ES2551315T3

ES2551315T3 - Composiciones de fenilalanina amoníaco-liasa procariótica y métodos de uso de dichas composiciones

Info

Publication number: ES2551315T3
Application number: ES08754717.0T
Authority: ES
Inventors: Michel C. Vellard; Paul A. Fitzpatrick; Emil D. Kakkis; Daniel J. Wendt
Original assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc
Current assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc
Priority date: 2007-05-25
Filing date: 2008-05-23
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2028-05-23
Also published as: KR101603796B1; TW200902052A; HRP20151268T1; NL301011I2; CN101842482A; WO2008153776A8; AR066716A1; BRPI0811267B1; PE20090315A1; SI2152868T1; MX2009012453A; NO2019037I1; CY2019039I1; EA018443B1; US20080008695A1; IL202132A0; EP2152868A1; PT2152868E; HUE025784T2; EP2152868B1

Abstract

Una variante de fenilalanina amoníaco liasa (AvPAL) de Anabaena variabilis donde dicha variante de AvPAL tiene una actividad convertidora de fenilalanina mayor y/o una inmunogenicidad reducida en comparación con una AvPAL tipo salvaje (SEQ ID NO:4), donde uno o más residuos de cisteína seleccionados del grupo que consiste en residuos de cisteína en las posiciones 503 y 565 se han sustituido con un residuo de serina.

Description

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La PAL bacteriana también se puede administrar en combinación con una dieta restringida en proteínas. La dieta restringida en proteínas administradas en los métodos en la presente es una que es una dieta restringida en fenilalanina donde la ingesta de fenilalanina total del sujeto está restringida a menos de 600 mg por día, con preferencia menos de 300 mg por día. En forma específica, la dieta restringida en proteínas es una suplementada con aminoácidos, tales como tirosina, valina, isoleucina y leucina. También se contempla una composición que comprende PAL bacteriana y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender además un suplemento de proteínas médico. Alternativamente, la composición PAL es parte de una leche fórmula para lactante. Alternativamente, el suplemento de proteínas está libre de fenilalanina. El suplemento de la proteína puede ser fortificado con L-tirosina, L-glutamina, L-carnitina en una concentración de 20 mg/100 g de suplemento, L-taurina a una concentración de 40 mg /100 g de suplemento y selenio. Puede comprender además las dosis diarias recomendadas de minerales, por ejemplo, calcio, fósforo y magnesio. El suplemento puede comprender además la dosis diaria recomendada de uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en L-leucina, L-prolina, acetato de L-lisina, L-valina, L-isoleucina, L-arginina, L-alanina, glicina, Lasparagina monohidrato, L-triptófano, L-serina, L-treonina, L-histidina, L-metionina, ácido L-glutámico y ácido Laspártico. Además, el suplemento puede estar fortificado con la dosis diaria recomendada de vitaminas A, D y E. El suplemento puede comprender un contenido de grasa que proporciona al menos 40% de la energía del suplemento. Tal suplemento se puede proporcionar en la forma de un suplemento de polvo o en forma de una barra de proteína.

También se describe en la presente métodos de tratamiento de diversas formas de crecimiento neoplásico y cáncer, qyue incluye leucemia linfoblástica, tumores mamarios, y melanomas.

En particular se describen métodos de uso de PAL bacteriana para la producción comercial de fenilalanina a partir de amoníaco y trans-cinamato. La fenilalanina se utiliza en el aspártamo, un edulcorante y otros productos alimenticios, que incluyen bebidas, cereales, pasteles, postres, huevos y quesos frescos, grasas, aceites, pescado y otros mariscos, carne y productos cárnicos, leche y productos lácteos, frutos secos, salsas y condimentos, sopas, azúcares, mermeladas y pastas para untar, y verduras.

También se contempla que la PAL bacteriana se puede usar para la producción de herbicidas y agentes antimicrobianos que incluyen enterocina y eritromicina.

También se describe en la presente un método para producir PAL procariótica o un fragmento, mutante, variante o análogo de esta biológicamente activo en cantidades que permiten el uso terapéutico de la enzima. El método usa PAL producida por bacterias que incluyen Streptomyces, Sorangium, Pseudomonas, y cianobacterias tales como Nostoc y Anabaena. En forma específica, PAL es producida por las especies bacterianas Streptomyces maritimus,

S. verticillatus, Soragium cellulosum, Nostoc punctiforme, Nostoc tobacum, Anabaena variabilis, y Pseudomonas putida. En forma específica, la actividad de la enzima PAL procariótica se genera utilizando ADNc o secuencias de ADN que se derivan de secuencias algunas veces descripta como codificadora de la actividad HAL o presenta un motivo PAL-HAL, pero que poseen residuos clave PAL que difieren de HAL

En particular, el método comprende la etapa de transformar un ADNc o ADN que codifica para el total o una parte de una PAL procariótica o un fragmento, mutante, variante o análogo de esta biológicamente activo en una célula adecuada para su expresión. En forma específica, un vector de expresión se usa para transferir el ADN en una célula o línea celular adecuada para su expresión. En forma específica, el ADNc se transforma en E. coli y la PAL bacteriana recombinada se sobreexpresa como proteína de fusión. En forma específica, el método de producción de PAL procariótica comprende las etapas de: (a) cultivar de las células transformadas con un ADNc que codifica la totalidad o una variante, fragmento o mutante de PAL procariótica biológicamente activa en un medio de crecimiento adecuado a una densidad apropiada para producir un cultivo de siembra, (b) introducir las células transformadas en un biorreactor, (c) suministrar un medio de crecimiento adecuado al biorreactor, y (d) separar las células transfectadas del medio que contiene la enzima.

En forma específica, PAL recombinante se sobreexpresa como una proteína de fusión marcada con octahistidilo Nterminal en un vector tal como E coli BL21 (DE3)/pLyseS (Invitrogen) con un promotor inducible tal como con IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido). Alternativamente, la PAL recombinante se sobreexpresa en E. coliBL21 (DE3)/pLysS sin una marca N-terminal. Alternativamente, el método de producción de PAL procariota comprende las etapas de: (1) crecimiento de un cultivo de siembra para un biorreactor/fermentador a partir de un patrón de glicerol en matraces de agitación; (2) introducción de tales cultivo de siembra en un biorreactor controlado en el modo de alimentación por lotes; (3) crecimiento de dicho cultivo en medios suplementados con glucosa, pH (7,8),> 20% de oxígeno disuelto, agitación hasta 1200 rpm, 30 ° C hasta alcanzar una densidad celular de OD600 de ~22-25 de 70100 (hrs) ; (4) inducción de dicho cultivo con IPTG 0,4 mM; (5) crecimiento de dicho cultivo a una temperatura reducida de 22 a 26 ° C hasta que el cambio de actividad sea < 0,1 UI/ml (aproximadamente 40-48 horas y típicamente una DO600 de 200); y (5) recolección de las bacterias por centrifugación continua. En forma específica, el medio de cultivo celular se define típicamente y está compuesta de proteína de extracto de levadura, peptonatriptona, glucosa, glicerol, casamino ácidos, trazas de sales y sales tampón de fosfato.

Además se describe en la presente un método para purificar AL bacteriana o a fragmento, análogo o mutante de esta biológicamente activo.

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glutamina, respectivamente (FIGURA 4). Por lo tanto, se puede decir que todas las proteínas con una región "PAL-HAL" y que tiene los homólogos de lisina 382 y glutamina 414 tienen el motivo distintivo de secuencia de una proteína con actividad PAL. Este motivo distintivo de PAL relativamente recién descripto (Williams et al., (2005) ibíd.) permite etiquetar la propiedad algunas enzimas de HAL a PAL y se podría usar para identificar algunas nuevas enzimas PAL a partir de bases de datos de genes y proteínas ya publicadas.

La presente solicitud se refiere a composiciones de tal PAL procariótica y fragmentos, mutantes y variantes de estas biológicamente activos y sus usos para propósitos terapéuticos e industriales.

A. DEFINICIONES

A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos usados en esta solicitud, que incluyen la memoria descriptiva y reivindicaciones, tienen las siguientes definiciones. Debe tenerse en cuenta que, tal como se utiliza en la memoria descriptiva y reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La definición de los términos de química estándar se pueden encontrar en las obras de referencia, incluyendo Carey y Sundberg, Advanced Organic Chemistry, 3ª edición, Vols. A y B (Plenum Press, Nueva York 1992). La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química orgánica sintética, espectroscopia de masas, métodos analíticos y preparativos de cromatografía, química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología, dentro de la experiencia de la técnica. Ver, por ejemplo, T.E. Creighton, Proteins: Structures y Molecular Properties (W.H. Freeman y Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 4th Edition, 2004); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1996).

Las siguientes abreviaturas de aminoácidos se usan en todo el texto:

Alanina: Ala (A): Arginina: Arg (R)

Asparagina: Asn (N): Ácido aspártico: Asp (D)

Cisteína: Cys (C): Glutamina: Gln (Q)

Ácido Glutámico: Glu (E): Glicina: Gly (G)

Histidina: His (H): Isoleucina: Ile (I)

Leucina: Leu (L): Lisina: Lys (K)

Metionina: Met (M): Fenilalanina: Phe (F)

Prolina: Pro (P): Serina: Ser (S)

Treonina: Thr (T): Triptófano: Trp (W)

Tirosina: Tyr (Y): Valina: Val (V)

En la presente, el término “polinucleótido” se refiere a un polímero compuesto de unidades de nucleótidos. Los polinucleótidos incluyen ácidos nucleicos de presentación natural, tales como ácido desoxirribonucleico (“ADN”) y ácido ribonucleico (“ARN”), como también los análogos de ácidos nucleicos. Los análogos de ácido nucleico incluyen aquellos que incluyen bases de presentación no natural, nucleótidos que intervienen en enlaces con otros nucleótidos distintos del enlace fosfodiéster de presentación natural o que incluyen bases fijados por medio de enlaces distintos de los enlaces por fosfodiéster. Por lo tanto, los nucleótidos incluyen, por ejemplo fosforotioatos, fosforoditioatos, fosforotriésteres, fosforamidatos, boranofosfatos, metilfosfonatos, quiral-metil fosfonatos, 2-O-metil ribonucleótidos, ácidos péptido-nucleicos (PNAs), y similares. Tales nucleótidos pueden sintetizarse, por ejemplo, utilizando un sintetizador automático de ADN. Típicamente, la expresión “ácido nucleico” se refiere a polinucleótidos grandes. El término “oligonucleótido” se refiere a polinucleótidos cortos, por lo general no mayores de aproximadamente 50 nucleótidos. Debe entenderse que cuando se representa una secuencia de nucleótidos mediante una secuencia de ADN (es decir, A, T, G, C), esto también incluye una secuencia de ARN (es decir, A, U, G, C) en la que "U" reemplaza a "T."

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La expresión “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere al cualquiera de los portadores, tampones y excipientes, farmacéuticos estándar, tales como una solución salina taponada con fosfato, una solución acuosa de dextrosa al 5%, y las emulsiones, tales como una emulsión de aceite/agua o de agua/aceite, y diversos tipos de agentes humectantes y/o de adyuvantes. Se describen portadores y formulaciones farmacéuticas adecuadas en: Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995). Los portadores farmacéuticos dependen del modo de administración previsto para el agente activo. Los modos de administración típicos incluyen la administración enteral (por ejemplo, oral) o parenteral (por ejemplo, inyecciones subcutáneas, intramusculares, intravenosas o intraperitoneales; o la administración tópica, transdérmica o transmucosal). Una “sal farmacéuticamente aceptable” es una sal que puede ser formulada de manera de obtener un compuesto o conjugado para uso farmacéutico, lo que incluye por ejemplo, sales de metal (de sodio, potasio, magnesio, calcio, etc.), y sales de amonio o de aminas orgánicas.

Las expresiones “farmacéuticamente aceptable” o “farmacológicamente aceptable” se refieren a un material que no es indeseable desde el punto de visto biológico ni de ninguna otra manera, es decir, el material puede ser administrado un individuo sin ocasionar ningún efecto biológico indeseable ni interactuar de una manera perjudicial con alguno de los componentes de la composición en la cual se halla contenido.

La expresión “forma de dosis unitaria”, tal como se la utilizan en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada del compuesto o conjugado de la presente dimensión, calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, portador o vehículo, farmacéuticamente aceptables. Las especificaciones para la novedosa dosis unitaria dependen del compuesto o conjugado particular utilizados, y del efecto que se desea lograr, y del comportamiento farmacodinámico asociado con cada compuesto o conjugado en el huésped.

Las expresiones “pH fisiológico” o “pH en el intervalo fisiológico” se refieren a un pH en el intervalo de aproximadamente 7,2, a 8,0 inclusive, más típicamente en el intervalo de 7, 2 a 7,6 inclusive.

Tal como se lo utiliza en la presente, el término “sujeto” abarca tanto mamíferos como no mamíferos. Los ejemplos de mamíferos incluyen sin limitación cualquier miembro de la familia de los mamíferos: seres humanos, primates no humanos tales como chimpancés, y otros especies de simios y de monos; animales de granja tales como ganado vacuno, caballos, ovejas, cabras, porcinos; animales domésticos tales como conejos, perros, y gatos; animales de laboratorio lo que incluye roedores tales como ratas, ratones y cobayos, y similares. Los ejemplos de no-mamíferos incluyen sin limitación: aves, peces, y similares. El término no designa una edad ni sexo en particular.

La pegilación de las variantes de PAL puede describirse haciendo referencia a las relaciones PAL:PEG o PEG:PAL. Tal como se utiliza en la presente, y a menos que se indique otra cosa, la relación "PAL:PEG" se refiere a la relación entre los residuos lisina en la variante de PAL y las moléculas de PEG en la reacción de pegilación. De manera similar, y tal como se la utiliza en la presente, la relación "PEG: PAL" se refiere a la relación entre las moléculas de PEG y los residuos lisina sobre la variante de PAL en la reacción de pegilación.

B. INGENIERÍA DE PROTEÍNAS BASADA EN LA ESTRUCTURA

Se conocen numerosos métodos para la ingeniería de proteínas usando optimización racional basada principalmente en la información estructural de la proteína (Brannigan, et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3(12):964-970 (2002); Marshall, et al., Drug Discov. Today 8(5):212-221 (2003)). El reemplazo sistemático de las características estructurales puede conducir a la mejora de las propiedades de la proteína y/o un rediseño de la especificidad de sustrato. La incorporación de la función de un miembro de una familia de genes en otro miembro homóloga se puede lograr mediante la introducción de un número limitado de sustituciones de aminoácidos en la vecindad de unión al sustrato inmediata. Tales mejoras en la función de las proteínas mediante la generación de mejores variantes de la proteína puede conducir a proteínas útiles para aplicaciones industriales, agrícolas y terapéuticas (Bocanegra, et al., Biochemistry 32(11):2737-2740 (1993); Failla, et al., Fold Des. 1(1):35-42 (1996); Hayes, et al., Proc Natl Acad Sci USA 99(25):15926-15931 (2002); Voigt, et al., Nat. Struct. Biol, 9(7):553-558 (2002); Malashkevich, et al., Nat Struct Biol. 2(7):548-553 (1995); Wells, et al., Proc Natl Acad Sci USA 84(15):5167-5171 (1987); Wilks, et al., Science 242(4885):15.41-1544 (1988)).

C. LA ESTRUCTURA DE PAL

La estructura tridimensional de PAL procariótica tipo salvaje se puede determinar usando cristalografía de rayos x. La proteína PAL es un homotetrámero, cada monómero que consiste principalmente de alfa-hélices y subdivisible en cuatro dominios -un dominio central catalítico, un dominio N-tetminal, y un dominio C-terminal pequeño, con similitud a la estructura de histidina amoníaco-liasa de Pseudomonas putida (HAL, Schwede, et al., Biochemistry 38(17):5355-5361 (1999)) más un dominio adicional insertado en la región C-terminal que sobresale de los extremos de la molécula intacta del tetrámero. Los primeros 25 residuos N-terminal no son visibles en la estructura para los cuatro monómeros en el tetrámero, y esta región está probablemente desordenada. Las regiones de bucle entre los residuos 109-123 y 350-353 están desordenadas para el monómero B, con las regiones 103-123 y 350-353 desordenado para los monómeros A, C y D en el tetrámero PAL. Otras dos estructuras de rayos X de PAL de

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Rhodosporidium toruloides se han determinado utilizando trans-cinamato y adición de iones NH4 durante el proceso de cristalización, con resoluciones de 2,1 Å (grupo espacial P3221) y 2,7 Å (grupo espacial P21; Calabrese, et al., Biochemistry 43(36):11403-11416 (2004)). El pH más bajo usado para la cristalización y la resolución más baja de estas estructuras llevaron a un trastorno más inherente a las estructuras (especialmente en las regiones Nterminales) y a la imposibilidad de asignar de forma inequívoca la densidad electrónica adicional presente en el cofactor MIO a un aducto NH2.

Existen numerosas estructuras relacionadas (utilizando DALI, Holm, et al., J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993)) en esta familia de enzimas tetraméricas que catalizan la eliminación de diversos grupos de ácidos carboxílicos, incluyendo los de amoníaco-liasas (PAL, HAL, y aspartato amoníaco-liasa (AAL)), fumarasa y arginosuccinato liasa (Schwede, et al., Biochemistry 38(17):5355-5361 (1999)). Además, la proteína el cristalino del ojo aviar δ-cristalino tiene un pliegue similar, pero es una forma no enzimática de esta familia estructural (Schwede, et al., (1999) ibíd.).

Las estructuras tridimensionales de rayos X de HAL de P. putida (Röther, et al., Eur. J. Biochem. 268:6011-6019 (2001); Schwede, et al., Biochemistry 27:5355-5361 (1999), y más recientemente de la PAL de Rhodosporidium toruloides (Calabrese, et al., Biochemistry 43:11.403-11416 (2004).), reveló los residuos del sitio activo de estas enzimas tetraméricas que son importantes para la unión, catálisis y la formación de MIO del sustrato. Todo residuos del sitio activo en HAL están presentes en EncP excepto para H83 y E414, que se sustituyen con residuos de valina y glutamina, respectivamente (Xiang, L., et al., J. Biol. Chem. 277:32505-3250924 (2002)). H83 en HAL se propone para unirse y orientar el resto de imidazol de L-histidina en el sitio activo y estabilizar un intermediario catiónico unido a la enzima, mientras que el grupo carboxilato del E414 puede actuar como una base en la catálisis.

La estructura cristalina de la proteína tridimensional de alta resolución de PAL se puede utilizar en métodos que implican la ingeniería de proteínas para mejorar las propiedades bioquímicas y biofísicas de PAL, y para aumentar la efectividad terapéutica in vivo de PAL. Además, la estructura proporciona información con respecto a cuáles regiones de la estructura son los más flexibles (para eliminar y generar una forma más compacta y estable de PAL), cuáles residuos se ubican cerca del sitio activo (para mutar con el fin de mejorar la actividad y/o minimizar el tamaño de la proteína, así como para proporcionar información para el diseño de inhibidores basados en la estructura), y cuáles lugares superficiales están cercanos a sitios inmunogénicos (por ejemplo, epítopos lineales identificados en estudios de mapeo) y/o sensibles proteolíticos (de los estudios de mapeo de la proteasa) , lo que permite la introducción de mutantes específicos de sitio para la ruptura directa de los sitios problema o, alternativamente, para la pegilación superficial u otra derivación química para proteger los sitios sensibles presentes en PAL nativa.

D. USOS DE LAS COORDENADAS ESTRUCTURALES DE PAL

La alta resolución de la estructura cristalina tridimensional de PAL se puede utilizar en métodos computados para la selección de regiones de la proteína de mutación, modificación, o mutación y modificación combinada. Por ejemplo, el programa GETAREA disponible comercialmente calcula la exposición de superficie para los residuos de aminoácidos sobre la base las coordenadas cristalográficas de rayos X..

La estructura cristalina tridimensional de alta resolución también se puede usar en métodos in silico para diseñar ligandos para el sitio activo de la enzima. Por ejemplo, los programas de software disponibles en el comercio para el acoplamiento y el diseño de moléculas pequeñas basadas en la estructura se pueden utilizar para diseñar inhibidores PAL (Billett, et al., Biochim Biophys Acta 524(1):219-230 (1978); Janas, et al., Acta Biochim Pol. 32(2):131-143 (1985); Zon, et al., Phytochemistry 59(1): 9-21 (2002); Alunni, et al., Arch Biochem Biophys. 412(2):170-175 (2003)).

Ingeniería de PAL basada en la estructura

La dilucidación de una estructura tridimensional confiable o modelo estructural para una macromolécula específica permite que diseño racional sea un método productivo para la optimización de la estructura y/o función específica de dicha macromolécula (Penning; et al., Chem Rev. 101(10): 3027-3046 (2001)). Los enfoques de optimización incluyen, pero sin limitación la reingeniería de la especificidad de la coenzima (Bocanegra, et al., Biochemistry 32(11):2737-2740 (1993)); mejora de las estabilidades de la proteína (Malakauskas, et al., Nat Struct Biol. 5(6): 470475 (1998); Jiang, et al., Protein Sci. 10(7):1454-1465 (2001); Luo, Protein Sci. 11(5):1218-1226 (2002); Filikov, et al., Protein Sci. 11(6):1452-1461 (2002); O'Fagain, Enz Microb Technol. 33:137-149 (2003); Cammett, et al., J Mol Biol. 327(1):285-297 (2003)), rediseño de las especificidades del sustrato (Hedstrom, et al., Science 255(5049):12491253 (1992); Failla, et al., Fold Des. 1(1):35-42 (1996); Malashkevich, et al., Nat Struct Biol. 2(7):548-553 (1995); Wilks, et al., Biochemistry 31(34):7802-7806 (1992); Feil, et al., Protein Eng. 10(3):255-262 (1997); Whittle, et al., J Biol Chem. 276(24):21500-21505 (2001)), alteración de las especificidades de unión del ligando o receptor (Cunningham, et al., Proc Natl Acad Sci USA 88(8):3407-3411 (1991); Reddy, et al., Nat Biotechnol. 14(13):16961699 (1996); Doyle, et al., Curr Opin Chem Biol. 4(1):60-63 (2000)), y reingeniería de actividades biológicas (Chen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12): 5618-5622 (1993); Sarkar, et al., Nat Biotechnol. 20:908-913 (2002); Blatt, et al., J Interferon Cytokine Res. 16(7):489-499 (1996)).

Se puede usar ingeniería basada en la estructura para generar variantes de PAL que incluyen mutantes racionales, tales como truncamientos, supresiones, inserciones, variantes de empalme, mutaciones puntuales, sustituciones,

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Biochemistry 36:10867-10871 (1997); El-Batal, et al., Acta Microbiol Pol. 49(1):51-61 (2000);Röther, et al., Eur. J. Biochem. 269:3065-3075 (2002)) y mutantes de HAL (Taylor, et al., J. Biol. Chem. 269(44):27473-27477 (1994); Baedeker, et al., Eur. J. Biochem. 269(6):1790-1797 (2002)).

Optimización de cinética de PAL – mutantes procarióticas con mejor actividad catalítica

Los sitios biológicamente activos de PAL tipo salvaje se pueden modificar como se desee para optimizar las características cinéticas de PAL. Km, la concentración de sustrato que da la mita de la actividad máxima, está íntimamente relacionada con la eficacia terapéutica de PAL en el mantenimiento de niveles de Phe dentro de un rango aceptable, es decir, 120 µM a 240 µM. Km es la afinidad de la enzima por el sustrato. Mediante el control de afinidad, se puede limitar o controlar la eficacia de cualquier enzima frente a diferentes concentraciones de sustrato. Por ejemplo, si Km es de µM (Rhodosporidium toruloides), la actividad de la enzima se reducirá aproximadamente 12,5% en los niveles sanguíneos de Phe de 240 µM y hasta aproximadamente 3% en los niveles sanguíneos de Phe de 60 µM. Si Km es 240 mu M, la actividad de la enzima se reducirá aproximadamente 50% en los niveles sanguíneos de Phe de 240 µM y hasta aproximadamente 12% en los niveles sanguíneos de Phe de 60 µM. Si la Km es 120 µM, la actividad de la enzima se reducirá a aproximadamente 70% en los niveles sanguíneos de Phe de 240 µM y hasta aproximadamente 35% en los niveles sanguíneos de Phe de 60 µM. De manera óptima, un objetivo terapéutico sería tener una enzima con actividad suficiente para reducir, pero también mantener Phe dentro del rango óptimo de aproximadamente 120 µM a aproximadamente 240 µM. Una enzima con un Km alto (es decir, 1,000 µM) perderá la actividad rápidamente ya que los niveles de fenilalanina caen dentro del rango normal y también requerirán la administración poco práctica de volúmenes de dosis muy concentrados o grandes. Por otro lado, una enzima con una Km muy baja puede agotar rápidamente los niveles de Phe, lo que puede ser fatal para hiperfenilalanemias pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer.

Como se describe en la presente, algo de la PAL modificada biológicamente activa tiene una kcat de al menos aproximadamente 0,1 s-1 o mayor de aproximadamente 0,5 s-1. Alternativamente, la PAL modificada biológicamente activa tiene una kcat de al menos aproximadamente 0,2 s-1 o mayor de aproximadamente 1,0 s-1. Como se describe en la presente, la PAL modificada biológicamente activa tiene una Km de entre aproximadamente 10 µM a aproximadamente 1.000 µM. Alternativamente, la PAL modificada biológicamente activa tiene una Km de entre aproximadamente 100 µM a aproximadamente 1.000 µM. Como se describe en la presente, la PAL modificada biológicamente activa presenta actividad enzimática que es desde aproximadamente dos veces a aproximadamente 1000 veces mayor que la de la de tipo salvaje. Como se describe en la presente, la PAL modificada biológicamente activa presenta actividad enzimática que es de aproximadamente 10% a aproximadamente 100% mayor que la de la de tipo salvaje. Tales proteínas PAL modificada biológicamente activa se pueden formar usando métodos bien conocidos en la técnica, tales como mediante mutagénesis dirigida al sitio.

Se demostró que todos los residuos del sitio activo en HAL, están presentes en EncP excepto por H83 y E414, que se sustituyen con residuos de valina y glutamina, respectivamente (Xiang, L., et al, J. Biol Chem 277:32505-32.509 (2.002)). Se investigó el papel de H83 en HAL en la unión y orientar el resto de imidazol de L-histidina en el sitio activo y en la estabilización de un intermediario catiónico unido a la enzima (Xiang, et al., J. Bacteriology 187(12):4286-4289 (2005); Xiang, et al., J. Bacteriology 188(14):5331 (2006)). Se propuso que el grupo carboxilato de E414 puede actuar como una base en la catálisis. En el estudio, las mutantes de EncP se generaron por mutagénesis dirigida al sitio para evaluar la contribución de V83 a la formación de ácido cinámico por EncP. El reemplazo de valina con histidina generó una mutante, V83H, que se caracteriza por una pérdida en la actividad PAL. El reemplazo de valina por alanina produjo una mutante, V83A, que era más activa que EncP V83A tipo salvaje, presentó una afinidad ligeramente inferior a L-fenilalanina con un Km de 120 µM versus 23 µM para la enzima de tipo salvaje. Sin embargo, en comparación con EncP V83A tipo salvaje tenía una kcat más alta y era más activo que la enzima de tipo salvaje.

Variantes de proteína específicas: Variantes que tienen inmunogenicidad reducida

Actualmente se usan numerosas estrategias para reducir la inmunogenicidad de la proteína. Como se describe en la presente, las modificaciones que se introducen para minimizar la respuesta inmune no destruyen la estructura, la función, o la estabilidad de la macromolécula. Las estrategias eficaces utilizadas incluyen el aumento de contenido secuencia humana (quimeras y/u otras estrategias de 'humanización'), la mejora de las propiedades de la solución, la eliminación de epítopos de anticuerpos, la introducción de derivación química (tal como pegilación), y/o la identificación y eliminación de agretopos MHC. Para un agente terapéutico inyectado, la inmunorreactividad in vivo se puede abordar mediante la realización del mapeo de epítopos seguido por mutagénesis racional para modificar y/o mutar de otra manera estos sitios de inmunogenicidad, solo y en combinación con la pegilación específica de sitio (Hershfield, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7185-7189 (1991); Leong, et al., Cytokine 16(3):106-119 (2001); Lee, et al., Pharm. Res. 20(5):818-825 (2003)) u otros métodos de derivación química para reducir la inmunorreactividad de la proteína a un nivel aceptable. La modificación de las regiones de la proteína de superficie antigénicas reduce la inmunogenicidad (Chirino, et al., Drug Discov. Today 9(2):82-90 (2004)). Un método de mejora implica la construcción de proteínas de menor tamaño que retienen la actividad catalítica (por ejemplo, se utiliza un ensayo de absorbancia para la medición de la actividad). Un segundo método de mejora, ingeniería de proteínas acoplada a la detección ELISA, también se puede utilizar para identificar mutantes con inmunorreactividad reducida. Otro método introduce mutaciones puntuales para los sitios de Lys de superficie adicionales para la derivación por

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pegilación, un método que demuestra reducir la inmunogenicidad con la prueba de enzima fosforilasa del nucleósido purínico (Hershfield et al. (1991) ibíd.). Una vía alternativa utiliza la mutación de residuos localizados en regiones de epítopos de proteínas para eliminar sitios inmunogénicos (Yeung, et al, J Immunol 172 (11):6.658-6.665 (2004)). En un enfoque que es análogo a la humanización de anticuerpos, las regiones y/o los residuos del bucle homólogos de bucle de los anticuerpos humanos se sustituyen en las regiones de bucle correspondientes de una proteína homóloga.

La mejora de las propiedades de la solución de proteínas pueden aumentar la actividad de la enzima específica y/o reducir la inmunogenicidad. Una propiedad de la solución típica de las proteínas recombinantes expresadas en bacterias es la formación de agregados de proteínas, debido, por ejemplo, a la formación de enlace disulfuro intercadena, interacciones hidrofóbicas y/o cationes divalentes (Chi, et al, Pharm Res 20 (9):1325 -1336 (2003)). La agregación de las proteínas expresadas de forma recombinante puede mejorar la respuesta inmune (Hermeling, et al, Pharm Res 21 (6):. 897-903 (2.994); Schllekens, Nephrol Dial Transplant 20 (Suppl 6): vi3-9 (2005)). Un método de mejora implica la sustitución de residuos de cisteína de superficie con otros residuos de aminoácidos (por ejemplo, serina) para minimizar la posibilidad de formación de enlaces disulfuro entre cadenas. Por ejemplo, la sustitución de dos residuos de cisteína de superficie con residuos de serina reduce la agregación de la corismato liasa con efectos menores sobre la actividad de la enzima (Holden, et al, Biochim Biophys Acta 1,594 (1):. 160-167 (2002)).

La eliminación de los sitios de procesamiento proteolítico de la proteína terapéutica también puede proporcionar una reducción de la inmunogenicidad al evitar el procesamiento proteasómico, de este modo se evita el recorte y el procesamiento de los fragmentos de péptidos para la unión de célula presentadora de antígeno. Se ha observado un fenómeno similar en la alteración de las regiones flanqueantes para los determinantes de MHC de clase II, lo que impide la presentación de las células T autorreactivas (Maverakis, et al., Proc Natl Acad Sci, USA 100(9):5342-5347 (2003)).

Mapeo de epítopos

Los epítopos terapéuticos de la proteína se pueden calcular usando un número de algoritmos o determinado experimentalmente con métodos in vitro o in vivo. Los programas de computadora tales como "Compañero péptido" y "Protean" en el conjunto del programa de Lasergene de DNAStar se utilizan comúnmente para estimar las regiones de epítopo superficiales de una proteína basada en la composición química y la conformación de una proteína. Las regiones inmunogénicas de una secuencia de proteína son las regiones de hidrofilicidad calculada más alta, sobre la base de un índice de hidrofilicidad, antigenicidad y, sobre la base de anfipaticidad y otros parámetros conformacionales de las regiones de proteína superficial calculadas. Alternativamente, los agretopos en una secuencia de proteína se pueden ubicar sobre la base de predicciones modeladas por computadora de la unión HLA potencial (Robinson, et al., Nucleic Acids Res. 31(1):311-314 (2003); De Groot, et al., Novartis Found. Symp. 254:5772 (2003)). Además, los epítopos se pueden identificar usando métodos bioquímicos in vitro (Tangri, et al., Curr. Med. Chem. 9(24):2191-2199 (2002)) y basados en células in vitro (Stickler, et al., J Immunother. 23(6):654-660 (2000); Stickler, et al., J Immunol Methods 281(1-2):95-108 (2003)). Para la ingeniería de proteínas, la reducción relativa de la inmunogenicidad se puede controlar usando ensayos similares en el ensayo basado en células in vitro de Stickler, et al. (Toxicol Sci. 77(2):280-289 (2004)).

El análisis Pepscan (mapeo de epítopos) implica el uso de una biblioteca de péptidos superpuestos que abarcan regiones de la superficie de la secuencia de la enzima y el análisis con anticuerpos policlonales de conejo generados contra los péptidos superpuestos que cubren la secuencia de la proteína de la enzima completa, y de este modo revela los epítopos lineales presentes en la enzima. Sobre la base de la estructura tridimensional de la enzima, los sitios identificados experimentalmente de antigenicidad están mutados ya sea por la mutación aleatoria de los residuos de la región del epítopo para eliminar los sitios de reconocimiento de epítopo o mediante mutación específica de sitio para introducir los residuos de Lys o Cys en la superficie cerca de estos sitios del epítopo proporcionan lugares para pegilación para cubrir y proteger estos sitios de reconocimiento inmunogénica. La detección ELISA de estas mutantes de enzimas potencialmente no inmunogénicas (o formas pegiladas de estos mutantes de enzimas) proporciona la identificación in vitro de subconjuntos de mutantes de enzimas que muestran inmunorreactividad disminuida.

Identificación y mutación de los residuos de superficie

Se pueden identificar los residuos expuestos en la superficie en o cerca de las regiones inmunogénicas de la enzima. Estos lugares serán un subconjunto del número total de lugares superficiales accesibles al solvente presentes en la proteína, que dependen de la proximidad a la superficie así como la proximidad a regiones de inmunogenicidad/antigenicidad. La estructura tridimensional de la proteína, determinada usando cristalografía de rayos X, RMN, o modelado por homología, se puede utilizar en los programas de software disponibles comercialmente para calcular el área de superficie accesible al solvente de la macromolécula. La salida proporcionada usando el programa GETAREA 1.1 (Fraczkiewicz, et al., J. Comp. Chem. 19:319-333 (1998)) proporciona una estimación confiable de la accesibilidad de superficie para PAL R. toruloides. GETAREA y PARAREA y programas similares calculan el área superficie accesible al solvente usando métodos continuos con un enfoque paramétrico basado en el teorema de Gauss-Bonnet. PARAREA encuentra puntos de intersección

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(2000)). Las formas mutantes de PAL se pueden obtener siguiendo los procedimientos de cualquiera de los métodos de la técnica.

HAL como un sustituto de enzima alternativo

La estructura de encP de Streptomyces maritimus se ha modelado por homología basado en la estructura de la HAL de P. putida. Aunque menor que la PAL, la estructura de S. maritimus es más similar a la PAL humana, lo que hace a encP una forma posiblemente menos inmunogénica de un amoníaco-liasa por usar para la manipulación genética de proteínas PAL. Un método alternativo para la obtención de variantes PAL no inmunogénicas implica la mutación de encP de S. maritimus u otro PAL procariótica para reemplazar las secuencias inmunogénicas por las secuencias de amoníaco-liasa de histidina humana (HAL, Suchi, et al., Biochim. Biophys. Acta 1216 (2) : 293-295 (1993)), utilizando mutación seguido de la selección para encP u otros mutantes procarióticas con actividad PAL, para obtener una encP "humanizada" u otra proteína PAL procariótica que se puede pegilar más siguiendo las etapas de mutación y selección para la actividad.

Variantes de proteína específicas: Variantes que tienen sensibilidad a proteasa reducida

Numerosas estrategias se usan actualmente para reducir la susceptibilidad de la proteína proteasa. En algunos ejemplos, las modificaciones introducidas para minimizar la sensibilidad proteolítica no destruyen la estructura, función, o estabilidad de la macromolécula. Las estrategias efectivas incluyen proporcionar una enzima con una especie que estabiliza el sitio activo tal como un inhibidor competitivo (Gilbert, et al, (1981) ibíd.; patentes US Nros 6.548.644;.. 6.451.986; 6.433.158; 6.461.849), la modificación química de los grupos amino en sitios de Lys y/o Arg susceptibles para bloquear los sitios de unión de tripsina, mutación de residuos de Tyr, Phe, y/o Trp sensibles a quimiotripsina en los aminoácidos neutros más pequeños para abolir la susceptibilidad de escisión, ligar o acoplar PAL a otras macromoléculas de protección (tales como dominios de anticuerpo Fc o los componentes no tóxicos de neurotoxina botulínica), y/o la introducción de sitios de Lys o Cys cerca de los sitios de proteasa susceptibles a proteasa para la derivación química subsiguiente con PEG u otros grupos químicamente protectores o estabilizantes.

F. VARIANTES PAL MODIFICADAS QUÍMICAMENTE

La modificación química de la macromolécula se puede realizar de una manera no específica (que produce mezclas de especies derivadas) o de una manera específica de sitio (basada en la derivación dirigida por reactividad de la macromolécula tipo salvaje y/o modificación selectiva de sitio usando una combinación de mutagénesis dirigida al sitio y modificación química), o de forma alternativa usando procedimientos de ligamiento de proteínas expresadas (Hofmann, et al., Curr Opin Biotechnol. 13(4):297-303 (2002)). La modificación química se usa para reducir la inmunogenicidad. La pegilación es un método demostrado para reducir la inmunogenicidad de las proteínas (Bhadra, et al, Pharmazie 57 (1): 5-29 (2002)), pero también son posibles la glicosilación y otros procedimientos de derivación química, utilizando la modificación con la fosforilación, amidación, carboxilación, acetilación, metilación, creación de sales de adición de ácido, amidas, ésteres, y derivados de N-acilo (Davis, Ciencia 303: 480-482 (2004)).

Proteínas pegiladas

Una serie de diferentes reacciones de pegilación en PAL, usando una variedad de relaciones de reactivo químico PEG a proteína PAL proporcionará derivados de PEG-PAL para cada método de modificación. El grado óptimo de pegilación se puede determinar sobre la base de la actividad residual obtenido para cada especie PAL derivada usando el ensayo de absorbancia en combinación con análisis PAGE y de gel nativo para determinar el grado de derivación del PEG. Después de determinar los rangos iniciales de modificación óptimo, se puede determinar el análisis cinético comparativo (incluyendo determinaciones de Vmax y Km, constantes de unión de sustratos, estabilidad proteolítica, dependencia del pH de la actividad, dependencia de temperatura de la actividad) e inmunorreactividad de las especies PEG-PAL óptimas por ELISA, inmunoprecipitación y transferencia de Western. La manipulación genética de las proteínas también se puede utilizar para generar la mutante PAL más favorable para la pegilación usando las condiciones óptimas de derivación; mediante la minimización del tamaño de la proteína PAL y la modificación solamente de las regiones más antigénicas de la superficie PAL, el costo de la modificación con PEG se reducirá mientras que al mismo tiempo se retiene la máxima cantidad de actividad enzimática y la cantidad mínima de inmunogenicidad. Del mismo modo, se puede usar la pegilación específica de sitio para proporcionar derivados de enzimas.

Otras modificaciones químicas tales como la fosforilación u otra modificación química de los residuos de Lys, Arg, Cys se pueden usar para enmascarar regiones inmunogénicas y/o regiones sensibles proteolíticas. Tales modificaciones químicas incluyen el método de adición de polímero de Bednarsaki y el método de reticulación Altus Corporation para mejorar la estabilidad PAL, reducir la inmunogenicidad, y mejorar la resistencia a la proteasa son ejemplos representativos. Bednarsaki demostró que la adición de polímero mejora la estabilidad de la temperatura de proteína (Wang, et al., J. Am. Chem. Soc. 114(1):378-380 (1992)), y Altus Corporation ha encontrado que la reticulación con glutaraldehído mejora la estabilidad de la enzima.

Para descubrir si la vida media terapéutica in vivo de una proteína tal como PAL se beneficiaría de pegilación, se sintetiza una gran variedad de diferentes conjugados PEG:PAL, caracterizado in vitro y analizado in vivo para la

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Además, incluso si el paciente es uno que sólo se manifiesta los síntomas de HPA no PKU, es decir, tiene una concentración elevada de Phe plasmática de hasta 600 µM, pero se le permite de otro modo a comer una dieta normal de proteínas se beneficiarán de la terapia de PAL de la invención porque se ha demostrado que las concentraciones elevadas de Phe tienen efectos significativos en el IQ de tales individuos. Por otra parte, como se discute a continuación, la intervención terapéutica con PAL de sujetos con necesidades especiales, por ejemplo, las mujeres embarazadas y lactantes, es particularmente importante, incluso si los niveles de Phe plasmáticos de ese paciente están dentro del nivel percibido "seguro" menor de 200 µM.

PKU materna y sus métodos de tratamiento

El control metabólico de los niveles de Phe plasmática en mujeres con PKU que planean la concepción y los que están embarazadas es importante debido a las graves consecuencias para el feto expuesto a niveles de Phe incluso moderadamente elevados en el útero, independientemente del estado de PAH del feto. El control terapéutico de la concentración de Phe plasmática es especialmente importante en el primer trimestre del embarazo, ya que el fracaso para lograr un control adecuado producirá trastornos que incluyen microcefalia, deficiencia mental y enfermedad cardíaca congénita.

Por ejemplo, la Declaración de Consenso del NIH (vol 17 # 3, octubre de 2000) sobre la fenilcetonuria informó que la exposición del feto a niveles de Phe materna de 3-10 mg/dl produjo una incidencia del 24% de microcefalia, mientras que las personas expuestas a más de 20 mg/dL (es decir, mayor que 1.200 µM) tuvo una incidencia de 73% de microcefalia. Del mismo modo la enfermedad cardíaca congénita se encuentra en más del 10% de los niños expuestos a niveles maternos de Phe que eran superiores a 20 mg/dL. Es importante destacar que se ha observado que los niveles de Phe mayores de 6 mg/dl disminuyen significativamente el IQ del niño. Por lo tanto, es imprescindible garantizar que la concentración de Phe plasmática de las mujeres con todas las formas de la fenilcetonuria, incluso las que se manifiesta la HPA más leve, deberá ser estrictamente controlada para evitar el riesgo de síndrome de PKU materna. Sin embargo, los niveles deseados aceptables para las concentraciones de Phe plasmáticas de mujeres con PKU que se han utilizado en las clínicas estadounidenses han variado entre 10 mg/dL y 15 mg/dL, que son mucho más altos que los niveles de 2-6 mg/dL recomendados para mujeres embarazadas o 1-4 mg/dl que se utilizan en las clínicas británicas y alemanas para disminuir los riesgos de desarrollar el síndrome de PKU materna.

Otra consideración importante para las mujeres embarazadas es su ingesta de proteínas total. Durante el embarazo, es importante que las mujeres ingieran suficiente proteína porque se ha sugerido que una dieta baja en proteínas durante el embarazo producirá desarrollo renal retardado y la subsiguiente reducción en el número de nefrones y potencialmente lleva a la hipertensión en la edad adulta. (D'Agostino, N. Engl. J. Med. 348 (17) 1723 a 1124, (2003)). La siguiente tabla proporciona lineamientos ejemplificativos para la ingesta de proteínas totales en la dieta recomendada para varias personas.

Tabla 1: Lineamientos de los Estados Unidos para los requerimientos de proteína dietaria

imagen21: Edad Ingesta de proteína total recomendada (g)

Lactante: 6 meses o menos 13

imagen22: 6 meses-1 año 14

imagen23: 1-3 años 16

Niño: 4-6 años 24

imagen24: 7-10 años 28

Varones: 11-14 años 45

imagen25: 15-18 años 59

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Sterogene Etox gel. NpPAL o AvPAL PEGilados formulados y estériles se sellaron en viales y se colocaron a -70 °C hasta que estén listos para los estudios in vivo.

EJEMPLO 7 (solo para referencia)

Efecto del PAL de Nostoc punctiforme (NpPAL) y su forma PEGilada en ratones afectados con PKU

5 El objetivo de este estudio fue determinar los niveles de fenilalanina en plasma (Phe) después de las administraciones subcutáneas de NpPAL o NpPAL pegilada.

Los efectos de (1) una R91K PAL con lisina mutante de Rhodosporidium toruloides y su forma pegilada (1: 3 PA :: PEG) (PEG de Nippon Oil and Fat, NOF) a una dosis de 3,0 UI/ml; (2) NpPAL y su forma pegilada (1: 3 PAL: PEG NOF) a dosis que varían de 0,6 UI/ml y 3,0 UI/ml; y (3) vehículo se analizaron en ratones homocigotas ENU2 10 (también conocidos como ratones BTBRenu2). Se demostró previamente que R91K PAL que tienen una mejor actividad relativa a PAL de R. toruloides tipo salvaje. R91K se encuentra en la hélice que abarca Asp86 a Leu101, cerca de la superficie de la proteína. Todas las soluciones tenían menos de 1,0 UE/ml de endotoxina y se almacenaron a -75-80 °C. El ratón ENU2 o BTBRenu2 es mutante homocigota en el locus del gen fenilalanina hidroxilasa (PAH), lo que produce un animal con hiperfenilalaninemia grave. Los niveles de fenilalanina plasmática

15 altos (Phe) hacen que este animal sea el modelo adecuado para evaluar la capacidad de la fenilalanina amonio-liasa (PAL) para reducir el plasma.

Diseño experimental

Tabla 3: Designaciones del grupo y niveles de dosis

Grupo N.º: N Administrado Nivel de dosis (UI/ratón) Actividad del artículo ensayo (IU/mL) de Volumen de dosis (mL)

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2: R91K 1.0 3.0 imagen40 0.33

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7: 5 npPAL 0.2 0.46 imagen57 0.43

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9: 5 npPAL 0.6 1.38 imagen83 0.43

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Diseño experimental

Tabla 5: Designaciones del grupo y niveles de dosis

Número de grupo: Descriptores del grupo Administrado Número de dosis N

1: Control vehículo, s.i.d. Tris NaCl 90 3

2: b.i.w.a R91K 26 3

3: b.i.w. pos-semana 3b R91K 22
3

4: Dosis de escalamiento, s.i.d. R91K 90 7

5: Dosis decreciente, s.i.d R91K 90 7

6: b.i.w.a R91K 1:3 NOF 26
6

7: b.i.w. pos-semana 3b R91K 1:3 NOF 22 6

8: Dosis de escalamiento, s.i.d. R91K 1:3 NOF 90 7

9: Dosis decreciente, s.i.d R91K 1:3 NOF 90 7

10: PAL bacteriana, s.i.w.c npPAL 1:3 NOF 13 6

b.i.w.: dos veces por semana s.i.d.: una vez por día s:i.w.: una vez por semana aDosis del día 1 y 4 en un esquema de 7 días (ejemplo, cada lunes y jueves) b Los Grupos 3 y 7 se administrarán en el día 1 y 8, y a partir del día 22 seguirá el mismo esquema de 7 días como los grupos 2 y 6. c aDosis del día 1 en un esquema de 7 días (ejemplo, cada lunes)

Tabla 6: Niveles de dosis

imagen92: Días de dosis

1 -14: 15 -28 29 -42 43 -56 57 -90

Números del grupo: Descriptores del grupo Nivel de dosis en UI/ratón/día

1: Control vehículo 0 0 0 0 0

2, 3, 6 y 7: Dosis estática b.i.w. 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

4 y 8: Dosis de escalamiento, s.i.d. 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

5 y 9: Dosis decreciente, s.i.d. 3,0 2,0 1,0 0,8 0,6

10: PAl bacteriana, s.i.w. 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

La administración de dosis se realizó una vez al día para los grupos 1, 4, 5, 8 y 9. Los Grupos 2 y 6 (b.i.w) se administraron dos veces por semana en los días 1 y 4, por ejemplo, todos los lunes y jueves. Los Grupos 3 y 7 (b.i.

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ratones tratados con AvPAL tipo salvaje pegilada o doble mutante de cisteína AvPAL pegilada. Como se muestra en la FIGURA 15, tampoco hubo diferencias significativas en el peso corporal entre los ratones tratados con vehículo, AvPAL tipo salvaje pegilada o doble mutante de cisteína AvPAL pegilada. Es probable que no se observen diferencias significativas en el peso corporal debido a que se usaron ratones machos y hembras en el estudio.

5 Los títulos de anticuerpos anti-AvPAL en estos ratones se analizaron con un ensayo ELISA indirecto. En este ensayo, las placas de microtitulación se recubrieron con AvPAL, se bloquearon, y luego se expusieron a sueros diluidos apropiadamente de cada sangrado de ratón. La AvPAL, que se unió a la superficie de placas de microtitulación, fue reconocida y unida por los anticuerpos específicos de AvPAL presentes en las muestras de suero. Los anticuerpos IgG antirratón de cabra marcados de manera detectable detectaron los anticuerpos anti

10 AvPAL unidos. Las muestras de suero se diluyeron 1:50 inicialmente, y se analizaron en comparación con el "punto de corte", que provino del suero de ratón diluido 1:50 mezclado. Las muestras con la señal más baja que el punto de corte se informaron como <50, o "negativo". El resto de las muestras, consideradas "positivas", se diluyeron adicionalmente en titulación en serie 1: 3 a una dilución en la que la señal cayó por debajo del punto de corte. El factor de dilución más alto que dio una señal positiva (es decir, más alto que el punto de corte) se informó como el

15 título de esa muestra. Durante esta serie de título, un cambio de 3 veces del título no puede reflejar una diferencia significativa del anticuerpo detectado porque la diferencia podría ser el resultado de un cambio mínimo de la señal en el nivel de punto de corte..

Como se muestra en la Tabla 10, los títulos de anticuerpos anti-AvPAL fueron más bajos en los ratones tratados con la mutante de cisteína doble AvPAL pegilada en comparación con los ratones tratados con una dosis equivalente

20 (4,0 UI) de AvPAL tipo salvaje pegilada. Aunque no se observó respuesta clara a la dosis, los ratones tratados con la dosis alta (4,0 UI) de mutante de cisteína doble AvPAL pegilada tenían mayores títulos de anticuerpos anti-AvPAL que los ratones tratados con la dosis baja (0,25 UI) de mutante de cisteína doble AvPAL pegilada.

Tabla 10: Títulos de IgG anti-AvPALs

Proteína AvPAL pegilada: Muestra Pre D8 D15 D 22 D29

AvPAL_C565SC503S (0.25 UI): S203 <50 50 <50 50 50

imagen99: S204 <50 50 50 50 450

imagen100: S205 <50 <50 <50 <50 <50

imagen101: S206 <50 <50 50 50 50

AvPAL C565SC503S (1.0 UI): S307 <50 <50 <50 <50 <50

imagen102: S308 <50 <50 <50 <50 <50

imagen103: S309 <50 <50 <50 <50 50

imagen104: S310 <50 <50 <50 <50 <50

AvPAL C565SC503S (4.0 UI): S411 <50 <50 <50 50 50

imagen105: S412 <50 <50 50 50 50

imagen106: S413 50 50 50 450 150

imagen107: S414 <50 <50 <50 <50 <50

WT AvPAL (4.0 UI): S515 <50 <50 150 150 450

imagen108: S516 <50 50 150 150 450

imagen109: S517 <50 <50 150 4050 12150

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Proteína AvPAL pegilada: Muestra Pre D8 D15 D 22 D29

imagen110: S518 <50 50 150 450 150

imagen111

Proteína AvPAL pegilada: Muestra Pre D 36 D 43 D 50 D 57

AvPAL_C565SC503S (0.25 UI): S203 <50 <50 150 150 <50

imagen112: S204 <50 >1350 >1350 >1350 4050

imagen113: S205 <50 N/A* N/A N/A N/A

imagen114: S206 <50 <50 50 50 <50

AvPAL_C565SC503S (1.0 UI): S3307 <50 50 150 >1350 150

imagen115: S308 <50 <50 <50 <50 <50

imagen116: S309 <50 450 >1350 >1350 450

imagen117: S310 <500 <50 50 50 <50

AvPAL_C565SC503S (4.0 UI): S411 <50 50 150 50 50

imagen118: S412 <50 150 150 150 50

imagen119: S413 50 450 450 450 150

imagen120: S414 <50 150 150 150 150

WT AvPAL (4.0 UI): S515 <50 450 1350 1350 150

imagen121: S516 <50 150 450 450 150

imagen122: S517 <50 4050 4050 4050 450

imagen123: S518 <50 50 50 50 <50

*Ninguna muestra/datos no disponibles

Los títulos de IgG anti-AvPAL reducidos en ratones tratados con 4,0 UI de mutante de cisteína doble AvPAL pegilada en comparación con 4,0 UI de AvPAL tipo salvaje pegilada se mantuvieron durante todo el estudio.

5 En el segundo estudio, la mutante de cisteína doble AvPAL AvPAL_C565SC503S se analizó en diferentes relaciones de pegilación. Los ratones ENU2 macho se dividieron en 5 grupos de dosis: 4 grupos de prueba (n=4) y un grupo de vehículo (n=2). A cada ratón se administraron 8 veces por semana dosis s.c. de vehículo, mutante de cisteína doble AvPAL pegilada de dosis baja (4 UI y 1:1.6 de relación AvPAL:PEG), mutante de cisteína doble AvPAL pegilada de dosis media (4 UI y relación 1:2.4 de AvPAL:PEG), mutante de cisteína doble AvPAL pegilada de 10 dosis alta (4 UI y relación 1:3 de AvPAL:PEG), o AvPAL pegilada tipo salvaje (4 UI y 1:3 de relación AvPAL:PEG). Se recolectó plasma predosis y a 4 días posdosis (al día 61) y se analizaron para determinar los niveles de Phe. También se recolectó predosis a 4 días posdosis (hasta el día 57) para el análisis de los niveles del anticuerpo anti-AvPAL. Los ratones también se pesaron una vez por semana comenzando 2 días antes de la primera dosis (al día 40).

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Un ratón tratado con vehículo murió durante el estudio. Como se muestra en la FIGURA 16, se observó una reducción dependiente de la relación de PEG en los niveles de Phe en plasma 4 días después de cada inyección

s.c. de la mutante de cisteína doble AvPAL pegilada. A relaciones de PEG equivalentes, no hubo diferencia en los niveles de Phe plasmáticos entre los ratones tratados con AvPAL tipo salvaje pegilada o mutante de cisteína doble 5 AvPAL pegilada. Como se muestra en la FIGURA 17, los pesos corporales de los ratones tratados con AvPAL tipo salvaje pegilada o mutante de cisteína doble AvPAL pegilada fueron significativamente más altos que los ratones tratados con vehículo.

Los títulos de anticuerpo anti-AvPAL en estos ratones se analizaron con el ensayo ELISA indirecto descripto anterior.

10 Como se muestra en la Tabla 11, los títulos de anticuerpo anti-AvPAL fueron más bajos en los ratones tratados con la mutante de cisteína doble AvPAL pegilada en comparación con los ratones tratados con una dosis equivalente de AvPAL tipo salvaje pegilada que tiene la misma relación (1:3) de AvPAL a PEG. Se observó una respuesta de dosis inversa entre los títulos de anticuerpo anti-AvPAL y la relación de AvPAL a PEG, compatible con la expectativa de que la pegilación de proteínas, tales como AvPAL, se asocia con inmunogenicidad reducida in vivo.

15 Tabla 11: Títulos de IgG anti-AvPAL

Proteína AvPAL pegilada: Muestra Pre D 15 D 28 D 43 D 64

WT AvPAL (PEG 1:3 NOF): S101 <50 450 12150 4050 >1350

imagen124: S106 <50 450 450 450 4050

imagen125: S110 <50 50 50 150 450

imagen126: S117 <50 150 450 450 1350

AvPAL C565SC503S (PEG 1:1.6): S202 50 450 12150 1350 1350

imagen127: S207 <50 1350 12150 12150 36450

imagen128: S211 <50 450 1350 12150 12150

imagen129: S218 50 150 36450 26.57M >36450

AvPAL_C565SC503S (PEG 1:2.4): S303 <50 50 150 450 4050

imagen130: S308 <50 50 50 50 450

imagen131: S312 <50 50 150 450 4050

imagen132: S313 <50 50 450 1350 4050

AvPAL_C565SC503S (PEG 1:3): S404 <50 50 50 450 450

imagen133: S409 50 50 50 150 450

imagen134: S414 <50 <50 50 450 1350

imagen135: S416 <50 <50 150 50 450

Vehículo: S505 <50 <50 <50 <50 N/A*

imagen136: S515 <50 <50 <50 <50 <50

*N/A: ninguna muestra de suero para este punto temporal

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Los resultados anteriores muestran que la mutante de cisteína doble AvPAL pegilada AvPAL_C565SG503S tiene actividad enzimática de PAL in vivo que es comparable con la AvPAL tipo salvaje pegilada. Debido a que AvPAL tipo salvaje no pegilada no presentó actividad enzimática PAL detectable in vivo (ver EJEMPLO 8), se concluye que las

5 variantes de AvPAL, que incluyen la mutante de cisteína doble AvPAL pegilada; AvPAL_C565SC503S, y la AvPAL tipo salvaje pegilada tienen mayor actividad convertidora de fenilalanina que la AvPAL tipo salvaje.

Los resultados anteriores muestran también que la variante de AvPAL pegilada, que tiene agregación de proteínas reducida in vitro debido a a sustituciones de cisteína a serina en ambas posiciones 503 y 565, tiene inmunogenicidad reducida en comparación con la vPAL tipo salvaje pegilada. Debido a la pegilación misma se asocia con

10 inmunogenicidad reducida, se concluye que las variantes AvPAL tienen inmunogenicidad reducida in vivo en comparación con la AvPAL tipo salvaje.

EJEMPLO 15

Generación de formas repegiladas de variantes de AvPAL

Los estudios se realizaron para determinar si las formas pegiladas de las variantes AvPAL se podrían someter a

15 repegilación para aumentar la cantidad de pegilación, es decir, el porcentaje de moléculas de PEG en los residuos de lisina AvPAL, y, si es así, si las formas repegiladas de variantes de AvPAL retienen actividad enzimática in vitro y tienen alguna propiedad mejorada in vivo, a saber, la reducción de la inmunogenicidad.

Pegilación de variantes de AvPAL

La mutante de cisteína doble AvPAL, AvPAL_C565SC503S, se pegiló básicamente como se describe en el

20 EJEMPLO 6 a unas relaciones diferentes de PAL:PEG (es decir, AvPAL_C565SC503S:SUNBRIGHT ME-200HS 20 kDa PEG activada con NHS (NOF)).

Brevemente, la mezcla de reacción estándar contenía: 7 mg/ml (correspondiente a residuos de lisina 2 mM) AvPAL_C565SC503S y 2,3,4 o 6 mM mPEG20K-NHS (éster de hidroxisuccinimida-metoxipolietilenglicolcarboximetil-N, 20 kDa, SUNBRIGHT ME-200HS, NOF) en tampón de fosfato de potasio 50 mM pH 8,5,

25 correspondiente a la relación molar 1: 1, 1: 1,5, 1: 3, respectivamente, del total de los residuos de lisina AvPAL a moléculas de PEG (ver la Tabla 12): 2 ó 1. Después de una incubación de 3 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se intercambió tampón en fosfato de potasio 200 mM, pH 8,5, y se concentró a más de 20 mg/ml usando filtración de flujo tangencial (Vivaflow 50 ó 200, membrana de polietersulfona o celulosa regenerada, 100 kDa MWCO, Sartorius) en la preparación para la etapa de repegilación subsiguiente..

30 Tabla 12: Condición de pegilación y repegilación para AvPAL

PEGilación: imagen137 RePEGilación

AvPAL (mg/ml): Residuos totales de lisina (mM) mPEG20K-NHS (mM) rAvPAL-PEG (mg/ml) Residuos totales de lisina (mM) mPEG20K-NHS (mM)

7: 2 6 - - -

7: 2 6 7 2 6

7: 2 6 3.5 1 3

7: 2 6 7 2 2

7: 2 6 7 2 4

7: 2 6 7 2 6

7: 2 6 10.5 3 6

7: 2 2 - - -

7: 2 2 7 2 2

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etapa de pegilación única, el resto de los residuos de lisina no conjugados se dirigieron a la pegilación después de la repegilación. En particular, la pegilación en el residuo de lisina en la posición 301 de AvPAL aumentó hasta en un 500% después de la repegilación. Las condiciones de repegilación en la presencia de concentraciones más altas de mPEG20K-NHS activadas, tales como 6 mM, parecía ser más eficaz en el aumento del grado de pegilación en rAvPAL-PEG que las concentraciones más bajas de PEG, tales como 2 mM..

EJEMPLO 16

Efecto de la repegilación de una variante de AvPAL-PEG en ratones

La AvPAL_C565SC503S repegilada (rAvPAL-PEG-RP1), generada usando una relación de PAL: PEG de 1:3 en las primera y segunda reacciones de pegilación descriptas en el EJEMPLO 15, se comparó con la AvPAL_C565SC503S pegilada individualmente (rAvPAL-PEG ), generada usando una relación de PAL:PEG de 1: 3 como se describe en los EJEMPLOS 6 y 15, con respecto a su capacidad para reducir los niveles de Phe plasmáticos en un modelo de ratón de PKU y para inducir una respuesta de anticuerpos in vivo.

La actividad específica de las dos variantes de de enzimas AvPAL pegiladas y repegiladas se midió como se describe en el EJEMPLO 3. Se encontró que rAvPAL-PEG-RP1 tenía una actividad específica (1,17 U/mg), que era aproximadamente 20% más baja que la actividad específica de rAvPAL-PEG (1,47 U/mg).

Las formas pegiladas y repegiladas de AvPAL_C565SC503S, rAvPAL-PEG y rAvPAL-PEG-RP1, respectivamente, se analizaron para determinar la actividad in vivo en ratones ENU2 homocigotas (también conocido como BTBRenu2) básicamente como se describe en el EJEMPLO 8. El diseño del estudio se muestra continuación en la Tabla 14.

Tabla 14: Diseño del estudio in vivo para comparar las formas PEGiladas y rePEGiladas de una variante AvPAL

Grupo N.º: N Artículo de prueba Período de dosificación (semana) Dosis (mg/kg) Actividad nominal del artículo de prueba (IU/mL) Volumen de dosis (mL/kg) Número total de dosis y frecuencia de dosis

1: 4 rAvPAL-PEG Semanas 1 8 80 12 10 14 administración una vez por semana (día 1 de semana 7)

imagen140: imagen141 imagen142 Semanas 9 14 20 3

2: 4 rAvPAL-PEG-RP1 Semanas 1 8 80 12

imagen143: imagen144 imagen145 Semanas 9 14 20 3

rAvPAL-: Semanas 1 80 12

PEG: 8

3: 4 imagen146 imagen147 imagen148 imagen149

rAvPAL-: Semanas 9 20 3

imagen150: imagen151 PEG-RP1 14 imagen152 imagen153 imagen154 imagen155

A dos grupos de ratones, grupos 1 y 2, se les administró por vía subcutánea una dosis alta (80 mg/kg) semanal de rAvPAL-PEG o rAvPAL-PEG-RP1, respectivamente, durante 8 semanas, seguido por una dosis baja (20 mg/kg ) semanal de rAvPAL-PEG o rAvPAL-PEG-RP1, respectivamente, durante 6 semanas. A un grupo de ratones, grupo 3, se administró la dosis alta de rAvPAL-PEG seguido por la dosis baja de rAvPAL-PEG-RP1. Se recogió plasma antes de la dosis y varios días después de la dosis, y se analizaron los niveles de Phe. Se midieron los niveles de plasma de Phe como se describe en el EJEMPLO 8, y los datos obtenidos se muestran en la FIGURA 21. El suero también se recogió antes de la dosis y varios días después de la dosis para el análisis de los niveles de anticuerpos anti-AvPAL. Se midieron los títulos de IgG anti-rAvPAL en suero como se describe en el EJEMPLO 14, y los datos obtenidos se muestran en la Tabla 15.

Como se muestra en la FIGURA 21, para los 3 grupos, 7-8 semanas de dosificación subcutánea semanal de 80 mg/kg de rAvPAL-PEG (DP, círculos rellenos o triángulos invertidos rellenos) o rAvPAL-PEG-RP1 (2xPEG, círculos abiertos) produjeron la estabilización de los niveles de Phe plasmáticos a <200 µM. Después de la estabilización, una disminución de la dosificación subcutánea a 20 mg/kg semanal con rAvPAL-PEG produjo 4 días de los niveles

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de Phe plasmáticos a <200 µM. Los niveles de Phe plasmáticos en ratones ENU2 tratados con 20 mg/kg de rAvPAL-PEG (DP, círculos rellenos) fueron más bajos que los ratones tratados con 20 mg/kg de rAvPAL-PEG-RP1 (2xPEG, círculos abiertos o triángulos invertidos rellenos), posiblemente debido a la mayor actividad específica del rAvPAL-PEG pegilado individualmente en comparación con la de la rAvPAL-PEG-RP1 doblemente pegilada.

Como se muestra en la Tabla 15, los títulos de IgG anti-AvPAL fueron más bajos en los ratones inyectados con rAvPAL ENU2-PEG-RP1 (grupo 2) que los inyectados con rAvPAL-PEG (grupos 1 y 3). Esto indicó que la repegilación de la variante AvPAL para tener una mayor cantidad de pegilación, en particular con moléculas de PEG lineal de 20 kDa, se asoció con una disminución de la inmunogenicidad in vivo.

Tabla 15: Títulos de IgG anti-AvPAL

Proteína AvPAL pegilada: Muestra D -2 D 14 D 26 D 42 D 68

rAvPAL-PEG: 1-1 <50 50 150 150 150

imagen156: 1-2 <50 50 1350 450 150

imagen157: 1-3 150 450 4050 1350 1350

imagen158: 1-4 150 1350 450 450 1350

rAvPAL-PEG-RP1: 2-1 <50 <50 50 150 50

imagen159: 2-2 150 50 <50 50 <50

imagen160: 2-3 <50 <50 <50 50 <50

imagen161: 2-4 <50 <50 <50 <50 <50

rAvPAL-PEG semanas 1-8, luego: 3-1 50 450 1350 1350 450

rAvPAL-PEG-RP1 semanas 9-14: 3-2 50 1350 1350 1350 1350

imagen162: 3-3 <50 450 4050 1350 1350

imagen163: 3-4 <50 50 450 150 450

En resumen, la repegilación de la variante AvPAL-PEG con moléculas de PEG lineal de 20 kDa para aumentar el porcentaje de pegilación en diversos residuos de lisina en AvPAL se asoció con una actividad de la enzima ligeramente disminuida in vitro, pero, sobre todo, con inmunogenicidad reducida in vivo.

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Claims

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