，进行Co-60γ射线辐照，辐照剂量8KGy。辐照过程中样品加冰袋保持低温，辐照结束，按青霉素酶活性测定方法测定酶活性，结果见表2。从试验结果看，添加维生素C后青霉素辐照后酶活性损失不明显。
表2，不同维生素C含量
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 维生素C(mg/ml) | 0 | 0.1 | 1 | 5 | 10 | 50 |
| 辐照前 | 1580 | 1580 | 1580 | 1580 | 1580 | 1580 |
| 辐照后 | 662 | 1249 | 1450 | 1503 | 1598 | 1550 |
实施例三 头孢菌素酶组合物
配制头孢菌素酶组合物溶液：
按表3用Co-60γ射线不同剂量辐照，辐照过程中样品加冰袋保持低温，辐照结束，按青霉素酶活性测定方法测定酶活性，结果见表3，实验结果表明头孢菌素酶组合物辐照后酶活性没有损失。
表3，头孢菌素酶不同剂量辐照
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 辐照剂量(KGy) | 0 | 8 | 15 | 25 |
| 辐照前酶活性(万单位/ml) | 360 | 360 | 360 | 360 |
| 辐照后酶活性(万单位/ml) | 377 | 385 | 355 | 348 |
实施例四 金属β-内酰胺酶组合物
按表4配制金属β-内酰胺酶组合物，电子束射线辐照，辐照剂量15KGy。辐照过程中样品加冰袋保持低温，辐照结束，按青霉素酶活性测定方法测定酶活性，结果见表4。
表4，金属β-内酰胺酶组合物
实施例五 青霉素酶溶液的稳定性
配制青霉素酶组合物溶液：
Co-60γ射线辐照，剂量辐照25KGy，辐照过程中样品加冰袋保持低温，辐照结束，按青霉素酶活性测定方法测定酶活性，不同时间测定结果见表5，实验结果表明青霉素酶组合物辐照后酶活性在测定的时间内是稳定的。
表5，青霉素酶组合物辐照后稳定性
实施例六 青霉素酶活性测定法
1、溶液配制
磷酸盐缓冲液(pH7.0)：取磷酸氢二钾7.36g与磷酸二氢钾3.14g，加水使成1000ml。
醋酸钠缓冲液(pH4.5)：取冰醋酸13.86ml，加水使成250ml；另取结晶醋酸钠27.30g，加水使成200ml，两液混合均匀。
青霉素溶液：称取青霉素钠(钾)适量，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。
青霉素酶稀释液：取青霉素酶溶液，按估计单位用磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释成每1ml中约含青霉素酶8000～12,000单位的溶液，在37℃预热。
2、测定法
样品测定：精密量取青霉素溶液50ml，置100ml量瓶中，预热至37℃后，精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml，迅速混匀，在37℃准确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液(0.01mol/L)[精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度]25ml中，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失。
空白试验：取已预热的青霉素溶液2ml，在37℃放置1小时，精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然后精密加青霉素酶稀释液1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。
3、结果计算
按下式计算：
E＝(B-A)×M×F×D×100
式中：E为青霉素酶活力，单位/(ml·小时)；
B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；
A为样品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；
M为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L；
F为在相同条件下，每1ml的上述碘滴定液(0.01mol/L)相当于青霉素的单位数；
D为青霉素酶溶液的稀释倍数。
实施例七 辐照青霉素酶的无菌检测
1、仪器、设备和用具
百级层流超净工作台、恒温培养箱，压力蒸汽灭菌锅、酒精灯、三角烧瓶、无菌棉签，镊子，试管若干，试管夹，接菌环
凡操作过程中所有器皿，都应包扎严实，121℃灭菌30分钟。所有的灭菌物品不应超过2周即用毕，否则应重新灭菌。
2、培养基
配制硫乙醇酸盐流体培养、改良马丁培养基和营养琼脂培养基，硫乙醇酸盐流体培养培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5。
3、直接接种法
按接种量10％接种辐照后的青霉素酶溶液，硫乙醇酸盐流体培养基6支接样品，4支接无菌生理盐水，改良马丁培养基8支接样品，2支接无菌生理盐水，营养琼脂培养基6支接样品，4支接无菌生理盐水，硫乙醇酸盐流体培养基和营养琼脂培养基各总数的1/2置30～35℃培养，其余置20～25℃培养，培养时间不少于14日。培养期间应逐日检查是否有菌生长(阳性对照在24小时应有细菌生长)，并填写无菌检查记录表。
4、结果
如培养管均为澄清或虽然浑浊但经证明并非有菌生成，均应判为供试品合格，或样品培养管中任何管显浑浊并证明为有菌生成，应重新取样，分别依法重复两次，除阳性对照管外，其它管均不得有菌生成，否则一应判为供试品不合格。青霉素酶无菌检测结果见表6。
表6，青霉素酶的无菌检测
检测结果，辐照后的青霉素酶溶液无菌检测结果阴性。
Claims (10)
1.一种β-内酰胺酶的稳定组合物，其特征在于包括活性成分β-内酰胺酶、维生素C、甘露醇、甘氨酸、甘油、表面活性剂和缓冲盐。
2.根据权利要求1所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，其特征在于该组合物由以下组分组成：
3.根据权利要求1所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，其特征在于β-内酰胺酶是青霉素酶、头孢菌素酶或者金属β-内酰胺酶。
4.根据权利要求1所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，其特征在于维生素C是L-抗坏血酸、抗坏血酸钠、异维生素C及其水合物。
5.根据权利要求1所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，其特征在于表面活性剂是吐温-80或吐温-20，缓冲盐是TRIS或者磷酸缓冲盐。
6.根据权利要求1所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，其特征在于优选pH范围为7.0～8.5。
7.根据权利要求1所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，其特征在于该组合物)由以下组分组成：
8.根据权利要求1所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，其特征在于该组合物由以下组分组成：
9.根据权利要求1所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，其特征在于该组合物由以下组分组成：
10.根据权利要求1所述的一种β-内酰胺酶的稳定组合物，其特征在于该组合物是无菌的。
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