JP2002306172A

JP2002306172A - 炭酸脱水酵素遺伝子

Info

Publication number: JP2002306172A
Application number: JP2001110283A
Authority: JP
Inventors: Yuzo Ogawa; 裕三小川; Itaru Nakagawa; 格中川; Keiji Matsumoto; 圭司松本
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2001-04-09
Filing date: 2001-04-09
Publication date: 2002-10-22

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】唾液に含まれる炭酸脱水酵素の遺伝子、及
び、当該遺伝子を用いた炭酸脱水酵素の製造方法を提供
する。【解決手段】特定のアミノ酸配列又は当該アミノ酸
配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換お
よび／もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩
基配列からなるポリヌクレオチド、または、特定の塩基
配列からなるポリヌクレオチド。上記ポリヌクレオチド
を含む、特に羊由来の、炭酸脱水酵素遺伝子。上記炭酸
脱水酵素遺伝子の発現カセットを含む組換えベクター。
上記組換えベクターによって形質転換された形質転換
体。上記形質転換体を培養し、得られる培養組成物から
炭酸脱水酵素を採取する、炭酸脱水酵素の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、唾液に含まれる炭
酸脱水酵素の遺伝子、及び、当該遺伝子を用いた炭酸脱
水酵素の製造方法に関する。詳しくは、口腔内に分泌さ
れ唾液に緩衝能力を付与する炭酸脱水酵素の遺伝子、及
び、当該遺伝子を利用した炭酸脱水酵素の製造方法に関
するものである。

【０００２】

【従来の技術】齲蝕は基本的には歯の石灰化組織を侵す
微生物による疾患であり、微生物によって産生された酸
により歯の表面の無機成分が部分的に脱灰されることで
始まり、その後、有機質マトリックス部分の分解により
進行する（細菌因子）。従って、現在主流をなすところ
の齲蝕治療・予防法はブラッシングを基本とし、抗菌
剤、酵素、抗体等を利用することにより如何に効率的に
歯垢を除去するかである。一方、食物は糖質を主原料と
しており、齲蝕発生を決定する基本要因となる（食事因
子）。また、宿主に対する固有の要因、例えば、歯質、
歯形、唾液の組成と流量等は、齲蝕罹患性と程度を決定
する（宿主要因）。このように齲蝕は多因性疾患とみな
すことができることから、最近はフッ素やハイドロキシ
アパタイトによる歯質の改善や、キシリトール等の非発
酵性代替味覚料の利用が広く行われるようになってき
た。しかしながら、上記の如く様々な検討が行われてい
るにもかかわらず、齲蝕治療・予防法・診断法は確立さ
れているとは言えないのが現状である。

【０００３】これに対し、唾液の緩衝能を向上させるこ
とにより齲蝕誘発菌の生産する酸を積極的にしかも持続
的に除去する炭酸脱水酵素を用いた齲蝕治療・予防法並
びに診断法が提案されている。炭酸脱水酵素（カーボニ
ックアンヒドラーゼ：ＥＣ４．２．１．１；ＣＡ）はＨ
^＋＋ＨＣＯ_３ ⁻＜＝＞ＣＯ_２＋Ｈ_２Ｏの反応を触媒し
（Ｍ．Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，４７，４６
５−５１３（１９７２）)、ほ乳類では６種類のアイソ
ザイムが分離精製されている。このうち、カーボニック
アンヒドラーゼVI（以下ＣＡVIと略す）は唯一の分泌型
アイソザイムであり、唾液腺と涙腺から分泌されている
(Ｓ．Ｐａｒｋｋｉｌａ，ｅｔ．ａｌ，Ｇｕｔ，３５，
６４６−６５０（１９９４）)。ＣＡVIは唾液中に比較
的多量に（全蛋白質の３％）存在し（Ｒ．Ｆｅｒｎｌｅ
ｙ，ｅｔ．ａｌ，Ａｒｃｈｓ．ＯｒａｌＢｉｏｌ．，
４０，５６７−５６９（１９９５））、更に多くのほ乳
類の種に広く認められる。従って、本酵素は生命活動に
おける基本的な役割を演じていると予測されている。

【０００４】唾液のｐＨが主に二酸化炭素−重炭酸イオ
ン緩衝系によって制御されていること、齲蝕患者又は齲
蝕経験者ではＣＡVIが減少している傾向にあること
（Ｊ．Ｋｉｖｅｌａ，ｅｔ．ａｌ，ＣａｒｉｅｓＲｅ
ｓ．，３３，１７８−１８４（１９９９））、ＣＡVIは
歯のエナメルペリクルに付着し活性を示すこと（Ｊ．Ｌ
ｅｉｎｏｎｅｎ，ｅｔ．ａｌ，ＣａｒｉｅｓＲｅ
ｓ．，３３，１８５−１９０（１９９９））から、本酵
素が唾液中、特に歯表面で齲蝕誘発菌が産生する酸を中
和し歯の脱灰化を防ぐ主成分である可能性が高いと考え
られている。

【０００５】更に最近、唾液中に存在する亜鉛メタロプ
ロテインであるガスチンとＣＡVIが同一であることが示
された（Ｂ．Ｔｈａｔｃｈｅｒ，ｅｔ．ａｌ，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２
５０，６３５−６４１（１９９８）））。ガスチンは味
覚障害患者で減少していることが知られており（Ｒ．Ｈ
ｅｎｋｉｎ，ｅｔ．ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２，４８８−４９２（１９７
５）））、ＣＡVI／ガスチンは味蕾の成長に関与してい
ると考えられている（Ｒ．Ｈｅｎｋｉｎ，ｅｔ．ａｌ，
Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，３１８，３９２−４０４
（１９９９））。

【０００６】更に、北欧のグループにより、唾液中のＣ
ＡVI量が減少すると胃の消化性潰瘍の頻度が高くなると
の報告がなされており（Ｓ．Ｐａｒｋｋｉｌａ，Ｄｉｇ
ｅｓｔｉｖｅＤｉｓｅａｓｅａｎｄＳｃｉｅｎｃ
ｅ，４２，１０１３−１０１９（１９９７））、何らか
の原因によるＣＡVI又はその活性の減少は、齲蝕のみな
らず、味覚障害や胃炎等の疾病の発症に関与しているも
のと考えられている。

【０００７】しかしながら、唾液よりＣＡVIの調製を行
うためには大量の唾液が必要となり、原料の確保が非常
に困難であった。そこで、上記齲蝕治療・予防法並びに
診断法に用いられるＣＡVIの、安価で簡便な製造方法の
開発が求められていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、ＣＡVI遺伝子の取得、及び、同遺伝子から成る遺
伝子発現カセットを形質転換した形質転換体、並びに、
得られた形質転換体を培養することにより、ＣＡVIを安
価で簡便に製造できる方法を提供するものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは様々な検討
を行った結果、羊唾液腺からＣＡVI遺伝子の一部をクロ
ーニングすることに成功した。本遺伝子を用いることに
より完全長ＣＡVI遺伝子の取得が容易に可能となり、大
腸菌等の細菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等
の、現在使用されている宿主ベクター系を利用すること
によって、ＣＡVIの安価で簡便な製造方法の提供が可能
となった。

【００１０】すなわち本発明は、配列番号２で表される
アミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１もしくは
数個のアミノ酸が欠失、置換および／もしくは付加され
たアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌク
レオチドであり、また、配列番号１で表される塩基配列
からなるポリヌクレオチドである。

【００１１】また本発明は、上記ポリヌクレオチドを含
む炭酸脱水酵素遺伝子、当該炭酸脱水酵素遺伝子の発現
カセットを含む組換えベクター、及び当該組換えベクタ
ーによって形質転換された形質転換体である。さらに本
発明は、当該形質転換体を培養し、得られる培養組成物
から炭酸脱水酵素を採取する、炭酸脱水酵素の製造方法
でもある。以下に本発明を詳述する。

【００１２】ＣＡVIの遺伝子を取得するためには以下の
ようにして実施することができる。（１）ＣＡVI遺伝子のクローニング使用する羊には特に制限がなく、解剖により唾液腺を分
離することができる。好ましくは、羊の成獣（１歳）よ
り解剖によって唾液腺を取得することができる。唾液腺
よりｍＲＮＡの抽出・精製を行うためには種々の方法を
用いることができる。酸性フェノール／グアニジンチオ
シアネート／クロロフォルム抽出によって行うＳｕｍｂ
ｒｏｃｈ等の方法（Ｊ．Ｓｕｍｂｒｏｃｈ，ｅｔａ
ｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｈｉｒｄ
Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）や、Ｐｒｏ
ｍｅｇａ社製ＴｏｔａｌＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ｓｙｓｔｅｍのような市販のキットを利用することが
できる。

【００１３】このようにして得られたＲＮＡ画分からｍ
ＲＮＡを精製する。ｍＲＮＡの精製とそれに続くｃＤＮ
Ａの作製は、オリゴｄＴセルロースをもちいた上記Ｓｕ
ｍｂｒｏｃｈ等の方法や、ＧｉｂｃｏＲＢＬ社製のＲＡ
ＣＥｓｙｓｔｅｍのような市販のキットを利用するこ
とができる。このようにしてｃＤＮＡを作製することが
できる。

【００１４】以上のようにして取得したｃＤＮＡからＣ
ＡVI遺伝子を取得するためには、種々の方法を用いるこ
とができる。ｃＤＮＡを大腸菌の発現ベクターであるプ
ラスミドベクターやファージベクターに組み込み、ｃＤ
ＮＡライブラリーを作成し、ＣＡVI抗体を用いてＣＡVI
遺伝子を有するクローンを検出することにより同遺伝子
をクローニングすることができる。

【００１５】また、ＰＣＲを利用してＣＡVI遺伝子のク
ローニングをすることもできる。現在までに羊（Ｒ．
Ｔ．Ｆｅｒｎｌｅｙ，ｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，２７，２８１５−２８２０（１９８８）、ＷＯ
８８／０４６８８）、人（Ｐ．Ａｌｄｒｅｄ，ｅｔａ
ｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，５６９−５７５
（１９９１））、牛（Ｗ．Ｊｉａｎｇ，ｅｔａｌ，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪ．，３１８，２９１−２９６
（１９９６））、マウス（Ｊ．Ｓｏｋ，ｅｔ．ａｌ，Ｍ
ｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１９，４９５−５０４
（１９９９））のＣＡVIアミノ酸配列が決定されてい
る。また、牛（Ｗ．Ｊｉａｎｇ，ｅｔａｌ，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌＪ．，３１８，２９１−２９６（１９
９６））、人（Ｐ．Ａｌｄｒｅｄ，ｅｔａｌ，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，５６９−５７５（１９９
１））、マウス（Ｊ．Ｓｏｋ，ｅｔ．ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌＢｉｏｌ．，１９，４９５−５０４（１９９
９））のＣＡVI遺伝子配列が決定されている。

【００１６】上記のようにして取得したｃＤＮＡからＣ
ＡVI遺伝子のクローニングを行うためには、羊を含むＣ
ＡVIのアミノ酸ホモロジー解析と、人、牛のＤＮＡホモ
ロジー解析を実施することにより羊ＣＡVI遺伝子の塩基
配列を予測し、この予測をもとにＰＣＲプライマーをデ
ザインすることができる。デザインされた２種類のプラ
イマーを用いてＰＣＲ法により特異的にＣＡVI遺伝子を
増幅し、本増幅断片をクローニングすることによって当
該遺伝子を取得することができる。プライマーとしては
例えば羊ＣＡVIのＮ末端から１１５番目のアルギニンか
ら１２５番目のチロシンに対応する配列番号３のプライ
マーと同２１３番目のトリプトファンから２２２番目の
ロイシンに対応する配列番号４のプライマーを利用して
ＰＣＲを行い、ＣＡVI遺伝子の一部分を増幅することが
できる。ＰＣＲの条件としては同遺伝子の増幅が行われ
れば特に制限されるものではないが、好ましくは、９４
℃ｘ１分、５５℃ｘ１分、７２℃ｘ３分のサイクルを３
０回行い、その後７２℃ｘ１０分の温度条件によって増
幅断片を取得することができる。

【００１７】このようにして得られたＣＡVI増幅断片を
大腸菌プラスミドベクターにクローニングすることがで
きる。プラスミドベクターとしてはＰＣＲ産物クローニ
ング用ベクターＮｏｖａｇｅｎ社製ｐＴ７ＢｌｕｅＴ
−Ｖｅｃｔｏｒやインビトロゲン社製ｐＣＲ２．１−Ｔ
ＯＰＯ等が利用できるが、１例としてＣＡVI増幅断片を
ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔｏｒにクローニングする
ことができる。

【００１８】このようにしてクローニングされる遺伝子
が当該ＣＡVI遺伝子であることの確認は、塩基配列決定
並びに当該遺伝子配列のアミノ酸配列解析を行い、既知
羊ＣＡVIアミノ酸配列との比較によって行うことができ
る。上記ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔｏｒにクローニ
ングされた遺伝子の塩基配列を決定すると、３２１塩基
から成る配列番号７で表される塩基配列が得られる。こ
の配列の５′側３２塩基は、プライマーとして用いた配
列番号３の塩基配列に一致する。また、３′側２８塩基
は、プライマーとして用いた配列番号４の相補配列に一
致する。この配列の３３番目から２９３番目のアミノ酸
配列を解析すると、８７アミノ酸から成る配列番号２の
アミノ酸配列が得られる。配列番号２を既知羊ＣＡVIア
ミノ酸配列（Ｒ．Ｔ．Ｆｅｒｎｌｅｙ，ｅｔａｌ，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，２８１５−２８２０
（１９８８）、ＷＯ８８／０４６８８）と比較すると、
配列番号２で表されるアミノ酸配列が羊ＣＡVIアミノ酸
配列の一部と一致することが判る。このようにして配列
番号７の３３番目から２９３番目までの配列番号１で表
される遺伝子は、羊ＣＡVI遺伝子の一部であることが判
る。

【００１９】上記ＰＣＲ法によるＣＡVI遺伝子のクロー
ニングとは別に、羊アミノ酸配列に基づいてデザインさ
れた混合プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＣＡVI遺伝
子のクローニングを行うこともできる。同アミノ酸配列
から予測される遺伝子配列をもとに混合プライマーを作
成し、ＰＣＲによって同遺伝子の増幅を行うことができ
る。混合プライマーの長さは、プライマーのマッチング
領域が長い方が特異性が増すことから長い方がよいが、
１５ヌクレオチド以上であればよい。また、混合プライ
マーを構成するプライマーの種類は少ない方が増幅効率
がよいことから、メチオニンやトリプトファンのような
対応コドンが１種類しかないものを含むようなデザイン
が好まれるが、特に制限されるものではない。ＰＣＲに
よる増幅条件は当該遺伝子断片の増幅を行うことができ
ればよく、特に制限されるものではない。

【００２０】このようにして得られたＣＡＶＩ増幅断片
を大腸菌プラスミドベクターにクローニングすることが
できる。１例としてＰＣＲ増幅断片クローニング用ベク
ターＮｏｖａｇｅｎ社製ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔ
ｏｒやｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（インビトロゲン社）等に
クローニングすることができる。クローニングされた遺
伝子が当該ＣＡVI遺伝子であることの確認は、塩基配列
決定とそれに引き続く対応アミノ酸配列解析結果と既知
羊ＣＡVIアミノ酸配列との比較によって行うことができ
る。

【００２１】このようにして取得された遺伝子がＣＡVI
の一部分である場合は、さらにこの遺伝子を利用して全
長を取得することができる。前述の羊唾液腺ｃＤＮＡラ
イブラリーに対して、ＣＡVI部分ＤＮＡをプローブに用
いてコロニーハイブリダイゼーション法やプラークハイ
ブリダイゼーション法を適用することによってＣＡVI全
遺伝子をクローニングすることができる。

【００２２】（２）ＣＡVI遺伝子発現カセットの構築並
びに形質転換体の作成ＣＡVI遺伝子の上流にプロモーター、下流にターミネー
ターを接続することによってＣＡVI発現カセットを構築
することができる。プロモーター、ターミネーターは使
用する宿主において機能すればよく、特に制限されるも
のではない。１例として大腸菌を宿主とする場合、プロ
モーターとしてラクトースオペロンのプロモーターやト
リプトファンオペロンのプロモーター等を利用すること
ができる。また、ターミネーターとしてはリボゾーム蛋
白のターミネーター等が利用できる。発現カセット構築
に用いられるベクターは大腸菌において自立増殖するプ
ラスミドであればどのようなベクターでもよい。このよ
うにして作成したＣＡVI遺伝子発現カセットを宿主に形
質転換することにより、ＣＡVI形質転換体を作製するこ
とができる。

【００２３】（３）ＣＡVIの製造本発明のＣＡVIの製造方法では、本発明の形質転換体を
培養して得られる培養物から、ＣＡVIを採取する。本発
明の形質転換体を培養することによるＣＡVIの製造は、
次のようにして行うことができる。培地は当該形質転換
体が生育できるものであればどのようなものでも良い。
また培養温度、培養時間は当該形質転換体が生育し、Ｃ
ＡVIを形質転換体内あるいは外に蓄積又は分泌する条件
であればどのような条件でも良い。培養終了後、培養液
を遠心分離や塩析、イオンクロマトグラフィー、ゲルろ
過、アフィニティクロマトグラフィー等を組み合わせて
ＣＡVIを精製することができる。

【００２４】（実施例）以下、実施例により本発明をさ
らに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施
例にその技術範囲を限定するものではない。（実施例１）ｃＤＮＡの作製生後約１年の羊より耳下腺１ｇを取り出した。耳下腺よ
りＰｒｏｍｅｇａ社製ＴｏｔａｌＲＮＡｉｓｏｌａ
ｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍを用いてｓｔａｎｄａｒｄＲ
ＮＡｇｅｎｔｓｓｙｓｔｅｍｐｒｏｔｏｃｏｌに従
ってＲＮＡ画分を調製した。得られたＲＮＡよりｃＤＮ
Ａを調製するためにＧｉｂｃｏＲＢＬ社製のＲＡＣＥｓ
ｙｓｔｅｍを用いた。同キットを用いて、オリゴｄＴセ
ルロースを利用したｍＲＮＡの精製、リボヌクレアーゼ
Ｈ処理、逆転写酵素処理を行い羊唾液腺ｃＤＮＡの調製
を行った。

【００２５】（実施例２）ＣＡVI遺伝子のクローニン
グ牛、人、マウスの各ＣＡVIｃＤＮＡ配列のホモロジー解
析を実施した。この解析結果をもとに保存領域を特定
し、さらに羊ＣＡVIのアミノ酸配列を対応させることで
配列番号３と配列番号４のプライマーを作製した。ま
た、配列番号５と配列番号６のプライマーを作製した。
配列番号３と配列番号４及び配列番号５と配列番号６の
それぞれのプライマーの組み合わせてＰＣＲによるＣＡ
VI遺伝子の増幅を行った。ＰＣＲは９４℃ｘ０．５分、
６０℃ｘ１分、７２℃ｘ２分の増幅サイクルを３５回行
った後、７２℃ｘ１０分の増幅条件にて実施した。ＰＣ
Ｒ増幅反応終了後、０．８％アガロースゲルにより増幅
断片を確認したところ、それぞれ約３２０ｂｐ、約８０
０ｂｐの増幅断片が観察された。これらの増幅断片をＮ
ｏｖａｇｅｎ社製ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔｏｒに
組み込み、形質転換体を得た。同形質転換体からアルカ
リＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、ＰＥＢ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ
ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｅｒを用いた塩基
配列決定反応を行い、ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製
ＤＮＡシークエンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７を用
いて各クローンの塩基配列を決定した。配列番号３と配
列番号４のＰＣＲプライマーを用いたクローンからは配
列番号７の遺伝子配列が得られた。しかしながら、配列
番号５と配列番号６のＰＣＲプライマーを用いたクロー
ンからはＣＡVI遺伝子に全くホモロジーを示さない遺伝
子配列が観察された。

【００２６】

【発明の効果】本発明により、羊唾液腺ＣＡVI遺伝子の
一部の取得に成功した。本遺伝子を用いることにより完
全長ＣＡVI遺伝子の取得が容易になり、大腸菌等の細
菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等の、現在使
用されている宿主ベクター系を利用することによって、
ＣＡVIの安価で簡便な製造方法の提供が可能となった。

【配列表】〈110〉鐘淵化学工業株式会社 KANEKA CORPORATION 〈120〉炭酸脱水酵素遺伝子〈130〉TKS-4451 〈160〉７〈210〉1 〈211〉261 〈212〉DNA 〈213〉Ovine 〈400〉1 aat tct aaa tac aac agc tat gag gaa gcc cag aaa gag cca gat ggt Asn Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr Glu Glu Ala Gln Lys Glu Pro Asp Gly 1 5 10 15 ttg gct gtg ctg gcg gcc ctg gtt gag gta aag gat tat act gaa aat Leu Ala Val Leu Ala Ala Leu Val Glu Val Lys Asp Tyr Thr Glu Asn 20 25 30 gct tac tac agc aaa ttc att tct cac ttg gaa gac atc cgg tat gca Ala Tyr Tyr Ser Lys Phe Ile Ser His Leu Glu Asp Ile Arg Tyr Ala 35 40 45 gga caa agc aca gtt ctg agg ggc ctt gac att gag gac atg cta cct Gly Gln Ser Thr Val Leu Arg Gly Leu Asp Ile Glu Asp Met Leu Pro 50 55 60 ggg gac ctc cgc tac tac tac agc tac ttg ggg tca ctc acc act cct Gly Asp Leu Arg Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Leu Gly Ser Leu Thr Thr Pro 65 70 75 80 ccc tgt aca gaa aac gtc cac Pro Cys Thr Glu Asn Val His 85 〈210〉2 〈211〉87 〈212〉PRT 〈213〉Ovine 〈400〉 2 Asn Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr Glu Glu Ala Gln Lys Glu Pro Asp Gly 1 5 10 15 Leu Ala Val Leu Ala Ala Leu Val Glu Val Lys Asp Tyr Thr Glu Asn 20 25 30 Ala Tyr Tyr Ser Lys Phe Ile Ser His Leu Glu Asp Ile Arg Tyr Ala 35 40 45 Gly Gln Ser Thr Val Leu Arg Gly Leu Asp Ile Glu Asp Met Leu Pro 50 55 60 Gly Asp Leu Arg Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Leu Gly Ser Leu Thr Thr Pro 65 70 75 80 Pro Cys Thr Glu Asn Val His 85 〈210〉3 〈211〉32 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈220〉〈223〉Primer 〈400〉3 gatacataat tgagattcac gtcgtccact ac 〈210〉4 〈211〉28 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈220〉〈223〉Primer 〈400〉4 gcttgacagt atctgctacc acaaacca 〈210〉5 〈211〉22 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈220〉〈223〉Primer 〈400〉5 gggtgctgga tgaaaaacac tg 〈210〉6 〈211〉25 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈220〉〈223〉Primer 〈400〉6 tgttgtttag ataaaagtgg agctt 〈210〉7 〈211〉321 〈212〉DNA 〈213〉Artificial 〈220〉〈221〉CDS 〈222〉(33)...(293) 〈400〉7 gatacataat tgagattcac gtcgtccact ac aat tct aaa tac aac agc tat gag gaa gcc cag aaa gag cca gat ggt Asn Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr Glu Glu Ala Gln Lys Glu Pro Asp Gly 1 5 10 15 ttg gct gtg ctg gcg gcc ctg gtt gag gta aag gat tat act gaa aat Leu Ala Val Leu Ala Ala Leu Val Glu Val Lys Asp Tyr Thr Glu Asn 20 25 30 gct tac tac agc aaa ttc att tct cac ttg gaa gac atc cgg tat gca Ala Tyr Tyr Ser Lys Phe Ile Ser His Leu Glu Asp Ile Arg Tyr Ala 35 40 45 gga caa agc aca gtt ctg agg ggc ctt gac att gag gac atg cta cct Gly Gln Ser Thr Val Leu Arg Gly Leu Asp Ile Glu Asp Met Leu Pro 50 55 60 ggg gac ctc cgc tac tac tac agc tac ttg ggg tca ctc acc act cct Gly Asp Leu Arg Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Leu Gly Ser Leu Thr Thr Pro 65 70 75 80 ccc tgt aca gaa aac gtc cac tggtttg tggtagcaga tactgtcaag c Pro Cys Thr Glu Asn Val His 85

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＦターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA11 BA07 CA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD11 EE10 LL01 LL03 4B065 AA26X AA72X AA88X AA90X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA27 CA44 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号２で表されるアミノ酸配列又は
当該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が
欠失、置換および／もしくは付加されたアミノ酸配列を
コードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】配列番号１で表される塩基配列からなる
ポリヌクレオチド。
【請求項３】請求項１又は２記載のポリヌクレオチド
を含む炭酸脱水酵素遺伝子。
【請求項４】羊由来の請求項３記載の炭酸脱水酵素遺
伝子。
【請求項５】請求項３又は４記載の炭酸脱水酵素遺伝
子の発現カセットを含む組換えベクター。
【請求項６】請求項５記載の組換えベクターによって
形質転換された形質転換体。
【請求項７】請求項６記載の形質転換体を培養し、得
られる培養組成物から炭酸脱水酵素を採取することを特
徴とする、炭酸脱水酵素の製造方法。