TWI418633B - 原核生物苯丙胺酸解氨酶組合物及使用該組合物之方法 - Google Patents

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Description

原核生物苯丙胺酸解氨酶組合物及使用該組合物之方法
本文中提供原核生物苯丙胺酸解氨酶(PAL)及其組合物，以及該等組合物之最佳化以增強PAL催化活性及穩定性，同時降低PAL之免疫原性及/或蛋白水解敏感性。本文中亦提供該等最佳PAL組合物用於治療目的及工業目的之用途。
本申請案為2007年5月25日申請之美國申請案第11/807,227號的部分接續申請案，該案以引用方式全文併入本文中。
PAL為廣泛分布於植物(Koukol等人，J. Biol. Chem. 236:2692-2698 (1961);Hanson等人，The Enzymes 7:75-166 (1972);Poppe等人，Curr. Org. Chem. 7:1297-1315 (2003))、一些真菌(Rao等人，Can. J. Biocbem. 4512:1863-1872 (1967);Abell等人，Methods Enzymol. 142:242-253 (1987))及細菌(Bezanson等人，Can. J. Microbiol. 16:147-151. (1970);Xiang等人，J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002);Hill等人，Chem. Commun. 1358-1359 (2003))中的非哺乳動物酶且可於大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)中重組產生。
PAL之代表性清單包括：Q9ATN7藿香(Agastache rugosa);O93967毒蠅傘(Amanita muscaria; Fly agaric);P35510、P45724、P45725、Q9SS45、Q8RWP4鼠耳芥 (Arabidopsis thaliana; Mouse-ear cress);Q6ST23綠竹(Bambusa oldhamii; Giant timber bamboo);Q42609蘭花(Bromheadia finlaysoniana; Orchid);P45726茶(Camellia sinensis; Tea);Q9MAX1長春花(Catharanthus roseus; Rosy periwinkle; Madagascar periwinkle);Q9SMK9鷹嘴豆(Cicer arietinum; Chickpea);Q9XFX5、Q9XFX6克萊門柚×柑橘(Citrus Clementina×Citrus reticulate);Q42667檸檬(Citrus limon; Lemon);Q8H6V9、Q8H6W0中粒咖啡(Coffea canephora; Robusta coffee);Q852S1胡蘿蔔(Daucus carota; Carrot);O23924)毛地黃(Digitalis lanata; Foxglove);O23865)胡蘿蔔(Daucus carota; Carrot);P27991大豆(Glycine max; Soybean);O04058)向日葵(Helianthus annuus; Common sunflower);P14166 (Q42858)甘薯(Ipomoea batatas; Sweet potato);Q8GZR8、Q8W2E4萵苣(Lactuca sativa; Garden lettuce);O49835、O49836紫草(Lithospermum erythrorhizon);P35511、P26600番茄(Lycopersicon esculentum; Tomato);P35512蘋果(Malus domestica; Apple; Malus sylvestris);Q94C45、Q94F89木薯(Manihot esculenta; Cassava; Manioc);P27990紫苜蓿(Medicago sativa; Alfalfa);P25872、P35513、P45733菸草(Nicotiana tabacum; Common tobacco);Q6T1C9栓皮櫟(Quercus suber; Cork oak);P14717、P53443、Q7M1Q5、Q84VE0、Q84VE0稻(Oryza sativa; Rice);P45727鱷梨 (Persea americana; Avocado);Q9AX15牽牛花(Pharbitis nil；紫羅蘭(Violet); Japanese morning glory);P52777火炬松(Pinus taeda; Loblolly pine);Q01861、Q04593豌豆(Pisum sativum; Garden pea);P24481、P45728、P45729歐芹(Petroselinum crispum; Parsley; Petroselinum hortense);Q84LI2蝶蘭×朵麗蝶蘭雜交品種(Phalaenopsis×Doritaenopsis hybrid cultivar);P07218、P19142、P19143菜豆(Phaseolus vulgaris; Kidney bean; French bean);Q7XJC3、Q7XJC4海岸松(Pinus pinaster; Maritime pine);Q6UD65大葉鑽天楊×美洲黑楊(Populus balsamifera subsp. trichocarpa×Populus deltoides);P45731、Q43052、O24266白楊(Populus kitakamiensis; Aspen);Q8H6V5、Q8H6V6顫楊(Populus tremuloides; Quaking aspen);P45730毛果楊(Populus trichocarpa; Western balsam poplar);O64963甜櫻桃(Prunus avium; Cherry);Q94EN0黏地黃(Rehmannia glutinosa);P11544紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides；酵母(Yeast)；瘦弱紅酵母(Rhodotorula gracilis));P10248深紅酵母(Rhodotorula rubra；酵母；膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa));Q9M568、Q9M567覆盆子(Rubus idaeus; Raspberry);P31425、P31426馬鈴薯(Solanum tuberosum; Potato);Q6SPE8長梗繁縷(Stellaria longipes;Longstalk starwort);P45732矮筆花豆(Stylosanthes humilis; Townsville stylo);P45734地三葉草(Trifolium subterraneum; Subterranean clover);Q43210、Q43664小麥(Triticum aestivum; Wheat);Q96V77玉米黑粉菌(Ustilago maydis; Smut fungus);P45735葡萄(Vitis vinifera; Grape)；及Q8VXG7玉米(Zea mays; Maize)。
諸多研究已集中於使用苯丙胺酸解氨酶(PAL; EC 4.3.1.5)對苯酮尿症(PKU)進行酶替代性治療(Hoskins等人，Lancet 1(8165):392-394 (1980);Gilbert等人，Biochem. J. 199(3):715-723 (1981);Hoskins, J.A.等人，Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 35(2):275-282 (1982);Sarkissian等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(5):2339-2344 (1999);Liu等人，Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 30(4):243-257 (2002);Wieder, K.J., J Biol. Chem. 254(24):12579-12587 (1979);Gamez等人，Mol. Ther. 11(6):986-989 (2005);Ambrus等人，J. Pharmacol. Exp. Ther. 224(3):598-602 (1983);Ambrus等人，Science 201(4358):837-839 (1978);Kalghatgi, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 27(3):551-561 (1980);Ambrus, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 37(1):105-111 (1982);Gilbert等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 131(2):557-563 (1985);Pedersen, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 20(3):559-569 (1978);Marconi等人，Biochimie 62(8-9):575-580 (1980);Larue等人，Dev. Pharmacol. Ther. 9(2):73-81 (1986);Ambrus, C.M.等人，Ann. Intern. Med. 106(4):531-537 (1987);Bourget等人，Appl. Biochem. Biotechnol. 10:57-59 (1984);Bourget等人，FEBS Lett. 180(1):5-8 (1985);Bourget等人，Biochim. Biophys. Acta 883(3):432-438 (1986);Chang等人，Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 23(1):1-21 (1995);Chang等人，Mol Biotechnol. 17(3):249-260 (2001)；美國專利第5,753,487號)。
PKU為由肝苯丙胺酸羥化酶(PAH)(該酶負責苯丙胺酸之代謝)之活性減弱所引起的先天性胺基酸代謝障礙。PAH突變引起PKU及高苯丙胺酸血症(HPA)的患者呈現升高的苯丙胺酸量、減弱的神經生理功能及減慢的認知發展。對於重度PKU患者，除非採用限制膳食使苯丙胺酸量維持在較低水準，否則可能出現不可逆轉性心智遲滯。PAL使苯丙胺酸轉化為氨及反式肉桂酸(一種無害的代謝物)，其進一步代謝並於尿中以馬尿酸鹽形式分泌(Hoskins等人，(1980)，同上；Hoskins等人，Biomed Mass Spectrom 11(6):296-300 (1984))。
PKU之現行治療涉及終生堅持胺基酸苯丙胺酸含量較低的膳食(Levy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(5):1811-1813 (1999))。此膳食療法難以維持(Matalon等人，Genet. Med. 6(1):27-32 (2004);Woolf等人，Arch. Dis. Child. 33(167):31-45 (1958);Kim, Mol Ther. 10(2):220-224 (2004))且並非總能消除可為高苯丙胺酸量所致的損傷性神經學效應(Sarkissian等人，Mol. Genet. Metab. 69:188-194 (2000))。 懷孕期間低於理想的膳食控制標準會引起先天缺陷(Levy, (1999)，同上)。此外，PKU/HPA患者很難在依循限制性膳食的同時過著正常的生活，且膳食療法會伴發若干種營養不足，其中有一些營養不足不利於腦發育(Levy, (1999)，同上)。最低苯丙胺酸的膳食產品具有不能充分地令人滿意從而有損於該治療順應性的感官特性(Levy, (1999)，同上)。因此，治療性治療之開發會置換或補充現行膳食治療且預防患有PKU之彼等個體(尤其患有該疾病之最嚴重形式之患者)承受神經性損傷。
1999年，Scriver及同事報導其對將紅冬孢酵母(Sarkissian等人，(1999)，同上)之酶PAL用於PKU酶替代應用的最初研究。小鼠PKU及HPA模型研究證明，投與PAL(使用與抗蛋白酶蛋白酶抑制劑組合的PAL或使用重組表現並存在於大腸桿菌細胞內的PAL藉由腹膜內注射或經口投與)與血漿中較低的苯丙胺酸含量相關。此外，描述對PKU患者使用PAL的初步研究已表明，使用以腸衣明膠膠囊形式投與之PAL(Hoskins等人，(1980)，同上)或使用體外酶工廠(extracorporeal enzyme factory)(Ambrus等人，Ann. Intern. Med. 106(4):531-537 (1987))可使苯丙胺酸含量降低。該等研究說明，若保護PAL以免發生蛋白水解性降解，則可在經口投藥後達成血漿Phe之顯著減少。
基於PAL能夠限制苯丙胺酸對癌細胞之營養供應並從而抑制瘤生長，亦已提出使用PAL治療癌症(Fritz等人，J Biol Chem. 251(15):726 (1976);Roberts等人，Cancer Treat Rep. 60(3):261-263 (1976);Shen等人，Cancer Res. 37(4):1051-1056 (1977);Shen等人，Cancer Treat Rep. 63(6):1063-1068 (1979);Wieder等人，J Biol Cbem. 254(24):12579-12587 (1979))。然而，靜脈內注射之聚乙二醇化PAL在第13次注射後，快速地自循環血液中清除。此外，PAL介導之苯丙胺酸減少可防止鼠科白血病及轉移性黑色素瘤增生(Abell等人，Cancer Res. 33:2529-2532 (1973);Roberts等人，(1976)，同上；Shen等人，(1977)，同上)
海洋細菌海洋鏈黴菌(Streptomyces maritimus)之細菌PAL可充當抑菌劑腸球菌素(enterocin)之重要來源。海洋鏈黴菌PAL (EncP)催化腸球菌素合成中之起始步驟，將苯丙胺酸轉化為反式肉桂酸(Xiang等人，J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002))。
PAL可用於工業合成L-苯丙胺酸甲酯(用於阿斯巴甜糖(Aspartame)製備)(D'Cunha等人，Enzyme and Microbial Technology 19(6):421-427 (1996);Hamilton等人，Trends in Biotechnol. 3(3):64-68 (1985))及其他用作醫藥前驅物的經取代之L-苯丙胺酸衍生物(美國專利申請案20020102712)。
PAL可能亦具有農業用途，其中PAL參與植物、真菌及細菌中產生苯丙酸類之初始酶促過程，苯丙酸類可產生木質素、香豆素及黃烷類。因此，調節PAL活性可影響很多農業現象，諸如果實褐變。此外，活性位點PAL抑制劑之 基於結構之藥物設計可產生有效的除草劑(Poppe等人，(2003)，同上)。
儘管PAL潛在地具有各種工業及治療性應用，但PAL之使用會受到低比活性及蛋白水解不穩定性之限制。類似於其他治療性蛋白質，將PAL用作酶治療劑伴有若干不利因素，諸如免疫原性及蛋白水解敏感性。此外，受質親和力與酶活性之間需要微妙的平衡，以便在以高苯丙胺酸血症為特徵之病症中，達成並維持血漿苯丙胺酸含量在正常略窄範圍內之控制。由於缺乏有關該蛋白質之結構及生物化學資料，因此迄今為止尚未共同致力於改良該等參數。
因此，仍存在對具有最佳動力學特徵之PAL分子之需要，該等動力學特性包括強催化活性及更長生物半衰期、更高生物化學穩定性及/或削弱之免疫原性。
已鑑別若干種細菌PAL為HAL/PAL家族之部分，包括但不限於海洋鏈黴菌PAL(亦稱EncP，SEQ ID NO:5，圖4)；點形念珠藻(Nostoc punctiforme)PAL/HAL(寄存號ZP_00105927，獲自點形念珠藻ATCC 29133，2004年10月1日提交，NCBI微生物基因組註解計劃)(SEQ ID NO:2，圖4)；多變魚腥藻(Anabaena variabilis)PAL/HAL(基因ID 3679622，Ava_3988苯丙胺酸/組胺酸解氨酶[多變魚腥藻ATCC 29413，2006年3月31日(SEQ ID NO:4，圖4)、光合原核生物組囊藻(Anacystis nidulans)PAL/HAL (Lofflehardt, Z. Naturforsch 31(11-12):693-9 (1976))、腸內菌科革蘭氏 陰性菌(gram-negative bacteria)發光桿菌TT01 (Photorabdus luminescens TT01)PAL/HAL(Williams等人，Microbiology 151:2543-2550 (2005))及輪枝鏈黴菌(Streptomyces verticillatus)PAL/HAL(Bezanson等人，Can. J. Microbiol. 16(3):147-51 (1970))。此外，海洋鏈黴菌中之PAL活性已得以評估(Xiang, L.等人，J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002))。已對藍藻菌(諸如魚腥藻(Anabaena)及念珠藻(Nostoc))在其產生生物活性天然產物(經由混合聚酮化合物-肽生物合成路徑產生)方面進行了研究(Moore, B.S., Natural Products Reports 22(5):580-593 (2005);Becker等人，Gene 325;35-42 (2004);Hoffman等人，Gene 311:171-180 (2003))。本發明係基於以下發現：原核生物或細菌PAL可用於有效治療PKU及其他病症。本發明涵蓋具有增強特性(諸如更強催化活性、更高生物化學穩定性，及對於治療性應用而言削弱之免疫原性及更長生物學半衰期)之細菌PAL及其生物學活性片段、突變體、變異體及類似物的組合物。本發明亦提供細菌PAL及其生物學活性片段、突變體、變異體及類似物之製備及純化方法，及將該等組合物用於治療目的及工業目的之方法。
如本文中所使用，"細菌PAL"與"原核生物PAL"可互換用於意謂：(1)原核生物體之野生型PAL，包括但不限於海洋鏈黴菌PAL(亦稱EncP，SEQ ID NO:5，圖4)、點形念珠藻PAL(SEQ ID NO:2，圖4)、多變魚腥藻PAL(SEQ ID NO:4，圖4)、組囊藻PAL(Lofflehardt, (1976)，同上)、發 光桿菌TT01 PAL(Williams等人，(2005)，同上)及輪枝鏈黴菌PAL(Bezanson等人，(1970)，同上)；(2)該等野生型酶之片段、突變體、變異體及類似物，該等片段、突變體、變異體及類似物保留針對苯丙胺酸之類似(亦即至少50%)催化活性且在一些實施例中呈現增強之催化活性及/或延長之半衰期及/或降低之免疫原性；及(3)該等野生型酶之化學修飾型式、其片段、突變體、變異體及類似物，該等化學修飾型式、其片段、突變體、變異體及類似物已與提供其他有利效應(諸如半衰期延長)的其他化學部分連接。舉例而言，任何提及製備或使用原核生物PAL、其片段、突變體、變異體、類似物或化學修飾型式及該(等)酶之組合物以達成治療或工業目的之方法均意指製備、使用或調配所有該等野生型、其片段、突變體、變異體、類似物或化學修飾的方法。
在第一態樣中，本發明提供細菌PAL及其生物學活性片段、突變體、變異體或類似物。一實施例為點形念珠藻之細菌PAL (SEQ ID NO:2)或其生物學活性片段、突變體、變異體或類似物。另一實施例為多變魚腥藻之細菌PAL (SEQ ID NO:4)或其生物學活性片段、突變體、變異體或類似物。在一些實施例中，變異體保留對應於紅冬孢酵母PAL中Ser 210 Ala-Ser-Gly三合物(211-213)Asp 214、Leu 215、Asn 270、Val 269、Leu 266、Leu 134、His 137、Lys 468、Glu 496、Gln 500位置處之野生型活性位點殘基，或該等活性位點殘基之保守性取代，其中211-213處 之Ala-Ser-Gly三合物據信為苯丙胺酸之結合位點。
理想變異體可包括一或多個半胱胺酸殘基已置換為另一種胺基酸(例如絲胺酸)殘基以減少可與活體內酶活性降低、免疫原性增強及/或其他不利效應相關的蛋白質聚集的蛋白質。
理想變異體可包括融合蛋白質，其中該酶已與另一種異源多肽(諸如保留此項技術中已知可延長半衰期之補救抗原決定基的免疫球蛋白或其片段之天然恆定區或經修飾之恆定區)融合。
本發明進一步涵蓋已與可提供其他有利效應之化學部分連接的該等多肽之化學修飾型式。舉例而言，此項技術中已知水溶性聚合物非特異性或位點特異性(例如N-末端)連接於多肽可改良半衰期，且連接化學部分亦可降低免疫原性並改良蛋白酶抗性。
該細菌PAL係根據本發明之方法分離並純化且從而以使該酶用於治療可行之量存在。在有些實施例中，使用編碼完整或野生型細菌PAL的cDNA。然而，在其他實施例中，可使用編碼其生物學活性片段或突變體的cDNA。此外，本發明提供藉由基於結構之分子工程化方法獲得的最佳細菌PAL組合物及/或PAL之化學修飾(例如聚乙二醇化)形式。特定實施例涵蓋比活性提高、穩定性增強、免疫原性及/或蛋白水解敏感性降低而適於治療用途之最佳PAL組合物。一實施例為比活性提高之點形念珠藻PAL的聚乙二醇化形式。另一實施例為比活性提高之多變魚腥藻PAL的聚 乙二醇化形式。
在多個實施例中，提及PAL:PEG或PEG:PAL之比率來描述PAL變異體之聚乙二醇化。如本文中所使用，且除非另有指示，否則"PAL:PEG"之比率係指在聚乙二醇化反應中PAL變異體上之離胺酸殘基與PEG分子之比率。類似地，如本文中所使用，且除非另有指示，否則"PEG:PAL"之比率係指在聚乙二醇化反應中PEG分子與PAL變異體上之離胺酸殘基之比率。
在一實施例中，本發明涵蓋免疫原性降低的聚乙二醇化PAL變異體。另一實施例為免疫原性降低之點形念珠藻PAL (NpPAL)變異體的聚乙二醇化形式。另一實施例為免疫原性降低之多變魚腥藻PAL (AvPAL)變異體的聚乙二醇化形式。特定實施例涵蓋NpPAL或AvPAL變異體，其中聚乙二醇化係藉由使NpPAL或AvPAL變異體與水溶性聚合物(例如聚乙二醇(PEG))反應來達成。在有些實施例中，聚乙二醇化係藉由使NpPAL或AvPAL變異體與PEG以至少1:1、至少1:1.5、至少1:2、至少1:3或至少1:4 PAL:PEG之比率反應一次來達成。在一實施例中，PAL變異體為AvPAL變異體，且聚乙二醇化係使用1:3之PAL:PEG比率達成。
本發明亦涵蓋將聚乙二醇化PAL變異體再聚乙二醇化以便使免疫原性降低。在有些實施例中，聚乙二醇化係藉由使NpPAL或AvPAL變異體與PEG反應兩次或兩次以上(每次聚乙二醇化係以至少1:1、至少1:1.5、至少1:2、至少1:3或 至少1:4 PAL:PEG之比率進行)來達成。在有些實施例中，聚乙二醇化係藉由使NpPAL或AvPAL變異體與PEG反應兩次、三次、四次、五次或五次以上(每次聚乙二醇化係以至少1:1、至少1:1.5、至少1:2、至少1:3或至少1:4PAL:PEG之比率進行)來達成。在一實施例中，PAL變異體為AvPAL變異體，且聚乙二醇化係藉由第一次與第二次聚乙二醇化反應均使用1:3之PAL:PEG比率來達成。
在有些實施例中，本發明之野生型PAL之生物學活性位點可視需要加以修飾，以使PAL動力學特徵最佳。在一實施例中，經修飾之PAL具有足夠的活性以使血漿苯丙胺酸含量降低且維持在約120 μM至約240 μM之最佳範圍內。在其他實施例中，經修飾之生物學活性PAL具有至少約0.1 s-1 或大於約0.5 s-1 的kcat。在有些實施例中，經修飾之生物學活性PAL具有至少約0.2 s-1 或大於約1.0 s-1 之kcat。在其他實施例中，經修飾之生物學活性PAL具有介於約10 μM至約1000 μM之間的Km。在其他實施例中，經修飾之生物學活性PAL具有介於約100 μM至約1000 μM之間的Km。在其他實施例中，經修飾之生物學活性PAL呈現的酶活性比野生型之酶活性大約兩倍至約1000倍。在其他實施例中，經修飾之生物學活性PAL呈現的酶活性比野生型之酶活性高約10%至100%。該等經修飾之生物學活性PAL蛋白可使用此項技術中熟知的方法(諸如定點誘變法)形成。在其他實施例中，本發明涵蓋使苯丙胺酸代謝(亦即使苯丙胺酸轉化為另一種物質)之細菌PAL之用途，其係用於製 備供治療哺乳動物(尤其人類)之PAH活性不足用的藥物；以及含有細菌PAL供治療PAH活性不足用之醫藥組合物。在有些實施例中，醫藥組合物包含單獨或與醫藥學上適當之載劑組合的經高度純化之細菌源PAL，或其生物學活性片段、突變體或類似物。在有些實施例中，製劑含有純度大於95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%的細菌PAL。在其他實施例中，本發明之細菌PAL之相對比活性大於野生型PAL之比活性之約110%。
在第二態樣中，本發明之特徵為出於治療及工業目的使用PAL組合物的新穎方法。在一實施例中，本發明涵蓋藉由將治療有效量之包含細菌PAL之醫藥組合物投與需要該治療之個體來治療完全或部分由PAH活性不足引起之病症的方法。PAH活性不足可觀測到(例如)與正常PAH活性水準相比，活性水準為其50%或小於50%、25%或小於25%，或10%或小於10%，或1%或小於1%，且可表現為高苯丙胺酸含量，例如，在高苯丙胺酸血症、輕度苯酮尿症或典型重度苯酮尿症中。在有些實施例中，該疾病為苯酮尿症(PKU)。
在特定實施例中，個體為已診斷為具有突變型苯丙胺酸羥化酶(PAH)者。突變型PAH可包含PAH之催化域中之突變。示範性該等突變包括但不限於突變F39L、L48S、165T、R68S、A104D、S110C、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、 K320N、A373T、V388M、E390G、A395P、P407S及Y414C。
本發明亦涵蓋一種治療具有超常濃度之血漿苯丙胺酸(例如大於180 μM或360 μM)之個體的方法，該方法包含將細菌PAL組合物以使得個體之血漿苯丙胺酸濃度降低之有效量投與個體。在投與細菌PAL之前，個體可能具有大於180 μM之血漿苯丙胺酸濃度。更特定而言，個體具有介於120 μM與200 μM之間的血漿苯丙胺酸濃度。在其他實施例中，個體具有介於200 μM與600 μM之間的血漿苯丙胺酸濃度。在其他實施例中，個體具有介於600 μM與1200 μM之間的血漿苯丙胺酸濃度。另一類待治療的個體為具有大於1200 μM之無限制血漿苯丙胺酸濃度。
在特定實施例中，個體為嬰兒，更特定而言為具有大於1200 μM之血漿苯丙胺酸濃度的嬰兒。本發明涵蓋治療患有苯酮尿症之嬰兒的方法，該方法包含將細菌PAL組合物以使得嬰兒之血漿苯丙胺酸濃度降低之有效量投與該個體，其中該嬰兒在0歲與3歲之間且該嬰兒具有介於約360 μM至約4800 μM之間的血漿苯丙胺酸濃度。在投與細菌PAL之前，嬰兒具有約1200 μM之苯丙胺酸濃度且投與細菌PAL使血漿苯丙胺酸濃度降至約1000 μM。在其他實施例中，在投與細菌PAL之前，嬰兒具有約800 μM之苯丙胺酸濃度，且投與PAL使血漿苯丙胺酸濃度降至約600 μM。在其他實施例中，在投與細菌PAL之前，嬰兒具有約400 μM之苯丙胺酸濃度，且投與PAL使血漿苯丙胺酸濃度降至 約300 μM。在有些實施例中，本文中所涵蓋的治療方法使嬰兒之血漿苯丙胺酸濃度降至約120 μM至約360 μM之間的範圍或約120 μM至約240 μM之間的範圍。
本文中亦涵蓋一種治療患有高苯丙胺酸血症(HPA)之孕婦的方法，該方法包含將細菌PAL單獨或與蛋白質限制性膳食組合投與個體，其中將細菌PAL單獨或與蛋白質限制性膳食組合投與可有效降低個體血漿中之苯丙胺酸濃度(與不進行組合投藥時之濃度相比)。在某些實施例中，個體具有大於180 μM、但小於600 μM之無限制血漿苯丙胺酸濃度。在其他實施例中，個體具有大於500 μM、但小於1200 μM之無限制血漿苯丙胺酸濃度。在其他實施例中，個體具有大於1200 μM之無限制血漿苯丙胺酸濃度。血漿苯丙胺酸濃度大於1200 μM的懷孕個體為此類型療法之尤具吸引力之候選者，育齡(涵蓋孕期)女性個體亦如此。在個體具有大於1200 μM之血漿苯丙胺酸濃度的彼等實施例中，該方法進一步包含將蛋白質限制性膳食投與個體。
本發明之特徵為治療個體之典型重度苯酮尿症(PKU)之方法，該等方法包含將細菌PAL或其生物學活性片段、突變體、變異體或類似物投與個體，其中投與細菌PAL可有效降低個體血漿中之苯丙胺酸濃度(與不投與細菌PAL時之濃度相比)。經選擇根據本發明之方法治療的個體將具有高血漿Phe濃度，不治療時，該濃度可大於1800 μM。其他實施例涵蓋當不實施治療方案時具有大於1000 μM之血漿苯丙胺酸濃度的個體。在有些實施例中，本發明之組合投 藥方法使個體之血漿苯丙胺酸濃度降至小於600 μM。在一實施例中，其降至小於500 μM。在另一實施例中，組合投藥使個體之血漿苯丙胺酸濃度降至約120 μM至約360 μM之範圍內。在另一實施例中，個體之血漿苯丙胺酸濃度降至約120 μM至約240 μM之範圍內。
某些實施例包括依據待治療之有機體(例如哺乳動物或人類)之需要使劑量最佳化，以有效改善疾病症狀。PAL可每日以單次日劑量、多次劑量投與，可每週以單次週劑量或多次劑量投與。在有些實施例中，PAL療法不為連續的，而是每日投與PAL，直至個體之血漿苯丙胺酸濃度降至小於360 μM。在有些實施例中，其中每日監測個體之血漿苯丙胺酸濃度，且當觀測到血漿苯丙胺酸濃度增大10%時投與PAL。在其他實施例中，每週給藥一次。本發明涵蓋至少0.001 mg/kg、0.005 mg/kg、0.01 mg/kg、0.05 mg/kg之劑量，且每週劑量範圍可達0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg或高於1.0 mg/kg。在有些實施例中，每週劑量為1 mg/kg、0.1 mg/kg或0.01 mg/kg。
本發明涵蓋傳遞等效劑量的各種非經腸或經腸投藥途徑，包括經口、經皮、經黏膜、肺內(包括噴霧)、肌肉內、皮下或靜脈內投藥。本發明亦特別涵蓋藉由快速注射或直接輸入關節或CSF內來投藥，諸如鞘內、腦內、心室內、經由腰椎穿刺，或經由小腦延髓池投藥。在有些實施例中，皮下或經口給藥。
本發明亦涵蓋增強人類個體之PAL活性的其他方法，包 括基因療法。PAL基因可經由此項技術中已知的多種方法(包括病毒載體、同源重組或直接DNA注射)移入。特徵為編碼細菌PAL或其生物學活性突變體或類似物之全部或一部分之核酸序列的實施例涵蓋於此態樣之範圍內，該等核酸序列可在活體內投與受PAH不足影響的細胞內。
在另一實施例中，細菌PAL亦可與蛋白質限制性膳食組合投與。依本文中之方法投與的蛋白質限制性膳食為苯丙胺酸限制性膳食，其中個體之苯丙胺酸總攝取量限制在小於每日600毫克。在其他實施例中，蛋白質限制性膳食為苯丙胺酸限制性膳食，其中苯丙胺酸總攝取量限制在小於每日300毫克。在其他實施例中，蛋白質限制性膳食為補充有胺基酸(諸如酪胺酸、纈胺酸、異白胺酸及白胺酸)的限制性膳食。本發明亦涵蓋一種組合物，其包含細菌PAL及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。該組合物可進一步包含醫療蛋白質補充物。在其他實施例中，PAL組合物為嬰兒配方食品之部分。在其他實施例中，蛋白質補充物不含苯丙胺酸。蛋白質補充物可用濃度為100公克補充物20毫克之L-酪胺酸、L-麩胺醯胺、L-肉鹼、濃度為100公克補充物40毫克之L-牛磺酸以及硒強化。其可進一步包含推薦日劑量之礦物質，例如鈣、磷及鎂。補充物可進一步包含推薦日劑量之選自以下各者組成之群的一或多種胺基酸：L-白胺酸、L-脯胺酸、L-離胺酸乙酸鹽、L-纈胺酸、L-異白胺酸、L-精胺酸、L-丙胺酸、甘胺酸、L-天冬醯胺酸一水合物、L-色胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L- 組胺酸、L-甲硫胺酸、L-麩胺酸及L-天冬胺酸。此外，補充物可用推薦日劑量之維生素A、D及E強化。補充物可包含提供補充物能量之至少40%的脂肪含量。該補充物可以粉末補充物之形式或蛋白棒之形式提供。
本發明涵蓋治療不同形式之腫瘤生長及癌症(包括但不限於淋巴母細胞白血病、乳腺腫瘤及黑色素瘤)的方法。
本發明涵蓋使用細菌PAL由氨及反式肉桂酸酯商業化製備苯丙胺酸的方法。苯丙胺酸用於阿斯巴甜糖、甜味劑及其他食品中，包括飲料、穀類食品、蛋糕、甜點、蛋乳酪菜肴、脂肪、油、魚及其他海鮮、肉及肉製品、牛奶及奶製品、堅果、醬油及調味品、湯、糖、果醬及塗抹食品及蔬菜。
本發明進一步涵蓋可使用細菌PAL製備除草劑及抗微生物劑，包括腸球菌素及紅黴素(erythromycin)。
在第三態樣中，本發明之特徵為一種以使酶用於治療可行之量製備原核生物PAL或其生物學活性片段、突變體、變異體或類似物的方法。本發明涵蓋藉由細菌(包括但不限於鏈黴菌(Streptomyces)、堆囊菌(Sorangium)、假單胞菌(Pseudomonas)及藍藻菌(諸如念珠藻及魚腥藻))製備的PAL。在有些實施例中，PAL係由如下菌種製備：海洋鏈黴菌、輪枝鏈黴菌、纖維堆囊菌(Soragium cellulosum)、點形念珠藻、煙草念珠藻(Nostoc tobacum)、多變魚腥藻及惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。在另一實施例中，原核生物PAL酶活性係使用cDNA或DNA序列產生，該等 序列來源於有時描述為編碼HAL活性或以PAL-HAL基元為特徵，但具有不同於HAL之關鍵PAL殘基的序列。
在一廣泛實施例中，該方法包含以下步驟：將編碼原核生物PAL或其生物學活性片段、突變體、變異體或類似物之全部或一部分的cDNA或DNA轉化至適於其表現之細胞內。在有些實施例中，使用表現載體將DNA移入適用於其表現的細胞或細胞株內。在一實施例中，將cDNA轉化至大腸桿菌內且將重組細菌PAL以融合蛋白之形式過度表現。在另一實施例中，原核生物PAL之製備方法包含以下步驟：(a)將經編碼原核生物PAL之全部或生物學活性變異體、片段或突變體之cDNA轉化的細胞於適當生長培養基中培養直至適當密度以製備種菌培養物；(b)將經轉化之細胞引入生物反應器內；(c)將適當的生長培養基置於該生物反應器內；及(d)將經轉染之細胞自含有該酶的培養基中分離。
在一實施例中，用誘導性啟動子(諸如IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)將重組PAL以N-末端八組胺醯基標記之融合蛋白形式過度表現於載體(諸如大腸桿菌BL21(DE3)/pLysS (Invitrogen))中。在另一實施例中，將重組PAL過度表現於無N-末端標記之大腸桿菌BL21(DE3)/pLysS細胞中。在另一實施例中，原核生物PAL之製備方法包含以下步驟：(1)將來自甘油儲備物之種菌培養物(用於生物反應器/醱酵器)於搖瓶中培養；(2)將該種菌培養物以分批饋入方式引入可控生物反應器中；(3) 將該培養物於補充有葡萄糖之培養基(pH 7.8，>20%溶解氧)中培養，在30℃下、攪動速率達1200 rpm，直至細胞密度OD600 達到70-100(約22-25小時)；(4)用0.4 mM IPTG誘導該培養物；(5)將該培養物在22℃至26℃之降低溫度下培養直至活性變化<0.1 IU/ml(約40-48小時，且OD600 一般為200)；及(6)藉由連續離心收穫細菌。在一實施例中，細胞培養基一般經限定且包含以下各者：酵母萃取物蛋白質、蛋白腖-胰化蛋白腖、葡萄糖、甘油、酪蛋白胺基酸、痕量鹽及磷酸鹽緩衝鹽。
在第四態樣中，本發明之特徵為一種純化細菌PAL或其生物學活性片段、突變體或類似物的方法。根據第一實施例，使經轉化之細胞團生長且破裂，得到粗重組酶。通常自粗塊體中分離出外源物質以防止管柱結垢。層析純化係使用一或多種層析樹脂執行。隨後，將經純化之蛋白質調配至設計成可長期提供穩定活性的緩衝液中。在另一實施例中，純化細菌PAL的方法包含以下步驟：(a)將含有重組PAL的細菌溶解；(b)對溶菌物進行熱處理以使病毒失活；(c)使用第二連續離心步驟及/或深度過濾使該溶菌物澄清；(d)使澄清之溶菌物通過炭過濾步驟；(e)使(d)之濾液通過最後過濾步驟(如使用Sartorious Sartopore 0.2 μm過濾器)；(f)使最後濾液通過疏水性相互作用層析樹脂(諸如丁基疏水性相互作用層析)；(g)使(f)之溶離液通過陰離子層析樹脂(諸如Q離子交換柱)；(h)藉由緩衝交換，經切向流過濾法回收最終產物；及(i)將最終產物滅菌。熟習此項技 術者易瞭解，可省略或取代一個或多個層析步驟，或層析步驟之順序可在本發明之範圍內變化。最後，可視需要執行適當的滅菌步驟。
在第五態樣中，本發明涵蓋如下鑑別可預防、改善或治療高苯丙胺酸含量之細菌PAL的篩檢檢定：使含有高含量苯丙胺酸的細胞與細菌PAL接觸且判定細菌PAL是否使該高苯丙胺酸含量降低。該等篩檢檢定亦可包括如下步驟；產生在活性位點(例如海洋鏈黴菌EncP中之Gly 142、Thr-Ser-Gly三合物(143-145)、Asp 146、Leu 147、Asn 196、Ile 195、Leu 192、Leu 76、Asn 79、Met 400、Thr 428、Gln 432，其相當於紅冬孢酵母PAL中之殘基Ser 210Ala-Ser-Gly三合物(211-213)Asp 214、Leu 215、Asn 270、Val 269、Leu 266、Leu 134、His 137、Lys 468、Glu 496、Gln 500)，在活性位點之鄰近區域中或在整個多肽序列中包括保守性或非保守性取代的變異體，繼之對變異體測試活體外苯丙胺酸轉化活性。在某些實施例中，該方法為高通量檢定。在一實施例中，使用生物資訊學方法對菌種之完整基因組測序並針對PAL同源物之存在進行篩檢。在另一實施例中，該等同源物之蛋白質產物之PAL催化活性係諸如藉由測試活體外使苯丙胺酸轉化為反式肉桂酸酯之能力來證明。
在第六態樣中，本發明提供使用細菌PAL組合物診斷疾病(包括但不限於完全或部分由PAH活性不足所引起的病症)的方法。在一實施例中，使用細菌PAL量測血樣中苯丙 胺酸之含量。在另一實施例中，本發明涵蓋包含細菌PAL用於監測具有高含量苯丙胺酸之個體之血樣的診斷套組。
本發明之其他特徵及優點經由以下實施方式將變得顯而易見。然而應瞭解，實施方式及特定實例雖然說明本發明之特定實施例，但僅為說明而提供，原因在於熟習此項技術者經由本實施方式可明顯易知屬於本發明之精神及範圍內的不同更動及潤飾。
儘管PAL為普遍存在的高等植物酶，其在產生苯丙酸類代謝物之關鍵步驟中催化苯丙胺酸非氧化性脫胺為肉桂酸(Hahlbrock等人，Annu. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 40:347-369 (1989))，但PAL僅見於幾種細菌中，其中PAL牽涉於"海洋鏈黴菌"中苯甲醯基-輔酶A生物合成中(Xiang, J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002))及纖維堆囊菌中苯甲醯基-輔酶A生物合成中(Hill等人，Chem. Commun. 1358-1359 (2003))及輪枝鏈黴菌中肉桂醯胺之生物合成中(Bezanson等人，Can. J. Microbiol. 16:147-151 (1970))。抑菌劑腸球菌素為海洋細菌"海洋鏈黴菌"之天然產物，其生物合成涉及多種罕見特徵(Hertweck等人，Chem. Biol. 11:461-468 (2004);Piel等人，Chem. Biol. 7:943-955 (2000);Piel等人，J. Am. Chem. Soc. 122:5415-5416 (2000);Xiang等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:15609-15614 (2004))。其中一特徵為形成罕見的聚酮化合物合成酶(PKS)起始單元苯甲醯基-輔酶A (CoA)(Moore 等人，Nat. Prod. Rep. 19:70-99 (2002))。初始生化反應涉及新穎的細菌苯丙胺酸解氨酶(PAL，EC 4.3.1.5)EncP將胺基酸L-苯丙胺酸轉化為反式肉桂酸(Xiang等人，J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002))。將肉桂酸活化為其輔酶A硫酯，繼之進行單輪β-氧化產生苯甲醯基-輔酶A(Hertweck等人，Chem Bio Chem 2:784-786 (2001);Hertweck等人，Tetrahedron 56:9115-9120 (2000);Xiang等人，J. Bacteriol. 185:399-404 (2003))，其使腸球菌素II型PKS準備進行七個丙二醯基-輔酶A分子之鏈延伸。
第一原核生物PAL編碼基因(encP)(SEQ ID NO:5)已加以表徵且其失活導致"海洋鏈黴菌"中之肉桂酸及腸球菌素重新合成取消(Kalaitzis等人，J. Am. Chem. Soc. 125:9290-9291 (2003);Xiang等人，J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002))。encP失活之突變體中之腸球菌素生物合成可經由補充肉桂酸或苯甲酸以及補充含質體之encP而恢復。此外，天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)中在ermE*啟動子控制下之encP基因異源表現使得醱酵培養物中產生肉桂酸(Xiang等人，J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002))。encP基因編碼的522胺基酸蛋白質比真核生物PAL編碼之蛋白質明顯少將近200個胺基酸殘基。儘管序列與植物PAL(諸如歐芹PAL)同源(Röther等人，Eur. J. Biochem. 269:3065-3075 (2002))(CAA57056，30%一致且48%類似)，但其與細菌組胺酸解氨酶(HAL，EC 4.3.1.3)(諸如惡臭假單胞菌之組胺酸解氨酶)共有更大的同 源性(Schwede等人，Biochemistry 27:5355-5361 (1999))(A35251，36%一致且54%類似，SEQ ID NO:6，圖4)且與莢膜紅細菌(Rhodobacter capsulatus )之酪胺酸解氨酶(TAL)共有更大的同源性(Kyndt等人，FEBS Lett. 512:240-244 (2002))(圖3)。同源性包括苯丙胺酸/組胺酸/酪胺酸解氨酶家族之位置143處之保守性活性位點絲胺酸殘基，其為4-次甲基咪唑-5-酮(MIO)輔基中經修飾之脫氫丙胺酸殘基之可能前驅物(Langer等人，Adv. Prot. Chem. 58:175-188 (2001);Poppe, Curr. Opin. Chem. Biol. 5:512-524 (2001);Schwede等人，Biochemistry 27:5355-5361 (1999))。EncP與AdmH(AAO39102，63%一致且76%類似)共有最大的序列同源性，AdmH為牽涉於成團泛菌(Pantoea agglomerans)中胺德咪素(andrimid)生物合成中的假定苯丙胺酸胺基歧化酶，其與球孢鏈黴菌(Streptomyces globisporus)之酪胺酸胺基歧化酶Sgc4相關(Christenson等人，J. Am. Chem. Soc. 125:6062-6063 (2003);Christenson等人，Biochemistry 42:12708-12718 (2003))。顯然，由於encP與人類蛋白質(HAL)具有更近的同源性，因此encP可潛在地具有較小免疫原性。再者，由於其極其相似，因此可使encP突變以看似人類HAL(encP之人源化型式)。
HAL與PAL經證明享有分別自組胺酸及苯丙胺酸中以化學方式艱難排除氨的共同機制。在兩種酶的作用下，超親電子輔基5-亞甲基-3,5-二氫咪唑-4-酮(MIO)藉由對芳環之Friedel-Crafts型攻擊而使其各自受質之非酸性β氫原子活 化。產生的σ複合物藉由排斥任何鹼基接近酶之結合袋來防止質子自環中吸出。環外雙鍵之形成為氨消除、再芳族化及斷裂之關鍵。MIO輔基再生且形成產物尿刊酸酯(urocanate)或肉桂酸酯(Poppe等人，Angew. Chem. Int. Ed. 44:3668-3688 (2005))。
由於HAL與PAL之間同源性高，因此HAL與PAL之保守區稱為HAL/PAL保守區。此高同源性會在如NCBI之資料庫中在"PAL-HAL"之潛在酶活性方面造成一些混淆而導致誤標，諸如NCBI資料庫中對於點形念珠藻及多變魚腥藻所列之蛋白質序列。因此有些PAL酶可能被誤標為HAL酶。儘管PAL與HAL之活性位點極其相似，但預計其在有些關鍵殘基上不同(Calabrese等人，Biochemistry 43(36):11403-11416 (2004);Xiang等人，(2002)，同上；Williams等人，(2005)，同上)。尤其在HAL中，惡臭假單胞菌之甲硫胺酸382與麩醯胺酸414 (SEQ ID NO:6)在所有HAL中為高度保守的，但在迄今為止所述的所有PAL中，常常分別為離胺酸與麩醯胺酸所置換(圖4)。因此可以說，具有"PAL-HAL"區域且具有離胺酸382與麩醯胺酸414之同源物的所有蛋白質具有具有PAL活性之蛋白質之序列特徵。此相對較新近描述的PAL特徵(Williams等人，(2005)，同上)容許正確地標記HAL至PAL之一些酶且可用於自已公開之基因及蛋白質資料庫中鑑別一些新穎PAL酶。
本發明係關於該原核生物PAL及其生物學活性片段、突 變體及變異體之組合物以及其用於治療目的及工業目的之用途。
A.定義
除非另有說明，否則本申請案(包括說明書及申請專利範圍)中所用的以下術語具有如下定義。須注意，除非上下文另有明確規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式"一"及"該"包括複數個所指物。標準化學術語之定義可見於參考文獻中，包括Carey及Sundberg, Advanced Organic Chemistry，第3版，A卷及B卷(Plenum Press, New York 1992)。除非另有說明，否則本發明之實施將採用此項技術技能範圍內之合成有機化學、質譜學、製備型及分析型層析法、蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學之習知方法。參見，例如T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993);A.L. Lehninger, Biochemistry(Worth Publishers, Inc.，第4版，2004)；Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S. Colowick及N. Kaplan編，Academic Press, Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)。
本文中所引用的所有公開案、專利及專利申請案，無論前述或下述，均以引用方式全文併入本文中。
正文中通篇使用以下胺基酸縮寫：
"聚核苷酸"係指包含核苷酸單元的聚合物。聚核苷酸包括天然存在之核酸，諸如去氧核酸("DNA")及核糖核酸("RNA")以及核酸類似物。核酸類似物包括：包含參與對其他核苷酸之鍵而非天然存在之磷酸二酯鍵之非天然存在之鹼基、核苷酸的核酸類似物，或包含經由不同於磷酸二酯鍵之鍵連接之鹼基的核酸類似物。因此，核苷酸類似物包含(例如但不限於)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯、磷醯胺酯、硼烷磷酸酯、甲基膦酸酯、對掌性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)及其類似物。該等聚核苷酸可(例如)使用自動化DNA合成儀合成。術語"核酸"通常係指大聚核苷酸。術語"寡核苷酸"通常係指短聚核苷酸(一般不大於約50個核苷酸)。應瞭解，當核苷酸序列由DNA序列(亦即A、T、G、C)表示時，此亦包括RNA序列(亦即A、U、G、C)，其中"U"置換"T"。
"cDNA"係指與mRNA互補或一致，呈單股或雙股形式的DNA。
本文中使用習知註解描述聚核苷酸序列：單股聚核苷酸序列之左手端為5'-端；雙股聚核苷酸序列之左手方向稱為5'-方向。將核苷酸添加至初生RNA轉錄物中之5'至3'之方向稱為轉錄方向。具有與mRNA相同之序列的DNA股稱為"編碼股"；位於具有與由之轉錄之mRNA相同之序列的DNA股上且以5'至RNA轉錄物之5'端定位的序列稱為"上游序列"；位於具有與RNA相同之序列之DNA股上且以3'至編碼RNA轉錄物之3'端定位的序列稱為"下游序列"。
"互補"係指兩個聚核苷酸之交互作用表面之拓撲相容性或配合性。因此，該兩個分子可描述為互補，且此外，接觸表面特徵彼此互補。若第一聚核苷酸之核苷酸序列與第二聚核苷酸之聚核苷酸結合搭配物之核苷酸序列一致，則第一聚核苷酸與第二聚核苷酸互補。因此，序列為5'-TATAC-3'的聚核苷酸與序列為5'-GTATA-3'的聚核苷酸互補。
若與主題核苷酸序列互補的序列與參考核苷酸序列大體上一致，則該主題核苷酸序列與參考核苷酸序列"大體上互補"。
"編碼"係指聚核苷酸(諸如基因、cDNA或mRNA)中之特定核苷酸序列在生物過程中充當合成其他具有確定核苷酸序列(亦即rRNA、tRNA及mRNA)或確定胺基酸序列及由此產生之生物學特性的聚合物及巨分子之模板的內在特性。 因此，若轉錄並轉譯一種基因所產生之mRNA在細胞或其他生物系統中產生一種蛋白質，則彼基因編碼該蛋白質。一種基因或cDNA之編碼股(其核苷酸序列與mRNA序列一致且通常提供於序列表中)與非編碼股(用作轉錄之模板)可稱為編碼彼基因或cDNA之蛋白質或其他產物。除非另有說明，否則"編碼胺基酸序列的核苷酸序列"包括作為彼此之簡并型式且編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質及RNA的核苷酸序列可包括內含子。
"重組性聚核苷酸"係指具有並非天然接合在一起之序列的聚核苷酸。擴增或組裝之重組性聚核苷酸可包括於適當載體中，且該載體可用於轉化適當的宿主細胞。包含重組性聚核苷酸的宿主細胞稱為"重組性宿主細胞"。接著將基因於重組性宿主細胞中表現以產生例如"重組性多肽"。重組性聚核苷酸亦可具有非編碼功能(例如啟動子、複製起點、核糖體結合位點等)。
"表現控制序列"係指聚核苷酸中的某種核苷酸序列，其調節與其操作性連接之核苷酸序列的表現(轉錄及/或轉譯)。"操作性連接"係指兩部分之間的功能關係，其中一部分之活性(例如調節轉錄之能力)對另一部分產生作用(例如轉錄該序列)。表現控制序列可包括(例如但不限於)以下各者之序列：啟動子(例如誘導型或組成型啟動子)、增強子、轉錄終止子、起始密碼子(亦即ATG)、內含子拼接信號及終止密碼子。
"表現載體"係指包含重組性聚核苷酸的載體，該重組性 聚核苷酸包含與待表現之核苷酸序列操作性連接的表現控制序列。表現載體包含足夠的順式作用表現要素；其他表現要素可由宿主細胞或活體外表現系統供給。表現載體包括此項技術中已知的所有表現載體，諸如併有重組性聚核苷酸的黏質體、質體(例如裸露或包含於脂質體中)及病毒。
"擴增"係指藉以複製聚核苷酸序列且從而使其擴展為更大量之聚核苷酸分子的任何方法，例如逆轉錄、聚合酶鏈反應及連接酶鏈反應。
"引子"係指能夠特異性地與指定聚核苷酸模板雜交且提供合成互補聚核苷酸之起點的聚核苷酸。當將聚核苷酸引子置於誘導合成的條件下(亦即在核苷酸、互補聚核苷酸模板及聚合媒介(諸如DNA聚合酶)之存在下)時，此合成發生。引子通常具有單股，但可具有雙股。引子通常為去氧核糖核酸，但多種合成及天然存在之引子可用於多種應用中。引子與設計成可與之雜交的模板互補以充當啟動合成之位點，但不一定反映該模板之確切序列。在此情況下，引子與模板之特異性雜交視雜交條件之嚴格性而定。引子可用例如發色部分、放射性部分或螢光部分標記且可用作可偵測部分。
"探針"當關於聚核苷酸使用時，係指能夠與另一種聚核苷酸之指定序列特異性雜交的聚核苷酸。探針與標靶互補聚核苷酸特異性雜交，但不一定反映模板之確切互補序列。在此情況下，探針與標靶之特異性雜交視雜交條件之 嚴格性而定。探針可用例如發色部分、放射性部分或螢光部分標記且可用作可偵測部分。
若序列為第一序列的聚核苷酸與序列為第二序列的聚核苷酸特異性雜交，則該第一序列相對於該第二序列為"反義序列"。
"特異性雜交"或"選擇性雜交"係指當特定核苷酸序列存在於複雜混合性(例如全細胞)DNA或RNA中時，核酸分子在嚴格條件下優先與彼序列結合、雙聯或雜交。
術語"嚴格條件"係指使得探針優先與其靶子序列雜交且與其他序列雜交程度較小或完全不雜交的條件。在核酸雜交實驗(諸如南方及北方雜交)背景下之"嚴格雜交"及"嚴格雜交洗滌條件"視序列而定且在不同環境參數下不相同。核酸雜交之廣泛規則見於Tijssen (1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes第2章第I部分"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York中。通常，選擇在限定離子強度及pH下，比特定序列之熱熔點(Tm)低約5℃的高度嚴格雜交及洗滌條件。Tm為靶序列之50%與理想匹配之探針雜交時的溫度(在限定離子強度及pH下)。對於特定探針，選擇等於Tm的極嚴格條件。
在南方或北方墨點法中，具有100個以上互補殘基之互補核酸在濾紙上雜交的嚴格雜交條件之實例為42℃下含有1 mg肝素之50%福爾馬林，其中雜交進行隔夜。高度嚴格 洗滌條件之實例為在72℃下，用0.15 M NaCl洗滌約15分鐘。嚴格洗滌條件之實例為在65℃下，用0.2倍SSC洗滌15分鐘(有關SSC緩衝液之描述參見Sambrook等人，(1989)同上)。通常，高嚴格性洗滌之前進行低嚴格性洗滌以移除背景探針信號。用於具有例如100個以上核苷酸之雙鏈體之中等嚴格性洗滌實例為在45℃下，用1倍SSC洗滌15分鐘。用於具有例如100個以上核苷酸之雙鏈體之低嚴格性洗滌實例為在40℃下用4-6倍SSC洗滌15分鐘。一般而言，在特定雜交檢定中，信雜比為無關探針之觀測值的2倍(或2倍以上)，說明偵測到特異性雜交。
"多肽"係指包含經由肽鍵連接之胺基酸殘基、其天然存在之相關結構變異體及非天然存在之合成類似物的聚合物、其天然存在之相關結構變異體及非天然存在之合成類似物。合成多肽可使用例如自動化多肽合成儀合成。術語"蛋白質"通常係指大多肽。術語"肽"通常係指短多肽。
本文中使用習知註解描述多肽序列：多肽序列之左手端為胺基末端；多肽序列之右手端稱為羧基末端。
"保守性取代"係指多肽中之胺基酸經功能相似的胺基酸取代。以下六組各自含有彼此間為保守性取代的胺基酸：1)丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T); 2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E); 3)天冬醯胺酸(N)、麩醯胺酸(Q); 4)精胺酸(R)、離胺酸(K); 5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；及 6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)。
胺基酸亦可如下分組：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile; (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr; (3)酸性：Asp、Glu; (4)鹼性：Asn、Gln、His、Lys、Arg; (5)影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
"對偶基因變異體"係指佔據相同基因座之兩種或兩種以上基因多態形式中之任意者。對偶基因變異經由突變天然地發生，且可在群體內產生表型多態現象。基因突變可為沉默的(在所編碼之多肽中無變化)或可編碼胺基酸序列改變的多肽。"對偶基因變異體"亦指來源於遺傳對偶基因變異體之mRNA轉錄物的cDNA，以及由其編碼的蛋白質。
在兩個或兩個以上聚核苷酸或多肽序列之背景中，術語"一致"或"一致性"百分比係指如使用以下序列比較演算法中之一者或藉由目測檢查所量測，當在達成最大對應性之情況下進行比較並比對時，兩個或兩個以上序列或子序列相同或具有指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基。
在兩種核酸或多肽之背景中，短語"大體上同源"或"大體上一致"通常係指如使用以下序列比較演算法中之一者或藉由目測檢查所量測，當在達成最大對應性之情況下進行比較並比對時，兩個或兩個以上序列或子序列具有至少40%、60%、80%、90%、95%、98%的核苷酸或胺基酸殘 基一致性。在有些實施例中，大體一致性存在於長度為至少約50個殘基、至少約100個殘基或至少約150個殘基的序列區域中。在另一實施例中，在比較生物聚合物兩者中之任一者或兩者之整個長度範圍內序列大體上一致。
序列比較時，通常一個序列充當參考序列，將測試序列與其進行比較。當使用序列比較演算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦，必要時指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。接著序列比較演算法基於所指定之程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。
供比較之序列之最佳比對可(例如)藉由以下方法執行：Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)之局部同源性演算法；Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)之同源性比對演算法；Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)之相似性搜尋法；該等演算法之電腦化執行(Wisconsin Genetics軟體套裝中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)；或目測檢查。
有效演算法之一實例為PILEUP。PILEUP使用漸進式成對比對由一組相關序列形成多重序列比對，以展示其關係及序列一致性百分比。亦可繪出展示用於形成比對之分群關係的樹或樹形圖。PILEUP使用Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)之漸進式比對方法之簡化法。所用方法類似於Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989)所述的方法。此程式可比對多達300個序列，各序列最大長 度為5,000個核苷酸或胺基酸。多重比對程序始於兩個最相似序列之成對比對，從而產生經比對之兩個序列之群組。接著將該群組與下一個最相關序列或比對序列群組比對。藉由兩個別序列之成對比對之簡單延伸來比對兩個序列之群組。藉由一系列漸進式成對比對來達成最終比對。藉由針對序列比較區指定特定序列及其胺基酸或核苷酸座標及藉由指定程式參數來運作程式。舉例而言，可使用以下參數將參考序列與其他測試序列比較以確定序列一致性百分比關係：預設空位權重(3.00)、預設空位長度權重(0.10)及加權端空位。用於形成多重序列比對的另一種演算法為Clustal W(Thompson等人，Nucleic Acids Research 22:4673-4680 (1994))。
適於測定序列一致性百分比及序列相似性之演算法之另一實例為BLAST演算法，其描述於Altschul等人，J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)中。執行BLAST分析的軟體可經由美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。該演算法涉及首先藉由鑑別查詢序列中長度W之短字碼來鑑別高分值序列對(HSP)，該等高分值序列對當與資料庫序列中相同長度字碼比對時，與某一正值臨限分值T匹配或相符。T稱為鄰近字碼臨限分值(Altschul等人，(1990)，上述)。該等最初命中的鄰近字碼充當開始搜尋之種子，以發現含有其之更長HSP。接著將命中字碼沿著各序列雙向延伸，只要可增大累計比對分。對於核苷酸序列，累計分係使用參數M(一對 匹配殘基之獎勵分；總是>0)及N(錯配殘基之罰分；總是<0)計算。對於胺基酸序列，使用計分矩陣計算累計分。在以下情況下停止命中字碼在各方向上之延伸：累計比對分自其所達成之最大值減少X之數值；累計分因一或多次負分值殘基比對之累計而趨於零或低於零；或到達任一序列之末端。BLAST演算法參數W、T及X決定比對之靈敏性及速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列)使用以下參數作為預設值：字長(W)11、期望值(E)10、M=5、N=-4及兩股之比較。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用以下參數作為預設值：字長(W)3、期望值(E)10及BLOSUM62計分矩陣(參見Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989))。
除計算序列一致性百分比外，BLAST演算法亦對兩序列之間的相似性執行統計分析(參見例如Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993))。BLAST演算法所提供之一種相似性量度為最小總和概率(P(N))，其指示兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生的匹配之概率。舉例而言，若在測試核酸與參考核酸之比較中，最小總和概率小於約0.1、小於約0.01或小於約0.001，則認為該測試核酸與參考序列相似。
兩核酸序列或多肽大體上一致之另一指示為如下文所述，由第一核酸編碼的多肽可與由第二核酸編碼的多肽發生免疫交叉反應。因此，(例如)若一多肽與第二多肽僅保守性取代不同，則該兩肽通常大體上一致。
兩核酸序列大體上一致之另一指示為如本文中所述，兩個分子可在嚴格條件下彼此雜交。
"大體上純"或"經分離"意謂目標物質為所存在之主要物質(亦即，以莫耳計，多於組合物中之任何其他個別巨分子物質)，且大體上經純化之溶離份為目標物質在所存在之所有巨分子物質中占至少約50%(以莫耳計)的組合物。通常，大體上純的組合物意謂存在於組合物中之巨分子物質中約80%至90%或90%以上為經純化之所關注物質。若組合物基本上由單一巨分子物質組成，則目標物質經純化至實質同質性(藉由習知偵測方法無法偵測到組合物中之污染物質)。就此定義而言，溶劑物質、小分子(<500道爾頓)、穩定劑(例如BSA)及元素離子物質不視為巨分子物質。在有些實施例中，本發明之化合物或結合物為大體上純的或經分離。在有些實施例中，本發明之化合物或結合物相對於其合成中所用的巨分子起始物質而言為大體上純的或經分離。在有些實施例中，本發明之醫藥組合物包含與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑混合的大體上經純化或經分離之PAL多肽結合物及活性劑。
如應用於某實物的"天然存在"係指該實物可存在於自然中。舉例而言，可由自然來源分離且尚未在實驗室中經人有意修飾之有機體(包括病毒)中所存在的多肽或聚核苷酸序列為天然存在的。
術語"野生型"(wt)係指有機體之天然遺傳形式。野生型有別於突變形式(發生基因突變的有機體)。 術語"多肽"及"蛋白質"係指胺基酸殘基之聚合物且不限於最小長度之產物。因此，該定義包括肽、寡肽、二聚體、多聚體及其類似物。全長蛋白質與其片段皆涵蓋於該定義中。該等術語亦包括多肽之表現後修飾，例如糖基化、乙醯化、磷酸化及其類似修飾。此外，出於本發明之目的，"多肽"係指包括對於天然序列之修飾(諸如缺失、添加及取代(通常為保守性取代))的蛋白質，只要該蛋白質維持所要活性。該等修飾可為有意的，如經由定點誘變，或可為偶然的，諸如經由產生蛋白質之主體或歸因於PCR擴增之錯誤所引起的突變。
如本文中所使用，"類似物"或"衍生物"為化合物，例如肽，其與指定化合物(例如肽)具有大於約70%、但小於100%的序列相似性。該等類似物或衍生物可包含非天然存在之胺基酸殘基(包括(例如但不限於)高精胺酸、鳥胺酸、青黴胺及正纈胺酸)以及天然存在之胺基酸殘基。該等類似物或衍生物亦可包含一或複數個D-胺基酸殘基，且可在兩個或兩個以上胺基酸殘基之間含有非肽互連子。
術語"有效量"意謂足以對個體之健康狀況、病理及疾病產生所要結果或達成診斷目的之劑量。所要結果可包含劑量接受者之主觀或客觀改善。"治療有效量"係指對健康產生預定有益影響的有效劑量。在任何個別情況下，適當"有效"量可由一般熟習此項技術者使用常規實驗確定。
"治療"係指預防性治療或治療性治療或診斷性治療。
"預防性"治療為施與不呈現疾病徵象或僅呈現早期徵象 之個體以便降低顯現病理現象之風險的治療。本發明之化合物或結合物可以預防性治療之形式給與，以降低顯現病理現象之可能性，或使病理現象(若顯現)之嚴重度降至最小。
"治療性"治療為施與呈現病理徵象或症狀之個體以便減弱或消除彼等徵象或症狀的治療。該等徵象或症狀可為生物化學、細胞、組織學、機能、主觀或客觀徵象或症狀。本發明之化合物或結合物可以治療性治療之形式給與，或出於診斷之目的給與。
"診斷"意謂鑑別病理狀況之存在或性質。診斷方法在其特異性及選擇性方面不同。雖然特定診斷方法可能未提供對病狀的明確診斷，但該方法若能提供有助於診斷的正性指示則足矣。
"醫藥組合物"係指適於受檢動物(包括人類及哺乳動物)之醫藥用途的組合物。醫藥組合物包含藥理學上有效之量之PAL多肽且亦包含醫藥學上可接受之載劑。醫藥組合物涵蓋包含活性成分及構成載劑之惰性成分的組合物，以及由任意兩種或兩種以上成分組合、複合或聚集或由一或多種成分解離或由一或多種成分之其他類型反應或相互作用直接或間接形成的任何產物。因此，本發明之醫藥組合物涵蓋藉由將本發明之化合物或結合物與醫藥學上可接受之載劑混合製備的任何組合物。
"醫藥學上可接受之載劑"係指任何標準醫藥載劑、緩衝劑及賦形劑，諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液、5%右旋 糖水溶液，及乳液，諸如油/水或水/油乳液，以及不同類型之濕潤劑及/或佐劑。適當的醫藥載劑及調配物描述於Remington's Pharmaceutical Sciences第19版(Mack Publishing Co., Easton, 1995)中。醫藥載劑視活性劑之預定投藥方式而定。典型投藥方式包括經腸投藥(例如經口)或非經腸投藥(例如皮下、肌肉內、靜脈內或腹膜內注射；或局部、經皮或經黏膜投藥)。"醫藥學上可接受之鹽"為可調配成用於醫藥用途的化合物或結合物之鹽，例如金屬鹽(鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽等)及氨或有機胺之鹽。
"醫藥學上可接受"或"藥理學上可接受"意謂不為生物學上或其他方面不合乎需要的物質，亦即，該物質可投與個體而不會產生任何不合乎需要的生物學效應或不會以有害方式與含有其之組合物中之任何組分相互作用。
如本文中所使用的術語"單位劑型"係指適用於人類及動物個體之呈單劑量形式的實體離散單元，各單元含有以足以產生所要效果之量計算之預定量的本發明化合物或結合物與醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或媒劑之組合。本發明之新穎單位劑型之規格視以下因素而定：所用特定化合物或結合物及欲達成之效果，及主體中與各化合物或結合物相關的藥效學。
"生理pH值"或"生理範圍內之pH值"意謂約7.2至8.0範圍內(包括7.2及8.0)、更通常約7.2至7.6(包括7.2及7.6)範圍內的pH值。
如本文中所使用，術語"個體"涵蓋哺乳動物及非哺乳動 物。哺乳動物之實例包括但不限於哺乳動物綱之任何成員：人類、非人類靈長類(諸如黑猩猩)及其他猿及猴種類；農場動物，諸如牛、馬、綿羊、山羊、豬；馴養動物，諸如兔、犬及貓；實驗動物，包括齧齒動物，諸如大鼠、小鼠及豚鼠，及其類似物。非哺乳動物之實例包括但不限於鳥、魚及其類似物。該術語不指定特定年齡或性別。
在多個實施例中，提及PAL:PEG或PEG:PAL之比率來描述PAL變異體之聚乙二醇化。如本文中所使用，且除非另有指示，否則"PAL:PEG"之比率係指在聚乙二醇化反應中PAL變異體上之離胺酸殘基與PEG分子之比率。類似地，如本文中所使用，且除非另有指示，否則"PEG:PAL"之比率係指在聚乙二醇化反應中PEG分子與PAL變異體上之離胺酸殘基之比率。
B.基於結構之蛋白質工程
已知許多使用主要基於蛋白質結構資訊之合理最佳化的蛋白質工程方法(Brannigan等人，Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3(12):964-970 (2002);Marshall等人，Drug Discov. Today 8(5):217-221 (2003))。結構特徵之系統性置換可產生改良之蛋白質特性及/或受質特異性之再設計。將一個基因家族之一個成員之功能補充至另一個同源成員可藉由在緊鄰受質結合附近引入有限數目的胺基酸取代來達成。該等藉由形成改良之蛋白質變異體所達成之蛋白質功能改良可產生適用於工業、農業及治療應用的蛋白質 (Bocanegra等人，Biochemistry 32(11):2737-2740 (1993);Failla等人，Fold Des. 1(1):35-42 (1996);Hayes等人，Proc Natl Acad Sci USA 99(25):15926-15931 (2002);Voigt等人，Nat. Struct. Biol. 9(7):553-558 (2002);Malashkevich等人，Nat Struct Biol. 2(7):548-553 (1995);Wells等人，Proc Natl Acad Sci USA 84(15):5167-5171 (1987);Wilks等人，Science 242(4885):1541-1544 (1988))。
C. PAL之結構
野生型原核生物PAL之三維結構可使用x-射線晶體學測定。PAL蛋白質為同元四聚體(homotetramer)，其中各單體主要由α-螺旋組成且可細分成四個域：中心催化域、N端域、與惡臭假單胞菌組胺酸解氨酶結構相似之小C端域(HAL, Schwede等人，Biochemistry 38(17):5355-5361 (1999))，加上嵌入C端區域內之另一域(該域自完整四聚體分子之各端突出)。在四聚體之所有四個單體之結構中，N端最先25個殘基不明顯，此區域可能紊亂無序。在PAL四聚體中，單體B之殘基109-123與殘基350-353之間的環區域無序，單體A、C及D之區域103-123及350-353無序。紅冬孢酵母PAL之兩種其他X射線結構已使用結晶過程中反式肉桂酸根及NH4離子加合，用2.1 Å(P3221空間群)及2.7 Å(P21空間群)之解析度測定(Calabrese等人，Biochemistry 43(36):11403-11416 (2004))。用於結晶的較低pH及該等結構之較低解析度導致結構中較多內在無序(尤其在N端區域中)，且不能將存在於MIO輔因子上之額外電子密度明確地 分配至NH2加合物中。
該可催化去除羧酸中各種基團之四聚體酶家族中有多種相關結構(使用DALI，Holm等人，J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993))，該等酶包括解氨酶(PAL、HAL及天冬胺酸解氨酶(AAL))、反丁烯二酸酶及精胺琥珀酸解離酶(Schwede等人，Biochemistry 38(17):5355-5361 (1999))。此外，δ-晶狀體球蛋白鳥眼晶體蛋白具有相似摺疊，但為該結構家族之非酶形式(Schwede等人，(1999)，同上)。
來自惡臭假單胞菌之HAL之三維X射線結構(Röther等人，Eur. J. Biochem. 268:6011-6019 (2001);Schwede等人，Biochemistry 27:5355-5361 (1999))及紅冬孢酵母PAL之最新三維X射線結構(Calabrese等人，Biochemistry 43:11403-11416 (2004))揭示該等四聚體酶中對受質結合、催化及MIO形成至關重要的活性位點殘基。HAL中除H83及E414外之所有活性位點殘基(H83及E414分別經纈胺酸及麩醯胺酸殘基置換)均存在於EncP中(Xiang, L.等人，J. Biol. Chem. 277:32505-3250924 (2002))。有人提出，HAL中之H83結合L-組胺酸之咪唑部分並使其定向於活性位點且使結合酶之陽離子中間體穩定，而E414之羧酸酯基團可作為鹼用於催化。
PAL之高解析度三維蛋白質晶體結構可用於涉及蛋白質工程化以改良PAL之生物化學及生物物理學特性及增大PAL之活體內療效的方法。此外，該結構提供以下相關資訊：該結構中哪些區域最具可撓性(以移除並形成更緊湊 且穩定形式的PAL)；哪些殘基位於活性位點附近(以發生突變，以便增強蛋白質之活性及/或將蛋白質尺寸降至最小，以及為基於結構之抑制劑設計提供資訊)；及哪些表面位置接近免疫原性位點(例如定位研究中所鑑別的線性抗原決定基)及/或蛋白水解敏感性位點(源自蛋白酶定位研究)，從而可引入位點特異性突變體以便直接破壞問題位點或進行表面聚乙二醇化或其他化學衍生化以保護存在於天然PAL中之敏感性位點。
D. PAL結構座標之使用
PAL之高解析度三維晶體結構可用於電腦化方法中以選擇蛋白質中供突變、修飾或突變與修飾組合之區域。舉例而言，市售程式GETAREA基於X-射線晶體座標計算胺基酸殘基之表面曝露量。
高解析度三維晶體結構可進一步用於電腦模擬方法(in-silico method)中以設計酶之活性位點之配位體。舉例而言，用於對接及設計基於結構之小分子的市售軟體程式可用於設計PAL抑制劑(Billett等人，Biochim Biophys Acta 524(1):219-230 (1978);Janas等人，Acta Biochim Pol. 32(2):131-143 (1985);Zon等人，Phytochemistry 59(1):9-21 (2002);Alunni等人，Arch Biochem Biophys. 412(2):170-175 (2003))。
基於結構之PAL工程化
特定巨分子之可靠三維結構或結構模型之闡明可使理性設計成為最佳化該巨分子之特定結構及/或功能的有效方 法(Penning等人，Chem Rev. 101(10):3027-3046 (2001))。最佳化方法包括但不限於輔酶特異性之再設計(Bocanegra等人，Biochemistry 32(11):2737-2740 (1993))、蛋白質穩定性之改良(Malakauskas等人，Nat Struct Biol. 5(6):470-475 (1998);Jiang等人，Protein Sci. 10(7):1454-1465 (2001);Luo, Protein Sci. 11(5):1218-1226 (2002);Filikov等人，Protein Sci. 11(6):1452-1461 (2002);O'Fagain, Enz Microb Technol. 33:137-149 (2003);Cammett等人，J Mol Biol. 327(1):285-297 (2003))、受質特異性之再設計(Hedstrom等人，Science 255(5049):1249-1253 (1992);Failla等人，Fold Des. 1(1):35-42 (1996);Malashkevich等人，Nat Struct Biol. 2(7):548-553 (1995);Wilks等人，Biochemistry 31(34):7802-7806 (1992);Feil等人，Protein Eng. 10(3):255-262 (1997);Whittle等人，J Biol Chem. 276(24):21500-21505 (2001))、配位體或受體結合特異性之改變(Cunningham等人，Proc Natl Acad Sci USA 88(8):3407-3411 (1991);Reddy等人，Nat Biotechnol. 14(13):1696-1699 (1996);Doyle等人，Curr Opin Chem Biol. 4(1):60-63 (2000))及生物學活性之再工程化(Chen等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5618-5622 (1993);Sarkar等人，Nat Biotechnol. 20:908-913 (2002);Blatt等人，J Interferon Cytokine Res. 16(7):489-499 (1996))。
基於結構之工程化可用於形成PAL變異體，包括理性突變體，諸如截短、缺失、插入、拼接變異體、點突變、取 代、嵌合、環再工程化突變體、環對換突變體、表面鑲飾突變體以及隨機衍生之突變體(包括單獨或與理性演化之突變體組合的定向進化衍生之突變體)。此外，可形成包含PAL突變體的PAL變異體，其中已引入突變以便進行位點特異性聚乙二醇化及/或其他化學衍生化。用於該等方法中的PAL突變體包括與野生型紅冬孢酵母PAL具有大體相同之功能活性的任何PAL變異體，包括親本PAL蛋白質之變異體、片段及化學衍生物。
定向進化式蛋白質最佳化
定向進化方法可使所關注之基因隨機突變，以更完全地探測蛋白質突變空間中之較大區域。存在多種定向進化方法，包括易出錯的PCR及隨機插入及缺失(RID)誘變法以引入整個DNA序列上之多樣性，及更集中型或"定向"型多樣性形成方法，諸如位點飽和誘變法及其他基於寡核苷酸之誘變方法(Brannigan等人，(2002)，同上)。此外，已使用DNA序列重組方法將有利突變位點組合且同時移除有害突變，從而產生新穎的DNA序列(例如，DNA改組方法、StEP、RACHITT、ITCHY)。最後，基於結構之定向進化技術已用於針對治療優點再設計蛋白質(基於結構之組合工程化、SCOPE及蛋白質設計自動化、PDA方法)。SCOPE方法係基於半理性蛋白質工程化方法，其使用蛋白質結構資訊聯合DNA操縱技術由非同源基因設計並形成多重交叉蛋白質變異體庫(O'Maille等人，J Mol Biol. 321(4):677-691 (2002))。在PDA中，對突變空間進行電腦 化預篩檢僅容許包含與特定蛋白質摺疊相容的突變，從而將序列變異體之數目減少至可經受實驗篩檢的大小(美國專利第6,403,312號；Dahiyat等人，Proc Natl Acad Sci USA 94(19):10172-10177 (1997);Dahiyat等人，Protein Sci. 6(6):1333-1337 (1997);Hayes等人，Proc Natl Acad Sci USA 99(25):15926-15931 (2002);Orencia等人，Nature Struct Biol. 8:238-242 (2001))。
存在很多實例，其中使用定向進化(聯合有效選擇或篩檢方案)，自初始酶種開始且使彼酶種突變以達成經改變及/或改良之功能可使催化功能及生物物理學特性改良(例如免疫原性降低、穩定性增強)(Vasserot等人，Drug Discovery Today 8(3):118-126 (2003))。舉例而言，已針對多種不同蛋白質使用定向進化及其他"隨機"誘變方法獲得成功突變體(磷酸丙醣異構酶，Hermes等人，Proc Natl Acad Sci USA 87(2):696-700 (1990);β-內醯胺酶，Stemmer, W.P., Nature 370(6488):389-391 (1994), Orencia, M.C.等人，Nature Struct Biol 8:238-242 (2001), Voigt, C.A.等人，(2002)，同上；對硝基苄基酯酶，Moore等人，Nature Biotechnol. 14:458-467 (1996)；半乳糖苷酶至岩藻糖苷酶，Zhang等人，Proc Natl Acad Sci USA 94(9):4504-4509 (1997)；天冬胺酸轉胺酶，Yano等人，Proc Natl Acad Sci USA 95(10):5511-5515 (1998)；綠色螢光蛋白質，Crameri等人，Nat Biotechnol 14(3):315-319 (1996)；辣根過氧化物酶，Lin等人，Biotechnol Prog 15:467-471 (1999)；細胞色素P450, Joo等人，Nature 399(6737):670-673 (1999)；聯苯雙加氧酶，Kumamaru等人，Nat Biotechnol 16(7):663-666 (1998)；砷酸鹽解毒路徑，Crameri等人，Nat Biotechnol 15(5):436-438 (1997)；頭孢菌素酶，Crameri等人，Nature 391(6664):288-291 (1998)；各種蛋白質，Shao等人，Curr Opin Struct Biol 6(4):513-518 (1996)；各種蛋白質，Skandalis等人，Chem Biol 4:889-898 (1997)；枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin), Cunningham等人，Protein Eng. 1(4):319-325 (1987)；腈水解酶，DeSantis等人，J Am Chem Soc. 125(38):11476-11477 (2003);α-天冬胺醯基二肽酶，Kong等人，Biochem Biophys Res Commun. 289(1):137-142 (2001)；天冬胺酸轉胺酶，Rothman等人，Protein Science 13(3):763-772 (2004);L-天冬胺酸酶，Wang等人，Biochem Biophys Res Commun. 276(1):346-349 (2000)；及乳酸脫氫酶，Wilks等人，Biochemistry 31 (34):7802-7806 (1992))。
該等研究已反覆證明"隨機"誘變技術應用於開發具有增強之穩定性、活性及降解路徑抗性之改良酶變異體的效用。對進化蛋白質純系之結構分析可深刻瞭解與所得經改良之物理及化學特性相關的分子變化(Orencia等人之Advances in Protein Chemistry: Evolutionary protein design, F.H. Arnold編，Academic Press: San Diego，第227-259頁(2001))。使用定向進化技術所獲得的效益就涉及非活性位點殘基之有益突變的重複發生而言特別明顯，其中有些突 變位點位於距離具有有益效應之酶活性位點區15-20 Å開外處(Oue等人，J. Biol. Chem. 274(4):2344-2349 (1999))。可將定向進化及其他隨機誘變技術聯合選擇及篩檢程序用於開發PAL之更具蛋白質裂解穩定性及化學穩固性之形式以用於工業應用或用於酶替代療法，例如用於PKU。
E.經修飾之PAL
上述實驗已描述PAL之經修飾形式，諸如PAL突變體(Schuster等人，FEBS Lett. 349(2):252-254 (1994);Schuster等人，Proc Natl Acad Sci USA 92(18):8433-8437 (1995);Langer等人，Biochemistry 36:10867-10871 (1997);El-Batal等人，Acta Microbiol Pol. 49(1):51-61 (2000);Röther等人，Eur. J. Biochem. 269:3065-3075 (2002))及HAL突變體(Taylor等人，J. Biol. Chem. 269(44):27473-27477 (1994);Baedeker等人，Eur. J. Biochem. 269(6):1790-1797 (2002))。
PAL動力學之最佳化-催化活性增強之原核生物突變體
本發明之野生型PAL之生物學活性位點可視需要加以修飾以使PAL動力學特徵最佳。產生半最大活性的受質濃度Km與PAL使Phe含量維持在可接受之範圍(亦即120 μM至240 μM)內之治療功效密切相關。Km為酶對受質的親和力。藉由控制親和力可限制或控制任何酶在不同濃度下針對受質之功效。舉例而言，若Km為1000 μM(紅冬孢酵母)，則酶之活性在240 μM之血液Phe含量下降低至約12.5%且在60 μM之血液Phe含量下降低至約3%。若Km為 240 μM，則酶之活性在240 μM之血液Phe含量下降低至約50%且在60 μM之血液Phe含量下降低至約12%。若Km為120 μM，則酶之活性在240 μM之血液Phe含量下降低至約70%且在60 μM之血液Phe含量下降低至約35%。最佳地，治療目標為使酶具有足以減少Phe但亦使Phe維持在約120 μM至約240 μM之最佳範圍內的活性。具有高Km(亦即1000 μM)的酶在Phe含量下降至正常範圍內時快速失去活性，且亦需要不切實際地投與高濃度或大體積的劑量。另一方面，具有極低Km的酶會使Phe含量快速減少，此對於高苯丙胺酸血症而言可為致命的，但可用於控制癌症。
在有些實施例中，經修飾之生物學活性PAL具有至少約0.1 s-1 或大於約0.5 s-1 之kcat。在其他實施例中，經修飾之生物學活性PAL具有至少約0.2 s-1 或大於約1.0 s-1 之kcat。在其他實施例中，經修飾之生物學活性PAL具有介於約10 μM至約1000 μM之間的Km。在其他實施例中，經修飾之生物學活性PAL具有介於約100 μM至約1000 μM之間的Km。在其他實施例中，經修飾之生物學活性PAL呈現的酶活性比野生型之酶活性大約兩倍至約1000倍。在其他實施例中，經修飾之生物學活性PAL呈現的酶活性比野生型之酶活性高約10%至約100%。該等經修飾之生物學活性PAL蛋白可使用此項技術中熟知的方法(諸如定點誘變法)形成。
經證明，HAL中除H83及E414外之所有活性位點殘基(H83及E414分別經纈胺酸及麩醯胺酸殘基置換)均存在於 EncP中(Xiang, L.等人，J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002))。經研究，HAL中之H83的作用為結合L-組胺酸之咪唑部分並使其定向於活性位點且使結合酶之陽離子中間體穩定(Xiang等人，J. Bacteriology 187(12):4286-4289 (2005);Xiang等人，J. Bacteriology 188(14):5331 (2006))。有人提出E414之羧酸酯基團可作為鹼用於催化。在研究中，藉由定點誘變法形成EncP突變體，以評定V83對EncP形成肉桂酸的作用。用組胺酸置換纈胺酸形成突變體V83H，該突變體之特徵為PAL活性喪失。用丙胺酸置換纈胺酸產生突變體V83A，該突變體活性強於野生型EncPV83A，對L-苯丙胺酸之親和力(120 μM之Km)比野生型酶對L-苯丙胺酸之親和力(23 μM之Km)略低。然而，與野生型EncP相比，V83A之kcat高於野生型酶且活性強於野生型酶。
特定蛋白質變異體：免疫原性降低的變異體
目前使用多種策略來降低蛋白質免疫原性。在有些實施例中，為使免疫反應最小化而引入的修飾不破壞巨分子之結構、功能或穩定性。所用有效策略包括：增加人類序列含量(嵌合及/或其他'人源化'方法)；改良溶解特性；移除抗體之抗原決定基；引入化學衍生化(諸如聚乙二醇化)；及/或鑑別並移除MHC抗原識別位。對於注射之治療劑而言，可藉由執行抗原決定基定位來尋找活體內免疫反應性之位址，繼之進行理性誘變以修飾該等免疫原性位點及/或以其他方式使其突變，單獨或與位點特異性聚乙二醇化 (Hershfield等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7185-7189 (1991);Leong等人，Cytokine 16(3):106-119(2001);Lee等人，Pharm. Res. 20(5):818-825 (2003))或其他化學衍生化方法組合，以將蛋白質免疫反應性降低至可接受的程度。抗原表面蛋白質區域之修飾使免疫原性降低(Chirino等人，Drug Discov. Today 9(2):82-90 (2004))。一種改良方法涉及建構尺寸更小、保留催化活性的蛋白質(例如使用吸光度檢定進行活性量測)。亦可使用第二種改良方法(蛋白質工程化聯合ELISA篩檢)鑑別免疫反應性降低的突變體。另一種方法將點突變引入其他表面Lys位點以便進行聚乙二醇化衍生化，該方法經證明可用測試酶嘌呤核苷磷酸化酶降低免疫原性(Hershfield等人，(1991)，同上)。另一途徑使用位於蛋白質抗原決定基區中之殘基之突變以移除免疫原性位點(Yeung等人，J Immunol. 172(11):6658-6665 (2004))。在類似於抗體人源化的方法中，將來源於人類抗體的同源環區域及/或殘基取代至同源蛋白質之相應環區域中。
改良蛋白質之溶解特性可增強酶比活性及/或降低免疫原性。經細菌表現之重組性蛋白質之一典型溶解特性為因(例如)鏈間二硫鍵形成、疏水性相互作用及/或二價陽離子而形成蛋白質聚集物(Chi等人，Pharm Res 20(9):1325-1336 (2003))。重組表現蛋白質之聚集可增強免疫反應(Hermeling等人，Pharm Res 21(6):897-903 (2994);Schllekens, Nephrol Dial Transplant 20(增刊6)：vi3-9 (2005))。一種改良方法包括用其他胺基酸殘基(例如絲胺酸)取代表面半胱胺酸殘基以將形成鏈間二硫鍵的可能性降至最小。舉例而言，用絲胺酸殘基取代兩個表面半胱胺酸殘基減少分支酸裂解酶之聚集，對酶活性的影響較小(Holden等人，Biochim Biophys Acta 1594(1):160-167 (2002))。
移除蛋白質治療性蛋白水解加工位點亦可藉由防止蛋白酶體加工，從而防止剪斷並加工成供抗原呈現細胞結合的肽片段來提供免疫原性之降低。已在改變II類MHC決定子之側邊區域從而防止呈予自體反應性T細胞中觀測到類似現象(Maverakis等人，Proc Natl Acad Sci, USA 100(9):5342-5347 (2003))。
抗原決定基定位
蛋白質治療性抗原決定基可使用多種演算法計算或使用活體外或活體內方法經由實驗測定。常使用電腦程式(諸如DNAStar之Lasergene程式組中之"Peptide Companion"及"Protean")，基於蛋白質之化學組成及構形評估蛋白質之表面抗原決定基區域。蛋白質序列中之免疫原性區域為親水性(基於所計算之表面蛋白質區域之親水指數)及抗原性(基於所計算之表面蛋白質區域之兩性及其他構形參數)計算值最高的彼等區域。或者，可基於潛在HLA結合之電腦模型預測來使蛋白質序列中之抗原識別位定位(Robinson等人，Nucleic Acids Res. 31(1):311-314 (2003);De Groot等人，Novartis Found. Symp. 254:57-72 (2003))。此外，抗 原決定基可使用活體外生物化學方法(Tangri等人，Curr. Med. Chem. 9(24):2191-2199 (2002))及基於細胞之活體外方法(Stickler等人，J Immunother. 23(6):654-660 (2000);Stickler等人，J Immunol Methods 281(1-2):95-108 (2003))鑑別。蛋白質工程化時，可使用與Stickler等人(Toxicol Sci. 77(2):280-289 (2004))之基於細胞之活體外檢定類似的檢定監測免疫原性之相對降低。
Pepscan分析(抗原決定基定位)包括使用覆蓋酶序列之表面區域之重疊肽之文庫且用針對覆蓋整個酶蛋白質序列之重疊肽所產生的兔多株抗體探測，且從而揭示存在於酶中的線性抗原決定基。基於酶之三維結構，藉由以下方式使經實驗鑑別之抗原性位點發生突變：使抗原決定基區域殘基隨機發生突變以移除抗原決定基識別位點，或使用位點特異性突變以將Lys或Cys殘基引入靠近該等抗原決定基位點的表面上以提供聚乙二醇化位置從而覆蓋並保護該等位點以防免疫原性識別。對該等潛在非免疫原性酶突變體(或該等酶突變體之聚乙二醇化形式)進行ELISA篩檢可提供對呈現降低免疫反應性之酶突變體之子集的活體外鑑別。
表面殘基鑑別及突變
可鑑別酶之免疫原性區域中或附近之表面曝露殘基。視與表面之接近程度及與免疫原性/抗原性區域之接近程度而定，該等位置可為存在於蛋白質中之所有溶劑可接近表面位置之子集。蛋白質三維結構(使用X射線晶體學、NMR 或同源性模擬法所測定)可用於市售軟體程式中計算巨分子溶劑可接近表面面積。使用程式GETAREA 1.1(Fraczkiewicz等人，J. Comp. Chem. 19:319-333 (1998))所得到的輸出結果提供對紅冬孢酵母PAL之表面可接近性的可靠評估。GETAREA及PARAREA及類似程式使用連續化方法及基於Gauss-Bonnet定理的參數法計算溶劑可接近表面面積。PARAREA使用各原子之鄰近清單中之所有原子對發現Gauss-Bonnet路徑中的潛在交點，而GETAREA使用雙球相交之平面所界定之交會半空間更有效地計算溶劑曝露最高點。
在天然PAL中，GETAREA鑑別出遍布於整個四聚體PAL蛋白質表面上的十二個表面曝露之Lys殘基以及一個部分表面曝露的Cys殘基(Cys140)。該等位置可直接供聚乙二醇化衍生化使用。此外，PAL之三維結構可用於鑑別可供定點誘變使用的額外表面殘基。該等額外位點可使用標準的蛋白質工程化技術突變以形成免疫原性降低、蛋白水解抗性改良及/或穩定性/活性改良的更佳PAL突變體。
為提供具有經改良之特性(諸如降低之免疫原性)之蛋白質而使蛋白質突變的策略於此項技術中已知。一種通用的方法為使抗原決定基中之每個非丙胺酸殘基突變為Ala且使抗原決定基中之每個丙胺酸殘基突變為Gly。其他方法為藉由突變或缺失將抗原決定基區域中的帶電及疏水性殘基移除。其他突變策略為引入位點特異性突變，繼之進行位點特異性化學衍生化。
亦可使用截短法形成蛋白質改良。PAL相對於組胺酸解氨酶(HAL)之生物資訊學分析已提出截短型突變體(殘基23-716及1-564)。此外，基於高度同源之HAL蛋白質之結構中缺乏C-末端結構域區域，PAL三維結構的分析提供另一供截短用之區域。C-末端域缺失突變體(包括HAL之對應環區域融合至PAL序列中以取代PAL結構之C-末端域突出區域(經計算具有主要抗原決定基區域)的突變體)形成更小、更穩固且預計免疫原性更小的PAL變異體。
在另一方法中，將理性誘變與定向進化法組合使用的蛋白質工程化可用於獲得PAL之突變體形式。舉例而言，伴隨實驗及組合設計執行理性設計已使康普素(compstatin)之活性改良(Morikis等人，Biochem. Soc. Trans. 32(1):28-32 (2004))。理性誘變與定向進化法之組合亦展示前景良好(Bornscheuer等人，Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2):137-143 (2001);Dwyer等人，Science 304(5679):1967-1971 (2004))。
呈現不及最佳之酶活性的PAL突變體形式可使用定向分子進化之蛋白質工程化方法針對活性進行進化，其中繼隨機誘變步驟之後為選擇具有活性之突變體的程序，從而得到僅為具有活性之彼等純系之新蛋白質突變體群。舉例而言，若特定突變體PAL(吾人已設計成將表面離胺酸殘基引入該結構之含抗原決定基區域附近)無活性，則對此突變體執行定向進化(使無活性突變體突變且選擇具有活性之轉化體)形成新的突變體群，該突變體群含有此有益突變 (表面離胺酸位點)以及定位於整個結構中之其他隨機突變(使各活性純系恢復活性)之子集。此外，可使具有相同蛋白質或不同蛋白質之相似序列之不同物種雜交的分子培育之定向進化技術(Crameri等人，Nature, 391:288-291 (1998);Minshull等人，Curr. Opin. Chem. Biol. 3(3):284-290 (1999))可取代人類組胺酸解氨酶之序列，以便用不會被免疫系統識別之人類序列置換PAL之大部分免疫原性區域中之一些區域。
PAL之突變體形式可藉由基於半理性方法製備雜合蛋白質變異體來獲得，從而使蛋白質設計之定向程度更高(相對於純定向進化方法)，且為使用該等偏向性蛋白質工程化方法所鑑別之蛋白質結構之彼等區域提供更高隨機程度之突變操縱。舉例而言，PDA方法形成電腦化預篩檢之蛋白質變異體庫，從而容許用純隨機或無偏向性蛋白質工程化方法對蛋白質特性進行更快速的最佳化(美國專利第6,403,312號；Dahiyat, Curr Opin Biotechnol. 10(4):387-390 (1999);Filikov等人，(2002)，同上；Hayes等人，(2002)，同上；Luo, P.等人，(2002)，同上)。類似地，SCOPE方法基於"等效"結構子域建構雜合酶變異體，從而容許自非同源基因起始形成多重交叉蛋白質變異體庫(O'Maille等人，(2002)，同上)。在類似形式中，Voigt等人開發的方法基於電腦化演算法之應用建構雜交種，該電腦化演算法鑑別可重組但不破壞蛋白質三維結構之完整性的蛋白質片段或'基模(schema)'(Voigt等人，(2002)，同 上)。電腦化分析亦可基於二級結構要素分配來鑑別蛋白質摺疊中具有結構及功能重要性之位置之保守核心區(Mizuguchi等人，Bioinformatics 16(12):1111-1119 (2000))。可按照任何技術方法之程序獲得PAL之突變體形式。
作為另一種酶取代物之HAL
已基於惡臭假單胞菌HAL之結構同源性模擬海洋鏈黴菌encP之結構。海洋鏈黴菌之結構儘管小於PAL，但與人類PAL更相似，從而使encP成為用於PAL蛋白質工程化的解氨酶之可能較低免疫原性形式。另一種獲得非免疫原性PAL變異體的方法包括利用突變使海洋鏈黴菌encP或其他原核生物PAL突變，以用人類組胺酸解氨酶序列置換免疫原性序列(HAL, Suchi等人，Biochim. Biophys. Acta 1216(2):293-295 (1993))，繼之選擇具有PAL活性的encP或其他原核生物突變體，以獲得可在突變及活性選擇步驟之後進一步聚乙二醇化的"人源化"encP或其他原核生物PAL蛋白。
特定蛋白質變異體：蛋白酶敏感性降低的變異體
目前可使用多種策略降低蛋白質蛋白酶敏感性。在有些實施例中，為使蛋白水解敏感性最小化而引入的修飾不破壞巨分子之結構、功能或穩定性。有效策略包括：向酶提供活性位點穩定物質，諸如競爭性抑制劑(Gilbert等人，(1981)，同上；美國專利第6,548,644號、第6,451,986號、第6,433,158號、第6,461,849號)；化學修飾敏感性Lys及/ 或Arg位點中之胺基以阻斷胰蛋白酶結合位點；使胰凝乳蛋白酶敏感性Tyr、Phe及/或Trp殘基突變為較小的中性胺基酸，以消除裂解敏感性、使PAL與其他保護性巨分子(諸如Fc抗體域或肉毒神經毒素非毒性組分)接合或偶合；及/或將Lys或Cys位點引入蛋白酶敏感性位點附近以便隨後用PEG或其他化學保護性及穩定基團進行化學衍生化。
F.經化學修飾之PAL變異體
巨分子化學修飾可以非特異性方式(產生衍生化物質之混合物)或以位點特異性方式(基於野生型巨分子反應性定向衍生化及/或位點選擇性修飾，使用定點誘變與化學修飾之組合)或使用經表現蛋白質接合法(Hofmann等人，Curr Opin Biotechnol. 13(4):297-303 (2002))執行。在有些實施例中，使用化學修飾降低免疫原性。聚乙二醇化經證明為降低蛋白質免疫原性的方法(Bhadra等人，Pharmazie 57(1):5-29 (2002))，但糖基化及其他化學衍生化程序(使用以下修飾法：磷酸化、醯胺化、羧基化、乙醯化、甲基化、形成酸加成鹽、醯胺、酯及N-醯基衍生物)亦可行(Davis, Science 303:480-482 (2004))。
聚乙二醇化蛋白質
使用一定範圍之PEG化學試劑與PAL蛋白質比率對PAL執行一系列不同的聚乙二醇化反應，可提供用於各種修飾方法的PEG-PAL衍生物。可基於將吸光度檢定與PAGE及天然凝膠分析組合使用測定PEG衍生化之程度所獲得之各衍生化PAL種之殘餘活性來確定最佳的聚乙二醇化程度。 確定初始的最佳修飾範圍之後，可藉由ELISA、免疫沈澱法及西方墨點法進行比較動力學分析(包括Vmax及Km測定、受質之結合常數、蛋白水解穩定性、活性之pH值依賴性、活性之溫度依賴性)並測定最佳PEG-PAL種之免疫反應性。亦可利用蛋白質工程化，使用最佳衍生化條件，藉由將PAL蛋白質之尺寸降至最小且僅修飾PAL表面之大部分抗原性區域來形成供聚乙二醇化之最佳PAL突變體，PEG修飾成本得以降低，同時保持最高量之酶活性及最低量之免疫原性。類似地，可使用位點特異性聚乙二醇化提供酶衍生物。
可使用對Lys、Arg及Cys殘基之其他化學修飾(諸如磷酸化或其他化學修飾)以遮蔽免疫原性區域及/或蛋白水解敏感區域。該等化學修飾包括作為代表性實例的Bednarsaki之聚合物添加法及Altus Corporation之交聯法，其用以改良PAL穩定性、降低免疫原性及改良蛋白酶抗性。Bednarsaki證明聚合物添加法可改良蛋白質之溫度穩定性(Wang等人，J. Am. Chem. Soc. 114(1):378-380 (1992))，且Altus公司已發現戊二醛交聯法可改良酶穩定性。
為查明諸如PAL之蛋白質之活體內治療半衰期是否得益於聚乙二醇化，合成多種不同PEG:PAL結合物，對其加以活體外表徵並針對L-Phe減少進行活體內測試。為使聚乙二醇化之潛在效果最佳且鑑別連接PEG之較佳位點，使用改變聚合物長度、構形及PEG連接度的設計策略。
製備本發明之聚乙二醇化PAL的方法通常包含以下步 驟：(a)在使PAL與一或多個PEG基團連接的條件下，使PAL與聚乙二醇反應；及(b)獲得反應產物。由於PAL修飾之特異性位點可顯著地改變結合物之內在活性，因此對PEG之不同類型及不同量加以探究。用於PAL聚乙二醇化的化學過程為使用甲氧基-PEG之NHS-酯(O-[(N-丁二醯亞胺基氧基羰基)-甲基]-O'-甲基聚乙二醇)將PAL之第一胺醯化。用甲氧基-PEG-NHS或甲氧基-PEG-SPA醯化，產生使初始第一胺中之電荷消除的醯胺鍵。
本發明方法提供聚合物：蛋白質結合物之大體上均質的混合物。如本文中所使用的"大體上均質"意謂僅觀測到聚合物：蛋白質結合物分子。聚合物：蛋白質結合物具有生物活性且本文中所提供之該等"大體上均質"聚乙二醇化PAL製劑為足以呈現均質製劑之優點(例如在臨床應用中易於預測批次間之藥物代謝動力學)的彼等均質物。
預期用於本文中所述之聚乙二醇化方法中的聚合物分子可選自水溶性聚合物或其混合物。水溶性聚合物可選自由以下各者組成之群：例如，聚乙二醇、單甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、HPMA、Fleximer.TM.及聚乙烯醇、單(C1-C10)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、三氟乙烷磺醯基單甲氧基PEG、PEG丙醛、雙丁二醯亞胺基碳酸酯PEG、纖維素或其他基於碳水化合物之聚合物。所選聚合物應具有水溶性，以使得其所連接之蛋白質在諸如生理環境之水相環境下不產生 沈澱。聚合物可為分枝或不分枝聚合物。在有些實施例中，出於終產物製劑之治療用途，聚合物為醫藥學上可接受的。
在有些實施例中，本文中所用的水溶性聚合物為聚乙二醇(縮寫成PEG)。如本文中所使用，聚乙二醇意欲涵蓋已用於將其他蛋白質衍生化的任何形式PEG，諸如單(C1-C10)烷氧基-聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇。
聚乙二醇分子與蛋白質分子之比例可改變，其在反應混合物中之濃度亦可改變。一般而言，最佳比率(依據反應效率：不存在過量的未反應蛋白質或聚合物)將由所選聚乙二醇分子量及所存在之可用反應性基團(通常為ε胺基)之數目確定。至於分子量，一般而言，所用聚合物之分子量愈高，可與蛋白質連接之聚合物分子數愈少。類似地，當最佳化該等參數時，應考慮聚合物之分枝情況。通常，分子量愈高(或分枝鏈愈多)，聚合物：蛋白質比率愈高。本發明涵蓋若干種不同線性PEG聚合物長度，包括但不限於5 kDa及20 kDa，雙臂分枝PEG聚合物之結合物的長度，包括但不限於10 kDa及40 kDa。在有些實施例中，對於本文中所涵蓋的聚乙二醇化反應，平均分子量為約2 kDa至約100 kDa(術語"約"係指＋/-1 kDa)。在其他實施例中，平均分子量為約5 kDa至約40 kDa。通常，水溶性聚合物與PAL比率的範圍對於monoPEG為1:1，對於diPEG為2:1等。
實例6至8描述在12天期間，來源於紅冬孢酵母之離胺酸突變體R91K PAL、藍藻細菌點形念珠藻所產生之 PAL (NpPAL)及藍藻細菌多變魚腥藻所產生之PAL (AvPAL)的聚乙二醇化形式及非聚乙二醇化形式對ENU2或BTBRenu2 小鼠苯丙胺酸含量的影響。該動物模型為苯丙胺酸羥化酶基因(PAH)基因座處之同型突變體，其導致動物患有重度高苯丙胺酸血症。因此，高苯丙胺酸(Phe)血漿含量使得該動物成為評價苯丙胺酸解氨酶(PAL)減少血漿Phe之能力的適當模型。亦以該PKU動物模型評價90天期間離胺酸突變體R91K PAL及NpPAL之聚乙二醇化形式及非聚乙二醇化形式對苯丙胺酸含量的影響。結果表明，分別與未聚乙二醇化NpPAL及AvPAL相比，NpPAL及AvPAL之聚乙二醇化形式使PKU動物模型之苯丙胺酸產生更大幅度的減少。此外，聚乙二醇化NpPAL降低高苯丙胺酸含量的該等效應維持達十週。該等研究表明，來源於藍藻細菌、點形念珠藻及多變魚腥藻之PAL之聚乙二醇化在降低罹患PKU之小鼠之苯丙胺酸含量方面起主要作用。該等發現說明，細菌PAL之聚乙二醇化變異體可在PKU之控制中充當有效的治療劑。
本發明涵蓋免疫原性降低的聚乙二醇化PAL變異體。一實施例為免疫原性降低之點形念珠藻PAL (NpPAL)變異體的聚乙二醇化形式。另一實施例為免疫原性降低之多變魚腥藻PAL (AvPAL)變異體的聚乙二醇化形式。特定實施例涵蓋NpPAL或AvPAL變異體，其中聚乙二醇化係藉由使NpPAL或AvPAL變異體與水溶性聚合物(例如聚乙二醇(PEG))反應來達成。在有些實施例中，聚乙二醇化係藉由 使NpPAL或AvPAL變異體與PEG以至少1:1、至少1:1.5、至少1:2、至少1:3或至少1:4 PAL:PEG之比率反應一次來達成。在一實施例中，PAL變異體為AvPAL變異體，且聚乙二醇化係使用1:3之PAL:PEG比率達成。本發明之聚乙二醇化PAL變異體的製備方法如上所述。
本發明亦涵蓋將聚乙二醇化PAL變異體再聚乙二醇化以便使免疫原性降低。在有些實施例中，聚乙二醇化係藉由使NpPAL或AvPAL變異體與PEG反應兩次或兩次以上來達成，每次聚乙二醇化係以至少1:1、至少1:1.5、至少1:2、至少1:3或至少1:4 PAL:PEG之比率進行。在有些實施例中，聚乙二醇化係藉由使NpPAL或AvPAL變異體與PEG反應兩次、三次、四次、五次或五次以上來達成，每次聚乙二醇化係以至少1:1、至少1:1.5、至少1:2、至少1:3或至少1:4 PAL:PEG之比率進行。在另一實施例中，PAL變異體為AvPAL變異體，且聚乙二醇化係藉由第一次與第二次聚乙二醇化反應均使用1:3之PAL:PEG比率來達成。
本發明之再聚乙二醇化PAL變異體的製備方法通常包含以下步驟：(a)使PAL變異體與聚乙二醇在使PAL變異體與一或多個PEG基團連接的條件下反應；(b)獲得反應產物；(c)使聚乙二醇化PAL變異體與聚乙二醇在使聚乙二醇化PAL變異體與一或多個PEG基團在步驟(a)之PEG未佔據之位置處連接的條件下反應；及(d)獲得反應產物。由於PAL修飾之特異性位點可顯著地改變PAL變異體之內在活性，因此對PEG之不同類型及不同量加以探究。用於PAL聚乙 二醇化的化學過程為使用甲氧基-PEG之NHS-酯(O-[(N-丁二醯亞胺基氧基羰基)-甲基]-O'-甲基聚乙二醇)將PAL之第一胺醯化。用甲氧基-PEG-NHS或甲氧基-PEG-SPA醯化，產生使初始第一胺中之電荷消除的醯胺鍵。
G.選擇及篩檢檢定
製備及篩檢活性PAL或HAL變異體時，初始突變純系表現可利用任何已知的載體表現系統(諸如His標記載體表現系統)，從而便於分離蛋白質變異體之高通量金屬螯合物純化步驟。可使用三級篩檢系統鑑別有利的蛋白質變異體。初始陽性純系鑑別可使用針對苯丙胺酸營養缺陷型大腸桿菌菌株中的生長之轉化及選擇。第二輪篩檢可利用能經受高通量處理的OD290吸光度量測(Hodgins, Biochem. Biophys. Res. Commun., 32:246-253 (1968))。最後，可利用針對蛋白質水解抗性(使用存在蛋白酶混合物的培育)或免疫原性降低(使用競爭性ELISA量測)的篩檢鑑別有利的蛋白質變異體。
H.最佳化PAL蛋白質之治療用途及投藥 1.高苯丙胺酸血症(HPA)之各種形式
本發明係關於用包含將PAL組合物單獨或與其他治療方案組合用於控制HPA及/或PKU之方法治療各種HPA患者群體。特定而言，預期可使用PAL組合物治療苯丙胺酸濃度足夠低而通常不採用膳食介入的彼患者群體(亦即，輕度HPA患者)、中度PKU患者、典型或重度PKU患者及其任何亞群。該等可經受PAL組合物治療以使輕度HPA之影響改 善的患者包括血清濃度小於200 μM的孕婦及嬰兒。不同患者群體及其不同的治療要求在本部分中進一步詳述。
本發明之某些實施例係關於藉由將蛋白質限制性膳食與包含PAL或其生物學活性變異體、突變體或片段之組合物組合投與個體來治療典型重度PKU，其中蛋白質限制性膳食與PAL之組合投與可有效降低該個體之血漿中的苯丙胺酸濃度(與不進行該組合投藥時之該濃度相比)。此外，本發明亦涵蓋如下治療患有HPA的孕婦：將蛋白質限制性膳食與PAL或其生物學活性衍生物組合投與該孕婦，以使得蛋白質限制性膳食與PAL之組合投與有效降低該孕婦之血漿中的苯丙胺酸濃度(與不進行該組合投藥時之該濃度相比)。在特定實施例中，治療意欲針對顯現大於420 μM之Phe含量的患者。
本發明之其他實施例需要向患有HPA的任何個體(其特徵為在投與PAL之前血漿Phe濃度大於180 μM)投與使該患者之該血漿Phe濃度降低之有效量的PAL組合物。本發明之方法適用於用本文中所述之PAL組合物治療患有PKU的嬰兒，該嬰兒的特徵為大於300 μM之高Phe濃度。在本申請案中，"嬰兒"係指年齡在0至約36個月之間的患者。
重度典型PKU之特徵及其治療方法
重度PKU顯現大於1200 μM之血漿Phe濃度且可發現高達4800 μM。患有該病症的患者必須用無Phe膳食治療，以便使其血漿Phe濃度降至臨床上可接受的含量(通常小於600 μM或小於300 μM)。該等患者僅能耐受每日250 mg-350 mg膳食Phe之間的最大量(Spaapen等人，Mol. Genet Metab. 78:93-99 (2003))。因而，該等患者在出生後第7天至第10天之間開始接受Phe限制性配方膳食且在其餘生中承受此膳食限制。該等個體所承受之嚴格膳食限制的任何減緩為有益的。
用於診斷患有典型Phe之個體的測試進一步詳述如下。該等測試已揭示，患有典型重度PKU的患者需要低苯丙胺酸膳食(Lucke等人，Pediatr. Neurol. 28:228-230 (2003))。因此，預期本發明之方法將需要藉由監測個體之血漿Phe濃度來判定該患者是否罹患典型PKU。接著藉由將原核生物PAL組合物單獨投與或以低蛋白膳食與PAL之組合療法投與來治療該患者，以使得該患者之血漿Phe濃度降低至少25%。在有些實施例中，該方法使血漿Phe濃度降低30%。在其他實施例中，該方法使個體之血漿Phe濃度降低40%、50%、60%、70%、80%、90%或90%以上(舉例而言，若患有重度典型PKU的患者具有4800 μM之Phe濃度，則Phe濃度降低90%會產生480 μM之血漿Phe濃度(該濃度足夠低以至於需要很小膳食限制))。當然，應瞭解本發明之治療方法(不論治療重度典型PKU或本文中所述的任何其他HPA)，應努力將患者之血漿Phe濃度儘可能降低至接近約120 μM至約360 μM±15 μM範圍(或約120 μM至約240 μM之最佳範圍)的含量。
在有些實施例中，所治療之典型PKU患者之血漿Phe濃度由大於1000 μM之無限制血漿Phe濃度之任何量降低至小 於600 μM之任何血漿Phe含量。當然，即使PAL與蛋白質限制性膳食之組合治療使血漿Phe濃度產生較小降幅，例如降至800 μM至約1200 μM之間的含量，此亦應視為臨床上有益的治療結果，原因在於血漿Phe濃度在此範圍內的患者可藉由簡單地限制膳食中蛋白質之量來控制該疾病而非食用Phe限制性配方，從而使個體之生活品質明顯改善且使患者對膳食限制的順應性更大。
患者可耐受之膳食Phe含量之量因治療而增大可被視為治療有效的結果。舉例而言，預期由於施以PAL療法，患者能夠使其膳食Phe之攝入量由每日250-350 mg增加至每日350-400 mg(亦即，患者之Phe耐受性表現型由典型PKU患者改變為中度PKU患者之Phe耐受性表現型)。當然，本文中所教示之治療性介入容許患者的膳食Phe攝入量由每日250-350 mg增加至每日400-600 mg(亦即，患者之Phe耐受性表現型由典型PKU患者改變為輕度PKU患者之Phe耐受性表現型)，或在有些情況下，容許患者具有大於每天600 mg Phe之攝入量(亦即，正常的膳食攝入量)將為合乎需要的。
BH4-無反應性PKU患者之特徵及其治療方法
可用本發明之方法治療的第二類患者為經確定具有高血漿Phe濃度(亦即大於200 μM的任何濃度)，但經診斷對BH4療法無反應(如藉由下述BH4負荷測試所測定)的彼等個體。該等患者可包括患有輕度PKU(亦即至多600 μM之血漿Phe濃度)的彼等個體、患有中度PKU(亦即600 μM至約 1200 μM之間的血漿Phe濃度)的個體以及患有典型重度PKU(亦即大於1200 μM之血漿Phe濃度)的患者。
將PAL與量減少之膳食蛋白質組合給與對BH4治療無反應的患者以便使患者之血漿Phe濃度降低。本發明之方法係使得投與PAL可使患者之血漿Phe濃度產生更大降幅(與在不進行PAL療法時所投與之相同膳食方案所產生之降幅相比)。膳食限制可為藉由提供具有減低量之Phe之合成醫藥蛋白質配方來限制Phe攝入量的膳食，或者，膳食限制可為僅需患者限制其總蛋白質攝入量，而容許患者限量食用正常食物的膳食。
對於典型PKU患者所述的治療性結果以引用方式併入本部分中。患有中度PKU之患者(亦即具有600 μM至1200 μM之無限制血漿Phe濃度的患者)的治療性結果包括患者之血漿Phe濃度降低至少25%。在有些實施例中，該方法使血漿Phe濃度降低30%。在其他實施例中，該方法使個體之血漿Phe濃度降低40%、50%、60%、70%、80%、90%或90%以上(舉例而言，若患有中度典型PKU的患者具有1000 μM之Phe濃度，則Phe濃度降低90%會產生100 μM之血漿Phe濃度(該濃度足夠低以至於需要很小膳食限制或不需要膳食性限制))。
在有些實施例中，所治療之中度PKU患者之血漿Phe濃度由600 μM至1200 μM之間的無限制血漿Phe濃度之任何量降低至小於300 μM之任何血漿Phe含量。在一實施例中，PAL(單獨或與膳食限制組合)治療使血漿Phe濃度降低 至例如200 μM至約400 μM之間的含量，此被視為臨床上有益的治療結果，原因在於血漿Phe濃度在此範圍內的患者可藉由簡單地限制膳食中蛋白質之量來控制該疾病，而非食用Phe限制性配方。實際上，諸多研究中教示該等患者甚至可食用正常膳食。
患者可耐受之膳食Phe含量之量因治療而增大被視為治療有效的結果。舉例而言，應瞭解，由於施以PAL療法(單獨或與其他治療性介入組合)，患者能夠使其膳食Phe攝入量由每天350-400 mg增加至每天400-600 mg(亦即患者之Phe耐受性表現型由中度PKU患者改變為輕度PKU患者之Phe耐受性表現型)。當然，本文中所教示之治療性介入容許患者使其膳食Phe之攝入量由每天350-400 mg增加至具有大於每天600 mg Phe之攝入量(亦即正常膳食攝入量)將為合乎需要的。
即使所治療之患者為僅顯現輕度PKU(亦即具有每天400-600 mg Phe攝入量之膳食容許量)的患者，其亦可得益於本發明之基於PAL之療法，原因在於需要產生儘可能接近於360 μM±15 μM的正常化血漿Phe濃度。對於該等患者，有利的治療性結果包括患者之血漿Phe濃度至少25%。在一實施例中，該方法使血漿Phe濃度降低30%。在另一實施例中，該方法使個體之血漿Phe濃度降低40%、50%、60%或60%以上(舉例而言，若患有輕度PKU的患者具有600 μM之Phe濃度，則Phe濃度降低60%會產生360 μM之血漿Phe濃度(亦即可接受的標準血漿Phe濃度))。
在有些實施例中，所治療之輕度PKU患者之血漿Phe濃度由400 μM至600 μM之間的無限制血漿Phe濃度之任何量降低至小於100 μM之任何血漿Phe含量。當然，即使PAL(單獨或與膳食限制組合)治療使血漿Phe濃度產生較小降幅(例如降低至200 μM至約400 μM之間的含量)，此亦被視為臨床上有益的治療結果。
患者可耐受之膳食Phe含量之量因治療而增大可被視為治療有效的結果。舉例而言，應瞭解，由於施以PAL療法(單獨或與其他治療性介入組合)，患者能夠使其每天400-600 mg膳食Phe之攝入量增加(亦即，患者之Phe耐受性表現型由輕度PKU患者改變為輕度HPA患者之Phe耐受性表現型)，以容許患者具有大於每天600 mg Phe之攝入量(亦即正常膳食攝入量)。
此外，即使患者為僅顯現非PKU HPA症狀(亦即，具有高達600 μM之高血漿Phe濃度)，但容許食用正常蛋白質膳食的患者，其亦可得益於本發明之PAL療法，原因在於已證明，高Phe濃度對該等個體之IQ產生明顯的影響。此外，如下文所述，對具有特殊需要之個體(例如孕婦及嬰兒)的PAL治療性介入尤其重要，即使彼患者的血漿Phe含量在小於200 μM之可覺察"安全"含量之範圍內。
母體PKU及其治療方法
由於胎兒在子宮內曝露於即使為中度之高Phe含量後果亦相當嚴重(不論胎兒之PAH狀態)，因此對計劃懷孕及已懷孕之PKU婦女之血漿Phe含量的代謝控制極為重要。治 療性控制血漿Phe濃度在懷孕最初三個月中尤其重要，因為不能達成足夠的控制將導致病症，包括小頭畸形、智力缺陷及先天性心臟病。
舉例而言，關於苯酮尿症的NIH共同聲明報告(NIH Consensus Statement)(第17卷第3期，2000年10月)報導，胎兒曝露於3-10 mg/dL之母體Phe含量會導致24%之小頭畸形發病率，而曝露於大於20 mg/dL(亦即大於1200 μM)之母體Phe含量則具有73%之小頭畸形發病率。同樣，在曝露於大於20 mg/dL之母體Phe含量之兒童中有超過10%發現先天性心臟病。重要的是，已注意到大於6 mg/dL之Phe含量顯著降低兒童之IQ。因此，必需確保患有所有形式之苯酮尿症之婦女(即使顯現最輕度HPA的彼等婦女)的血漿Phe濃度必須得到嚴密控制，以避免母體PKU症候群之風險。然而，美國臨床醫學中所使用之PKU婦女之血漿Phe濃度的可接受目標含量在10 mg/dL與15 mg/dL之間，此含量比推薦用於孕婦之2-6 mg/dL含量或在英國及德國臨床醫學中用於減小患母體PKU症候群之風險之1-4 mg/dL高的多。
對於孕婦之另一種重要考慮因素為其總蛋白質攝入量。在懷孕期間，婦女食用足夠的蛋白質係重要的，因為已提出在懷孕期間，低蛋白膳食將會導致腎發育延遲及隨後之腎元數目減少，且潛在地引起成人期高血壓。(D'Agostino, N. Engl. J. Med. 348(17)1723-1724, (2003))。下表提供針對不同個體之推薦膳食總蛋白質攝入量之示範性準則。
如由以上示範性準則可知，在美國，育齡(例如小於51歲)婦女之推薦蛋白質攝入量為每天約44至50 g，而孕婦需求推薦為每天約60 g之攝入量。在加拿大及英國，孕婦之推薦蛋白質攝入量為約70公克/天及52公克/天。因此，確保孕婦之血漿Phe濃度含量得到嚴密控制的需要因以下事實而進一步複雜化：此類PKU患者比相仿年齡之非懷孕PKU女性需要更多的蛋白質。
鑒於以上所述，預期本發明之PAL療法尤其適用於孕婦。預期可將罹患任何形式之HPA之孕婦或計劃懷孕之婦女置於PAL治療過程，以確保其血漿Phe濃度水準維持在儘 可能接近於180 μM至約360 μM。該治療過程會使婦女的正常蛋白質攝入量水準增加。
上文論述的血漿Pbe濃度之水準及該等Phe濃度應降低之幅度併入該針對孕婦之部分中。
控制嬰兒之PKU及其治療方法
如本文中通篇所述，已確定嬰兒(0歲至3歲)之血漿Phe濃度之升高導致童年IQ之顯著降低。然而，如本說明書中別處所論述，具有約高達400 μM之高血漿Phe濃度的患者通常不接受任何膳食介入。因此，0歲至3歲之嬰兒遭受本發明療法之顯著有害效應。本申請案涵蓋用包含PAL的治療性組合物治療具有大於360 μM±15 μM之無限制血漿Phe濃度的任何嬰兒，以便使彼個體之血漿Phe濃度產生有益的降幅。
在有些實施例中，嬰兒年齡在0歲與3歲之間，且在PAL投與之前具有約1200 μM之無限制血漿Phe濃度，且該投藥使血漿Phe濃度降低。在一實施例中，投藥後，血漿Phe濃度由大於1800 μM降低至約1500 μM、約1200 μM、約1100 μM、約1000 μM、約900 μM、約800 μM、約700 μM、約600 μM、約550 μM、約500 μM、約450 μM、約400 μM、約350 μM、約300 μM、約275 μM、約250 μM。在其他實施例中，嬰兒年齡在0歲與3歲之間且具有大於1200 μM之無限制血漿Phe濃度，在單獨或與膳食組合投與PAL後，此血漿Phe濃度降低至約800 μM、約500 μM或約360 μM。熟習此項技術者將瞭解，本發明涵蓋用PAL治療具有大於360 μM之無限制血漿Phe濃度的嬰兒，以使該等血漿Phe濃度降低。以上對血漿Phe濃度治療性降低的論述以引用方式併入本文中。此外，初始無限制血漿Phe濃度之任何超過10%之降幅應視為針對嬰兒之治療性療法之治療性結果。應瞭解PAL療法可與膳食限制組合，以使該等嬰兒之血漿Phe濃度產生治療性降低。
表2列舉投與治療有效量之PAL將有益的多種病狀。非經腸、經口或其他標準投藥途徑及劑量可使用標準方法確定。
2.用於治療的組合物
本發明涵蓋PKU/HPA之治療性介入。該等介入最初係基於使用PAL，PAL可單獨使用或與膳食限制組合使用。此外，PAL及/或膳食限制可進一步與其他治療性組合物組合，該等治療性組合物可設計成(例如)抗擊PKU之其他表現形式(例如大的中性胺基酸)以阻止Phe在腦中累積(參見Koch等人，Mol. Genet. Metabol. 79:110-113 (2003))或酪胺酸補充。該部分提供可用於本文中所涵蓋之療法中之組合物的論述。
PAL組合物
一般而言，本發明涵蓋醫藥組合物，其包含有效量之本發明之蛋白質或衍生產物以及醫藥學上可接受之稀釋劑、穩定劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑及/或載劑。該等組合物包括具有不同緩衝性內含物(例如Tris-HCl、磷酸鹽)、pH值及離子強度的稀釋劑；添加劑，諸如清潔劑及增溶劑(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)、防腐劑(例如Thimerosol、苄醇)及增積物質(例如乳糖、甘露糖醇)；參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences第18版(1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa)第1435:1712頁，其以引用方式併入本文中。活性成分之有效量為可由熟習此項技術者藉由考慮諸如體重、年齡及治療目標之因素容易確定的治療有效量、預防有效量或診斷有效量。
本發明之PEG:PAL組合物亦可包括使溶液pH值維持在所要範圍內的緩衝劑。示範性試劑包括乙酸鈉、磷酸鈉及檸檬酸鈉。亦可使用該等緩衝劑之混合物。適用於組合物中的緩衝劑之量主要視所用特定緩衝劑及溶液之pH值而定。舉例而言，乙酸鹽為在pH 5下比在pH 6下有效的緩衝劑，因此，在pH 5下可使用比在pH 6下少的乙酸鹽。在一實施例中，本發明之組合物之pH值範圍為pH 3.0-7.5。
本發明之組合物可進一步包括使溶液等張且更適於注射的等張性調整劑。實例為0-150 mM濃度範圍內的氯化鈉。
如本文中所使用，且當涵蓋PEG:PAL結合物時，術語"治療有效量"係指使血清L-苯丙胺酸降低，從而使患者受益 的量。該量將因個體而異且視多種因素(包括患者之整體身體狀況)而定。用於治療之PAL量產生可接受之血清L-苯丙胺酸降低率且使該值維持在有益水準(一般至少約30%且通常在10%至50%範圍內)。本發明組合物之治療有效量可由熟習此項技術者使用可公開獲得之物質及程序容易地確定。
本發明提供頻率低於天然PAL的PEG:PAL結合物投藥。給藥頻率視所治療之病狀而變，但通常為約每週一次。應瞭解，由於不同個體對PEG:PAL結合物的反應不同，因此實際所用的給藥頻率可能略微不同於本文中所揭示之給藥頻率；術語"約"旨在反映該等不同。
本發明因此可用於降低血清L-苯丙胺酸含量。最通常地，血清L-苯丙胺酸含量因高苯丙胺酸血症而增加。本發明可治療的病狀包括伴隨苯酮尿症的高苯丙胺酸血症。亦可治療可引起血清L-酪胺酸含量增加(諸如見於酪胺酸血症中)的病狀。此外，多種癌症相關病狀(其中血清L-苯丙胺酸及/或血清L-酪胺酸含量降低為有益的)亦可用本發明之PEG:PAL結合物治療。
在一實施例中，根據本發明所製備的PEG:PAL結合物係藉由腹膜內、皮下或肌肉內注射投與。然而，熟習此項技術者應瞭解，亦可有效地利用其他傳遞途徑來使用本發明之組合物。
本文中所述的方法使用醫藥組合物，該等醫藥組合物包含上述分子以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或媒劑 以及視需要之其他治療性及/或預防性成分。該等賦形劑包括液體，諸如水、生理食鹽水、甘油、聚乙二醇、玻糖醛酸、乙醇、環糊精、改質環糊精(亦即磺丁基醚環糊精)等。適用於非液體調配物的賦形劑亦為熟習此項技術者所知。
醫藥學上可接受之鹽可用於本發明之組合物中且包括例如，無機酸鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽及其類似物；及有機酸鹽，諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽及其類似物。醫藥學上可接受之賦形劑及鹽之全面論述可見於Remington's Pharmaceutical Sciences 第18版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)中。
此外，該等媒劑中可存在輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、生物學緩衝物質、界面活性劑及其類似物。生物學緩衝劑實際上可為藥理學上可接受且為調配物提供所要pH值(亦即，生理學可接受之範圍內的pH值)的任何溶液。緩衝溶液之實例包括生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、Tris緩衝生理食鹽水、Hank氏緩衝生理食鹽水及其類似物。
視預定投藥方式而定，醫藥組合物可呈以下形式：固體、半固體或液體劑型，諸如錠劑、栓劑、藥丸、膠囊、散劑、液體、懸浮液、乳膏、軟膏、洗液或其類似劑型，且在有些實施例中，為適於單次投與準確劑量的單位劑型。組合物包括有效量之所選藥物與醫藥學上可接受之載 劑之組合，且此外可包括其他藥劑、佐劑、稀釋劑、緩衝劑等。
一般而言，本發明之化合物或結合物可以醫藥調配物(包括適於經口(包括經頰及舌下)、直腸、鼻、局部、肺、陰道或非經腸(包括肌肉內、動脈內、鞘內、皮下及靜脈內)投藥的彼等調配物)之形式或以適於藉由吸入或吹入投藥之形式投與。一示範性投藥方式為使用便利的每日給藥方案靜脈內投藥，該每日給藥方案可根據患病程度加以調整。
對於固體組合物，習知非毒性固體載體包括(例如)醫藥級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂及其類似物。醫藥學上可投與之液體組合物可如下製備：例如將如本文中所述之活性化合物或結合物及可選醫藥佐劑溶解、分散(等)於賦形劑(諸如水、生理食鹽水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇及其類似物)中，從而形成溶液或懸浮液。需要時，待投與之醫藥組合物亦可含有少量非毒性輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、pH值緩衝劑、張力劑及其類似物，例如乙酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺乙酸鈉、油酸三乙醇胺酯等。該等劑型之實際製備方法已為熟習此項技術者所知或顯而易見，例如參見以上所提及之Remington's Pharmaceutical Sciences。
對於經口投藥，組合物通常採用錠劑、膠囊或軟明膠膠囊之形式，或可為水溶液或非水溶液、懸浮液或糖漿。錠 劑及膠囊為經口投藥形式中之一些。經口使用的錠劑及膠囊通常包括一或多種常用載劑，諸如乳糖及玉米澱粉。通常亦添加諸如硬脂酸鎂的潤滑劑。使用液體懸浮液時，可將活性劑與乳化劑及懸浮劑組合。需要時，亦可添加調味劑、著色劑及/或甜味劑。用於併入本文中之經口調配物中的其他可選組分包括但不限於防腐劑、懸浮劑、增稠劑及其類似物。
非經腸調配物可製備成習知形式，諸如液體溶液或懸浮液、適於在注射之前溶解或懸浮於液體中之固體形式，或乳液。在一實施例中，無菌注射懸浮液係根據此項技術中已知之技藝，使用適當載劑、分散劑或濕潤劑及懸浮劑加以調配。無菌注射調配物亦可為於非經腸可接受之非毒性稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或懸浮液。可使用的可接受之媒劑及溶劑為水、林格氏溶液(Ringer's solution)及等張氯化鈉溶液。此外，無菌的不揮發性油、脂肪酸酯或多元醇為習用的溶劑或懸浮介質。此外，非經腸投藥可包括使用緩釋系統或持續釋放系統，以便維持恆定的劑量水準。
上述經鑑別的PEG:PAL結合物可以治療有效劑量投與患者以治療或改善心血管疾病。該等結合物之毒性及治療功效可藉由標準醫藥程序，用細胞培養物或實驗動物測定，諸如藉由測定LD50 (使群體之50%死亡的劑量)及ED50 (對群體之50%治療有效的劑量)。毒性效應與治療性效應之間的劑量比為治療指數且其可表示為比率LD50 /ED50 。呈現大 治療指數的結合物用於一些實施例中。
獲自細胞培養檢定及動物研究的資料可用於調配供人類使用之劑量範圍。在有些實施例中，劑量處於循環濃度之範圍(包括具有很小毒性或最小毒性的ED50 )內。視所用劑型及所用投藥途徑而定，劑量可在此範圍內改變。治療有效劑量可由細胞培養檢定且可由動物模型確定。
膳食蛋白質
除將PAL及相關類似物投與HPA/PKU患者之外，預期亦可限制或修改患者之膳食蛋白質。熟習此項技術者已知用於治療PKU的各種市售蛋白質配方。該等配方包括MAXIMAID、PHENEX 1、PHENEX 2 (Ross Laboratories, Liverpool, UK)、LOFENALAC、PHENYL-FREE (Mead-Johnson)及其類似物。
熟習此項技術者可使用參考蛋白質配方，其一般不含Phe濃縮物。蛋白質配方通常補充有PKU患者缺乏的胺基酸。該等胺基酸包括(例如)L-酪胺酸及L-麩胺醯胺。已提出可能需要用纈胺酸、異白胺酸及白胺酸補充PKU患者之膳食(參見美國專利第4,252,822號)。在某些臨床表現中，PKU之毒性效應係起因於Phe阻斷腦攝取其他胺基酸，諸如酪胺酸及色胺酸。已發現，使PKU患者之膳食補充過量的該等大中性胺基酸可阻斷Phe攝入腦中且降低腦Phe含量。因此，預期對於本發明之方法，膳食療法可進一步用包含一個或多種該等胺基酸的組合物補充(Koch等人，Mol. Genet. Metabol. 79:110-113 (2003))。
此外，正如所知，除限制蛋白質之外，亦應提供通常存在於人乳及其他動物來源食物中的L-肉鹼及牛磺酸。在某些實施例中，L-肉鹼可以每100 g蛋白質補充物20 mg提供，且牛磺酸可以每100 g蛋白質補充物40 mg提供，以便有助於提供適量之通常存在於人乳及動物來源食物中之該等因子。
此外，熟習此項技術者可參考2000美國國家科學院國家研究委員會(2000 National Academy of Sciences-National Research Council)關於其他組分之另外清單的膳食參考攝入量，該等其他組分諸如應提供給患者以確保縱使在膳食蛋白質限制下仍提供其他補充物的必需維生素及礦物質。
熟習此項技術者參考以上有關總蛋白質量及所要血漿Phe濃度的論述將能夠確定所需要之膳食蛋白質限制之量且因此相應地調整患者之膳食。舉例而言，約11-14歲之男性個體應接受每天45 g蛋白質。在個體患有重度典型PKU的情況下，其無限制血漿Phe濃度可能大於1200 μM，且彼個體之大部分(若非所有)膳食蛋白質源很可能來自粉狀蛋白質補充物，此可將其血漿Phe濃度降低至小於600 μM。藉由將PAL投與彼個體，治療性結果為使患者之血漿Phe濃度產生更大降幅，或者治療性結果為使個體血漿Phe濃度降低至類似程度，但彼個體能夠耐受源自正常膳食而非來自膳食配方之蛋白質。
類似地，對於患有中度PKU之約11-14歲男性，可使用本發明之方法經由正常蛋白質攝入而非限制性配方使其得 到所分配之每天45公克蛋白質。判定本發明之方法是否有效將需要定期測定患者之血漿Phe濃度以確保血漿Phe濃度保持低於至少400 μM。用於測定該等濃度的測試描述如下。在有些實施例中，達成小於或約360 μM之濃度。
3.鑑別並監測患者群體
如本文中通篇所述，本發明之多個實施例中將必需判定指定患者是否對PAL療法有反應及測定患者之苯丙胺酸濃度，該等操作在初期進行以鑑別所治療之PKU患者類別及在治療性療法進行期間進行以監測該方案之功效。示範性該等方法描述於下文中。
BH4負荷測試
BH4負荷測試容許在因BH4不足或因PAH不足而患有HPA的患者之間加以區別。
最簡單的BH4負荷測試為投與外源性BH4並測定投藥對降低血漿Phe濃度的影響。2 mg/kg BH4之靜脈內負荷最初由Danks等人(Lancet 1:1236 (1976))提出，由於更大純度之BH4已可獲得，因此使用以約每公斤體重2.5 mg之量經口投與BH4來執行該測試成為可能。後來Niederwieser等人提出了標準化方法，其中投與7.5 mg/kg單次口服劑量之BH4(Niederwieser等人，Eur. J. Pediatr. 138:441 (1982))，儘管有些實驗室仍使用每公斤體重20 mg以上的BH4。
為使簡單的BH4負荷測試產生可靠的結果，患者之血液Phe含量需要高於400 μM。因此，慣用的做法通常為使患者脫離PKU膳食2天後再執行負荷測試。BH4測試套組可獲 得且由Dr. Schircks實驗室(Jona, Switzerland)配售。該套組推薦在正常膳食攝入之後約30分鐘20毫克BH4/公斤體重之劑量。
測定Phe濃度
測定血液中是否存在Phe的方法有多種(Shaw等人，Analytical Methods in Phenylketonuria-Clinical Biochemistry，Bickett等人編，Phenylketonuria and Some Other Inborn Errors of Amino Acid Metabolism, Stuttgart, Georg Thiem Verlag, 47-56 (1971))。通常，使用螢光檢定測定患者血清中的苯丙胺酸及酪胺酸濃度。該檢定依賴於當在白胺醯基丙胺酸存在下將苯丙胺酸與茚滿三酮(ninhydrin)一起加熱時螢光物質之形成(McCaman等人，J. Lab. Clin. Med. 59:885-890 (1962))。
測定Phe濃度的最通用方法為Guthrie測試，其中由已浸透患者血樣之濾紙紮出圓片。將相同圓片在已經枯草桿菌(Bacillus subtilis)接種且含有枯草桿菌生長之特異性抑制劑的瓊脂盤中培育。與使用含有已知量之Phe之圓片所執行的類似檢定相比，當苯丙胺酸自相同圓片轉移至瓊脂上時，Phe逆轉對細菌生長之抑制，從而產生可與苯丙胺酸濃度關聯的細菌生長面積。
量化Phe濃度的其他方法包括HPLC、質譜法、薄層層析法及其類似方法。該等方法可用於測定患者在治療前之血漿Phe濃度及監測治療性療法期間之Phe濃度以判定其功效。
預期在治療性療法之整個時程中，以適當的間隔時間(例如每日、隔日或每週)監測患者之血漿Phe含量。藉由如此定期地監測血漿Phe含量，臨床醫師將能夠評定治療功效並對PAL及/或膳食蛋白質需求作出相應調整。
4.組合療法
本發明之某些方法包括將PAL與膳食蛋白質限制組合使用以使患有不同形式之HPA的患者產生治療性結果。為使本文中所涵蓋之組合療法達成適當的治療性結果，一般將PAL組合物與膳食性限制以有效產生所要治療性結果(亦即，血漿Phe濃度降低及/或能夠耐受更大量之Phe/蛋白質攝入量而不使血漿Phe濃度產生伴隨性增大)的組合量投與個體。該方法可包括將PAL組合物與膳食蛋白質治療性組合物同時投與。此舉可藉由投與單一組合物或藥理學蛋白質調配物(包括所有膳食蛋白質需求且亦將PAL包括在該蛋白質調配物內)來達成。或者，膳食蛋白質(補充物或正常蛋白質膳食)大致與PAL之藥理學調配物(錠劑、注射液或飲料)同時投與。PAL亦可調配成蛋白棒或適於攝入的其他食物，諸如堅果巧克力餅、薄烤餅、蛋糕。
在其他替代方案中，PAL治療可先於或後於膳食蛋白質療法，間隔時間在數分鐘至數小時範圍內。在蛋白質與PAL組合物單獨投與的實施例中，一般應確保每次傳遞之時間間隔不超過有效時段，以便PAL仍能夠對患者產生有利影響。在該等情況下，預期將PAL在膳食蛋白質攝入(之前或之後)約2-6小時內投與，在有些實施例中延遲時間僅 為約1小時。在某些實施例中，預期PAL療法為連續療法，其中在長時期內將PAL日劑量投與患者。在其他情況下，例如在僅患有較輕度形式之PKU及HPA的孕婦之情況下，只要婦女處於懷孕期及/或哺乳期，便可僅延續PAL療法。
此外，除僅基於傳遞PAL與膳食蛋白質調控之療法之外，本發明之方法亦涵蓋與特異性靶向HPA之一或多種症狀之第三組合物的組合療法。舉例而言，已知HPA引起的酪胺酸不足導致神經傳遞素多巴胺及血清素之不足。因此，在本發明之背景中，預期基於PAL與膳食蛋白質的方法可進一步與左旋多巴(L-dopa)、卡比多巴(carbidopa)及5-羥色胺酸神經傳遞素之投與組合，以糾正由膳食中酪胺酸之量降低所引起的缺陷。
由於投與PAL不會形成酪胺酸(不同於投與PAH)，因此該治療仍使得酪胺酸為該等患者之必需胺基酸)。因此，接受PAL與BH4療法之組合的患者可能需要酪胺酸膳食補充物。
I.PAL同源物之篩檢及表徵
本發明之另一態樣為如下鑑別可預防、改善或降低高苯丙胺酸含量之細菌PAL的篩檢檢定：使含有高含量苯丙胺酸的細胞與細菌PAL接觸且判定細菌PAL是否使該高苯丙胺酸含量降低。在某些實施例中，該方法為高通量檢定。在一實施例中，使用生物資訊學方法對菌種之完整基因組測序並針對PAL同源物之存在進行篩檢。在另一實施例中，鑑別與encP同源的基因並對相關蛋白序列執行BLAST 分析以測定一致性百分比。針對為PAL活性所必需的保守殘基之存在評定該等蛋白質之一級序列比對。所有HAL酶之位置83(惡臭假單胞菌HAL)為組胺酸，而在具有PAL活性的酶中該位置為脂族胺基酸，例如白胺酸或纈胺酸。對位置83之分析可闡明注為HAL之酶是否可能誤標及是否實際上顯示PAL活性。舉例而言，位置413在大部分HAL酶中為麩醯胺酸(Q)且在所有HAL酶中，位置413之後為位置414之麩胺酸(E)。比較而言，在迄今為止所鑑別的大部分PAL酶中，位置414為麩醯胺酸(Q)，其後為位置415之天冬胺酸(D)或天冬醯胺酸(N)。藉由此生物資訊學方法測定很可能誤標為原核生物PAL酶的代表性註解HAL酶包括來源於以下細菌之HAL酶：類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1 (ZP 00005404)、嗜木糖紅色桿菌(Rubrobacter xylanophilus)DSM9941 (ZP 00188602)、發光桿菌亞種Laumondii (Photorhhabdus luminescens subsp. Laumondii)TT01 (NP 930421)、騰沖嗜熱桿菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)(AA051415)。
在另一個實施例中，該等同系物之蛋白質產物之PAL催化活性得以證實。在另一個實施例中，PAL同系物之基因組經PCR擴增且選殖至pHIS8或類似載體中。將假定之PAL蛋白質以His標記之蛋白質形式異源性表現於大腸桿菌中，純化且檢定PAL活性。PAL活性檢定可包括，但不限於：能夠在活體外將苯丙胺酸轉化為肉桂酸酯；不能在活體外將酪胺酸轉化為對-香豆酸酯；測試HAL活性之檢定，及表徵該酶動力學之檢定。
J.製備原核生物PAL
本發明之另一態樣為原核生物PAL之製備方法。在一個實施例中，用一種誘導性啟動子(諸如IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷))將重組PAL以N端經八組胺醯基標記之融合蛋白質形式過度表現於載體(例如大腸桿菌BL21(DE3)/pLysS (Invitrogen))中。在另一個實施例中，將重組PAL以無N端標記過度表現於大腸桿菌BL21(DE3)/pLysS細胞中。將甘油儲備物之種菌培養物(用於生物反應器/醱酵器)在搖瓶中生長。接著使用該等種菌培養物以分批饋入方式加入一個可控生物反應器中。補充葡萄糖，且用鹼(NH4 OH)控制pH，且使攪動速率達1200 rpm。O2 饋入保持溶氧大於20%。細胞在30℃之溫度生長至達到70-100之OD600 (約22-25小時)，且接著用0.4 mM IPTG誘導。將溫度降低至22至26℃，且使其生長至活性變化小於0.1 IU/mL(約40-48小時且OD600 通常為200)。細胞培養基一般限定且包含酵母萃取蛋白質、蛋白腖-胰蛋白腖、葡萄糖、甘油、酪蛋白胺基酸、痕量鹽及磷酸鹽緩衝鹽。重組PAL產物在細胞內產生且不分泌。藉由連續離心(Alfa-Laval、Carr、Ceba，或相等物)收穫細菌。
K.純化原核生物PAL
本發明之另一態樣之特徵為一種純化細菌PAL或其生物學活性片段、突變體或類似物的方法。根據第一實施例，使經轉化之細胞團生長且破裂，得到粗重組酶。通常自粗塊體中分離出外源物質以防止管柱結垢。層析純化係使用 一或多種層析樹脂執行。隨後，將經純化之蛋白質調配至設計成可長期提供穩定活性的緩衝液中。在另一實施例中，純化細菌PAL的方法包含以下步驟：(a)使用壓力均化器(但可藉由其他物理方法，諸如玻璃珠溶解法)將含有重組PAL的細菌溶解；(b)熱處理；(c)使用第二連續離心步驟及/或深度過濾(如用Cuono Zeta Plus或Maximizer, Pall Filtron，或Millipore Millistak或Opticao過濾器)使該溶菌物澄清；(d)通過炭過濾步驟(如用Millipore Millistak 40AC)；(e)通過最後過濾步驟(如用Sartorious Sartopore 0.2 μm過濾器)；(f)通過丁基疏水性相互作用層析(如Tosoh Biosciences之Toyopearl Butyl 650M)；(g)通過Q離子交換管柱(如BioRad之Macroprep High Q)；及(h)藉由緩衝交換，經切向流過濾(如用Sartorious Hydrosart或PES 100 kDa膜)回收最終產物。熟習此項技術者易瞭解，可省略或取代一或多個層析步驟，或層析步驟之順序可在本發明之範圍內變化。最後，可視需要執行適當的滅菌步驟。
現已對本發明進行一般性描述，經由對以下實例的以下參考可更易瞭解本發明。該等實例僅為說明性目的而提供，且不希望其以任何方式限制本發明之範圍。已努力確保有關所用數字(例如量、溫度等)的準確度，但理應容許存在某些實驗誤差及偏差。
實例1 選殖點形念珠藻及多變魚腥藻PAL DNA操縱
點形念珠藻基因組DNA係購自ATCC(29133D)且PAL基因(ZP_00105927)係由引子5'-CACTGTCATATGAATATAACAT CTCTACAACAGAACAT-3' (SEQ ID NO:12)及5'-GACAGTG GCGGCCGCTCACGTTGACTTTAAGCTCGAAAAAATATG-3' (SEQ ID NO:13)PCR擴增。所得PCR產物用NdeI及NotI消化且將1.7 kb片段分別接入pET-28a(+)及pET-30a(+)(Novagen)中以便達成N-His標記及不標記。
多變魚腥藻細胞係購自ATCC (29413)。萃取(Qiagen)基因組DNA且藉由SOE-PCR移除NheI位點來擴增PAL基因(YP_324488)。使用引子1 (5'-CACTGTGCTAGCATGAAGA CACTATCTCAAGCACAAAG-3')(SEQ ID NO:14)及引子2 (5'-GGAAATTTCCTCCATGATAGCTGGCTTGGTTATCAACATCAATTAGTGG-3')(SEQ ID NO:15)擴增核苷酸1-1190且使用引子3 (5'-CCACTAATTGATGTTGATAACCAAGCCAG CTATCATGGAGGAAATTTCC-3')(SEQ ID NO:16)及引子4 (5'-CACTGTGCGGCCGCTTAATGCAAGCAGGGTAAGATAT CTTG-3')(SEQ ID NO:17)擴增核苷酸1142-1771。將該兩種PCR產物組合，以用引子1及4擴增全長基因。將所得PCR產物用NheI消化，用Klenow (NEB)鈍化，接著用NotI消化。將1.7 kb片段接入pET-28a(+)及pET-30a(+)(Novagen)中。
菌株及培養條件
將大腸桿菌BL21(DE3)細胞(Stratagene)用pGro7 (TaKaRa)轉化且藉由Inoue方法(Sambrook及Russell,Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，第3版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001))製備勝任BL21(DE3)pGro7細胞。將該等細胞用pET-28-NpPAL轉化且在37℃下，在含有50 mg/L卡那黴素(kanamycin)及20 mg/L氯黴素(chloramphenicol)的25 ml LB中培養隔夜。將20毫升之該培養物接種於含有卡那黴素、氯黴素及500 mg/L L-阿拉伯糖(L-arabinose)的1 L LB培養基中且在37℃下生長。OD600 為0.6時，將培養物於冰上冷卻。5分鐘之後，將培養物用0.3 mM IPTG誘導且在20℃下生長16小時。藉由離心收穫細胞。
將BL21(DE3)pLysS細胞(Stratagene)用AvPAL轉化且以與NpPAL相同之方式培養，但無阿拉伯糖誘導。
實例2 純化NpPAL及AvPAL
將培養物於台上型離心機中，以5,000 g離心20分鐘且棄去上清液。在進一步處理之前，通常將細胞離心塊在-70℃下冷凍。解凍後，將細胞離心塊於TBS (25 mM Tris、150 mM NaCl，pH 7.8)中懸浮至約80個光密度單位(600 nm)。藉由兩次通過APV壓力均化器，12-14,000 psi下溶解該等細胞。接著將粗溶胞物在55℃下熱處理2小時。將溶胞物以10,000g離心30分鐘且上清液保留且用0.2 μm真空過濾器(Corning)過濾。
藉由依序通過丁基650 M管柱(Tosoh BioSciences)及MacroPrep High Q管柱(BioRad)來自澄清之溶胞物中純化 PAL。根據SDS PAGE及逆相HPLC，溶離產物展示高純度。
實例3 形成聚乙二醇化PAL變異體 蛋白質聚乙二醇化
聚乙二醇化使用文獻方法(Hershfield等人，(1991)，同上；美國專利第6,057,292號；Lu等人，Biochemistry 40(44):13288-13301 (2001);Nektar Therapeutics，2003年目錄)之改良方法。活化PEG包括線性PEG丁二醯亞胺基丁二酸酯(mPEG-SPA，MW 5 kDa或MW 20 kDa)與分枝PEG羥基丁二醯亞胺(mPEG2 -NHS酯，MW 10 kDa或MW 40 kDa)，其皆在一端以甲氧基封端且可獲自Nektar Therapeutics；通常需要對最佳聚乙二醇化蛋白質進行實驗測定(Veronese, F.M.等人，J. Bioactive Compatible Polymers 12:196-207 (1997))。最佳聚乙二醇化條件係使用PAL:PEG之不同比率(考慮蛋白質之莫耳比以及每個蛋白質單體之離胺酸數目)、不同pH值、不同緩衝劑、不同溫度及培育時間確定。由於天然PAL具有大量離胺酸(每個紅冬孢酵母(Rt)及多變魚腥藻(Av)單體分別具有29個及18個離胺酸)且由於未經修飾之PAL在反覆注射於小鼠中後呈現免疫反應性且由於裸(野生型)PAL在曝露於蛋白酶後很快失活，因此需要高PAL蛋白質：PEG衍生化比率。藉由在-20℃下冷凍來中止聚乙二醇化反應，且藉由SDS-PAGE、MALDI-TOF質譜法、活性評定、蛋白水解敏感性及免疫 反應性來分析樣本。
在活性、蛋白水解及免疫評定之前，且為移除過量的未反應PEG，在4℃下，在攪拌下，使用Tube-O透析器(GenoTechnology)將反應物相對於pH 8.5、0.05 M之磷酸鉀緩衝液透析。使用NI蛋白質檢定套組(Geno Technology)測定蛋白質濃度之後，如上所述使用標準反應條件對未衍生化之PAL樣本及經PEG衍生化之PAL樣本進行PAL活性量測。活體外表徵之後，使用PKU小鼠模型，用最有希望的聚乙二醇化治療性候選物進行活體內試驗。
表徵
對於未經修飾之蛋白質樣本及對於聚乙二醇化蛋白質樣本，使用PAL消光係數(對於RtPAL及AvPAL分別為0.5及0.83 mg mL-1 cm-1 )，在280 nm下測定蛋白質濃度，該濃度係使用NT蛋白質檢定(GenoTechnology)計算，NT蛋白質檢定包括樣本處理以移除可能干擾蛋白質濃度測定準確度的非蛋白質污染物。
PEG-PAL產物係用MALDI-TOF MS表徵以測定與每個PAL單體連接之PEG分子的數目，且可使用活性評定及SDS-PAGE及天然凝膠分析法表徵以分別確保活性保留、衍生化完整及四聚體PAL形成不減少。對於PAL及PEG-PAL樣本，MALDI-TOF質譜分析需要使用0.5 M尿素或0.025 M胍鹽酸鹽以改良亞單元解離及物質偵測之可再現性。
PAL活性檢定
使用Cary UV分光光度儀(Cary 50)，以動力學方式執行PAL活性檢定。PAL對於L-苯丙胺酸受質之活性係在室溫(25℃)下，藉由量測290 nm下之吸光度增加所監測之反式肉桂酸酯之產生來檢定(Hodgins, (1968)，同上)。反式肉桂酸在290 nm下之莫耳消光係數為10.2381 L M-1 cm-1 。反應混合物在100 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.5)中含有22.5 mM苯丙胺酸。對於標準量測，最後酶濃度為0.0035 mg/mL，但對於動力學研究，對檢定中的酶濃度加以調整以使得290 nm下每分鐘之斜率在0.005至0.02範圍內。活性數據表示為比活性(μmol×min-1 mg-1 )。一個單位之PAL定義為在室溫下每分鐘產生1 μmol反式肉桂酸之酶的量。
實例4 測試活體外半衰期及免疫原性
進行生物化學表徵之後，使用三種不同但互補的技術(西方墨點法、ELISA及免疫沈澱法(IP))就針對經天然PAL(非聚乙二醇化)注射之PKU小鼠所產生之抗體的免疫反應性對最有希望的PEG-PAL候選物進行篩檢。
西方墨點法分析時，以1:10,000稀釋度使用PAL抗血清(獲自經天然PAL注射的小鼠)。亦以相同稀釋度使用獲自經緩衝液處理之小鼠的血清作為陰性對照。將二次抗體(鹼性磷酸酶結合山羊抗小鼠IgG)(Promega)稀釋至1:5,000且使用AP受質西方藍(Western Blue)(Promega)顯色。ELISA測試係使用Nunc/Immuno Maxisorp板(Nalge Nunc International)，依照標準程序，使用於PBS中之1 mg/mL PAL，且用PBS、0.05% Tween-20、2% BSA阻斷來執行。將小鼠抗血清(獲自天然PAL曝露小鼠)1:10,000稀釋於EB阻斷溶液(PBS、0.05% Tween-20、2% BSA)中，且將HRP-山羊抗小鼠IgG用作二次抗體，且使用TMB在450 nm下進行偵測。
使用免疫沈澱法測試PAL抗體結合。將蛋白質樣本(PAL或聚乙二醇化PAL)於TTBS緩衝液(含有0.1% Tween的Tris緩衝鹽水)中培育且在添加抗體樣本之前量測PAL活性。將各樣本與8倍過量的陽性對照抗-PAL血清一起培育，且用陰性對照反應物使用非免疫性小鼠血清進行重複實驗。培育之後，考慮小鼠IgG與珠粒之結合力，添加過量的蛋白質G瓊脂糖4(50%，v/v)，且將樣本再在4℃下，在旋轉下培育隔夜。藉由離心回收上清液且對上清液檢定各樣本之PAL活性。不棄去珠粒離心塊，以便可藉由西方墨點法進一步執行分析。為證實抗體-珠粒結合已發生，使用西方墨點法偵測珠粒上之PAL抗原。將PAL結合步驟之後藉由離心回收的珠粒用TTBS及TBS緩衝液洗滌數次。該等沖洗之後，將SDS-PAGE負載緩衝液添加至珠粒中且將樣本在95℃下加熱5分鐘。接著使用PAL抗血清，藉由西方墨點法分析樣本。如藉由西方墨點法所偵測，展現不良抗體結合的酶變異體在離心塊狀珠粒部份中具有相應的極少PAL，且此表明，與呈現高抗體結合的天然未修飾PAL相比，上清液中保留更高活性。
實例5 測試蛋白酶敏感性
對紅冬孢酵母之天然PAL的蛋白酶定位研究已指出蛋白水解敏感性之主要位點。移除該等位點可降低或消除蛋白水解敏感性並促進有效PKU酶取代之形成。然而，消除該等蛋白水解敏感性位點會使得酶活性降低或減小。
在蛋白質工程化已形成經改良之保留活性之PAL(及PEG-PAL)突變體之後，使用胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶蛋白酶混合物培育來篩檢蛋白酶抗性，繼之對活性保留(經由OD290 量測)及蛋白質裂解減少(經由PAGE凝膠分析)進行監測，從而可鑑別具有適當活體外特性之突變體以用於活體內測試。
使用接近腸環境且含有2.3 mM胰蛋白酶、3.5 mM胰凝乳蛋白酶、3.05 mM羧基肽酶A及3.65 mM羧基肽酶B的蛋白酶混合物培育來評定蛋白水解穩定性。蛋白水解測試包括酶促培育(將蛋白酶添加至PAL溶液中)以測定蛋白酶對所檢測之不同蛋白質變異體(進行或未進行聚乙二醇化或其他化學修飾的天然或突變體蛋白質)的敏感度，包括在蛋白酶曝露之後活性保持及穩定性保持的時程。SDS-PAGE及MALD1-TOF質譜定位實驗用於測定任何蛋白酶敏感性位點之位置(Kriwacki, R.W.等人，J. Biomol. Tech. 9(3):5-15 (1980))。該等定位結果對於測定蛋白酶敏感性之主要位點(諸如已經鑑別的兩個主要位點)而言極為重要，以便可使用聚乙二醇化保護作用及/或突變移除所有主要的敏感性位點以移除及/或保護PAL結構中之敏感性區域。
實例6 形成聚乙二醇化NpPAL及AvPAL
一般而言，NpPAL與AvPAL之聚乙二醇化包括將蛋白質與SUNBRIGHT ME-200HS 20 kDa NHS活化之PEG (NOP)混合。
使用經NHS活化之20 kDa線性PEG的聚乙二醇化方案(標準"HC"方法)：
1)針對內毒素之存在評價蛋白質
將蛋白質溶液(0.1 mL)稀釋於0.9 ml新鮮MQ水中且用手持式Charles River裝置(EndoPTS)，在0.5 EU/ml敏感度下測試內毒素。若內毒素大於0.5 EU/ml，則最初藉由Mustang E過濾、繼之藉由Sterogene Etox樹脂且視需要藉由進一步層析純化來減少內毒素。減少內毒素係有限的，但藉由通過pH 7.8之DEAE FF (Amersham)係足夠有用的。
2)蛋白質之濃縮及緩衝交換
將蛋白質濃縮至大於25 mg/ml，但小於或等於75 mg/ml，且緩衝交換至50 mM KPO4 (pH 8.5)中。若使用旋轉過濾器製備該濃縮物，則首先藉由用單獨緩衝液在減小之速度及時間(3000 rpm，3分鐘)下旋轉來測試過濾器之內毒素，接著以與步驟1中之蛋白質相同的方式測試所保留之緩衝液之內毒素。50 mM KPO4 (pH 8.5)之緩衝液批記錄/配方由水(補足至1 L)、磷酸氫二鉀(8.4913 g/L，48.75 mM)及磷酸二氫鉀(0.17011 g/L，1.25 mM)組成。將溶液經由0.2 μm過濾器過濾且在室溫下儲存。將濃縮產物經由 Mustang E過濾器acrodisc緩慢過濾(1-2 mL/min)。在A280下量測經無菌TBS (pH 7.5)稀釋的樣本及無菌TBS (pH 7.5)空白樣本，以測定蛋白質濃度。NpPAL之消光係數為0.83且AvPAL之消光係數為0.75。
3)NpPAL及AvPAL之聚乙二醇化
將在-80℃下正常儲存的PEG溫至室溫。將KPO4 緩衝液添加至PEG中以藉由以最大速度渦旋來使其再懸浮，且用手將試管猛烈震盪以確保所有的大塊體懸浮。將蛋白質在1分鐘內首先使PEG濕潤且藉由極輕緩的倒置混合而添加至良好懸浮的PEG溶液中。將包裹於鋁箔中的試管置於搖動器之軸上且在室溫下極輕緩地搖動3小時。將TBS (pH 7.5)裝填於試管中且無菌過濾。立即調配懸浮液或將其在4℃下儲存直至準備調配。
4)調配
調配物緩衝液配方/批記錄由水(補足至1 L)、Tris-鹼(3.2 mM)、Tris-HCl (16.8 mM)及氯化鈉組成；將緩衝溶液經由0.2 μm過濾器過濾且在室溫下儲存。使用具有100 MWCO再生纖維素膜的Vivalow 50(較小批次)或Vivalfow 200(較大批次)，使緩衝溶液經受切向流過濾。將溶液用MQ水、0.1 N NaOH且再用200 mL水沖洗。將溶液用TBS(pH 7.5)，以50 nL/min橫向流速平衡。測定滲透物之pH值以確保pH值為7.5。
藉由首先用TBS稀釋約3倍且恢復至原始體積來使溶液緩衝交換至少四次。Vivaflow 50與Vivaflow 200的橫向流 速通常皆為180-200 mL/min。
將最終產物經由Mustang E過濾。取0.1 mL用1.9 ml無菌新鮮水稀釋之後，評價內毒素之存在。若內毒素大於1 EU/mL，則用Sterogene Etox凝膠使其減少。將經調配且無菌的聚乙二醇化NpPAL或AvPAL密封於小瓶內且置放於-70℃下直至準備進行活體內研究。
實例7 點形念珠藻PAL (NpPAL)及其聚乙二醇化形式對罹患PKU之小鼠的影響
此研究之目的為測定皮下投與NpPAL或聚乙二醇化NpPAL之後的血漿苯丙胺酸(Phe)含量。
測試(1)紅冬孢酵母之離胺酸突變體R91K PAL及其聚乙二醇化形式(1:3 PAL:PEG)(PEG獲自Nippon Oil and Fat, NOF)(3.0 IU/mL之劑量)；(2)NpPAL及其聚乙二醇化形式(1:3 PAL:PEG NOF)(0.6 IU/mL至3.0 IU/mL範圍內之劑量)；及(3)媒劑對同型ENU2小鼠(亦稱BTBRenu2 小鼠)的影響。R91K PAL先前已證明具有相對於野生型紅冬孢酵母PAL改良之活性。R91K位於跨過Asp86至Leu101的螺旋中，靠近蛋白質之表面。所有溶液具有小於1.0 EU/mL的內毒素且在-75至-80℃下儲存。ENU2或BTBRenu2 小鼠為苯丙胺酸輕化酶基因(PAH)基因座之同型突變體，其導致動物患有重度高苯丙胺酸血症。高血漿苯丙胺酸(Phe)含量使得該動物成為評價苯丙胺酸解氨酶(PAL)減少血漿Phe之能力的適當模型。
實驗設計
將溶液在第1天經由皮下快速注射於肩胛骨之間、在第4天皮下快速注射於右側腹部內及在第8天皮下快速注射於左側腹部內來投與。使用25號針及1 cc或3 cc注射器將溶液投與至皮下間隙內。每隻動物接受上表所述之劑量體積之0.2、0.4、0.6或1.0 IU測試物。藉由吸入氟烷(1-3% mg/kg)來使動物輕度麻醉且亦用手將其按住。在各劑量投與日大致同時執行劑量投與。
每日觀測動物的發病率、死亡率及一般健康狀況。特定而言，觀測注射部位之充血或水腫跡象。在第3天、第8天及第12天量測體重並記錄，且用作臨床參數，而非用於確定劑量體積。血液採集(P-血漿；S-血清)係在第3天(P，S)、第2天(P)、第4天(給藥前)(P)、第5天(P)、第8天(給藥前)(P,S)、第9天(P,S)、第12天(P)及第23天(S)執行。在各時間點採集約50-100 μL之全血(25-50 μL之血漿或血清)。自尾靜脈採集血液。如以上時程所指明採集血漿或血清。刺入尾靜胍且使用RAM Scientific Green-Top毛細採血管(#07 7250)採集血滴。採集血清時，將血滴採集至不含添加劑的試管內。收穫血漿/血清並移入儲存管內以在-20℃(血漿)或-80℃(血清)下儲存。
結果
NpPAL短期給藥研究結果證明聚乙二醇化酶具有降低過高苯丙胺酸含量的功效。值得注意的是，在任何注射之後，即使在可能存在免疫原性反應之前，未聚乙二醇化之NpPAL未使苯丙胺酸含量降低。因此，聚乙二醇化為NpPAL成為PKU之潛在治療的絕對必要條件(圖5)。
實例8 多變魚腥藻PAL (AvPAL)及其聚乙二醇化形式對罹患PKU之小鼠的影響
此研究之目的為測定皮下投與AvPAL或聚乙二醇化AvPAL之後的血漿苯丙胺酸(Phe)含量。
測試(1)紅冬孢酵母之離胺酸突變體R91K PAL及其聚乙 二醇化形式(1:3 PAL:PEG)(PEG獲自Nippon Oil and Fat, NOF)(3.0 IU/mL之劑量)；(2)AvPAL及其聚乙二醇化形式(1:3 PAL:PEG NOF)(0.6 IU/mL及3.0 IU/mL之劑量)；及(3)媒劑對同型ENU2小鼠(亦稱BTBRenu2 小鼠)的影響。R91K PAL先前已證明具有相對於野生型紅冬孢酵母PAL改良之活性。R91K位於跨過Asp86至Leu101的螺旋中，靠近蛋白質之表面。所有溶液具有小於1.0 EU/mL的內毒素且在-75至-80℃下儲存。ENU2或BTBRenu2 小鼠為苯丙胺酸羥化酶基因(PAH)基因座之同型突變體，其導致動物患有重度高苯丙胺酸血症。高血漿苯丙胺酸(Phe)含量使得該動物成為評價苯丙胺酸解氨酶(PAL)減少血漿Phe之能力的適當模型。
實驗設計
在第1、4及8天，將溶液經由皮下快速注射於動物後背中來投與。使用25號針及1 cc或3 cc注射器將溶液投與至皮下間隙內。每隻動物接受上表所述之劑量體積之0.2、0.4、0.6或1.0 IU測試物。藉由吸入氟烷(1-3% mg/kg)來使 動物輕度麻醉且亦用手將其按住。在各劑量投與日大致同時執行劑量投與。
每日觀測動物的發病率、死亡率及一般健康狀況。特定而言，觀測注射部位之充血或水腫跡象。在第3天、第8天及第12天量測體重並記錄，且用作臨床參數，而非用於確定劑量體積。血液採集(P-血漿；S-血清)係在第3天(P，S)、第2天(P)、第4天(給藥前)(P)、第5天(P)、第8天(給藥前)(P,S)、第9天(P,S)、第12天(P)及第22天(S)執行。在各時間點採集約50-100 μL之全血(25-50 μL之血漿或血清)。自尾靜脈採集血液。如以上時程所指明採集血漿或血清。刺入尾靜胍且使用RAM Scientific Green-Top毛細採血管(#07 7250)採集血滴。採集血清時，將血滴採集至不含添加劑的試管內。收穫血漿/血清並移入儲存管內以在-20℃(血漿)或-80℃(血清)下儲存。
結果
AvPAL短期給藥研究結果證明聚乙二醇化酶具有降低過高苯丙胺酸含量的功效。值得注意的是，在任何注射之後，即使在可能存在免疫原性反應之前，未聚乙二醇化之AvPAL未使苯丙胺酸含量降低。因此，聚乙二醇化經證明為AvPAL成為PKU之潛在治療的絕對必要條件(圖6)。
實例9 對未聚乙二醇化及聚乙二醇化R91K PAL及聚乙二醇化NpPAL在罹患PKU之小鼠中之長期(90天)耐受性研究
此研究之目的為評價用聚乙二醇化及未聚乙二醇化 R91K PAL及聚乙二醇化NpPAL長期(90天)給藥對ENU/2小鼠(苯酮尿症疾病模型)的藥效參數及免疫原性影響。
測試物(R91K及其聚乙二醇化形式R91KPAL:PEG 1:3;npPAL及其聚乙二醇化形式npPAL:PEG 1:3 NOF；及媒劑Tris-HCl)各製備兩批，一批用於研究之前半部分且第二批用於研究之後半部分。將測試溶液在-70℃至-80℃下儲存。使用總共55隻(各劑量組n=3-7隻)同型ENU2小鼠(aka BTBRenu2 )，且在任何情況下均不使用經處理動物(預先注射PAL的小鼠)。
實驗設計
第1、4、5、8及9組每日一次執行劑量投與。第2組及第6組(b.i.w.)在第1天及第4天(例如每週一及每週四)每週兩次給藥。第3組及第7組(第3週後每週兩次)在第1天及第8天給藥且接著在第22天再次給藥，之後的時程與第2組及第6組的時程一致(每週一及週四)。第10組每週給藥一次。測試溶液係使用25號或26號針及1 cc注射器，藉由皮下注射(快速注射)於肩胛骨之間的皮下間隙內來投與。每隻動物接受預定劑量體積，該劑量體積係使用測試溶液活性(IU/mL)及劑量水準(IU/小鼠)算得。在各劑量投與日大致同時執行劑量投與。
每日觀測動物的發病率、死亡率及一般健康狀況。特定而言，觀測注射部位之充血或水腫跡象。每週一次(第-3天、第5天、第12天…，例如每週五)及在研究終止日量測並記錄體重。若存在死亡或因瀕死狀態而出現非預定終止，則記錄彼時之體重。在各時間點採集約100 μL之全血(25 μL血漿及25 μL血清)。經由刺入有知覺動物之尾靜胍來採集血液。使用RAM Scientific Green-Top毛細採血管 (#07 7250)採集血滴之血漿。採集血清時，將血液採集至不含添加劑的試管內。將血樣在濕冰上儲存至多2小時後，再藉由離心分離成血漿/血清，且在-70℃至-80℃下儲存直至檢定評定。在以下日期採集血液之血漿及血清用於測定苯丙胺酸與抗體效價：第-3天(研究開始前)、第9天、第17天、第24天、第31天、第38天、第45天、第52天、第59天、第66天、第73天、第80天、第87天及第91天。在第89天，亦採集第1組、第5組、第9組及第10組動物的血液及血漿。每週單一時間點可能無法提供對血液Phe對給藥之反應的準確觀察。額外時間點展示Phe含量在每次給藥之間是否改變。第9天樣本對於研究完整性至關重要，因為其標明在迄今為止所嘗試之所有給藥方案中PD效應消失的時間。採集最後100 μL血液樣本。
結果
圖7中所示的長期給藥研究表明，在經十週時間多個每週一次注射(NpPAL-PEG)之後，功效持續。
實例10 形成AvPAL變異體(半胱胺酸突變體)
在AvPAL多肽中形成胺基酸取代以使發生於細菌表現之重組蛋白質中的聚集減少。蛋白質聚集會減少活體內酶活性及/或增加活體內免疫原性。一種該形式之聚集因形成鏈間二硫鍵而發生。為將此可能性降至最小，將單獨或組合的不同AvPAL半胱胺酸殘基置換為絲胺酸殘基。
AvPAL多肽具有在位置64、235、318、424、503及565 處之6個半胱胺酸殘基(SEQ ID NO:4)。形成以下AvPAL單半胱胺酸突變體：AvPAL_C64S (SEQ ID NO:7)、AvPAL_C318S (SEQ ID NO:8)、AvPAL_C503S(SEQ ID NO:9)及AvPAL_C565S (SEQ ID NO:10)。亦形成AvPAL雙半胱胺酸突變體AvPAL_S565SC503S (SEQ ID NO:11)。圖8展示該等AvPAL半胱胺酸突變體之胺基酸序歹j。
選殖
用前置引子AvarPAL (5'_CACTGTCATATGAAGACACTAT CTCAAGCACAAAG-3')(SEQ ID NO:18)及反置引子AvarPALrev (5'-CACTGTCTCGAGATGCAAGCAGGGTAAG ATATCTTG-3')(SEQ ID NO:19)由多變魚腥藻基因組DNA(ATCC 29413-U，Qiagen DNeasy套組)擴增AvPAL基因。將所得PCR產物用Taq處理且接著接入pCR2.1 TOPO TA (Invitrogen)內。所得質體取名為lp40。
藉由SOE-PCR添加5' NheI位點並移除內部NheI位點。用前置引子N-Nhe-AvPAL (5'-CACTGTGCTAGCATGAAGACA CTATCTCAAGCACAAAG-3')(SEQ ID NO:20)及反置引子Nhe-AvPALrev (5'-GGAAATTTCCTCCATGATAGCTGGCTT GGTTATCAACATCAATTAGTGG-3')(SEQ ID NO:21)由lp40擴增上游AvPAL片段，且用前置引子Nhe-AvPAL (5'-CCACTAATTGATGTTGATAACCAAGCCAGCTATCATGGAG GAAATTTCC-3')(SEQ ID NO:22)及反置引子AvPALrev-r (5'-ACAGTGGCGGCCGCTTAATGCAAGCAGGGTAAGATAT CTTG-3')(SEQ ID NO:23)由lp40擴增下游AvPAL片段。在 單一PCR反應中，將兩個PCR產物黏接且用DNA聚合酶延伸以產生全長AvPAL基因，且接著用引子N-Nhe-AvPAL及AvPALrev-r擴增。將所得PCR產物用NheI消化，用Klenow鈍化，用NotI消化，且接入pET28a＋載體(藉由用NdeI消化、用Klenow鈍化且用NotI消化所製備)內。所得質體取名為3p86-23。
藉由PCR添加新的限制位點。用前置引子AvEcoRI (5'-CACTGTGAATTCATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3')(SEQ ID NO:24)及反置引子AvSmaIrev (5'-CACTGTCCC GGGTTAATGCAAGCAGGGTAAGATATCT-3')(SEQ ID NO:25)由質體3p86-23擴增AvPAL。所得PCR產物用EcoRI及SmaI消化且接入經EcoRI及SmaI消化的pIBX7載體內。所得質體取名為7p56 Av3。
半胱胺酸突變體
藉由定點誘變(QuickChange XL II, Stratagene)，將AvPAL基因中的兩個半胱胺酸密碼子(對應於AvPAL多肽之位置503及565)用絲胺酸密碼子取代。使用前置引子Av_C503S (5'-GTCATTACGATGCACGCGCCTCT CTATCAC CTGCAACTGAG-3')(SEQ ID NO:26)及反置引子Av_C503Srev (5'-CTCAGTTGCAGGTGATAGAGA GGCGCG TGCATCGTAATGAC-3')(SEQ ID NO:27)，藉由PCR將質體7p56 Av3中位置503處的半胱胺酸密碼子改為絲胺酸密碼子。絲胺酸密碼子加有下劃線且編碼股中之G至C突變(非編碼股中之C至G突變)以粗體標明。所得質體取名為 j282。用前置引子Av_C565S (5'-CAGTTCAAGATATCTTAC CCTCC TTGCATTAACCCGGGCTGC-3')(SEQ ID NO:28)及反置引子Av_C565Srev (5'-GCAGCCCGGGTTAATGCAAGGA GGGTAAGATATCTTGAACTG-3')(SEQ ID NO:29)將質體j282中位置565處之半胱胺酸密碼子改為絲胺酸密碼子。絲胺酸密碼子加有下劃線且編碼股中之G至C突變(非編碼股中之C至G突變)以粗體標明。所得質體取名為j298a。
使用以下引子對將AvPAL基因中位於AvPAL多肽之位置64、318及565處之半胱胺酸密碼子類似地用絲胺酸密碼子取代：C64S：前置引子Av_C64S (5'-GCAGGGTATTCAGG CATCTTCT GATTACATTAATAATGCTGTTG-3')(SEQ ID NO:30)及反置引子Av_C64Srev (5'-CAACAGCATTATTAATG TAATCAGA AGATGCCTGAATACCCTGC-3')(SEQ ID NO:31);C318S：前置引子Av_C318S (5'-CAAGATCGTTACTCACTC CGATCC CTTCCCCAGTATTTGGGGC-3')(SEQ ID NO:32)及反置引子Av_C318Srev (5'-GCCCCAAATACTGGGGAAGGGA TCGGAGTGAGTAACGATCTTG-3')(SEQ ID NO:33)；及C565S：前置引子Av C565S (SEQ ID NO:28)及反置引子Av_C565Srev (SEQ ID NO:29)。絲胺酸密碼子加有下劃線且編碼股中之G至C突變及非編碼股中之C至G突變以粗體標明。
實例11 AvPAL變異體(半胱胺酸突變體)之活體外酶活性
此研究之目的為測定絲胺酸取代AvPAL多肽中之各種半胱胺酸殘基對活體外苯丙胺酸解氨酶(PAL)酶活性的影響。
如實例10中所述，選殖AvPAL變異體(亦即半胱胺酸突變體)。將AvPAL半胱胺酸突變體表現質體轉化至細菌內，且如實例1中所述表現AvPAL半胱胺酸突變體多肽，且如實例2中所述加以純化。
如實例3中所述，測試野生型(WT)AvPAL及AvPAL半胱胺酸突變體的活體外PAL酶活性。表7展示，與未聚乙二醇化之WT AvPAL相比，經純化之未聚乙二醇化AvPAL半胱胺酸突變體蛋白質之活體外PAL比活性因絲胺酸取代位置64處之半胱胺酸殘基(AvPAL_C64S)而降低，但未因絲胺酸取代位置503或565中任一處或位置503與565處之半胱胺酸殘基(AvPAL_C503S、AvPAL_C565S及AvPAL_C565SC503S)而受到不利影響。
為判定引入絲胺酸殘基是否對聚乙二醇化AvPAL蛋白質之酶活性產生影響，如實例6中所述，將WT AvPAL及雙半胱胺酸突變體AvPAL_C565SC503S聚乙二醇化。表7展示，聚乙二醇化AvPAL蛋白質之活體外PAL比活性未因絲胺酸取代位置503與位置565處之半胱胺酸殘基而受到不利影響。
實例12 AvPAL變異體(半胱胺酸突變體)之活體外生物化學表徵
此研究之目的為測定絲胺酸取代AvPAL多肽中之各種半胱胺酸殘基對：(1)加速穩定性；(2)聚集物形成；及(3)位點特異性聚乙二醇化的影響。
加速穩定性
如下測定絲胺酸取代AvPAL中之半胱胺酸殘基對活體外穩定性的影響：將經純化之AvPAL半胱胺酸突變體(聚乙二醇化或未聚乙二醇化)在37℃儲存不同時段，且接著如實例3中所述量測該等蛋白質之活體外PAL比活性。
野生型AvPAL及AvPAL半胱胺酸突變體(未聚乙二醇化或聚乙二醇化)係如實例11中所述製備。
如圖9A所示，未聚乙二醇化AvPAL蛋白質之比活性在37℃下至少5天係穩定的，且未因絲胺酸取代位置565或位置503與565處之半胱胺酸殘基而受到不利影響。類似地，如圖9B所示，聚乙二醇化AvPAL蛋白質之比活性在37℃下至少6天係穩定的。在37℃下6天之後，與野生型AvPAL及雙半胱胺酸AvPAL突變體AvPAL_C565SC503S相比，單半 胱胺酸AvPAL突變體AvPAL_C565S展示略微降低的穩定性。
聚集物形成
絲胺酸取代AvPAL中之半胱胺酸殘基對溶液中蛋白質聚集物形成的影響係藉由以變性及天然凝膠電泳法或以SEC-HPLC將經純化之未聚乙二醇化野生型AvPAL及AvPAL半胱胺酸突變體分離來測定。
經純化之AvPAL製劑係藉由在變性條件(4-12% NuPAGE Bis-Tris)或天然條件(8% Tris-Gly，pH 8.3)下進行凝膠電泳加以分離。將所分離之AvPAL蛋白質用庫馬斯藍(Coomassie Blue)染色。
將經純化之AvPAL製劑藉由SEC-HPLC分離。將AvPAL蛋白質裝載於20 mM磷酸鈉、300 mM NaCl (pH 6.9)中的TSK凝膠管柱(G3000SW×1, 7.8 mm×30 cm, 5 μm (Tosoh Bioscience, LLC))上，且以0.5 mL/min之流速溶離。用Agilent系列1100光譜儀分析所分離的AvPAL蛋白質。
如藉由凝膠電泳(圖10A)或SEC-HPLC(圖10B)所判斷，聚集物存在於野生型AvPAL製劑中及AvPAL_C503S及AvPAL_C64S製劑中，但不存在於AvPAL_C565S及AvPAL_C565SC503S製劑中。
位點特異性聚乙二醇化
絲胺酸取代AvPAL中之半胱胺酸殘基對位點特異性聚乙二醇化的影響係如下測定：將野生型AvPAL及雙半胱胺酸突變體AvPAL_C503SC565S如實例6中所述聚乙二醇化，且 接著比較以下AvPAL離胺酸殘基處之相對聚乙二醇化：K2、K10、K32、K115、K145、K195、K301、K335、K413、K419、K493、K494及K522。
使約100 μg (10 μL×10 μg/μL)未聚乙二醇化或聚乙二醇化AvPAL蛋白質於8 M尿素中變性。接著在37℃下，以100 μL反應體積將變性蛋白質用胰蛋白酶在pH 8.2下消化隔夜(約20小時)。藉由在37℃下用1 μL 1 M DTT處理1小時、繼之用3 μL 15% TFA中止來使經胰蛋白酶消化之蛋白質還原。將經消化之蛋白質用C18逆相管柱加以分離。各聚乙二醇化AvPAL肽之聚乙二醇化百分比係藉由減去相應未聚乙二醇化肽之肽定位來計算。
如圖11所示，AvPAL蛋白質：PEG之比率為1:3時，任何離胺酸(K)殘基之聚乙二醇化百分比不存在顯著差異(K419可能除外)，其中雙半胱胺酸突變體C565SC503S之聚乙二醇化百分比低於野生型AvPAL。然而，使用遞增AvPAL蛋白質：PEG比率下之雙半胱胺酸突變體所獲得的結果(其中未觀測到劑量反應關係)，結合相對較小的聚乙二醇化百分比表明，所觀測之K1419差異可能沒有意義。因此，絲胺酸取代位置503與565處之半胱胺酸殘基似乎不影響AvPAL之位點特異性聚乙二醇化。
實例13 AvPAL蛋白質之聚集機制
執行研究以探究細菌表現之AvPAL蛋白質之聚集機制。
將經純化之AvPAL製劑濃縮，且將濃縮之蛋白質溶液在 37℃下培育2小時，經純化之AvPAL蛋白質在溶液中加速聚集。藉由以SEC-HPLC將AvPAL蛋白質分離來偵測聚集。為判定是否為二硫鍵交聯引起聚集，將50 mM二硫蘇糖醇(DTT)添加至濃縮之蛋白質溶液中，繼之在37℃下培育2小時。
將在細菌中表現的AvPAL蛋白質如實例2中所述純化，且使用旋轉過濾器(Millipore Biomax-10K NMWL)濃縮。將蛋白質於Eppendorf離心機5415C中以約15,000 g旋轉數分鐘。對於趨向聚集的半胱胺酸突變體(例如AvPAL_C503S及AvPAL_C64S)，將蛋白質濃縮至約20 mg/ml且在37℃下培育2小時。對於抗聚集的半胱胺酸突變體(例如AvPAL_C565S及AvPAL_C565SC503S)，將蛋白質濃縮至約40 mg/ml且在37℃下培育2小時。
如表8中所示，經純化之AvPAL半胱胺酸突變體AvPAL_C64S及AvPAL_C503S之製劑在37℃下培育2小時後形成聚集物。正如所料，當將AvPAL蛋白質濃縮後再在37℃下培育2小時時，此聚集加劇。此聚集可藉由使濃縮蛋白質曝露於DTT來阻斷，表明此聚集係起因於二硫鍵交聯。相反，經純化之AvPAL半胱胺酸突變體AvPAL_C565S及AvPAL_C565SC503S之製劑在37℃下培育2小時後不形成聚集物，表明位置565處之半胱胺酸殘基與AvPAL經由二硫鍵交聯聚集相關。
為測定哪些半胱胺酸殘基以游離氫硫基之形式存在，將經純化之AvPAL製劑在8 M尿素存在下變性，用碘乙醯胺烷基化，用胰蛋白酶消化且藉由LC/MS分析。所有AvPAL半胱胺酸殘基經碘乙醯胺標記，表明細菌表現之AvPAL之所有半胱胺酸殘基以游離氫硫基之形式存在。
為測定哪些半胱胺酸殘基存在於天然蛋白質之表面上，將經純化之AvPAL製劑首先用N-乙基順丁烯二醯亞胺(NEM)處理，接著在8 M尿素存在下變性，用碘乙醯胺烷基化，用胰蛋白酶消化且藉由LC/MS分析。位置235及424處之半胱胺酸殘基未被NEM烷基化，且位置318處之半胱 胺酸殘基僅部分地被NEM烷基化，表明位置64、503及565處之半胱胺酸殘基位於天然AvPAL之表面上且位置318處之半胱胺酸殘基部分地曝露於天然AvPAL之表面上。
為測定哪些半胱胺酸殘基與鏈間二硫鍵交聯有關，將經純化之未聚乙二醇化野生型AvPAL製劑之0.7 mg/ml溶液67 μL在37℃下於8 M尿素中變性1小時，且接著在25℃下，以100 μL反應體積用胰蛋白酶在pH 8.2下消化隔夜(約17.5小時)。將經胰蛋白酶消化的蛋白質分離且藉由質譜分析，其中鑑別與預測二硫鍵對相對應的肽且以總離子數(TIC)測定其數量。
表9展示C503-C503、C503-C565、C565-C318及C565-C565之二硫鍵對得以偵測。在經純化之AvPAL製劑之二硫鍵對中發現位置565處之半胱胺酸殘基及數量較少之位置503處之半胱胺酸殘基。
執行研究以判定是否除二硫鍵交聯機制外的其他機制可能與AvPAL蛋白質聚集有關。
將經純化之AvPAL製劑用0.05% Tween或10 mM EDTA培育，且接著如實例12中所述藉由SEC-HPLC分離。Tween使蛋白質聚集因疏水性相互作用而減少，且EDTA使蛋白質聚集因二價陽離子之存在而減少。如圖12中所示，曝露於0.05% Tween或10 mM EDTA對AvPAL蛋白質聚集無影響。經10 mM EDTA處理之AvPAL在第10分鐘之額外峰係由於EDTA在210 nm之吸光度。
為進一步探究二硫鍵交聯在AvPAL蛋白質聚集中的作用，將經純化之AvPAL藉由用DTT處理來還原且接著去鹽，再藉由SEC-HPLC分離。如圖13A中所示，AvPAL蛋白質聚集藉由DTT處理而減至最小，且在37℃下培育18小時後，聚集物再形成。相反，如圖13B中所示，一旦將AvPAL表面半胱胺酸藉由在DTT曝露之後，但在去鹽及在37℃培育18小時之前用N-甲基順丁烯二醯亞胺(NEM)處理加以修飾(亦即烷基化)，聚集物便不再形成。
基於以上所述，細菌表現之AvPAL之聚集似乎僅歸因於鏈間二硫鍵之形成，而非歸因於疏水性作用或存在二價陽離子。位置565及503處之半胱胺酸殘基與AvPAL製劑中之鏈間二硫鍵之形成有關。
實例14 AvPAL變異體(半胱胺酸突變體)及其聚乙二醇化形式對小鼠的影響
該等研究之目的為測定絲胺酸取代AvPAL多肽中位置503及565處之半胱胺酸殘基對小鼠活體內苯丙胺酸(Phe)含量的影響。
基本上如實例8中所述測試AvPAL雙半胱胺酸突變體AvPAL_C565SC503S之聚乙二醇化形式在同型ENU2(亦稱BTBRenu2 )小鼠中的活體內活性。ENU2小鼠為PAH基因座之同型突變體，其導致動物患有重度HPA。高血漿Phe含量使得該動物成為評價PAL減少血漿Phe之能力的適當模型。
在首次研究中，以不同劑量測試AvPAL雙半胱胺酸突變體AvPAL_C565SC503S。將ENU2小鼠(雄鼠及雌鼠)分成5個劑量組：4個測試組(n=4)及1個媒劑組(n=2)。以下列各物對各小鼠進行8週每週一次皮下給藥：媒劑、低劑量之聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL (0.25 IU)、中等劑量之聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL (1.0 IU)、高劑量之聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL (4.0 IU)或聚乙二醇化野生型AvPAL (4.0 IU)。給藥前及給藥後第48小時(直至第57天)採集血漿且分析Phe含量。給藥前及給藥後第48小時(直至第57天)亦採集血清以便分析抗-AvPAL抗體含量。從首次給藥之前第2天開始(直至第40天)，亦將小鼠每週稱重一次。
研究期間兩隻小鼠死亡，一隻為經媒劑處理的小鼠且一隻為經低劑量聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL處理的小鼠。如圖14中所示，在每次皮下注射聚乙二醇化雙半胱 胺酸突變體AvPAL之後第48小時，觀測到血漿中Phe含量之劑量依賴性降低。在均等劑量下，在經聚乙二醇化野生型AvPAL或聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL處理的小鼠之間，血漿Phe含量不存在差異。如圖15中所示，在經媒劑、聚乙二醇化野生型AvPAL或聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL處理的小鼠之間，體重亦不存在顯著差異。未觀測到體重有顯著差異可能係由於研究中使用了雌鼠與雄鼠。
該等小鼠之抗-AvPAL抗體效價係用間接ELISA檢定分析。在此檢定中，將微量滴定板用AvPAL塗覆，阻斷且接著曝露於源自各小鼠血液之經適當稀釋的血清。與微量滴定板表面結合的AvPAL被存在於血清樣本中的AvPAL特異性抗體識別並結合。經可偵測標記之山羊抗小鼠IgG抗體偵測所結合的抗-AvPAL抗體。血清樣本最初以1:50稀釋，且與來自1:50稀釋之混合小鼠血清的"切點"對比分析。具有低於切點之信號的樣本報導為<50或"陰性"。其餘樣本(視為"陽性")以1:3系列效價進一步稀釋至信號下降至切點以下之稀釋度。得到陽性信號(亦即高於切點)的最高稀釋倍數報導為彼樣本之效價。在此效價系列中，效價之3倍變化可能不能反映所偵測之抗體之顯著差異，因為差異可能為在此切點水準信號最小變化的結果。
如表10中所示，與經均等劑量(4.0 IU)之聚乙二醇化野生型AvPAL處理的小鼠相比，經聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL處理之小鼠的抗-AvPAL抗體效價較低。儘管未 觀測到明顯劑量反應，但與經低劑量(0.25 IU)之聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL處理的小鼠相比，經高劑量(4.0 IU)之聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL處理的小鼠具有較高抗-AvPAL抗體效價。
與4.0 IU聚乙二醇化野生型AvPAL相比，投與4.0 IU聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL之小鼠之降低抗-AvPAL IgG效價在研究中始終得以保持。
在第二次研究中，以不同聚乙二醇化比率測試AvPAL雙半胱胺酸突變體AvPAL_C565SC503S。將ENU2雄性小鼠分成5個劑量組：4個測試組(n=4)及1個媒劑組(n=2)。以下列各物對各小鼠進行8週每週一次皮下給藥：媒劑、低劑量之聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL(4 IU及1:1.6AvPAL:PEG比率)、中等劑量之聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL(4 IU及1:2.4 AvPAL:PEG比率)、高劑量之聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL(4 IU及1:3 AvPAL:PEG比率)或聚乙二醇化野生型AvPAL(4 IU及1:3 AvPAL:PEG比率)。給藥前及給藥後第4天(直至第61天)採集血漿且分析Phe含量。給藥前及給藥後第4天(直至第57天)亦採集血清以便分析抗-AvPAL抗體含量。從首次給藥前第2天開始(直至第40天)，亦將小鼠每週稱重一次。
研究期間，一隻經媒劑處理的小鼠死亡。如圖16中所示，每次皮下注射聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL之後第4天，觀測到血漿中Phe含量之PEG比率依賴性減少。在均等PEG比率下，在經聚乙二醇化野生型AvPAL或聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL處理的小鼠之間，血漿Phe含量不存在差異。如圖17中所示，經聚乙二醇化野生型AvPAL或聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL處理之小鼠的體重明顯高於經媒劑處理的小鼠。
該等小鼠之抗-AvPAL抗體效價係用上述間接ELISA檢定分析。
如表11中所示，與經均等劑量之聚乙二醇化野生型AvPAL(具有相同之AvPAL與PEG比率(1:3))處理的小鼠相比，經聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL處理之小鼠的抗-AvPAL抗體效價較低。觀測到抗-AvPAL抗體效價與AvPAL與PEG之比率之間反向的劑量反應，此正如所料：蛋白質(諸如AvPAL)之聚乙二醇化與降低之活體內免疫原性相關。
以上結果表明，聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL AvPAL_C565SC503S具有與聚乙二醇化野生型AvPAL相當的活體內PAL酶活性。由於未聚乙二醇化野生型AvPAL不具有可偵測之活體內PAL酶活性(參見實例8)，因此斷定，AvPAL變異體(包括聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL、AvPAL C565SC503S及聚乙二醇化野生型AvPAL)具有比野生型AvPAL高的苯丙胺酸轉化活性。
以上結果亦表明，聚乙二醇化AvPAL變異體(因位置503與565處之半胱胺酸均取代為絲胺酸而蛋白質聚集減少)具有與聚乙二醇化野生型AvPAL相比降低的免疫原性。由於聚乙二醇化本身與降低之免疫原性相關，因此斷定，AvPAL變異體具有與野生型AvPAL相比降低的活體內免疫原性。
實例15 形成AvPAL變異體之再聚乙二醇化形式
執行研究以判定AvPAL變異體之聚乙二醇化形式是否可經受再聚乙二醇化以增加聚乙二醇化之量，亦即AvPAL離胺酸殘基上之PEG分子百分比，及若如此，AvPAL變異體之再聚乙二醇化形式是否保留活體外酶活性且具有經改良之活體內特性，亦即降低之免疫原性。
AvPAL變異體之聚乙二醇化
基本上如實例6中所述，以不同PAL:PEG(亦即，AvPAL_C565SC503S:SUNBRIGHT ME-200HS 20 kDa NHS活化PEG (NOF))比率將雙半胱胺酸突變體AvPAL (AvPAL C565SC503S)聚乙二醇化。
簡而言之，標準反應混合物在50 mM磷酸鉀緩衝液(pH 8.5)中含有：7 mg/ml(相當於2 mM離胺酸殘基)AvPAL C565SC503S，及2 mM、3 mM、4 mM或6 mM mPEG20K-NHS(甲氧基聚乙二醇-羧甲基-N-羥基丁二醯亞胺酯，20 kDa, SUNBRIGHT ME-200HS, NOF)，分別對應於所有AvPAL離胺酸殘基與PEG分子之1:1、1:1.5、1:2或1:3莫耳比(參見表12)。在室溫下培育3小時之後，將反應混合物緩衝交換至200 mM磷酸鉀緩衝液(pH 8.5)中，且使用切向流過濾(Vivaflow 50或200，聚醚碸或再生纖維素膜，100 kDa MWCO, Sartorius)濃縮至大於20 mg/ml，以備用於隨後的再聚乙二醇化步驟。
聚乙二醇化AvPAL變異體之再聚乙二醇化
基本上如實例6中所述，使用不同濃度之聚乙二醇化酶及AvPAL酶中之離胺酸殘基與SUNBRIGHT ME-200HS 20 kDa NHS活化PEG (NOF)分子之不同量及不同比率將以不同PAL:PEG比率聚乙二醇化之AvPAL_C565SC503S再聚乙二醇化。
對於每次再聚乙二醇化反應，起始物質為於200 mM磷酸鉀(pH 8.5)中濃縮至大於20 mg/ml的聚乙二醇化AvPAL_C565SC503S (rAvPAL-PEG)。每次再聚乙二醇化反應單獨稱取mPEG20K-NHS，且將其再懸浮於最小體積之水中。將視需要稀釋於緩衝液中的rAvPAL-PEG直接添加至再懸浮之mPEG20K-NHS溶液中，以達到表12中所指示的最後濃度。使再聚乙二醇化反應在室溫下進行3小時，且接著藉由用25 mM TrisHCl (pH 7.3)稀釋兩倍來中止。使用切向流過濾法(Vivaflow 50或200，聚醚碸或再生纖維素膜，100 kDa MWCO, Sartorius)將再聚乙二醇化rAvPAL-PEG樣本於10 mM Tris HCl、135 mM NaCl、1 mM L-Phe (pH 7.3)中緩衝交換並濃縮。視需要，使用離心濃縮法將最後再聚乙二醇化rAvPAL-PEG樣本進一步濃縮。
活體外表徵方法
總蛋白質檢定： 使用Pierce之市售檢定套組(目錄號23227)，以牛血清白蛋白作為標準，藉由二喹啉甲酸(bicinchoninic acid; BCA)檢定測定聚乙二醇化rAvPAL-PEG樣本及再聚乙二醇化rAvPAL-PEG樣本之濃度。簡而言 之，將25 μL樣本及標準物在37℃下用200 μL BCA試劑培育30 min。用SPECTRAmax PLUS微板光譜儀(Molecular Devices Corporation)讀取562 nm下之吸光度。
rAvPAL活性檢定： 基於實例3中所述之既定PAL活性檢定方案，測定聚乙二醇化rAvPAL-PEG樣本及再聚乙二醇化rAvPAL-PEG樣本之比活性。簡而言之，將蛋白質樣本(25-50 μL)添加至1 mL檢定反應物中後，監測到當L-Phe轉化為反式肉桂酸時OD290 增大。需要時，將樣本於檢定稀釋緩衝液(10 mM Tris HCl，135 mM NaCl，pH 7.3)中稀釋後再檢定。各數據點代表三個獨立量測值之平均值。
毛細管凝膠電泳(CGE)： 使用Beckman-Coulter之ProteomeLab SDS-MW分析套組(目錄號390953)執行CGE分析。將聚乙二醇化及再聚乙二醇化rAvPAL-PEG及rAvPAL-PEG-RPl樣本在SDS及對巰基乙醇存在下在95℃下加熱5分鐘，且接著裝載於Beckman-Coulter之P/ACE MDQ毛細管電泳系統中之毛細管(PA800 CE，23 cm熔融矽石)上。CGE分布圖呈現214 nm下之UV吸光度之量。各CGE樣本含有10 kDa遷移標記作為供分析用的參照物。rAvPAL-PEG樣本之間再調節毛細管。
TNBS檢定： 使用三硝基苯磺酸(TNBS)檢定提供對存在於聚乙二醇化及再聚乙二醇化rAvPAL-PEG樣本中之游離胺基的評估。
肽定位： 如實例10中所述執行rAvPAL-PEG及rAvPAL-PEG-樣本之胰蛋白酶肽定位，以測定AvPAL變異體蛋白質 上離胺酸殘基處的聚乙二醇化百分比。測定聚乙二醇化之量，亦即再聚乙二醇化AvPAL_C565SC503S之AvPAL離胺酸殘基K10、K32、K115、K145、K195、K301、K335、K413、K493/K494及K522上之PEG分子的百分比。
聚乙二醇化及再聚乙二醇化AvPAL變異體之活體外表徵
rAvPAL酶活性： 如圖18(上圖)中所示，聚乙二醇化或再聚乙二醇化使得rAvPAL活體外酶活性暫時性降低。此似乎係歸因於靠近催化活性位點之特異性酪胺酸殘基之可逆聚乙二醇化。與單次聚乙二醇化相比，再聚乙二醇化似乎可增強聚乙二醇化反應對rAvPAL酶活性的影響，亦即使其比活性暫時性降低，活性隨著時間逐步恢復。在聚乙二醇化反應中之較高PEG濃度與比活性之較大暫時性降幅相關聯。然而，在4℃下數週之後，再聚乙二醇化rAvPAL-PEG(首先使用各種PAL:PEG比率及酶及PEG分子之濃度(AvPAL中之離胺酸殘基及PEG之mM濃度已指定)形成)之比活性達到單次聚乙二醇化AvPAL-PEG(使用1:3之PAL:PEG比率(2 mM離胺酸殘基：6 mM PEG，實心圓)形成)之至少約80%。此外，聚乙二醇化之後，聚乙二醇化及再聚乙二醇化AvPAL-PEG酶經歷相當速率的活性恢復。
如圖18(下圖)中所示，當首先使用1:1之PAL:PEG比率(2 mM離胺酸殘基：2 mM PEG，實心方塊)形成聚乙二醇化rAvPAL-PEG時，觀測到類似的趨勢。總體而言，儘管再聚乙二醇化暫時性地影響AvPAL活性，但與以1:3之PAL:PEG比率形成的單次聚乙二醇化rAvPAL-PEG相比， 再聚乙二醇化rAvPAL-PEG所產生之比活性在可接受之範圍內。
聚乙二醇化及再聚乙二醇化rAvPAL之CGE分析： CGE分析表明，相對於單次聚乙二醇化，再聚乙二醇化使總聚乙二醇化程度增大。如圖19A中所示，再聚乙二醇化使得rAvPAL-PEG之電泳遷移率降低，說明由於連接額外PEG分子而使分子尺寸增大。此外，聚乙二醇化程度與再聚乙二醇化步驟期間所使用之PEG之濃度密切相關。如圖19B中所示，不論首次聚乙二醇化步驟期間的反應條件如何，6 mM或高於6 mM濃度的mPEG20K-NHS同等有效地增加rAvPAL-PEG之聚乙二醇化。總之，與單次聚乙二醇化rAvPAL相比，再聚乙二醇化rAvPAL-PEG明顯展示CGE遷移率降低及由此之分子量增大。
再聚乙二醇化後rAvPAL-PEG中之游離胺： 執行TNBS檢定以評估存在於再聚乙二醇化rAvPAL-PEG中之游離胺基之量(相對於單次聚乙二醇化rAvPAL-PEG)。如表13中所示，較高PEG濃度(諸如6 mM)存在下之再聚乙二醇化使存在於rAvPAL蛋白質上之游離胺之量最大幅度地降低，說明聚乙二醇化總體增大。在此處所用的條件下，再聚乙二醇化之後，非聚乙二醇化rAvPAL中可供化學修飾用之游離胺大部分得以有效地聚乙二醇化。
再聚乙二醇化後離胺酸殘基之聚乙二醇化百分比： 如圖20中所示，胰蛋白酶肽定位研究表明再聚乙二醇化使rAvPAL-PEG上之離胺酸殘基之聚乙二醇化百分比提高。除AvPAL之位置10處之離胺酸殘基(其在單次聚乙二醇化步驟期間已經100%聚乙二醇化)外，殘餘未結合的離胺酸殘基經再聚乙二醇化後成為聚乙二醇化的標靶。最值得注意的是，再聚乙二醇化後，AvPAL之位置301處之離胺酸殘基的聚乙二醇化增加高達500%。與較低PEG濃度(諸如2 mM)相比，在較高濃度(諸如6 mM)之活化mPEG20K-NHS存在下，再聚乙二醇化條件似乎可更有效地增大rAvPAL-PEG中之聚乙二醇化程度。
實例16 AvPAL-PEG變異體之再聚乙二醇化對小鼠的影響
將再聚乙二醇化AvPAL_C565SC503S (rAvPAL-PEG-RPl)(如實例15中所述，在第一聚乙二醇化反應與第二聚乙二醇化反應中均使用1:3之PAL:PEG比率形成)與單次聚乙 二醇化AvPAL_C565SC503S (rAvPAL-PEG)(如實例6及15中所述，使用1:3之PAL:PEG比率形成)在其使PKU小鼠模型之血漿Phe含量降低及誘導活體內抗體反應之能力方面進行對比。
如實例3中所述，量測聚乙二醇化及再聚乙二醇化兩種AvPAL變異體酶之比活性。發現rAvPAL-PEG-RPl所具有的比活性(1.17 U/mg)比rAvPAL-PEG之比活性(1.47 U/mg)低約20%。
基本上如實例8中所述，分別測試AvPAL_C565SC503S、rAvPAL-PEG及rAvPAL-PEG-RPl之聚乙二醇化形式及再聚乙二醇化形式在同型ENU2(亦稱BTBRenu2 )小鼠中的活體內活性。研究設計展示於下表14中。
將兩組小鼠(第1組及第2組)8週每週一次分別皮下投與高劑量(80 mg/kg)之rAvPAL-PEG或rAvPAL-PEG-RPl，繼之6週每週一次分別皮下投與低劑量(20 mg/kg)之rAvPAL- PEG或rAvPAL-PEG-RPl。一組小鼠(第3組)投與高劑量之rAvPAL-PEG，繼之投與低劑量之rAvPAL-PEG-RPl。給藥前及給藥後不同日期採集血漿且分析Phe含量。如實例8中所述量測血漿Phe含量，且所得數據展示於圖21中。給藥前及給藥後不同日期採集血清以便分析抗-AvPAL抗體含量。如實例14中所述量測血清抗-rAvPAL IgG效價，且所得數據展示於表15中。
如圖21中所示，對於所有3個組，7-8週之每週一次80 mg/kg rAvPAL-PEG(DP，實心圓或實心倒三角形)或rAvPAL-PEG-RPl(2×PEG，空心圓)皮下給藥使得血漿Phe含量穩定在<200 μM。穩定之後，減量至每週一次皮下給與20 mg/kg rAvPAL-PEG使得4天血漿Phe含量<200 μM。經20 mg/kg rAvPAL-PEG處理之ENU2小鼠之血漿Phe含量(DP，實心圓)低於經20 mg/kg rAvPAL-PEG-RPl處理的小鼠(2×PEG，空心圓或實心倒三角形)，原因可能在於單次聚乙二醇化rAvPAL-PEG之比活性大於兩次聚乙二醇化rAvPAL-PEG-RPl之比活性。
如表15中所示，與注射rAvPAL-PEG的彼等小鼠(第1組及第3組)相比，注射rAvPAL-PEG-RPl(第2組)之ENU2小鼠的抗-AvPAL IgG效價較低。此說明，AvPAL變異體再聚乙二醇化成具有增大量之聚乙二醇化(尤其用20 kDa線性PEG分子)與降低之活體內免疫原性相關。
總之，用20 kDa線性PEG分子將AvPAL-PEG變異體再聚乙二醇化以使AvPAL中之多個殘基處之聚乙二醇化百分比增大與略微降低之活體外酶活性相關，但重要地是，與降低之活體內免疫原性相關。
實例17 原核生物PAL組合物之臨床評價
以下實例提供用於臨床評價本發明之治療方法中包含原核生物PAL或其生物學活性變異體、突變體及片段("PAL")之組合物的參數導則。如本文中通篇所述，PAL將用於治療HPA，包括HPA、輕度苯酮尿症(PKU)及典型PKU。執行臨床試驗，提供對經口或皮下給與PAL之安全性、藥物動力學以及替代臨床終點與規定臨床終點之初始反應的評定。試驗進行最短(但不必限於)24週，以收集100位可評價 患者之足夠安全資訊。試驗之初始劑量為約0.001至約1.0毫克/公斤/週不等。在該劑量不使患者之過高血漿苯丙胺酸(Phe)含量降低或產生明顯直接臨床效益(按使每日Phe經口攝入量增大而不使血漿Phe含量增大之能力量測)的情況下，應視需要增大劑量，且將此劑量另外維持最短(但不必限於)24週以確保安全性及評價進一步功效。
安全性之量測包括不良事件、過敏反應、完整臨床化學典型檢查(腎功能及肝功能)、尿分析及差示CBC。此外，亦監測其他參數，包括血液Pbe含量之含量降低、神經心理學及認知測試及全面評價。該實例亦涵蓋測定藥物在循環中之藥物動力學參數及PAL在血液中之一般分布及半衰期。預期該等量測將有助於顯示劑量與臨床反應的關係。
方法
具有高血漿Phe含量的患者將經歷基礎檢查；病史檢查及體格檢查；神經心理學及認知測試；一套標準的臨床實驗測試(CBC，典型檢查20，CH50，UA)；尿喋呤含量、二氫喋啶還原酶(DHPR)含量及血清胺基酸之空腹血液(血漿)典型檢查。應密切追蹤患者作每週一次臨床隨訪。治療期結束之後第一週，患者應復診以作出全面評價。若需增大劑量，則患者應依循上述相同時程。在試驗過程中始終監測安全性。
診斷及納入/排除標準
患者可為已藉由遺傳測試及血液中高Phe含量之跡象證實確診為HPA或輕度PKU的男性或女性。研究包括不準確 依循膳食控制的HPA或PKU患者。具有生育潛力的女性患者必須每次在臨給藥前進行妊娠測試(尿β-hCG)為陰性且必須勸其在整個研究中使用醫學上可接受之避孕方法。若患者處於懷孕期或哺乳期；在研究招募之前30天內已接受研究性藥物；或具有可能明顯降低研究順應性的醫學病況、嚴重間發性疾病，或其他掩飾情形，則該研究將該患者排除在外。
膳食介入
初始隨機化及兩週治療期之後，所有研究參加者在總共四至六週內經歷膳食輔導且依循標準膳食及/或補充有Phe特異性醫藥食物的標準Phe限制性膳食。在家控制膳食且將膳食攝入量記錄於日誌中。對各治療組之營養及醫藥食物之攝入量及推薦膳食攝入量(RDI)百分比作比較分析。
PAL安全性
若研究過程中未發生明顯的急性或慢性藥物反應，則判定PAL療法為安全的。若臨床檢查、臨床實驗或其他適當研究中未觀測到明顯的異常，則判定長期投與此藥物為安全的。
實例18 臨床評價聚乙二醇化AvPAL變異體
以人類臨床評價聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL (AvPAL_C565SC503S)。臨床評價之目的為判定對PKU患者的安全性、可耐受性、藥物動力學(PK)及功效。血液苯丙胺酸(Phe)含量用作臨床終點。
1期
1期為對年齡在16歲與50歲之間的35位PKU患者的開放標記單次劑量遞增研究。主要目的為評定聚乙二醇化雙半胱胺酸突變體AvPAL (AvPAL_C565SC503S)之安全性及可耐受性，且次要目的為評價聚乙二醇化酶的PK及Phe降低。將0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3及1 mg/kg遞增劑量之聚乙二醇化AvPAL_C565SC503S依序投與七組各5位個體。各組之個體接受單次劑量，且接著追蹤總共6週。納入標準為篩檢時之血液Phe含量及過去3年內之平均血液Phe含量為600 μM。
2期
2期研究分成不中斷的兩部分；o第1部分：16週-8週投藥，接著最佳化劑量o第2部分：40週延續
2期為對35位PKU個體的兩部分、開放標記、劑量最佳化研究。執行持續16週的第1部分包括8週每週一次投與各劑量之聚乙二醇化AvPAL_C565SC503S，繼之為劑量最佳化期。調整每位個體的劑量以使血液Phe濃度低於600 μM。主要目的為評價多次投與聚乙二醇化AvPAL_C565SC503S之安全性及可耐受性，且次要目的為評價聚乙二醇化酶對血液Phe濃度、免疫反應(例如抗-AvPAL抗體效價)及穩態PK的影響。在第2部分中，將聚乙二醇化AvPAL_C565SC503S以適應個別需要之最佳化劑量及投藥頻率投與個體歷時40週。
3期
1期及2期研究一結束，額外研究便可能潛在地包括對更多個體之3期6個月的雙盲研究，額外研究針對特殊群體，諸如但不限於非PKU高苯丙胺酸血症(HPA)患者、BH4-反應性PKU患者及非BH4-反應性PHU患者。
圖1.圖1A：點形念珠藻PAL之基因序列(SEQ ID NO:1)；圖1B：點形念珠藻PAL之蛋白質序列(SEQ ID NO:2)。
圖2.圖2A：多變魚腥藻PAL之基因序列(SEQ ID NO:3)；圖2B：多變魚腥藻PAL之蛋白質序列(SEQ ID NO:4)。
圖3.原核生物與真核生物之芳族胺基酸解氨酶之關係樹。序列係自GenBank中擷取(圓括號中給出寄存編號)且使用鄰接法與ClustalX (1.83)比對。
圖4.點形念珠藻PAL (SEQ ID NO:2)及多變魚腥藻PAL (SEQ ID NO:4)之藍藻細菌蛋白質序列與EncP PAL (SEQ ID NO:5)及惡臭假單胞菌HAL (SEQ ID NO:6)之比對。對應於PAL或HAL活性的活性位點殘基高亮顯示。
圖5. 12天期間，(A)非聚乙二醇化NpPAL (1.0 IU/mL)及(B)聚乙二醇化NpPAL 1:3 PAL:PEG (Nippon Oil and Fat, NOF Corporation)(1.0 IU/mL)對苯丙胺酸含量(μM)的影響。
圖6. 12天期間，(A)非聚乙二醇化AvPAL (1.0 IU/mL)及(B)聚乙二醇化AvPAL 1:3 PAL:PEG (Nippon Oil and Fat, NOF Corporation)(1.0 IU/mL)對苯丙胺酸含量(μM)的影 響。
圖7. 90天長期耐受性研究中，聚乙二醇化NpPAL 1:3 PAL:PEG (Nippon Oil and Fat, NOF Corporation)(1.0 IU/mL)對苯丙胺酸含量(μM)的影響。
圖8.圖8A：位置64處之半胱胺酸經絲胺酸取代之多變魚腥藻苯丙胺酸解氨酶(PAL)的蛋白質序列(AvPAL_C64S, SEQ ID NO:7)；圖8B：位置318處之半胱胺酸經絲胺酸之多變魚腥藻PAL的蛋白質序列(AvPAL_C318S, SEQ ID NO:8)；圖8C：位置503處之半胱胺酸經絲胺酸取代之多變魚腥藻PAL的蛋白質序列(AvPAL_C503S, SEQ ID NO:9)；圖8D：位置565處之半胱胺酸經絲胺酸取代之多變魚腥藻PAL的蛋白質序列(AvPAL_C565S, SEQ ID NO:10)；圖8E：位置503及565處之半胱胺酸經絲胺酸取代之多變魚腥藻PAL的蛋白質序列(AvPAL_C565SC503S, SEQ ID NO:11)。半胱胺酸取代為絲胺酸以粗體加下劃線顯示。
圖9.圖9A：在37℃下培育不同長度之時間之後，未聚乙二醇化AvPAL之位置565處或位置565與503處之半胱胺酸取代為絲胺酸對活體外PAL酶比活性的影響。圖9B：在37℃下培育不同長度之時間之後，聚乙二醇化AvPAL之位置565處或位置565與503處之半胱胺酸取代為絲胺酸對活體外PAL酶比活性的影響。
圖10.圖10A：如藉由在變性條件(左圖)或天然條件(右圖)下之凝膠電泳法所分析，AvPAL中之半胱胺酸取代為絲胺酸對溶液中形成蛋白質聚集物的影響。圖10B：如藉由 SEC-HPLC所分析，AvPAL中之半胱胺酸取代為絲胺酸對溶液中形成蛋白質聚集物的影響。
圖11.在不同PEG濃度下，AvPAL中之位置565與503處之半胱胺酸取代為絲胺酸(dbl突變體)對位點特異性聚乙二醇化的影響。
圖12.如藉由SEC-HPLC所分析，用0.05% Tween80或10 mM EDTA處理AvPAL對溶液中形成蛋白質聚集物的影響。
圖13.圖13A：如藉由SEC-HPLC所分析，用二硫蘇糖醇(DTT)處理AvPAL對溶液中形成蛋白質聚集物的影響。圖13B：如藉由SEC-HPLC所分析，用DTT及N-乙基順丁烯二醯亞胺(NEM)處理AvPAL對溶液中形成蛋白質聚集物的影響。
圖14.與給與媒劑或4.0 IU野生型聚乙二醇化AvPAL的ENU2小鼠相比，聚乙二醇化AvPAL中之位置565與503處之半胱胺酸取代為絲胺酸(AvPAL_C565SC503S)對給與0.25 IU(上圖)、1.0 IU(中圖)或4.0 IU(下圖)酶之ENU2小鼠活體內之苯丙胺酸(Phe)含量的影響。
圖15.與給與媒劑或4.0 IU野生型聚乙二醇化AvPAL的ENU2小鼠相比，聚乙二醇化AvPAL中之位置565與503處之半胱胺酸取代為絲胺酸(AvPAL_C565SC503S)對給與0.25 IU、1.0 IU或4.0 IU酶之ENU2小鼠之體重的影響。
圖16.與給與媒劑或4.0 IU野生型聚乙二醇化AvPAL(AvPAL:PEG比率為1:3)的ENU2小鼠相比，聚乙二醇化AvPAL中之位置565與503處之半胱胺酸取代為絲胺酸 (AvPAL C503S/565S)對給與4 IU不同AvPAL:PEG比率(1:1.6(上圖)、1:2.4(中圖)或1:3(上圖))的酶之ENU2小鼠活體內之苯丙胺酸(Phe)含量的影響。
圖17.與給與媒劑或4.0 IU野生型聚乙二醇化AvPAL(AvPAL:PEG比率為1:3)的ENU2小鼠相比，聚乙二醇化AvPAL中之位置565與503處之半胱胺酸取代為絲胺酸(AvPAL_C565SC503S)對給與4 IU不同AvPAL:PEG比率(1:1.6、1:2.4或1:3)之酶之ENU2小鼠體重的影響。
圖18.聚乙二醇化AvPAL_C565SC503S之再聚乙二醇化對活體外AvPAL比活性的影響。(上圖)在所指示之各種PAL:PEG比率以及離胺酸殘基及PEG分子之濃度下再聚乙二醇化之後，最初以1:3之PAL:PEG比率(2 mM離胺酸殘基：6 mM PEG，實心圓)聚乙二醇化之rAvPAL-PEG之比活性恢復。(下圖)在所指示之各種PAL:PEG比率以及離胺酸殘基及PEG分子之濃度下再聚乙二醇化之後，最初以1:1(2 mM離胺酸殘基：2 mM PEG，實心方塊)或1:3(2 mM離胺酸殘基：6 mM PEG，實心圓)之PAL:PEG比率聚乙二醇化之rAvPAL-PEG之比活性恢復。
圖19.圖19A：如藉由毛細管凝膠電泳(CGE)分析所判定，在再聚乙二醇化反應中增大PAL:PEG比率對最初以1:3之PAL:PEG比率(2 mM離胺酸殘基：6 mM PEG)聚乙二醇化之rAvPAL-PEG之總體聚乙二醇化的影響。圖19B：如藉由CGE分析所判定，在最初聚乙二醇化反應中增大PAL:PEG比率對rAvPAL-PEG之總體聚乙二醇化的影響， 其中以1:3之固定PAL:PEG比率(2 mM離胺酸殘基：6 mM PEG)執行再聚乙二醇化反應。
圖20.在所指示之各種PAL:PEG比率及離胺酸殘基及PEG分子之濃度下再聚乙二醇化之後，最初以1:3之PAL:PEG比率(2 mM離胺酸殘基：6 mM PEG)聚乙二醇化之AvPAL C565SC503S的再聚乙二醇化對AvPAL中之特異性離胺酸殘基之聚乙二醇化百分比的影響。位置2處之離胺酸殘基(K2)在所有測試條件下均經100%聚乙二醇化(未展示)。
圖21.最初以1:3之PAL:PEG比率(2 mM離胺酸殘基：6 mM PEG)聚乙二醇化且以相同PAL:PEG比率及離胺酸殘基及PEG分子之濃度再聚乙二醇化之AvPAL_C565SC503S的再聚乙二醇化對如表14所示皮下給藥之ENU2小鼠活體內之血漿苯丙胺酸(Phe)含量的影響。
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<223>在位置565形成絲胺酸取代半胱胺酸的多變魚腥藻PAL引子(反置)
<400>29
<210>30
<211>44
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>在位置64形成絲胺酸取代半胱胺酸的多變魚腥藻PAL引子(前置)
<400>30
<210>31
<211>44
<212>DHA
<213>人造
<220>
<223>在位置64形成絲胺酸取代半胱胺酸的多變魚腥藻PAL引子(反置)
<400>31
<210>32
<211>43
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>在位置318形成絲胺酸取代半胱胺酸的多變魚腥藻PAL引子(前置)
<400>32
<210>33
<211>43
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>在位置318形成絲胺酸取代半胱胺酸的多變魚腥藻PAL引子(反置)
<400>33
(無元件符號說明)

Claims (35)

  1. 一種多變魚腥藻(Anabaena variabilis )苯丙胺酸解氨酶(AvPAL)變異體，其中AvPAL之位置503之半胱胺酸殘基已經絲胺酸殘基取代(SEQ ID NO：9)。
  2. 一種AvPAL變異體，其中AvPAL之位置565之半胱胺酸殘基已經絲胺酸殘基取代(SEQ ID NO：10)。
  3. 一種AvPAL變異體，其中位置503及565之半胱胺酸殘基已經絲胺酸殘基取代(SEQ ID NO：11)。
  4. 如請求項1至3中任一項之AvPAL變異體，其係經聚乙二醇化。
  5. 如請求項4之AvPAL變異體，其中該聚乙二醇化係藉由使該AvPAL變異體與NHS活化之聚乙二醇以AvPAL變異體之每個離胺酸殘基至少1.6個聚乙二醇之比率反應來達成。
  6. 如請求項4之AvPAL變異體，其中該聚乙二醇化係藉由使該AvPAL變異體與NHS活化之聚乙二醇以AvPAL變異體之每個離胺酸殘基至少2.4個聚乙二醇之比率反應來達成。
  7. 如請求項4之AvPAL變異體，其中該聚乙二醇化係藉由使該AvPAL變異體與NHS活化之聚乙二醇以AvPAL變異體之每個離胺酸殘基3個聚乙二醇之比率反應來達成。
  8. 如請求項4之AvPAL變異體，其中該AvPAL變異體之位置2、10、32、145、195、301、413、493及522之離胺酸殘基中至少28%經聚乙二醇化。
  9. 如請求項4之AvPAL變異體，其中該AvPAL之位置2、10、195、413、493及522之離胺酸殘基中至少51%經聚乙二醇化。
  10. 如請求項4之AvPAL變異體，其中該AvPAL之位置2、10、195、493及522之離胺酸殘基中至少75%經聚乙二醇化。
  11. 一種醫藥組合物，其包含如請求項4之AvPAL變異體及醫藥學上可接受之載劑。
  12. 一種如請求項4之AvPAL變異體之用途，其係用於製備治療個體中完全或部分由苯丙胺酸羥化酶(hydroxylase)(PAH)不足所引起之疾病的藥物。
  13. 如請求項12之用途，其中該疾病之特徵為高苯丙胺酸含量。
  14. 如請求項12或13之用途，其中該個體具有正常PAH活性之約10%或更低的活性。
  15. 一種如請求項4之AvPAL變異體的用途，其係用於製備治療個體典型重度苯酮尿症(PKU)的藥物，其中該藥物包含該AvPAL變異體之量足以降低該個體血漿中苯丙胺酸的濃度。
  16. 如請求項15之用途，其中該個體具有突變苯丙胺酸羥化酶(PAH)。
  17. 如請求項16之用途，其中該突變PAH包含PAH之催化域中之突變。
  18. 如請求項17之用途，其中該突變包含一或多個選自由以 下組成之群的突變：F39L、L48S、I65T、R68S、A104D、S110C、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、K320N、A373T、V388M、E390G、A395P、P407S及Y414C。
  19. 一種如請求項4之AvPAL變異體的用途，其係用於製備治療孕婦高苯丙胺酸血症(HPA)之藥物，其中該製備之藥物係用以與蛋白質限制性膳食組合投與該孕婦，且其中該藥物與該蛋白質限制性膳食之組合投與相較於不進行該組合投與，可有效地降低該孕婦之血漿苯丙胺酸濃度。
  20. 一種如請求項4之AvPAL變異體之用途，其係用於製備治療個體高血漿苯丙胺酸含量的藥物，其中該藥物包含該AvPAL變異體之量可產生降低該個體血漿中苯丙胺酸濃度的效果。
  21. 一種如請求項4之AvPAL變異體的用途，其係用於製備治療年齡在0歲與3歲之間之嬰兒苯酮尿症(PKU)的藥物，且該嬰兒具有之血漿苯丙胺酸濃度為約360μM至約4800μM，其中該藥物包含該AvPAL變異體之量可產生降低該嬰兒血漿中苯丙胺酸濃度的效果。
  22. 一種如請求項4之AvPAL變異體之用途，其係用於製備降低個體高血漿苯丙胺酸含量的藥物，其中該藥物包含該AvPAL變異體之量足以降低該個體血漿中苯丙胺酸的濃度。
  23. 如請求項22之用途，其中在投與該AvPAL前，該個體之 血漿苯丙胺酸濃度大於約200μM。
  24. 如請求項22或23之用途，其中該量以降低該個體之血漿苯丙胺酸濃度達10%或更多。
  25. 如請求項22或23之用途，其中該個體之PAH活性不足。
  26. 如請求項22或23之用途，其中該個體具有突變PAH。
  27. 如請求項26之用途，其中該突變PAH包含PAH之催化域中之突變。
  28. 如請求項27之用途，其中該突變包含一或多個選自由以下組成之群的突變：F39L、L48S、I65T、R68S、A104D、S110C、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、K320N、A373T、V388M、E390G、A395P、P407S及Y414C。
  29. 如請求項22或23之用途，其中該藥物係製備以與蛋白質限制性膳食一同投與個體。
  30. 如請求項22或23之用途，其中該個體具有PKU。
  31. 如請求項30之用途，其中該PKU為典型重度PKU。
  32. 如請求項22或23之用途，其中該個體為懷孕女性。
  33. 如請求項32之用途，其中該藥物係製備以與蛋白質限制性膳食組合投與該懷孕女性。
  34. 如請求項22或23之用途，其中該個體為年齡在0歲與3歲之間。
  35. 如請求項12、13及15至23中任一項之用途，其中該個體為人類。
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