PT1774323E - Análise automática de padrões de interacções sonda-alvo multiplex: correspondência de padrões e identificação de alelos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"ANÁLISE AUTOMÁTICA DE PADRÕES DE INTERACÇÕES SONDA-ALVO MULTIPLEX: CORRESPONDÊNCIA DE PADRÕES E IDENTIFICAÇÃO DE ALELOS"

Antecedentes

Padrões de interseção complexos como marcadores de diagnóstico - Os formatos de ensaios paralelos, permitindo a análise simultânea ("multiplex") de múltiplos loci genéticos numa única reacção, são adequados para a determinação de configurações de alvos específicos ("alelos") encontradas numa determinada amostra e para a monitorização de marcadores quantitativos, tais como níveis de expressão de determinados genes ou níveis de biomarcadores proteicos circulantes, que se manifestam em padrões de interaeção receptor-ligando. No que se segue, a referência a interac-ções sonda-alvo pretende referir-se a esta situação mais geral. Através da interrogação dos alvos com uma série seleccionada de sondas oligonucleotídicas (ver, e.g., Patente U.S. N° 5,837,832, intitulada "Arranjos de sondas de ácido nucleico em chips biológicos") e da análise de padrões de interaeções específicas de uma ou mais sequências alvo com aquela série de sondas, os alelos e combinações de alelos podem ser rapidamente identificados.

Esta capacidade diagnóstica provavelmente desempenhará um papel cada vez mais importante no estudo de doenças complexas tais como artrite, diabetes e cancro, incluindo a avaliação da predisposição para desenvolver uma doença tendo hereditariedade complexa e necessitando da interpretação de toda uma série de marcadores moleculares. No entanto, a análise dos resultados - na forma de um padrão de intensidade de leituras produzidas num ensaio multiplex reflectindo a força da interacção de um ou mais alvos com a série de sondas seleccionadas - enfrenta o grande desafio de interpretação do padrão de interacção através do seu mapeamento em combinações de alelos válidas ou através da avaliação da predisposição ou risco, enquanto também avalia a reprodutibilidade e "originalidade" da atribuição.

Modelo A: Tipagem molecular de HLA - A análise de polimorfismos no complexo de genes do Antigénio de Leucócitos Humanos (HLA) proporciona um modelo da complexidade envolvida na análise de associação a doença, servindo assim para delinear os requisitos a serem avaliados através de análise automática rápida e reprodutível. 0 complexo HLA compreende múltiplos loci altamente polimórficos que codificam antigénios variáveis, os quais medeiam uma resposta imune contra medula óssea ou tecido "estranho". Presentemente foram identificados os alelos da classe I 282 HLA-A, 540 HLA-B e 136 HLA-C e os da classe II 418 HLA-DRB, 24 HLA-DQA1 e 53 HLA-DQB1. Existem muitas sequências de alelos conhecidas nas bases de dados públicas, por exemplo, a base de dados IMGT/HLA, www.ebi.ac.uk/imgt/hla/intro.html) para os antigénios de leucócitos humanos.

Os ensaios de hibridação paralela ("multiplex") em vários formatos têm sido largamente usados para a tipagem molecular de HLA que requer uma combinação única de dados analisados e reprodutibilidade na identificação de alelos ou grupos de alelos associados com os antigénios específicos classe I e classe II. No contexto da tipagem molecular de HLA, metodologias de ensaios convencionais da técnica invocam o formato "transferência reversa de pontos em membrana" ("reverse dot blot"). De acordo com este formato, as sondas, colocadas numa série de bandas bem separadas, numa tira estreita de membrana de nylon ou outro material que sirva de substrato, são expostas a uma solução de um ou mais alvos em condições que permitem a captura dos alvos para produzir, num passo de reacção subsequente, sinais colorimétricos. Outros métodos da técnica incluem o uso de sondas apresentadas em micropartículas codificadas que são suspensas numa solução do alvo e analisadas por citometria de fluxo (ver "Products" http://www.onelambda.com). Um método recente proporciona um ambiente de ensaio integrado através da utilização de arranjos planares de micropartículas codificadas arranjadas em chips de silicone (ver, e.g. pedido de patente concedido N° de Série 09/690,040, atribuído a BioArray Solutions, Ltd) . 0 desenho de formatos de ensaio paralelos para a análise de loci polimórficos tais como o complexo HLA, principalmente a selecção de séries de pares de sequências iniciadoras e sondas, foi descrita em trabalhos anteriores, assim como em vários pedidos de patente co-pendentes (ver, e.g., Optimização simultânea na selecção de séries de sequências iniciadoras e de sondas de captura para análise de ácidos nucleicos", entregue em 7/15/2004 e atribuida a BioArray Solutions, Ltd.).

Complementaridade de sequências e representação binária - A interpretação de padrões de interacção sonda-alvo envolve a tarefa de fazer corresponder uma sequência binária ("padrão de reacção") derivada de um padrão de intensidade de sinal experimental a uma ou mais combinações de alelos ou o estabelecimento da validade de novos alelos.

Cada alelo terá subsequências que são perfeitamente complementares e outras que não são complementares das sondas numa série de sondas construída para interrogar o alvo. Esta configuração é representada na técnica através de um código binário que proporciona a base de classificações de alelos. Ou seja, através da atribuição a cada sonda com correspondência perfeita de uma pontuação " + " (aqui designada por "8") e a cada sonda sem correspondência perfeita uma pontuação de (aqui designado por "1"), constrói-se uma sequência binária para representar o padrão de interacção da série de sondas escolhidas com uma combinação específica de alelos encontrada. 0 dicionário que mostra a correspondência entre alelos e sequências binárias é conhecido na técnica como a "tabela de sucessos" ("hit table"). 0 padrão de reacção - produzido pela série de sondas seleccionada - pode corresponder a mais de uma única combinação de alelos, e o grau de ambiguidade ("degenerescência") determina a precisão ("resolução") atingível na identificação das combinações de alelos. Em geral, o grau de resolução pode ser aumentado através da adição de sondas à série.

As intensidades de sinal do ensaio reflectem a força das interacções sonda-alvo. Uma sonda ideal produz um sinal de ensaio de elevada intensidade quando perfeitamente complementar ("emparelhada") com a sua sequência alvo numa determinada amostra e caso contrário produz uma intensidade de sinal do ensaio de baixa intensidade. Ou seja, a distribuição da intensidade de sinal de tal sonda numa grande série de amostras, idealmente, apresentará dois picos distintos, sugerindo uma segmentação das intensidades de sinal em subpopulações reflectindo as configurações "emparelhadas" ou "desemparelhadas" das sequências sonda e alvo.

No entanto, na prática, a interacção de um ou mais alvos polimórficos com uma multiplicidade de sondas pode produzir uma larga gama de intensidades de sinal do ensaio. Por exemplo, as intensidades de sinal positivas do ensaio podem ser fracas, ou as intensidades de sinal negativo do sinal podem ser altas, "distorcendo" as distribuições individuais das intensidades. Por exemplo, a hibridação sonda-alvo é enfraquecida quando uma sonda encontra numa subsequência alvo um alelo compreendendo polimorfismos diferentes do polimorfismo "designado" pela sonda. Pelo contrário, uma hibridação sonda-alvo pode ser inesperadamente aumentada quando uma sonda, apesar de apresentar um desemparelhamento significativo com o alvo dentro da sua subsequência designada, emparelha com um alelo especifico numa subsequência não designada.

Como acontece geralmente com a binarização, são delineadas subpopulações através da fixação de um patamar. Particularmente quando as distribuições de sinal do ensaio não são bimodais, a fixação do patamar representa um passo inicial critico na análise.

No contexto da tipagem molecular de HLA, a necessidade de análise extensa dos padrões de interacção e a atribuição dos alelos presentemente baseiam-se em grande parte na experiência dos especialistas. Estes especialistas e peritos encetam, geralmente com um suporte informático mínimo, um processo demorado, difícil e frequentemente subjectivo do estabelecimento interactivo, revisão e edição ("redacção") das atribuições dos alelos, frequentemente com referência a compilações impressas de alelos conhecidos (e.g., as bases de dados mantidas pelo Programa Nacional de Medula Óssea) e correspondentes "tabelas de sucessos".

Como acontece com a tipagem molecular dos antigénios de leucócitos e dos antigénios de eritrócitos, a análise reprodutível e rápida e interpretação de padrões complexos de interacção sonda-alvo representa um pré-requisito para a validação compreensível de séries de marcadores genéticos para validar estes "preditores" de predisposição para doença ou de resposta ao tratamento em populações de doentes de tamanho suficiente para permitir conclusões estatisticamente significativas. Desafios semelhantes surgem noutras áreas, por exemplo: relacionadas com a análise de polimorfismos genéticos na análise de mutações para rastreio e diagnóstico de portadores e avaliação do risco associado; e relacionado com a avaliação da predisposição para adquirir doenças genéticas de hereditariedade complexa que podem manifestar-se na forma de uma série completa de marcadores polimórficos ou perfis de expressão de genes.

Será desejável um sistema informático conveniente invocando algoritmos informáticos e procedimentos robustos para análise e interpretação automática de padrões e proporcionando um ambiente integrado para a revisão interactiva e redacção de atribuições assim como gestão e visualização de dados.

Pastinem et al., descreve uma detecção de duas cores de alelos começando pela determinação de uma intensidade de sinal num primeiro comprimento de onda (CY5 a 67 0 nm) e num segundo comprimento de onda (CY3 a 570 nm). Subsequentemente, a primeira intensidade de sinal CY5 (amostra a testar) é dividida pela segunda intensidade de sinal CY3 (amostra controlo). Estes valores ajustados são então usados para calcular a razão de intensidades de sinal entre as amostras a testar e controlo.

Sumário O objectivo acima é conseguido através de um modo de atribuição de alelos de acordo com a reivindicação 1. Realizações preferidas podem ser derivadas das respectivas reivindicações dependentes. São ainda descritos métodos e algoritmos (e a sua implementação) suportando a análise automática e revisão interactiva e refinamento ("redacção") da análise dentro de um ambiente informático integrado, para atribuições automáticas de alelos. A implementação, de preferência com um sistema informático e um programa referido como programa Avaliação Automática de Alelos ("Automated Allele Assignment", "AAA"), proporciona uma multiplicidade de funcionalidades incluindo: Gestão de dados através de uma interface integrada com uma base de dados portátil para permitir a visualização, importação, exportação e criação de relatórios de sumários pelo utilizador; Configuração do sistema ("Instalação") incluindo autorização do utilizador, análise de séries de treino e ocultação de sondas; Análise de Padrões incluindo correspondência de sequências e troca de sondas; e Reacção interactiva combinando computações de bases de dados em tempo real e edição de "corte e colagem", geração de frases de aviso e anotações de suporte.

Fixação de patamares - Descrevem-se métodos de fixação e refinamento de patamares, incluindo uma generalização da representação binária obtida através da segregação das distribuições de intensidade das sondas em três ou mais subpopulações.

Determinação de patamares iniciais - Um método de fixação de patamares através da análise de uma série de referências ("treino") e selecção é igualmente divulgado, para cada sonda numa série de sondas seleccionadas, um patamar que maximiza o grau de concordância dos resultados dos ensaios e atribuição de alelos com os proporcionados para a série de treino. 0 método de fixação dos patamares iniciais também proporciona um número de mérito ("bondade", "goodness") como método de base de avaliação da robustez daquele patamar. Um método relacionado de fixação de patamares iniciais aqui divulgado aplica um algoritmo de binarização a perfis de intensidade de sondas individuais.

Refinamento dos patamares: Correspondência de padrões - Divulga-se um método de refinamento de patamares através de uma sequência binária experimental ("padrão de reacção"), produzido através da aplicação de fixação de patamares iniciais, com um compêndio de padrões de reacção correspondendo a combinações de alelos válidas. 0 sistema informático aqui descrito suporta um modo de troca ("flipping") de bits específicos dentro da sequência experimental ("palavra"). 0 programa identifica sondas, e combinações de sondas, como candidatas a troca ("flipping") de modo a produzir concordância completa ou parcial entre a "palavra" experimental modificada e a palavra, ou palavras, mais próxima no dicionário. A troca de uma sonda - para determinadas amostras na sequência considerada - corresponde a um refinamento no estabelecimento do patamar para essa sonda.

Ocultação de sondas - É igualmente divulgada uma caracteristica do programa que suporta um modo de configuração ("instalação") em que sondas seleccionadas podem ser temporariamente excluídas da análise ("ocultadas"). Os sinais do ensaio produzidos pelas sondas que não contribuem significativamente para a descriminação entre alelos - ou podem ser avaliadas como produtoras de padrões de intensidade de baixa reprodutibilidade - podem também ser ocultados quando da análise dos resultados e depois visualizados apenas se a sua contribuição for muito necessária.

Estatística da frequência de alelos - Num outro aspecto, o sistema informático proporciona um método para o seguimento e apresentação da frequência relativa da ocorrência de grupos de alelos (e combinações dos mesmos). "Redacção" interactiva - 0 sistema informático proporciona um ambiente integrado para facilitar o acesso simultâneo aos dados a serem analisados e bases de dados e tabelas de sucessos a serem consultadas, por exemplo no decurso da redacção. As operações de "corte e colagem" são proporcionadas em múltiplos écrans para permitir a edição rápida e conveniente de classificações automáticas ("programa") incluindo uma função de anotação.

Testes confirmatórios para resolução de ambiguidades - 0 programa também acomoda informação adicional que ajuda na resolução de ambiguidades através da amplificação especifica de grupo ou através da utilização de análise mediada por alongamentos de polimorfismos (ver "Análise multiplex de loci polimórficos através de interrogação simultânea e detecção mediada por enzimas" entregue em 10/15/2002; N° de Série 10/271,602.

Análise distribuída: Processamento, análise, interpretação, arquivamento - A arquitectura do sistema informático suporta um modo de análise distribuída, permitindo que diferentes funções tais como registo de imagens do ensaio, análise automática, redacção interactiva e avaliação da "assinatura" final e geração de relatório sejam efectuadas por diferentes indivíduos em diferentes localizações geográficas. Este modo de análise distribuída expande as capacidades dos laboratórios individuais de testes para expandir os seus respectivos menus de testes sem a necessidade de perícia local relativa a tantas áreas diferentes de especialização. Por exemplo, as localizações dos centros de testes podem ser escolhidas de forma a facilitar a colheita de amostras dos doentes, ao mesmo tempo que médicos com certificação podem rever e libertar resultados finais dos testes de uma localização diferente, servindo ao mesmo tempo múltiplos centros de testes. É igualmente divulgado um método e pseudocódigo para análise de alelos totalmente automatizada, que está descrito abaixo.

Breve descrição dos desenhos

Fig. IA ilustra uma série de intensidades de sinal de ensaio registadas para a sonda HA109 na análise de uma série de treino de amostras. Através de um método independente, a intensidade da sonda normalizada foi classificada como negativa para as amostras marcadas e positiva para as amostras marcadas "+".

Fig. 1B mostra uma determinação de patamares para uma sonda numa série de treino de sondas, onde o valor do patamar é representado no eixo dos X e a medição do patamar é no eixo dos Y. 0 patamar óptimo dá a medição máxima em Y, a qual é 1 neste caso.

Fig. 1C mostra os parâmetros do sistema para uma série de diferentes sondas de HLA. A tolerância de atribuição de alelos (ver Fig. 2) está descrita nas caixas de texto. HLA-A é permitido um máximo de 6 alterações; HLA- B 8 alterações; e HLA-DR 5 alterações. Cada sonda pode ser classificada como necessária, de elevada confiança, baixa confiança e não usada. A série nuclear de sondas (ver Fig. 3) consiste apenas em sondas de elevada confiança, enquanto a série expandida de sondas inclui sondas de elevada e baixa confiança. Ao alterarem-se as configurações, pode-se alterar interactivamente a série nuclear e a série expandida. Por exemplo, HA120 pode ser estabelecido como de elevada confiança e HA121 como de baixa confiança. FIGS. 2A a 2C mostram, respectivamente, a intensidade normalizada ("razão") para as sondas HB103, HB123A, HB154, separadas por ordem crescente de razões para ilustrar uma descontinuidade no perfil de razões da sonda. HB103 (FIG. 2A) possui a maior diferença no perfil de razões. HB123A (FIG. 2B) não possui saltos óbvios do perfil. No padrão de reacção, 8 indica positivo, 1 indica negativo (sem sinal) e 0 indica que a sonda não é usada. FIG. 3 é um exemplo da classificação de alelos, onde o padrão de reacção está apresentado na primeira fila, variando entre 0 e 8, e a sequência de hibridações é o padrão mostrado nas colunas. As colunas 119, 121, 122, 135A, 142A e 145 são sondas de baixa confiança. Uma vez que existe apenas uma atribuição, a série de sondas expandida está vazia. FIG. 4 ê o padrão de reacção e a tabela de sucessos para uma reacção exemplificativa entre sondas e um alvo. Mostrando também o écran do programa para fazer a redacção manual, atribuição de alelos e um local para inserção de comentários. FIG. 5 é um gráfico de barras para a distribuição de frequência de alelos de uma população particular. FIG. 6 é um gráfico de barros mostrando a comparação entre estudos de genotipagem publicados de uma distribuição de alelos numa população de "Judeus normais" e os resultados experimentais para tal população. FIG. 7 é um écran que ilustra a informação sumária de classificação para um painel designado "03250443" e inclui o nome do painel, nome da amostra, posição da amostra, atribuição do alelo, sondas alteradas, mensagens de aviso e comentários. FIG. 8A é um perfil de razões de sondas. FIG. 8B é uma derivada numérica que mostra os pontos de inflexão derivados da Fig. 8A.

Descrição detalhada

Após o registo de um padrão de intensidade de sinais de um ensaio para uma determinada amostra, uma sequência de passos analíticos é realizada para identificar a correspondente combinação de alelos. 2.1 Conversão dos padrões de intensidade de ensaios em sequências binárias

Intensidades de sinais de ensaio normalizadas -

Determinados métodos do despiste de polimorfismos dentro de um ácido nucleico alvo como seja análise de polimorfismos mediada por elongação (eMAP™, também referido como "elongação mediada por captura")/ divulgada no pedido de patente U.S. co-pendente N° de Série 10/271,602 (PCT/US02/33012) produz sinais de ensaio que se baseiam num processo de reconhecimento molecular cuja especificidade elevada produz uma distribuição aproximadamente "binária" dos sinais do ensaio. Pelo contrário, métodos tais como análise multiplex de polimorfismos mediada por hibridação (hMAP™, Pedido de Patente U.S. N° de Série 10/847,046) produzem intensidades de sinal de ensaio que reflectem a afinidade eficaz que governa a interacção de cada sonda numa série de múltiplas sondas com o alvo. Para corrigir variações no fundo, concentração do alvo original ou outras condições experimentais, as intensidades de sinal experimentais que registam as interacções sonda-alvo são normalizadas usando sinais registados a partir de sondas controlo positivas e negativas (e pares de sonda-alvo) incluídas na reacção. A partir de cada intensidade de sinal, geralmente o valor médio, Ik, para o tipo k-th da sonda, incluindo o sinal do controlo positivo, Ipc, e o sinal de controlo negativo, Inc, é subtraído e o resultado é dividido pelo sinal do controlo positivo corrigido para obter uma intensidade normalizada (razão):

Para facilitar uma avaliação do desempenho de qualquer sonda determinada num painel, um perfil de intensidade de sondas, também referido aqui como um perfil de razões, foi construído distribuindo os valores de r registados para aquela sonda por uma série de amostras, tipicamente 100 amostras, por exemplo, em ordem ascendente. Exemplos de tais perfis estão mostrados nas Figs. 2A-2C, onde a Fig. 2A ilustra um perfil que apresenta uma distribuição abrupta de grande amplitude desde valores de r mais baixos até mais altos, enquanto a Fig. 2B ilustra um perfil que apresenta uma transição gradual de pequena amplitude.

Para métodos tais como hMAP, as intensidades de sinal normalizadas são primeiro convertidas numa representação binária: se r exceder um patamar pré-fixado, T, a correspondente classificação binária é positiva, s = 1 (também designado aqui como "8"), de outra forma negativa, s=-l (também designado aqui como "1") . Métodos de implementação deste passo crítico de processamento do sinal estão divulgados nas subsecções que se seguem. 2.2 Determinação de patamares: binarização

Descreve-se um algoritmo para a determinação e refinamento iterativo da fixação de patamares por binarização. Como acontece para o passo análogo na análise de imagens de conversão das intensidades de pixéis na escala de cinzas para a representação "preto e branco", a binarização classifica as intensidades de sinal do ensaio normalizadas para uma de duas subséries. Isto é problemático uma vez que a distribuição de intensidades de sinal normalizadas para uma série de amostras em consideração possui uma forma bimodal com dois picos bem separados: um patamar pode então ser fixado quase em qualquer lado entre os dois picos sem afectar o resultado; Fig. 2A corresponde a um histograma bimodal. No entanto, noutros casos, quando os picos separados não estão bem resolvidos, a binarização apresenta uma fonte de incerteza ou de potencial erro: a atribuição de valores de intensidade especificos a uma ou outra subsérie dependerá numa forma sensivel da fixação precisa do patamar; Fig. 2B corresponde a um destes casos.

Fixação de patamares iniciais: análise de séries de "treino" - A fixação de patamares iniciais pode basear-se na análise de uma referência ou "série de treino". De preferência, as amostras de referência são escolhidas para reflectirem caracteristicas do grupo de amostras de interesse; por exemplo, a frequência prevalecente de ocorrências de combinações de alelos e haplótipos. Tal informação pode proporcionar restrições adicionais nas classificações de alelos prováveis. Os métodos de colheita automática e análise estatística da estatística de populações da amostra são elaboradas abaixo.

Uma série de referência ("treino") de amostras S, com padrão de reacção de referência independentemente determinado e validado {Ok, 1 k Pt}, e atribuições de alelos independentemente determinados e validados, é analisada com uma série seleccionada de sondas P, para obter o padrão de intensidades normalizadas (razão) (rk, 1 k P} e para cada sonda, k, na série seleccionada (ver também abaixo), um patamar, Tk, é determinado de modo a maximizar a concordância entre o padrão de reacção real, Sk = Sk(T), e o padrão de referência {Ok, 1 k PT} .

Ou seja, para cada sonda na série actual, um patamar é determinado para cada sonda através da análise do perfil de intensidades normalizadas ao longo da série de treino de amostras S de modo a maximizar a correlação cruzada C = E±((r± - Tk) * σ±) /Σι | (r± - Tk) I, 1 i S. Para cada sonda à vez, encontrar o máximo da função C, a fixação do patamar, Tk, é aumentada gradualmente até o sinal da quantidade r± - Tk ser concordante com o bit correspondente, σ±, no padrão de referência. Para as sondas usadas no ensaio, mas não na interrogação da série de treino, um padrão de reacção é "calculado retroactivamente" a partir da tabela de sucessos usando os alelos classificados. Fig. 1B ilustra a forma da função C = C(T), rmin T Umax· 0 parâmetro de patamar é escolhido de modo a maximizar a função C. 0 pseudocódigo para determinar o parâmetro de patamar inicial é como se segue: /* ** p is the normalized intensity ("ratio") pattern for a given sample; binarization will ** convert each intensity pattern into a reaction pattern composed of P bits; there will ** be S such patterns; ** π is the set of probe profiles; there will be P such profiles, each with a threshold, T; ** T is the set of optimal (initial) thresholds, to be determined by maximization of C; */

GenerateProbeProfiles (p S, η, P) /* sort reaction patterns by probe */ { FOR( each probe ) {

Extractlntensity(from reaction patterns )

SortProbelntensities () ; } } /* ** maximize C = E± ((n- Tk * cn) / /(ri - Tk) / ** the ri denote the elements of the ratio profile R */ */

FindThreshold (R, Σ, S) {

}

DeterminelnitialThresholds ( ) {

GenerateProbeProfilesfp, S, π, P) FOR(each of P ratio profile, nk) {

Tk = FindThreshold ( nk, Fk* S) ; }

Return (τ) ; } "Bondade" da fixação de patamares - A fixação de patamares pode ser robusta para algumas sondas na série, mas menos robustos para outras. Ou seja, quando a composição das duas subpopulações de amostras, gerada através da aplicação de um patamar T às alterações do perfil de intensidades de sondas como resposta a uma pequena alteração no valor T para Τ + ΔΤ ou Τ-ΔΤ, onde ΔΤ/Τ«1, então esse patamar não é robusto e a confiança estatística é baixa.

Para permitir a colocação de intervalos de confiança na fixação de patamares individuais, uma figura de mérito ("bondade do patamar") também é aqui descrita. Isto deriva da forma do pico da função C=C(T), produzido no decurso de maximização da correlação cruzada com uma série de atribuições para uma série de treino. Quanto mais acentuado o pico na função, mais sensivel o valor seleccionado de T para variações pequenas em T, como ilustrado na Fig. 1B.

Uma "bondade", G, de um patamar seleccionado pelo método de maximização da correlação cruzada, como acabado de descrever, é definida como se segue: G = (Cl + Cr) / 2CMax, em que CMax, Cl e Cr respectivamente significam o valor máximo de C, CL o valor de C obtido quando se reduz o valor do patamar em 30% e Ck o valor de C obtido quando se aumenta o valor do patamar em 30%.

Pesos - Uma vez determinado um patamar, T, o perfil de intensidade da sonda, {r±, 1 i S} pode ser reformulado numa forma escalada, wi = (r± - T)/T, em que os pesos, w±, representam a grandeza relativa de intensidades de sinal individuais (normalizadas). O sistema informático aqui descrito (designado "ΑΆΑ") acompanha os pesos e apresenta-os num de vários formatos, por exemplo, através de uma simples classificação em "Próximo" ("C", w 0,5) ou "Distante" ("D") em relação à troca de bits, como ainda discutido abaixo. 2.3 Correspondência de sequências; Correlações dentro dos padrões de interacçâo Sonda-Alvo A análise dos padrões de intensidades experimentais tem como objectivo identificar ou aproximadamente identificar, um ou mais alelos alvo subjacentes. Para tal, os padrões de intensidade são binarizados através da aplicação de uma série de patamares e a sequência binária resultante ("padrão de reacção") é comparada com combinações de pares de tais séries correspondendo a alelos conhecidos listados numa "tabela de sucessos". Cada entrada numa "tabela de sucessos" representa um alelo válido e proporciona uma sequência binária em que cada posição contém uma classificação de "Emparelhado" ou "Desem-parelhado" referindo-se ao grau de complementaridade do alelo com a sonda naquela posição (ver Fig. 3A). Os alelos são designados por códigos de 4 digitos e são agrupados através dos 2 digitos principais em grupos de antigénios.

Correcçâo de erros através da correspondência de sequências: "Alterações" - Para identificar os alelos alvo, o padrão de reacção binária, {Sk, 1 k P} é comparado, bit a bit, com todas as séries de referência representando combinações de 2 alelos; estes são gerados através da aplicação de uma operação OR às entradas da tabela de sucessos. A correspondência de todas as séries de bits reforça as correlações e fornece um método de "correcção de erros" através da inversão de bits individuais ("flipping", troca) na série conforme considerado necessário para produzir uma correspondência com uma sequência de referência válida. Este processo é comparável à correcção de erros topográficos de modo a produzir palavras válidas: através da troca da letra "t" em "valit" para "d", obtém-se uma palavra inglesa para válido ("valid"); uma outra palavra inglesa para válido ("valid") é obtida através da troca de "i" para "u" e "t" para "u", mas "valit" é mais "próximo" de "valid" que de "value" e a primeira portanto representa mais provavelmente a palavra pretendida.

De forma análoga, o programa AAA destina-se a encontrar a série de bits válida mais próxima ("palavras") representando alelos válidos, como identificado, por exemplo numa base de dados que pode ser acedida no programa AAA. 0 programa AAA lista as séries válidas "mais próximas", agrupadas por códigos de "grupo" de 2 digitos comuns, por ordem crescente de distância de Hamming (i.e., o número de bits desemparelhados) a partir da série experimental. Especificamente, o programa identifica os bits desemparelhados e sugere as "trocas" necessárias, nomeadamente "1 a 8" ou "8 a 1", que produzirão um emparelhamento completo entre a série experimental e as séries válidas adicionais dentro de uma distância de Hamming máxima pré-estabelecida. 0 programa AAA também permite uma pesquisa mais intensa do espaço das séries de referência de modo a produzir uma lista de "emparelhamentos próximos" (ver o menu baixado na Fig. 4). Este prolongamento da análise frequentemente revela possíveis séries alternativas representando classificações de alelos mais prováveis com base em tais considerações adicionais como a frequência de ocorrência de determinados alelos ou haplótipos na população de interesse. Esta caracteristica reduz substancialmente o tempo e esforço despendidos na edição interactiva.

Distância entre sequências - Dentro de cada grupo, séries correspondendo a combinações válidas de alelos são ordenadas por ordem crescente da distância de Hamming pesada a partir do padrão de reacção. Esta função da distância é definida em termos dos pesos, w± = (ri -T)/T, associadas com as sondas desemparelhadas. Por exemplo, assumindo ser M sondas desemparelhadas, uma função de distância possível é:

2.4 Refinamento iterativo de patamares

Idealmente, o procedimento de emparelhamento de séries acabado de descrever produzirá uma correspondência não ambígua entre o padrão de reacção e uma série representando uma combinação de alelos válidos. No entanto, mesmo quando é chamada uma correspondência perfeita, esta poderá ser não ambígua se envolver pesos baixos para uma ou mais sondas. Ou seja, na prática, o padrão de reacção pode conter falsos negativos ou falsos positivos, dependendo da fixação de patamares estabelecidos para sondas individuais e dos pesos de intensidades normalizadas. Especialmente a confiança estatística associada à fixação de patamares estabelecidos para sondas com perfis de razões contínuos para a série de amostras em consideração será baixa e é portanto benéfico ter um processo de ajustamento ("acerto fino") de tais fixações de patamares. 0 procedimento de correspondência de sequências proporciona uma base para o refinamento de patamares iniciais. No final, a troca de uma sonda é equivalente a ajustar o correspondente patamar de modo a alterar o sinal da razão normalizada relativamente à fixação do patamar estabelecido. Ou seja, se, após um passo inicial de atribuição automática de alelos para uma série de amostras, uma determinada sonda for consistentemente "assinalada" como falsa positiva ou falsa negativa, isto é uma indicação que um refinamento de patamares para aquela sonda deve ser feito. Assim, a optimização de patamares envolve um processo iterativo de ajustamento da fixação de patamares de uma ou mais sondas "assinaladas" de modo a minimizar o número total de trocas identificadas pelo programa AAA. Devido a esta optimização de patamares ser baseada em correspondência de sequências, em vez de uma inspecção de perfis de razões de sondas individuais, como no passo de estabelecimento de patamares iniciais, a optimização de patamares reflecte a correlação entre múltiplas sondas na série e melhora a confiança estatística. 0 refinamento de patamares pode ser realizado numa base contínua usando amostras analisadas como um grupo de referências conti-nuamente em expansão. Nesta aplicação, cada novo grupo de amostras torna-se um novo grupo de treino.

Em geral, o número de trocas mesmo após a optimização de patamares permanecerá finito. Nesses casos, os pesos associados a trocas indicados deverá ser tido em consideração. 0 programa AAA convenientemente designa razões de "trocas" como "Próximas" (C, r 0,5) do patamar ou "Distantes" (D) do patamar. 0 limite de exclusão representa um parâmetro de desempenho ajustável que pode ser estabelecido de forma mais ou menos conservada, um estabelecimento mais conservado geralmente implica um maior grau de revisão e edição iterativa, como discutido mais detalhadamente abaixo. A necessidade de troca de sondas "distantes", í.e. aquelas que possuem um grande peso, para obter uma correspondência representa uma indicação de que se pode ter em mãos um novo alelo. O pseudocódigo abaixo resume o procedimento de refinamento de patamares conforme implementado no sistema informático AAA da invenção. /* calculate allele assignment for a list of samples, then /* identify and analyze the flipped probes for that list

CalculateAssignment(SampleLists);

GetFlips(SampleLists);

AnalyzeFlips () ; /* Select probes requiring threshold refinement ProbeSet = SelectProbes(); /*for each probe, find the optimal threshold by minimizing the number of total flips FOR each (probe in ProbeSet) {

To = GetlnitialThreshold (probe); /* get initial threshold FOR( T = Το-range; T<= To+range; T+=deltaT) /* adjust threshold {

RecalculateAssignment(SampleLists);

TotalFlips = AnalyzeFlips (); /* re-analyze flipped probes and get the number of total flips ; }

FindMinTotalFlips () ; /*findmin total flips /* the new threshold will be the one minimizing total flips Tnew = GetNewThreshold (probe) ; }

Características adicionais incluídas no sistema informático AAA estão estabelecidas abaixo.

Modificação de séries de sondas - Um padrão de reacção binário particular pode corresponder a mais de um alelo e frequentemente corresponderá se a série de bits possuir apenas alguns elementos ("8s" e "ls") e o alvo incluir múltiplas regiões polimórficas. 0 grau de ambiguidade é calculado simplesmente enumerando o número de alelos não resolvidos ("degenerados"). 0 aumento da série, através da inclusão de sondas adicionais, pode proporcionar um meio de atingir maior resolução de modo a resolver ambiguidades.

Ocultação de sondas: Séries de sondas nucleares e expandidas - Descreve-se abaixo um método para a designação iterativa de séries nucleares e séries expandidas de sondas, juntamente com uma função "ocultação de sondas", a qual pode ser usada para corrigir sinais das sondas que tenham pior desempenho que outras. Na ocultação de sondas, os resultados das sondas que hibridam com uma larga variedade de amostras, em vez de apenas com amostras particulares com alelos particulares, são ignorados. Tal nivel alargado de hibridação pode resultar da hibridação cruzada ou de sondas que tenham como alvo subsequências largamente expressas. 0 programa informático AAA proporciona um écran de configuração ("instalação") que permite ao utilizador escolher sondas dentro de um painel para serem parte de uma série nuclear ou de uma série expandida. A função de ocultação de sondas permite aos utilizadores entrar com uma lista de sondas que devem ser ignoradas ("ocultadas") no primeiro passo de atribuição automática de alelos - ou seja, o programa calcula atribuições primeiro com base numa série nuclear de sondas que hibridam mais estreitamente. 0 objectivo de usar a série nuclear é obter uma atribuição ao nivel de grupo para alelos (i.e., um conjunto de vários alelos possíveis) usando sondas que proporcionam discriminação ao nível de grupo com um nível de confiança elevado.

No modo de ocultação de sondas, o programa AAA primeiro faz uma atribuição ao nível de grupo usando apenas o grupo nuclear de sondas. Num segundo passo (facultativo), a atribuição pode ser refinada através da repetição do cálculo com o grupo aumentado que possui todas as sondas no grupo nuclear, assim como as restantes sondas menos fiáveis. 0 segundo passo produzirá atribuições adicionais que permanecem compatíveis com as atribuições feitas no primeiro passo. 0 programa também realiza este segundo passo sempre que o primeiro passo não produzir uma atribuição única ao nível de conjunto. A série aumentada é útil na orientação da "redac-ção" e permite ao utilizador seleccionar a atribuição mais provável de alelos. Nalguns casos, a versão complementar (e.g., anti-sentido) de uma ou mais sondas (e os transcritos ou amplicões correspondentes) podem necessitar de ser gerados e usados, para evitar hibridação cruzada excessiva. Em tais casos, as sondas não complementares são então excluídas do primeiro e/ou segundo passo.

Estatística de populações: análise da frequência de alelos - A taxa de recorrência de cada alelo está dependente da população em que a tipagem de HLA está a ser realizada. Para um painel contendo um grande número de amostras, a ocorrência de um alelo particular é representativa da sua abundância ou raridade na totalidade da população de interesse. A distribuição de alelos numa população de etnicidade conhecida pode ser calculada para um painel.

Os resultados de um conjunto de painéis do programa da base de dados AAA foram usados para calcular a frequência de alelos. 0 programa atribui a cada amostra um conjunto de dois alelos com base no seu padrão de reacção com o conjunto total de sondas. Os cálculos de frequências são baseados nas atribuições de alelos de dois dígitos. Os primeiros dois dígitos da atribuição de alelos para todas as amostras são extraídos e compilados num único vector. Calcula-se um histograma que lista cada alelo com o número vezes que é encontrado no apinel (a sua contagem) . A frequência é calculada à medida que a contagem é normalizada pelo número total de atribuições.

Uma finalidade de fazer o seguimento da estatística da frequência de alelos, conforme implementado no programa, é proporcionar ajudas na edição, como sejam gerar avisos sempre que um alelo raro é identificado. Isto ajudará no caso de classificações degeneradas, onde mais de uma atribuição é possível. Em tais casos, as atribuições que envolvem alelos raros podem ser eliminadas manualmente. No caso de atribuições simples, tais avisos de alelos raros asseguram que os avisos sejam manualmente verificados e confirmados ou trocados. "Redacçâo" interactiva - Após atribuições automáticas de alelos usando o programa e os métodos aqui descritos, as atribuições putativas podem ser "editadas" contra uma base de alelos indicando alelos conhecidos ou através de uma combinação de dados experimentais para alelos (que forma uma série de referências continuamente em expansão) e uma base de dados de alelos. Uma ilustração de passos chave é dada num Exemplo.

Os pesos representam uma medida de confiança na atribuição de bits a qualquer intensidade de sonda: os bits têm menos probabilidade de serem incorrectamente atribuídos, e as trocas são portanto executadas com menos probabilidade, quanto maior o peso de um sinal de intensidade específico da sonda (ou uma função adequada baseada nesses pesos). Assim, os pesos podem ajudar a guiar a redacçâo interactiva.

Um outro guia está disponível na forma de frequências de alelos na população total, ou numa subpopulação a ser monitorizada. Novamente, as amostras analisadas formam uma base de dados de referências continuamente em expansão, que são adicionadas à série de treino cujas frequências de alelos (e haplótipos) são actualizadas em tempo real.

Detecção de novos alelos - Os novos alelos podem ser indicados por alvos que produzem padrões de reacção binários, os quais podem ser comparados com sequências de referência existentes representando combinações de alelos conhecidos apenas através da troca de sondas tendo pesos significativos. Isto está discutido mars detalhadamente no Exemplo I (Classificação de alelos) abaixo.

Generalização da representação binária - 0 programa AAA também acomoda representações de padrões de intensidade diferentes da representação binária e as correspondentes sequências binárias ("palavras").

Alfabeto de três letras em tabelas de sucessos -

Como generalização imediata, considere-se representações invocando um alfabeto de três ou mais letras. Tal representação de três letras surge naturalmente quando um par de sondas degeneradas é proporcionado para um ou mais locais alvo polimórficos designados. Por exemplo, numa nova abordagem que invoca a análise multiplex de polimorfismos mediada por elongação (eMAP) para analisar mutações numa série de genes codificadores dos antigénios de grupo sanguíneo humanos, um par de sondas de elongação degeneradas é proporcionado para cada um dos locais variáveis designados. Os membros do par diferem nos seus extremos 3' ou perto deles, um membro destinado a emparelhar com o alelo alvo normal esperado, o outro membro destinado a emparelhar com o alelo variante esperado. Apenas a sonda de elongação emparelhada com o alvo é prolongada de forma a produzir um sinal de ensaio correspondente associado aos produtos de elongação (ver Pedido de Patente US N° Série 10/271, 602) . Ou seja, eMAP produz um de três valores possíveis em cada local polimórfico designado, nomeadamente normal, variante (mutante "homozigótico") ou heterozi-gótico. A representação reflecte os três resultados possíveis da determinação eMAP em cada local designado, nomeadamente: sonda normal emparelhada, sonda variante desemparelhada: normal - assinalado por 1 sonda normal desemparelhada, sonda variante emparelhada: variante - assinalado por -1 sonda normal emparelhada, sonda variante emparelhada: heterozigótico - designado por 0

Isto reflecte as combinações possíveis dos alelos subjacentes, nomeadamente AA (normal ou "selvagem", BB (variante homozigótico) e AB ou BA (heterozigótico). Uma tabela de sucessos para os locais de interesse será composta por códigos de letras que são combinados através das regras acabadas de estabelecer. O Exemplo III ilustra a utilização de um alfabeto de três letras (1, 0, -1) para representar as combinações alélicas observadas.

Patamares superiores e inferiores - Uma representação de três letras também surge, de modo análogo, em associação com a introdução de um patamar superior e inferior. Para cada sonda em consideração, uma intensidade de sinal do ensaio abaixo do patamar inferior corresponde a um desemparelhamento com ambos os alelos alvo, uma intensidade de sinal do ensaio acima do inferior, mas abaixo do patamar superior, corresponde a um emparelhamento com um mas não com o outro alelo e uma intensidade de sinal do ensaio acima do patamar superior corresponde a um emparelhamento com ambos os alelos. A designação de bits negativos e positivos pode ser feita com maior confiança se dois patamares forem definidos, os quais segregam intensidades de ensaio normalizadas registadas para qualquer sonda determinada nas três subpopulações. As três subpopulações serão aquelas em que: (i) uma determinada sonda está emparelhada para ambos os alelos classificados (1,1), (ii) uma sonda está emparelhada para um alelo (1,8; 8;1) e (iii) uma sonda está emparelhada para ambos os alelos (8,8) .

Devido à possivel existência do segundo patamar (8,8), será possível estabelecer incorrectamente um patamar para uma sonda particular; ou seja, o patamar para uma sonda (8,8) distinto do de uma sonda (8,1), poderá ser correctamente identificado como o patamar para uma sonda (8,1) distinta de uma sonda (1,1). Tais fixações incor- rectas dos patamares podem ser detectadas e corrigidas através do refinamento e expansão continuados do grupo de treino e/ou através de dupla confirmação da atribuição dos alelos contra as referências de bases de dados de alelos conhecidos e assegurando a consistência.

Uma outra situação que necessita de ser considerada, é que as intensidades do ensaio normalizado registadas para qualquer sonda determinada que estejam acima do segundo patamar (mais elevado), poderá ser devido a reacção com a subsequência alvo designada em ambos os alelos (indicando um homozigótico) ou poderá ser devida a reacção com dois alelos independentes, que coincidentemente são reactivos com aquela sonda. Novamente, esta situação pode ser detectada e corrigida através do refinamento e expansão continuados da série de treino e/ou através de dupla confirmação das atribuições dos alelos contra as referências das bases de dados de alelos conhecidas.

Na determinação da localização de patamares, onde existe mais de um patamar para uma sonda particular, pode-se examinar as razões de perfis de intensidade (como se mostra nas Figs. 2A a 2C; ver também Figs. 8A e 8B) . Mas caso não exista uma inflexão abrupta no perfil, como ilustrado claramente na Fig. 2B, pode-se localizar os pontos de inflexão e assim os patamares, calculando a derivada numérica usando um filtro de convolução. Os resultados do cálculo da derivada numérica desta forma estão mostrados na Fig. 8A, que é um perfil de razões, e na

Fig. 8B, que é a derivada numérica mostrando os pontos de inflexão derivados da Fig. 8A.

Digitalizaçâo de padrões analógicos - As intensidades normalizadas, em vez de serem binarizadas, também podem ser digitalizadas com qualquer grau desejável de maior precisão que o proporcionado pela binarização. Por exemplo, em vez de duas subpopulações, pode-se escolher segregar intensidades em oito subpopulações ou 16 subpopulações. Inerente a esta representação é a informação representada na forma de pesos na representação binária aqui discutida atrás. Cada intensidade normalizada digitalizada de facto representa uma medida da co-afinidade de uma interacção sonda-alvo particular (ver Pedido de Patente US N° 10/204,799 "Análise molecular de múltiplas analitos"; WO 01/98765). Os padrões de reacção experimentais digitalizados e os padrões de referências digitalizados são comparados por meio de computação de correlações cruzadas usando métodos convencionais.

Serviço de aplicações de acesso remoto para múltiplos utilizadores - O uso de um programa também permite o estabelecimento de uma rede para permitir a análise remota, redacção e preparação de um relatório dos resultados da classificação de alelos. Por exemplo, uma base de dados que constitui parte do ambiente informático AAA, pode ser acedida através de um ligações em rede seguras. O programa também suporta um modo de serviço de aplicações que permite a edição interactiva a partir de uma localização diferente do laboratório experimental.

Realização preferida da análise por multiplex: detecçâo de arranjos codificados aleatoriamente - Num formato de análise multiplex, as sondas de detecçâo são apresentadas em micropartículas codificadas ("esferas"). Com os alvos são associadas marcas. As esferas codificadas ligadas às sondas no arranjo são de preferência fluorescentes e podem ser distinguidas usando filtros que permite a discriminação entre diferentes matizes. De preferência, séries de esferas codificadas são arranjadas na forma de um arranjo planar aleatório num substrato planar, permitindo assim o exame e análise por microscopia. A intensidade de marcas alvo são monitorizadas para indicar a quantidade de alvo ligado por esfera. Este formato de ensaio está explicado mais detalhadamente na Publicação Internacional N° WO 01/98765 intitulada: "Análise molecular de múltiplos analitos". Vários métodos de produção de assinaturas ópticas estão disponíveis, por exemplo, através de captura de alvos marcados ou através da elongação de sondas mediada pelo alvo (eMAP), a segunda sendo de preferência realizada usando oligonucleótidos específicos de alelos imobilizados capazes de iniciar uma reacção de elongação catalisada por polimerase. (ver, e.g. Publicação Internacional N° WO 03/034029). São produzidos um ou mais alvos adequados, por exemplo, através de transcrição reversa de RNA e/ou amplificação de DNA genómico, facultativamente seguido de passos adicionais tais como fragmentação (ver Pedido de Patente Provisória US 60/515,413), desnaturação ou selecção de cadeias (Pedido de Patente US N° de Série 10/847,046).

Subsequentemente ao registo de uma imagem descodificadora do arranjo de esferas, o arranjo é exposto aos alvos em condições que permitem a captura por sondas apresentadas em partículas. Após um tempo de reacção adequado, o arranjo de partículas codificadas é lavado para remover os alvos livres e fracamente emparelhados residuais. Uma imagem do ensaio do arranjo foi então tirada para registar o sinal óptico dos complexos sonda-alvo do arranjo (ou para registar o sinal de sondas prolongadas, no caso da elongação mediada por captura ser o formato usado). Devido a cada tipo de partícula estar associado unicamente a uma sonda especifica de sequência, o passo descodificador permite a identificação de moléculas alvo emparelhadas determinadas a partir da fluorescência de cada tipo particular de particula.

Na descodificação é usado um microscópio de fluorescência. As séries de filtros de fluorescência no descodificador são programadas para distinguir a fluorescência produzida pelos corantes codificadores usados para corar partículas, enquanto outras séries de filtros são programadas para distinguir sinais do ensaio produzidos pelos corantes associados com os alvos. Uma câmara CCD pode ser incorporada no sistema para registo das imagens da descodificação e do ensaio. A imagem do ensaio é analisada para determinar a identidade de cada um dos alvos capturados através da correlação da distribuição espacial na imagem do ensaio com a distribuição espacial das partículas codificadas correspondentes no arranjo.

Neste formato de análise multiplex, existe uma limitação no número de tipos de sondas, por o número total de tipos de esferas no arranjo ser limitado pelo método codificador usado (e.g. o número de cores distinguíveis disponível) e pelos limites da instrumentação usada para interpretação, e.g., o tamanho do campo no microscópio usado para ler o arranjo. Deve-se também considerar, na selecção das sondas que, nas mesmas condições, determinadas sondas hibridam mais eficientemente com o seu alvo que outras. A eficiência de hibridação pode ser afectada por uma série de factores, incluindo a interferência entre sondas vizinhas, comprimento da sonda e sequência da sonda e, significativamente, a temperatura a que o emparelhamento é conduzido. Uma eficiência de hibridação baixa pode resultar num sinal falso negativo. Assim, o desenho de um ensaio deverá tentar corrigir tal emparelhamento sonda/alvo de baixa eficiência.

Após um ensaio ter sido realizado, o Sistema de Imagiologia do Arranjo (como descrito no Pedido de Patente dos Estados Unidos N° de Série 10/714,203) pode ser usado para gerar uma imagem do ensaio, que pode ser usado para determinar a intensidade dos sinais de hibridação a partir de várias esferas (sondas) . A imagem do ensaio pode ser aplicada através de um sistema de atribuição automática de alelos, como descrito aqui.

EXEMPLOS I. Atribuição de alelos - com fins ilustrativos (ver também a "imagem instantânea do écran" na Fig. 3), AAAA, usando a série de sondas nucleares, lista duas atribuições sugeridas para os grupos de alelos, nomeadamente A*03 + A*29 e A*29 + A*74. Os dois grupos são ordenados de acordo com os pesos das sondas trocadas. Quanto menor o peso, mais elevada a classificação dos grupos. Se o conjunto de sondas nucleares produzir atribuições sugeridas como degeneradas, como neste caso, a análise é automaticamente repetida usando o conjunto de sondas expandidas. Este segundo passo produz uma atribuição sugerida de A*03 + A*29 que necessitará da troca de HA120+, indicando que HA120 pode representar um falso positivo. 0 padrão de reacção e a tabela de sucessos (para alelos HLA-A) também são apresentados no écran instantâneo. No padrão de reacção, 8 indica que a sonda é positiva, 1 negativa e 0 significa que a sonda não é usada.

No modo de reacção manual, o utilizador pode editar as atribuições iniciais dos alelos através da verificação das referências conhecidas para os alelos identificados nas série nuclear e expandida e depois adequando as sequências de bits às esperadas a partir dos alelos conhecidos. Verificando os resultados experimentais contra os alelos conhecidos, proporciona-se desta forma uma validação dos resultados do ensaio e um meio para editar a sequência de bits. 0 utilizador selecciona A*03011 e A*2901101 como atribuição, HA120 como sonda trocada no modo de redacção manual na Fig. 4. EXEMPLO II: estatística da frequência de alelos 1155 amostras foram testadas usando um painel HLA-A e os padrões de intensidade das amostras foram analisados usando o programa AAA para obter atribuições de grupos de alelos com dois dígitos. A contagem e frequência relativa da ocorrência de selecção de grupos calculadas pelo programa AAA estão mostradas na Tabela 1, imediatamente abaixo.

(continuação)

0 gráfico de barras para a distribuição seguinte está mostrado na Fig. 1. É evidente que os alelos 01, 02 e 03 são muito mais abundantes nesta população, enquanto os alelos 36, 43 e 80 são comparativamente raros. EXEMPLO III: Instantâneo do écran de informação sumária das atribuições O instantâneo do écran na Fig. 3 ilustra a informação do sumário de atribuições para o painel 03250443. Inclui o nome do painel, o nome da amostra, a posição da amostra, a atribuição do alelo, sondas trocadas, mensagem de aviso e comentários. A atribuição de alelos lista o nivel de atribuição do alelo através do algoritmo computacional. As trocas e as mensagens de aviso serão apresentadas igualmente de acordo com atribuição informática. Caso exista redacção manual, a atribuição de alelos será por selecção do redactor manual. Ver Fig. 4 para uma ilustração da redacção manual. São igualmente apresentados o comentário e trocas introduzidas durante qualquer redacção manual. As sondas trocadas serão inseridas numa sequência (manual) no final, o que indica serem geradas através de redacção manual. 0 programa lista os dois primeiros dígitos da atribuição de alelos e os dígitos seguintes, se aplicável. Por exemplo, A*24(020101) indica que a entrada de dois dígitos é A*24. A janela de informação resumida apresenta toda a informação importante numa janela, o que torna fácil examinar e navegar através das diferentes amostras. EXEMPLO IV: Alfabeto de três letras: Tipagem molecular dos antigénios dos grupos sanguíneos

Numa série de aproximadamente 500 amostras clínicas e controlos, várias combinações de alelos foram identificadas através de um ensaio eMAP, projectado para identificar antigénios de grupos sanguíneos pouco frequentes incluindo Duffy (FYA/FYB), GATA, Landsteiner-Weiner (LWA/LWB), Colton (CoA/CoB), Scianna (SC1/SC2), Diego (DIA/DIB) e Dombrock (DoA/DoB) , este último compreendendo três mutações. Ver Tabela 2 abaixo. TABELA 2 - Combinações de alelos observadas para antigénios de grupos sanguíneos pouco frequentes

EXEMPLO v: Estabelecimento de relações com doenças e condições

As atribuições de alelos, determinadas pelos métodos descritos, podem ser igualmente usadas para estabelecer o risco ou a presença de doenças ou condições. É bem conhecido que determinados distúrbios imunes estão associados ao locus HLA. Os alelos associados podem ser tipados, se conhecidos, e, se desconhecidos, os métodos aqui descritos podem ser usados para estabelecer uma base de dados de alelos para indicar risco ou presença de doenças ou condições. A base de dados pode ser continuamente actualizada com base na monitorização de doentes cujas amostras foram usadas na base de dados; i.e. uma vez que alguns desenvolvem a doença, os seus alelos podem ser analisados para determinar caracteristicas comuns aos que possuem uma doença ou condição particular.

Deverá ser entendido que os termos, expressões e exemplos aqui apresentados são exemplificativos e não limitantes e que a invenção é definida apenas nas reivindicações que se seguem, e incluem todos os equivalentes da presente matéria das reivindicações. Os passos do método nas reivindicações não estão necessariamente por ordem e a menos que de outra forma seja especificado, podem ser realizados por qualquer ordem, incluindo as especificadas nas reivindicações.

Lisboa, 31 de maio de 2016

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Um método para atribuição de alelos onde as atribuições são feitas com base na submissão de uma amostra, incluindo ácido nucleico alvo, a um ensaio de hibridação ou a um ensaio de elongação mediado por captura, ou ambos, e em que vários marcadores polimórficos, presentes nos alelos no ácido nucleico alvo são analisados, o método compreendendo: determinação de um padrão de intensidade de sinal do ensaio gerado pelas interacções sonda-alvo para gerar um padrão de reacção ao designar como positivas as intensidades de sinal que excedem um patamar pré-determinado e ao designar como negativas as intensidades de sinal que não excedem o patamar pré-determinado, tornando-o assim binário o referido padrão de intensidade de sinal do ensaio gerado pelas interacções sonda-alvo onde cada referida intensidade corresponde ao número de eventos de hibridação ou elongação correspondente, conforme aplicável, fazer atribuições de alelos com base na comparação e correspondência do referido padrão de reacção com um padrão de reacção representando combinações de dois ou mais alelos de referência, conforme listado numa colecção de referências de alelos para o ácido nucleico alvo em construção; e designação de novos alelos, como os que possuem padrões de reacção que diferem dos padrões de reacção das referências representando combinações de dois ou mais alelos de referência através de uma diferença minima pré-determinada . 2. 0 método da reivindicação 1, em que o referido padrão de reacção é editado com base na comparação com o padrão de reacção de referência. 3. 0 método da reivindicação 1, incluindo ainda o passo de atribuição inicial de alelos que são então confirmados ou alterados após os referidos passos de comparação e correspondência. 4. 0 método da reivindicação 1, em que o padrão de reacção semelhante é o padrão de reacção de referência mais semelhante. 5. 0 método da reivindicação 1 ou 4, realizado através de um sistema de programa informático. 6. 0 método da reivindicação 1, em que o ensaio de hibridação gera um sinal de ensaio positivo quando a hibridação ocorre. 7. 0 método da reivindicação 1, em que o ensaio de elongação mediada por captura gera um sinal de ensaio positivo quando a elongação ocorre. 8. 0 método da reivindicação 6, em que o ensaio de elongação mediada por captura gera um sinal de ensaio positivo quando a elongação ocorre. 9. 0 método da reivindicação 1, incluindo ainda o passo de subtracção a cada intensidade de sinal, I, o sinal de controlo negativo, Inc, e dividindo o resultado pelo sinal do controlo positivo, Ipc - Inc, para obter uma intensidade normalizada (razão): r = (I - Inc)/ (Ipc - Inc) .
2. 10. O método da reivindicação 1, ainda incluindo o passo de selecção do referido patamar pré-determinado de modo a maximizar a similaridade entre o referido padrão de reacção e um padrão de reacção de uma referência. Lisboa, 31 de maio de 2016