ES2573484T3 - Análisis automatizado de patrones de interacción sonda-diana multiplexados: coincidencia de patrones e identificación de alelos - Google Patents

Abstract

Método para asignaciones de alelos donde las asignaciones se realizan basándose en someter una muestra que incluye ácido nucleico diana a un ensayo de hibridación o ensayo de elongación mediado por captura, o ambos, y donde se analizan varios marcadores polimórficos, presentes en alelos del ácido nucleico diana, comprendiendo el método: determinar un patrón de intensidad de señales de ensayo generado por interacciones sonda-diana para generar un patrón de reacción designando como positivas aquellas intensidades de señal que superan un umbral predeterminado y designando como negativas aquellas intensidades de señal que no superan el umbral predeterminado, binarizando de ese modo dicho patrón de intensidad de señales de ensayo generado por interacciones sonda-diana donde cada una de dicha intensidad corresponde al número de acontecimientos de hibridación o elongación correspondientes, según sea aplicable; realizar asignaciones de alelos basándose en comparar y hacer coincidir dicho patrón de reacción con un patrón de reacción de referencia similar que representa combinaciones de dos o más alelos de referencia, tal como se enumera en una colección de referencia de alelos para el ácido nucleico diana en construcción; y designar, como nuevos alelos, los que tienen patrones de reacción que difieren de patrones de reacción de referencia que representan combinaciones de dos o más alelos de referencia mediante una disparidad mínima predeterminada.

Description

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DESCRIPCION

Analisis automatizado de patrones de interaccion sonda-diana multiplexados: coincidencia de patrones e identificacion de alelos

Antecedentes

Patrones de interaccion complejos como marcadores de diagnostico - Los formatos de ensayo paralelos, que permiten el analisis simultaneo (“multiplexado”) de multiples loci geneticos en una sola reaccion, son muy adecuados para la determinacion de configuraciones de diana espedficas (“alelos”) encontradas en una muestra dada y para la monitorizacion de marcadores cuantitativos tales como los niveles de expresion de genes designados o los niveles de biomarcadores de protema circulantes que se manifiestan por sf mismos en patrones de interaccion de receptor- ligando. En lo que sigue, la referencia a interacciones sonda-diana pretende referirse a esta situacion mas general. Mediante el estudio de la(s) diana(s) con un conjunto seleccionado de sondas de oligonucleotido (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.837.832, titulada “Arrays of nucleic acid probes on biological chips”) y el analisis de los patrones de interacciones espedficas de una o mas secuencias diana con ese conjunto de sondas, pueden identificarse rapidamente alelos y combinaciones de alelos.

Esta capacidad de diagnostico probablemente desempenara un papel cada vez mas importante en el estudio de enfermedades complejas tales como artritis, diabetes y cancer, incluyendo la evaluacion de la predisposicion a desarrollar una enfermedad que tienen herencia compleja y que requiere la interpretacion de todo un conjunto de marcadores moleculares. Sin embargo, el analisis de los resultados (en forma de un patron de lecturas de intensidad producido en un ensayo multiplexado que refleja la fuerza de la interaccion de una o mas diana(s) con el conjunto de sondas seleccionado) se enfrenta al reto formidable de interpretar el patron de interaccion mapeandolo para validar combinaciones de alelos o evaluando la predisposicion o el riesgo, a la vez que tambien se determina la fiabilidad y la “exclusividad” de la asignacion.

Un modelo: Tipificacion molecular de HLA - El analisis de polimorfismos en el complejo de genes del antfgeno leucocitario humano (HLA) proporciona un modelo de la complejidad implicada en analizar la asociacion de enfermedades, sirviendo de ese modo para delinear los requisitos que han de abordarse mediante un analisis automatizado rapido y fiable. El complejo de HLA comprende multiples loci altamente polimorficos que codifican para antfgenos variables mediando una respuesta inmunitaria a medula osea o tejido “extrano”. En la actualidad se han identificado como alelos de clase I 282 HLA-A, 540 HLA-B y 136 HLA-C alelos, y como alelos de clase II 418 HLA- DRB, 24 HLA-DQA1 y 53 HLA-DQB1. Muchas secuencias de alelos conocidos aparecen en bases de datos publicas, por ejemplo, la base de datos IMGT/HLA,
www.ebi.ac.uk/imgt/hla/intro.html) para antfgenos leucocitarios humanos.

Se han usado ampliamente ensayos de hibridacion paralelos (“multiplexados”) de diversos formatos para tipificacion molecular de HLA lo que requiere una combinacion unica de rendimiento y fiabilidad en la identificacion de alelos o grupos de alelos asociados con antfgenos de clase I y clase II espedficos. En el contexto de la tipificacion molecular de HLA, las metodologfas de ensayo convencionales de la tecnica recurren a un formato de “transferencia puntual inversa”. Segun este formato, se exponen sondas, situadas en un conjunto de bandas bien separadas, en una tira estrecha de membrana de nailon u otro material de sustrato, a una disolucion de diana(s) en condiciones que permiten la captura de la(s) diana(s) para producir, en una etapa de coloracion posterior, senales colorimetricas. Otros metodos de la tecnica incluyen el uso de sondas presentadas sobre micropartfculas codificadas que se suspenden en una disolucion diana y se analizan mediante citometna de flujo (vease “Products”
http://www.onelambda.com). Un metodo reciente proporciona un entorno de ensayo integrado usando matrices planas de micropartfculas codificadas dispuestas sobre chips de silicio (vease, por ejemplo, la solicitud aceptada con n.° de serie 09/690.040, asignada a BioArray Solutions, Ltd.).

En la tecnica anterior se ha descrito el diseno de formatos de ensayo paralelos para el analisis de loci polimorficos tales como el complejo de HLA, especialmente la seleccion de conjuntos de pares de cebadores y sondas, asf como en varias solicitudes en tramitacion junto con la presente (vease, por ejemplo, Concurrent Optimization in Selection of Primer and Capture Probe Sets for Nucleic Acid Analysis”, presentado el 15/7/2004 y cedida a BioArray solutions, Ltd.).

Complementariedad de secuencia y representacion binaria - La interpretacion de patrones de interaccion sonda- diana implica la tarea de hacer coincidir una cadena binaria (“patron de reaccion”) derivada de un patron de intensidad de senales experimental con una (o mas) combinaciones de alelos o de establecer la validez de nuevos alelos.

Cada alelo tendra subsecuencias que son perfectamente complementarias, y otras que no son complementarias a un conjunto de sondas construido para estudiar la diana. Esta configuracion se representa en la tecnica por un codigo binario que proporciona la base para asignaciones de alelos. Es decir, mediante la asignacion a cada sonda con coincidencia perfecta de una puntuacion “+” (en el presente documento indicada mediante “8”), y a cada sonda sin coincidencia de una puntuacion de “-” (en el presente documento indicada mediante “1”), se construye una

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cadena binaria para representar el patron de interaccion del conjunto de sondas elegido con una combinacion de alelos espedfica encontrada. El diccionario que muestra la correspondencia entre alelos y cadenas binarias se conoce en la tecnica como la “tabla de resultados positivos”.

El patron de reaccion (producido por los conjuntos de sondas seleccionados) puede corresponder a mas de una combinacion de alelos individual, y el grado de ambiguedad (“degeneracion”) determina la precision (“resolucion”) que puede obtenerse en la identificacion de combinaciones de alelos. En general, el grado de resolucion puede aumentarse mediante la adicion de sondas al conjunto.

Las intensidades de senal de ensayo reflejan la fuerza de las interacciones sonda-diana. Una sonda ideal produce una senal de ensayo de alta intensidad cuando es perfectamente complementaria (“con coincidencia”) con su subsecuencia diana en una muestra dada y de otro modo produce una intensidad de senal de ensayo de baja intensidad. Es decir, la distribucion de intensidades de senal de una sonda de este tipo a lo largo de un gran conjunto de muestras, presentana de manera ideal dos picos distintos, lo que sugiere una segmentacion de intensidades de senal en subpoblaciones que reflejan configuraciones de secuencia de sonda y diana “con coincidencia” o “sin coincidencia”.

Sin embargo, en la practica, la interaccion de una o mas dianas polimorficas con una multiplicidad de sondas puede producir una amplia variedad de intensidades de senal de ensayo. Por ejemplo, pueden reducirse intensidades de senal de ensayo de otro modo positivas, o pueden potenciarse intensidades de senal de ensayo de otro modo negativas, “extendiendo” de ese modo las distribuciones de intensidades individuales. Por ejemplo, la hibridacion sonda-diana se debilita cuando una sonda se encuentra en una subsecuencia diana un alelo que comprende polimorfismos distintos del polimorfismo “designado” de la sonda. A la inversa, una hibridacion sonda-diana puede potenciarse inesperadamente cuando una sonda, a la vez que presenta una ausencia de coincidencia significativa con la diana dentro de su subsecuencia designada, coincide con un alelo espedfico en una subsecuencia no designada.

Como con la binarizacion, generalmente las subpoblaciones se delinean mediante la seleccion de un umbral. Particularmente cuando las distribuciones de senales de ensayo no son bimodales, la seleccion del umbral representa una etapa inicial cntica en el analisis.

En el contexto de la tipificacion molecular de HLA, el amplio analisis necesario de patrones de interaccion y asignacion de alelos se basa actualmente en un grado sustancial en la experiencia de los especialistas. Estos especialistas y expertos emplean, habitualmente con un soporte informatico mmimo, un proceso que lleva mucho tiempo, diffcil y a menudo subjetivo de establecimiento, revision y refinamiento (“redaccion”) de modo interactivo de asignaciones de alelos, a menudo con referencia a compilaciones impresas de alelos conocidos (por ejemplo, la base de datos mantenida por el Programa Nacional de Donantes de Medula Osea) y “tablas de resultados positivos” correspondientes.

Como con la tipificacion molecular de antfgenos leucocitarios y antfgenos eritrocitarios, el analisis y la interpretacion fiables y rapidos de patrones de interaccion sonda-diana complejos representa un requisito previo para la validacion significativa de conjuntos de marcadores geneticos para validar estos “factores de prediccion” de predisposicion de enfermedad o capacidad de respuesta al tratamiento en poblaciones de pacientes de tamano suficiente para permitir conclusiones estadfsticamente significativas. Surgen retos similares en otras areas, por ejemplo: en relacion con el analisis de polimorfismos geneticos en el analisis de mutacion para examen de portador y diagnostico y evaluacion de riesgo asociado; y en relacion con la evaluacion de la predisposicion a adquirir enfermedades geneticas de herencia compleja que puede manifestarse por sf misma en forma de un conjunto completo de marcadores polimorficos o perfiles de expresion genica.

Sena deseable un sistema de software conveniente que recurra a algoritmos informaticos y procedimientos robustos para el analisis e interpretacion automatizados de patrones y que proporcione un entorno integrado para la revision interactiva y redaccion de asignaciones asf como para la gestion y la visualizacion de datos.

Pastinen et al., ensena una deteccion de alelos de dos colores partiendo de la pagina n mediante la determinacion de una intensidad de senal a una primera longitud de onda (CY5 a 670 nm) y una segunda longitud de onda (CY3 a 570 nm). Posteriormente, la primera intensidad de senal CY5 (muestra de prueba) se divide entre la segunda intensidad de senal CY3 (muestra de control). Estos valores ajustados se usan entonces para calcular la proporcion de intensidades de senal entre las muestras de prueba y control.

Sumario

El objeto anterior se logra mediante un metodo para asignaciones de alelos segun la reivindicacion 1. Pueden derivarse realizaciones preferidas de las reivindicaciones dependientes respectivas.

Se divulgan adicionalmente metodos y algoritmos (y su implementacion) que soportan el analisis automatizado y la revision y la mejora interactivas (“redaccion”) del analisis dentro de un entorno de software integrado, para

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asignaciones de alelos automatizadas. La implementacion, preferiblemente con un sistema de software y un programa denominado el programa de asignacion de alelos automatizada (“AAA”), proporciona una multiplicidad de funcionalidades incluyendo: Gestion de datos por medio de una interfaz integrada para una base de datos portatil para permitir la visualizacion, importacion, exportacion y creacion de informes resumen personalizables; Configuracion del sistema (“ajuste”) incluyendo autorizacion de usuario, analisis de conjunto de entrenamiento y enmascaramiento de sonda; Analisis de patrones incluyendo coincidencia de cadenas e inversion de sonda; y Redaccion interactiva que combina calculos de bases de datos en tiempo real y edicion de “corta y pega”, generando declaraciones de “advertencia” y anotacion de soporte.

Umbralizacion - Metodos de seleccion y refino de umbrales tal como se divulga, incluyendo una generalizacion de la representacion binaria obtenida segregando distribuciones de intensidad de sonda en tres o mas subpoblaciones.

Determinacion de umbral inicial- Tambien se divulga un metodo de ajuste de umbrales por medio del analisis de un conjunto de referencia (“entrenamiento”) y seleccionando, para cada sonda en un conjunto de sondas seleccionado, un umbral que maximiza el grado de concordancia de los resultados de ensayo y los alelos asignados con los proporcionados para el conjunto de entrenamiento. El metodo de determinacion de los ajustes de umbral iniciales tambien proporciona una cifra de merito (“bondad”) como metodo de base de evaluar la robustez de ese umbral: Un metodo relacionado de determinacion de umbral inicial divulgado en el presente documento aplica un algoritmo de binarizacion a perfiles de intensidad de sonda individuales. Refinamiento de umbral: Coincidencia de patrones- Se divulga un metodo de refino de patrones haciendo coincidir una cadena binaria experimental (“patron de reaccion”), producida mediante la aplicacion de ajustes de umbral iniciales, con un compendio de patrones de reaccion correspondientes a combinaciones de alelos validas. El sistema de software en el presente documento soporta un modo de alterar (“invertir”) bits espedficos dentro de la cadena (“palabra”) experimental. El programa identifica sondas, y combinaciones de sondas, como candidatas para “inversion” con el fin de producir la concordancia completa o parcial entre la “palabra” experimental modificada y la palabra o palabras mas cercanas, en el diccionario. La inversion de una sonda (para determinadas muestras en el conjunto que esta considerandose) corresponde a un refinamiento en el ajuste de umbral para esa sonda.

Enmascaramiento de sonda - Tambien se divulga una caractenstica de programa que soporta un modo de configuracion (“ajuste”) en el que sondas seleccionadas pueden excluirse temporalmente del analisis (“emascararse”). Tambien pueden enmascararse senales de ensayo producidas por sondas que no contribuyen significativamente a discriminar entre alelos (o que puede considerarse que producen patrones de intensidad de baja fiabilidad) cuando se analizan los resultados, y entonces visualizarse solo si su contribucion se considera necesaria.

Datos estad^sticos de frecuencia de alelos - En otro aspecto, el sistema de software proporciona un metodo para realizar un seguimiento y presentar la frecuencia relativa de aparicion de grupos de alelos (y combinaciones de los mismos).

“Redaccion” interactiva - El sistema de software proporciona un entorno integrado para facilitar el acceso simultaneo a los datos que estan analizandose y a bases de datos y tablas de resultados positivos que estan consultandose, por ejemplo en el transcurso de la redaccion. Se proporcionan operaciones de “cortar y pegar” en multiples pantallas para permitir la edicion rapida y conveniente de asignaciones automatizadas (“programa”) incluyendo una funcion de anotacion.

Pruebas de confirmacion para resolucion de ambiguedad - El programa tambien alberga informacion adicional que ayuda a la resolucion de ambiguedades por medio de amplificacion espedfica de grupo o por medio del uso de analisis de polimorfismos mediado por elongacion (vease “Multiplexed Analysis of Polimorphic Loci by Concurrent Interrogation and Enzyme-Mediated Detection” presentada el 15/10/2002; n.° de serie 10/271,602).

Analisis distribuido: Procesamiento, analisis, interpretacion, archivo - La arquitectura del sistema de software soporta un modo de analisis distribuido, que permite diferentes funciones tales como registro de imagenes de ensayo, analisis automatizado, redaccion interactiva y evaluacion y “aprobacion final” y generacion de informes que va a realizarse por diferentes individuos en diferentes ubicaciones geograficas. Este modo de analisis distribuido amplfa las capacidades de laboratorios de prueba individuales para ampliar sus menus de pruebas respectivos sin la necesidad de especializacion local relacionada con las muchas areas de especializacion distintas. Por ejemplo, pueden elegirse ubicaciones centrales de pruebas para facilitar la recogida de muestras de pacientes, mientras que medicos acreditados pueden revisar y liberar resultados de prueba finales desde una ubicacion diferente, a la vez que sirven a multiples centros de prueba.

Tambien se divulga un metodo y pseudocodigo para el analisis de alelos completamente automatizado, que se expone a continuacion.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1A ilustra un conjunto de intensidades de senal de ensayo registradas para la sonda HA109 en el analisis de un conjunto de entrenamiento de muestras. Mediante un metodo independiente, la intensidad de sonda

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normalizada se puntuo negativa para muestras marcadas “-” y positiva para muestras marcadas “+”.

La figura 1B muestra una determinacion de umbral para una sonda en un conjunto entrenamiento de sondas, donde el valor de umbral se representa en el eje X, y la medicion de umbral se representa sobre el eje Y. El umbral optimo produce la medicion maxima en Y, que es 1 en este caso.

La figura 1C muestra los ajustes del sistema para varias sondas de HLA diferentes. La tolerancia de asignacion de alelos (vease la figura 2) se introduce en los recuadros de texto. Para HLA-A se permite un maximo de 6 inversiones; para HLA-B 8 inversiones; y HLA-DR 5 inversiones. A cada sonda puede asignarse segun se requiera, alta confianza, baja confianza o no usarse. El conjunto de sondas central (vease la figura 3) consiste solo en las sondas de alta confianza, mientras que el conjunto de sondas expandido incluye las sondas de alta y baja confianza. Mediante el cambio de estos ajustes, puede cambiarse interactivamente el conjunto central y el conjunto expandido. Por ejemplo, HA120 puede ajustarse como alta confianza y HA121 como baja confianza.

Las figuras 2A a 2C muestran, respectivamente, la intensidad normalizada (“proporcion”) para las sondas HB103, HB123A, HB154, ordenadas en orden de proporcion creciente para ilustrar una discontinuidad en el perfil de proporcion de sondas. HB103 (figura 2A) tiene la mayor diferencia en el perfil de proporcion. HB123A (figura 2B) no tiene un salto obvio en el perfil. HB154 (figura 2C) tiene dos saltos en el perfil. En el patron de reaccion, 8 indica positivo, 1 indica negativo (sin senal) y 0 indica que la sonda no se usa.

La figura 3 es un ejemplo de asignacion de alelos, donde el patron de reaccion se muestra en la primera fila, oscilando entre 0 y 8, y la cadena de hibridacion es el patron mostrado en las columnas. Las columnas 119, 121, 122, 135A, 142A y 145 son sondas de baja confianza. Puesto que solo hay una asignacion sugerida, el conjunto de sondas expandido esta vacfo.

La figura 4 es el patron de reaccion y la tabla de resultados positivos para una reaccion a modo de ejemplo entre sondas y una diana, que tambien muestra una captura de pantalla del programa para realizar redaccion manual, asignacion de alelos y un lugar para insertar comentarios.

La figura 5 es un grafico de barras para la distribucion de la frecuencia de alelos de una poblacion particular.

La figura 6 es un grafico de barras que muestra la comparacion entre estudios de genotipado notificados de una distribucion de alelos en una poblacion “judfa normal”, y los resultados experimentales para tal poblacion.

La figura 7 es una captura de pantalla que ilustra la informacion resumen de asignaciones para un panel designado “03250443,” e incluye el nombre del panel, el nombre de la muestra, la posicion de la muestra, la asignacion de alelos, las sondas de inversion, mensaje de advertencia y comentarios.

La figura 8A es un perfil de proporcion de sondas.

La figura 8B es la derivada numerica que muestra los puntos de inflexion derivados de la figura 8A.

Descripcion detallada

Tras el registro de un patron de intensidad de senales de ensayo para una muestra dada, se realiza una secuencia de etapas analfticas para identificar la combinacion de alelos correspondiente.

2.1 Conversion de patrones de intensidad de ensayo en cadenas binarias

Intensidades de senal de ensayo normalizadas: Perfiles de intensidad de sonda - Determinados metodos para sondar polimorfismos dentro de un acido nucleico diana tales como el analisis de polimorfismos mediado por elongacion (eMAP™, tambien denominado en el presente documento “elongacion mediada por captura”), divulgado en la solicitud de patente estadounidense en tramitacion junto con la presente con n.° de serie 10/271.602 (PCT/US02/33012) producen senales de ensayo que se basan en un proceso de reconocimiento molecular cuya alta especificidad produce una distribucion de senales de ensayo aproximadamente “binaria”. En cambio, metodos tales como el analisis de polimorfismos multiplexado mediado por hibridacion (hMAP™, solicitud de patente estadounidense con n.° de serie 10/847.046) producen intensidades de senal de ensayo que reflejan la afinidad eficaz que rige la interaccion de cada sonda en un conjunto de tales sondas multiples con la diana. Para corregir variaciones en el trasfondo, en la concentracion de la diana original o en otras condiciones experimentales, se normalizan las interacciones sonda-diana que registran intensidades de senal experimentales usando senales registradas a partir de sondas de control positivas y negativas (y pares sonda-diana) incluidas en la reaccion.

A partir de cada intensidad de senal, habitualmente se resta el valor medio, Ik, para el tipo k° de sonda que incluye la senal de control positiva, Ipc, y la senal de control negativa, Inc, y el resultado se divide entre la senal de control positiva corregida para obtener una intensidad normalizada (proporcion):

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r - (I - Inc) / (Ipc - Inc)

Para facilitar una evaluacion del rendimiento de cualquier sonda dada en el panel, se construye un perfil de intensidad de sonda, tambien denominado en el presente documento perfil de proporcion, ordenando los valores de r registrados para esa sonda a lo largo de un conjunto de muestras, normalmente 100 muestras, por ejemplo, en orden ascendente. Ejemplos de tales perfiles se muestran en las figuras 2A-2C, donde la figura 2A ilustra un perfil que presenta una transicion brusca de gran amplitud desde valores de r inferiores hasta superiores, mientras que la figura 2B ilustra un perfil que presenta una transicion gradual de amplitud pequena.

Para metodos tales como hMAP, las intensidades de senal normalizadas se convierten primero en una representacion binaria: si r supera un umbral ajustado previamente, T, la puntuacion binaria correspondiente es positiva, s - 1 (tambien indicada en el presente documento como “8”), de lo contrario es negativa, s - -1 (tambien indicada en el presente documento como “1”). En las subsecciones siguientes se divulgan metodos de implementacion de esta etapa cntica de procesamiento de senales.

2.2 Determinacion de umbrales: Binarizacion - Se divulga un algoritmo para la determinacion y el refinamiento iterativo de ajustes de umbral de binarizacion. Al igual que para la etapa analoga en el analisis de imagenes de convertir intensidades de pfxeles en escala de grises en una representacion “en blanco y negro”, la binarizacion asigna intensidades de senal de ensayo normalizadas a uno de dos subconjuntos. Esto no resulta problematico siempre que la distribucion de intensidades de senal normalizadas para un conjunto de muestras en consideracion tenga una forma bimodal que presente picos bien separados: entonces puede situarse un umbral casi en cualquier parte entre los dos picos sin afectar al resultado; la figura 2A corresponde a un histograma bimodal. Sin embargo, en otros casos, cuando los picos separados no estan claramente resueltos, la binarizacion presenta una fuente de incertidumbre o error potencial: la asignacion de valores de intensidad espedficos a uno u otro subconjunto dependera de manera sensible de la colocacion precisa del umbral; la figura 2B corresponde a un caso de este tipo.

Ajustes de umbral iniciales: Analisis de conjuntos de “entrenamiento” - Los ajustes de umbral iniciales pueden basarse en el analisis de una referencia o “conjunto de entrenamiento”. Preferiblemente, las muestras de referencia se eligen para reflejar caractensticas del grupo de muestras de interes; por ejemplo la frecuencia predominante de aparicion de combinaciones de alelos y haplotipos. Tal informacion puede proporcionar restricciones adicionales sobre asignaciones de alelos probables. A continuacion se elaboran metodos de recogida y analisis estadfstico automatizados de los datos estadfsticos de la poblacion de muestra.

Se analiza un conjunto de referencia (“entrenamiento”) de S muestras, con patron de reaccion de referencia determinado y validado de manera independiente {ok, 1 k Pt}, y asignaciones de alelos determinadas y validadas de manera independiente, con un conjunto seleccionado de sondas P, para obtener el patron de intensidad normalizada (proporcion) {rk; 1 k P} y, para cada sonda, k, en el conjunto seleccionado (vease tambien a continuacion), se determina un umbral, Tk, para maximizar la concordancia entre el patron de reaccion real, sk - sk(7"), y el patron de referencia {ok, 1 k Pt}.

Es decir, para cada sonda en el conjunto real, se determina un umbral para cada sonda mediante el analisis del perfil de intensidad normalizado a lo largo del conjunto de entrenamiento de S muestras para maximizar la correlacion cruzada C - Hi ((r - Tk) * oi) /Hi |(r - Tk)|, 1 i S. A su vez, para cada sonda, para encontrar el maximo de la funcion C, el ajuste de umbral, Tk, se aumenta gradualmente hasta que el signo de la cantidad r - Tk coincide con el del bit correspondiente, oi, en el patron de referencia. Para las sondas usadas en el ensayo, pero no en el estudio del conjunto de entrenamiento, se “retrocalcula” un patron de reaccion a partir de la tabla de resultados positivos usando los alelos asignados. La figura 1B ilustra la forma de la funcion C - C(T), rmin T rmax. El ajuste de umbral se elige para maximizar la funcion C.

El pseudocodigo para determinar el ajuste de umbral inicial es el siguiente:

/*

** p es el patron de intensidad normalizada (“proporcion") para una muestra dada; la binarizacion convertira ** cada patron de intensidad en un patron de reaccion compuesto por P bits; habra ** S de tales patrones:

** 7res el conjunto de perfiles de sonda; habra P de tales perfiles, cada uno con un umbral T;

** res el conjunto de umbrales optimos (iniciales), que va a determinarse mediante la maximizacion de C;

*/

Generar perfiles de sonda p S, k P) /* ordenar los patrones de reaccion

por sonda */

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PARA (cada sonda)

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Extraer Intensidad (de los patrones de reaccion)

Ordenar intensidades de sonda();

}

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**maximizar C = Si ((r - Tk) * o) /S \(r - Tk)\

** ri indica los elementos del perfil de proporcion R */ */

Encontrar umbral (R, S S) {

Cmax =

T = rmtn,

DO

{

SI ((C = Si ((n -T) * o) /Si \(r, - T)\) > Cmax) Cmax = C; T = T+ AT;

} MIENTRAS QUE (T <= rmax);

Volver (T);

}

Determinar umbrales iniciales()

{

Generar perfiles de sonda (p, S, k P) PARA (cada perfil de proporcion P, k)

{

Tk = Encontrar umbral (k, Sk, S)

}

Volver (T)

}

“Bondad” de los ajustes de umbral - Los ajustes de umbral pueden ser robustos para algunas sondas, pero menos robustos para otras sondas en el conjunto. Es dedr, cuando la composicion de las dos subpoblaciones de muestras, generada por la aplicacion de un umbral T al perfil de intensidad de sonda cambia en respuesta a un pequeno cambio en el valor T aT + AT oT - AT, donde AT /T << 1, entonces ese umbral no es robusto y la confianza estadfstica es baja.

Para permitir la colocacion de intervalos de confianza en ajustes de umbral individuales tambien se divulga en el presente documento un factor de merito (“bondad de umbral”). Esto se deriva de la forma del pico de la funcion C = C(T), producida en el transcurso de maximizar la correlacion cruzada con un conjunto de asignaciones para un conjunto de entrenamiento. Cuanto mas pronunciado es el pico en la funcion, mas sensible es el valor seleccionado de T para pequenas variaciones en T, tal como se ilustra en la figura 1B.

Una “bondad”, G, de un umbral seleccionado mediante el metodo de maximizacion de la correlacion cruzada, C, tal como acaba de describirse, se define tal como sigue:

G = (Cl + Cr) / 2CMax,

en la que Cmsx, Cl y Cr, respectivamente, indican el valor maximo de C, Cl el valor de C obtenido cuando se disminuye el valor de umbral en un 30% y Cr el valor de C obtenido cuando se aumenta el valor de umbral en un 30%.

Pesos - Una vez que se ha determinado un umbral, T, puede reformularse el perfil de intensidad de sonda, {ri, 1 i S} de forma en escala, Wi = (ri - T)/T, en la que los pesos, Wi, representan la magnitud relativa de intensidades de senal individuales (normalizadas). El sistema de software descrito en el presente documento (designado “AAA”) realiza un seguimiento de pesos y los presenta en uno de varios formatos, por ejemplo, mediante una simple clasificacion en “Cerrado” (“C”, w 0,5) o “Distante” (“D”) en relacion con “inversion” de bits, tal como se comenta adicionalmente a continuacion.

2.3 Coincidencia de cadenas: Correlaciones dentro de patrones de interaccion sonda-diana

El analisis de patrones de intensidad experimentales se dirige a identificar, o identificar aproximadamente, el/los alelo(s) diana subyacentes. Para este fin, se binarizan patrones de intensidad mediante la aplicacion de un conjunto de umbrales, y la cadena binaria resultante (“patron de reaccion”) se compara con combinaciones de pares de tales cadenas correspondientes a alelos conocidos enumerados en una “tabla de resultados positivos.” Cada entrada en una “tabla de resultados positivos” representa un alelo valido y proporciona una secuencia binaria en la que cada posicion contiene una puntuacion de “Coincidencia” o “Sin coincidencia” que hace referencia al grado de complementariedad del alelo con la sonda en esa posicion (vease la figura 3A). Los alelos se designan mediante codigos de 4 dfgitos y se agrupan mediante los 2 dfgitos principales en grupos de antfgenos.

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Correccion de errores mediante coincidencia de cadenas: “Inversiones" - Para identificar los alelos diana, se compara el patron de reaccion binario, {sk, l k P}, bit por bit, con todas las cadenas de referencia que representan combinaciones de 2 alelos; estas se generan mediante la aplicacion de una operacion O en las entradas de la tabla de resultados positivos. La coincidencia de cadenas de bits completas refuerza las correlaciones y permite un metodo de “correccion de errores” dando la vuelta (“invirtiendo”) bits individuales en la cadena segun se considere necesario con el fin de producir una coincidencia con una cadena de referencia valida. Este proceso es parecido a comprobar errores topograficos para reducir palabras validas; cambiando la letra “t” en “valit” por “d”, se obtiene una palabra valida en ingles; se obtiene otras palabra valida en ingles cambiando “i” por “u” y “t” por “u”, pero “valit” esta mas “proxima” a “valid” que a “value”, y por tanto es mas probable que la primera represente la palabra deseada.

De manera analoga, el programa AAA esta disenado para encontrar cadenas de bits validas mas proximas (“palabras”) que representen alelos validos, tal como se identifica, por ejemplo, en una base de datos que puede introducirse en el programa AAA. El programa AAA enumera las cadenas validas “mas proximas”, agrupadas mediante codigos de “grupos” de 2 dfgitos comunes, en el orden de distancia de Hamming creciente (es decir, el numero de bits sin coincidencia) para la cadena experimental. Espedficamente, el programa identifica los bits sin coincidencia y sugiere las “inversiones” necesarias, concretamente “de 1 a 8” o “de 8 a 1,” lo que producina una coincidencia completa entre la cadena experimental y las cadenas validas adicionales dentro de una distancia de Hamming maxima ajustada previamente.

El programa AAA tambien permite una busqueda mas profunda del espacio de cadenas de referencia con el fin de producir una lista de “casi coincidencias” (vease el menu desplegable ilustrado en la figura 4). Este analisis ampliado frecuentemente revela posibles cadenas alternativas que representan asignaciones de alelos mas probables basandose en consideraciones adicionales tales como la frecuencia de aparicion de determinados alelos o haplotipos en la poblacion de interes. Esta caractenstica reduce sustancialmente el tiempo y el esfuerzo invertidos en la edicion interactiva.

Distancia entre cadenas - Dentro de cada grupo, las cadenas correspondientes a combinaciones de alelos validas se ordenan en el orden de distancia de Hamming ponderada creciente a partir del patron de reaccion. Esta funcion de distancia se define en terminos de los pesos, Wi = r - T)/T, asociados con las sondas sin coincidencia. Por ejemplo, suponiendo que hay M sin coincidencia, una posible funcion de distancia es:

X2

(1/M)Z

sondas sin coincidencia

W2

2.4 Refinamiento de umbral iterativo

De manera ideal, el procedimiento de coincidencia de cadenas que acaba de describirse producira una coincidencia inequvoca entre el patron de reaccion y una cadena que representa una combinacion de alelos valida. Sin embargo, aun cuando se denomine una coincidencia perfecta, esta denominacion puede no ser inequvoca si implica bajos pesos para una o mas de las sondas. Es decir, en la practica, el patron de reaccion puede contener falsos negativos o falsos positivos, dependiendo del ajuste de umbral para sondas individuales y los pesos de intensidades normalizadas. Especialmente la confianza estadfstica asociada con ajustes de umbral de sondas que tienen perfiles de proporcion continuos para el conjunto de muestras que esta considerandose sera baja, y por tanto resulta beneficioso tener un proceso de ajuste (“ajuste fino”) de tales ajustes de umbral.

El procedimiento de coincidencia de cadenas proporciona una base para el refinamiento de los umbrales iniciales. Despues de todo, invertir una sonda es equivalente a ajustar el umbral correspondiente para cambiar el signo de la proporcion normalizada en relacion con el ajuste de umbral. Es decir, si tras un paso inicial de asignacion de alelos automatizada para un conjunto de muestras, una determinada sonda se “disminuye” de manera sistematica, o bien como falso positivo o bien como falso negativo, esto es una indicacion de que esta vigente un refinamiento de umbral para esa sonda. Por consiguiente, la optimizacion de umbral implica un proceso iterativo de ajustar los ajustes de umbral de una o mas sondas “disminuidas” para minimizar el numero total de inversiones identificadas por el programa AAA. Dado que este proceso de optimizacion de umbral se basa en coincidencia de cadenas, en lugar de en la inspeccion de perfiles de razon de sonda individuales, como en la etapa de ajuste de umbrales iniciales, la optimizacion de umbral refleja las correlaciones entre multiples sondas en el conjunto y mejora la confianza estadfstica. El refinamiento de umbral puede realizarse de manera continua usando muestras analizadas como un conjunto de referencia que se expande de manera continua. En esta aplicacion, cada nuevo conjunto de muestras se convierte en un nuevo conjunto de entrenamiento.

En general, el numero de inversiones incluso tras la optimizacion de umbral permanecera finito. En tales casos, deben tenerse en cuenta los pesos asociados con las inversiones indicadas. El programa AAA designa de manera conveniente proporciones de “inversiones” o bien como “Proxima” (C, r 0,5) al umbral, o bien como “Distante” (D) del umbral. El punto de corte representa un parametro de rendimiento ajustable que puede ajustarse de manera mas o menos conservativa, implicando generalmente un ajuste mas conservativo un mayor grado de revision y edicion interactiva, tal como se comenta en mayor detalle a continuacion. Una necesidad de invertir sondas “distantes”, es decir aquellas que tienen un gran peso, con el fin de obtener una coincidencia representa una indicacion de que

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puede estar disponible un nuevo alelo.

El pseudocodigo a continuacion resume el procedimiento de refinamiento de umbral tal como se implementa en el sistema de software AAA de la invencion.

/* calcular la asignacion de alelos para una lista de muestras, entonces /*identificary analizar las sondas invertidas para esa lista

Calcular asignacion (listas de muestras);

Obtener inversiones (listas de muestras);

Analizar inversiones();

/* Seleccionar sondas que requieren refinamiento de umbral Conjunto de sondas = Seleccionar sondas();

/* para cada sonda, encontrar el umbral optimo minimizando el numero de inversiones PARA cada (sonda en el conjunto de sondas)

{

To = Obtener el umbral inicial (sonda);

PARA (T = To-intervalo; T<=To+intervalo; T+=delta T)

umbral

{

Volver a calcular la asignacion (listas de muestras);

Inversiones totales = Analizar inversiones() /* volver a analizar

las sondas invertidas y obtener el numero de inversiones totales

}

Encontrar las inversiones totales m^n.Q; /* encontrar inversiones

totales mm.

totales

/* obtener el umbral inicial /* ajustar

/* el nuevo umbral sera el que minimiza las inversiones totales Tnuevo = Obtener nuevo umbral (sonda);

}

A continuacion se exponen caractensticas adicionales incluidas en el sistema de software AAA.

Modificacion de conjuntos de sondas - Un patron de reaccion binario particular puede coincidir con mas de un alelo, y a menudo lo hara si la cadena de bits tiene solo algunos elementos (“8s” y “1s”) y la diana incluye multiples regiones polimorficas. El grado de ambiguedad se calcula enumerando simplemente el numero de alelos no resueltos (“degenerados”). El alargamiento de la cadena, mediante la inclusion de sondas adicionales, puede proporcionar un medio para lograr la resolucion aumentada con el fin de resolver ambiguedades.

Enmascaramiento de sonda: Conjuntos de sondas central y expandido - A continuacion se describe un metodo para la designacion interactiva de conjuntos centrales y conjuntos expandidos de sondas, junto con una caractenstica de “enmascaramiento de sonda”, que puede usarse para corregir senales de aquellas sondas que no funcionan tan bien como otras. En el enmascaramiento de sondas se ignoran los resultados de aquellas sondas que se hibridan con una amplia variedad de muestras, en lugar de solo con muestras particulares con alelos particulares. Un nivel tan amplio de hibridacion puede resultar de hibridacion cruzada o de sondas que seleccionan como diana subsecuencias que se expresan ampliamente.

El sistema de software AAA proporciona una pantalla de configuracion (“ajuste”) que permite al usuario designar sondas dentro de un panel para formar parte de un conjunto central o un conjunto expandido. La funcion de enmascaramiento de sonda induce a los usuarios a introducir una lista de sondas que han de ignorarse (“enmascaradas”) en el primer paso de la asignacion de alelos automatizada (es decir, el programa calcula primero las asignaciones basandose en un conjunto de sondas central que se hibridan mas estrechamente. El objetivo de usar el conjunto central es obtener una asignacion de nivel de grupo para alelos (es decir, un grupo de varios alelos posibles) que usan sondas que proporcionan discriminacion de nivel de grupo con un alto nivel de confianza.

En el modo de enmascaramiento de sonda, el programa AAA realiza en primer lugar asignaciones de nivel de grupo usando solo el conjunto de sondas central. En un segundo paso (opcional), la asignacion puede refinarse repitiendo el calculo con el conjunto extendido que contiene todas las sondas en el conjunto central, asf como las sondas menos fiables restantes. El segundo paso producira asignaciones adicionales que siguen siendo compatibles con las

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asignaciones realizadas en el primer paso. El programa tambien realiza este segundo paso siempre que el primer paso no produzca una asignacion de nivel de grupo unica.

El conjunto extendido es util para guiar la “redaccion” y permite que el usuario seleccione la asignacion de alelos mas probable. En algunos casos, puede ser necesario generar y usar la version complementaria (por ejemplo, antisentido) de una o mas sondas (y los transcritos y amplicones correspondientes) para evitar hibridacion cruzada excesiva. En tales casos, las sondas no complementarias se excluyen entonces de los pasos primero y/o segundo.

Datos estad^sticos de la poblacion: Analisis de distribucion de la frecuencia de alelos - La tasa de recurrencia de cada alelo depende de la poblacion sobre la que esta realizandose la tipificacion de HLA. Para un panel que contiene un gran numero de muestras, la aparicion de un alelo particular es representativa de su abundancia o excepcionalidad en toda la poblacion de interes. Puede calcularse la distribucion de alelos en una poblacion de etnia conocida para un panel.

Se usaron los resultados para un conjunto de paneles del programa de base de datos AAA para calcular la frecuencia de alelos. El programa asigna a cada muestra un conjunto de dos alelos basandose en su patron de reaccion a lo largo de todo el conjunto de sondas. Los calculos de frecuencia se basan en asignaciones de alelos de dos dfgitos. Los dos primeros dfgitos de las asignaciones de alelos para todas muestras se extraen y se compilan en un unico vector. Se calcula un histograma que enumera cada alelo con el numero de veces que se encuentra en el panel (su recuento). Se calcula la frecuencia cuando el recuento se normaliza por el numero total de asignaciones.

Un objetivo de realizar un seguimiento de los datos estadfsticos de la frecuencia de alelos, tal como se implementa en el programa, es proporcionar ayudas de edicion, tales como indicaciones de advertencia siempre que se identifica un alelo poco frecuente. Esto ayudara en el caso de asignaciones degeneradas, donde es posible mas de una unica asignacion. En tales casos, pueden eliminarse manualmente aquellas asignaciones que implican alelos poco frecuentes. En el caso de asignaciones individuales, una indicacion de este tipo de alelos poco frecuentes garantiza que las asignaciones se comprueban manualmente, y o bien se verifican o bien se invierten.

“Redaccion” interactiva - Tras las asignaciones de alelos automatizadas usando el programa y los metodos descritos anteriormente, las supuestas asignaciones pueden “editarse” frente a o bien una base de datos de alelos que indica alelos conocidos, o bien mediante una combinacion de datos experimentales para alelos (que forma un conjunto de referencia que se expande continuamente) y una base de datos de alelos. Una ilustracion de las etapas clave se facilita en un ejemplo.

Los pesos representan una medida de confianza en el bit asignado a cualquier intensidad de sonda dada: es menos probable que los bits se asignen incorrectamente y por tanto es menos probable que se ejecuten las inversiones, cuanto mayor sea el peso de una senal de intensidad de sonda espedfica (o una funcion adecuada basandose en esos pesos). Por tanto, los pesos pueden ayudar a guiar la redaccion interactiva.

Se dispone de otra grna en forma de frecuencias de alelos en toda la poblacion, o en una subpoblacion que esta monitorizandose. De nuevo, las muestras analizadas forman una base de datos de referencia en expansion continua, que se anaden al conjunto de entrenamiento cuyas frecuencias de alelos (y haplotipo) se adaptan en tiempo real.

Deteccion de nuevos alelos - Pueden indicarse nuevos alelos mediante dianas que producen patrones de reaccion binarios que pueden hacerse coincidir con cadenas de referencia existentes que representan combinaciones de alelos conocidos solo invirtiendo sondas que tienen pesos significativos. Esto se comenta en mayor detalle en el ejemplo I (Asignacion de alelos) a continuacion.

Generalizacion de representacion binaria - El programa AAA tambien alberga representaciones de patrones de intensidad distintos de la representacion binaria y las cadenas binarias correspondientes (“palabras”).

Alfabeto de tres letras y tablas de resultados positivos - Como generalizacion inmediata, deben considerarse representaciones que recurren a un alfabeto de tres o mas letras. Una representacion de tres letras de este tipo surge de manera natural cuando se proporciona un par sondas degeneradas para uno o mas de los sitios diana polimorficos designados. Por ejemplo, en un enfoque nuevo que recurre al formato de analisis de polimorfismos multiplexados mediado por elongacion (eMAP) para analizar mutaciones en un conjunto de genes que codifican para antfgenos de grupo sangumeo humano, se proporciona un par de sondas de elongacion degeneradas para cada uno de los sitios variables designados. Los miembros del par difieren en o cerca de sus extremos 3' terminales, estando designado un miembro para coincidir con el alelo diana normal esperado, estando designado el otro miembro para coincidir con el alelo variante esperado. Solo se elonga la sonda de elongacion que coincide con la diana de manera que se produce una senal de ensayo correspondiente asociada con los productos de elongacion (vease la solicitud estadounidense con n.° de serie 10/271.602). Es decir, eMAP produce uno de tres valores posibles en cada sitio polimorfico designado, concretamente normal, variante (mutante “homocigoto”), o heterocigoto.

La representacion refleja los tres posibles desenlaces de la determinacion de eMAP en cada sitio designado,

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concretamente:

- sonda normal con coincidencia, sonda variante sin coincidencia: normal - indicado mediante 1

- sonda normal sin coincidencia, sonda variante con coincidencia: variante - indicado mediante -1

- sonda normal con coincidencia, sonda variante con coincidencia: heterocigoto - indicado mediante 0

Esto refleja las posibles combinaciones de los alelos subyacentes, concretamente AA (normal o “de tipo natural”), BB (variante, homocigoto) y AB o BA (heterocigoto). Una tabla de resultados positivos para los sitios de interes estara compuesta por codigos de letras que se combinan mediante normas ya expuestas.

El ejemplo III ilustra el uso de un alfabeto de 3 letras (1, 0, -1) para representar combinaciones bialelicas observadas.

Umbrales superior e inferior - Una representacion de tres letras tambien surge, de manera analoga, en relacion con la introduccion de un umbral superior y uno inferior. Para cada sonda que esta considerandose, un ensayo intensidad de senal por debajo del umbral inferior corresponde a una ausencia de coincidencia con ambos alelos diana, un ensayo intensidad de senal por encima del umbral inferior, pero por debajo del umbral superior, corresponde a una coincidencia con un alelo pero no con el otro, y un ensayo intensidad de senal por encima del umbral superior corresponde a una coincidencia con ambos alelos.

Las designacion de bits negativos y positivos puede realizarse con confianza aumentada si se definen dos umbrales, que segregan intensidades de ensayo normalizadas registradas para cualquier sonda dada en tres subpoblaciones. Las tres subpoblaciones senan aquellas para las que: (i) una sonda dada presenta ausencia de coincidencia con ambos alelos asignados (1,1), (ii) una sonda coincide con un alelo (1, 8; 8, 1) y (iii) una sonda coincide con ambos alelos (8, 8).

Debido a la posible existencia del segundo (8, 8) umbral, sena posible establecer un umbral para una sonda particular de manera incorrecta; es decir, el umbral para una sonda (8, 8) diferente de una sonda (8, 1), podna identificarse de manera incorrecta como el umbral para una sonda (8, 1) diferente de una sonda (1, 1). Las designaciones de umbral incorrectas de este tipo pueden detectarse y corregirse mediante el refinamiento y la expansion continuados del conjunto de entrenamiento, y/o comprobando de manera doble las asignaciones de alelos frente a referencias de la base de datos de alelos conocidos y garantizando la coherencia.

Otra situacion en la que han de considerarse las necesidades, es que las intensidades de ensayo normalizadas registradas para cualquier sonda dada que estan por encima del segundo umbral (superior), podnan deberse a la reaccion con la subsecuencia diana designada en ambos alelos (indicando un homocigoto) o podnan deberse a la reaccion con dos alelos independientes, que de manera coincidente, son reactivos con esa sonda. De nuevo, esta situacion puede detectarse y corregirse mediante el refinamiento y la expansion continuados del conjunto de entrenamiento, y/o comprobando de manera doble las asignaciones de alelos frente a referencias de la base de datos de alelos conocidos.

En la determinacion de la ubicacion de umbrales, cuando hay mas de un umbral para una sonda particular, puede examinarse la proporcion de perfiles de intensidad (tal como se muestra en las figuras 2A a 2C; veanse tambien las figuras 8A y 8B). Pero si no hay inflexion pronunciada en el perfil, tal como se ilustra claramente en la figura 2B, pueden localizarse los puntos de inflexion, y por tanto los umbrales, adoptando la derivada numerica usando un filtro de desconvolucion. Los resultados de adoptar la derivada numerica de esta manera se muestran en la figura 8A, que es un perfil de proporcion, y en la figura 8B, que es la derivada numerica que muestra los puntos de inflexion derivados de la figura 8A.

Digitalizacion de patrones analogos - Tambien pueden digitalizarse intensidades normalizadas, en lugar de binarizarse, con cualquier grado deseable de precision superior a la permitida por la binarizacion. Por ejemplo, en lugar de dos subpoblaciones, podna escogerse segregar intensidades en ocho subpoblaciones o 16 subpoblaciones. Inherente a esta representacion es la informacion representada en forma de pesos en la representacion binaria comentada anteriormente en el presente documento. Cada intensidad normalizada digitalizada representa de hecho una medida de la coafinidad de una interaccion sonda-diana particular (vease la solicitud estadounidense n.° 10/204.799 “Multianalyte Molecular Analysis”; documento WO 01/98765). Se comparan patrones de reaccion digitalizados experimentales y patrones digitalizados de referencia por medio del calculo de correlaciones cruzadas usando metodos convencionales.

Acceso a distancia para multiples usuarios, servidor de aplicaciones - el uso de un programa tambien permite el establecimiento de una red para permitir el analisis, la redaccion y la notificacion a distancia de los resultados de asignacion de alelos. Por ejemplo, puede accederse a una base de datos que forma parte del entorno de software AAA a traves de una conexion de red segura. El programa AAA tambien soporta un modo de servicio de aplicacion que permite la edicion interactiva desde una ubicacion distinta de la ubicacion del laboratorio experimental.

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Realizacion preferida de analisis multiplexado: Deteccion de matrices codificadas al azar - En un formato de analisis multiplexado, las sondas de deteccion se presentan en micropartfculas codificadas (“perlas”). Se asocian marcadores con las dianas. Las perlas codificadas unidas a las sondas en la matriz son preferiblemente fluorescentes y pueden distinguirse usando filtros que permiten la discriminacion entre diferentes tonos. Preferiblemente, se disponen conjuntos de perlas codificadas en forma de una matriz plana al azar sobre un sustrato plano, permitiendo de ese modo el examen y el analisis mediante microscopfa. Se monitoriza la intensidad de los marcadores diana para indicar la cantidad de diana unida por perla. Este formato de ensayo se explica en detalle adicional en la publicacion internacional n.° WO 01/98765 titulada: “Multianalyte molecular analysis”.

Se dispone de varios metodos de produccion de firmas opticas, por ejemplo mediante captura de dianas marcadas o mediante elongacion de sonda mediada por diana (eMAP), realizandose esta ultima preferiblemente usando oligonucleotidos espedficos de alelos inmovilizados que pueden actuar como cebadores de una reaccion de elongacion catalizada por polimerasa. (vease, por ejemplo, la publicacion internacional n.° WO 03/034029). Se producen una o mas dianas adecuadas, por ejemplo, mediante transcripcion inversa de ARN y/o amplificacion de ADN genomico, seguido opcionalmente por etapas adicionales tales como fragmentacion (vease la solicitud provisional estadounidense 60/515.413), desnaturalizacion o seleccion de cadenas (solicitud estadounidense con n.° de serie 10/847.046).

Posteriormente al registro de una imagen de decodificacion de la matriz de perlas, se expone la matriz a las dianas en condiciones que permiten la captura de sondas presentadas por partfculas. Tras un tiempo de reaccion adecuado, se lava la matriz de partfculas codificadas para retirar dianas restantes libres y debilmente apareadas. Entonces se obtiene una imagen del ensayo para registrar la senal optica de los complejos sonda-diana en la matriz (o para registrar la senal de las sondas alargadas, en el caso de elongacion mediada por captura en el formato de ensayo que esta usandose). Puesto que cada tipo de partfcula se asocia de manera unica con una sonda espedfica de secuencia, la etapa de descodificacion permite la identificacion de moleculas diana apareadas determinada a partir de la fluorescencia de cada tipo particular de partfcula.

Se usa un microscopio de fluorescencia para la descodificacion. Los conjuntos de filtro de fluorescencia en el descodificador estan disenados para distinguir la fluorescencia producida por colorantes de codificacion usados para tenir partfculas, mientras que otros conjuntos de filtro estan disenados para distinguir senales de ensayo producidas por los colorantes asociados con las dianas. Puede incorporarse una camara CCD en el sistema para el registro de imagenes de descodificacion y ensayo. La imagen del ensayo se analiza para determinar la identidad de cada una de las dianas capturadas correlacionando la distribucion espacial de las senales en la imagen del ensayo con la distribucion espacial de las partfculas codificadas correspondientes en la matriz.

En este formato de analisis multiplexado, existe una limitacion en el numero de tipos de sonda, porque el numero total de tipos de perla en la matriz esta limitado por el metodo de codificacion usado (por ejemplo, el numero de colores distinguibles disponibles) y por los lfmites de la instrumentacion usada para la interpretacion, por ejemplo, el tamano del campo en el microscopio usado para leer la matriz. Tambien debe considerarse, al seleccionar las sondas, que determinados tipos de sonda se hibridan mas eficazmente a su diana que otros, en las mismas condiciones. La eficacia de la hibridacion puede resultar afectada por varios factores incluyendo la interferencia entre sondas vecinas, la longitud de la sonda y la secuencia de la sonda, y, significativamente, por la temperatura a la que se realiza el apareamiento. Una eficacia de hibridacion baja puede dar como resultado una senal falsa negativa. Por consiguiente, un diseno de ensayo debe intentar corregir un apareamiento sonda/diana de poca eficacia de este tipo.

Una vez realizado un ensayo real, puede usarse el sistema de obtencion de imagenes de matriz (tal como se describe en la solicitud estadounidense con n.° de serie 10/714.203) para generar una imagen del ensayo, que puede usarse para determinar la intensidad de las senales de hibridacion de diversas perlas (sondas). La imagen del ensayo puede aplicarse entonces mediante un sistema para asignacion de alelos automatica, tal como se describe en el presente documento.

Ejemplos

I. Asignacion de alelos - A modo de ilustracion (vease tambien la “ilustracion de captura de pantalla” en la figura 3), AAA, usando el conjunto de sondas central de sondas, enumera dos asignaciones de alelos en grupo sugeridas, concretamente A*03 + A*29 y A*29 + A*74. Los dos grupos se ordenan en el orden de los pesos de las ondas invertidas. Cuanto menor es el peso, mayor es el orden de los grupos. Si el conjunto de sonda central produce asignaciones sugeridas degeneradas, como en este caso, el analisis se repite automaticamente usando el conjunto de sondas expandido. Este segundo paso produce una asignacion sugerida de A*03 + A*29 lo que requerina la inversion de HA120+, lo que indica que HA120 puede representar un falso positivo. El patron de reaccion y la tabla de resultados positivos (para alelos de HLA-A) tambien se presentan en la captura de pantalla. En el patron de reaccion, 8 indica que la sonda es positiva, 1 negativa y 0 significa que la sonda no se usa.

En el modo de redaccion manual, el usuario puede editar las asignaciones de alelos iniciales comprobando las referencias conocidas para los alelos identificados en los conjuntos central y expandido, y adaptando entonces las cadenas de bits a las esperadas a partir de los alelos conocidos. La verificacion de los resultados experimentales

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frente a alelos conocidos de esta manera proporciona una validacion de los resultados de ensayo, y un medio de editar la cadena de bits. El usuario escoge A*03011 y A*2901101 como asignacion, HA120 como sonda de inversion en un modo de redaccion manual en la figura 4.

EJEMPLO II: Datos estadfsticos de la frecuencia de alelos

Se examinaron 1155 usando un panel de HLA-A, y se analizaron los patrones de intensidad de muestra usando el programa AAA para obtener asignaciones de alelos en grupos de dos dfgitos. En la tabla 1 se muestran el recuento y la frecuencia relativa de aparicion de denominaciones de grupo calculadas por el programa AAA, inmediatamente a continuacion.

N.° de alelo

Recuento Frecuencia

01

332 0,144

02

448 0,194

03

251 0,109

11

139 0,060

23

86 0,037

24

260 0,113

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30 0,013

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203 0,088

29

87 0,038

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105 0,045

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46 0,020

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66 0,029

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86 0,037

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25 0,011

68

100 0,043

69

28 0,012

74

5 0,002

80

3 0,001

2310

El grafico de barras para la siguiente distribucion se muestra en la figura 1. Resulta evidente que los alelos 01, 02 y 03 son mucho mas abundantes en esta poblacion mientras que los alelos 36, 43 y 80 son comparativamente poco frecuentes.

EJEMPLO III. Captura de pantalla de informacion resumen de asignaciones

La captura de pantalla en la figura 3 ilustra la informacion resumen de asignaciones para el panel 03250443. Incluye el nombre del panel, el nombre de la muestra, la posicion de la muestra, la asignacion de alelos, las sondas de inversion, mensaje de advertencia y comentarios. La asignacion de alelos enumera la asignacion de nivel de alelos mediante un algoritmo informatico. Las inversiones y los mensajes de advertencia tambien se presentaran segun una asignacion informatica. Si hay redaccion manual, la asignacion de alelos se realizara segun la eleccion del redactor manual. Vease la figura 4 para una ilustracion de la redaccion manual. Tambien se presentan el comentario y las inversiones introducidas durante cualquier redaccion manual. Las sondas de inversion se insertaran en una cadena (manual) en el extremo, lo que indica que se genera mediante redaccion manual.

El software enumera los dos primeros dfgitos en la asignacion de alelos y los siguientes dfgitos, si es aplicable. Por ejemplo, A*24(020101) indica que la denominacion de dos dfgitos es A*24. La ventana de informacion resumen presenta toda la informacion vital en una ventana, lo que facilita examinar y navegar a traves de diferentes muestras.

EJEMPLO IV: Alfabeto de tres letras. TipiUcacion molecular de ant^genos de grupo sangumeo

En un conjunto de aproximadamente 500 muestras clmicas y controles, se identificaron varias combinaciones de alelos mediante un diseno de ensayo eMAP, disenado para sondar antfgenos de grupo sangumeo minoritarios incluyendo Duffy (FYA/FYB), GATA, Landsteiner-Weiner (LWA/LWB), Colton (CoA/CoB), Scianna (SC1/SC2), Diego (DIA/DIB) y Dombrock (DoA/DoB), comprendiendo este ultimo tres mutaciones. Vease la tabla 2 a continuacion.

TABLA 2 - Combinaciones de alelos observadas de antfgenos de grupo sangumeo humano minoritarios

ID de la

FYA/FYB GATA LWA/LWB CoA/CoB SC1/SC2 DIB/DIA DO-793 DO-624 DO-378

muestra

N21 BAS

-1 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1

N40 BAS

-1 0 1 1 1 1 -1 -1 -1

M17

0 0 1 1 1 1 -1 -1 -1

A10

-1 1 1 1 1 1 -1 -1 -1

A4

0 1 1 1 1 1 -1 -1 -1

A1

1 1 1 1 1 1 -1 -1 -1

N39 BAS

-1 -1 1 1 1 1 -1 -1 0

N71

-1 0 1 1 1 1 -1 -1 0

N62-BAS

0 0 1 1 1 1 -1 -1 0

N66-BAS

-1 -1 1 1 1 1 -1 -1 1

1

-1 0 1 1 1 1 -1 -1

1

N72

-1 1 1 1 1 1 -1 -1 1

M12

-1 1 1 1 1 1 -1 -1 1

16

-1 -1 1 1 1 1 0 0 -1

34

-1 0 1 1 1 1 0 0 -1

A21

-1 1 1 1 1 1 0 0 -1

N34 BAS

0 0 1 1 1 1 0 0 -1

A28

0 1 1 1 1 1 0 0 -1

A14

1 1 1 1 1 1 0 0 -1

N70

-1 -1 1 1 1 1 0 0 0

A6

0 1 1 1 1 1 0 0 0

A7

1 1 1 1 1 1 0 0 0

N78-BAS

-1 -1 1 1 1 1 0 0 1

2

-1 1 1 1 1 1 1 1 0

M23

0 1 1 1 1 1 1 1 0

U79

1 1 1 1 1 1 1 1 0

N35 BAS

-1 -1 1 1 1 1 1 1 1

N51

-1 0 1 1 1 1 1 1 1

A9

-1 1 1 1 1 1 1 1 1

26

-1 1 1 1 0 1 1 1 1

62

-1 1 1 1 1 1 1 1 1

N51-BAS

0 0 1 1 1 1 1 1 1

A25

0 1 1 1 1 1 1 1 1

N7 BAS

1 1 1 1 1 1 1 1 1

EJEMPLO V: Establecimiento de relaciones con enfermedades y estados

Tambien pueden usarse asignaciones de alelos determinadas por los metodos anteriores para establecer riesgo o 5 presencia de enfermedades o estados. Se conoce bien que determinados trastornos inmunitarios estan asociados con el locus de HLA. Si se conocen los alelos asociados pueden escribirse y si se desconocen pueden usarse los metodos descritos en el presente documento para establecer una base de datos de alelos para indicar el riesgo o la presencia de enfermedades o estados. La base de datos puede actualizarse de manera continua basandose en la monitorizacion de pacientes cuyas muestras se usaron en la base de datos; es decir, cuando se produce un 10 determinado desarrollo de la enfermedad, sus alelos pueden analizarse para determinar coincidencias con aquellos con una enfermedad o estado particular.

Debe entenderse que los terminos, expresiones y ejemplos en el presente documento son a modo de ejemplo y no limitativos, y que la invencion se define unicamente en las reivindicaciones que siguen, e incluye todos los 15 equivalentes del contenido de las reivindicaciones. Las etapas del metodo en las reivindicaciones no estan necesariamente en orden, y a menos que se especifique en la reivindicacion, pueden llevarse a cabo en cualquier orden, incluyendo el especificado en las reivindicaciones.

Claims (9)

1. 10

   15

   20
2. 2.

   25
3. 3.
4. 4. 30
5. 5.
6. 6. 35
7. 7.

   40 8.
8. 9.

   45
9. 10.

   50

   REIVINDICACIONES

   Metodo para asignaciones de alelos donde las asignaciones se realizan basandose en someter una muestra que incluye acido nucleico diana a un ensayo de hibridacion o ensayo de elongacion mediado por captura, o ambos, y donde se analizan varios marcadores polimorficos, presentes en alelos del acido nucleico diana, comprendiendo el metodo:

   determinar un patron de intensidad de senales de ensayo generado por interacciones sonda-diana para generar un patron de reaccion designando como positivas aquellas intensidades de senal que superan un umbral predeterminado y designando como negativas aquellas intensidades de senal que no superan el umbral predeterminado, binarizando de ese modo dicho patron de intensidad de senales de ensayo generado por interacciones sonda-diana donde cada una de dicha intensidad corresponde al numero de acontecimientos de hibridacion o elongacion correspondientes, segun sea aplicable;

   realizar asignaciones de alelos basandose en comparar y hacer coincidir dicho patron de reaccion con un patron de reaccion de referencia similar que representa combinaciones de dos o mas alelos de referencia, tal como se enumera en una coleccion de referencia de alelos para el acido nucleico diana en construccion;

   y designar, como nuevos alelos, los que tienen patrones de reaccion que difieren de patrones de reaccion de referencia que representan combinaciones de dos o mas alelos de referencia mediante una disparidad minima predeterminada.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicho patron de reaccion se edita basandose en la comparacion con el patron de reaccion de referencia.

   Metodo segun la reivindicacion 1, que incluye ademas la etapa de realizar asignaciones de alelos iniciales que luego se confirman o cambian tras dichas etapas de comparacion y coincidencia.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el patron de reaccion de referencia similar es el patron de reaccion de referencia mas similar.

   Metodo segun la reivindicacion 1 o 4, realizado mediante un sistema informatico de software.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el ensayo de hibridacion genera una senal de ensayo positiva cuando tiene lugar la hibridacion.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el ensayo de elongacion mediado por captura genera una senal de ensayo positiva cuando tiene lugar la elongacion.

   Metodo segun la reivindicacion 6, en el que el ensayo de elongacion mediado por captura genera una senal de ensayo positiva cuando tiene lugar la elongacion.

   Metodo segun la reivindicacion 1, que incluye ademas la etapa de restar de cada intensidad de senal, I, la senal de control negativa, Inc, y dividir el resultado entre la senal de control positiva corregida, Ipc - Inc, para obtener una intensidad normalizada (proporcion):

   r = (I - Inc) / (Ipc - Inc)

   Metodo segun la reivindicacion 1, que incluye ademas la etapa de seleccionar dicho umbral predeterminado para maximizar la similitud entre dicho patron de reaccion y un patron de reaccion de referencia.