BRPI0713726A2

BRPI0713726A2 - beta-lactamase modificada e métodos para sua preparação

Info

Publication number: BRPI0713726A2
Application number: BRPI0713726-5A
Authority: BR
Inventors: Susanna Koorioinen; Nina Wickstrand; Pertti Koski
Original assignee: Ipsat Therapies Oy
Priority date: 2006-06-21
Filing date: 2007-06-19
Publication date: 2012-10-30
Also published as: AU2007262916A1; KR101609243B1; EP2038411A4; JP2009540814A; BRPI0713726B1; US20090181004A1; JP5306191B2; US7989192B2; NO20090297L; AU2007262916B2; ZA200810460B; CN101484577A; EP2038411A1; FI20065431A; CA2659691A1; FI119190B; EP2038411B1; FI20065431A0; CA2659691C; RU2009101795A

Abstract

BETA-LACTAMASE MODIFICADA E MéTODOS PARA SUA PREPARAçãO. A invenção refere-se a uma modificação pós-traducional alvejada de metalo-beta-lactamase, através do truncamento e inserção de um dipeptídeo na extremidade do terminal de amino para reduzir a heterogeneizado do terminal de amino em um sistema de produção de DNA recombinante. A proteína K-T-E-ABL é expressa e modificada pelas proteases hospedeiras para E-ABL. Moléculas, vetores e hospedeiros de nucleotídeos apropriados são também descritos. E-ABL é útil em uma composição farmacêutica por tratar os efeitos adversos induzidos por antibiótico no intestino de pacientes tratados com antibióticos beta-lactamas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "BETA- LACTAMASE MODIFICADA E MÉTODOS PARA SUA PREPARAÇÃO".

Campo da Invenção

Vários antibióticos são usados no tratamento de infecções bacte- rianas. Entretanto, os antibióticos não atacam somente os patógenos, mas eles afetam a flora bacteriana normal, levando a efeitos colaterais adversos, por exemplo, no intestino do paciente. Esses efeitos colaterais podem ser reduzidos administrando enzimas capazes de degradar o antibiótico residual no intestino. A presente invenção refere-se a metalo-beta-lactamases modi- ficadas que são úteis para tratar e prevenir efeitos adversos de antibióticos que têm um anel de beta-Iactamase, ou na preparação de tais enzimas. A invenção é também dirigida para um método de preparar beta-lactama modi- ficado como também para moléculas de nucleotídeos, vetores e células hos- pedeiras úteis para esse fom. Antecedentes da Invenção

As enzimas beta-lactamases representam o principal mecanismo de resistência entre a bactéria para os antibióticos de beta-lactama, que in- cluem penicilinas, cefalosporinas e carbapenemas. Essas enzimas catalisam a hidrólise irreversível da ligação de amida do anel beta-lactama para criar agentes antimicrobianos não eficazes. Com base na classificação da estrutu- ra molecular e de mecanismos cataiíticos, as beta-lactamases podem ser divididas em quatro classes: A, B, C, e D. As classes A, C e D são enzimas de serina e compreendem a maioria das beta-lactamases (Ambler, 1980). Essas enzimas geralmente deasativam penicilinas ou cefalosporinas e mui- tas vezes mostram uma preferência por um desses dois antibióticos.

As beta-lactamases de Classe B são metalo-enzimas que reque- rem um ou dois íons de zinco como um co-fator para a atividade da enzima. As metalo-beta-lactamases constituem o grupo 3 na classificação funcional de Bush-Jacoby-Madeiros (Bush, 1998). Esse esquema é principalmente baseado nos perfis dos substratos, na sensibilidade deles ao EDTA e sua resistência aos inibidores de beta-lactamases serina. Baseadas nas similari- dades estruturais na região que coordena a ligação de zinco, as metalo- beta- Iactamases podem ser divididas em três subgrupos, B1, B2 e B3 (Gal- Ieni et al., 2001). O subgrupo B1 possui três histidinas e uma cisteína como resíduos de coordenação do zinco chave. Estruturas cristalográficas têm sido descritas para muitas enzimas de subgrupos B1 tais como Bcll de Baeil- Ius cereus (Carfi et al, 1995 e 1998a), CcrA de Bacteroides fragilis (Carfi et al., 1998b) e IMP-1 de Pseudomonas aeruginosa (Concha et al., 2000). De uma maneira correspondente, Iactamases B2 de subgrupo têm um resíduo de arginina, em vez de histidina, na primeira posição do motivo de ligação do zinco principal, NXHXD. Recentemente, a primeira estrutura de cristal de um subgrupo de enzima B2 (CphA) foi solucionada por Garau et al. (2005). O subgrupo B3 contém enzimas com estrutura multimérica (Walsh et al., 2005). As metalo-beta-lactamases mostram um perfil de substrato de espectro am- plo incluindo penicilinas e cefalosporinas, e elas são resistentes à ação dos inibidores de beta-lactamase serina convencionais comuns, tais como sul- bactâmico e tazobactâmico de ácido clavulânico. Além disso, ao contrário da maioria das beta- Iactamases serina, as metalo-beta-lactamases têm a ca- pacidade de hidrolizar carbapenêmicos tais como meropenêmico e imipe- nêmico. Diversos números de bactérias são conhecidos como produtores de metalo-beta-lactamases. Elas são comumente expressas entre as Entero- bacteriae genus (incluindo Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Ci- trobacter freudii, Shigella fiexnerf), Pseudomonas aeruginosa, Stenobacteri- um maltophila, Aeinetobaeter genus, Baeteroides fragilis, Baeillus cereus, Flavobaeteruim odoratum, e Baeteroides fragilis (Walsh et al., 2005).

As beta-lactamases podem ser utilizadas como proteínas farma- cêuticas para desativar beta-lactamases não absorvidas no trato gastrointes- tinal, a fim de prevenir os efeitos adversos induzidos pela beta-lactamase incluindo alterações microbióticas intestinais normais e o super- crescimento das bactérias resistentes ao beta-lactama (W093/13795, W02004/016248). Para uma terapia de beta-lactamase eficaz no trato do intestino delgado, a enzima deve ser resistente à ação de proteases intestinais na presença de ácidos biliares, e preservarem a tividade enzimática alta em uma faixa ampla de pH (5,5-7,5). A viabilidade da terapia de enzima alvejada em modelos de ca- nino e camundongo foi demonstrada empregando uma beta- Iactamase seri- na de Bacillus Iicheniformis durante a medicação de ampicilina parenteral (Harmoinen et al., 2004, Mentula et al., 2004, Stiefel et al., 2003). Entretanto, o perfil do substrato dessa enzima essencialmente limita seu uso como uma substância de fármaco uma vez que ela tem pouca capacidade de hidrolisar cefalosporinas, carbapenemas ou penicilinas na presença de inibidores beta- lactamase. Conseqüentemente, uma nova enzima beta- Iactamase resisten- te à protease com amplo espectro beta-lactama é indispensável para prolon- gar o uso da terapia de beta-lactamase entre pacientes hospitalizados sob medicação intravenosa com vários beta-lactamas. As metalo-beta- Iactamases são conhecidas por desativar vários tipos de beta-lactamas, e elas são resistentes aos inibidores de beta-lactamases serina. As cepas de bacillus cereus são conhecidas por produzir metalo-beta-lactamases que pertencem ao grupo B1. Uma amostra de metalo-beta- Iactamase semipurifi- cada recombinantemente produzida de um Bacillus cereus 98ME 1552 clíni- co isolado, demonstrou eliminar o supercrescimento de bactérias patogêni- cas em potencial em um modelo de camundongo (Stiefel et al, 2005). Entre- tanto, os presentes inventores descobriram que essa preparação de metalo- beta-lactamase continha uma mistura de variantes de beta-lactamase, que baixa seu valor como uma proteína farmacêutica, uma vez que as variações de uma substância de fármaco reduzem a robustez do processo de produ- ção, aumentam as variações de batelada para batelada, tornam difíceis os testes clínicos, que naturalmente têm um impacto negativo sobre seu regis- tro como um medicamento.

A presente invenção agora provê meios para reduzir a heteroge- nicidade do terminal de amino que descobriu-se estar associado com a pro- dução recombinante de metalo-beta-lactamase. A invenção ainda provê me- talo-beta-lactamases modificadas que podem ser produzidas em forma subs- tancialmente pura, e que podem ser usadas na fabricação de composições farmacêuticas. Sumário de Invenção A invenção provê uma proteína metalo-beta-lactamase modifica- da que tem a fórmula geral:

NH2- K-T-E- ABL-COOH (I)

em que K é Iisina

T é treonina E é ácido glutâmico, e

ABL é uma proteína metalo-beta-lactamase que foi truncada na extremidade do terminal de amino, de maneira a deixar quatro cepas beta antes da primeira alfa-hélice da estrutura secundária prevista da dita proteí- na.

A invenção ainda provê uma molécula de nucleotídeo isolada compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificando a dita proteína metalo-beta-lactamase modificada, como também um vetor de expressão contendo a molécula de nucleotídeo, e uma célula hospedeira capaz de ex- pressar a proteína metalo-beta-lactamase codificada pela molécula de nu- cleotídeo.

A invenção também provê uma proteína metalo-beta-lactamase modificada que tem a fórmula geral NH2-E-ABL-COOH (II)

em que E e ABL são como definido acima. A invenção ainda adicionalmente provê um método de preparar uma proteína metalo-beta-lactamase modifi- cada, o dito método compreendendo fazer a cultura sa dita célula hospedei- ra, sob condições que permitam a expressão de uma metalo-beta-lactamase que tem a fórmula geral:

NH2- K-T-E- ABL-COOH, (I)

em que

K é Iisina T é treonina E é ácido glutâmico, e

ABL é uma proteína metalo-beta-lactamase que foi truncada na extremidade do terminal de amino de maneira a deixar quatro cepas beta- antes do primeiro alfa-hélice da estrutura secundária prevista da dita proteí- na, e conduzindo a modificação pós-traducional, resultando em uma metalo- beta-lactamase modificada que tem a fórmula geral:

NH2- E - ABL-COOH, (II) em que E e ABL são como definidos acima, e

opcionalmente, isolando e purificando a proteína pós- traducionalmente modificada obtida.

Como aspectos adicionais a invenção provê uma composição farmacêutica comprendendo a proteína metalo-beta-lactamase de fórmula II, uma metalo-beta-lactamase modificada de fórmula II, para uso como um medicamento, e o uso da metalo-beta-lactamase modificada de fórmula Il para a fabricação de um medicamento para eliminar os efeitos adversos in- duzidos pelo antibiótico beta-lactama no trato intestinal.

Finalmente, a invenção provê um método de tratar os efeitos adversos induzidos pelo antibiótico de beta-lactama no trato intestinal, com- preendendo administrar uma quantidade eficaz de metalo-beta-lactamase modificada de fórmula II, ou uma composição farmacêutica que a contém, para uma pessoa com necessidade da mesma. Modalidades específicas da invenção estão descritas nas reivindicações dependentes. Outros objetivos, detalhes e vantagens da presente invenção se

tornarão evidentes a partir dos desenhos a seguir, da descrição detalhada e dos exemplos.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 mostra a seqüência completa de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos deduzida do gene beta-lactamase de B. cereus 98ME1552.

A Figura 2 mostra a seqüência completa de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos deduzida do gene beta-lactamase de B. cereus 98ME1552, derivadas do construto da expressão de pRSH315. O sítio de clivagem dos resíduos de aminoácido 31 ao longo da seqüência de sinal de Bacillus amyloliquefaciens está prevista para ocorrer entre alanina na posi- ção -1 e glutamina na posição +1. A extensão de NH2-terminal de um NH2- QAS-tripeptídeo, que é derivado de sítio de clonagem Hind III, está expressa em negrito.

A Figura 3 mostra a seqüência completa de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos deduzida do gene beta-lactamase de B. cereus 98ME1552 derivadas do construto da expressão de pRSH318. A clivagem dos resíduos de um aminoácido 31, ao longo da seqüência de sinal de Baeil- Ius amyloliquefaciens, está prevista para ocorrer entre alanina na posição -1 e glutamina na posição +1. A extensão de NH2-terminal de um NH2-QAS- tripeptídeo que é derivado do sítio de clonagem Hind Ill e a inserção de KT estão apresentadas em negrito. Descrição Detalhada da Invenção

Um preparado de metalo-beta-lactamase foi primeiro produzido em um sistema de produção de Bacillus subtilis contendo um construto de expressão do gene completo de metalo-beta-lactamase, codificando a enzi- ma completa de metalo-beta. A análise de espectrometia de massa detalha- da revelou que o preparado de metalo enzima incluiu vários números de va- riantes de enzima com seqüências de terminal amino heterogêneo. Acredita- se que as variações nas seqüências de terminação de amino são um resul- tado da modificação pós-traducional de proteases da célula hospedeira. As alterações observadas na seqüência de aminoácido metalo enzima aumen- tou as variações de batelada para batelada de enzima que tinha sido produ- zida em um sistema de produção de Bacillus subtilis e, dessa maneira, em perspectiva reguladora reduz seu uso como uma proteína farmacêutica. As- sim sendo, os meios biológicos moleculares para reduzir as variações ob- servadas na seqüência de terminal de amino da enzima metalo-beta- lactamase foram estudados.

Espera-se que a região do terminal de amino não tenha influên- cia essencial sobre as propriedades catalíticas da enzima. Em adição, des- cobriu-se que a região do terminal de amino está exposta às modificações pós-traducionais de proteases no sistema de produção de Bacillus subtilis em que a proteína recombinante é secretada fora da célula bacteriana. A fim de reduzir essa micro-heterogeneidade na região de terminal de amino, a seqüência de nucleotídeos, que codifica essa região prevista, foi eliminada por um método de PCR. Entretanto, a mera eliminação por si mesma não levou a uma redução significativa da heterogeneidade do terminal de amino. Surpreendentemente, entretanto, a eliminação combinada com a inserção de um dipeptídeo, que foi projetada para atender a modificação pós- tranducional, levou a uma única variante de metalo-beta- Iactamase produzi- da com um terminal de amino igualmente modificado.

Essa invenção, de um modo geral, refere-se a uma beta- Iactamase modificada útil como uma proteína farmacêutica, e também a um intermediário de beta-lactamase recombinante que é produzido pela trunca- mento e inserção de um dipeptídeo em seu terminal amino, resultando em números reduzidos de variantes de beta-lactamase. Essas modificações fa- cilitam a produção recombinante da enzima em forma homóloga para uso como uma substância de fármaco em terapia com beta-lactamase para a eliminação de efeitos colaterais induzidos por beta-lactamas (cefalosporinas, carbapenemas, e penicilinas na presença ou ausência de inibidores beta- lactamase conhecidos tais como ácido clavulânico, sulbactâmico e tazobac- tâmico). Em particular, a invenção refere-se à modificação pós-traducional alvejada de metalo-beta-lactamase ativa, através de truncamento e inserção de um dipeptídeo na região de terminal amino, a fim de reduzir a heteroge- neidade do terminal amino em um sistema de produção de Bacillus subtilis.

"Metalo-beta-lactamases", como usado aqui a seguir, refere-se à beta- Iactamases de classe B, isto é, beta-lactamases que requerem pelo menos um íon de metal bivalente (Zn2+) por atividade; e constituem o grupo 3 na classificação funcional de Bush-Jacoby-Madeiros (Bush, 1998). Com base nas similaridades estruturais na região que coordena a ligação de zin- co, as metalo-beta-lactamases podem ser divididas em três subgrupos, B1, B2 e B3 (Galleni et al., 2001). Preferivelmente, a metalo-beta-lactamase da invenção pertence ao subgrupo B1. Esse subgrupo possui os resíduos cha- ve de coordenação de zinco de três histidinas e uma cisteína. Mais detalhes sobre os subgrupos estão descritos na parte de antecedentes deste relató- rio. As metalo-beta-lactamases são membros de uma grande, diver- sificada, superfamília de proteínas que compartilham uma estrutura de αβ/βα similar de quatro camadas. A cadeia de polipeptídeos é dividida em dois domínios, que compreende filamentos e hélices na ordem a seguir: βϊ β2 β3 β4 βε αϊ β6 α2 β7 α3 e β8 βg βίο βιι α4 βΐ2 α5, respectivamente (Carfi et al.,1995 e 1998a, e Gallenr et a/., 2001). As metalo-beta-lactamases da inven- ção são truncadas na extremidade do terminal de amino, antes do segundo filamento beta. Preferivelmente, elas são truncadas entre o primeiro e a se- gunda fita beta, e em particular imediatamente em frente do aminoácido E, entre o primeiro e a segunda fita beta, de acordo com a estrutura cristalográ- fica acima.

Garau et al., 2004 demonstraram um esquema de numeração padrão para beta-lactamases de classe B (BBL) por analogia à numeração de beta-lactamases de Ambler (ABL) para beta-lactamases de serina (Am- bler, 1980). O esquema de numeração de BBL é derivado de uma alinha- mento estrutural de estruturas de raio X de metalo-beta-lactamases conheci- das, a fim de descobrir regiões conservadas entre vários grupos metalo be- ta-lactamase que têm grau de identidade de reboque no nível de seqüências de aminoácidos primários. O estudo de Garau et al, revelou que o primeiro fragmento conservado, forma a segunda estrutura de lâmina beta em metalo beta-lactamase de Bacillus cereus Bell, demonstrado por Carfi et al. 1995, e Carfi et al., 1998a. Conseqüentemente, a lâmina βι de metalo beta- lactamase S. cereus parece não ser essencial para a função da enzima, porque ela não está presente em todos os grupos metalo beta-lactamase. Entretanto, a região de terminal de amino de todas as metalo beta- lactamases possui uma estrutura secundária de quatro lâminas beta, con- servadas formando fragmentos antes do primeiro fragmento formador de alfa helix. Dessa maneira, o sítio de truncamento para a metalo beta-lactamase pode ser definido como deixando quatro lâminas beta antes da primeira alfa helix da estrutura secundária prevista independente da presença original de βι ou não.

No presente contexto, são usados os códigos de aminoácido uma letra convencionais. Dessa maneira, A denota alanina, R denota argini- na, N denota asparagina, D denota ácido aspártico, C denota cisteína, E de- nota ácido glutâmico, Q denota glutamina, G denota glicina, H denota histidi- na, I denota isoleucina, L denota leucina, K denota lisina, M denota metioni- na, F denota fenilalanina, P denota prolina, S denota serina, T denota treoni- na, W denota triptofano, Y denota tirosina, e V denota valina. As seqüências de aminoácidos são mostradas com a terminação de amino à esquerda e a terminação de carboxila à direita. NH2- e -COOH podem estar ou não indica- dos.

De acordo com uma modalidade da invenção a célula hospedei- ra é transformada com um vetor de expressão capaz de expressar uma be- ta-lactamase que tem a fórmula geral I:

NH2- K-T-E- △BL-COOH, (I) em que K é lisina, T é treonina, E é ácido glutâmico, e ABL é uma proteína metalo- beta-lactamase que foi truncada na extremidade do terminal de ami- no, antes do segundo filamento beta da dita proteína, dessa maneira a prote- ína que tem a fórmula geral II:

NH2- E - △BL-COOH, (II) é formada como um resultado da modificação pós- traducional da proteína de fórmula I. A proteína da fórmula geral I é convenientemente produzida por ligar uma seqüência de DNA que codifica KT à uma seqüência de DNA que codifica E - ABL, em que E - ABL é um Bacillus e em particular uma metalo- beta-lactamase B. cereus que foi truncada na extremidade do terminal de amino, antes do segundo filamento beta, imediatamente em frente a um re- síduo de ácido glutâmico E. Em particular, o construto de nucleotídeo com- preende os nucleotídeos seqüenciais 94 - 756 de SEQ ID NO: 2.

O comprimento da região do terminal de amino sem estrutura rígida varia entre os grupos metalo-beta-lactamase e dentro de cada sub- classe. As metalo-beta-lactamases de Bacillus spp também possuem varia- ções na seqüência do terminal de amino, antes da segunda fita beta, mas a maioria das enzimas têm um ácido glutâmico (E) conservado na posição +12 (veja a Tabela 1). Conseqüentemente, a eliminação acoplada com a inser- ção de KT adjacente a E pode ser aplicada aos Bacillus metalo-beta- Iactamases conhecidos, caso em que os primeiros aminoácidos de terminal amino onze são eliminados da extremidade de terminal N- da proteína de beta-lactamase madura de ocorrência natural. De acordo com uma modali- dade específica da invenção, a beta-lactamase é truncada entre os aminoá- cidos KT e E, e especialmente entre VIKN e Ei ou VMKN e E.

Tabela 1. Comparação das seqüências de terminal amino entre metallo- beta-lactamases de Bacillus sp e P2A.

<table>table see original document page 11</column></row><table>* As substituições de aminoácidos estão em negrito e o ácido

glutâmico (E) conservador está sombreado. O primeiro filamento beta para as metalo-beta-lactamases é uma vez sublinhado, e o segundo filamento beta é sublinhado duas vezes.

De acordo com a modalidade específica da invenção E - ABL tem pelo menos 70, 80, 90, 95, 98 ou 99 % de identidade para a seqüência de aminoácidos de resíduos de aminoácido seqüencial 6-221 de SEQ ID NO: 3. A identidade da seqüência pode ser determinada usando BLAST (Basic Local Alignment Search Tools [Ferramentas de Pesquisa de Alinha- mento Local Básico) como descrito em Altschul et al., 1997. Em particular E - ABL é uma forma truncada de uma metalo- beta-lactamase tendo a se- quência descrita como SEQ ID NO: 1, ou uma variante ativa de beta- Iacta- mase ou fragmento da mesma. Ela pode por exemplo ser uma forma trunca- da de metalo-beta-lactamase B. cereus Bell. Preferivelmente, E - ABL tem uma extremidade de terminal de amino que corresponde aos resíduos de aminoácidos 12-15, 12-19, ou 12-23 de SEQ ID NO: 1, com a adição de que aquela do aminoácido na posição + 13 pode ser ou T (treonina) ou A (alani- na).

Por uma seqüência de aminoácidos que é uma "variante" de uma seqüência de aminoácidos específica se quer dizer uma seqüência de aminoácido que não é idêntica á seqüência de aminoácidos específica, mas contém pelo menos algumas trocas de aminoácidos, isto é, eliminações, substituições, inversões, inserções etc. que não afetam essencialmente a atividade biológica da proteína quando comparadas àquelas da seqüência de aminoácidos específica. Atividade biológica neste contexto refere-se à atividade de beta- lactamase. Uma variante pode ser um polipeptídeo que ocorre naturalmente, por exemplo, como uma variante alélica dentro do mesmo filamento, espécie ou joelho, ou ela pode ter sido gerada por muta- gênese.

Entende-se por "fragmento" como sendo parte de uma seqüên- cia de aminoácidos específica que é longa o suficiente para ter a atividade biológica desejada, isto é, atividade de beta- lactamase. Em outras palavras o fragmento pode ser, por exemplo, uma subsequência das beta-lactamases especificamente descritas.

O construto de nucleotídeo que codifica NH2 -K-T-E- ABL- COOH pode ser inserido em um vetor de expressão, e transformado em uma célula hospedeira. A célula hospedeira é depois cultivada sob condições que permitem a modificação da expressão e pós- traducional da proteína em NH2 - E - ABL-COOH, que dessa maneira pode ser obtida em forma substancial- mente pura, que significa que pelo menos 90 %, e preferivelmente pelo me- nos 95 %, em particular pelo menos 99 % de metalo-beta- lactamase está presente em uma forma única como NH2- E - ABL-COOH. A modificação traducional da proteína expressa, isto é, a clivagem do dipeptídeo KT é cata- lisada pelas proteases do hospedeiro. O hospedeiro pode ser eucariótico ou pró- cariótico, tal como uma célula bacteriana, Ievedo ou fungo. O hospedei- ro bacteriano pode ser, por exemplo, Escherichia coli. Preferivelmente o hospedeiro pertence ao Baciilus spp, e em particular é B. Iieheniformis ou B. subtilis. De acordo com uma modalidade preferida, a NH2 -K-T-E- ABL- COOH é expressa como uma proteína compreendendo um peptídeo de si- nal, desse modo a proteína é secretada em meio de cultura, e o peptídeo de sinal é primeiro clivado, e depois o dipeptídeo. Outras mudanças menores tais como desamidação, oxidação, rompimento ou formação de ligação de dissulfeto, isomerização, succinimidação, ligação cruzada de não-dissulfeto, reação de Maillard, desglicosilação pode ocorrer na proteína durante o pro- cesso de produção ou armazenamento, e são aceitáveis desde que a ativi- dade de beta-lactamase não seja afetada significativamente.

A beta-lactamase NH2 - E - ABL-COOH modificada por qualquer bactéria capaz de produzir uma metalo-beta-lactamase. Tais bactérias são exemplos bactérias de Enterobaeteriae genus (Serratia mareescens, Klebsi- ella pneumoniae, Cifrobaeter freudii, Shigella flexnen), Pseudomonas aeru- ginosa, Stenobaeterium maltophila, Aeinetobaeter genus, Bacteroides fragi- lis, Bacillus cereus, Flavobaeteruim odoratum, and Baeteroides fragilis. Ou- tras possíveis fontes são as espécies de Aeromonas, Legionella e Stenotro- phomonas. A enzima é truncada na extremidade do terminal de amino e a proteína da enzima madura anterior ao segundo filamento beta em uma po- sição resultando em E como o aminoácido de terminal N-. Se não houver resíduo apropriado E na beta- Iactamase bcteriana, somente a parte de ABL pode ser obtida da bactéria, dessa maneira um tripeptídeo KTE é acoplado na frente de ABL para formar a proteína NH2 -K-T-E- ABL-COOH. Prefe- rivelmente, a beta-lactamase modificada é derivada de Bacillus, e especial- mente de B. cereus. Em particular ela é uma beta-lactamase B. cereus a partir da qual os primeiros aminoácidos de terminal N onze da proteína de beta- Iactamase madura não modificada foi eliminada. A beta-lactamase modificada da invenção pode ser misturada

com quaisquer excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis para formar uma composição farmacêutica. Uma quantidade eficaz de beta- Iactamase modificada de eliminação do efeito adverso de antibióticos de be- ta-lactama no intestino é depois administrada oralmente para uma pessoa que está sendo tratada com um ou mais antibióticos de beta-lactama. A pre- paração de beta-lactamase pode ser administrada antes, simultaneamente com, ou depois do tratamento antibiótico. Ela é insensível aos inibidores be- ta- Iactamase serina, e pode dessa maneira ser usada para eliminar o antibi- ótico na presença e na ausência de tais inibidores.

A invenção é ilustrada pelos exemplos não Iimitantes a seguir. Deverá ficar entendido, entretanto, que as modalidades dadas na descrição acima e nos exemplos são para fins ilustrativos somente, e que diversas mudanças e modificações são possíveis dentro do escopo da invenção. Exemplo 1. Materiais e métodos Filamentos bacterianos e condições de crescimento

Os filamentos bacterianos e seus genótipos e fenótipos relevantes são apre- sentados na Tabela 2.

Tabela 2. Filamentos bacterianos e seus genótipos e fenótipos relevantes

<table>table see original document page 14</column></row><table> <table>table see original document page 15</column></row><table>

As bactérias foram de um modo geral cultivadas em meio de Lu- ria complexa (5 gramas de extrato de levedo, 10 gramas de triptona e 10 gramas de cloreto de sódio por litro) suplementado com antibióticos apropri- ados como agentes de seleção em modo de frasco agitado a +37C. Um meio de cultura sintética suplementado com antibiótico apropriado foi usado em fermentações. Um meio sintético modificado foi usado para gerar células de Bacillus subtilis adequadas. A composição detalhada desses meios está descrita no W003/040352. Técnicas de DNA

Técnicas convencionais de DNA incluindo, por exemplo, restri- ções, eletroforese e ligações de agarose gel, foram realizadas de acordo com Sambrook e Russell (2001). O DNA cromossomal foi isolado pelo méto- do de Marmur (Marmur, 1961). O plasmídeo de DNA foi isolado por Midi Kit de plasmídeo Qiagen de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen Plasmid Purification Handbook, 1999), mas o tratamento de Iisozima (1 mg/ml) foi adicionado ao protocolo a fim de degradar a camada de peptido- glicano. A Iisozima foi suplementada para o tampão P1 e as células foram incubados a 37°C por 30 minutos.

O PCR geralmente foi executado de acordo com os protocolos descritos no W003/040352.

Caracterização da região de terminal de amino de várias formas de metalo- beta-lactamase

Para determinações da seqüência de aminoácideos de termianal N- e espectrometria de massa, amostras de metalo-beta-lactamase purifica- das foram submetidas à cromatografia de fase reversa e as enzimas foram fracionadas em um gradiente linear de 0,1 % de TFA e 0,075 % de TFA- a- cetonitrila de 0% a 100 % por 60 minutos.

As seqüências de terminal NH2- de formas de metalo-beta- Iactamase foram determinadas pela degradação Edman automática com um Applied Biosystems modelo 494A Proteína Sequenator.

As análises de massa das formas de metalo-beta-lactamase fo- ram realizadas por um instrumento de tempo-de-vôo-tetrapolar (Q-TOF) hí- brido. Supõe-se que as variantes de metalo-beta-lactamase provêm potenci- ais de ionização comparáveis que têm sido utilizadas nas avaliações de suas proporções relativas nas amostras. As seqüências de nucleotídeos dos ge- nes beta-lactamase foram determinadas pelo método de terminação de ca- deia de dideóxi com um sequenciador de DNA automático. Exemplo 2. A seqüência completa de nucleotídeos de gene metalo-beta- lactamase de Bacillus cereus 98ME1552. A determinação de gene completa que codifica metalo-beta- Iac-

tamase foi seqüencialmente realizada usando técnicas de PCR e Vectorette. Parte do gene estrutural foi expandida através de PCR, com DNA cromos- somal isolado de um B. cereus 98ME1552 como um gabarito, com os inicia- dores projetados para hibridizar para a região de codificação de SQKVEKTVI (iniciador avançado) e região de c codificação de HTLDLL (iniciador reverso) do gene metalo-beta-lactamase de Bacillus cereus 569/H. Ambos os inicia- dores também contêm os sítios de restrição Hind III. O fragmento de DNA amplificado (cerca de 700 pb) foi fragmentado com Hind Ill e ligado ao sítio Hind Ill de um vetor de secreção pKTH141. As células adequadas do Bacil- Ius subtilis 1H6140 foram transformadas com uma mistura de ligação. Um clone que abriga um plasmídeo expressando metalo-beta-lactamase foi veri- ficado seqüenciando o DNA. O plasmídeo foi chamado de pRSH314. Células adequadas de B. subtilis RS303, preparadas como descrito em W003/04052, foram transformadas com pRSH314 tendo como resultado o filamento B. subtilis RS314.

A seqüência completa de genes metalo-beta-lactamase foi de- terminada a partir de fragmentos de PCR obtidos empregando a técnica de Vectorette a seguir: 0 DNA cromossomal do Bacillus cereus 98ME1552 foi fragmentado com enzima de restrição Hind Ill e ligado ao Vectorettell Hind Ill tratado. A biblioteca Vectorette obtida foi rastreada em uma reação de PCR através do emprego de MEBLSQ-F (S'-AGGAAATGTTGCGGATGC) ou MEBLSQ-R (S'-CCTTCGTTAATTTGTTATCCC) iniciando os iniciadores pro- jetados a partir da seqüência de DNA obtida de 700 pb de pRSH314.

O rastreamento de PCR da biblioteca Vectorette com o iniciador MEBLSQ-F gerou um fragmento de cerca de 1000 pb (fragmento MEBL1), e com o iniciador MEBLSQ-R um fragmento de cerca de 1100 pb (fragmento MEBL2). Ambos os fragmentos, MEBL1 e MEBL2, foram purificados com gel de agarose depois da eletroforese. A seqüência de nucleotídeos de ambos os fragmentos foi determinada seqüenciando o DNA resultando no nucleotí- deo completo do gene metalo-beta-lactamase de B. cereus 98ME1552. O nucleotídeo completo e a seqüência de aminoácidos deduzida do gene me- talo-beta-lactamase B. cereus 98ME1552 é apresentada na Figura 1. A se- qüência de aminoácidos está também referida como SEQ ID NO: 1. A estru- tura de leitura aberta codifica um polipeptídeo de aminoácido 257, cuja se- qüência de terminal amino (30 resíduos de aminoácidos) exibe característi- cas típicas daquelas de um peptídeo bacteriano de sinal que alveja a secre- ção de proteína por toda a membrana citoplásmica, através de uma via se- cretora geral. O sítio de clivagem de peptidase de sinal previsto está depois de alanina, na posição de -30 (veja a Figura 1.). A massa molecular calcula- da e o valor de pi da proteína, de resíduos de aminoácidos 227 madura é 24877,3 Da e 6,0, respectivamente. A seqüência de metalo- beta-lactamase 98ME1552 foi usada como um gabarito de pesquisa em uma pesquisa de BLAST a fim de identificar a proteína. A pesquisa de BLAST foi realizada usando a Rede de Serviços SIB BLAST do Instituto Suíço de Bioinformática (Swiss Institute of Bioinformatics) (http://www.expasy.org/tools/blast/). A pes- quisa foi feita contra um banco de dados com base em UniProtKB Knowled- ge, usando o programa NCBI BLASTP 2.2.13 program (Altschul et al., 1997) com o algoritmo de BLOSUM62 e 11 pontos de intervalo para existência e 1 para prolongamento. A pesquisa de BLAST realizado com metalo- beta- Iactamase 98ΜΕ1552 deu a mais alta similaridade classificada com outras beta- Iactamases de classe B do subgrupo B1. Como esperado, a beta- Iactamase de 98ME1552 exibiu um alto grau de identidade (mais de 90 %) com outras beta- Iactamases de B.cereus. De acordo com o alilnhamento estrutural de várias metalo- beta-lactamase de B. cereus, as substituições de aminoácidos em Iactamase de B. cereus 98ME 1552 são prognosticadas para se localizarem em regiões não essenciais para a função da enzima. Exemplo 3. Clonagem e expressão do gene metalo- beta-lactamse de B.cereus 98ME 1552 no Bacillus subtilis Com base nas seqüências de DNA obtidas a partir dos iniciado-

res da biblioteca de Vectorette, novos iniciadores, BLC1-F (5'-CGCGAAGCTTCCGAACAAAAGCTAGAGCAAATAGTAATC), e BLC1-R

(5'-GCCGAAGCTTTTATTTTAATAAATCCAATGTATGTAAAAGTAATCCC) foram projetados para gerar um inserção de DNA codificando a metalo-beta- Iactamase completa em PCR. Os iniciadores também carregaram sítios de Hind Ill- em suas extremidades e o DNA cromossomal purificado B. cereus98ME1552 foi usado como um gabarito. Ofragmento de PCR ampliado de cerca de 0,7 kb foi fragmentado com Hind III, e ligado ao sítio Hind Ill de um vetor de secreção pKTH141. Células de Bacillus subtilis RS303 adequadas foram transformadas pela mistura de ligação. Um clone positivo foi designa- do RS315 e o construto de expressão de abrigo foi chamado de PRSH315.

O construto de expressão pRSH315 foi isolado e a região de inserção foi sequenciada. O nucleotídeo e as seqüências de aminoácidos deduzidos do gene de metalo-beta-lactamase clonado eram idênticos àque- les determinados pela biblioteca Vectorette. A seqüência de DNA determina- da revelou na fusão de estrutura entre a seqüência de nucleotídeos codifi- cando uma seqüência longa de sinais de aminoácidos 31 de Bacillus amylo- Hquefaciens alfa amilase, o sítio de clonagem Hind Ill e o gene de metalo- beta-lactamase B.cereus 98ME1552 completo (veja a Figura 2.). Existe o prognóstico da peptidase de sinal cortar a ligação de peptídeo entre alanina (A) na posição de -1 e glutamina (Q) na posição de +1. A metalo- beta- Iactamase madura possui uma extensão de terminal NH2- de um tripeptídeo NH2-QAS- que é derivado do sítio de clonagem Hind Ill no construto da ex- pressão. Em conseqüência, com base na seqüência de aminoácido deduzi- da a metalo-beta- Iactamase modificada madura é compreendida de 230 resíduos de aminoácidos.

Exemplo 4. Determinação da seqüência de aminoácidos do terminal de ami- no de variantes metallo-beta-lactamase obtidas a partir de um sistema de produção de Bacillus subtilis

Para uma caracterização adicional, a metalo-beta- Iactamase recombinante foi produzida em cultivos realizados em frasco de agitação ou fermentação, usando um meio de crescimento sintético. A metalo-beta- Iactamase foi eficazmente secretada em uma sobrenadante de cultura. A enzima foi purificada a partir da sobrenadante de cultura concentrada por cromatografia de troca de íons. A atividade de enzima foi observada em du- as frações separadas. Frações de enzima purificada foram submetidas para a seqüência de terminal NH2-, e análise de espectrometria de massa. As a- nálises revelaram que ambas as frações compreendem formas de enzimas com terminação de amino heterogêneo. As várias formas de enzima e suas proporções relativas são apresentadas na Tabela 3. Em relação à seqüência de aminoácidos deduzidos, todas as formas de enzima têm eliminações de vários comprimentos em suas regiões de terminal NH2-. Em geral, o octa- peptídeo NH2-QASEQKLE parece estar eliminado em todas as formas de enzima. Além disso, a menor forma de enzima na fração 2 não tem um pen- tapeptídeo adicional IVIKN-. A micro-heterogeneidade observada na região de terminal NH2- pode ser explicada como modificações pós-traducionais causadas pela ação de várias proteases de célula hospedeira.

Tabela 3. Seqüências de terminal de amino deduzidas e determinadas e massa molecular determinada de formas metalo-beta-lactamase truncadas

<table>table see original document page 19</column></row><table> <table>table see original document page 20</column></row><table> Exemplo 5. Construção de forma metalo- beta-lactamase eliminada de Bacil- lus cereus 98ME1552 e suas variantes de terminal amino em um sistema de produção de Bacillus subtilis

A fim de tentar reduzir a heterogeneidade de terminal IMH2- a seqüência de DNA que codifica a região variável de NH2-EQKLEQIVIKN do gene de metalo-beta- Iactamase foi deletado por PCR. O gene completo me- talo-beta-lactamase de B. cereus 98ME1552 foi usado como um gabarito em PCR com um iniciador dianteiro hibridizando para uma seqüência de codifi- cação de ETGTISISQ, e um iniciador reverso hibridizando para uma se- quência de codificação de GLLLHTLDLLK seguida por uma tradução de um códon de terminação TAA. Ambos os iniciadores conduziram sítios Hind III.

O fragmento de PCR obtido de cerca de 0,7 kb foi clonado em um sítio Hind Ill do vetor de secreção pKTH141 e o filamento de B.subtilis RS303 adequada foi transformado pela mistura de ligação. A eliminação do terminal NH2- foi verificada por sequenciamento do DNA do gene metalo- beta-lactamase inserido do construto de expressão isolado de um clone po- sitivo. O filamento transformador foi chamado de Bacillus subtilis RS317 e o construto de expressão foi chamado de pRSH317.

A metalo-beta-lactamase truncada foi produzida em um hospe- deíro de produção de Bacillus subtilis, e a enzima foi purificada a partir da sobrenadante de cultura empregando cromatografia de troca de íon da qual a enzima ativa foi depurada como uma fração única. A fração de enzima foi submetida ao sequenciamento de aminoácido de terminal NH2- e análise de massa molecular. Os resultados observados (na Tabela 4) mostraram que a metalo-beta-lactamase truncada também apareceu como uma proteína com uma terminação de amino heterogênea. A principal variante de enzima pos- sui uma seqüência de terminal de amino idêntica àquela da seqüência de aminoácidos deduzida incluindo o sítio Hind Ill codificando a iniciação de QAS-tripeptídeo. Uma variante menor foi encontrada como tendo uma elimi- nação de um QA- dipeptídeo. Devido ao bloqueio do terminal de amino, ne- nhuma seqüência de aminoácido foi recebida de uma variante. O bloqueio do terminal de amino é provável que seja o resultado de ciclização de resí- duo de glutamina para formar um resíduo de piroglutamila durante o proces- so de produção. Para concluir, a eliminação do terminal amino não reduz fundamentalmente a micro-heterogeneidade do terminal amino. Tabela 4. Seqüências de terminal amino determinadas e massas molecula- res de formas de metalo-beta-lactamase truncadas

<table>table see original document page 21</column></row><table> Exemplo 6. Construção de metalo- beta-lactamase de Bacillus cereus98ME1552 truncado possuindo uma inserção de seqüência codificando KT A fim de evitar a modificação pós-traducional, um truncamento molecular de metalo-beta-lactamase foi projetado para compreender a elimi- nação da seqüência de DNA codificando a região de NH2-EQKLEQIVIKN junto com a inserção de uma seqüência codificando o dipeptídeo KT, Iocali- zado diretamente a jusante do sítio de clonagem 3'- Hind III.

Um gene de metalo-beta-lactamase modificado foi criado como no Exemplo 5, exceto para o iniciador anterior, que continha uma seqüência de DNA codificando KT. O fragmento de PCR foi cortado com Hind Ille liga- do ao sítio Hind Ill do vetor de secreção pKTH141, e as células B. subtilis RS303 adequadas foram transformadas pela mistura de ligação. A seqüên- cia correta de nucleotídeos do gene metalo-beta-lactamase modificado no construto da expressão foi confirmado sequenciando o DNA. Um clone posi- tivo foi chamado de Bacillus subtilis RS318, e o construto da expressão foi chamado de pRSH318. O nucleotídeo e a seqüência de aminoácido deduzi- da da beta-lactamase de B. cereus 98ME1552 derivados de pRSH318, são apresentados na Figura 3, e descritos como SEQ ID N0:2 e 3, respectiva- mente.

A metalo-beta-lactamase truncada foi produzida, purificada e analisada como descrito anteriormente. A metalo enzima ativa truncada foi depurada da coluna como um pico único. A fração única continha metalo- beta- Iactamase que possuía um resíduo de ácido glutâmico de terminal a- mino homólogo (NH2-E; veja a Tabela 5). Por conseguinte, a inserção do dipeptídeo KT- conduz à modificação pós- traducional resultando em uma seqüência de aminoácido de terminal amino uniforme. A metalo-beta- lactamase truncada foi chamada de proteína P2A.

Tabela 5. Seqüências de terminal amino deduzidas e determinadas, e a massa molecular determinada da forma de metallo-beta-lactamase truncado

<table>table see original document page 22</column></row><table> <table>table see original document page 23</column></row><table> .1. a. Nh2-ETGISI a. 100 a. 23554

Exemplo 7. Parâmetros de enzima cinética metalo-beta- Iactamase P2A

A diversidade das propriedades catalíticas da enzima P2A foi estudada com vários tipos de beta-lactamas, incluindo a família da periicilina com e sem inibidores beta-lactamase serina, cefalosporinas de segunda e terceira geração, e carbapenemas (meropenema). Os parâmetros de enzima cinética kcat e Km foram determinados a partir das variações iniciais pelo plot de Hanes. As reações foram realizadas em 10 mM de tampão de fosfato, pH7,0 a 30°C. A cubeta de reação (um m(_) continha cerca de 5 pmols de enzi- ma em todas as reações exceto 1,7 pmol de enzima no ensaio de merope- nema. A hidrólise de vários substratos de beta-lactamas foi espectrofometri- camente registrada em um comprimento de onda específico para cada subs- trato.

Os valores para parâmetros cinéticos diferentes (kcat, Km e kcat/Km) que representam valores médios obtidos a partir de três medidas independentes estão reportados na Tabela 6.

Tabela 6. Valores de parâmetro cinético para metalo-beta-lactamase P2A

<table>table see original document page 23</column></row><table> <table>table see original document page 24</column></row><table> Exemplo 8. Estabilidade da proteína P2A em quimio ileal de ser humano

A resistência às proteases intestinais é um dos fatores mais im- portantes que afetam a aplicabilidade da proteína P2A como uma substância de fármaco na terapia de beta-lactamase alvejada no intestino delgado. A suscetibilidade da metalo-beta-lactamase para a ação de proteases do intes- tino delgado foi testada adicionando várias quantidades de enzima ativa em tubos que consistem o quimo ileal do ser humano. A hidrólise da metalo- beta-lactamase foi monitorada medindo a atividade de beta-lactamase de amostras ileais em vários pontos do tempo. O Meropenemo foi empregado como substrato nos ensaios da atividade.

Os resultados obtidos a partir de quatro experimentos indepen- dentes e os valores médios são expressos na Tabela 7. A enzima P2A pare- ce ser uma proteína estável, que foi depurada no quimo ileal humano com uma média de vida de 55 minutos (valor médio). Variações altas de médias de vida foram observadas entre os vários experimentos. Entretanto, a média de vida de P2A no quimo do intestino delgado de ser humano tem sido ava- liada para ser adequada à aplicação bem sucedida da terapia da enzima P2A para a eliminação da reação adversa induzida por beta-lactama residual nos tratos intestinais. Tabela 7. Média de vida (in vitro) da metalo-beta-lactamase P2A no quimo ileal de ser humano.

<table>table see original document page 24</column></row><table> Referências

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<170> PatentIn versão 3.2 <210> 1 <211> 257 <212> PRT

<213> Bacillus cereus <22 0>

<221> mat_peptideo <222> (31)..(257) <400> 1

Met Lys Lys Asn Thr Leu Leu Lys Leu Gly Val Cys Val Ser Leu Leu -30 -25 -20 -15

Gly Ile Thr Gln Phe Val Ser Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Gln

-10 -5 -1 1

Lys Leu Glu Gln Ile Val Ile Lys Asn Glu Thr Gly Thr Ile Ser Ile

5 10 15

Ser Gln Leu Asn Lys Asn Val Trp Val His Thr Glu Leu Gly Tyr Phe

20 25 30

Asn Gly Glu Ala Val Pro Ser Asn Gly Leu Val Leu Asn Thr Ser Lys 35 40 45 50

Gly Leu Val Leu Val Asp Ser Ser Trp Asp Asn Lys Leu Thr Lys Glu

55 60 65

Leu Ile Glu Met Val Glu Lys Lys Phe Gln Lys Arg Val Thr Asp Val

70 75 80

Ile Ile Thr His Ala His Ala Asp Arg Ile Gly Gly Ile Thr Ala Leu

85 90 95

Lys Glu Arg Gly Ile Lys Ala His Ser Thr Ala Leu Thr Ala Glu Leu 100 105 110 Ala Lys Asn Ser Gly Tyr Glu Glu Pro Leu Gly Asp Leu Gln Thr Ile 115 120 125 130

Thr Ser Leu Lys Phe Gly Asn Thr Lys Val Glu Thr Phe Tyr Pro Gly

135 140 145

Lys Gly His Thr Glu Asp Asn Ile Val Val Trp Leu Pro Gln Tyr Gln

150 155 160

Ile Leu Ala Gly Gly Cys Leu Val Lys Ser Ala Glu Ala Lys Asp Leu

165 170 175

Gly Asn Val Ala Asp Ala Tyr Val Asn Glu Trp Ser Thr Ser Ile Glu

180 185 190

Asn Val Leu Lys Arg Tyr Gly Asn Ile Asn Ser Val Val Pro Gly His 195 200 205 210

Gly Glu Val Gly Asp Lys Gly Leu Leu Leu His Thr Leu Asp Leu Leu 215 220 225

Lys <210> 2 <211> 759 <212> DNA

<213> Bacillus cereus <22 0>

<221> sig_ peptídeo <222> (1) . . (93) <22 0>

<221> CDS

<222> (1) . . (756)

<220>

<221> mat_peptídeo <222> (94) . . (756) <400> 2

atg att caa aaa cga aag cgg aca gtt tcg ttc aga ctt gtg ctt atg 48

Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met -30 -25 -20

tgc acg ctg tta ttt gtc agt ttg ccg att aca aaa aca tca gcg caa 96

Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala Gln -15 -10 -5 -1 1

gct tcc aaa aca gag acg gga acc att tca ata tct cag tta aac aag 144

Ala Ser Lys Thr Glu Thr Gly Thr Ile Ser Ile Ser Gln Leu Asn Lys

5 10 15

aat gta tgg gtt cat acg gag tta ggt tat ttt aat gga gaa gca gtt 192

Asn Val Trp Val His Thr Glu Leu Gly Tyr Phe Asn Gly Glu Ala Val

20 25 30

cct tcg aac ggt cta gtt ctt aat act tct aaa ggg cta gta ctt gtt 240

Pro Ser Asn Gly Leu Val Leu Asn Thr Ser Lys Gly Leu Val Leu Val

35 40 45

gat tct tct tgg gat aac aaa tta acg aag gaa cta ata gaa atg gta 288

Asp Ser Ser Trp Asp Asn Lys Leu Thr Lys Glu Leu Ile Glu Met Val 50 55 60 65

gaa aag aaa ttt cag aag cgc gta acg gat gtc att att aca cat gcg 336

Glu Lys Lys Phe Gln Lys Arg Val Thr Asp Val Ile Ile Thr His Ala

70 75 80

cac gct gat cga att ggc gga ata aca gcg ttg aaa gaa aga ggc att 384

His Ala Asp Arg Ile Gly Gly Ile Thr Ala Leu Lys Glu Arg Gly Ile

85 90 95

aaa gcg cat agt aca gca tta acc gca gaa cta gca aag aac agt gga 432

Lys Ala His Ser Thr Ala Leu Thr Ala Glu Leu Ala Lys Asn Ser Gly 100 105 110

tat gaa gag ccg ctt gga gat tta caa aca att acg agt tta aag ttt

480

Tyr Glu Glu Pro Leu Gly Asp Leu Gln Thr Ile Thr Ser Leu Lys Phe

115 120 125

ggc aat aca aaa gta gaa acg ttc tat cca ggg aaa gga cat aca gaa

528 Gly Asn Thr Lys Val Glu Thr Phe Tyr Pro Gly Lys Gly His Thr Glu

130 135 140 145

gat aat att gtt gtt tgg ttg cca caa tat caa att tta gct gga ggc

576

Asp Asn Ile Val Val Trp Leu Pro Gln Tyr Gln Ile Leu Ala Gly Gly

150 155 160

tgt tta gta aaa tct gcg gaa gct aaa gat tta gga aat gtt gcg gat

624

Cys Leu Val Lys Ser Ala Glu Ala Lys Asp Leu Gly Asn Val Ala Asp

165 170 175

gcg tat gta aat gaa tgg tct aca tcg att gag aat gtg ctg aag cga

672

Ala Tyr Val Asn Glu Trp Ser Thr Ser Ile Glu Asn Val Leu Lys Arg

180 185 190

tat gga aat ata aat tcg gta gta cct ggt cat gga gaa gta gga gac

720

Tyr Gly Asn Ile Asn Ser Val Val Pro Gly His Gly Glu Val Gly Asp

195 200 205

aag gga tta ctt tta cat aca ttg gat tta tta aaa taa

759

Lys Gly Leu Leu Leu His Thr Leu Asp Leu Leu Lys

210 215 220

<210> 3

<211> 252

<212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 3

Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met -30 -25 -20

Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala Gln -15 -10 -5 -1 1

Ala Ser Lys Thr Glu Thr Gly Thr Ile Ser Ile Ser Gln Leu Asn Lys 5 10 15

Asn Val Trp Val His Thr Glu Leu Gly Tyr Phe Asn Gly Glu Ala Val 20 25 30

Pro Ser Asn Gly Leu Val Leu Asn Thr Ser Lys Gly Leu Val Leu Val 35 40 45

Asp Ser Ser Trp Asp Asn Lys Leu Thr Lys Glu Leu Ile Glu Met Val .50 55 60 65

Glu Lys Lys Phe Gln Lys Arg Val Thr Asp Val Ile Ile Thr His Ala 70 75 80 His Ala Asp Arg Ile Gly Gly Ile Thr Ala Leu Lys Glu Arg Gly Ile 85 90 95

Lys Ala His Ser Thr Ala Leu Thr Ala Glu Leu Ala Lys Asn Ser Gly 100 105 110

Tyr Glu Glu Pro Leu Gly Asp Leu Gln Thr Ile Thr Ser Leu Lys Phe 115 120 125

Gly Asn Thr Lys Val Glu Thr Phe Tyr Pro Gly Lys Gly His Thr Glu .130 135 140 145

Asp Asn Ile Val Val Trp Leu Pro Gln Tyr Gln Ile Leu Ala Gly Gly 150 155 160 Cys Leu Val Lys Ser Ala Glu Ala Lys Asp Leu Gly Asn Val Ala Asp 165 170 175

Ala Tyr Val Asn Glu Trp Ser Thr Ser Ile Glu Asn Val Leu Lys Arg 180 185 190

Tyr Gly Asn Ile Asn Ser Val Val Pro Gly His Gly Glu Val Gly Aap 195 200 205 Lys Gly Leu Leu Leu His Thr Leu Asp Leu Leu Lys 210 215 220

Claims

1. Proteína metalo-beta-lactamase modificada, caracterizada pelo fato de que apresenta a fórmula geral: NH2-K-T-E- △BL-COOH na qual K é Iisina T é treonina E é ácido glutâmico, e △BL é uma proteína metalo-beta-lactamase que foi truncada na extremidade do terminal de amino de maneira a deixar quarto filamentos be- ta- antes da primeira alfa-hélice da estrutura secundária predita da dita pro- teína.

2. Molécula de nucleotídeo isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína metalo-beta-lactamase como definida na reivindicação 1.

3. Molécula de nucleotídeo de acordo com a reivindicação 2, ca- racterizada pelo fato de que compreende nucleotídeos seqüenciais 94-756 de SEQ ID N0:2.

4. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que contém a molécula de nucleotídeo como definido na reivindicação 2.

5. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de ser capaz de expressar a proteína metalo-beta-lactamase codificada pela molécula de nucleotídeo como definida na reivindicação 2.

6. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5, caracteri- zada pelo fato de que secreta a dita proteína metalo-beta- lactamase.

7. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5 ou 6, ca- racterizada pelo fato de que é Bacillus spp, especialmente B. Iicheniformis ou B. subtilis.

8. Proteína metalo-beta-lactamase modificada, caracterizada pelo fato de que apresenta a fórmula geral NH2- E - △BL - COOH na qual E é ácido glutâmico, e ABL é uma proteína metalo-beta-lactamase que foi truncada na extremidade do terminal de amino de maneira a deixar quatro filamentos be- ta-antes da primeira alfa-hélice da estrutura secundária prevista da dita pro- teína.

9. Proteína metalo-beta-lactamase de acordo com a reivindica- ção 8, caracterizada pelo fato de que pertence ao subgrupo metalo-beta- Iactamases B1.

10. Proteína metalo-beta-lactamase de acordo com a reivindica- ção 9, caracterizada pelo fato de que a beta-lactamase truncada é derivada de Bacillus spp., e especialmente de B. cereus.

11. Proteína metalo-beta-lactamase de acordo com a reivindica- ção 10, caracterizada pelo fato de que E - ABL é derivado eliminando os a- minoácidos do terminal de amino onze de uma metalo-beta-lactamase ma- dura.

12. Proteína metalo-beta-lactamase de acordo com a reivindica- ção 9, caracterizada pelo fato de que a seqüência E - ABL tem pelo menos 80 % de identidade para a seqüência de resíduos de aminoácidos seqüenci- ais 6-221 de SEQ ID NO:3.

13. Proteína metalo-beta-lactamase de acordo com a reivindica- ção 9, caracterizada pelo fato de que a seqüência E - ABL é uma forma trun- cada de uma metalo-beta-lactamase que tem a seqüência descrita como SEQ ID NO:1, ou uma variante ativa de beta-lactamase ou fragmento da mesma.

14. Proteína metalo-beta-lactamase de acordo com a reivindica- ção 9, caracterizada pelo fato de que E - ABL é derivado pela truncamento de uma metalo-beta-lactamase entre os aminoácidos KN e E.

15. Método para preparar uma proteína metalo-beta-lactamase modificada, caracterizado pelo fato de que compreende fazer a cultura de uma célula hospedeira como definida na reivindicação 5 sob condições que permitem a expressão de uma metalo-beta-lactamase que apresenta a fór- mula geral: NH2-K-T-E- ΔBL-COOH, na qual K é Iisina T é treonina E é ácido glutâmico, e ΔBL é uma proteína metalo-beta-lactamase que foi truncada na extremidade do terminal de amino de maneira a deixar quatro filamentos be- ta- antes da primeira alfa-hélice da estrutura secundária prevista da dita pro- teína, e conduzir a modificação pós-traducional resultando em uma metalo- beta-lactamase modificada que apresenta a fórmula geral: NH2- E - ΔBL-COOH, na qual E e ΔBL são como definido acima, e opcionalmente isolando e purificando a proteína modificada pós- traducionalmente obtida.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pe- lo fato de que a proteína metalo-beta-lactamase é expressa em uma forma que compreende uma seqüência de sinal, de maneira que a proteína é se- cretada a partir da célula hospedeira.

17. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracteri- zado pelo fato de que a proteína é produzida em Bacillus spp. Especialmen- te em B. Iicheniformis ou S. subtilis.

18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de com- preende a proteína metalo- beta-lactamase modificada como definida na rei- vindicação 8.

19. Proteína metalo-beta-lactamase modificada de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de ser usada como um medicamen- to.

20. Uso da proteína metalo-beta-lactamase modificada como definida na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para eliminar os efeitos adversos induzidos pelo antibió- tico beta-lactama no trato intestinal.

21. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o antibiótico beta-lactama é selecionado a partir do grupo que consiste em cefalosporinas, carbapenemas e penicilinas, cujo antibiótico é para ser eliminado na presença ou ausência de um inibidor contra beta- Iactamases serina,

22. Método para tratar os efeitos adversos induzidos por antibió- tico beta-lactama no trato intestinal, caracterizado pelo fato de que compre- ende administrar uma quantidade eficaz da proteína metalo-beta-lactamase modificada como definida na reivindicação 8, ou uma composição farmacêu- tica como definida na reivindicação 18 para uma pessoa com necessidade da mesma.

23. Método para a produção de uma preparação homogênea de enzima metalo-beta-lactamase, caracterizado pelo fato de que compreende a) preparar um constructo de expressão que expressa uma pro- teína que apresenta a fórmula geral: NH2 -K-T-E- ABL-COOH, na qual K é lisina, T é treonina, E é ácido glutâmico, e ABL é uma proteína metalo- beta-lactamase que foi truncada na extremidade do terminal de amino de maneira a deixar quatro filamentos beta-antes da primeira alfa-heliz da estru- tura secundária prevista da dita proteína, b) transformar uma célula hospedeira bacteriana com o dito constructo de expressão; e c) isolar a preparação homogênea de enzima metalo-beta- lactamase produzido pela dita célula hospedeira bacteriana, em que a dita preparação homogênea de enzima metalo-beta-lactamase produzida pela dita célula hospedeira bacteriana é mais homogênea do que uma prepara- ção de metalo-beta-lactamase não-truncada sobre condições similares a partir de uma célula hospedeira transformada com um constructo de expres- são contendo um gene não-modificado que codifica a metalo-beta- lactamase.