BR112012030029B1 - Beta-lactamases modificadas, métodos, polinucleotídeo e composições relacionadas - Google Patents

Abstract

beta-lactamases modificadas e métodos e usos relacionados a elas a presente invenção refere-se aos produtos farmacêuticos e ás beta-lactamases modificadas. especificamente, a invenção refere-se a novas beta-lactamases recombinantes e composições farmacêuticas compreendendo as beta-lactamases. da mesma forma, a presente invenção refere-se aos métodos para modificar uma beta-lactamase, produzir a beta-lactamase e tratar ou prevenir efeitos adversos induzidos pelo antibiótico beta-lactâmico. além disso, a presente invenção refere-se à beta-lactamase para uso como medicamento e ao uso da beta-lactamase na fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir os efeitos adversos induzidos pelo antibióticos beta-lactâmicos. ainda adicionalmente, a invenção refere-se a um polinucleotídeo e a uma célula hospedeira que compreende o polinucleotídeo.

Description

Campo da invenção

A presente invenção refere-se aos produtos farmacêuticos e às beta-lactamases modificadas. Especificamente, a invenção refere-se a novas beta-lactamases recombinantes e composições farmacêuticas compreendendo as beta-lactamases.

Da mesma forma, a presente invenção refere-se aos métodos para modificar uma beta-lactamase, produzir a beta-lactamase e tratar ou prevenir efeitos adversos induzidos pelo antibiótico beta-lactâmico. Além disso, a presente invenção refere-se à beta-lactamase para uso como medicamento e ao uso da beta-lactamase na fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir os efeitos adversos induzidos pelos antibióticos beta-lactâmicos.

Ainda adicionalmente, a invenção refere-se a um polinucleotídeo e a uma célula hospedeira que compreende o polinucleotídeo.

Antecedentes da invenção

Os antibióticos beta-lactâmicos são caracterizados por um anel beta-lactâmico em suas estruturas moleculares. A integridade do anel beta-lactâmico é essencial para a atividade biológica, o que resulta na inativação de um conjunto de transpeptidases que catalisam as reações de reticulações finais da síntese de peptidoglicanos. Membros dos antibióticos beta-lactâmicos compreendem penicilinas, cefalosporinas, clavamas (ou oxapenamas), cefamicinas e carbapenemas.

Beta-lactamases são enzimas defensivas bacterianas que hidrolisam os antibióticos beta-lactâmicos. A produção de beta-lactamases é um mecanismo predominante para conferir resistência a beta-lactâmicos em bactérias Gram-negativas. Beta-lactamases catalisam muito eficientemente a hidrólise irreversível da ligação amida do anel beta-lactâmico, resultando em produto(s) biologicamente inativo(s).

Devido à diversidade das características enzimáticas de tipos de beta-lactamase diferentes, vários sistemas de classificação foram propostos para a sua classificação. As classificações baseiam-se em duas abordagens principais, que são as classificações funcional e molecular.

O esquema de classificação funcional das beta-lactamases proposto por Bush et al., (1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39:1211-1233) define quatro grupos de beta-lactamase, que baseiam-se em seus perfis de substrato e de inibidor. O grupo 1 consiste em cefalosporinases que não são bem inibidas pelo ácido clavulânico. O grupo 2 consiste de penicilinases, cefalosporinases e beta-lactamases de amplo espectro, que são geralmente inibidos pelos inibidores da beta-lactamase direcionados a sítio ativo. O grupo 3 consiste em metalo-beta-lactamases que hidrolisam penicilinas, cefalosporinas e carbapenemas e que mal são fracamente inibidas por quase todas as moléculas que contêm beta-lactama. O grupo 4 consiste em penicilinases que não são bem inibidas pelo ácido clavulânico. Os subgrupos também foram definidos de acordo com as taxas de hidrólise de carbenicilina ou cloxacilina (oxacilina) pelas penicilinases do grupo 2.

A classificação mais amplamente utilizada é a classificação de Ambler, que divide as beta-lactamases em quatro classes (A, B, C, D) e baseia-se em suas sequências de aminoácidos (Ambler 1980, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 289:321 -331). As classes A, C e D reúnem grupos evolutivamente distintos de enzimas serina beta-lactamases, e a classe B as enzimas beta-lactamase dependentes de zinco (inibidas por EDTA) (Ambler R. P. et al, 1991 , Biochem J. 276:269-270). As classes A, C e D pertencem às serina beta-lactamases, em que a hidrólise da beta-lactama é mediada por serina em um sítio ativo. Serinas beta-lactamases estão relacionadas com as DD peptidases (D-alanil-D-alanina carboxipeptidase), a enzima alvo das beta-lactamas. Acredita-se que o mecanismo pelo qual as serina beta-lactamases hidrolisam os antibióticos beta-lactâmicos siga uma via de três etapas, incluindo um complexo de Henri-Michaelis não covalente, um intermediário acil-enzima covalente e a desacilação (Matagne et al., 1998, Biochem J 330:581-598). O mecanismo da acilação é considerado como sendo um mecanismo comum para todos os grupos de serina beta-lactamase, enquanto que, com base em cálculos teóricos, os mecanismos de desacilação de substrato da serina beta-lactamase das classes A, C e D parecem ser diferentes entre si. Os mecanismos de desacilação têm processos elementares específicos dos grupos e comuns (Hata M et al., 2006, Biol Pharm Bull. 29: 2151 -2159).

Serina beta-lactamases de Bacillus spp. e as famílias TEM-1, SHV-1 e CTX-M foram primariamente classificadas como beta-lactamases de classe A e como penicilinases que possuem boa capacidade de hidrolisar, por exemplo, a penicilina e ampicilina. As beta-lactamases de classe A foram primeiramente identificadas em St. aureus resistente à penicilina na década de 1940. Um gene de resistência à penicilina oriundo de plasmídeo, TEM-1, foi descoberto em E. coli 20 anos mais tarde. Posteriormente, também foi demonstrado que a serina beta-lactamases desenvolvem a capacidade de hidrolisar a maioria das cefalosporinas e, além disso, se especializam na hidrólise de um subconjunto específico de cefalosporinas. A maioria destas beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) são derivadas das enzimas TEM-1, TEM-2 ou SHV-1. Recentemente, há números cada vez maiores de relatórios que descrevem o vasto surgimento de enzimas CTX-M, um novo grupo de ESBLs de classe A. Hoje em dia, as enzimas CTX-M são as ESBLs mais frequentemente observadas e são subclassificadas em cinco grandes famílias principais. As enzimas CTX-M têm uma ampla gama de substratos, incluindo a penicilina e as cefalosporinas de primeira, segunda e terceira geração (Bonnet, R. 2004. Antimicrob Agents Chemother. 48:1-14).

Embora a similaridade de sequência entre as beta-lactamases de classe A (TEM, SHV, CTX-M, Bacillus spp.) seja moderada, as estruturas cristalinas de todas as serina beta-lactamases apresentam uma similaridade particularmente elevada (Matagne et al., 1998, Biochem J 330:581 -598; Tranier S. et al., 2000, J Biol Chem, 275: 28075-28082; Santillana E. et al., 2007, Proc Natl Acad Sci. U S A, 104: 5354-5359). As enzimas são compostas por dois domínios. Um domínio consiste em uma folha beta de cinco fitas empacotada contra três alfas-hélices, enquanto que o segundo domínio, um domínio alfa, é composto por oito alfa-hélices. O bolso do sítio ativo é a parte da interface entre estes dois domínios e é limitada pela alça ômega. A alça ômega é um elemento estrutural conservado de todas as beta-lactamases da classe A e está essencialmente envolvido na reação catalítica (Figura 1).

Vários sequências peptídicas (elementos) conservados relacionados com a catálise ou o reconhecimento do substrato foram identificadas nas beta-lactamases de classe A. O primeiro elemento conservado 70-Ser-X-X-Lys-73 (classificação de Ambler) inclui o resíduo de serina ativo no local 70 alfa-helice2 e lisina na posição 73. O segundo elemento conservado é uma alça SXN em um domínio alfa (nas posições entre 130 e 132 de acordo com a classificação de Ambler), onde ele forma um lado de uma cavidade catalítica. O terceiro elemento conservado (nas posições entre 234 e 236 de acordo com a classificação de Ambler) está na fita mais interna da folha beta3 e forma o outro lado da cavidade catalítica. O terceiro elemento conservado é geralmente KTG. No entanto, em alguns casos excepcionais, a lisina (K) pode ser substituída por histidina (H) ou arginina (R), e em várias beta-lactamases, treonina (T) pode ser substituída por serina (S) (Matagne et al., 1998. Biochem J 330:581-598).

A resistência mediada por beta-lactamase aos beta-lactâmicos é amplamente difundida entre a microbiota patogênica e comensal, por causa do uso abundante de beta-lactâmicos nas últimas décadas. De fato, a resistência aos antibióticos é um problema clínico bem conhecido em seres humanos e na medicina veterinária, e centenas de diferentes beta-lactamases derivadas de bactérias gram-positivas e gram-negativas foram purificadas e caracterizadas na literatura científica. Devido ao fato de o uso de antimicrobianos não ter reduziu e, além disso, a resistência aos antimicrobianos ter se tornado parte do cotidiano, novas abordagens são invariavelmente e urgentemente necessárias para resolver esses problemas médicos.

A microbiota intestinal de seres humanos é uma complexa comunidade bacteriana que desempenha um papel importante na saúde humana, por exemplo, pela estimulação do sistema de resposta imune, auxiliando na digestão de alimentos e prevenindo o crescimento excessivo de bactérias potencialmente patogênicas. Agentes antimicrobianos, por exemplo, beta-lactâmicos são conhecidos por ter efeito sobre a microbiota normal. A eficácia dos agentes antimicrobianos para promover alterações da microbiota intestinal normal está associada a vários fatores, incluindo a dosagem do fármaco, a via de administração e a farmacocinética/dinâmica e as propriedades dos antibióticos (Sullivan A. et al., 2001, Lancet 1: 101-114). Embora a microbiota intestinal tenha uma tendência de voltar ao normal após o término do tratamento com antibiótico, a persistência em longo prazo de bactérias comensais resistentes selecionadas foi relatada (Sjolund M. et al., 2003, Ann Intern Med. 139:483-487). Tal persistência e a troca de genes de resistência aos antibióticos fazem a microbiota comensal um reservatório putativo de genes de resistência aos antibióticos.

Certos beta-lactâmicos parenteralmente administrados, como ampicilina, ceftriaxona, cefoperazona e piperacilina são eliminados em parte através de excreção biliar na parte proximal do intestino delgado (duodeno). Beta-lactamas não absorvidas residuais no trato intestinal podem causar um efeito indesejável sobre o equilíbrio ecológico da microbiota intestinal normal, resultando em diarreia associada a antibiótico, crescimento demasiado de bactérias patogênicas, como enterococos resistentes à vancomicina (VRE), bacilos gram-negativos produtores de beta-lactamase de espectro ampliado (ESBL), Clostridium difficile e fungos, e a seleção de cepas resistentes a antibióticos entre a microbiota intestinal normal e bactérias potencialmente patogênicas.

A finalidade terapêutica das beta-lactamases é inativar os antibióticos não absorvidos no trato gastrintestinal (GIT), mantendo deste modo uma microbiota intestinal normal e impedindo o seu crescimento excessivo com microrganismos potencialmente patogénicos (WO 93/13795).

Há pelo menos três requisitos para os produtos de fármaco de beta-lactamase, que são adequados para a terapia direcionada ao GIT. O primeiro requisito é preservar a atividade enzimática sob as condições prevalecentes no GIT. A resistência contra a quebra proteolítica por várias proteases secretadas por várias glândulas no GIT é uma pré-condição quintessencial para a viabilidade da terapia de beta-lactamase. Outra consideração importante é a faixa de valores de pH prevalecentes nos diferentes compartimentos do intestino delgado. Estes valores de pH normalmente variam entre 5 (duodeno) e 7,5 (íleo). Portanto, a fim de qualificar-se como candidatos para a finalidade terapêutica tencionada, uma beta-lactamase precisa apresentar alta atividade enzimática na faixa de pH de 5 a 7,5.

O segundo requisito de uma beta-lactamase ou um produto da mesma é hidrolisar a beta-lactama eficientemente. A concentração de um antibiótico beta-lactâmico no quimo do intestino delgado durante um episódio de tratamento com antibiótico está relacionada principalmente com a eliminação da beta-lactama particular através de excreção biliar. Uma beta-lactamase adequada precisa ter parâmetros cinéticos que lhe permitam hidrolisar efetivamente as concentrações de beta-lactama do GIT inferior abaixo dos níveis que causam alterações na microbiota intestinal. O conjunto ideal de parâmetros cinéticos consiste em um valor numérico baixo para o Km da constante de Michaelis, combinado com um valor numericamente alto para a taxa reacional máxima Vmax. Um alto valor de Vmax é necessário para fornecer um grau suficiente de capacidade de quebra, enquanto que um valor de KM baixo é necessário para assegurar a atividade de degradação da beta-lactama em baixas concentrações de substrato.

O terceiro requisito de uma beta-lactamase ou um produto da mesma é tolerar as condições, tais como temperaturas relativamente elevadas, na fabricação de composições farmacêuticas. Além disso, no processo de produção, a dispersão de mistura dos excipientes aquosos e do fármaco requer um alto grau de solubilidade em pH adequado.

Uma terapia enzimática, chamada Ipsat P1A, está sendo desenvolvida para a prevenção dos efeitos adversos dos antibióticos e-lactâmicos dentro do intestino. O sistema de administração Ipsat P1A foi concebido para inativar beta-lactamas do grupo da penicilina administradas por via parenteral (por exemplo, penicilina, amoxicilina, ampicilina e piperacilina) com ou sem inibidores da beta-lactamase (por exemplo, tazobactam, sulbactam, ácido clavulânico) excretados através do sistema biliar (WO 2008065247; Tarkkanen, A.M. et al., 2009, Antimicrob Agents Chemother. 53:2455-2462). A enzima P1A é uma forma recombinante da exo beta-lactamase pequena 749/C de Bacillus licheniformis (WO 2008065247) que pertence à classe A e é agrupada ao subgrupo 2a na classificação funcional. A beta-lactamase de B. licheniformis e seu derivado de P1A são consideradas como penicilinases que têm alta capacidade hidrolítica para degradar, por exemplo, penicilina, ampicilina, amoxicilina ou piperacilina (Tabela 1) e eles geralmente são inibidos por inibidores da beta-lactamase direcionados a sítio ativo, como o ácido clavulânico, sulbactam ou tazobactam (Bush K. et al., 1995, Antimicrob Agents Chemother 39: 1211-1233).

No entanto, a enzima P1A tem apenas uma capacidade muito limitada para inativar antibióticos beta-lactâmicos que pertencem ao grupo da cefalosporina ou carbapenem. Uma vez que as beta-lactamases utilizadas possuem fraca atividade para as cefalosporinas, elas não podem ser aplicadas em conjunto com a terapia de cefalosporina parenteral para a inativação de beta-lactama não absorvida no trato do intestino delgado.

Portanto, novas beta-lactamases ou derivados de P1A com perfil de substrato ampliado, por exemplo, conforme observado em metalo-beta-lactamases, são indispensáveis.

A presente invenção fornece novos derivados geneticamente adaptados de beta-lactamases P1A e, além disso, novos métodos para modificar e produzir as beta-lactamases.

Breve descrição da invenção

Os novos derivados recombinantes da beta-lactamase P1A da invenção atendem aos três requisitos acima mencionados de beta-lactamases adequadas (ou seja, eles têm capacidade para preservar a atividade enzimática, hidrolisar as beta-lactamas eficientemente e tolerar as condições na fabricação das composições farmacêuticas) e, além disso, eles têm perfis de substrato ampliados. As beta-lactamases da invenção pode também ser utilizadas em conjunto com terapia de cefalosporina parenteral para inativar a beta-lactama eliminada pela bile no trato do intestino delgado.

A presente invenção destaca os estudos pré-clínicos e preliminares de uma nova proteína farmacêutica Ipsat P3A (um derivado D276N substituído de P1A) e apresenta uma dose de substância de fármaco única.

A presente invenção permite métodos rápidos e eficientes para modificar as beta-lactamases e para produzi-las. Além disso, pela presente invenção, tratamentos mais eficazes e específicos são disponibilizados.

As enzimas da invenção são adequadas para a fabricação em grande escala para uma substância de fármaco para tratar ou prevenir efeitos adversos induzidos por vários grupos de antibióticos beta-lactâmicos.

O objeto da presente invenção é fornecer novas beta-lactamases, especialmente beta-lactamases de B. licheniformis, e fornecer produtos, métodos e usos relacionados com as beta-lactamases. Ferramentas para desenvolvimentos adicionais nas indústrias farmacêuticas também são apresentados pela invenção.

A presente invenção refere-se a uma beta-lactamase que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 e tendo um resíduo de aminoácido hidrofílico em uma posição da SEQ ID NO: 1 correspondendo à posição 276, de acordo com a classificação de Ambler, ou uma variante ou fragmento do mesmo.

A invenção refere-se também a uma composição farmacêutica que compreende a beta-lactamase da invenção.

A invenção refere-se também a um método de modificação de uma beta-lactamase que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, em que um aminoácido da beta-lactamase em uma posição da SEQ ID NO: 1 correspondendo à posição 276 de acordo com a classificação de Ambler é substituído com um aminoácido hidrofílico.

Além disso, a invenção refere-se a um método de produção de beta-lactamase, em que o método compreende as seguintes etapas: i) fornecer um gene que codifica a beta-lactamase da invenção; ii) transformar uma célula hospedeira com o gene; iii) obter uma célula hospedeira que produz a beta-lactamase; iv) recuperar a beta-lactamase.

Além disso, a invenção refere-se a um método de tratamento ou prevenção de efeitos adversos induzidos pelo antibiótico beta-lactâmico no trato gastrintestinal pela administração da beta-lactamase da invenção simultaneamente ou sequencialmente com um antibiótico beta-lactâmico a um indivíduo.

Ainda adicionalmente, a presente invenção refere-se à beta-lactamase para uso como um medicamento.

Ainda adicionalmente, a presente invenção refere-se a um uso da beta-lactamase na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de efeitos adversos induzidos por antibióticos beta-lactâmicos no trato gastrintestinal.

Ainda adicionalmente, a invenção refere-se a um polinucleotídeo, que compreende uma sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2 ou 4, ou um degenerado da mesma, ou ele codifica a beta-lactamase da invenção. A invenção refere-se também a uma célula hospedeira que compreende o polinucleotídeo.

Breve descrição das figuras

A figura 1 mostra a estrutura 3D da beta-lactamase de Bacillus licheniformis (forma exo pequena de PenP). Os resíduos de aminoácidos conservados e os resíduos das cadeias laterais de R-244 e D-278 estão marcados. O diagrama foi gerado utilizando o programa MolSof-Browser.

A figura 2 mostra o nucleotídeo e as sequências de aminoácidos deduzidas do gene da beta-lactamase D276N de Bacillus licheniformis (derivado de P1A). A sequência de aminoácidos corresponde à sequência da SEQ ID NO: 3, em que Xaa é asparagina (Asn). A sequência de nucleotídeos corresponde à sequência da SEQ ID NO: 4, em que o triplete de nucleotídeo nnn é aat. O quadro de leitura aberto codifica um polipeptídeo de 299 aminoácidos que possui uma sequência de sinal de 31 aminoácidos de comprimento (sublinhada) do gene amyQ derivado do vetor de secreção pKTH141 (WO 2008/065247). O sítio de clivagem do sinal peptidase previsto é após a alanina (A) na posição -1. O sítio de clonagem HindIII que codifica uma extensão de NH2-QAS é expresso em negrito. A enzima mutante D276N madura inicia a partir da glutamina (Q) em uma posição +1. Assim, a beta-lactamase mutante D276N madura compreende 268 resíduos de aminoácidos, incluindo a extensão NH2-QAS codificada por HindIII. Uma substituição de aminoácido única do ácido aspártico (D) para asparagina (N) está localizada na posição 280 (expressa como um caractere em negrito) correspondendo à posição 276 no sistema de classificação de Ambler e correspondendo à posição do aminoácido 249 na sequência SEQ ID NO: 3.

A sequência NH2-terminal da enzima mutante D276N purificada foi determinada pela degradação de Edman automatizada em um sequenciador de proteína. A análise demonstrou que a enzima mutante D276N não tem o pentapeptídeo NH2-QASKT no seu terminal amino deduzido de forma semelhante à da enzima p1A de origem (WO 2008/065247). A fração principal da enzima mutante D276N purificada, que foi utilizada nos exemplos 4 e 6 deste pedido, inicia a partir do ácido glutâmico na posição +6 e é composta de 263 resíduos de aminoácidos com uma massa molecular de 29 272.

A figura 3 mostra o nucleotídeo e as sequências de aminoácidos deduzidas do gene da beta-lactamase substituído D276N de P1A derivado de Bacillus licheniformis. A sequência de aminoácidos corresponde à sequência da SEQ ID NO: 3, em que Xaa é arginina (Arg). A sequência de nucleotídeos corresponde à sequência da SEQ ID NO: 4, em que o triplete de nucleotídeo nnn é cgc.

A figura 4 mostra o efeito de péletes de beta-lactamase substituídos D276N (P3A) revestidos entericamente e oralmente administrados sobre as concentrações de ceftriaxona no quimo jejunal de cães beagle (n = 5) após a administração intravenosa de ceftriaxona (30 mg de ceftriaxona por Kg de peso corporal) (quadrados fechados). Os péletes de beta-lactamase foram recebidos 10 minutos antes da injeção de ceftriaxona. Os diamantes fechados representam as concentrações de ceftriaxona jejunal alcançada após uma dose única de ceftriaxona (i.v.) sem tratamento de beta-lactamase.

Descrição detalhada da invenção

Beta-lactamases foram usadas na inativação de beta-lactamas não absorvidas no trato gastrintestinal a fim de prevenir os efeitos adversos induzidos pela beta-lactama, incluindo alterações na microbiota normal intestinal e o crescimento excessivo de bactérias resistentes a beta-lactama (WO 9313795, WO 2008065247, WO 2007147945. A presente invenção agora fornece uma beta-lactamase modificada de Bacillus licheniformis, que apresenta um perfil de substrato alterado surpreendente.

Conforme usado neste documento, uma beta-lactamase refere-se a uma enzima que hidrolisa beta-lactamas. A hidrólise da ligação amida do anel beta-lactama torna os agentes antimicrobianos biologicamente inativos. Conforme usado neste documento, as beta-lactamases de classe A (classificação de Ambler) referem-se às serina beta-lactamases, em que a hidrólise da beta-lactama é mediada pela serina no sítio ativo, normalmente na posição de aminoácido 70 na alfa-hélice2. As beta-lactamases de classe A incluem, mas não se limitam, a Len-1, SHV-1, TEM-1, PSE-3/PSE-3, ROB-1, Bacillus cereus como 5/B tipo 1, 569/H tipo 1 e 569/H tipo 3, Bacillus anthrasis sp, Bacillus licheniformis como PenP, Bacillus weihenstephanensis, Bacillus clausii, Staphylococcus aureus, PC1, Sme-1, NmcA, e beta-lactamases tipo IMI, PER, VEB, GES, KPC, CME e CTX-M.

Identidade de sequência dos peptídeos e polinucleotídeos

As sequências de aminoácido do mutante beta-lactamase da presente invenção (D276X, derivado de P1A) estão estabelecidas como a SEQ ID NO: 1 e a SEQ ID NO: 3. As sequências de nucleotídeos correspondentes estão estabelecidas como SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4. A SEQ ID NO: 1 estabelece a sequência de aminoácidos que participa na formação da estrutura secundária da beta-lactamase. A SEQ ID NO: 3 estabelece a sequência de aminoácidos de comprimento total da proteína, incluindo a sequência de sinal com 31 aminoácidos de comprimento.

Uma beta-lactamase da invenção pode compreender uma sequência de aminoácidos, tendo pelo menos 30, 35, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 99,5, 99,8, 99,9 ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou 3.

De acordo com uma modalidade específica da invenção, o peptídeo tem pelo menos 30, 35, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,8, 99,9 ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou 3.

Em uma modalidade preferencial da invenção, a beta-lactamase da invenção compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade preferencial da invenção, a beta-lactamase tem pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 3.

Em uma modalidade da invenção, a beta-lactamase que compreende uma sequência de aminoácidos que tem qualquer identidade de sequência acima mencionada com a SEQ ID NO: 1 possui um aminoácido hidrofílico selecionado a partir de um grupo consistindo em arginina (R), histidina (H), lisina (K), asparagina (N), glutamina (Q), serina (S) e treonina (T) em uma posição da SEQ ID NO: 1 correspondendo à posição 276 de acordo com a classificação de Ambler.

Em uma modalidade preferencial da invenção, o peptídeo tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1 ou 3. Em uma modalidade da invenção, a beta-lactamase tem a sequência como mostrada na SEQ ID NO: 1 ou 3, em que um resíduo de aminoácido hidrofílico na posição correspondente à posição 276 de acordo com a classificação de Ambler (marcado como Xaa na SEQ ID NO: 1 ou 3) é uma arginina (R, Arg). Em outra modalidade da invenção, a beta-lactamase tem a sequência como mostrada na SEQ ID NO: 1 ou 3, em que um resíduo de aminoácido hidrofílico na posição correspondente à posição 276 de acordo com a classificação de Ambler (marcado como Xaa na SEQ ID NO: 1 ou 3) é uma asparagina (N, Asn).

A identidade de qualquer sequência com a sequência desta invenção refere-se à identidade com toda a sequência da presente invenção. A identidade de sequência pode ser determinada por qualquer método de bioinformática convencional, por exemplo, usando BLAST (Ferramentas de Busca de Alinhamento Local Básicas) ou FASTA (FAST-AII).

A presente invenção refere-se também a quaisquer variantes ou fragmentos das novas beta-lactamases. Conforme usado neste documento, um fragmento ou variante da beta-lactamase refere-se a qualquer parte ou variante, que tem uma função biológica, ou seja, que é enzimaticamente ativo. Uma variante refere-se a um peptídeo que tem pequenas alterações na sequência peptídica, por exemplo, mutações, pequenas eliminações ou inserções. Os fragmentos e variantes devem incluir o aminoácido hidrofílico na posição correspondente à posição 276 de acordo com a classificação de Ambler. O aminoácido hidrofílicos é tipicamente diferente de ácido aspártico (D).

Existem várias formas curtas de beta-lactamases, que são obteníveis da SEQ ID NO: 3 e que são secretadas fora da célula. Estas são chamadas de exoformas. As exoformas são o resultado da atividade hidrolítica de proteases na parede celular ou no meio de cultura. D276X, D276N, D276R, a forma mutante, o derivado P1A ou P3A, conforme usado neste documento, engloba qualquer fragmento ativo de beta-lactamase e/ou variante da SEQ ID NO: 3 ou variante que compreende a sequência de aminoácidos explicitamente determinada (SEQ ID NO: 1). Especialmente, a beta-lactamase da invenção é uma forma NH2-truncada, que significa que ela foi truncada no terminal amino. Além do truncamento-NH2, ele pode incluir uma ou mais eliminações, substituições e/ou inserções de aminoácidos, contanto que tenha atividade beta-lactamase. As ditas modificações podem ser variações de ocorrência natural ou mutantes, ou modificações artificiais introduzidas, por exemplo, por tecnologia gênica.

Exoformas aminoterminalmente truncadas de modo diferente foram encontradas no meio de crescimento de B. licheniformis. Tais exoformas também são englobadas neste documento. Matagne et al. descreveram várias extensões de micro-heterogeneidade nas formas extracelulares produzidas pelo hospedeiro natural B. licheniformis 749/C (Matagne A. et al., 1991. Biochem J. 273: 503-510). As cinco exoformas secretadas diferentes a seguir com diferentes resíduos de aminoácidos N-terminais foram identificadas: SQPAEKNEKTEMKDD KALNMNGK EKTEMKDD KALNMNGK KTEMKDD KALNMNGK EMKDD KALXMNGK MKDD KALNMNGK

Os resíduos de aminoácidos iniciais são apresentados em negrito. Os resíduos de aminoácidos C-terminais são indicados na direita. A exoforma iniciando em serina (S) é chamada de "forma secretada grande" da beta-lactamase de B. licheniformis, e a que inicia a partir da lisina (K) é chamada de "forma secretada pequena".

A primeira alfa-hélice (ai-hélice) inicia a partir do ácido aspártico (D) (apresentado em itálico) e o final da última alfa-hélice (aii-hélice) termina na asparagina (N) (apresentada em itálico). De acordo com uma modalidade da invenção, a beta-lactamase compreende pelo menos os aminoácidos i-258 da SEQ ID NO: i ou os aminoácidos 7-264 da SEQ ID NO: 3, que fazem parte da estrutura secundária da proteína (Knox J. R. et al., i99i. J. Mol Biol. 220: 435-455).

De acordo com outra modalidade da invenção, um ou mais dos ditos aminoácidos i-258 da SEQ ID NO: i ou os aminoácidos 7-264 da SEQ ID NO: 3 foram eliminados ou substituídos.

De acordo com ainda outra modalidade da invenção, o aminoterminal da beta-lactamase começa com NH2-KTEMKDD (aminoácidos 4-i0 da SEQ ID NO: 3). Esta exoforma chamada de ES-betaL pode ainda não ter até 2i resíduos contíguos, conforme descrito por Gebhard et al. (Gebhard L.G. et al., 2006, J. Mol. Biol. 2i: 358(i)280-288). De acordo com outra modalidade da invenção, o aminoterminal começa com ácido glutâmico (E) da SEQ ID NO: 3 e ele, especialmente, começa com NH2-EMKDD (aminoácidos 6-i0 da SEQ ID NO: 3), ou alternativamente ele começa com NH2-MKDD (aminoácidos 7-i0 da SEQ ID NO: 3 ou aminoácidos i-4 da SEQ ID NO: i).

A região variável na sequência aminoterminal da beta-lactamase não tem estrutura rígida que represente a constância de parâmetros enzimáticos de várias formas de beta-lactamase.

Os quatro últimos aminoácidos na extremidade carboxílica da beta-lactamase, MNGK-COOH (aminoácidos 265-268 da SEQ ID NO: 3), não são parte da estrutura secundária e, portanto, também podem ser eliminados sem perder a atividade. Em outra modalidade, até nove aminoácidos C-terminais podem ser eliminados. As formas C-truncadas da proteína foram descritas por Santos et al. (Santos J. et al., 2004. Biochemistry 43:1715-1723).

Todas as diferentes formas de beta-lactamase acima definidas são englobadas pela presente invenção, juntamente com outras formas de proteína com atividade de beta-lactamase.

Um polinucleotídeo da invenção pode compreender ou ter uma sequência de qualquer uma da SEQ ID NO: 2 ou 4, ou um degenerado da mesma. Um polinucleotídeo que é um degenerado de uma sequência mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2 ou 4 refere-se a um polinucleotídeo que tem um ou mais nucleotídeos diferentes em comparação com as SEQ ID NOs: 2 ou 4, mas que codifica o mesmo aminoácido. Preferencialmente, o nucleotídeo triplete nnn da SEQ ID NO: 2 ou 4 codifica um aminoácido hidrofílico, mais preferencialmente N ou R. Um "polinucleotídeo", como usado neste documento, é uma sequência dos nucleotídeos, como uma sequência de DNA ou RNA, e pode ser um ácido polinucleico de fita simples ou dupla. O termo polinucleotídeo engloba o cDNA, mRNA e o DNA genômico.

De acordo com uma modalidade específica da invenção, o polinucleotídeo tem pelo menos 30, 35, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,8 ou 99,9% de identidade com qualquer uma das sequências de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 2 ou 4, ou fragmentos das mesmas.

Em uma modalidade específica da invenção, o polinucleotídeo tem uma sequência mostrada em qualquer uma das sequências SEQ ID NO: 2 ou 4.

Aminoácidos na posição 276 (Ambler) das beta-lactamases de classe A

Asparagina (Asn, N), na posição de aminoácido 276, está presente em uma ampla variedade de beta-lactamases de classe A. A função da Asn276 tem sido intensamente estudada em beta-lactamases TEM e SHV, em que n276 forma ligações de hidrogênio com o grupo guanídio da arginina (Arg, R) 244 e, portanto, limita a mobilidade da cadeia lateral Arg244.

Substituições da asparagina (Asn, N) nas enzimas TEM ou foram reconhecidas como um dos principais contribuintes para a resistência aos inibidores da serina beta-lactamase, como ácido clavulânico, sulbactam ou tazobactam. Variantes da substituição de N276D (Asp) da beta-lactamase TEM-1 estão presentes nas beta-lactamases resistentes ao inibidor (enzimas IRT como TEM-35 e TEM-36). Uma variante N276D é mais resistente ao ácido clavulânico e tazobactam do que a enzima TEM-1 tipo selvagem, porém concomitantemente, as eficiências catalíticas (kcat/Km) da variante de N276D para várias penicilinas são menores do que 50% daquelas na enzima tipo selvagem TEM-1. As eficácias catalíticas da variante N276D às cefalosporinas são reduzidas em comparação com aquelas das TEM-1 do tipo selvagem (Saves I et al., 1995, J Biol Chem. 270:18240-18245).

Semelhantemente como a TEM-1, a substituição N276D na beta-lactamase SHV-1 ou SHV-5 aumenta a resistência aos inibidores da serina beta-lactamase, porém reduz as suas eficiências na maioria das beta-lactamas (Giakkoupi P. et al., 1999, J Antimicrobiol Chemother, 43: 23-29). Além disso, a substituição N276D nas enzimas SHV-1 ou SHV-5 melhora moderadamente a capacidade destas em degradar as cefalosporinas de “quarta geração” cefpiroma e cefepima.

Na beta-lactamase tipo SHV OHIO-1, um mutante N276G (Gly) demonstrou ser altamente resistente ao ácido clavulânico, enquanto que um mutante N276G derivado de TEM-1 possui apenas resistência moderada ao ácido clavulânico (Bono-mo RA et al., 1995, Biochim Biophys Acta. 1247:121-125).

Na família de enzimas CTX-M, a arginina (Arg, R) está tipicamente presente na posição 276 (Bonnet R., 2004,

Antimicrob Agents Chemother, 48: 1-14) e mutações da Arg276 afetam a extensão da atividade enzimática. As taxas de hidrólise relativa das enzimas CTX-M contra a cefotaxima são moderadamente reduzidas pela substituição de Arg276. Além disso, as enzimas mutantes CTX-M Arg276Trp, Arg276Cys, Arg276Ser e Arg276Gly não afetam o nível de resistência do inibidor de beta-lactamase (Bonnet R., 2004, Antimicrob Agents Chemother, 48: 1-14; Perez-Llarena F.J. et al., 2008, J

Antimicrobiol Chemother, 61: 792-797). Tabela 1. Resíduos de aminoácidos localizados na posição 276 (classificação de Ambler) entre as beta-lactamases de classe A (Matagne A et al., 1998, Biochem J 330: 581-598; Tranier S. et al., 2000, J Biol Chem, 275: 28075-28082)

Agora, na presente invenção, as beta-lactamases que compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 (derivado PenP de Bacillus licheniformis, ou seja, derivado P1A) e tendo um resíduo de aminoácido hidrofílico em uma posição da SEQ ID NO: 1 correspondendo à posição 276, de acordo com a classificação de Ambler, apresentam um beta-lactâmico estendido, bem como efeitos catalíticos melhorados nas beta-lactamas.

Antes, o papel das substituições dos aminoácidos de ácido aspártico (D) na posição 276 na resistência aos inibidores de serina beta-lactamase ou nas propriedades catalíticas para várias beta-lactamas não foi estudado entre beta-lactamases de Bacillus spp., especificamente beta-lactamase de B. licheniformis.

Conforme usado neste documento, o resíduo de aminoácido 276 de acordo com a classificação de Ambler corresponde à posição do aminoácido 243 da SEQ ID NO: 1 e à posição de aminoácido 249 da SEQ ID NO: 3.

Tipicamente, as beta-lactamases da presente invenção têm um aminoácido hidrofílico em uma posição correspondente à posição 276 da classificação de Ambler, diferente do ácido aspártico (D). Os aminoácidos são classificados com base nas propriedades químicas e/ou estruturais de suas cadeias laterais. Os grupos de classificação de aminoácidos incluem aminoácidos hidrofílicos, que são divididos nos seguintes grupos: aminoácidos polares e positivamente carregados hidrofílicos; aminoácidos polares e neutros de carga hidrofílicos; aminoácidos polares e negativamente carregados hidrofílicos; aminoácidos aromáticos, polares e positivamente carregados hidrofílicos. Conforme usado neste documento, “aminoácido hidrofílico"inclui todos os grupos acima mencionados de aminoácidos hidrofílicos, ou seja, refere-se aos aminoácidos polares e positivamente carregados hidrofílicos, aminoácidos polares e neutros de carga hidrofílicos; aminoácidos polares e negativamente carregados hidrofílicos e/ou aminoácidos aromáticos, polares e positivamente carregados hidrofílicos (http://www.biomed.curtin.edu.aU/biochem/tutorials/AAs/AA.html). "Um aminoácido polar e positivamente carregado hidrofílico" refere-se à arginina (R) ou lisina (K). "Um aminoácido polar e neutro de carga hidrofílico” refere-se à asparagina (N), glutamina (Q), serina (S) ou treonina (T). "Um aminoácido polar e negativamente carregado hidrofílico" refere-se ao aspartato (D) ou glutamato (E). "Um aminoácido aromático, polar e positivamente carregado hidrofílico” refere-se à histidina (H).

Em uma modalidade da invenção, o aminoácido hidrofílico é um aminoácido neutro ou positivamente carregado hidrofílico selecionado do grupo consistindo em arginina (R), histidina (H), lisina (K), asparagina (N), glutamina (Q), serina (S) e treonina (T) em uma posição da Seq ID NO: 1, correspondendo à posição 276 de acordo com a classificação de Ambler.

Em uma modalidade preferida da invenção, o aminoácido hidrofílico da beta-lactamase em uma posição da SEQ ID NO: 1 correspondendo à posição 276 de acordo com a classificação de Ambler é selecionado de aminoácidos polares e positivamente carregados hidrofílicos do grupo consistindo em arginina (R), histidina (H) e lisina (K). Mais preferencialmente, o aminoácido na posição da SEQ ID NO: 1 correspondendo à posição 276 de acordo com a classificação de Ambler é arginina.

Em outra modalidade preferencial da invenção, o aminoácido hidrofílico é selecionado dos aminoácidos polares e neutros de carga hidrofílicos do grupo consistindo em asparagina (N), glutamina (Q), serina (S) e treonina (T). Mais preferencialmente, o aminoácido na posição da SEQ ID NO: 1 correspondendo à posição 276 é asparagina.

Em outra modalidade preferida da invenção, o aminoácido hidrofílico na posição da SEQ ID NO: 1 correspondendo à posição 276 se localiza em uma alfa-hélice. Uma alfa-hélice é um porção da estrutura secundária da proteína, assemelhando-se a uma conformação enrolada. As alfa-hélices podem ter particular importância nas porções de ligação ao DNA (por exemplo, hélice-volta-hélice, zíper de leucina e porções de dedo de zinco). Uma modalidade preferencial da invenção, o resíduo de aminoácido 276 está localizado na alfa-hélice11 final (Figura 1). Esta alfa-hélice11 não é conservada entre as beta-lactamases de classe A.

Características específicas das beta-lactamases de classe A

Uma característica específica das beta-lactamases de classe A é um grupo guanidínio de Arg278. As enzimas CTX-M têm Arg278, Arg244 ou Arg220, que se encontra em posições equivalentes nas estruturas tridimensionais. É demonstrado que arginina na posição 220 ou 244 é essencial para as propriedades catalíticas de TEM-1 (Leu220 e Arg244) e beta-lactamase de Streptococus albus G (Arg220 e Asn244). Um grupo guanidínio básico de arginina 244 ou arginina 220 é proposto para contribuir com a ligação da beta-lactama ou a química de inativação dos inibidores “suicidas”, como o ácido clavulânico (Matagne et al., 1998, Biochem J. 330:582-598; Perez-Llarena et al., 2008, J Antimicrobiol Chemother, 61: 792-797). Em PenP de B. licheniformis, o resíduo de Arg-244 forma uma ligação salina com o ácido aspártico 276 (Herzberg, O. 1991 , J Mol Biol. 217: 701 -719; Knox, J.R., e P.C. Moews, 1991 , J Mol Biol. 220: 435-555).

Em uma modalidade preferencial da invenção, a beta-lactamase compreende ainda pelo menos um aminoácido selecionado do grupo consistindo em Leu220 e Arg244, de acordo com a classificação de Ambler, que corresponde à Leu189 e Arg212, respectivamente, da SEQ ID NO: 1.

Beta-lactamase de Bacillus licheniformis (PenP, P1A)

A beta-lactamase da invenção se origina da cepa 749/C de Bacillus licheniformis. A beta-lactamase de B. licheniformis 749/C (PenP; amido-beta-lactam-hidrolase de penicilina, EC3.5.2.6) pertence a um subgrupo 2a na classificação funcional das beta-lactamases de classe A (Bush K. et al., 1995, Antimicrob Agents Chemother 39: 1211-1233). A beta-lactamase de B. licheniformis pode ser considerada como uma penicilinase, que tem alta capacidade hidrolítica para degradar, por exemplo, a penicilina, ampicilina, amoxicilina ou piperacilina e é geralmente inibida por inibidores da beta-lactamase direcionados a sítio ativos, como o ácido clavulânico, sulbactam ou tazobactam (Bush K. et al., 1995, Antimicrob Agents Chemother. 39: 1211-1233).

A beta-lactamase de Bacillus licheniformis 749/C é expressa como uma pré-proteína de 307 resíduos de aminoácidos. Após a translocação e remoção da sua sequência de sinal com 26 resíduos de aminoácidos de comprimento, ela se torna uma lipoproteína ancorada à membrana, em que a cisteína aminoterminal (C27) forma uma ligação tioéter com um diacilglicerídeo. A beta-lactamase de B. Licheniformistambém é encontrada como as formas secretadas (extracelulares), que são produtos proteolíticos da forma de lipoproteína (Izui K. et al., 1980, Biochemistry 19: 1882-1886; Matagne A. et al., 1991, Biochem J, 273: 503-510). A região do gene da beta-lactamase de Bacillus Licheniformis 749/C codificando a forma secretada pequena (forma exo pequena; P1A) dos resíduos de aminoácidos 43-307 foi escolhida como um fragmento de DNA para adaptação do sistema de produção de vetor hospedeiro do Bacillus subtilis (WO 2008065247).

Função

As beta-lactamases hidrolisam os antibióticos beta-lactâmicos que compreendem um anel beta-lactama como penicilinas, cefalosporinas, clavamas (ou oxapenamas), cefamicinas e carbapenemas. Em uma modalidade preferencial da invenção, a beta-lactamase hidrolisa as penicilinas e/ou as cefalosporinas. "Penicilinas" refere-se a diversas variantes naturais ou semissintéticas da penicilina, que é originalmente derivada do Penicillium. As penicilinas incluem, mas não estão limitadas, a amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, hetacilina, oxacilina, mezlocilina, penicilina G, penicilina V e piperacilina.

Em cefalosporinas, o anel beta-lactama é fundido a um anel di-hidrotiazina de seis membros ao invés de ao anel tiazolidina de cinco-membros encontrado nas penicilinas. Com base nas suas atividades biológicas, as cefalosporinas são divididas em seis gerações, mas algumas cefalosporinas não foram agrupadas a uma geração específica. Em uma modalidade específica da invenção, a beta-lactamase tem eficiência catalítica melhorada em cefalosporinas em comparação com as beta-lactamases tipo selvagem. De acordo com a presente invenção, a beta-lactamase de Bacillus licheniformis, em que o ácido aspártico (Asp, D) na posição 276, numerado de acordo com a classificação de

Ambler, é substituído por um resíduo de aminoácido hidrofílico, como asparagina (N) ou arginina (R), apresenta uma atividade prolongada aos antibióticos beta-lactâmicos, como cefalosporinas.

Em uma modalidade da invenção, as cefalosporinas são selecionadas do grupo consistindo em cefoperazona, ceftriaxona e cefazolina.

Conforme usado neste documento, a eficiência catalítica das beta-lactamases refere-se à capacidade para hidrolisar os antibióticos beta-lactama A eficiência catalítica melhorada pode ser medida por quaisquer métodos convencionais in vitro, ex vivo ou in vivo de qualquer amostra biológica ou um indivíduo.

Métodos de produção e modificação de beta-lactamases

A beta-lactamase da invenção pode ser produzida pela modificação da enzima com qualquer método convencional de engenharia genética. Métodos como projeto racional, mutagênese aleatória, embaralhamento de DNA (recombinação aleatória), exibição de fago, embaralhamento de genoma inteiro, heteroduplex, quimeragênese aleatória na montagem dos moldes transitórios dos oligonucleotídeos projetados, remontagem mutagênica e unidirecional, embaralhamento de éxons, embaralhamento de blocos à base de ligação Y, recombinação não homóloga e design racional de combinação com evolução direcionada podem ser utilizados na produção. Além disso, as enzimas mutantes podem ser obtidas pelo uso da mutagênese direcionada a sítio e união por técnicas de extensão de sobreposição.

Em uma modalidade da invenção, um método de modificação de uma beta-lactamase compreende uma etapa de modificar a beta-lactamase que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 pela substituição de um aminoácido em uma posição da SEQ ID NO: 1 correspondendo à posição 276 de acordo com a classificação de Ambler com um aminoácido hidrofílico. O aminoácido hidrofílico podem ser qualquer aminoácido hidrofílico, por exemplo, selecionado do grupo consistindo em arginina (R), histidina (H), lisina (K), asparagina (N), glutamina (Q), serina (S) e treonina (T).

Em uma modalidade da invenção, um aminoácido não hidrofílico é substituído com um aminoácido hidrofílico em uma posição da SEQ ID NO: 1 correspondendo à posição 276 de acordo com a classificação de Ambler.

A beta-lactamase da invenção também pode ser produzida, por exemplo, pelos métodos sintéticos, por exemplo, síntese de peptídeo ou por produção recombinante em uma célula hospedeira.

Em uma modalidade preferencial da invenção, a enzima é recombinante. Conforme usado neste documento, material genético “recombinante” refere-se a um material que é tipicamente uma combinação de material genético, por exemplo, fitas de DNA de várias origens, e que foi produzido através da combinação ou inserção das sequências. O polinucleotídeo da invenção podem, por exemplo ser inserido sob o controle de quaisquer reguladores endógenos ou exógenos, como os promotores. A proteína recombinante é derivada do DNA recombinante.

Pelo menos um polinucleotídeo ou fragmento de polinucleotídeo de interesse pode ser isolado de uma célula ou produzido sinteticamente. Este polinucleotídeo ou fragmento de polinucleotídeo pode ser transformado para uma célula hospedeira. Uma célula hospedeira adequada para produzir qualquer peptídeo da invenção pode ser qualquer célula eucariótica ou procariótica, preferencialmente bactérias, mais preferencialmente uma cepa de Bacillus spp. como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilis ou Bacillus amyloliquefaciens.

Conforme usado neste documento, a "transformação"refere-se a uma alteração genética de uma célula por material genético estrangeiro, preferencialmente o DNA, resultando na expressão desse material genético. O material genético estrangeiro pode ser introduzido como tal ou como incorporado em qualquer outro material genético, como vetores, plasmídeos, etc. Qualquer método de engenharia genética ou quaisquer métodos de clonagem molecular podem ser usados para transformar uma célula hospedeira com o polinucleotídeo da invenção. Existem vários métodos de introdução de material estrangeiro em uma célula eucariótica. Materiais como polímeros (por exemplo, DEAE-dextrana ou polietilenimina), lipossomas e nanopartículas (por exemplo, ouro) têm sido utilizados como veículos para a transformação. Material genético também pode ser introduzido em células usando, por exemplo, vírus ou vetores como veículos. Outros métodos para a introdução de material estrangeiro em uma célula incluem, mas não estão limitados, à nucleofecção, eletroporação, conjugação, transfecção, sonoporação, choque térmico e magnetofecção.

Depois de uma célula hospedeira ter produzido o peptídeo da invenção sob condições apropriadas, o peptídeo pode, por exemplo, ser purificado a partir de célula ou uma forma secretada do peptídeo pode ser recuperada, por exemplo, dos meio de cultura. Em uma modalidade preferencial da invenção, a beta-lactamase é secretada.

Composição farmacêutica

A composição farmacêutica da invenção compreende a beta-lactamase da invenção. A composição pode compreender apenas uma beta-lactamase ou mais, como pelo menos duas, três, quatro, etc. diferentes beta-lactamases.

As composições farmacêuticas da invenção também podem compreender quaisquer outros ingredientes ativos diferentes das beta-lactamases da invenção.

As composições farmacêuticas podem ser usadas, por exemplo, na forma sólida, semissólida ou líquida, como na forma de comprimidos, péletes, cápsulas, soluções, emulsões ou suspensões. Preferencialmente, a composição é para administração oral ou aplicações entéricas.

Além de pelo menos uma beta-lactamase da invenção ou polinucleotídeos ou células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos da invenção, a composição farmacêutica pode compreender veículo(s), adjuvante(s), excipiente(s), excipiente(s) adjuvante(s), antisséptico(s), agentes(s) estabilizante(s), agentes(s) de ligação, agente(s) de enchimento, agente(s) lubrificante(s), agente(s) de suspensão, plastificante, corantes, formadores de filme, açúcar, álcoois, agentes lubrificantes e agentes diluentes e/ou componentes normalmente encontrados nos produtos correspondentes.

O produto ou composição farmacêutica da invenção compreende as beta-lactamases em uma quantidade suficiente para produzir o efeito desejado.

Os produtos ou as composições farmacêuticas podem ser fabricados por quaisquer processos convencionais conhecidos na técnica. As beta-lactamases podem ser adicionadas a qualquer produto farmacêutico ou misturadas com quaisquer agentes durante qualquer etapa de preparação. A beta-lactamase da invenção também podem ser produzida, por exemplo, pela expressão do gene da beta-lactamase sob condições apropriadas em um produto farmacêutico ou no tecido alvo, depois que o produto farmacêutico foi degradado.

Em uma modalidade preferencial da invenção, a(s) beta-lactamase(s) e o antibiótico beta-lactâmico são administrados juntos sob a forma de um pélete de revestimento entérico a um indivíduo. Formas de revestimento de base aquosa parecem ser os mais favoráveis materiais para os processos de revestimento da proteína P1A hidrofílica. Os polímeros aquosos comumente usados para alcançar as propriedades entéricas e também utilizáveis na presente invenção são os polimetacrilatos, como Eudragit®, polímeros à base de celulose, por exemplo, éteres de celulose, por exemplo, Duodcell®, ou ésteres de celulose, por exemplo, Aquateric®, ou copolímeros de acetato de polivinila, por exemplo, Opadry®.

A beta-lactamase da invenção ou uma composição farmacêutica da invenção pode ser administrada a um indivíduo simultaneamente ou sequencialmente com um antibiótico beta-lactâmico. Em uma modalidade da invenção, a beta-lactamase ou a composição farmacêutica é administrada antes de um antibiótico beta-lactâmico, por exemplo, de 5 a 30 minutos antes de um antibiótico beta-lactâmico. A beta-lactamase e um antibiótico/antibióticos beta-lactâmicos pode(m) estar na mesma formulação ou em formulações diferentes.

Efeitos adversos das beta-lactamas e tratamentos

Efeitos adverso, isto é, reações de fármacos adversas aos antibióticos beta-lactâmicos podem incluir, mas não estão limitadas, a diarreia, náuseas, exantema, urticária, superinfeção, febre, vômitos, eritema, dermatite, angioedema e colite pseudomembranosa.

Em uma modalidade preferencial da invenção, os efeitos adversos a serem tratados ou prevenidos ocorrem no trato gastrintestinal (GIT). Conforme usado neste documento, trato gastrintestinal refere-se às estruturas digestivas que se estendem desde a boca até o ânus. O trato gastrintestinal compreende a boca, esôfago, estômago, duodeno, jejuno, íleo, intestino delgado, cólon, ceco, reto e ânus.

A beta-lactamase da invenção ou a composição farmacêutica da invenção pode ser administrada a um indivíduo oralmente ou diretamente ao trato gastrintestinal. Produto(s) de fármaco das combinações enzimáticas destinam-se a inativar a beta-lactama não absorvida no GIT ou em outros compartimentos corporais indesejáveis, tais como a pele ou cavidade vaginal. A composição farmacêutica pode ser um produto de fármaco oralmente administrado, uma formulação dermatológica ou um supositório vaginal, e pode compreender formulações de dosagem de liberação líquida, imediata, retardada ou sustentada.

Em uma modalidade preferencial da invenção, a(s) beta-lactamase(s) é/são administrada(s) por via oral. Em outra modalidade preferencial da invenção, a(s) beta-lactamase(s) é/são administrada(s) diretamente ao gastrointestino de um paciente.

Um indivíduo tratado pode ser um homem ou um animal como um animal de estimação ou animal de produção, por exemplo, um cachorro, gato, vaca, porco, galinha ou cavalo. Em uma modalidade preferencial da invenção, o indivíduo é um ser humano.

A presente invenção é ilustrada pelos exemplos a seguir, que não se destinem a ser limitados sob qualquer aspecto.

Exemplo 1. Construção das enzimas mutantes D276N e D276R

Mutantes D276N e D276R da beta-lactamase de Bacillus licheniformis foram construídos por mutagênese de extensão de união por sobreposição (SOE) usando o plasmídeo pRSI-110 que codifica a beta-lactamase P1A como um molde para as reações de PCR iniciais de acordo com os procedimentos anteriormente publicados (Horton R.M. et al., 1989, Gene 77:61-68). Iniciadores foram projetados para fornecer dois produtos diferentes de PCR com uma região de sequência comum. Os fragmentos foram, em seguida, fundidos em uma amplificação por PCR subsequente pelo auxílio de regiões de sobreposição. As mutações desejadas foram alcançadas usando iniciadores mutagênicos na PCR inicial.

Para o mutante D276N, a mutação foi feita na posição desejada no gene tipo selvagem, convertendo um códon GAT em um códon AAT. Os iniciadores utilizados nas primeiras amplificações de PCR são apresentados na Tabela 2. O tamanho dos fragmentos amplificados no primeiro PCR foi de 800 nt e 220 nt, que tinha uma região de sobreposição longa com 21 nt. Tabela 2. Iniciadores de PCR oligonucleotídicos. As regiões complementares são sombreadas e os códons modificados são expressos em negrito. Os iniciadores Normal-1 e Reverso-1 10 foram utilizados na amplificação do fragmento fundido na segunda PCR.

Na segunda reação de PCR (reação SOE), os dois fragmentos sobrepostos foram fundidos em uma reação de extensão subsequente. A inclusão dos iniciadores externos (Normal-1 e Reverso-1) na reação de extensão amplifica o produto fundido por PCR. O produto SOE purificado foi digerido com a enzima de restrição HindIII e ligado ao vetor de secreção pKTH141 clivado HindIII conforme descrito em WO 2008/065247.

As células competentes de Bacillus subtilis RS303 foram transformadas com uma mistura de ligação. Clones positivos em placas Luria-canamicina foram testados pela suspensão da massa bacteriana de uma única colônia em solução de nitrocefina. Os clones positivos efetivamente hidrolisaram a nitrocefina, mudando a cor da solução de nitrocefina de amarelo para vermelho. O plasmídeo híbrido foi purificado das células de um único clone. A sequência correta da região gerada por PCR foi verificada por sequenciamento de DNA.

Para o mutante D276R, a mutação foi feita na posição desejada pela conversão de um códon GAT para um códon CGC. A construção da cepa mutante D276R foi realizada semelhantemente àquela do mutante D276N, exceto que os iniciadores reverso D276R e normal D276R foram usados na PCR inicial (ver Tabela 2).

Exemplo 2. Sequência de nucleotídeos do gene da beta-lactamase mutante D276N (penP)

O constructo de expressão foi isolado de um clone positivo e a inserção foi submetida ao sequenciamento de DNA. A sequência nucleotídica completa e a sequência de aminoácidos deduzida do gene da beta-lactamase mutante D276N revelaram que uma substituição de Asp por Asn ocorreu corretamente no códon desejado (Figura 2). Além disso, a sequência de DNA do gene da beta-lactamase mutante D276N revelou na fusão do quadro entre a sequência nucleotídica que codifica uma sequência de sinal de 31 aminoácidos de comprimento a alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens, o sítio de clonagem HindIII e a sequência completa do gene mutante D276N. É previsto que a peptidase de sinal corta a ligação peptídica entre a alanina (A) na posição de -1 e a glutamina (Q) na posição +1. A beta-lactamase D276N madura possui uma extensão NH2-terminal de um NH2-QAS-tripeptídeo derivado do sítio de clonagem HindIII no constructo de expressão. Portanto, com base na sequência de aminoácidos deduzida, a beta-lactamase mutante D276N madura é compreendida de 268 resíduos de aminoácidos.

Exemplo 3. Sequência de nucleotídeos do gene da beta-lactamase mutante D276R (penP)

Para confirmar a substituição desejada de ácido aspártico para arginina na posição 276 (classificação de Ambler) no gene da beta-lactamase de Bacillus licheniformis, o constructo de expressão foi isolado a partir de um clone positivo e a sequência nucleotídica da inserção foi sequenciada semelhantemente ao exemplo 2. De acordo com a sequência nucleotídica obtida, a sequência de aminoácidos deduzida contém a substituição D276R desejada e a enzima mutante D276R madura é composta por 268 resíduos de aminoácidos (Figura 3).

Exemplo 4. Análise bioquímica da beta-lactamase mutante D276N (P3A)

A pureza do preparado de enzima foi estimada como mais de 95 por cento por análise de SDS-PAGE (dados não mostrados).

Os parâmetros cinéticos das beta-lactamases de B. licheniformis tipo selvagem (P1A) e mutante D276N (P3A) foram determinados para a hidrólise de vários tipos de beta-lactamas e estão resumidos na Tabela 3. As reações enzimáticas foram realizadas em tampão fosfato a 20 mM (pH 7), a 30 °C, usando a concentração de enzima apropriada e várias concentrações de substratos de penicilina ou cefalosporina. Os valores de kcat e Km foram obtidos com o auxílio do método de linearização de Hanes. Os principais resultados estão descritos abaixo.

(i) Penicilinas

O efeito de substituição D276N na hidrólise das penicilinas (ampicilina, amoxicilina ou piperacilina) não foi drástico com as eficiências enzimáticas das porcentagens de 51 a 80 daquelas da enzima tipo selvagem. Consequentemente, os valores de Km da enzima mutante D276N para as penicilinas foram reduzidos como um máximo de duas vezes ou menos.

(ii) Cefalosporinas

Conforme esperado, em relação às penicilinas, a beta-lactamases tipo selvagem tinham má eficiência enzimática para várias cefalosporinas, incluindo as cefalosporinas de primeira (cafazolina), segunda (cefuroxima) e terceira (ceftriaxona, cefotaxima, ceftadizima, cefoperazona e cefepime) geração (Tabela 1). Surpreendentemente, as eficiências enzimáticas da enzima mutante D276N para certas cefalosporinas, preferencialmente para cefoperazona e mais preferencialmente para ceftriaxona, foram essencialmente melhoradas em comparação com aquelas obtidas com as enzimas tipo selvagem. As constantes Km para ceftriaxona e cefoperazona foram reduzidas e, concomitantemente, os números de renovação (kcat) para ceftriaxona e cefoperazona foram aumentados em comparação com aqueles da enzima tipo selvagem (P1A). Assim, a substituição de ácido aspártico-asparagina na posição 276 da beta-lactamase de Bacillus licheniformis contribui com a extensão do perfil de substrato beta-lactâmico na beta-lactamase de Bacillus licheniformis. Tabela 3. Parâmetros cinéticos para a hidrólise dos substratos beta-lactâmicos pelas enzimas tipo selvagem (P1A) e mutantes D276N das beta-lactamases de Bacillus licheniformis.

(1) Eficiência catalítica relativa (k /K ) de D276N em comparação com aquela da enzima tipo selvagem (P1A).

Exemplo 5. Caracterização bioquímica da enzima mutante D276R

A enzima mutante D276R foi construída para avaliar se

Asp-276 tolera substituições e avaliar a contribuição da substituição D276R para a extensão da atividade da beta-lactamase observada na enzima D276N.

Amostras de enzima brutas de D276R e D276N obtidas dos sobrenadantes de cultura foram utilizadas como materiais de teste. A pureza e a quantidade das amostras da enzima foram estimados pela realização da análise de SDS-PAGE. A taxa de hidrólise das enzimas mutantes D276R e D276N para várias beta-lactamas foi realizada pela determinação dos valores de Vmax. Os resultados obtidos são apresentados como atividades relativas (%) em comparação com aquelas da enzima D276N na Tabela 4.

Em geral, as eficiências catalíticas da beta-lactamase D276R tanto para penicilinas quanto para cefalosporinas é comparável com aquelas da enzima D276N. Em comparação com a enzima D276N, a enzima D276R tem atividade reduzida em relação à ceftriaxona e atividade melhorada em relação à cefoperazona. Este estudo mostrou que o espectro estendido de beta-lactamas pode ser alcançado pela substituição de um resíduo de aminoácido hidrofílico, como arginina ou asparagina, pelo ácido aspártico na posição 276 na beta-lactamase do Bacillus licheniformis. Ele também indica que uma modificação de enzima desejada pode ser alcançada pela substituição de outro resíduo de aminoácido hidrofílico, como a glutamina (Q), lisina (K), serina (S) ou treonina (T) pelo ácido aspártico na posição 276. Tabela 4. Atividades relativas (%) da enzima mutante D276R em comparação com aquelas da enzima mutante D276N

Exemplo 6. Estudo in vivo da beta-lactamase D276N

A capacidade da enzima beta-lactamase mutante D276N do Bacillus licheniformis para inativar a ceftriaxona (CRO), que foi excretada para dentro do trato gastrintestinal durante a terapia parenteral foi investigada em um modelo canino. Beagles de laboratório do estudo têm uma válvula niple cirurgicamente inserida no jejuno aproximadamente a 170 cm de distância do piloro, permitindo a coleta de amostras para análise. A cirurgia intestinal não alterou a motilidade intestinal. Cinco cães beagle foram utilizados em cada experimento.

O estudo foi realizado como dois tratamentos sequenciais: no primeiro tratamento (experimento de controle sem terapia de beta-lactamase), uma dose única de ceftriaxona (30 mg de ceftriaxona (CRO) por Kg de peso corporal, que corresponde a cerca de 1 grama de CRO em seres humanos) foi administrada por via intravenosa 20 minutos após a primeira alimentação dos cães. Amostras jejunais foram coletadas em vários pontos de tempo durante dez horas. Os cães foram alimentados novamente cinco horas e quarenta minutos após a administração de ceftriaxona para induzir a excreção biliar da ceftriaxona acumulada na vesícula biliar.

Amostras de quimo jejunal foram imediatamente congeladas e armazenado a -20 °C para aguardar a análise. As amostras de quimo foram pré-tratadas com ácido perclórico-cítrico para precipitar as substâncias interferentes. Os precipitados foram removidos por centrifugação. Um método de cromatografia de alta pressão de fase reversa com detecção por UV foi utilizado para a quantificação de ceftriaxona nos sobrenadantes.

No segundo tratamento, a beta-lactamase mutante D276N foi fornecida como péletes revestidos entéricos preenchidos em cápsulas de gelatina dura 10 minutos antes da injeção de ceftriaxona. As formas de dosagem de revestimento entérico são comuns entre os produtos orais na indústria farmacêutica. Os produtos de fármaco de revestimento entérico são projetados para contornar o estômago como uma forma intacta e liberar os conteúdos da forma de dosagem no intestino delgado. As razões para a aplicação de formulações sólidas entéricas são proteger a substância do fármaco da ação destrutiva das enzimas ou ambiente de pH baixo do estômago ou para evitar a droga induzida por substância de fármaco da mucosa gástrica, náusea ou sangramento ou para fornecer a substância de fármaco na forma não diluída em um sítio alvo no intestino delgado. Com base nestes critérios, os produtos de medicamento revestido entérico podem ser considerados como um tipo de formas de dosagem de ação retardada. O copolímero de ácido polimetacrílico Eudragit® L 30 D-55 foi utilizado para atingir uma forma de dosagem de revestimento entérico dependente do pH. Uma dose única de péletes de revestimento entérico contendo cerca de 0,44 mg de princípio ativo beta-lactamase D276N por Kg de peso corporal foi utilizada no segundo tratamento.

Os resultados obtidos de ambos os tratamentos estão apresentados na Figura 4.

O Tratamento 1 mostrou que concentrações elevadas de ceftriaxona foram excretadas dentro do trato intestinal pequeno durante a terapia parenteral de ceftriaxona. A concentração jejunal mais alta (cerca de 1500 microgramas por grama de quimo jejunal) foi encontrada 60 minutos após a injeção de ceftriaxona. Os níveis de ceftriaxona jejunal aumentado foram observados após a segunda alimentação dos cães (em um 5 ponto do tempo de 340 minutos) que indica o acúmulo de excreção de bile contento ceftriaxona estimulada por alimento na vesícula biliar.

O tratamento 2 mostrou que a beta-lactamase mutante D276N oralmente administrada é capaz de reduzir os níveis de 10 ceftriaxona jejunais perto do limite de quantificação (10 microgramas de ceftriaxona por micrograma de quimo jejunal). Esta verificação mostra que a beta-lactamase mutante D276N é uma substância de fármaco potente candidata a reduzir os efeitos secundários relacionados com o uso de ceftriaxona 15 parenteral. Além disso, com base nas altas atividades para as penicilinas, como ampicilina, amoxicilina e piperacilina, as enzimas mutantes D276N ou D276R podem ser usadas como uma substância de fármaco alternativa na terapia de beta-lactamase descrita em WO 2008065247.

Claims (11)

1. Beta-lactamase consistindo em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, caracterizada por a beta-lactamase ter um aminoácido na posição 243, correspondente à posição 276 de acordo com a classificação de Ambler substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de arginina (R), histidina (H), lisina (K), asparagina (N), glutamina (Q), serina (S) e treonina (T) e hidrolisa penicilinas e/ou cefalosporinas.

2. Beta-lactamase, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o aminoácido na posição da SEQ ID NO: 1 correspondente à posição 276 é asparagina (N).

3. Beta-lactamase de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o aminoácido na posição da SEQ ID NO: 1 correspondente à posição 276 é arginina (R).

4. Beta-lactamase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o aminoácido hidrofílico na posição da SEQ ID NO: 1 correspondente à posição 276 se localiza em uma hélice alfa.

5. Beta-lactamase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a beta-lactamase compreende ainda pelo menos um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Leu220 e Arg244, de acordo com a classificação de Ambler, em que Leu se refere a leucina e Arg se refere a arginina.

6. Beta-lactamase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato da beta-lactamase ter eficiência catalítica melhorada para cefalosporinas, em comparação com a beta-lactamase da SEQ ID NO: 1 com ácido aspártico (D) na posição correspondente à posição 276 da classificação Ambler.

7. Beta-lactamase, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as cefalosporinas são selecionadas do grupo que consiste em cefoperazona, ceftriaxona e cefazolina.

8. Método para produzir a beta-lactamase, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o método compreende as seguintes etapas: i) fornecer um gene que codifica a beta-lactamase conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; ii) transformar uma célula hospedeira com o gene; iii) obter uma célula hospedeira que produz beta-lactamase; iv) recuperação da beta-lactamase, em que o gene que codifica a beta-lactamase é um polinucleotídeo de qualquer uma das SEQ ID NO:s 2 ou 4 modificado para codificar um aminoácido hidrofílico selecionado do grupo que consiste de arginina (R), histidina (H), lisina (K), asparagina (N ), glutamina (Q), serina (S) e treonina (T) na posição 276 de acordo com a classificação de Ambler.

9. Polinucleotídeo, caracterizado por consistir na sequência de qualquer uma das SEQ ID NO: 2 ou 4, modificado para codificar um aminoácido hidrofílico selecionado do grupo que consiste de arginina (R), histidina (H), lisina (K), asparagina (N), glutamina (Q), serina (S) e treonina (T) na posição 276 de acordo com a classificação de Ambler, ou codificar a betalactamase conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

10. Composição farmacêutica caracterizada compreendendo beta-lactamase conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

11. Beta -lactamase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser para uso como medicamento.

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