KR101609243B1

KR101609243B1 - 변형 베타-락타마제 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR101609243B1
Application number: KR1020097001283A
Authority: KR
Inventors: 수산나 카리아이넨; 니나 위크스트랜드; 뻬르띠 코스키
Original assignee: 아이피에스에이티 테라피즈 오와이
Priority date: 2006-06-21
Filing date: 2007-06-19
Publication date: 2016-04-05
Also published as: US7989192B2; EP2038411B1; EP2038411A4; RU2009101795A; NO342006B1; CA2659691C; BRPI0713726B1; FI20065431A; US20090181004A1; CA2659691A1; JP5306191B2; FI20065431A0; FI119190B; ES2452321T3; NZ573696A; BRPI0713726A2; KR20090046787A; ZA200810460B; AU2007262916B2; JP2009540814A

Abstract

본 발명은, 재조합 DNA 생산 시스템(recombinant DNA production system)에서 아미노 말단의 불균일성(heterogeneity)을 줄이기 위해, 아미노 말단부분에서 디펩타이드를 절단하고 삽입하는 메탈로 베타 락타마제의 번역 후 변형(modification)에 대한 것이다.

단백질 K-T-E-△BL가 발현된 후 숙주 프로테아제에 의해 E-△BL로 변형된다. 뉴클레오타이드, 벡터 및 숙주에 대해서는 본문에 상세히 설명하였다.

E-△BL은 베타 락탐 항생제 치료를 받는 환자의 장에서 항생제 유발 부작용을 치료하는 제약용 조성물(pharmaceutical composition)로 유용하다.

Description

변형 베타-락타마제 및 이의 제조 방법{MODIFIED BETA-LACTAMASE AND METHOD FOR ITS PREPARATION}

박테리아의 감염에 의한 질병을 치료하는데 많은 항생제(antibiotics)가 사용된다. 그러나 항생제는 병원균을 공격할 뿐만 아니라 환자의 소화관에 있는 일반적인 세균총(細菌叢, bacterial flora)에도 영향을 미쳐 부작용을 일으킬 수 있다. 상기와 같은 부작용은 소화관에서 잔여 항생제를 분해할 수 있는 효소를 투여함으로써 줄일 수 있다.

본 발명은 베타-락탐 고리를 가지는 항상제의 부작용을 예방하거나 이러한 효소 제제에 유용한 메탈로-베타-락타마제(metallo-beta-lactamases)에 대한 것이다.

본 발명은 유용한 변형 베타 락타마제(modified beta-lactamases)의 뉴클레오타이드 분자, 벡터, 숙주 세포 뿐만 아니라 변형 베타 락타마제의 제조 방법을 제공한다.

베타-락타마제(beta-lactamase) 효소는 페니실린(penicillins), 세파로스포 린(cephalosporins) 및 카르바페넴(carbapenems) 등 베타-락탐계 항생제에 대해 내을 갖는 박테리아의 주요 대사물질이다. 상기 효소는 베타-락탐 고리의 아마이드 결합의 비가역적인 가수분해를 촉매작용하여 항균제의 효과를 떨어뜨린다.

분자 구조 분류 및 촉매 매카니즘을 바탕으로 상기 베타 락타마제를 A, B, C 또는 D 4가지로 분류할 수 있다. A, C 및 D는 세린 효소(serine enzymes)이고, 대부분의 베타 락타마제를 구성한다(Ambler, 1980). 이러한 효소는 일반적으로 페니실린 또는 세파로스포린을 비활성화 시키며 종종 상기 두 가지 항생제 중 하나에 대한 선호도를 보인다.

B형 베타 락타마제는 메탈로 효소(metallo-enzyme)이며, 효소 활성을 위한 조효소로 하나 또는 두개의 아연 이온을 필요로한다.

부쉬-자코비-마데로스(bush-jacoby-maderios)의 기능적 분류에 따르면 상기 메탈로 베타 락타마제(metallo-beta-lactamases)는 3 그룹으로 나뉘어진다(bush, 1998). 상기와 같은 체계는 일차적으로 기질 프로필(substrate profiles), EDTA(Ethylenediamine tetraacetic acid)에 대한 감수성(sensitivity) 및 세린 베타 락타마제 억제제(serine beta-lactamase inhibitors)에 대한 내성을 기초로 하여 분류한 것이다.

메탈로 베타 락타마제는 아연과 배위결합한 부분의 구조적 유사성을 바탕으로 하여B1, B2 및 B3의 세개의 하위 그룹으로 나뉜다.

하위 그룹인 B1은 주요 아연 배위 결합 잔기인 3개의 히스티딘(histidines)과 1개의 시스테인(systeine)을 가지고 있다. 대부분의 B1 효소는 결정상 구조로 설명되는데, 예를 들어, 바실러스 시리우스(Bacillus cereus)의 BcII(Carfi 등, 1995 and 1998a), 박터로이드 프라질리스(Bacteroides fragilis)의 CcrA(Carfi 등, 1998b) 및 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 IMP-1(Concha 등, 2000)이 있다.

이에 상응하여, B2 그룹의 락타마제는, 히스티딘(histidine)을 대신, 아연 결합 모티브(motif)인 NXHXD의 첫번째 위치에 아르기닌(arginine)잔기가 있다. 최근에, B2 효소(CphA)의 첫번째 결정 구조가 가라우(Garau) 등에 의해 해석되었다(2005).

B3 그룹은 다중 결합 구조를 가진 효소가 포함된다(Walsh et al., 2005).

메탈로 베타 락타마제는 페니실린 및 세팔로스포린을 포함한 폭넓은 스펙트럼 기질 프로필(substrate profile)을 보여주는데, 이들은 클라불란산 설박탐(clavulanic acid sulbactam) 및 타조박탐(tazobactam)과 같은 기존의 세린 베타 락타마제 억제제의 활동에 대한 내성이 있다.

더욱이, 대부분의 세린 베타 락타마제와 달리, 메탈로 베타 락타마제는 메로페넴(meropenem) 및 이미페넴(imipenem)과 같은 카르바페넴(carbapenem)을 가수분해시킬 수 있다.

많은 박테리아는 메탈로 베타 락타마제를 생산하는 것으로 알려져 있다. 이러한 것들로는 엔테로박테리아 속(Enterobacteriae genus, 세라티아 마케스센스(Serratia marcescens), 클라브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 시트로박터 프라우디(Citrobacter freudii), 시겔라 피엑스너프(Shigella fiexnerf) 포 함), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스테노박테리움 말토필라(Stenobacterium maltophila), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 박터로이드 프라질리스(Bacteroides fragilis), 바실러스 시리우스(Bacillus cereus), 플라보박테리움 오도라툼(Flavobacteruim odoratum), 및 박터로이드 프라질리스(Bacteroides fragilis) (Walsh 등, 2005)이 있다.

베타 락타마제는 제약용 단백질(pharmaceutical proteins)로 사용되어 위장관(gastro intestinal tract)에서 흡수되지 않은 베타 락탐을 비활성화 시켜 장내세균총(intestinal normal microbiota)의 변화 및 베타 락탐 내성 박테리아의 과성장과 베타 락탐에 의해 유발되는 부작용을 일으키지 않도록 한다(WO93/13795, WO2004/016248).

소장관(small intestinal tract)에서 효과적인 베타 락타마제 치료를 위해, 상기 효소는 답즙산이 있는 경우 장(intestinal) 프로테아제의 활동에 내성이 있어야 하며, 폭넓은 범위의 산도(pH5.5-7.5)에서 높은 효소적 활성을 유지해야 한다.

비경구 암피실린(ampicilline) 치료를 하는 동안 개 및 쥐 모델에서 바실러스 릭케니포르미스(Bacillus licheniformis) 세린 베타 락타마제를 이용한 대상 효소 치료의 가능성이 보여졌다(Harmoinen 등, 2004, Mentula 등, 2004, Stiefel 등, 2003).

그러나, 베타 락타마제 억제제가 있으면, 세팔로스포린, 카르바페넴 또는 페니실린을 가수분해 하지 못하기 때문에, 이 효소의 기질 프로필은 약의 재료로 사용하는데 제약사항이 있다.

따라서, 다양한 베타 락탐에 의한 정맥 치료를 받고 있는 환자에 있어서, 광범위한 베타 락탐 스펙트럼을 갖는 새로운 프로테아제 내성 베타 락타마제 효소가 필요하다.

메탈로 베타 락타마제는 다양한 유형의 베타 락탐을 비활성화시키는 것으로 알려져 있으며, 세린 베타 락타마제의 억제제에 대한 내성이 있다.

바실러스 시리우스(Bacillus cereus) 계통(strain)은 B1 그룹에 속하는 메탈로 베타 락타마제를 생산하는 것으로 알려져 있다.

임상의 바실러스 시리우스 98ME 1552의 추출물의 반 정제 재조합 메탈로 베타 락타마제 시료(A semi purified recombinantly produced metallo-beta- lactamase sample of a clinical Bacillus cereus 98ME 1552)는 쥐를 이용한 실험에서 잠재적 병원성 박테리아의 과성장을 제거한 것으로 확인되었다(Stiefel 등, 2005).

그러나 본 발명자들은 베타 락타마제 변종의 혼합물(다양한 약물 재료(drug substance)이 생산 절차의 안전성을 줄이기 때문에 제약용 단백질(pharmaceutical protein)로서의 가치가 떨어지는)이 함유된 이 메탈로 베타 락타마제 제제가 변이를 증가시키고 임상적인 실험을 어렵게 하여 치료제로서 등록되는 것에 부정적인 영향을 준다는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명은 메탈로 베타 락타마제의 재조합 생산(recombinant production)과 관련된 아미노 말단의 불균일(heterogenicity)성을 줄이는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 실질적으로 균질한 형태(pure form)로 생산될 수 있고, 제약용 조성물(pharmaceutical compositions)의 제조에 사용될 수 있는 변형 메탈로 베타 락타마제(modified metallo-beta-lactamases)를 제공한다.

본 발명은 다음의 식을 갖는 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질(modified metallo-beta-lactamase protein)을 제공한다.

NH₂- K - T - E - ΔBL-COOH(I)

상기 식 (I)에서 K는 리신(lysine), T는 트레오닌(threonine), E는 글루탐산(glutamic acid)이고, ΔBL 는 메탈로 베타 락타마제 단백질로 아미노 말단 끝에서 절단되어 상기 단백질의 예측되는 2차 구조의 첫번째 알파나선(alpha-helix) 앞에 4개의 베타판(beta-strand)으로 남아있는 것이다.

본 발명은 또한, 상기 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질을 코딩하는 뉴클레오 타이드 시퀀스로 구성된 추출된 뉴클레오타이드 분자 및 상기 뉴클레오타이드 분자를 함유하는 발현 벡터(expression vector), 상기 뉴클레오타이드 분자에 의해서 코딩된 메탈로 베타 락타마제를 발현할 수 있는 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 하기 식을 가진 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질을 제공한다.

NH₂- E - ΔBL-COOH(Ⅱ)

상기 식(Ⅱ)에서 E와 ΔBL는 위에서 정의한 것과 동일하다.

본 발명은 또한, 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 일반적으로 하기 식(I)을 갖는 메탈로 베타 락타마제가 발현되고 번역 후 변형(post translational modification)을 통해 하기 식(Ⅱ)을 갖는 변형 메탈로 베타 락타마제를 얻을 수 있는 조건하에서 이루어지는 상기 숙주 세포의 배양을 포함하는 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질 제조 방법을 제공한다:

NH₂- K - T - E - ΔBL-COOH(I)

NH₂- E - ΔBL-COOH(Ⅱ)

상기 식 (I)에서 K는 리신(lysine)이고, T는 트레오닌이고, E는 글루탐산이고, ΔBL은 메탈로 베타 락타마제 단백질로 아미노 말단 끝에서 절단되어 상기 단백질의 예측되는 2차 구조의 첫번째 알파나선 앞의 4개의 베타판으로 남아있는 것이며, 상기 식 (Ⅱ)에서 E 및 ΔBL은 상기에서 정의한 것과 동일하다.

또한 상기 방법은 선택적으로 상기에서 얻어진 번역 후 변형 단백질(post translationally modified protein)을 분리 정제하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 식 Ⅱ의 변형 메탈로 베타 락타마제를 포함하는 제약용 조성물(pharmaceutical composition), 약제조용으로 사용하기 위한 식 Ⅱ의 변형 메탈로 베타 락타마제의 용도, 및 위장관(intestinal tract)에서 베타 락탐 억제제 유도성 부작용 제거용 약제의 제조를 위한 변형 메탈로 베타 락타마제의 용도를 제공한다.

마지막으로 본 발명은, 식 Ⅱ의 변형 메탈로 베타 락타마제의 유효량을 투여하거나 이를 포함하는 제약용 조성물(pharmaceutical composition)을 필요한 사람에게 투여하여 베타 락탐 항생제 유발성 부작용을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예는 종속항에 규정되어 있다.

다른 목적으로는, 본 발명의 자세한 내용 및 효과는 발명의 상세한 설명, 실시예 및 도면을 바탕으로 상세하게 설명하였다.

메탈로 베타 락타마제는 완전한 메탈로 베타 효소를 인코딩하는 완전한 메탈로 베타 락타마제 유전자의 발현구조를 포함하는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 생산 시스템에서 최초로 생산되었다.

상세한 질량 분광 분석(mass spectrometry analysis)을 통해 메탈로 효소가 불균일(heterogeneous)한 아미노 말단 시퀀스를 가진 다양한 효소 변이(variants)를 포함하고 있는 것으로 확인하였다.

아미노 말단 시퀀스(amino terminus sequences)의 변이는 숙주 세포 프로테아제의 번역 후 변형(post translational modification)의 결과인 것으로 이해되었다.

메탈로 효소의 아마노산 시퀀스에서 관찰된 변이(alterarions)는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)생산 시스템에서 생산되는 효소의 배치별(batch to batch) 변이를 증가시키고 따라서, 조절의 관점에서, 제약용 단백질(pharmaceutical protein)로의 사용이 어려운 것으로 보인다.

따라서, 메탈로 베타 락타마제 효소의 아미노 말단 시퀀스에서 관찰된 변이를 줄이기 위한 분자생물적 방법이 연구되었다.

아미노 말단 부위는 상기 효소의 촉매적 특성에 대해 영향을 받지 않을 것으로 예상된다.

또한, 아미노 말단 부위는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 생산 시스템에 있는 프로테아제의 번역 후 변형에 노출된다고 밝혀졌는데, 여기의 변형 단백질(modified protein)은 박테리아 세포 외부에서 분비된다.

아미노 말단 부위에서 이러한 미세불균일성(microheterogeneity)를 줄이기 위해서는, 이러한 예상되는 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스가 PCR방법에 의해서 제거되어야 한다. 그러나 단순하게 자동적으로 제거하는 것은 아미노 말단 불균일성을 줄이는데 효과적이지 않다.

그러나, 원래 번역 후 변형(post translational modification)에 사용하기 위한, 디펩타이드(dipeptide)을 삽입하면서 제거하는 방법을 이용하면, 동일하게 변형된 아미노 말단이 있는 단일의 메탈로 베타 락타마제가 생산된다.

본 발명은 일반적으로 변형 베타 락타마제에 대한 것으로 제약용 단백질(pharmaceutical protein)로 사용할 수 있으며, 또한 아미노 말단에서 디펩타이드를 삽입하고 절단(truncation)해서 베타 락타마제 변이를 줄여 생산되는 변형 베타 락타마제 중간체(intermediate)에 대한 것이다.

이러한 변형은 베타 락탐 유도성 부작용(클라부라닉산(clavulanic acid), 설박탐(sulbactam) 및 타조박탐(tazobactam)과 같은 공지의 베타 락타마제 억제제가 존재하거나 부존재하는 경우의 세팔로스포린(cephalosporins), 카르바페넴(carbapenems) 및 페니실린(penicillins))을 줄이기 위한 베타 락타마제 치료에 사용되는 약재(drug substance)용 균질 형태(homologous form)의 효소의 재조합 생산(recombinant production)을 촉진시킨다.

본 발명은 특히, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 생산 시스템에서 아미노 말단 불균일성(heterogeneity)를 감소시키 위한 아미노 말단 부위에서의 디펩타이드의 삽입 및 절단에 의한 활성 메탈로 베타 락타마제의 번역 후 변형에 관련된 것이다.

여기에 사용되는 용어인 메탈로 베타 락타마제(metallo-beta-lacamase)는 B 베타 락타마제인 것으로, 즉, 활성을 위해 최소 1개의 2가 금속 이온(Zn²⁺)이 요구되는 베타 락타마제로 부쉬-자코비-마데로스(Bush-Jacoby-Madeiros) 기능 분류 중 3개로 구성되는 것이다(Bush 1998).

아연 결합과 배위결합한 지역에서의 구조적 유사성 때문에, 메탈로 베타 락타마제는 3개의 하위그룹인 B1, B2 및 B3로 나뉘어진다.

바람직하게는 본 발명의 메탈로 베타 락타마제는 하위그룹 B1에 속한다. 이 하위그룹은 3개의 히스티딘(histidines)과 하나의 시스테인(cysteine)의 잔기와 배위결합한 아연을 가진다. 이 하위그룹에 대한 상세한 내용은 이 명세서의 배경기술란에 설명하였다.

메탈로 베타 락타마제는 유사한 4개의 층이 있는 αβ/βα 구조를 공유하는 크고 다양한 상과(上科, superfamily) 단백질에 포함되어 있다.

상기 폴리펩타이드 사슬은 두개의 부분(domain)으로 나뉘어지는데, 각각 β₁ β₂ β₃ β₄ β5 α₁ β₆ α₂ β₇ α₃ 및 β₈ β₉ β₁₀ β₁₁ α₄β₁₂ α₅와 같은 순서인 판(strands) 및 나선(helices)으로 구성되어 있다(Carfi 등., 1995 및 1998a, 및 Gallenr 등, 2001).

상기 본 발명의 메탈로 베타 락타마제는 두번째 베타판(beta strand) 이전에 아미노 말단 끝부분에서 절단된 것이다. 바람직하게는, 이것들은 첫번째 및 두번째 베타판(beta-strand) 사이에서 절단된 것으로, 특히, 상기 결정학적인 구조에 따라 첫번째 및 두번째 베타판 사이의 아미노산 E(글루탐산)의 직전에서 절단된 것이다.

가라우(Garau) 등(2004)는 세린 베타 락타마제(serine beta-lactamase)에 대한 앰블러 베타 락타마제 분류(Ambler beta lactamase numbering)의 유사성에 의거해서, B 그룹 베타 락타마제(BBL)를 위한 표준 분류 체계를 정하였다.

BBL 분류 체계는 공지의 메탈로 베타 락타마제 X-선 구조의 구조적 정렬에 따른 것인데, 이것은 1차 아미노산 시퀀스 수준에서 낮은 유사성을 갖는 다양한 메탈로 베타 락타마제 그룹에서 보존된 부분을 확인하기 위한 것이다.

가라우(Garau) 등의 연구에 따르면, 카르피(Carfi) 등이 1995 및 1998a에 규정한 Bacillus cereus Bcll 메탈로 베타 락타마제에서 최초로 보존된 단편은 2차 베타판구조를 형성하는 것으로 확인하였다.

결과적으로, 바실러스 시리우스(B. cereus)의 메탈로 베타 락타마제의 제1 베타판(β₁-sheet)은 모든 메탈로 베타 락타마제 그룹에서 발견되는 것은 아니기 때문에 상기 효소 기능에 있어서 필수적인 요소가 아니다.

그러나 모든 메탈로 베타 락타마제의 아미노 말단 부위는 단편(fragment)을 형성하는 첫번째 알파 나선 이전에 단편(fragments)을 형성하는 4개의 보존된 베타판의 2차 구조를 갖는다.

따라서, 메탈로 베타 락타마제에 대한 절단부위(truncation site)는 β₁ 의 존재 여부에 상관없이, 예상되는 2차 구조의 첫번째 알파나선 앞에 4개의 베타판이 있는지 여부에 따라 결정된다.

본 명세서에서는 아미노산을 하나의 영문 알파벳 코드로 표기하도록 정한다.

이하, A는 알라닌(alanine), R은 아르기닌(arginine), N은 아스파라긴(asparagine), D는 아스파르산(aspartic acid), C는 시스테인(cysteine), E는 글루탐산(glutamic acid), Q는 글루타민(glutamine), G는 글리신(glycine), H는 히스티딘(histidine), I는 이소류신(isoleucine), L은 류신(leucine), K는 라이신(lysine), M은 메치오닌((methionine), F는 페닐알라닌(phenylalanine), P는 프롤린(proline), S는 세린(serine), T는 트레오닌(threonine), W는 트립토판(tryptophan), Y는 티로신(tyrosine) 및 V는 발린(valine)을 나타낸다.

아미노산 시퀀스(sequences)은 왼쪽의 아미노 말단과 오른쪽의 카르복실말단을 가진다. NH₂- 및 -COOH는 표시될 수도 있고 안될 수도 있다.

본 발명의 1실시예에 따라, 숙주 세포는 하기 식 I을 가진 베타 락타마제를 발현할 수 있는 발현 벡터(expression vector)에 의해 변형된다.

NH₂- K - T - E - △BL-COOH(I)

여기서 K는 라이신(lysine), T는 트레오닌(threonine), E는 글루탐산(glutamic acid), △BL는 상기 단백질의 두번째 베타판 앞의 아마노 말단에서 절단된 메탈로 베타 락타마제이며, 상기 단백질은 하기 일반식,

NH₂- E -△BL-COOH(Ⅱ)를 갖는 단백질이다.

상기 식 (II)는 식 (I)의 단백질의 번역 후 변형의 결과로 형성된 것이다.

일반식 I의 상기 단백질은 종래에는 E-ΔBL 코딩 DNA 시퀀스에 대한 KT 코딩 DNA 시퀀스를 결합시켜 생산하였다. 여기에서 E-ΔBL은 바실러스(Bacillus), 특히 바실러스 시리우스(B. cereus) 의 메탈로 베타 락타마제인 것으로, 글루탐산 잔기 E 바로 앞에서 제2 베타판(β-strand) 앞의 아미노 말단에서 절단된 것이다.

특히, 뉴클레오타이드 구조는 시퀀스 식별번호 2: 94 - 756(SEQ ID NO: 2)인 시퀀셜 뉴클레오타이드를 포함한다.

단단한 구조(rigid structure)가 없는 아미노 말단 부위의 길이는 메탈로 베타 락타마제 그룹 및 각 하위그룹에 따라 다양하다.

바실러스 속(Bacillus spp)의 상기 메탈로 베타 락타마제는 제2 베타판 앞의 아미노 말단 시퀀스에서 다양한 변종을 갖는데, 그러나 대부분의 효소는 +12 위치에서 보존된 글루탐산(E)을 갖는다(표 1 참조).

결과적으로, E 옆에 KT의 삽입과 함께 이루어지는 결손(deletion)은 공지의 메탈로 베타 락타마제에 적용될 수 있는데, 이것은 자연적으로 발생한 성숙한 베타 락타마제 단백질의 N-말단으로부터 최초 11개의 아미노산이 제거되는 경우를 말한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 따라서, 상기 베타 락타마제는 아미노산 KT 및 E 사이에서 절단되며, 특히, VIKN 및 E1 또는 VMKN 및 E 사이에서 절단된다.

바실러스 종 메탈로 베타 락타마제 및 P2A 사이의 아미노 말단 시퀀스의 비교

단백질	바실러스 종	아미노 말단 영역*(Amino terminal region)
P2A Q2AJV1 P10425 Q734F3 P04190 Q81AW2 Q93T40 Q6SPY5 Q4MXZ5 P14488 Q6HFY5	B.cereus 98ME1552 B.weihenstephanensis KBAB4 Bacillus sp.(strain 170) B.cereus ATCC 10987 B.cereus 569/H B.cereus ATCC14579/DSM31 B. anthracis Steme Penicillin resistant B. anthracis B. cereus G9241 B.cereus 5/B/6 B. thuringiensis 97-27	EQKLEQIVIKNETGTISISQLNK EQKLEQK VIKNETGTISISQLNK SQKVEQIVIKNETGTISISQLNK EQKLEQK VIKNEAGTISISQLNK SQKVEKT VIKNETGTISISQLNK SQKVEKT VIKNETGTISISQLNK ERKVEHK VIKNETGTISISQLNK ERKVEHK VIKNETATISISQLNK SQKVEQK V M KNEAGTISISQLNK ERTVEHK VIKNETGTISISQLNK ERTVEHK VIKNETGTISISQLNK

아미노산 치환기는 굵은 글씨체로 표시하고, 보존된 글루탐산(E)은 음영으로 표시하였다. 제1 메탈로 베타 락타마제에 대한 베타판은 밑줄로 표시하였고, 제2 베타판은 이탤릭체로 표시하였다.

본 발명의 구체적인 일실시예에 따라, E-ΔBL는 시퀀스 식별번호 3의 6-221(6-221 of SEQ ID NO: 3) 순차적 아미노산 잔기와 적어도 70, 80, 90, 95, 98 또는 99%의 동일한 아미노산 시퀀스를 가지고 있다.

시퀀스 동일성(Sequence identity)은 Altschul 등이 1997년에 발표한 블라스트(BLAST, Basic Local Alignment Search Tools)에 의해서 정할 수 있다.

특히, E - ΔBL은 시퀀스 식별번호: 1(SEQ ID NO: 1)에 나타난 것과 같은 시퀀스을 갖는 메탈로 베타 락타마제의 절단된 형태이거나 베타 락타마제 활성 변종(active variant) 또는 이의 단편(fragment)이다.

예를 들어, 바실러스 시리우스(B. cereus) 메탈로 베타 락타마제 BcII의 제거된 형태일 수 있다.

바람직하게 E - ΔBL은 시퀀스 식별번호 1(SEQ ID NO: 1)의 12-15, 12-19 또는 12-23 아미노산 잔기에 대응되는 아미노 말단을 가지고 있으며, 이들은 또한 +13 위치의 아미노산이 T(트레오닌, threonine) 이거나 A(알라닌, alanine)인 것이다.

특정 아미노산 시퀀스의 변종(variant)인 아미노산 시퀀스는 특정 아미노산 시퀀스와 동일한 것을 의미하는 것이 아니라, 결손(deletion), 치환(substitutions), 변환(inversions), 삽입(insertion) 등 적어도 몇몇 아미노산이 변화하였으나, 그 특정 아미노산 시퀀스에 비해 단백질의 생물학적 활성에는 아무런 영향을 미치지 않는 것을 의미한다.

상기 문맥에서 생물학적인 활성이란 베타 락타마제 활성을 말한다. 변종(variant)은 동일한 계통(strain), 종(species) 혹은 속(genus)내의 대립형질변형(allelic variant) 종처럼 자연적으로 발생하는 폴리펩타이드이거나, 유전공학적으로 조작될 수도 있다.

단편(fragment)은 베타 락타마제 활성과 같이 특정한 생물학적 확성을 가질 정도로 긴 아미노산 시퀀스의 일부분으로 이해된다.

즉, 상기 단편은 특정하게 개시된 베타 락타마제의 서브시퀀스(subsequence)일 수 있다.

NH₂-K-T-E-ΔBL-COOH를 코딩하는 뉴클레오타이드 구조는 발현 벡터로 삽입되며, 숙주 세포로 변환(transformed)될 수 있다.

그런 다음, 숙주 세포(host cell)는 발현 및 NH₂-E-ΔBL-COOH로의 번역 후 변형이 일어날 수 있는 조건(실질적으로 순수한 형태로 얻어질 수 있는)하에서 배양되는데, 이것은 최소 90% 바람직하게는 95%, 메탈로 베타 락타마제의 99%가 NH₂-E-ΔBL-COOH인 단일형태로 존재한다.

발현된 단백질 번역 후 변형, 즉 디펩타이드 KT의 쪼개짐(cleavage)은 숙주의 프로테아제(proteases)에 의해 촉매된다.

숙주는 박테리아, 이스트, 혹은 곰판이 등과 같은 진핵생물 또는 원핵생물일 수 있다.

박테리아 숙주는 예를 들어 대장균(Escherichia coli)인 것이다.

바람직하게는 상기 숙주는 바실러스 속에 속하거나 특히, 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis) 또는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 인 것이다.

바람직한 구체적인 일 실시예에 따라, NH₂-K-T-E-ΔBL-COOH는 시그널 펩타이드(signal)를 포함하는 단백질로 발현되며, 여기에서 단백질은 배지(culture medium)로 분비되고, 상기 시그널 펩타이드는 우선 분리된 다음 디펩타이드(dipeptide)가 된다.

생산 및 저장과정 중에 탈아마이드화(deamidation), 산화(oxidation), 이황화결합(disulfide bond)의 끊어짐 또는 형성, 이성질화(isomerization), 숙신이미데이션(succinimidation), 비이황화 가교결합(non-disulfide crosslingking), 마일라드반응(maillard reaction), 탈당화(deglycosylation)와 같은 다른 작은 변화들이 단백질 내에서 일어날 수 있으며, 베타 락타마제 활성에 중대한 영향을 미치지 않는 이상 허용가능하다.

변형 베타 락타마제 NH₂-E-ΔBL-COOH는 메탈로 베타 락타마제를 생산할 수 있는 박테리아라면 어떤 것이든지 그로부터 생산될 수 있다.

이러한 박테리아로는 엔테로박테리아 속(Enterobacteriae genus)의 박테리아(세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens), 클레브시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 시프로박터 프레우디(Cifrobacter freudii), 시겔라 플렉스너리(Shigella flexneri)), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 스테노박테리움 말토필라(Stenobacterium maltophila), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 박테로이데스 프라질리스(bacteroides fragilis), 바실러스 시리우스(Bacillus cereus), 플라보박테리움 오도라툼(Flavobacteruim odoratum) 및 박테로이데스 프라질리스(Bacteroides fragilis)가 있다.

다른 가능한 출처로는 에로모나스(Aeromonas), 레지오넬라(Legionella) 및 스텐노트로포모나스(Stenotrophomonas) 종이 있다.

상기 효소는 N 말단 아미노산으로서 E가 되도록 한 부분에서 제2 베타판 직전 성숙한 효소 단백질의 아미노 말단에서 절단된다.

만일 박테리아의 베타 락타마제에서 적절한 E 잔기가 없는 경우, 단지 ΔBL 부분만 박테리움으로부터 얻을 수 있는데, 여기에서, 트리펩타이드인 KTE는 ΔBL앞에서 결합되어 단백질 NH₂-K-T-E-ΔBL-COOH을 형성한다.

바람직하게, 상기 변형 베타 락타마제는 바실러스(Bacillus)에서 얻을 수 있으며, 특히, 바실러스 시리우스(B. cereus)인 것이다.

특히, 변형되지 않은 성숙한 베타 락타마제 단백질의 최초 11개 N-말단 아미노산이 제거되지 않은 바실러스 시리우스(B. cereus) 베타 락타마제인 것이다.

본 발명의 변형 베타 락타마제는 제약용으로 허용가능한 부형제 또는 캐리어를 혼합하여 제약용 조성물(pharmaceutical composition)을 형성할 수 있다.

장(intestine)에서의 베타 락탐 항생제의 역효과(adverse effect)를 제거하기 위해 효과적인 양의 변형 베타 락타마제를 하나 이상의 베타 락탐 항생제로 치료받는 환자에게 경구로 투여할 수 있다.

상기 베타락타마제 제제(preparation)는 항생제의 치료 전 또는 후, 혹은 동시에 투여될 수 있다.

이것은 세린(serine) 베타 락타마제 억제제에 영향을 받지 않으며, 상기와 같은 억제제가 존재하거나 존재하지 않는 경우 모두 상기 항생제를 제거하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해서 구체적으로 설명되나 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

그러나, 발명의 상세한 설명 및 실시예에 기재된 구체적인 실시예는 발명을 설명하기 위한 목적이며, 본 발명의 범위 내에서 다양한 변화 및 변형은 가능한다는 것을 이해하여야 한다.

실시예 1. 재료 및 방법

박테리아 계통 및 성장 조건

실험에 사용된 박테리아 계통 및 이들의 관련 유전형 및 표현형을 하기 표 2에 정리하였다.

박테리아 계통(strains) 및 이들의 관련 유전자형(genotypes) 및 표현형(phenotypes)

계통(strain)	관련 유전자형 (relevant genotype)	관련 표현형 (relevant genotypes)
바실러스 서브틸리스 RS303 Bacillus subtills RS303	trpC2, sigG::cat (△sigG)	트립토판 돌연변이(Tryptophan auxotroph), 포자형성불능(asporogenic)
바실러스 서브틸리스 IH 6140 Bacillus subtills IH 6140	sacA321	저감된 세포외 프로테아제 수준(Reduced exoprotease level)
바실러스 서브틸리스 RS314 Bacillus subtills RS314	trpC2, sigG::cat,(△sigG) pRSH314 절단된 베타 락타마제를 코딩하는 발현구조(expression construct encoding the truncated metallo-beta lactamase)	트립토판 돌연변이(Tryptophan auxotroph), asporogenic(포자형성불능), 분비 메탈로 베타 락타마제(secretes metallo-beta-lactamase)
바실러스 서브틸리스 RS314 Bacillus subtills RS314	trpC2, sigG::cat,(△sigG) pRSH315 완전한 메탈로 베타 락타마제를 코딩하는 발현 구조(expression construct encoding the complete metallo-beta lactamase)	트립토판 돌연변이(Tryptophan auxotroph), asporogenic(포자형성불능), 분비 메탈로 베타 락타마제(secretes metallo-beta-lactamase)
바실러스 서브틸리스 RS317 Bacillus subtills RS317	trpC2, sigG::cat,(△sigG) pRSH317 절단된 메탈로 베타 락타마제를 코딩하는 발현 구조(expression construct encoding truncated metallo-beta lactamase)	트립토판 돌연변이(Tryptophan auxotroph), (포자형성불능)asporogenic, 분비 메탈로 베타 락타마제(secretes metallo-beta-lacamase)
바실러스 서브틸리스 RS318 Bacillus subtills RS318	trpC2, sigG::cat,(△sigG) pRSH318 절단된 메탈로 베타 락타마제를 코딩하는 메탈로 베타 락타마제(expression construct encoding truncated metallo-beta lactamase)	트립토판 돌연변이(Tryptophan auxotroph), 포자형성불능( asporogenic), 분비 메탈로 베타 락타마제(secretes metallo-beta-lactamase)
바실러스 시리우스98ME 1552 Bacillus cereus 98ME 1552		다양한 베타 락탐에 대한 다제내성(Multiresistant to various beta-lactam)

선발제(selection agents)로 적절한 항생제(antibiotics)가 첨가된 혼합 루리아(Luria) 배지(1리터당, 이스트 추출물 5g, 트립토판 10g, 염화나트륨 10g)에 박테리아를 플라스크에 넣고 37℃ 교반하여 배양하였다. 발효에는 적절한 항생제가 투여된 합성 배양 배지를 이용하였다. 상기 변형 합성 배지(modified synthetic medium)는 항체반응능력이 있는 바실러스 서브틸리스 세포(Bacillus subtilis) 세포를 만드는데 사용된다. 상기 배지에 대한 상세한 내용은 WO03/040352에 기술되어 있다.

DNA 기술

Sambrook 및 Russell(2001)에 따라 공지의 제한(restriction), 아가젤 전기영동(agarose gel electrophoresis) 및 결합(ligation)과 같은 DNA기술을 이용하였다.

염색체상 DNA는 마머법(Marmur method, 1961)에 의해 추출되었다. 플라스미드 DNA는 플라스미드 미디 키트(plasmid Midi Kit, Qiagen 社)를 이용하여 추출하였다. 이때 상기 기트의 제조업체의 설명서(Qiagen Plasmid Purification Handbook, 1999)를 참조하였고, 펩티도글리칸 층을 분리하기 위해 추가적으로 리소자임 처리제(1mg/ml)룰 상기 프로토콜에 첨가하였다.

완충제 P1(buffer P1)에 리소자임을 보충하고, 세포를 37℃에서 30분 동안 배양하였다.

WO03/040352에 기재된 규약에 따라, PCR을 수행하였다.

메탈로 베타 락타마제의 다양한 형태의 아미노 말단 부위의 특징

상기 N-말단 아미노산 시퀀스의 결정 및 질량분석을 위해, 정제된 메탈로 베타 락타마제 샘플을 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography)를 실시하고, 60분동안 0% 에서 100%의 아세토니트릴(acetonitrile)을 이용하여, 상기 효소를 0.1%의 TFA 와 0.075%의 TFA를 선형적으로 변화시키면서 세분화하였다.

메탈로 베타 락타마제 형태의 NH₂-말단 시퀀스는, 응용 바이오시스템 모델 494A 단백질 시퀀스 분석기(applied Biosystem model 494A Protein sequenator)가 구비된, 자동화된 에드만 분해법(Edman degradation)을 이용하여 결정하였다.

메탈로 베타 락타마제 형태의 질량분석(mass analyses)은 혼성 Q-TOF(a hybrid quadrupole-time-of flight)질량분석기를 이용하여 수행하였다.

메탈로 베타 락타마제 변종(variants)은 상기 시료에서 상대적인 비율의 평가에 활용되는 유사한 이온화 전위(ionization potentials)을 보이는 것으로 추정된다.

상기 베타 락타마제 유전자의 뉴클레오타이드 시퀀스는 자동 DNA 시퀀스 분석기(sequencer)가 구비된 이중 탈산소 시퀀스 종결법(dideoxy-chain termination method)을 사용하여 결정한다.

실시예 2. 바실러스 시리우스 ( Bacillus cereus) 98ME1552 메탈로 베타 락타마제 유전자의 완전한 뉴클레오타이드 시퀀스

상기 메탈로 베타 락타마제를 코딩하는 완전한 유전자의 결정은 PCR과 벡토레트(Vectorette) 기술을 이용해서 순차적으로 수행된다.

구조 유전자의 일부는 PCR로 증폭하였으며, 템플릿으로는 임상적으로 단리된 바실러스 시리우스(B. cereus) 98ME1552에서 추출된 염색체 DNA를 이용하였고, 프라이머로는 SQKVEKTVI 코딩 부위 (포워드 프라이머(forward primer)) 와 바실러스 시리우스(Bacillus cereus) 569/H 메탈로 베타 락타마제 유전자의 HTLDLL 코딩 부위 (리버스 프라이머(reverse primer))가 하이브리드된 것을 이용하였다.

두 프라이머는 또한 Hind Ⅲ 제한 부위를 이동시킨다.

상기 증폭된 DNA 단편(약 700bp)은 Hind Ⅲ와 함께 소화된 후, 분비 벡터(secretion vector)인 pKTH141의 Hind Ⅲ 부위에 연결된다.

컴피턴트(competent) 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) IH6140 세포는 상기 결찰 혼합물에 의해 형질전환되었다.

메탈로 베타 락타마제 발현 플라스미드가 삽입된 클론을 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다. 상기 플라시미드를 pRSH314로 명명하였다.

WO03/04052에 개시되어 있는 컴피턴트(competent) 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) RS303 세포는 pRSH314로 형질전환되어 바실러스 서브틸리스 (B. subtilis) RS314 계열이 되었다.

상기 메탈로 베타 락타마제 유전자의 완전한 DNA 시퀀스는 다음과 같은 벡토레트(vectorette) 기술을 이용하여 얻어진 PCR 단편으로부터 결정되었다. 바실러스 시리우스(Bacillus cereus) 98ME1552의 염색체 DNA를 Hind Ⅲ 제한 효소로 소화시킨 후 Hind Ⅲ 처리된 벡토레트 II(Vectorette II)에 연결하였다. 상기에서 얻어진 벡토레트 도서관(Vectorette-library)은 PCR 반응을 이용해서 스크리닝 하였다. 반응을 개시하는 프라이머로는 MEBLSQ-F (S'-AGGAAATGTTGCGGATGC) 또는 MEBLSQ-R (S'-CCTTCGTTAATTTGTTATCCC)를 사용하는데, 상기 프라이머는 pRSH314의 700bp에서 얻어진 DNA 시퀀스로 부터 설계된 것이다.

MEBLSQ-F 프라이머를 이용하는 벡토레트 도서관(Vectorette-library)의 PCR 스크리닝은 약 1000bp(MEBL1 fragment)의 단편을, MEBLSQ-R 프라이머를 이용하는 스크리닝은 약 1100bp(MEBL 2 fragment)의 단편을 생성하였다. MEBL1 및 MEBL2 단편은 전기영동 후 아가젤로 정제하였다.

두 단편의 뉴클레오타이드 시퀀스는 DNA 시퀀싱에 의해서 완전한 바실러스 시리우스(B. cereus) 98ME1552 메탈로 베타 락타마제 유전자의 뉴클레오타이드로 확인되었다.

도 1은 바실러스 시리우스(B. cereus) 98ME1552 메탈로 베타 락타마제 유전자의 완전한 뉴클레오타이드 및 그로부터 추론된 아미노산 시쿼스를 나타낸 것이다.

상기 아미노산 시퀀스는 또한 시퀀스 식별번호 1(SEQ ID NO: 1)로 표시하였다.

상기 오픈 리딩 프레임(ORF, open reading frame)은 257개의 아미노산 폴리펩타이드를 코딩하고 있으며, 이의 아미노 말단 시퀀스(30 아미노산 잔기)는 일반적인 분비 경로를 통해 사이토플라스믹 멤브레인(cytoplasmic membrane)을 거쳐 단백질 분비를 타겟으로 하는 박테리아의 시그널 펩타이드(signal peptide)의 전형적인 특징을 보여주고 있다.

예상되는 시그널 펩티다아제(peptidase)의 절단 부위(cleavage site)는 알라닌 뒤의 -30 위치이다(도 1 참조).

계산된 분자량 및 227 아미노산 잔기의 성숙한 단백질의 pi 값은 각각 24 877.3 Da 및 6.0이었다.

상기 단백질을 동정하기 위한 블라스트(BLAST)에서 조사 템플릿(search template)으로 98ME1552 메탈로 베타 락타마제 시퀀스를 사용하였다.

상기 BLAST 조사는 스위스 생물정보 연구소의 SIB 블라스트 네트웍 서비스(SIB BLAST Network Service of Swiss Institute of Bioinformatics, http://www.expasy.org/tools/blast/)를 이용하여 수행되었다.

상기 조사는 UniProtKB 지식 기반 데이터베이스와 비교하여 수행되었는데, BLOSUM62 알고리듬을 구비한 NCBI BLASTP 2.2.13프로그램(Altschul 등, 1997)을 이용하였고, 존재(existence)에 대해서는 11의 갭 감점(gap penalties)을, 연장(extension)에 대해서는 1의 갭 감점(gap penalties)을 두었다.

98ME1552 메탈로 베타 락타마제를 이용하여 수행된 블라스트(BLAST) 조사는 하위 그룹 B1의 다른 B 베타 락타마제에 비해 높은 유사성을 보여주었다.

예상된 바와 같이, 98ME1552 베타 락타마제는 다른 바실러스 시리우스(B.cereus) 베타 락타마제에 대해 높은 동일성을 보여주었다(90% 이상).

다양한 바실러스 시리우스(B. cereus) 메탈로 베타 락타마제의 구조적인 정렬(alignment)에 따라, 바실러스 시리우스(B. cereus) 98ME1552 락타마제의 아미노산 치환체는 상기 효소의 기능에 대해 필수적이지 않은 부분에 위치할 것으로 예상된다.

실시예 3. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 에서 바실러스 시리우스(B. cereus) 98ME 1552 메탈로 베타 락타마제 유전자의 클로닝 및 발현

벡토레트 도서관(vectorette-library)에서 얻은 DNA 시퀀스를 기초로 하여 새로운 프라이머, BLC1-F(5'-CGCGAAGCTTCCGAACAAAAGCTAGAGCAAATAGTAATC)와 BLC1-R(5'-GCCGAAGCTTTTATTTTAATAAATCCAATGTATGTAAAAGTAATCCC)를 설계하였고, PCR을 이용하여 완전한 메탈로 베타 락타마제를 코딩하는 DNA 인서트를 만들었다.

또한 상기 프라이머의 말단 부분에 Hind Ⅲ 부위(site)를 만들고, 정제된 바실러스 시리우스(B. cereus) 98ME1552의 염색체 DNA를 템플릿으로 사용하였다.

약 0.7 k의 증폭된 PCR 단편을 Hind Ⅲ으로 소화시키고, pKTH141 분비 벡터의 Hind Ⅲ 부위에 결찰하였다.

컴피턴트 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) RS303 세포는 결찰 혼합물(ligation mixture)에 의해서 형질전환 되었다.

1개의 양성 클론(positive clone)은 RS315로 명명되었으며, 발현 구조(expression construct)를 가지고 있는 것을 PRSH315라고 하였다.

pRSH315 발현 구조를 추출하여 삽입 부위를 시퀀싱하였다.

클론된 메탈로 베타 락타마제 유전자의 뉴클레오타이드와 유래된 아미노산 시퀀스를 벡토레트 도서관(vectorette libraty)으로부터 결정된 것들과 동일하였다.

상기 결정된 DNA 시퀀스는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 알파 아밀라아제(Bacillus amyloliquefaciens αamylase)의 31개 아미노산 긴 신호 퀀스(long signal sequence)를 코딩하는 뉴클레오타이드, hind Ⅲ 클로닝 부위 및 완전한 바실러스 시리우스(B. cereus) 98ME1552 메탈로 베타 락타마제 유전자 간에 프레임 융합(frame fusion)된 것이다.

신호 펩티다아제(signal peptidase)는 -1 위치의 알라닌(A)과 + 위치의 글루타민(Q)사이의 결합을 끊는 것으로 예상된다.

성숙한 메탈로 베타 락타마제는 발현 구조에서 NH₂-말단이 연장되어 Hind Ⅲ 클로닝 부위로부터 유래된 NH₂-QAS-트리펩타이드를 갖는다.

따라서, 성숙한 변형 메탈로 베타 락타마제는 유래된 아미노산 시퀀스를 기초로 하여, 230개의 아미노산 잔기로 구성된다.

실시예 4. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 생산 시스템에서 얻은 메탈로 베타 락타마제 변종의 아미노 말단 아미노산 시퀀스의 확인

상기 변형 메탈로 베타 락타마제는 교반 플라스크 또는 합성 재배기를 이용한 발효에 의한 배양방법에 의해 생산되었다.

상기 메탈로 베타 락타마제는 효과적으로 배양 상층액으로 분비되었다.

상기 효소는 농축된 배양 상층액에서 이온교환 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다.

효소 활성은 두가지 분획된 부분(separate fractions)에서 관찰되었다.

정제된 효소 부분(fractions)는 NH₂-말단 시퀀싱 및 질량분석법(mass spectrometry analysis)으로 분석하였다.

분석을 통해 상기 두 부분(fraction)이 불균일한(heterogeneous) 아미노 말단을 가진 효소 형태로 구성되어 있다는 것을 알 수 있었다.

표 3은 상기 다양한 효소 형태 및 이들의 관련된 특징을 도시한 것이다.

상기 유래된 아미노산 시퀀스와 관련하여, 모든 효소 형태는 자신들의 NH₂ 말단 부위에 다양한 길이의 결손(deletion)을 갖는다.

일반적으로 NH₂-QASEQKLE 옥타펩타이드는 모든 효소 형태에서 결손된 것으로 보인다. 더욱이, 분획(fraction) 2에서 가장 작은 효소형태는 추가적인 IVIKN-펜타펩타이드가 결여된 것이다.

NH₂ 말단 부위에서 관찰된 미세불균일성은 다양한 숙주 세포 프로테아제의 활성에 의해 야기된 번역 후 변형에 의해서 설명될 수 있다.

유래되어 결정된 아미노 말단 시퀀스 및 절단된 메탈로 베타 락타마제 형태의 결정된 분자량

효소 분획(fraction) 번호	유래된 NH₂말단 시퀀스	결정된 NH₂-말단 시퀀스	분획(fraction)내에서 효소 형태의 관련 비율(%)	결정된 질량(kDa)
	NH2-QASEQKLEQIVIKNETGTI
1		NH₂-IVIKNETGTI	100	24.122
2		NH₂-NETGTI	60	23.668
3		NH₂-ETGTI	40	23.554

실시예 5. 메탈로 베타 락타마제 형태가 제거된 바실러스 시리우스(Bacillus cereus) 98ME1552 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 생산 시스템에서 이의 아미노 말단의 구조

NH₂말단의 불균일성(heterogeneity)을 줄이기 위해서, 메탈로 베타 락타마제 유전자의 가변부(variable region)의 NH₂-EQKLEQIVIKN을 코딩(coding)하는 DNA 시퀀스를 PCR로 제거하였다.

상기 바실러스 시리우스(B. cereus) 98ME1552 메탈로 베타 락타마제의 완전한 유전자를 PCR의 템플릿으로 사용하였으며 이때 ETGTISISQ 코딩 시퀀스(coding sequence)를 혼성화하는 포워드 프라이머 및, 번역 종결 코돈 TAA을 따르는, GLLLHTLDLLK 코딩 시퀀스(coding sequence)를 혼성화하는 리버스 프라이머를 이용하였다. 두 프라이머는 hind Ⅲ 부위로 이동하였다.

약 0.7kb의 PCR 단편(fragment)가 pKTH141 분비 벡터(secretion vector)의 hind Ⅲ 부위로 클론되었고, 컴피턴트 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) RS303 계통(strain)이 결찰 혼합물(ligation mixture)에 의해서 형질전환 되었다.

NH₂ 말단 결손은 양성 클론(positive clone)으로 부터 추출된 발현 구조의 삽입된 메탈로 베타 락타마제 유전자의 DNA 시퀀싱에 의해서 확인되었다.

상기 변형 계통(transformant strain)은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) RS317라고 명명하였으며, 발현 구조는 pRSH317이라고 하였다.

바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 생산 숙주에서 절단된 메탈로 베타 락타마제를 생산하고, 상기 활성 효소를 단일 분획(fraction)으로 녹여 분리한 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 배양 상층액에서 상기 효소를 정제하였다.

상기 효소 단편(fraction)을 NH₂ 말단 아미노산 시퀀싱과 분자량 분석을 하였다.

절단된 메탈로 베타 락타마제는 또한 불균일한(heterogeneous)의 아미노 말단을 가진 단백질인 것으로 관찰되었다(표 4 참조).

상기 주요 효소 변종(variant)은 개시 QAS 트리펩타이드를 코딩하는 Hind Ⅲ 부위를 포함하는 유도된 아미노산 시퀀스의 그것과 동일한 아미노 말단 시퀀스를 가진다.

소수의 변종(minor variant)는 QA 디펩타이드가 결손된 것으로 확인되었다.

아미노 말단의 봉쇄(blockage) 때문에, 하나의 변종에서 받은 아마노산 시퀀스는 없었다.

아마노 말단이 봉쇄되면, 상기 생산 과정에서 글루타민 잔기가 고리화되어 피로글루타밀(pyroglutamyl) 잔기를 형성하도록 하는 경향이 있다.

결과적으로 아미노 말단의 결손(deletion)은 아미노 말단의 미세불균일성(microheterogeneity)를 감소시킬 수 없었다.

절단된 메탈로 베타 락타마제 형태의 분자량 및 결정된 아미노 말단 시퀀스

효소 분획(fraction) 번호	유도된 NH₂말단 시퀀스	결정된 NH₂-말단 시퀀스	분획내에서 효소 형태의 관련 비율(%)	결정된 질량(kDa)
	NH₂-QASETGTISI
1		a. 고리형 글루타민 -> 아미노산 시퀀스 없음 b. NH₂ QASETGTISI c. NH₂-SETGTISI	b. 90 c. 10	a. 23.823 b. 23.840 c. 23.641

실시예 6. KT 코딩 시퀀스 삽입을 갖는 바실러스 시리우스 98ME1552 절단된 메탈로 베타 락타마제의 구조

번역 후 변형(post translation modification)을 방지하기 위해서, NH₂-EQKLEQIVIKN 부위를 코딩하는 DNA 시퀀스를 제거하고, 3'-Hind Ⅲ 클로닝 부위의 하위(downstream)에 직접적으로 위치하는 KT-디펩타이드 코딩 시퀀스를 삽입하여 절단된 형태의 메탈로 베타 락타마제를 설계하였다.

KT 코딩 DNA 시퀀스를 포함하는 포워드 프라이머를 제외하고, 실시예 5에서와 같이 변형 메탈로 베타 락타마제 유전자를 만들었다.

PCR 단편을 Hind Ⅲ으로 잘라 pKTH141 분비 벡터의 Hind Ⅲ 부위에 결찰시키고, 컴피턴트 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) RS303 세포를 결찰 혼합물(ligation mixture)로 변형시켰다.

발현 구조(expression construct)에서 변형 메탈로 베타 락타마제 유전자의 정확한(correct) 뉴클레오타이드 시퀀스를 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다.

1개의 양성 클론(positive clone)을 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) RS318로 명명하였고, 발현 구조(express construct)를 pRSH318로 명명하였다.

도 3은 pRSH318에서 유래된 바실러스 시리우스(B. cereus) 98ME1552 베타 락타마제의 상기 뉴클레오타이드와 상기 유도된 아미노산 시퀀스이며, 각각 시퀀스 식별번호 2 및 3(SEQ ID NO:2 및 3)으로 하였다.

상기 절단된 메탈로 베타 락타마제를 생산 및 정제하여 상기와 같이 분석하였다.

활성 절단형 메탈로 효소를 단일 피크로 컬럼에서 녹여 분리하였다.

상기 단일 분획(single fraction)은 균일한(homologous) 아미노 말단 글루탐산 잔기를 포함하는 메탈로 베타 락타마제를 포함하였다.

따라서, KT 디펩타이드 삽입은 번역후 변형을 수행하여 결과적으로 동일한 아미노 말단 아미노산 시퀀스가 된다. 절단된 메탈로 베타 락타마제를 P2A 단백질로 명명하였다.

절단된 메탈로 베타 락타마제 형태의 결정된 분자량 및 유도되어 결정된 아미노 말단 시퀀스

효소 분획(FRACTION) 번호	유도된 NH₂말단 시퀀스	결정된 NH₂-말단 시퀀스	분획(frction)내에서 효소 형태의 관련 비율(%)	결정된 질량(kDa)
	NH₂-QASKTETGTISI
1		a. NH₂-ETGTISI	a. 100	a. 23554

실시예 7. P2A 메탈로 베타 락타마제의 효소 반응 매개변수(kinetic enzyme parameters)

세린 베타 락타마제 억제제가 있는 또는 이들이 없는 페니실린 계통(family), 2세대 및 3세대 세팔로스포린(cephalosporins), 및 카르바페넴(carbapenems, meropenem)를 포함한 다양한 종류의 베타 락탐을 이용하여 P2A효소 가지는 다양한 촉매특성을 연구하였다.

효소 반응 매개변수(enzyme kinetic parameter)인 Kcat 및 Km을 하네스 플롯(hanes plot)에 의한 초기 비율로 결정하였다.

상기 반응은 pH 7.0, 30℃에서 10mM 인 완충용액(phosphate buffer)에서 수행되었다.

모든 반응에 대해 반응 큐벳(reaction cuvette, 1mL)에 약 5 pmol의 효소를 넣었다. 이중 메로페넴 에세이(meropenem assay)에에 대해서는 1.7 pmol의 효소를 제외하였다.

다양한 베타 락탐 기질(beta-lactam substrates)을 가수분해시켜 각 기질에 대한 특정 파장을 흡수 분광 광도 측정법(spectrophometry)을 이용해서 기록하였다.

3개의 독립적인 방법에 의해 얻어진 평균 값을 나타내는 각각 다른 속도 파라메터(Kcat, Km and Kcat/Km)에 대한 값을 표 6에 나타내었다.

P2A 메탈로 베타 락타마제에 대한 반응 매개변수값

항생제	P2A 단백질
	Km(㎛)	Kcat(1/s)	Kcat/Km (M^-1×S^-1)
암피실린(Ampicillin)	942	1114	1.18×10^-6
암피실린 설박탐(유나신 (Ampicillin-sulbactam (Unasyn))	1104	1251	1.15×10^-6
아목실린(Amoxycillin)	716	980	1.37×10^-6
아목실린-클라불란산(오그멘틴) (Amoxycillin-clavulanic acid(Augmentin))	717	990	1.38×10^-6
피페라실린(Piperacillin)	372	1049	2.82×10^-6
피페라실린-타조박탐(타조신) (Piperacillin-tazobactam(Tazocin))	412	1098	2.67×10^-6
세푸록심(Cefuroxime)	27	221	7.99×10^-6
세포탁심(Cefotaxime)	66	479	7.28×10^-6
세프트리악손(Ceftriaxone)	68	95	1.40×10^-6
메로페넴(Meropenem)	410	480	1.17×10^-6

실시예 8. 인체 회장(回腸, lieal)의 유미즙(chyme)에 있는 P2A 단백질의 안정성

장(intestinal) 프로테아제에 대한 저항성은 소장 내에서 대상 베타 락타마제 치료에 사용되는 약물로서의 P2A 단백질이 적용성에 영향을 미치는 중요한 요소 중 하나이다.

소장 프로테아제의 활동에 대한 메탈로 베타 락타마제의 민감성(susceptibility)을 인체 회장의 유미즙이 포함된 튜브(tubes)에서 다양한 양의 활성 효소를 첨가하여 측정하였다.

다양한 시점에서 회장 샘플의 베타 락타마제 활성을 측정하여 메탈로 베타 락타마제가 가수분해되는 것을 모니터링 하였다.

활성 에세이(activity assays)에 기질로서 메로페넴을 사용하였다.

4개의 독립적인 실험 결과 및 평균값을 표 7에 정리하였다.

P2A 효소는 안정적인 단백질인 것으로 보이며, 이것은 인체 회장 유미즙에서 55분의 반감기(평균값)를 갖는다.

다양한 실험을 통해 반감기가 다양한 것을 확인하였다.

그러나, 인체 소장의 유미즙에서 P2A의 반감기를 평가하였다. 장관(intestinal tracts)에서 부작용을 유발하는 잔여 베타 락탐의 제거를 위한 P2A 효소 치료의 성공적인 적용에 적절하다고 판단되었다.

인체 회장 유미즙에서 P2A 메탈로 베타 락타마제의 반감기(실험실 조건)

실험 번호	반감기(분)	평균값(±SD)
1	60	55±25
2	80	55±25
3	20	55±25
4	60	55±25

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도 1은 전체 뉴클레오타이드 시퀀스 및 상기 시퀀스로부터 추론된 바실러스 시리우스(B. cereus) 98ME1552 베타 락타마제 유전자의 아미노산 시퀀스이다.

도 2는 전체 뉴클레오타이드 시퀀스 및 pRSH315 발현 구조에서 나온 바실러스 시리우스(B. cereus) 98ME1552 베타 락타마제 유전자의 아미노산 시퀀스이다. 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens)의 긴 시그널 시퀀스 중 31 아미노산 잔기의 분해분열 부위는 -1 부분의 알라닌(alanine)과 +1 부분의 글루타민 사이에서 일어날 것으로 예상된다. Hind Ⅲ 클로닝 부위에서 유래된 NH₂- QAS-트리펩타이드의 NH₂ 말단의 연장은 굵은 글씨로 표시하였다.

도 3은 전체 뉴클레오타이드 시퀀스 및 상기 시퀀스로 추적한 pRSH318 발현 구조에서 유래된 B. cereus 98ME1552 베타 락타마제 유전자의 아미노산 시퀀스이다. 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)의 긴 시그널 시퀀스 중 31 아미노산 잔기의 분해분열 부위는 -1 부분의 알라닌(alanine)과 +1 부분의 글루타민 사이에서 일어날 것으로 예상된다. Hind Ⅲ 클로닝 부위에서 유래된 NH₂-QAS-트리펩타이드의 NH₂ 말단의 연장 및 KT 삽입은 굵은 글씨로 표시하였다.

SEQUENCE LISTING <110> IPSAT Therapies <120> Modified beta-lactamase and method for its preparation <130> 2061011 <160> 3 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 257 <212> PRT <213> Bacillus cereus <220> <221> mat_peptide <222> (31)..(257) <400> 1 Met Lys Lys Asn Thr Leu Leu Lys Leu Gly Val Cys Val Ser Leu Leu -30 -25 -20 -15 Gly Ile Thr Gln Phe Val Ser Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Gln -10 -5 -1 1 Lys Leu Glu Gln Ile Val Ile Lys Asn Glu Thr Gly Thr Ile Ser Ile 5 10 15 Ser Gln Leu Asn Lys Asn Val Trp Val His Thr Glu Leu Gly Tyr Phe 20 25 30 Asn Gly Glu Ala Val Pro Ser Asn Gly Leu Val Leu Asn Thr Ser Lys 35 40 45 50 Gly Leu Val Leu Val Asp Ser Ser Trp Asp Asn Lys Leu Thr Lys Glu 55 60 65 Leu Ile Glu Met Val Glu Lys Lys Phe Gln Lys Arg Val Thr Asp Val 70 75 80 Ile Ile Thr His Ala His Ala Asp Arg Ile Gly Gly Ile Thr Ala Leu 85 90 95 Lys Glu Arg Gly Ile Lys Ala His Ser Thr Ala Leu Thr Ala Glu Leu 100 105 110 Ala Lys Asn Ser Gly Tyr Glu Glu Pro Leu Gly Asp Leu Gln Thr Ile 115 120 125 130 Thr Ser Leu Lys Phe Gly Asn Thr Lys Val Glu Thr Phe Tyr Pro Gly 135 140 145 Lys Gly His Thr Glu Asp Asn Ile Val Val Trp Leu Pro Gln Tyr Gln 150 155 160 Ile Leu Ala Gly Gly Cys Leu Val Lys Ser Ala Glu Ala Lys Asp Leu 165 170 175 Gly Asn Val Ala Asp Ala Tyr Val Asn Glu Trp Ser Thr Ser Ile Glu 180 185 190 Asn Val Leu Lys Arg Tyr Gly Asn Ile Asn Ser Val Val Pro Gly His 195 200 205 210 Gly Glu Val Gly Asp Lys Gly Leu Leu Leu His Thr Leu Asp Leu Leu 215 220 225 Lys <210> 2 <211> 759 <212> DNA <213> Bacillus cereus <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(93) <220> <221> CDS <222> (1)..(756) <220> <221> mat_peptide <222> (94)..(756) <400> 2 atg att caa aaa cga aag cgg aca gtt tcg ttc aga ctt gtg ctt atg 48 Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met -30 -25 -20 tgc acg ctg tta ttt gtc agt ttg ccg att aca aaa aca tca gcg caa 96 Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala Gln -15 -10 -5 -1 1 gct tcc aaa aca gag acg gga acc att tca ata tct cag tta aac aag 144 Ala Ser Lys Thr Glu Thr Gly Thr Ile Ser Ile Ser Gln Leu Asn Lys 5 10 15 aat gta tgg gtt cat acg gag tta ggt tat ttt aat gga gaa gca gtt 192 Asn Val Trp Val His Thr Glu Leu Gly Tyr Phe Asn Gly Glu Ala Val 20 25 30 cct tcg aac ggt cta gtt ctt aat act tct aaa ggg cta gta ctt gtt 240 Pro Ser Asn Gly Leu Val Leu Asn Thr Ser Lys Gly Leu Val Leu Val 35 40 45 gat tct tct tgg gat aac aaa tta acg aag gaa cta ata gaa atg gta 288 Asp Ser Ser Trp Asp Asn Lys Leu Thr Lys Glu Leu Ile Glu Met Val 50 55 60 65 gaa aag aaa ttt cag aag cgc gta acg gat gtc att att aca cat gcg 336 Glu Lys Lys Phe Gln Lys Arg Val Thr Asp Val Ile Ile Thr His Ala 70 75 80 cac gct gat cga att ggc gga ata aca gcg ttg aaa gaa aga ggc att 384 His Ala Asp Arg Ile Gly Gly Ile Thr Ala Leu Lys Glu Arg Gly Ile 85 90 95 aaa gcg cat agt aca gca tta acc gca gaa cta gca aag aac agt gga 432 Lys Ala His Ser Thr Ala Leu Thr Ala Glu Leu Ala Lys Asn Ser Gly 100 105 110 tat gaa gag ccg ctt gga gat tta caa aca att acg agt tta aag ttt 480 Tyr Glu Glu Pro Leu Gly Asp Leu Gln Thr Ile Thr Ser Leu Lys Phe 115 120 125 ggc aat aca aaa gta gaa acg ttc tat cca ggg aaa gga cat aca gaa 528 Gly Asn Thr Lys Val Glu Thr Phe Tyr Pro Gly Lys Gly His Thr Glu 130 135 140 145 gat aat att gtt gtt tgg ttg cca caa tat caa att tta gct gga ggc 576 Asp Asn Ile Val Val Trp Leu Pro Gln Tyr Gln Ile Leu Ala Gly Gly 150 155 160 tgt tta gta aaa tct gcg gaa gct aaa gat tta gga aat gtt gcg gat 624 Cys Leu Val Lys Ser Ala Glu Ala Lys Asp Leu Gly Asn Val Ala Asp 165 170 175 gcg tat gta aat gaa tgg tct aca tcg att gag aat gtg ctg aag cga 672 Ala Tyr Val Asn Glu Trp Ser Thr Ser Ile Glu Asn Val Leu Lys Arg 180 185 190 tat gga aat ata aat tcg gta gta cct ggt cat gga gaa gta gga gac 720 Tyr Gly Asn Ile Asn Ser Val Val Pro Gly His Gly Glu Val Gly Asp 195 200 205 aag gga tta ctt tta cat aca ttg gat tta tta aaa taa 759 Lys Gly Leu Leu Leu His Thr Leu Asp Leu Leu Lys 210 215 220 <210> 3 <211> 252 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 3 Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met -30 -25 -20 Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala Gln -15 -10 -5 -1 1 Ala Ser Lys Thr Glu Thr Gly Thr Ile Ser Ile Ser Gln Leu Asn Lys 5 10 15 Asn Val Trp Val His Thr Glu Leu Gly Tyr Phe Asn Gly Glu Ala Val 20 25 30 Pro Ser Asn Gly Leu Val Leu Asn Thr Ser Lys Gly Leu Val Leu Val 35 40 45 Asp Ser Ser Trp Asp Asn Lys Leu Thr Lys Glu Leu Ile Glu Met Val 50 55 60 65 Glu Lys Lys Phe Gln Lys Arg Val Thr Asp Val Ile Ile Thr His Ala 70 75 80 His Ala Asp Arg Ile Gly Gly Ile Thr Ala Leu Lys Glu Arg Gly Ile 85 90 95 Lys Ala His Ser Thr Ala Leu Thr Ala Glu Leu Ala Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Tyr Glu Glu Pro Leu Gly Asp Leu Gln Thr Ile Thr Ser Leu Lys Phe 115 120 125 Gly Asn Thr Lys Val Glu Thr Phe Tyr Pro Gly Lys Gly His Thr Glu 130 135 140 145 Asp Asn Ile Val Val Trp Leu Pro Gln Tyr Gln Ile Leu Ala Gly Gly 150 155 160 Cys Leu Val Lys Ser Ala Glu Ala Lys Asp Leu Gly Asn Val Ala Asp 165 170 175 Ala Tyr Val Asn Glu Trp Ser Thr Ser Ile Glu Asn Val Leu Lys Arg 180 185 190 Tyr Gly Asn Ile Asn Ser Val Val Pro Gly His Gly Glu Val Gly Asp 195 200 205 Lys Gly Leu Leu Leu His Thr Leu Asp Leu Leu Lys 210 215 220

Claims

일반식 NH₂- K - T - E - ΔBL-COOH를 갖고,

여기에서 K는 라이신(lysine)이고, T는 트레오닌(threonine), E는 글루탐산(glutamic acid)이고,

ΔBL 는 메탈로 베타 락타마제 단백질로 아미노 말단 끝에서 절단되어 상기 단백질의 예측되는 2차 구조의 첫번째 알파나선(alpha-helix) 앞에 4개의 베타판(beta-strand)으로 남아있는 것이며,

상기 시퀀스 E-ΔBL는, 시퀀스 식별번호 3(SEQ ID No. 3)의 아미노산 잔기 6 내지 221로 이루어진 것인, 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질(modified metallo-beta-lactamase protein).
제1항에 따른 메탈로-베타-락타마제-단백질을 코딩하는 '시퀀스 식별번호 2(SEQ ID No. 2)의 뉴클레오타이드 94 내지 756'로 이루어진, 분리된 뉴클레오타이드 분자.
삭제
제2항에 따른, 상기 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현 벡터.
제2항에 따른 상기 뉴클레오타이드 분자에 의해 코딩된 메탈로 베타 락타마제 단백질을 발현할 수 있는 숙주세포.
제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 상기 메탈로 베타 락타마제 단백질을 분비하는 것인 숙주세포.
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 숙주 세포는 바실러스 속인 숙주 세포.
일반식 NH₂- E - ΔBL - COOH을 갖고,

여기에서, 상기 E는 글루탐산이며,

ΔBL 는 메탈로 베타 락타마제 단백질로 아미노 말단 끝에서 절단되어 상기 단백질의 예측되는 2차 구조의 첫번째 알파나선(alpha-helix) 앞에 4개의 베타판(beta-strand)으로 남아있는 것이며,

상기 시퀀스 E-ΔBL는, 시퀀스 식별번호 3(SEQ ID No. 3)의 아미노산 잔기 6 내지 221로 이루어진 것인, 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질.
제8항에 있어서, 메탈로 베타 락타마제의 하위 그룹 B1에 속하는, 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질.
제9항에 있어서,

상기 절단된 베타 락타마제는 바실러스 속에서 유래된 것인, 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질.
제10항에 있어서,

상기 E - ΔBL 은 성숙한 메탈로 베타 락타마제(mature metallo beta-lactamase)의 아미노 가장 말단의 아미노산 11개를 제거하여 생성된 것인, 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질.
삭제
제9항에 있어서,

상기 E - ΔBL 시퀀스는 시퀀스 식별번호 1(SEQ ID NO: 1)의 시퀀스로 이루어진 메탈로 베타 락타마제의 절단된 형태인, 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질.
제9항에 있어서,

상기 E-ΔBL는, 메탈로 베타 락타마제를 아미노산 KN 및 E 사이에서 절단함으로써 유래된 것인, 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질.
다음 식

NH₂-K-T-E-ΔBL-COOH

(여기에서 K는 라이신(lysine)이고, T는 트레오닌(threonine), E는 글루탐산이(glutamic acid)이며, ΔBL은 메탈로 베타 락타마제 단백질로 아마노 말단에서 절단되어 예측되는 상기 단백질의 2차 구조의 첫번째 알파 나선 앞에서 4개의 베타판이 남아있는 것이며, 상기 시퀀스 E-ΔBL는 시퀀스 식별번호 3(SEQ ID No. 3)의 아미노산 잔기 6 내지 221로 이루어진 것이다.)

을 가진 메탈로 베타 락타마제 단백질을 발현하기 위한 조건에서 제5항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

다음 식

NH₂-E-△BL-COOH

(여기에서 E 및 ΔBL는 상기 정의된 것과 같다)

을 가진 변형 메탈로 베타 락타마제가 되도록 번역 후 변형(post translational modification)을 수행하는 단계;를 포함하며,

상기 번역 후 변형은, 프로테아제(proteases)에 의한 디펩타이드 KT의 쪼개짐(cleavage)인, 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질 제조방법.
제15항에 있어서,

상기 메탈로 베타 락타마제 단백질은 단일 시퀀스를 포함하는 형태로 발현된 것으로서, 상기 단백질이 상기 숙주 세포로부터 분비된 것인 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질 제조방법.
제15항 또는 제16항에 있어서,

상기 단백질은 바실러스 속에서 생산되는 것인, 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질 제조방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제7항에 있어서,

상기 숙주 세포는 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis) 또는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)인 숙주 세포.
제9항에 있어서,

상기 절단된 베타 락타마제는 바실러스 시리우스(B. cereus)에서 유래된 것인, 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질.
제15항에 있어서,

상기 변형을 수행하는 단계로부터 수득된 변형 단백질을 분리 및 정제하는 단계;를 더 포함하는, 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질 제조방법.
제17항에 있어서,

상기 단백질은 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis) 또는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)에서 생산되는 것인, 변형 메탈로 베타 락타마제 단백질 제조방법.