CN103038341B

CN103038341B - 经修饰的β-内酰胺酶及其相关方法和应用

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Publication number: CN103038341B
Application number: CN201180035810.5A
Authority: CN
Inventors: P·科斯基; U·艾尔阿克辛; K·卡里马基
Original assignee: Biological Agent Synthesis Co Ltd
Current assignee: Treva Biologicals Co.,Ltd.
Priority date: 2010-05-24
Filing date: 2011-05-17
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2031-05-17
Also published as: US20220090044A1; KR20130133648A; FI20105572A0; AU2011257092C1; US20150209418A1; US20170327812A1; CA2800671A1; US9301995B2; BR112012030029A2; JP5827681B2; EP2576776A4; EP2576776B1; KR101708703B1; HK1183905A1; ZA201208948B; US9034602B2; US20190169590A1; US20140127785A1; US9587234B2; US20130216622A1

Abstract

本发明涉及药物和经修饰的β-内酰胺酶。具体而言，本发明涉及新型的重组β-内酰胺酶和包含所述β-内酰胺酶的药物组合物。另外，本发明涉及用于修饰β-内酰胺酶的方法、生产所述β-内酰胺酶的方法和治疗或预防β-内酰胺抗生素引起的副作用的方法。此外，本发明涉及用作药物的所述β-内酰胺酶和所述β-内酰胺酶在制造用于治疗或预防β-内酰胺抗生素引起的副作用的药物中的应用。此外，本发明涉及一种多核苷酸和包含所述多核苷酸的宿主细胞。

Description

经修饰的β-内酰胺酶及其相关方法和应用

技术领域

本发明涉及药物和经修饰的β-内酰胺酶。具体而言，本发明涉及新型重组β-内酰胺酶和包含所述β-内酰胺酶的药物组合物。

另外，本发明涉及用于修饰β-内酰胺酶的方法、制造所述β-内酰胺酶的方法和治疗或预防β-内酰胺抗生素引起的副作用的方法。此外，本发明涉及用作药物的所述β-内酰胺酶和所述β-内酰胺酶在制造用于治疗或预防β-内酰胺抗生素引起的副作用的药物中的应用。

此外，本发明涉及多核苷酸和包含所述多核苷酸的宿主细胞。

背景技术

β-内酰胺抗生素的特征在于其分子结构中的β-内酰胺环。β-内酰胺环的完整性对于生物活性是必需的，其引起催化肽聚糖合成的最终交联反应的一组转肽酶的失活。β-内酰胺抗生素家族的成员包括青霉素、头孢菌素、克拉维烷(氧青霉烷)、头霉素和碳青霉烯。

β-内酰胺酶是水解β-内酰胺抗生素的细菌防御酶。β-内酰胺酶的产生是赋予革兰氏阴性细菌β-内酰胺抗性的主要机制。β-内酰胺酶非常高效地催化β-内酰胺环的酰胺键的不可逆水解，从而产生失去生物学活性的产物。

由于不同种类β-内酰胺酶的酶特性的多样性，已经提出数种分类系统来对其分类。这些分类基于两种主要途径，即功能分类和分子分类。

Bush等提出的β-内酰胺酶的功能分类方案(1995,Antimicrob.AgentsChemother.39:1211-1233)定义了四组β-内酰胺酶，其是基于β-内酰胺酶的底物和抑制剂特征。第1组由基本不受克拉维酸抑制的头孢菌素酶组成。第2组由通常受针对活性部位的β-内酰胺酶抑制剂抑制的青霉素酶、头孢菌素酶和广谱β-内酰胺酶组成。第3组由水解青霉素、头孢菌素和碳青霉烯并且被几乎所有的含β-内酰胺的分子微弱抑制的金属β-内酰胺酶组成。第4组由基本不受克拉维酸抑制的青霉素酶组成。还根据第2组的青霉素酶水解羧苄西林或氯唑西林(苯唑西林)的速率定义了若干亚组。

使用最广泛的分类是Ambler分类，其基于β-内酰胺酶的氨基酸序列将β-内酰胺酶分成四类(A、B、C、D)(Ambler1980,PhilosTransRSocLondBBiolSci.289:321-331)。A、C和D类集合了进化上独特的几组丝氨酸β-内酰胺酶，B类集合了锌依赖性("受EDTA抑制的")β-内酰胺酶(AmblerR.P.等,1991,BiochemJ.276:269-270)。A、C和D类属于丝氨酸β-内酰胺酶，其中β-内酰胺的水解由活性部位中的丝氨酸介导。丝氨酸β-内酰胺酶涉及DD肽酶(D-丙氨酰基-D-丙氨酸羧基肽酶)，即β-内酰胺的靶酶。据认为，丝氨酸β-内酰胺酶水解β-内酰胺抗生素的机制采用三步途径，包括非共价的Henri-Michaelis复合物、共价的酰基-酶中间体和脱酰化(Matagne等,1998,BiochemJ330:581-598)。据认为酰化机制是所有丝氨酸β-内酰胺酶组的共同机制，然而，基于理论计算，A、C和D类的丝氨酸β-内酰胺酶的底物脱酰机制看上去彼此不同。脱酰机制兼具共同的基本过程和组特异性基本过程(HataM等,2006,BiolPharmBull.29:2151-2159)。

芽孢杆菌属丝氨酸β-内酰胺酶以及TEM-1、SHV-1和CTX-M家族最初被归类为A类β-内酰胺酶，并被归类为具有良好的水解例如青霉素和氨苄青霉素的能力的青霉素酶。在20世纪40年代，在青霉素抗性金黄色葡萄球菌中首次鉴定出A类β-内酰胺酶。20年后，在大肠杆菌中发现了质粒携带的青霉素抗性基因TEM-1。后来，还显示出丝氨酸β-内酰胺酶进化出水解大多数头孢菌素的能力并进一步专注于水解特定亚组的头孢菌素。这些超广谱β-内酰胺酶(ESBL)是TEM-1酶、TEM-2酶或SHV-1酶的衍生物。最近，描述CTX-M酶(一组新的A类ESBL)的大量出现的报道越来越多。现在，CTX-M酶是最频繁观察的ESBL，并被细分为5个主要家族。CTX-M酶具有宽范围的底物，包括青霉素和第一、二、三代头孢菌素(Bonnet,R.2004.AntimicrobAgentsChemother.48:1-14)。

虽然A类β-内酰胺酶(TEM、SHV、CTX-M、芽孢杆菌属β-内酰胺酶)之间的序列相似性中等，但是所有丝氨酸β-内酰胺酶的晶体结构显示出特别高的相似性(Matagne等,1998,BiochemJ330:581-598;TranierS.等,2000,JBiolChem,275:28075-28082;SantillanaE.等,2007,ProcNatlAcadSci.USA,104:5354-5359)。这些酶由两个结构域组成。一个结构域由三个α螺旋和靠着其组装的五股β折叠片组成，而第二结构域是α结构域，由八个α螺旋组成。活性部位口袋是这两个结构域之间的界面的一部分，并且被Ω环界定。Ω环是所有A类β-内酰胺酶的保守结构元件，其不可或缺地参与催化反应(图1)。

已经在A类β-内酰胺酶中鉴定出与底物的催化或识别相关的数种保守肽序列(元件)。第一种保守元件70-Ser-X-X-Lys-73(Ambler分类)包含位于α螺旋₂中的第70位的活性丝氨酸残基和位于第73位的赖氨酸。第二种保守元件是α结构域中的SXN环(位于Ambler分类第130位和第132位之间的位置)，在此处其形成催化腔的一侧。第三种保守元件(位于Ambler分类第234位和第236位之间的位置)在β折叠片3的最内一股上，并且形成催化腔的另一侧。第三种保守元件通常是KTG。但是，在一些例外情况下，赖氨酸(K)可以被组氨酸(H)或精氨酸(R)置换，并且在数种β-内酰胺酶中，苏氨酸(T)可以被丝氨酸(S)替换(Matagne等,1998.BiochemJ330:581-598)。

由于近数十年来大量使用β-内酰胺，β-内酰胺酶所介导的β-内酰胺抗性在病原体和共生微生物丛中广泛分布。实际上，抗生素抗性是人类医学和兽医学中众所周知的临床问题，已经纯化出源自革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的数百种不同的β-内酰胺酶，并在科技文献中进行了表征。由于对抗微生物剂的使用尚未减少，并且抗微生物剂抗性还已经成为日常生活的一部分，所以一直都迫切需要新的方法来解决这些医学问题。

人类的肠道微生物丛是复杂的细菌群落，其通过例如刺激免疫应答系统、辅助食物消化并防止潜在的病原体细菌的过度生长而在人类健康中起重要作用。已知诸如β-内酰胺等抗微生物剂对正常微生物丛具有影响。抗微生物剂的促进正常肠道微生物丛的变化的功效与数种因素相关，这些因素包括药物的剂量、施用途径和药代动力学/药效动力学以及抗生素的性质(Sullivan等,2001,Lancet1:101-114)。即使肠道微生物丛具有在抗生素治疗结束后恢复正常的倾向，但已经报道了具有选择性抗性的共生细菌的长期留存(等,2003,AnnInternMed.139:483-487)。抗生素抗性基因的此类留存和交换使得共生微生物丛成为抗生素抗性基因的推定贮库。

某些胃肠外施用的β-内酰胺(例如氨苄青霉素、头孢曲松、头孢哌酮和哌拉西林)通过胆道排泄进入小肠的近端部份(十二指肠)而被部分排出。肠道中残余的未吸收的β-内酰胺可能对正常的肠道微生物丛的生态平衡造成不良影响，从而导致抗生素相关的腹泻、病原性细菌(例如万古霉素抗性肠球菌(VRE)、产生超广谱β-内酰胺酶的革兰氏阴性杆菌(ESBL)、艰难梭菌和真菌)的过度生长、以及在正常的肠道微生物丛和潜在的病原体细菌中对抗生素抗性株的选择。

β-内酰胺酶的治疗目的是使胃肠道(GIT)中未吸收的抗生素失活，由此保持正常的肠道微生物丛并防止潜在的病原性微生物在其中过度生长(WO93/13795)。

对于适于GIT靶向治疗的β-内酰胺酶药物产品至少有三个要求。第一个要求是在GIT中的主导条件下保持酶活性。对于β-内酰胺酶疗法的可行性而言，对从各种腺体分泌到GIT中的各种蛋白酶所致的蛋白水解的抗性是基本前提。另一重要的考虑因素是小肠的不同腔室中的主导pH值的范围。这些pH值通常为在5(十二指肠)和7.5(回肠)之间变动。因此，为了能够胜任用于指定治疗目的的候选物，β-内酰胺酶需要在5～7.5的pH范围展示出高的酶活性。

对β-内酰胺酶或其产品的第二个要求是高效地水解β-内酰胺。在抗生素治疗期间β-内酰胺抗生素在小肠食糜中的浓度通常与特定β-内酰胺经由胆道排泄的排出情况相关。适合的β-内酰胺酶需要具有以下动力学参数：该动力学参数使其能够有效地将较低的GITβ-内酰胺浓度水解至低于使小肠微生物丛发生变化的水平。理想的动力学参数组由数值较低的米氏常数K_M与数值较高的最大反应速率V_max的组合构成。为了提供程度足够高的分解能力，需要较高的V_max值，而为了确保β-内酰胺在低底物浓度下的降解活性，则需要较低的K_M值。

对β-内酰胺酶或其产品的第三个要求是对制造药物组合物时的条件(例如相对高的温度)耐受。此外，在生产过程中，水性赋形剂和原料药(drugsubstance)的混合分散需要合适pH下的较高程度的溶解度。

正在开发名为IpsatP1A的酶疗法以用于防止β-内酰胺抗生素在肠内的副作用。已经将IpsatP1A递送系统设计成使经由胆道系统排泄的、带有或不带有β-内酰胺酶抑制剂(例如他唑巴坦、舒巴坦、克拉维酸)的胃肠外给药的青霉素组β-内酰胺(例如青霉素、阿莫西林、氨苄青霉素和哌拉西林)失活(WO2008065247;Tarkkanen,A.M.等,2009,AntimicrobAgentsChemother.53:2455-2462)。P1A酶是地衣芽孢杆菌749/C的较小的胞外β-内酰胺酶的重组形式(WO2008065247)，其属于A类，并且在功能分类中属于第2a亚组。认为地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶及其P1A衍生物是青霉素酶，具有较高的降解例如青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林或哌拉西林(表1)的水解能力，并且他们通常被针对活性部位的β-内酰胺酶抑制剂(例如克拉维酸、舒巴坦或他唑巴坦)抑制(BushK.等,1995,AntimicrobAgentsChemother39:1211-1233)。

但是，P1A酶仅具有非常有限的使属于头孢菌素或碳青霉烯类的β-内酰胺抗生素失活的能力。由于所用的β-内酰胺酶对头孢菌素的活性较差，它们不能与胃肠外头孢菌素疗法联用以使小肠道中未吸收的β-内酰胺失活。

因此，具有超广谱底物(例如，如金属β-内酰胺酶中所见到的)的新型β-内酰胺酶或P1A衍生物是必不可少的。

本发明提供了P1Aβ-内酰胺酶的新型的基因改造衍生物，以及用于修饰和生产β-内酰胺酶的新方法。

发明内容

本发明的P1Aβ-内酰胺酶的新型重组衍生物满足了合适的β-内酰胺酶的上述三个要求(即，具有保持酶活性的能力、高效地水解β-内酰胺的能力和对制造药物组合物时的条件耐受的能力)，并且还具有超广谱的底物。本发明的β-内酰胺酶还可以与胃肠外头孢菌素疗法联用以使小肠道中的由胆排出的β-内酰胺失活。

本发明着重描述了对新型IpsatP3A药物蛋白(P1A的D276N替换衍生物)的初步研究和临床前研究，并给出了单原料药剂量。

本发明能够获得用于修饰β-内酰胺酶和用于生产其的快速高效的方法。此外，通过本发明可获得更加有效和更具特异性的治疗。

本发明的酶适于大规模地制造用于治疗或预防由各组β-内酰胺抗生素引起的副作用的原料药。

本发明的目的在于提供新型β-内酰胺酶、特别是地衣芽孢杆菌的β-内酰胺酶，并提供与所述β-内酰胺酶相关的产品、方法和应用。本发明还给出了用于在医药工业中进行进一步开发的工具。

本发明涉及一种β-内酰胺酶或其变体或片段，所述β-内酰胺酶包含与SEQIDNO:1具有至少60%序列同一性的氨基酸序列，并且在SEQIDNO:1的与Ambler分类第276位对应的位置处具有亲水性氨基酸残基。

本发明还涉及包含本发明的β-内酰胺酶的药物组合物。

本发明还涉及一种修饰β-内酰胺酶的方法，所述β-内酰胺酶包含与SEQIDNO:1具有至少60%序列同一性的氨基酸序列，其中，用亲水性氨基酸置换所述β-内酰胺酶的在SEQIDNO:1的与Ambler分类第276位对应的位置处的氨基酸。

此外，本发明涉及生产所述β-内酰胺酶的方法，其中所述方法包括以下步骤：

i)提供编码本发明的β-内酰胺酶的基因；

ii)用所述基因转化宿主细胞；

iii)获得产生所述β-内酰胺酶的宿主细胞；

iv)回收所述β-内酰胺酶。

此外，本发明涉及一种通过向受试对象同时施用或依次施用β-内酰胺酶和β-内酰胺抗生素来治疗或预防β-内酰胺抗生素在胃肠道中引起的副作用的方法。

此外，本发明还涉及用作药物的β-内酰胺酶。

此外，本发明还涉及所述β-内酰胺酶在制造用于治疗或预防β-内酰胺抗生素在胃肠道中引起的副作用的药物中的应用。

此外，本发明还涉及一种多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQIDNO:2或4中任一个的序列或其简并序列，或者，所述多核苷酸编码本发明的β-内酰胺酶。本发明还涉及包含所述多核苷酸的宿主细胞。

附图说明

图1显示了地衣芽孢杆菌的β-内酰胺酶的β-内酰胺酶3D结构(PenP的较小的胞外形式)。标记出了R-244和D-278的保守氨基酸残基和侧链残基。该图使用MolSof-Browser程序生成。

图2显示了地衣芽孢杆菌的D276Nβ-内酰胺酶基因(P1A衍生物)的核苷酸序列和推导出的氨基酸序列。该氨基酸序列对应于序列SEQIDNO:3，其中Xaa是天冬酰胺(Asn)。该核苷酸序列对应于序列SEQIDNO:4，其中核苷酸三联体nnn是aat。开放阅读框编码299个氨基酸的多肽，其拥有源自pKTH141分泌载体的amyQ基因的31个氨基酸长的信号序列(用下划线标出)(WO2008/065247)。预测的信号肽酶切割位点在第-1位的丙氨酸(A)之后。编码NH₂-QAS延伸部分的HindIII克隆位点以粗体表示。成熟的D276N突变酶从第+1位的谷氨酰胺(Q)开始。因此，成熟的D276N突变β-内酰胺酶包含268个氨基酸残基，其中包括由HindIII编码的NH₂-QAS延伸部分。天冬氨酸(D)至天冬酰胺(N)的单氨基酸替换位于第280位(以粗体字符表示)，该位置对应于Ambler分类系统中的第276位，并对应于序列SEQIDNO:3中的氨基酸位置249。

经纯化的D276N突变酶的NH₂末端序列在蛋白测序仪中通过自动Edman降解来确定。分析显示，D276N突变酶在其推导出的氨基末端缺少NH₂-QASKT五肽，缺少方式与其亲本P1A酶相似(WO2008/065247)。经纯化的D276N突变酶的主要部分(已经在本申请的实施例4和6中利用)始于第+6位的谷氨酸，并且由263个氨基酸残基组成，分子量为29272。

图3显示了源自地衣芽孢杆菌的P1AD276R替换型β-内酰胺酶基因的核苷酸序列和推导出的氨基酸序列。该氨基酸序列对应于序列SEQIDNO:3，其中Xaa是精氨酸(Arg)。该核苷酸序列对应于序列SEQIDNO:4，其中核苷酸三联体nnn是cgc。

图4显示了口服施用的D276N替换型β-内酰胺酶(P3A)肠溶包衣微丸剂对静脉内施用头孢曲松(每kg体重30mg头孢曲松)之后的小猎犬(n=5)的空肠食糜中的头孢曲松浓度的影响(闭合方形)。在注射头孢曲松之前10分钟，服用β-内酰胺酶微丸剂。闭合菱形表示在用单剂量的头孢曲松(静脉注射)而不使用β-内酰胺酶治疗之后得到的空肠头孢曲松浓度。

具体实施方式

β-内酰胺酶一直用于使胃肠道中未吸收的β-内酰胺失活，从而防止β-内酰胺引起的副作用，所述副作用包括肠道正常微生物丛的改变和β-内酰胺抗性细菌的过度生长(WO9313795,WO2008065247,WO2007147945)。本发明现在提供了一种地衣芽孢杆菌的经修饰的β-内酰胺酶，该酶显示出了令人惊讶的发生变化的底物谱。

本文所用的β-内酰胺酶是指水解β-内酰胺的酶。β-内酰胺环的酰胺键的水解使得抗微生物剂失去生物活性。本文所用的A类β-内酰胺酶(Ambler分类)是指丝氨酸β-内酰胺酶，其中β-内酰胺的水解由活性部位中的丝氨酸(通常在α螺旋₂的氨基酸位置70处)介导。A类β-内酰胺酶包括但不限于：Len-1；SHV-1；TEM-1；PSE-3/PSE-3；ROB-1；蜡状芽孢杆菌(例如5/B1型、569/H1型和569/H3型)β-内酰胺酶；炭疽杆菌物种β-内酰胺酶；地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶(例如PenP)；韦氏芽孢杆菌(Bacillusweihenstephanensis)β-内酰胺酶；克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)β-内酰胺酶；金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶；PC1；Sme-1；NmcA；IMI型、PER型、VEB型、GES型、KPC型、CME型和CTX-M型β-内酰胺酶。

肽和多核苷酸的序列同一性

本发明的突变β-内酰胺酶(D276X、P1A衍生物)的氨基酸序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:3所示。相应的核苷酸序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:4所示。SEQIDNO:1示出了参与β-内酰胺酶的二级结构的形成的氨基酸序列。SEQIDNO:3示出了该蛋白的全长氨基酸序列，包括31个氨基酸长的信号序列。

本发明的β-内酰胺酶可以包含与SEQIDNO:1或3具有至少30%、35%、40%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或100%同一性的氨基酸序列。

本发明的特定实施方式的肽与SEQIDNO:1或3具有至少30%、35%、40%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或100%的同一性。

在本发明的一个优选实施方式中，本发明的β-内酰胺酶包含与SEQIDNO:1具有至少60%序列同一性的氨基酸序列。在本发明的另一优选实施方式中，所述β-内酰胺酶与SEQIDNO:1或3具有至少60%的序列同一性。

在本发明的一个实施方式中，包含与SEQIDNO:1具有任何上述序列同一性的氨基酸序列的所述β-内酰胺酶在SEQIDNO:1的与Ambler分类第276位对应的位置处具有亲水性氨基酸，所述亲水性氨基酸选自由精氨酸(R)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)组成的组。

本发明的优选实施方式的肽具有SEQIDNO:1或3所示的序列。在本发明的一个实施方式中，所述β-内酰胺酶具有SEQIDNO:1或3所示的序列，其中，在与Ambler分类第276位对应的位置处的亲水性氨基酸残基(在SEQIDNO:1或3中标记为Xaa)是精氨酸(R,Arg)。在本发明的另一实施方式中，所述β-内酰胺酶具有SEQIDNO:1或3所示的序列，其中，在与Ambler分类第276位对应的位置处的亲水性氨基酸残基(在SEQIDNO:1或3中标记为Xaa)是天冬酰胺(N,Asn)。

任一序列与本发明的序列的同一性是指与本发明的全序列的同一性。序列同一性可以通过任何常规的生物信息学方法来确定，例如通过使用BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTools)或FASTA(FAST-AII)。

本发明还涉及新型β-内酰胺酶的任何变体或片段。本文所用的β-内酰胺酶的片段或变体是指具有生物学功能(即具有酶活性)的任何部分或变体。变体是指在肽序列中具有小变异(例如突变、小的缺失或插入)的肽。片段和变体应该包括位于与Ambler分类第276位对应的位置的亲水性氨基酸。该亲水性氨基酸通常不是天冬氨酸(D)。

β-内酰胺酶有多种较短形式，这些形式可以从SEQIDNO:3获得并且分泌到细胞外。将它们称为胞外形式(exoform)。胞外形式是细胞壁或培养基中的蛋白酶的水解活性的结果。

本文所用的D276X、D276N、D276R、突变形式、P1A衍生物或P3A涵盖了任何β-内酰胺酶活性片段和/或SEQIDNO:3的变体或包含明确给出的氨基酸序列(SEQIDNO:1)的变体。特别而言，本发明的β-内酰胺酶为NH₂-截短的形式，这意味着其已经在氨基末端被截短。除了NH₂-截短之外，其可以包含一个或多个其他氨基酸缺失、替换和/或插入，只要其具有β-内酰胺酶活性即可。所述修饰可以是天然存在的变异或突变，或者是通过例如基因技术引入的人工修饰。

在地衣芽孢杆菌的生长培养基中已经发现了氨基末端截短方式不同的胞外形式。此类胞外形式也被本文涵盖。Matagne等已经描述了由天然宿主地衣芽孢杆菌749/C产生的细胞外形式的各种程度的微观不均一性(MatagneA等,1991.BiochemJ.273:503-510)。鉴定出了具有不同N端氨基酸残基的以下五种不同的分泌出的胞外形式：

SQPAEKNEKTEMKDD.....KALNMNGK

EKTEMKDD.....KALNMNGK

KTEMKDD.....KALNMNGK

EMKDD.....KALNMNGK

MKDD.....KALNMNGK

起始氨基酸残基以粗体示出。C端氨基酸残基显示在右侧。将从丝氨酸(S)开始的胞外形式称为地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶的“较大的分泌形式”，将从赖氨酸(K)开始的胞外形式称为“较小的分泌形式”。

第一α螺旋(α₁-螺旋)始于天冬氨酸(D)(以斜体示出)，最后的α螺旋(α₁₁-螺旋)的末端终止于天冬酰胺(N)(以斜体示出)。根据本发明的一个实施方式，所述β-内酰胺酶至少包含SEQIDNO:1的第1～258位氨基酸或SEQIDNO:3的第7～264位氨基酸，这些氨基酸参与构成该蛋白质的二级结构(KnoxJ.R.等,1991.J.MolBiol.220:435-455)。根据本发明的另一实施方式，上述SEQIDNO:1的第1～258位氨基酸或SEQIDNO:3的第7～264位氨基酸中的一个或多个已经缺失或已经被置换。

根据本发明的又一实施方式，β-内酰胺酶的氨基末端以NH₂-KTEMKDD(SEQIDNO:3的第4～10位氨基酸)开始。如Gebhard等所述，这个所谓的ES-βL胞外形式还可以缺少至多21个连续的残基(GebhardL.G.等,2006,J.Mol.Biol.21:358(1)280-288)。根据本发明的另一实施方式，氨基末端以SEQIDNO:3的谷氨酸(E)开始，特别是其以NH₂-EMKDD(SEQIDNO:3的第6～10位氨基酸)开始，或作为另一选择，其以NH₂-MKDD(SEQIDNO:3的第7～10位氨基酸或SEQIDNO:1的第1～4位氨基酸)开始。

β-内酰胺酶的氨基末端序列中的可变化区域不具有刚性结构，这使得各种β内酰胺酶形式的酶参数具有恒定性。

β-内酰胺酶的羧基末端处的最后4个氨基酸MNGK-COOH(SEQIDNO:3的第265～268位氨基酸)不是二级结构的一部分，因此也可以使之缺失且不会丧失活性。在另一实施方式中，可以缺失至多9个C端氨基酸。该蛋白的C-截短形式已经由Santos等进行了描述(SantosJ.等,2004.Biochemistry43:1715-1723)。

β-内酰胺酶的上述所有不同形式以及该蛋白质的具有β-内酰胺酶活性的其他形式都涵盖在本发明范围内。

本发明的多核苷酸可以包含或具有SEQIDNO:2或4中任一个的序列或其简并序列。作为SEQIDNO:2或4中任一个所示的序列的简并序列的多核苷酸是指与SEQIDNO:2或4相比具有一个或多个不同的核苷酸但编码相同的氨基酸的多核苷酸。优选的是，SEQIDNO:2或4的核苷酸三联体nnn编码亲水性氨基酸，最优选编码N或R。本文所用的“多核苷酸”是如DNA或RNA序列等核苷酸序列，并且可以是单链核酸或双链核酸。术语多核苷酸涵盖基因组DNA、cDNA和mRNA。

根据本发明的具体实施方式，所述多核苷酸与SEQIDNO:2或4或者他们的片段中的任一个核苷酸序列具有至少30%、35%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.8%或99.9%的同一性。

在本发明的一个具体实施方式中，所述多核苷酸具有SEQIDNO:2或4中任一个序列所示的序列。

位于A类β-内酰胺酶的第276位(Ambler)的氨基酸

位于氨基酸位置276的天冬酰胺(Asn,N)存在于多种A类β-内酰胺酶中。Asn276的功能已经在TEM和SHVβ-内酰胺酶中得到了深入研究，其中Asn276与精氨酸(Arg,R)244的胍基团形成氢键，由此限制了Arg244侧链的移动性。

已经意识到，对TEM或SHV酶中的天冬酰胺(Asn,N)进行替换是对丝氨酸β-内酰胺酶抑制剂(例如克拉维酸、舒巴坦或他唑巴坦)的抗性的一个主要贡献因素。TEM-1β-内酰胺酶的N276D(Asp)替换变体存在于抗抑制剂的β-内酰胺酶(IRT酶，例如TEM-35和TEM-36)中。N276D变体对克拉维酸和他唑巴坦的抗性比野生型TEM-1酶更高，但是同时N276D变体对各种青霉素的催化效率(kcat/Km)小于TEM-1野生型酶的50%。N276D变体对头孢菌素的催化效力与野生型TEM-1的催化效率相比有所下降(SavesI等,1995,JBiolChem.270:18240-18245)。

与TEM-1相似，SHV-1或SHV-5中的β-内酰胺酶的N276D替换增强了对丝氨酸β-内酰胺酶抑制剂的抗性，但是降低了它们对大多数β-内酰胺的水解效率(GiakkoupiP.等,1999,JAntimicrobiolChemother,43:23-29)。此外，SHV-1或SHV-5酶中的N276D替换适度地改善了其降解“第4代”头孢菌素头孢匹罗和头孢吡肟的能力。

在SHV型β-内酰胺酶OHIO-1中，N276G(Gly)突变蛋白已经显示出对克拉维酸具有高度抗性，而TEM-1衍生的N276G突变蛋白仅对克拉维酸具有中等抗性(BonomoRA等,1995,BiochimBiophysActa.1247:121-125)。

在CTX-M酶家族中，精氨酸(Arg,R)通常存在于第276位(BonnetR.,2004,AntimicrobAgentsChemother,48:1-14)，并且Arg276的突变会影响酶活性的扩展。CTX-M酶对头孢噻肟的相对水解速率因Arg276的替换而适度下降。此外，Arg276Trp、Arg276Cys、Arg276Ser和Arg276GlyCTX-M突变酶不影响β-内酰胺酶抑制剂抗性的水平(BonnetR.,2004,AntimicrobAgentsChemother,48:1-14;Perez-LlarenaF.J.等,2008,JAntimicrobiolChemother,61:792-797)。

表1.A类β-内酰胺酶中位于第276位(Ambler分类)处的氨基酸残基(MatagneA等,1998,BiochemJ330:581-598;TranierS.等,2000,JBiolChem,275:28075-28082)

现在，在本发明中，包含与SEQIDNO:1(地衣芽孢杆菌PenP衍生物，即P1A衍生物)具有至少60%序列同一性的氨基酸序列并且在SEQIDNO:1的与Ambler分类第276位对应的位置处具有亲水性氨基酸残基的β-内酰胺酶显示出了超广β-内酰胺谱以及提高的对β-内酰胺的催化效果。

之前，在芽孢杆菌属β-内酰胺酶中、特别是地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶中，尚未研究对第276位的天冬氨酸(D)进行的氨基酸替换在对丝氨酸β-内酰胺酶抑制剂的抗性或在对各种β-内酰胺的催化性质方面的作用。

本文所用的Ambler分类第276位氨基酸残基对应于SEQIDNO:1的第243位氨基酸和SEQIDNO:3的第249位氨基酸。

通常，本发明的β-内酰胺酶在与Ambler分类的第276位对应的位置处具有除天冬氨酸(D)之外的亲水性氨基酸。对氨基酸的分类是基于其侧链的化学性质和/或结构性质。氨基酸的类别包括亲水性氨基酸，其可细分为以下组：极性带正电的亲水性氨基酸；极性的电中性亲水性氨基酸；极性带负电的亲水性氨基酸；芳香族的极性带正电的亲水性氨基酸。本文所用的“亲水性氨基酸”包括所有上述组的亲水性氨基酸，即是指极性带正电的亲水性氨基酸、极性的电中性亲水性氨基酸、极性带负电的亲水性氨基酸和/或芳香族的极性带正电的亲水性氨基酸(http://www.biomed.curtin.edu.au/biochem/tutorials/AAs/ AA.html)。“极性带正电的亲水性氨基酸”是指精氨酸(R)或赖氨酸(K)。“极性的电中性亲水性氨基酸”是指天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。“极性带负电的亲水性氨基酸”是指天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。“芳香族的极性带正电的亲水性氨基酸”是指组氨酸(H)。

在本发明的一个实施方式中，所述亲水性氨基酸是位于SeqIDNo:1的与Ambler分类第276位对应的位置处的中性或带正电的亲水性氨基酸，其选自由精氨酸(R)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)组成的组。

在本发明的一个优选实施方式中，位于SEQIDNO:1的与Ambler分类第276位对应的位置处的亲水性氨基酸选自极性带正电的亲水性氨基酸，其来自由精氨酸(R)、组氨酸(H)和赖氨酸(K)组成的组。最优选的是，位于SEQIDNO:1的与Ambler分类第276位对应的位置处的氨基酸是精氨酸。

在本发明的另一优选实施方式中，亲水性氨基酸选自来自由天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)组成的组的极性的电中性亲水性氨基酸。最优选的是，位于SEQIDNO:1的对应于第276位的位置处的氨基酸是天冬酰胺。

在本发明的另一个优选实施方式中，位于SEQIDNO:1的对应于第276位的位置处的亲水性氨基酸处在α螺旋中。α螺旋是蛋白质二级结构的基序，类似于螺旋构象。α螺旋在DNA结合基序(例如螺旋-转角-螺旋、亮氨酸拉链基序和锌指基序)中可以具有特殊意义。在本发明的优选实施方式中，第276位氨基酸残基位于最后的α螺旋₁₁中(图1)。该α螺旋₁₁在A类β-内酰胺酶中不是保守的。

A类β-内酰胺酶的特定特征

A类β-内酰胺酶的一个特定特征是Arg278的胍基团。CTX-M酶具有位于三维结构中等效位置处的Arg278、Arg244或Arg220。据显示，在第220或244位的精氨酸对于TEM-1(Leu220和Arg244)和白色链球菌Gβ-内酰胺酶(Arg220和Asn244)的催化性质而言必不可少。已提出，精氨酸244或精氨酸220的碱性胍基团有助于β-内酰胺的结合或“自杀”抑制剂(如克拉维酸)的失活化学作用(Matagne等,1998,BiochemJ.330:582-598;Perez-Llarena等,2008,JAntimicrobiolChemother,61:792-797)。在地衣芽孢杆菌PenP中，Arg244残基与天冬氨酸276形成盐键(Herzberg,O.1991,JMolBiol.217:701-719;Knox,J.R.,和P.C.Moews,1991,JMolBiol.220:435-555)。

在本发明的优选实施方式中，β-内酰胺酶还可以包含选自由基于Ambler分类的Leu220和Arg244组成的组的至少一种氨基酸，所述Leu220和Arg244分别对应于SEQIDNO:1的Leu189和Arg212。

地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶(PenP，P1A)

本发明的β-内酰胺酶源自地衣芽孢杆菌749/C菌株。地衣芽孢杆菌749/Cβ-内酰胺酶(PenP；青霉素酰氨基β-内酰胺水解酶，EC3.5.2.6)属于对A类β-内酰胺酶的功能分类中的第2a亚组(BushK.等,1995,AntimicrobAgentsChemother39:1211-1233)。可以认为地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶是青霉素酶，其降解例如青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林或哌拉西林的水解能力较高，并且通常被针对活性部位的β-内酰胺酶抑制剂(例如克拉维酸、舒巴坦或他唑巴坦)抑制(BushK.等,1995,AntimicrobAgentsChemother.39:1211-1233)。

地衣芽孢杆菌749/Cβ-内酰胺酶作为307个氨基酸残基的前蛋白表达。在转移并除去其26个氨基酸残基长的信号序列之后，该前蛋白变成膜锚定的脂蛋白，其中氨基末端半胱氨酸(C27)与甘油二酯形成硫醚键。还发现地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶的分泌(细胞外)形式，其为脂蛋白形式的蛋白水解产物(IzuiK.等,1980,Biochemistry19:1882-1886;MatagneA.等,1991,BiochemJ,273:503-510)。已选择了地衣芽孢杆菌749/Cβ-内酰胺酶基因的编码较小分泌形式(较小的胞外形式;P1A)的区域(第43～307位氨基酸残基)作为用于对宿主-载体枯草杆菌生产系统进行改造的DNA片段(WO2008065247)。

功能

β-内酰胺酶水解含有β-内酰胺环的β-内酰胺抗生素，例如青霉素、头孢菌素、克拉维烷(氧青霉烷)、头霉素和碳青霉烯。在本发明的优选实施方式中，β-内酰胺酶水解青霉素和/或头孢菌素。“青霉素”是指最初源自青霉属的青霉素的数种天然或半合成的变体。青霉素包括但不限于阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、羧苄西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、海他西林、苯唑西林、美洛西林、青霉素G、青霉素V和哌拉西林。

在头孢菌素中，β-内酰胺环与二氢噻嗪六元环稠和，而不是与青霉素中发现的噻唑烷五元环稠和。根据生物活性可将头孢菌素分为六代，但某些头孢菌素尚未归类到特定的代中。在本发明的一个具体实施方式中，所述β-内酰胺酶与野生型β-内酰胺酶相比对头孢菌素的催化效率有所提高。根据本发明，第276位(根据Ambler分类进行编号)的天冬氨酸(Asp,D)被亲水性氨基酸残基(例如天冬酰胺(N)或精氨酸(R))替换了的地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶展现出对诸如头孢菌素等β-内酰胺抗生素的超广谱的活性。

在本发明的一个实施方式中，头孢菌素选自由头孢哌酮、头孢曲松和头孢唑林组成的组。

本文所用的β-内酰胺酶的催化效率描述的是水解β-内酰胺抗生素的能力。提高的催化效率可以通过任何常规的体外、离体或体内方法从任何生物样品或受试对象测得。

产生和修饰β-内酰胺酶的方法

本发明的β-内酰胺酶可以通过用任何常规的基因工程方法对酶进行修饰而产生。在产生时可以采用例如以下方法：理性设计、随机诱变、DNA混编(随机重组)、噬菌体展示、全基因组混编、异源双链体、对所设计的寡核苷酸的临时模板集随机嵌合、诱变和单向重组装、外显子混编、基于Y形连接的区段混编(Y-ligation-basedblockshuffling)、非同源重组、理性设计与定向进化的组合。此外，突变酶可以通过使用位点定向诱变和利用重叠延伸技术的剪接来获得。

在本发明的一个实施方式中，修饰β-内酰胺酶的方法包括以下步骤：通过用亲水性氨基酸置换位于SEQIDNO:1的与Ambler分类第276位对应的位置处的氨基酸来修饰β-内酰胺酶，所述β-内酰胺酶包含与SEQIDNO:1具有至少60%序列同一性的氨基酸序列。该亲水性氨基酸可以是任何亲水性氨基酸，例如选自由精氨酸(R)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)组成的组。

在本发明的一个实施方式中，位于SEQIDNO:1的与Ambler分类第276位对应的位置处的非亲水性氨基酸被亲水性氨基酸置换。

本发明的β-内酰胺酶还可以通过例如合成方法(如肽合成)或通过在宿主细胞中的重组生产来生产。在本发明的优选实施方式中，所述酶是重组的。本文所用的“重组”遗传物质是指下述物质：其通常为遗传材料(例如各种来源的DNA链)的组合，并且已经通过组合或插入序列而制得。例如可以将本发明的多核苷酸在任何内源或外源调控子(例如启动子)的控制下插入。重组蛋白源自重组DNA。

至少一种兴趣多核苷酸或多核苷酸片段可以从细胞中分离出或通过合成来生产。可以将该多核苷酸或多核苷酸片段转化到宿主细胞中。用于生产本发明的任何肽的合适的宿主细胞可以是任何真核细胞或原核细胞，优选细菌，最优选芽孢杆菌属菌株，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或解淀粉芽胞杆菌。

本文所用的“转化”是指通过外源遗传物质(优选DNA)使细胞发生遗传变异，从而引起该遗传物质的表达。外源遗传物质可以原样导入或以整合在任何其他遗传物质(例如载体、质粒等)中的形式来导入。可以使用任何基因工程方法或任何分子克隆方法来用本发明的多核苷酸转化宿主细胞。存在各种方法将外源物质导入真核细胞中。已经使用诸如聚合物(例如DEAE-右旋糖苷或聚乙烯亚胺)、脂质体和纳米颗粒(例如金)等材料作为转化用运载体。还可以使用例如病毒或载体作为运载体将遗传物质导入细胞中。用于将外源物质导入细胞中的其他方法包括但不限于核转染、电穿孔、接合、转染、声孔作用(sonoporation)、热休克和磁转染。

在宿主细胞已经在适合的条件下产生本发明的肽之后，可以例如从所述细胞中纯化出所述肽，或例如从培养基中回收所述肽的分泌形式。在本发明的优选实施方式中，所述β-内酰胺酶被分泌。

药物组合物

本发明的药物组合物包含本发明的β-内酰胺酶。所述组合物可以仅包含一种β-内酰胺酶，或包含更多种，例如至少2种、3种、4种等不同的β-内酰胺酶。

本发明的药物组合物还可以包含除本发明的β-内酰胺酶之外的任何其他活性成分。

所述药物组合物可以以例如固体、半固体或液体形式(例如以片剂、微丸剂、胶囊剂、溶液、乳液或悬浮液形式)使用。优选的是所述组合物用于口服施用或用于肠道应用。

除了本发明的至少一种β-内酰胺酶或多核苷酸或包含本发明的多核苷酸的宿主细胞之外，所述药物组合物可以包含药学上可接受的载剂、佐剂、赋形剂、辅助赋形剂、防腐剂、稳定剂、结合剂、填充剂、润滑剂、悬浮剂、塑化剂、着色剂、成膜剂、糖、醇、助流剂和稀释剂和/或在相应产品中常见的成分。

本发明的产品或药物组合物包含足以产生所需效果的量的β-内酰胺酶。

所述产品或药物组合物可以通过本领域已知的任何常规方法制造。可以将β-内酰胺酶添加至任何药物产品中或在任何制备步骤中将其与任何试剂混合。本发明的β-内酰胺酶还可以通过例如在合适的条件下在药物产品中产生或在所述药物产品降解后于靶组织中表达β-内酰胺酶基因来产生。

在本发明的优选实施方式中，将β-内酰胺酶和β-内酰胺抗生素以肠溶包衣微丸剂的形式一起施用至受试对象。对于亲水性P1A蛋白的包衣工序而言，水性包衣形式似乎是最有利的材料。用来实现肠溶性质的常用的并且也可用于本发明的水性聚合物是聚甲基丙烯酸酯(例如)、纤维素类聚合物(例如纤维素醚(如)或纤维素酯(如))或者聚乙酸乙烯酯共聚物(例如)。

本发明的β-内酰胺酶或本发明的药物组合物可以与β-内酰胺抗生素同时施用或者依次施用给受试对象。在本发明的一个实施方式中，在施用β-内酰胺抗生素之前，例如在施用β-内酰胺抗生素前5～30分钟，施用β-内酰胺酶或药物组合物。所述β-内酰胺酶和一种或多种β-内酰胺抗生素可以在同一制剂中或在不同制剂中。

β-内酰胺的副作用和治疗

β-内酰胺抗生素的副作用(即药物不良反应)可以包括但不限于腹泻、恶心、皮疹、荨麻疹、重叠感染、发热、呕吐、红斑、皮炎、血管性水肿和假膜性结肠炎。

在本发明的优选实施方式中，待治疗或预防的副作用出现在胃肠道(GIT)中。本文所用的胃肠道是指从口延伸到肛门的消化结构。胃肠道包括口、食道、胃、十二指肠、空肠、回肠、小肠、结肠、盲肠、直肠和肛门。

可以将本发明的β-内酰胺酶或本发明的药物组合物口服施用给受试对象或直接施用至胃肠道。酶的组合药物产品旨在使GIT中或其他不期望的体腔(如皮肤或阴道腔)中的未吸收的β-内酰胺失活。药物组合物可以是口服施用的药物产品、皮肤病制剂或阴道栓剂，并且可以包含液体剂型、速释剂型、延迟释放剂型或持续释放剂型。

在本发明的一个优选实施方式中，口服施用所述β-内酰胺酶。在本发明的另一优选实施方式中，直接向患者的胃肠施用所述β-内酰胺酶。

受治疗的受试对象可以是人或动物，例如宠物或生产动物，如犬、猫、牛、猪、鸡或马。在本发明的优选实施方式中，受试对象是人。

通过以下实施例来说明本发明，但这些实施例无论如何不意图为限制性的。

实施例1.D276N和D276R突变酶的构建

地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶D276N和D276R突变形式通过以下方法来构建：根据之前公开的方法(HortonR.M.等,1989,Gene77:61-68)，使用编码P1Aβ-内酰胺酶的pRSH10质粒作为起始PCR反应的模板，来进行重叠延伸剪接诱变(SOE)。将引物设计成提供具有共同序列区的两种不同的PCR产品。然后借助于重叠区将片段融合在随后的PCR扩增中。通过在起始PCR中使用诱变引物来实现所需的突变。

为了获得D276N突变形式，在野生型基因中的所需位置制造突变，将GAT密码子转化成AAT密码子。第一次PCR扩增中使用的引物示于表2中。第一次PCR中扩增的片段的大小为800nt和220nt，它们具有21nt长的重叠区。

表2.寡核苷酸PCR引物。将互补区暗化，突变的密码子以粗体表示。在第二次PCR中对融合的片段进行扩增时使用正向-1引物和反向-1引物。

在第二次PCR反应(SOE反应)中，两个重叠片段在随后的延伸反应中融合在一起。在延伸反应中外侧引物(正向-1和反向-1)的引入使融合产物得到了PCR扩增。用HindIII限制性内切酶消化经纯化的SOE产物，并将其连接到WO2008/065247中所述的经HindIII切割的pKTH141分泌载体中。

用连接混合物转化枯草芽孢杆菌RS303的感受态细胞。将单个菌落的细菌团悬浮在头孢硝噻溶液中，从而在Luria-卡那霉素平板上筛选阳性克隆。阳性克隆有效地水解头孢硝噻，将头孢硝噻溶液的颜色从黄色变为红色。从单克隆的细胞中纯化出杂交质粒。通过DNA测序验证了PCR生成区的正确序列。

为了获得D276R突变形式，在所需位置处通过将GAT密码子转化成CGC密码子来制造突变。D276R突变菌株的构建以与D276N突变的构建相似的方式进行，不同之处在于：在起始PCR中使用反向-D276R引物和正向-D276R引物(见表2)。

实施例2.D276N突变β-内酰胺酶基因(penP)的核苷酸序列

从阳性克隆中分离出表达构建体，并对插入序列进行DNA测序。D276N突变β-内酰胺酶基因的全核苷酸序列和推导出的氨基酸序列揭示出，在所需的密码子处正确地出现了Asn对Asp的替换(图2)。此外，D276N突变β-内酰胺酶基因的DNA序列揭示了编码解淀粉芽胞杆菌α淀粉酶的31个氨基酸长的信号序列的核苷酸序列、HindIII克隆位点和D276N突变基因的全序列之间的框内融合。据预测，信号肽酶会切割-1位的丙氨酸(A)与+1位的谷氨酰胺(Q)之间的肽键。成熟D276Nβ-内酰胺酶拥有源自表达构建体中的HindIII克隆位点的NH₂-QAS-三肽NH₂-末端延伸。因此，基于所推导的氨基酸序列，成熟D276N突变β-内酰胺酶由268个氨基酸残基组成。

实施例3.D276R突变β-内酰胺酶基因(penP)的核苷酸序列

为了确认地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶基因中的在第276位(Ambler分类)的天冬氨酸至精氨酸的所需替换，从阳性克隆中分离出了表达构建体，并以与实施例2类似的方式对插入序列的核苷酸序列进行测序。根据所获得的核苷酸序列，推导出的氨基酸序列含有所需的D276R替换，并且成熟D276R突变酶由268个氨基酸残基组成(图3)

实施例4.对D276N突变β-内酰胺酶(P3A)的生化分析

通过SDS-PAGE分析，估算出酶制备物的纯度大于95%(数据未示出)。

确定了野生型(P1A)和D276N(P3A)突变型地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶在水解各种类型的β-内酰胺时的动力学参数，并将其总结于表3中。通过使用合适的酶浓度和各种浓度的青霉素或头孢菌素底物，在20mM磷酸盐缓冲液(pH7)中于30°C进行了酶促反应。借助于Hanes线性化方法获得了k_cat和K_m值。以下描述了主要结果。

(i)青霉素

D276N替换对青霉素(氨苄青霉素、阿莫西林或哌拉西林)的水解的影响并不强烈，其酶促效率为野生型酶的酶促效率的51%～80%。因此，D276N突变酶对青霉素的k_cat/K_m值的减少最大为两倍以下。

(ii)头孢菌素

如所预期，相对于青霉素，野生型β-内酰胺酶对各种头孢菌素的酶促效率较差，所述各种头孢菌素包括第一代头孢菌素(头孢唑林)、第二代头孢菌素(头孢呋辛)和第三代头孢菌素(头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮和头孢吡肟)(表1)。令人惊奇的是，D276N突变酶对某些头孢菌素(优选对头孢哌酮、更优选对头孢曲松)的酶促效率相对于用野生型酶获得的酶促效率具有实质性的提高。对头孢曲松和头孢哌酮的K_m常数相对于野生型酶(P1A)有所下降，伴随的是对头孢曲松和头孢哌酮的转换数(k_cat)相对于野生型酶(P1A)有所增大。因此在地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶的第276位处的天冬氨酸-天冬酰胺替换有助于地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶的β-内酰胺底物谱的扩展。

表3.地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶的野生型酶(P1A)和D276N突变酶水解β-内酰胺底物的动力学参数。

⁽¹D276N的相对催化效率(k_cat/K_m)与野生型酶(P1A)的相对催化效率(k_cat/K_m)相比

实施例5.对D276R突变酶的生化表征

构建了D276R突变酶以评估Asp276是否能够容忍替换，并且估算D276R替换对在D276N酶中观察到的β-内酰胺酶活性扩展的贡献。

使用从培养物上清液获得的D276R和D276N的粗提酶样品作为测试材料。酶样品的纯度和量通过进行SDS-PAGE-分析来估算。通过确定V_max值来进行评价D276R和D276N突变酶对各种β-内酰胺的水解速率。在表4中将所获得的结果表示为相对于D276N酶的结果的相对活性(%)。

通常，D276Rβ-内酰胺酶对青霉素和头孢菌素的催化效率均与D276N酶的催化效率相当。与D276N酶相比，D276R酶对头孢曲松的活性下降，而对头孢哌酮的活性升高。该研究表明，通过用诸如精氨酸或天冬酰胺等亲水性氨基酸残基替换地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶中第276位的天冬氨酸，可以实现对β-内酰胺的超广谱。其还表明，通过用诸如谷氨酰胺(Q)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)等另一亲水性氨基酸残基替换第276位的天冬氨酸可以实现所需的酶修饰。

表4.D276R突变酶相对于D276N突变酶的相对活性(%)

β-内酰胺	相对活性
		氨苄青霉素	8215 -->
哌拉西林	84
		阿莫西林	71
头孢曲松	50
		头孢噻肟	105
头孢他啶	-
		头孢吡肟	74
头孢唑林	84
		头孢哌酮	232
头孢呋辛	99

实施例6.对D276Nβ-内酰胺酶的体内研究

在犬模型中研究了地衣芽孢杆菌D276N突变β-内酰胺酶使在胃肠外治疗过程中被排泄到胃肠道中的头孢曲松(CRO)失活的能力。该研究中的实验小猎犬具有通过外科手术插入到空肠的距离幽门约170cm处的乳头阀，从而能够收集分析用样品。该小肠外科手术并未改变小肠的运动性。每个实验中使用了5只小猎犬。

该研究以两个连续治疗的形式进行：在第一个治疗(对照试验，不使用β-内酰胺酶疗法)中，在第一次饲喂犬20分钟之后静脉内施用单剂量的头孢曲松(每kg体重30mg头孢曲松(CRO)，这相当于人类中的约1克剂量的CRO)。在十个小时期间在多个时间点收集空肠样品。在施用头孢曲松之后5小时40分钟，再次饲喂犬，以诱导胆囊中累积的头孢曲松的胆道排泄。

将空肠食糜样品立即冷冻并贮存在-20°C以等待分析。用高氯酸-柠檬酸预处理食糜样品以使干扰物质沉淀。离心除去沉淀物。使用带有UV检测的反相高压色谱法对上清液中的头孢曲松进行定量。

在第二个治疗中，在注射头孢曲松之前10分钟，以填充在硬明胶胶囊中的肠溶包衣微丸剂的形式给予D276N突变β-内酰胺酶。肠溶包衣剂型在医药工业的口服产品中是常见的。经设计，肠溶包衣药物产品以完整形式经过胃并在小肠中释放剂型中的内含物。应用肠溶固体制剂的原因是为了保护原料药免受胃的酶或低pH环境的破坏作用，或者为了防止原料药诱导的胃黏膜刺激、恶心或出血，或者为了将未稀释形式的原料药递送到小肠中的靶位。基于这些标准，肠溶包衣药物产品可以视为一种迟效作用剂型。为了得到pH依赖性的肠溶包衣剂型，采用了聚甲基丙烯酸聚合物L30D-55。在第二个治疗中使用了含有每kg体重约0.44mg活性D276Nβ-内酰胺酶的单剂量的肠溶包衣微丸剂。

从这两个治疗获得的结果示于图4中。治疗1显示出，在胃肠外头孢曲松治疗过程中，高浓度的头孢曲松被排泄到小肠肠道中。在注射头孢曲松后60分钟，发现了最高的空肠浓度(每克空肠食糜含约1500微克)。在第二次饲喂犬(在340分钟的时间点)之后，观察到了空肠头孢曲松水平升高，这表明食物刺激了积累在胆囊中的含有头孢曲松的胆汁的排泄。

治疗2显示出，口服施用的D276N突变β-内酰胺酶能够将空肠头孢曲松水平减少至接近定量极限(每微克空肠食糜10微克头孢曲松)。该发现表明，D276N突变β-内酰胺酶是用于减少与胃肠外使用头孢曲松相关的副作用的强力原料药候选。此外，基于对诸如氨苄青霉素、阿莫西林和哌拉西林等青霉素的高活性，D276N或D276R突变酶可以用作WO2008065247所述的β-内酰胺酶疗法中的替代性原料药。

Claims

1.一种β-内酰胺酶，所述β-内酰胺酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1，所述β-内酰胺酶具有针对青霉素和头孢菌素的β-内酰胺酶活性，并且在所述β-内酰胺酶中，与Ambler分类第276位对应的位置处为精氨酸(R)或天冬酰胺(N)，其中，所述头孢菌素选自头孢曲松和头孢哌酮。

2.一种修饰β-内酰胺酶以获得针对青霉素和头孢菌素的β-内酰胺酶活性的方法，所述β-内酰胺酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1，所述方法的特征在于，用除天冬氨酸(D)之外的亲水性氨基酸置换所述β-内酰胺酶在SEQIDNO:1的与Ambler分类第276位对应的位置处的氨基酸，所述亲水性氨基酸选自精氨酸(R)和天冬酰胺(N)，其中，所述头孢菌素选自头孢曲松和头孢哌酮。

3.如权利要求1所述的β-内酰胺酶或权利要求2所述的方法，其特征在于，在SEQIDNO:1的对应于第276位的位置处的所述氨基酸是天冬酰胺(N)。

4.如权利要求1所述的β-内酰胺酶或权利要求2所述的方法，其特征在于，在SEQIDNO:1的对应于第276位的位置处的所述氨基酸是精氨酸(R)。

5.如权利要求1所述的β-内酰胺酶或权利要求2所述的方法，其特征在于，在SEQIDNO:1的对应于第276位的位置处的所述亲水性氨基酸位于α螺旋中。

6.如权利要求1所述的β-内酰胺酶或权利要求2所述的方法，其特征在于，所述β-内酰胺酶还包含选自由基于Ambler分类的Leu220和Arg244组成的组的至少一种氨基酸。

7.如权利要求1所述的β-内酰胺酶或权利要求2所述的方法，其特征在于，所述β-内酰胺酶与SEQIDNO:1的β-内酰胺酶相比具有提高的对头孢菌素的催化效率。

8.如权利要求1所述的β-内酰胺酶或权利要求2所述的方法，其特征在于，所述头孢菌素选自由头孢哌酮和头孢曲松组成的组。

9.一种生产权利要求1或权利要求3～8中任一项所述的β-内酰胺酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

i)提供编码权利要求1或权利要求3～8中任一项所述的β-内酰胺酶的基因；

ii)用所述基因转化宿主细胞；

iii)获得产生所述β-内酰胺酶的宿主细胞；

iv)回收所述β-内酰胺酶。

10.一种用于治疗或预防β-内酰胺抗生素在胃肠道中引起的副作用的组合物，所述组合物包含权利要求1或权利要求3～8中任一项所述的β-内酰胺酶，其中，所述组合物适合于与β-内酰胺抗生素同时施用或依次施用给受试对象。

11.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸由SEQIDNO:2或SEQIDNO:4中任一个的序列构成，或者所述多核苷酸编码权利要求1或权利要求3～8或权利要求10中任一项所述的β-内酰胺酶。

12.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求11所述的多核苷酸。

13.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1或权利要求3～8或权利要求10中任一项所述的β-内酰胺酶。

14.如权利要求1或权利要求3～8或权利要求10中任一项所述的β-内酰胺酶，所述β-内酰胺酶用作药物。

15.权利要求1或权利要求3～8或权利要求10中任一项所述的β-内酰胺酶在制造用于治疗或预防β-内酰胺抗生素在胃肠道中引起的副作用的药物中的应用。

16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述β-内酰胺酶用于口服施用。

17.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述β-内酰胺酶用于直接胃肠施用。

18.如权利要求15～17中任一项所述的应用，其特征在于，所述β-内酰胺酶用于作为肠溶包衣微丸剂施用给受试对象。