PT2152868E - Composições de amónia-liase de fenilalanina procariótica e métodos de utilização das referidas composições - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "Composições de amónia-liase de fenilalanina procariótica e métodos de utilização das referidas composições"

CAMPO TÉCNICO DO INVENTO São aqui proporcionadas variantes da amónia-liase de fenilalanina (PAL) procariótica e composições destas, e otimização de tais composições para aumentar a atividade catalítica e a estabilidade de PAL reduzindo ao mesmo tempo a imunogenicidade e/ou a sensibilidade proteolítica de PAL. É também aqui proporcionada a utilização de tais composições ótimas de PAL para fins terapêuticos e industriais.

ANTECEDENTES DO INVENTO PAL é uma enzima não mamífera amplamente distribuída em plantas (Koukol, et al., J. Biol. Chem. 236:2692-2698 (1961); Hanson, et al. , The Enzymes 7:75-166 (1972); Poppe, et al. ,

Curr. Org. Chem. 7:1297-1315 (2003)), alguns fungos (Rao, et al., Can. J. Biochem. 4512:1863-1872 (1967); Abell, et al.,

Methods Enzymol. 142:242-253 (1987)) e bactérias (Bezanson, et al., Can. J. Microbiol. 16:147-151. (1970); Xiang, et al., J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002); Hill, et al., Chem.

Commun. 1358-1359 (2003)) e pode ser produzida de forma recombinante em Escherichia coli.

Uma lista representativa de PAL inclui: Q9ATN7 Agastache rugosa; 093967 Amanita muscaria (Agário-das-moscas) ; P35510, P45724, P45725, Q9SS45, Q8RWP4 Arabidopsis thaliana (Arabeta); Q6ST23 Bambusa oldhamii (Bambu gigante); Q42609 Bromheadia finlaysoniana (Orquídia); P45726 Camellia sinensis (Chá); Q9MAX1 Catharanthus roseus (Vinca-de-gato) (Vinca-de-Madagáscar); Q9SMK9 Cicer arietinum (Grão-de-bico); Q9XFX5, Q9XFX6 Citrus Clementina χ Citrus reticulate; Q42667 Citrus limon (Limoeiro); Q8H6V9, Q8H6W0 Coffea canephora (Café robusta); Q852S1 Daucus carota (Cenoura); 023924) Digitalis lanata (Dedaleira); 023865) Daucus carota (Cenoura); P27991

Glycine max (Soja); 004058) Helianthus annuus (Girassol comum); P14166, (Q42858) Ipomoea batatas (Batata doce); Q8GZR8, Q8W2E4 Lactuca sativa (Alface); 049835, Q49836

Lithospermum erythrorhizon; P35511, P2 6600 Lycopersicon esculentum (Tomateiro) ; P35512 Malus domestica (Madeira) (Malus sylvestris); Q94C45, Q94F89 Manihot esculenta (Cassava) (Manioc); P27990 Medicago sativa (Alfalfa); P25872, P35513, P45733 Nicotiana tabacum (Tabaco comum); Q6T1C9

Quercus suber (Sobreiro); P14717, P53443, Q7M1Q5, Q84VE0, Q84VE0 Oryza sativa (Arroz); P45727 Persea americana (Abacate); Q9AXI5 Pharbitis nil (Violeta) (Campainhas); P52777 Pinus taeda (Pinheiro do Arkansas); Q01861, Q04593

Pisum sativum (Ervilha de jardim); P24481, P45728, P45729

Petroselinum crispum (Salsa) (Petroselinum hortense); Q84LI2 cultivar híbrida Phalaenopsis x Doritaenopsis; P07218, P19142, P19143 Phaseolus vulgaris (Feijão comum) (Feijão francês); Q7XJC3, Q7XJC4 Pinus pinaster (Pinheiro-bravo); Q6UD65 Populus balsamifera subsp. trichocarpa χ Populus deltoides; P45731, Q43052, 024266 Populus kitakamiensis (Faia); Q8H6V5, Q8H6V6 Populus tremuloides (Choupo americano); P45730 Populus trichocarpa (Álamo); 064963 Prunus avium (Cerejeira); Q94EN0 Rehmannia glutinosa; P11544

Rhodosporidium toruloides (Levedura) (Rhodotorula gracilis); P10248 Rhodotorula rubra (Levedura) (Rhodotorula mucilaginosa) ; Q9M568, Q9M567 Rubus idaeus (Framboesa); P31425, P31426 Solanum tuberosum (Batata); Q6SPE8 Stellaria longipes (Estelária-de-caule-longo); P45732 Stylosanthes humilis (Alfafa anual); P45734 Trifolium subterraneum (Trevo subterrâneo); Q43210, Q43664 Triticum aestivum (Trigo); Q96V77 Ustilago maydis (Carvão do milho); P45735 Vitis vinifera (Videira); e Q8VXG7 Zea mays (Milho).

Numerosos estudos focaram-se na utilização da enzima amónia-liase de fenilalanina (PAL, EC 4.3.1.5), para tratamento de substituição enzimática de fenilcetonúria (PKU) (Hoskins et ai., Lancet, 1(8165):392-394 (1980); Gilbert, et ai., Biochem. J. 199(3):715-723 (1981); Hoskins, J.A., et ai., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 35(2):275-282 (1982); Sarkissian, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96(5):2339-2344 (1999); Liu, et ai., Artif. Cells Blood

Substit. Immobil. Biotechnol. 30(4):243-257 (2002); Wieder, K.J., J. Biol. Chem. 254(24):12579-12587 (1979); Gamez, et ai., Mol. Ther. 11(6):986-989 (2005); Ambrus, et ai., J.

Pharmacol. Exp. Ther. 224(3):598-602 (1983); Ambrus, et al.,

Science 201(4358):837-839 (1978); Kalghatgi, Res. Commun.

Chem. Pathol. Pharmacol. 27(3):551-561 (1980); Ambrus, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 37(1):105-111 (1982);

Gilbert, et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 131(2) :557-563 (1985); Pedersen, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 20(3):559-569 (1978); Marconi, et al., Biochimie 62 (8 — 9) :575-580 (1980); Larue, et al., Dev. Pharmacol. Ther. 9(2):73-81- (1986); Ambrus, C.M., et al. , Ann. Intern. Med. 106(4):531-537 (1987); Bourget, et al. , Appl. Biochem. Biotechnol. 10:57-59 (1984); Bourget, et al., FEES Lett. 180(1):5-8 (1985); Bourget, et al., Biochim. Biophys. Acta 883(3):432-438 (1986); Chang, et al. , Artif. Cells Blood Substit.

Immobil. Biotechnol. 23(1):1-21 (1995); Chang, et al., Mol.

Biotechnol. 17(3):249-260 (2001); Patente U.S. No. 5,753,487). PKU é um erro inato do metabolismo dos aminoácidos que resulta da atividade deficiente da fenilalanina-hidroxilase hepática (PAH), a enzima responsável pelo metabolismo da fenilalanina. Os pacientes com mutações em PAH que levam a PKU e hiperfenilalaninemia (HPA) apresentam níveis elevados de fenilalanina, funcionamento neurofisiológico deficiente e desenvolvimento cognitivo reduzido. Para os pacientes com PKU grave, há o potencial de atraso mental irreversível a menos que os níveis de fenilalanina sejam mantidos a níveis baixos utilizando restrições dietéticas. A PAL converte a fenilalanina em amónia e ácido transcinâmico, um metabolito inofensivo, que é ainda metabolizado e excretado na urina como hipurato (Hoskins et al. , (1980) ibid; Hoskins, et al.,

Biomed. Mass. Spectrom. 11(6): 296-300 (1984)). O tratamento atual para a PKU envolve a adesão para toda a vida a uma dieta que seja pobre no aminoácido fenilalanina (Levy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(5):1811-1813 (1999)).

Esta terapia dietética é difícil de manter (Matalon, et al., Genet. Med. 6(1): 27-32 (2004); Woolf, et al. , Arch. Dis.

Child. 33(167):31-45 (1958); Kim, Mol. Ther. 10(2):220-224 (2004)) e nem sempre elimina os efeitos neurológicos prejudiciais que podem ser causados por elevados níveis de fenilalanina (Sarkissian, et al., Mol. Genet. Metab. 69:188-194 (2000)) . Um controlo dietético que seja ótimo durante a gravidez pode levar a defeitos congénitos (Levy, (1999) ibid.) . Além disso, é muito difícil para os pacientes com PKU/HPA viver uma vida normal seguindo a dieta restritiva, e a terapia dietética pode estar associada a deficiências de vários nutrientes, algumas das quais são prejudiciais para o desenvolvimento do cérebro (Levy, (1999) ibid) . A maioria dos produtos de dieta pobre em fenilalanina tem propriedades organoléticas suficientemente insatisfatórias para que a adesão a este tratamento esteja comprometida (Levy, (1999) ibid) . Portanto, o desenvolvimento de um tratamento terapêutico poderia substituir ou suplementar o tratamento dietético atual e prevenir os danos neurológicos infligidos nesses indivíduos com PKU, particularmente para aqueles pacientes com as formas mais graves da doença.

Em 1999, Scriver e colegas relataram os seus estudos iniciais sobre a utilização da enzima PAL de Rhodosporidium toruloides (Sarkissian, et ai., (1999) ibid) para aplicações de substituição enzimática em PKU. Estudos do modelo de PKU e HPA de ratinho demonstraram que a administração de PAL (quer através de injeção i.p. que oralmente utilizando PAL em combinação com o inibidor de aprotinina-proteases ou PAL expressa de forma recombinante e presente dentro de células de E. coli) estava associada a níveis mais baixos de fenilalanina no plasma sanguíneo. Além disso, estudos preliminares descrevendo a utilização de PAL com pacientes de PKU mostraram redução nos níveis de fenilalanina utilizando PAL administrada em cápsulas de gelatina com revestimento entérico (Hoskins, et ai., (1980) ibid.) ou utilizando uma fábrica extracorpórea de enzimas (Ambrus, et ai., Ann. Intern. Med. 106(4):531-537 (1987)). Estes estudos sugerem que se a PAL for protegida contra a degradação proteolítica, reduções significativas de Phe plasmática podem ser conseguidos através de administração oral. A utilização de PAL para tratamento do cancro foi também sugerida com base na sua capacidade para limitar o fornecimento de nutrientes de fenilalanina às células de cancro e inibindo assim o crescimento neoplásico (Fritz, et ai., J. Biol. Chem.: 251(15):726 (1976); Roberts, et ai., Cancer Treat. Rep. 60(3):261-263 (1976); Shen, et al., Cancer Res. 37(4):1051-1056 (1977); Shen, et al., Cancer Treat. Rep. 63(6):1063-1068 (1979); Wieder, et al., J. Biol. Chem. 254(24):12579-12587 (1979)). No entanto, a PAL peguilada injetada por via intravenosa foi eliminada rapidamente do sangue em circulação após a 13a injeção. Além disso, a redução de fenilalanina mediada por PAL impediu a proliferação de leucemia e de melanoma metastático de murídeo (Abell, et al., Cancer Res. 33:2529-2532 (1973); Roberts, et al. , (1976) ibid.; Shen, et al., (1977) ibid) . A PAL bacteriana da bactéria marinha Streptomyces maritimus pode servir como uma fonte importante do agente bacteriostático enterocina. A PAL de S. maritimus, EncP, catalisa o passo inicial na síntese de enterocina, que é a conversão de fenilalanina em ácido transcinâmico (Xiang, et al., J. Biol. Chem. 277: 32505-32509 (2002)). A PAL pode ser utilizada para síntese industrial de éster metílico de L-fenilalanina (para produção de Aspartame) (D'Cunha, et al., Enzyme and Microbial Technology 19(6):421-427 (1996); Hamilton, et al. , Trends in Biotechnol. 3(3):64-68 (1985)) e outros derivados substituídos de L-fenilalanina que são utilizados como precursores farmacêuticos (Pedido de Patente U.S. 20020102712) . A PAL pode também ter aplicações agrícolas, em que a PAL participa no processo enzimático inicial que conduz aos fenilpropanoides que produzem lenhinas, cumarinas e flavonoides em plantas, fungos e bactérias. Assim, a modulação da atividade de PAL pode influenciar vários fenómenos agrícolas tais como o escurecimento da fruta. Além disso, a concepção de fármacos com base na estrutura de inibidores do local ativo de PAL poderia levar a herbicidas eficazes (Poppe, et al., ibid.).

Embora potencialmente a PAL tenha várias aplicações industriais e terapêuticas, a utilização de PAL pode ser limitada pela atividade específica reduzida e instabilidade proteolítica. Semelhante a outras proteínas terapêuticas, o uso de PAL como terapia enzimática é acompanhado por várias desvantagens tais como imunogenicidade e sensibilidade proteolítica. Além disso, é necessário um equilíbrio delicado entre a afinidade do substrato e a atividade da enzima para atingir e manter o controlo dos níveis de fenilalanina no plasma dentro de um intervalo normal relativamente estreito em distúrbios caracterizados por hiperfenilalanemia. Até agora, um esforço concertado para melhorar estes parâmetros não foi feito devido a uma escassez de conhecimento estrutural e bioquímico em relação a esta proteína.

Assim, continua a haver a necessidade de moléculas de PAL com características cinéticas ótimas incluindo uma potente atividade catalítica e uma maior semivida biológica, maior estabilidade bioquímica e/ou imunogenicidade atenuada.

SUMÁRIO DO INVENTO Várias PAL bacterianas foram já identificadas como parte da família HAL/PAL, incluindo a PAL de Streptomyces maritimus (também conhecida como EncP, SEQ ID N0:5, FIGURA 4), PAL/HAL de Nostoc punctiforme (Acesso ZP_00105927 de Nostoc punctiforme ATCC 29133, apresentado a 1 de outubro de 2004, NCBI Microbial Genomes Annotation Project) (SEQ ID NO:2, FIGURA 4), PAL/HAL de Anabaena variabilis (Gene ID 3679622, amónia-liase de fenilalanina/histidina de Ava_3988 [Anabaena variabilis ATCC 29413, 31 de março de 2006 (SEQ ID NO:4, FIGURA 4), o procariota fotossintético Anacystis nidulans (Lofflehardt, Z. Naturforsch 31(11-12):693-9 (1976)), as bactérias gram-negativas da família Enterobacteriaceae, Photorabdus luminescens TT01 (Williams, et al. , Microbiology 151:2543-2550 (2005)), Streptomyces verticillatus (Bezanson, et al. , Can. J. Microbiol. 16(3):147-51 (1970)). Mais, a atividade da PAL foi avaliada em Streptomyces maritimus (Xiang, L., et al., J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)). Cianobactérias, tais como Anabaena e Nostoc foram estudadas em relação à sua produção de produtos naturais bioativos que são gerados através das vias biossintéticas mistas de policétidos-péptidos (Moore, B.S., Natural Products Reports 22(5):580-593 (2005); Becker, et al., Gene 325:35-42 (2004); Hoffman, et al., Gene 311:171-180 (2003)). O invento baseia-se na descoberta de que a PAL procariótica ou bacteriana pode servir como tratamento eficaz para PKU e outros distúrbios. O presente invento proporciona uma variante de amónia-liase de fenilalanina de Anabaena variabilis (AvPAL) em que a referida variante de AvPAL tem uma maior atividade conversora de fenilalanina e/ou uma imunogenicidade reduzida em comparação com uma AvPAL de tipo selvagem (SEQ ID N0:4), em que um ou mais resíduos de cisteína selecionados a partir do grupo consistindo em resíduos de cisteína na posições 503 e 565 foram substituídos por um resíduo de serina. Numa concretização particular, o resíduo de cisteína na posição 565 de AvPAL foi substituído por um resíduo de serina (SEQ ID NO:10). Noutra concretização, os resíduos de cisteína nas posições 503 e 565 de AvPAL foram substituídos por um resíduo de serina (SEQ ID NO:11). Noutra concretização, a variante de AvPAL compreende ainda um polímero solúvel em água, de preferência um polietilenoglicol. Noutra concretização, a variante de AvPAL é obtenível fazendo reagir a variante de AvPAL com polietilenoglicol ativado com NHS a uma razão de 3 polietilenoglicol por resíduo de lisina da variante de AvPAL. O presente invento proporciona ainda uma composição farmacêutica para utilização em tratamento de uma doença de metabolismo de aminoácidos compreendendo a variante de AvPAL de acordo com o invento e um transportador farmaceuticamente aceitável. O presente invento proporciona ainda uma composição compreendendo a variante de AvPAL do invento para utilização em tratamento de uma doença causada no todo ou em parte por uma deficiência em fenilalanina-hidroxilase (PAH). Numa concretização, a doença é caracterizada por níveis elevados de fenilalanina. Noutra concretização, a composição é preparada para tratamento de um sujeito possuindo 10% ou menos de uma atividade normal de PAH. Noutra concretização, a variante de AvPAL do invento é utilizada em tratamento de um humano sofrendo de fenilcetonúria (PKU). O presente invento proporciona ainda uma composição compreendendo a variante de AvPAL do invento para utilização em tratamento de PKU grave clássica, em que a composição é eficaz a baixar a concentração de fenilalanina no plasma de um sujeito em comparação com a referida concentração na ausência de administração da referida composição.

Numa concretização, o referido sujeito foi diagnosticado como possuindo uma PAH mutante. Noutra concretização, a referida PAH mutante compreende uma mutação no domínio catalítico de PAH, ou uma ou mais mutações selecionadas a partir do grupo consistindo em F39L, L48S, I65T, R68S, A104D, S110C, D129G, E178G, V190A, P211T, R241C, R261Q, A300S, L308F, A313T, K320N, A373T, V388M E390G, A395P, P407S, e Y414C. 0 presente invento proporciona ainda uma composição compreendendo a variante de AvPAL do invento para utilização em tratamento de uma fêmea grávida possuindo hiperfenilalaninemia (HPA), em que a composição é preparada para ser administrada em combinação com uma dieta com restrição de proteínas, em que a administração combinada da composição e a dieta com restrição de proteínas é eficaz a baixar a concentração de fenilalanina no plasma da referida fêmea, em comparação com a referida concentração na ausência de administração da referida combinação. 0 presente invento proporciona ainda uma composição compreendendo a variante de AvPAL do invento para utilização em tratamento de um bebé possuindo PKU, em que a composição é preparada para ser administrada a um bebé entre os 0 e os 3 anos de idade e possuindo uma concentração plasmática de fenilalanina de entre 360 μΜ a 4800 μΜ, e em que a composição é preparada para ser administrada numa quantidade eficaz para produzir uma diminuição na concentração plasmática de fenilalanina do referido bebé. O presente invento proporciona ainda uma variante de AvPAL em que os resíduos de cisteína nas posições 503 e 565 de AvPAL foram substituídos com resíduos de serina (SEQ ID. NO. 11) . Numa concretização, a AvPAL é opcionalmente peguilada. Noutra concretização, a referida peguilação é alcançável fazendo reagir a variante de AvPAL com polietilenoglicol ativado com NHS a uma razão de pelo menos 1,6 polietilenoglicol por resíduo de lisina da variante de AvPAL. Noutra concretização, a referida peguilação é alcançável fazendo reagir a variante de AvPAL com polietilenoglicol ativado com NHS a uma razão de pelo menos 2,4 polietilenoglicol por resíduo de lisina da variante de AvPAL.

Noutra concretização, a referida peguilação é alcançável fazendo reagir a variante de AvPAL com polietilenoglicol ativado com NHS a uma razão de 3 poliet ilenoglicol por resíduo de lisina de variante de AvPAL. Noutra concretização, pelo menos 28 porcento de resíduos de lisina nas posições 2, 10, 32, 145, 195, 301, 413, 493, e 522 da variante de AvPAL estão peguilados; em que pelo menos 51 porcento dos resíduos de lisina nas posições 2, 10, 195, 413, 493, e 522 da AvPAL estão peguilados. Noutra concretização, pelo menos 75 porcento dos resíduos de lisina nas posições 2, 10, 195, 493, e 522 da variante de AvPAL estão peguilados. São também aqui descritas composições de PAL bacteriana e fragmentos, mutantes, variantes e análogos desta biologicamente ativos com propriedades melhoradas, tais como uma atividade catalítica mais potente, maior estabilidade bioquímica e, para aplicações terapêuticas, imunogenicidade atenuada e maior semivida biológica. São também aqui descritos métodos de produção e purificação de PAL bacteriana e fragmentos, mutantes, variantes e análogos destes biologicamente ativos, e métodos de utilização de tais composições para fins terapêuticos e industriais.

Tal como aqui utilizado, "PAL bacteriana" e "PAL procariota" são utilizados de forma intercambiável para significar (1) PAL de tipo selvagem de organismos procariotas, PAL de Streptomyces maritimus (também conhecida como EncP, SEQ ID NO:5, FIGURA 4), Nostoc punctiforme (SEQ ID NO:2, FIGURA 4), Anabaena variabilis (SEQ ID NO:4, FIGURA 4), Anacystis nidulans (Loftlehardt, (1976) ibid.), Photorabdus luminescens TT01 (Williams, et ai., (2005) ibid), e Streptomyces verticillatus (Bezanson, et ai., (1970) ibid.); (2) fragmentos, mutantes, variantes e análogos de tais enzimas de tipo selvagem que retém uma atividade catalítica semelhante (i.e., pelo menos 50%) para a fenilalanina, e que, nalgumas concretizações, exibem maior atividade catalítica e/ou maior semivida e/ou menor imunogenicidade, e (3) versões quimicamente modificadas de tais enzimas de tipo selvagem, fragmentos, mutantes, variantes e análogos desta que tenham sido ligados a outras porções químicas que proporcionem outros efeitos vantajosos, tais como maior semivida. Por exemplo, quaisquer referências a métodos de produção ou utilização de PAL procariótica, fragmentos, mutantes, variantes, análogos ou versões quimicamente modificadas desta, e composições de tal ou de tais enzimas, quer para fins terapêuticos quer industriais, destinam-se a referir métodos de produção, utilização ou formulação do tipo selvagem e todos esses fragmentos, mutantes, variantes, análogos ou modificações químicas deste. É aqui descrita a PAL bacteriana e fragmentos, mutantes, variantes ou análogos biologicamente ativos desta. É especificamente descrita uma PAL bacteriana de Nostoc punctiforme (SEQ ID N0:2) ou fragmento, mutante, variante ou análogo desta biologicamente ativo. É especificamente descrita uma PAL bacteriana de Anabaena variabilis (SEQ ID NO:4) ou fragmento, mutante, variante ou análogo biologicamente ativo desta. Nalgumas concretizações, as variantes retêm os resíduos do local ativo de tipo selvagem nas posições correspondendo a Ser210, tríade Ala-Ser-Gly (211-213), Asp214, Leu215, Asn270, Val269, Leu266, Leul34, Hisl37, Lys468, Glu496, Gin 500 em PAL de Rhodosporidium toruloides ou à substituição ou substituições conservativas deste ou destes resíduos do local ativo, dos quais se crê que a tríade Ala-Ser-Gly em 211-213 seja o local de ligação para a fenilalanina.

Variantes desejáveis podem incluir proteínas em que um ou mais resíduos de cisteína foram substituídos por outro resíduo de aminoácido (p. ex., serina) para reduzir a agregação da proteína que pode estar associada a uma menor atividade enzimática, maior imunogenicidade, e/ou outros efeitos desvantajosos in vivo.

Variantes desejáveis podem incluir proteínas de fusão em que a enzima foi fundida com outro polipéptido heterólogo, tal como uma região constante nativa ou modificada de uma imunoglobulina ou um fragmento desta que mantém o epitopo de salvamento, que se sabe na técnica que aumenta a semivida. O invento contempla ainda versões quimicamente modificadas de tais polipéptidos, os quais foram ligados a uma porção química que proporciona outros efeitos vantajosos. Por exemplo, sabe-se na técnica que a ligação não específica ou específica do local (p. ex., N-terminal) de polímeros solúveis em água a polipéptidos melhora a semivida, e a ligação de porções guímicas pode também reduzir a imunogenicidade e melhorar a resistência a proteases.

Tal PAL bacteriana é isolada e purificada de acordo com os métodos agui descritos e está assim presente em guantidades gue permitem utilizar a enzima terapeuticamente. Especificamente, é utilizado um ADNc codificando para uma PAL bacteriana completa ou de tipo selvagem. No entanto, pode ser utilizado um ADNc codificando para um fragmento ou mutante biologicamente ativo desta. Além disso, são descritas composições de PAL bacteriana otimizada obtida através de abordagens de engenharia molecular baseada na estrutura e/ou formas guimicamente modificadas (p. ex., peguiladas) de PAL. Exemplos específicos contemplam composições ótimas de PAL com atividade específica melhorada, maior estabilidade, imunogenicidade reduzida e/ou sensibilidade proteolítica apropriada para utilização terapêutica. Um exemplo é uma forma peguilada de PAL de Nostoc punctiforme com atividade específica melhorada. Outro exemplo é uma forma peguilada de PAL de Anabaena variabilis com melhor atividade específica. A peguilação de uma variante de PAL é descrita com referência à razão de PAL:PEG ou PEG:PAL. Tal como aqui utilizado, e a menos que indicado em contrário, a razão de "PAL:PEG" refere-se à razão de resíduos de lisina na variante de PAL para moléculas de PEG na reação de peguilação. Semelhantemente, tal como aqui utilizado, e a menos que indicado em contrário, a razão de "PEG:PAL" refere-se à razão de moléculas de PEG para resíduos de lisina na variante de PAL na reação de peguilação. São aqui descritas variantes de PAL peguiladas com imunogenicidade reduzida. É também descrita uma forma peguilada de variante de PAL de Nostoc punctiforme (NpPAL) com imunogenicidade reduzida. É também descrita uma forma peguilada de variante de PAL de Anabaena variabilis (AvPAL) com imunogenicidade reduzida. São também descritas variantes de NpPAL ou AvPAL em que a peguilação é alcançada fazendo reagir a variante de NpPAL ou AvPAL com um polímero solúvel em água, p. ex., polietilenoglicol (PEG). Em particular, uma peguilação é alcançada fazendo reagir a variante de NpPAL ou AvPAL uma vez com PEG a uma razão de pelo menos 1:1, pelo menos 1:1,5, pelo menos 1:2, pelo menos 1:3, ou pelo menos 1:4 PAL:PEG. Especificamente, a variante de PAL é uma variante de AvPAL, e a peguilação é alcançada utilizando uma razão de PAL:PEG de 1:3. 0 invento contempla também a repeguilação de variantes de PAL peguiladas para imunogenicidade reduzida. Tal como aqui descrito, a peguilação é alcançada fazendo reagir a variante de NpPAL ou AvPAL duas vezes ou mais, com PEG, cada peguilação a uma razão de pelo menos 1:1, pelo menos 1:1,5, pelo menos 1:2, pelo menos 1:3., ou pelo menos 1:4 PAL:PEG. Especificamente, a peguilação é alcançada fazendo reagir a variante de NpPAL ou AvPAL duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, ou mais, com PEG, cada peguilação a uma razão de pelo menos 1:1, pelo menos 1:1,5, pelo menos 1:2, pelo menos 1:3., ou pelo menos 1:4 PAL:PEG. Especificamente, a variante de PAL é uma variante de AvPAL, e a peguilação é alcançada utilizando uma razão de PAL:PEG de 1:3 tanto para a primeira como para a segunda reação de peguilação.

Os locais biologicamente ativos de PAL de tipo selvagem podem ser modificados tal como descrito para otimizar as características cinéticas de PAL. Especificamente, uma PAL modificada tem atividade suficiente para reduzir mas também manter os níveis plasmáticos de fenilalanina dentro do intervalo ótimo de cerca de 120 μΜ a cerca de 240 μΜ. Alternativamente, a PAL modificada biologicamente ativa tem uma kcat de pelo menos cerca de 0,1 s_1 ou mais de cerca de 0,5 s_1. Mais especificamente, a PAL modificada biologicamente ativa tem uma kcat de pelo menos cerca de 0,2 s_1 ou mais de cerca de 1,0 s_1. Especif icamente, a PAL modificada biologicamente ativa tem uma Km de entre cerca de 10 μΜ e cerca de 1000 μΜ, de preferência entre cerca de 100 μΜ e cerca de 1000 μΜ. Especif icamente, a PAL modificada biologicamente ativa exibe atividade enzimática que é de cerca de duas vezes a cerca de 1000 vezes mais elevada que a do tipo selvagem, de preferência é de cerca de 10% a 100% mais elevada que a do tipo selvagem. Tais proteínas PAL modificadas biologicamente ativas podem ser formadas utilizando métodos bem conhecidos na técnica, tal como através de mutagénese dirigida ao local. Além disso, é descrita a utilização de PAL bacteriana que metaboliza fenilalanina (i.e., converte a fenilalanina noutra substância) na preparação de um medicamento para o tratamento de uma deficiência na atividade de PAH, em mamíferos, em particular, humanos, assim como uma composição farmacêutica contendo PAL bacteriana para utilização em tratamento de uma deficiência na atividade de PAH. Especificamente, a composição farmacêutica compreende PAL altamente purificada derivada de bactérias, ou um fragmento, mutante ou análogo biologicamente ativo desta sozinho ou em combinação com um transportador farmaceuticamente adequado. Especificamente, as preparações contêm PAL bacteriana com uma pureza superior a 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,2%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9%. Especificamente, a atividade específica relativa da PAL bacteriana de acordo com o presente invento é superior a cerca de 110% da atividade específica da PAL de tipo selvagem. São também aqui descritos novos métodos de utilização de composições de PAL para fins terapêuticos e industriais. Assim, são descritos métodos de tratamento de distúrbios causados no todo ou em parte por uma deficiência na atividade de PAH através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo PAL bacteriana a um sujeito a necessitar de tal tratamento. A deficiência na atividade de PAH pode ser observada, p. ex., como níveis de atividade de 50% ou menos, 25% ou menos, ou 10% ou menos ou 1% ou menos, em comparação com níveis normais de atividade de PAH e podem manifestar-se como níveis elevados de fenilalanina, por exemplo, como em hiperfenilalanemia, fenilcetonúria moderada ou fenilcetonúria grave clássica. Especificamente, a doença é fenilcetonúria (PKU) .

Tal como aqui descrito, o sujeito é um que tenha sido diagnosticado como possuindo uma fenilalanina-hidroxilase (PAH) mutante. A PAH mutante pode compreender uma mutação no domínio catalítico de PAH. Exemplos de tais mutações incluem as mutações F39L, L48S, I65T, R68S, A104D, S110C, D129G, E178G, V190A, P211T, R241C, R261Q, A300S, L308F, A313T, K320N, A373T, V388M E390G, A395P, P407S, e Y414C. É também descrito um método de tratamento de um sujeito possuindo uma concentração acima do normal de fenilalanina plasmática (p. ex., superior a 180 μΜ ou 360 μΜ) compreendendo a administração ao sujeito de uma composição de PAL bacteriana numa quantidade eficaz para produzir uma diminuição da concentração plasmática de fenilalanina do sujeito. O sujeito terá provavelmente uma concentração plasmática de fenilalanina superior a 180 μΜ antes da administração da PAL bacteriana. Mais particularmente, o sujeito tem uma concentração plasmática de fenilalanina de entre 120 μΜ e 200 μΜ. Especif icamente, o sujeito tem uma concentração plasmática de fenilalanina de entre 200 μΜ e 600 μΜ de preferência entre 600 μΜ e 1200 μΜ. Ainda outra classe de sujeitos a tratar é aquela que tem uma concentração plasmática de fenilalanina sem restrições superior a 1200 μΜ.

Particularmente, o sujeito é um bebé, mais particularmente, um bebé possuindo uma concentração plasmática de fenilalanina superior a 1200 μΜ. São descritos métodos de tratamento de um bebé possuindo fenilcetonúria, compreendendo a administração de uma composição de PAL bacteriana ao sujeito numa quantidade eficaz para produzir uma diminuição na concentração plasmática de fenilalanina do bebé em que o bebé tem entre 0 e 3 anos de idade e o bebé tem uma concentração plasmática de fenilalanina de entre cerca de 360 μΜ a cerca de 4800 μΜ. Antes da administração de PAL bacteriana, o bebé tem uma concentração de fenilalanina de cerca de 1200 μΜ e a administração de PAL bacteriana diminui a concentração plasmática de fenilalanina para cerca de 1000 μΜ. Especificamente, antes da administração da PAL bacteriana o bebé tem uma concentração de fenilalanina de cerca de 800 μΜ e a administração de PAL diminui a concentração plasmática de fenilalanina para cerca de 600 μΜ. Mais especificamente, antes da administração da PAL o bebé tem uma concentração de fenilalanina de cerca de 400 μΜ e a administração de PAL diminui a concentração plasmática de fenilalanina para cerca de 300 μΜ. Mais especificamente, os métodos terapêuticos aqui contemplados devem reduzir a concentração plasmática de fenilalanina do bebé a um intervalo de entre cerca de 120 μΜ a cerca de 360 μΜ ou um intervalo de entre cerca de 120 μΜ a cerca de 240 μΜ. É também aqui descrito um método para o tratamento de uma fêmea grávida possuindo hiperfenilalaninemia (HPA) compreendendo a administração ao sujeito de PAL bacteriana sozinha ou em combinação com uma dieta com restrição de proteínas, em que a administração da PAL bacteriana sozinha ou em combinação com a dieta com restrição de proteínas é eficaz a baixar a concentração de fenilalanina no plasma do sujeito em comparação com a concentração na ausência da administração combinada. Assim, o sujeito tem uma concentração plasmática de fenilalanina sem restrições superior a 180 μΜ mas inferior a 600 μΜ. Especificamente, o sujeito tem uma concentração plasmática de fenilalanina sem restrições superior a 500 μΜ mas inferior a 1200 μΜ. Mais especificamente, o sujeito tem uma concentração plasmática de fenilalanina sem restrições superior a 1200 μΜ. As sujeitas grávidas com uma concentração plasmática de fenilalanina superior a 1200 μΜ são candidatos particularmente atrativos para este tipo de terapia génica, uma vez que são sujeitos que são fêmeas em idade de serem portadoras de bebés que estão a contemplar a gravidez. Nesses exemplos, o sujeito tem uma concentração plasmática de fenilalanina superior a 1200 μΜ, e o método compreende além disso a administração de uma dieta com restrição de proteínas ao sujeito. São aqui descritos métodos de tratamento de fenilcetonúria grave clássica (PKU) num sujeito compreendendo a administração ao sujeito de uma PAL bacteriana ou de um fragmento, mutante, variante ou análogo biologicamente ativo desta em que a administração de PAL bacteriana é eficaz a baixar a concentração de fenilalanina no plasma do sujeito em comparação com a concentração na ausência de administração de PAL bacteriana. Um sujeito selecionado para tratamento de acordo com os métodos aqui descritos terá uma elevada concentração plasmática de Phe, uma tal concentração pode ser superior a 1800 μΜ na ausência do agente terapêutico. Outros contemplam um sujeito que tenha uma concentração plasmática de fenilalanina superior a 1000 M na aêscia de um regime terapêutico. Os métodos de administração combinada do invento diminuem a concentração plasmática de fenilalanina do sujeito para menos de 600 μΜ. É diminuída para menos de 500 μΜ. A administração combinada diminui a concentração plasmática de fenilalanina do sujeito no intervalo de cerca de 120 μΜ a cerca de 360 μΜ. A concentração plasmática de fenilalanina do sujeito é reduzida no intervalo de cerca de 120 μΜ a cerca de 240 μΜ.

Certos exemplos incluem a otimização da dosagem para as necessidades do organismo a tratar, por exemplo, mamíferos ou humanos, para melhorar eficazmente os sintomas da doença. A PAL pode ser administrada numa única dose diária, múltiplas doses numa base diária, numa única dose semanal ou em múltiplas doses numa base semanal. Especificamente, a terapia de PAL não é contínua, mas em vez disso a PAL é administrada numa base diária até a concentração plasmática de fenilalanina do sujeito ser diminuída para menos de 360 μΜ. Especificamente, a concentração plasmática de fenilalanina do sujeito é monitorizada numa base diária e a PAL é administrada quando é observado um aumento de 10% na concentração plasmática de fenilalanina. As doses são distribuídas uma vez por semana. O método contempla doses de pelo menos 0,001 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,05 mg/kg, e podem variar até 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg ou mais por semana. Nalgumas concretizações, a dose é de 1 mg/kg/semana, 0,1 mg/kg/semana, ou 0,01 mg/kg/semana.

Uma variedade de vias parentéricas ou não parentéricas da administração, incluindo oral, transdérmica, transmucosa, intrapulmonar (incluindo em aerossol), intramuscular, subcutânea, ou intravenosa que distribui dosagens equivalentes está contemplada. A administração através de injeção de bolo ou infusão diretamente nas articulações ou CSF está também especificamente contemplada, tal como intratecal, intracerebral, intraventricular, via punção lombar, ou via a cisterna magna. De preferência, as doses são distribuídas por via subcutânea ou oral.

Outros meios de aumento da atividade de PAL nos sujeitos humanos estão também contemplados, incluindo terapia génica. A transferência de um gene de PAL é possível através de uma variedade de meios conhecidos na técnica, incluindo vetores virais, recombinação homóloga, ou injeção direta de ADN. São particularmente mencionadas sequências de ácido nucleico codificando toda ou uma parte de PAL bacteriana ou um mutante ou análogos desta biologicamente ativos, que possam ser administrados in vivo nas células afetadas com deficiência em PAH. A PAL bacteriana pode também ser administrada em combinação com uma dieta com restrição de proteínas. A dieta com restrição de proteínas administrada nos métodos aqui é uma dieta com restrição de fenilalanina em que a ingestão total de fenilalanina do sujeito está restringida a menos de 600 mg por dia, de preferência menos de 300 mg por dia. Especificamente, a dieta com restrição de proteínas é uma suplementada com aminoácidos, tais como tirosina, valina, isoleucina e leucina. É também contemplada uma composição compreendendo PAL bacteriana e um transportador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição pode ainda compreender um suplemento proteico médico. Alternativamente, a composição de PAL é parte de uma fórmula infantil. Alternativamente, o suplemento proteico é isento de fenilalanina. O suplemento proteico pode ser fortificado com L-tirosina, L-glutamina, L-carnitina a uma concentração de 20 mg/100 g de suplemento, L-taurina a uma concentração de 40 mg/100 g de suplemento e selénio. Pode ainda compreender as doses diárias recomendadas de minerais, p. ex., cálcio, fósforo e magnésio. O suplemento pode ainda compreender a dose diária recomendada de um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em L-leucina, L-prolina, acetato de L-lisina, L-valina, L-isoleucina, L-arginina, L-alanina, glicina, monoidrato de L-asparagina, L-triptofano, L-serina, L-treonina, L-histidina, L-metionina, ácido L-glutâmico e ácido L-aspártico. Além disso, o suplemento pode ser fortificado com a dose diária recomendada de vitaminas A, D e E. O suplemento pode compreender um teor de gordura que proporcione pelo menos 40% da energia do suplemento. Um tal suplemento pode ser proporcionado na forma de um suplemento em pó ou na forma de uma barra proteica. São também aqui descritos métodos de tratamento de várias formas de crescimento neoplásico e cancro, incluindo leucemia linfoblástica, tumores mamários e melanomas.

Particularmente descritos são métodos de utilização de PAL bacteriana para a produção comercial de fenilalanina a partir de amónia e transcinamato. A fenilalanina é utilizada em aspartame, um adoçante e outros produtos alimentares, incluindo bebidas, cereais, bolos, sobremesas, pratos de ovo e queijo, gorduras, óleos, peixes e outros produtos do mar, carne e produtos à base de carne, leite e produtos lácteos, nozes, molhos e condimentos, sopas, açúcares, compotas e produtos para barrar, e vegetais.

Está além disso contemplado que a PAL bacteriana pode ser utilizada para a produção de herbicidas e agentes antimicrobianos incluindo enterocina e eritromicina. É também aqui descrito um método para produzir PAL procariótica ou um fragmento, mutante, variante ou análogo desta biologicamente ativo em quantidades que permitam a utilização da enzima de forma terapêutica. 0 método utiliza PAL produzida por bactérias incluindo Streptomyces, Sorangium, Pseudomonas, e cianobactérias tais como Nostoc e Anabaena. Especificamente, a PAL é produzida pelas espécies bacterianas Streptomyces maritimus, S. verticillatus, Soragium cellulosum, Nostoc punctiforme, Nostoc tobacum, Anabaena variabilis, e Pseudomonas putida. Especificamente, a atividade enzimática da PAL procariótica é gerada utilizando ADNc ou sequências de ADN que são derivadas de sequências por vezes descritas como codificando para a atividade de HAL ou apresentando um motivo de PAL-HAL, mas possuindo resíduos chave de PAL que diferem de HAL.

Em particular, o método compreende o passo de transformação de um ADNc ou ADN codificando para toda ou uma parte de uma PAL procariótica ou um fragmento, mutante, variante ou análogo desta biologicamente ativo numa célula adequada para a expressão desta. Especificamente, é utilizado um vetor de expressão para transferência do ADN para uma célula ou linha celular adequada para expressão desta. Especif icamente, o ADNc é transformado em E. coli e a PAL bacteriana recombinante é sobre-expressa como proteína de fusão. Especificamente, o método de produção de PAL procariótica compreende os passos de: (a) cultura das células transformadas com um ADNc codificando toda a PAL procariótica ou uma variante, fragmento ou mutante desta biologicamente ativo num meio de crescimento adequado até uma densidade apropriada para produzir uma cultura de sementeira, (b) introdução das células transformadas num biorreator, (c) fornecimento de um meio de crescimento adequado ao biorreator, e (d) separação das células transfetadas do meio contendo a enzima.

Especificamente, a PAL recombinante é sobre-expressa como proteína de fusão etiquetada no terminal N com octa-histidilo num vetor tal como E. coli BL21(DE3)/pLyseS (Invitrogen) com um promotor indutível tal como com IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido) . Alternativamente, a PAL recombinante é sobre-expressa em células de E. coli BL21(DE3)/pLysS sem uma etiqueta N-terminal. Alternativamente, o método de produção de PAL procariótica compreende os passos de: (1) crescimento de uma cultura de sementeira para um biorreator/fermentador a partir de uma reserva em glicerol em balões de agitação; (2) introdução de tal cultura de sementeira num biorreator controlado em modo de alimentação por lotes; (3) crescimento da referida cultura em meio suplementado com glicose, pH (7,8), oxigénio dissolvido a >20%, agitação até 1200 rpm, 30°C até se atingir uma densidade celular de D0600 de 70-100 (-22-25 h) ; (4) indução da referida cultura com IPTG 0,4 mM; (5) crescimento da referida cultura a uma temperatura reduzida de 22 a 26°C até a mudança na atividade ser <0,1 IU/ml (aproximadamente 40-48 h e uma D0600 tipicamente de 200); e (5) colheita das bactérias através de centrifugação continua. Especificamente, o meio de cultura das células é tipicamente definido e constituído por proteína de extrato de levedura, peptona-triptona, glicose, glicerol, casaminoácidos, sais vestigiais e sais de fosfato tampão. É ainda aqui descrito um método para purificar PAL bacteriana ou um fragmento, mutante ou um análogo desta biologicamente ativo. Especificamente, uma massa de células transformadas é criada e rompida deixando enzima recombinante bruta. Os materiais exógenos são normalmente separados da massa bruta para evitar a incrustação das colunas. A purificação cromatográfica é realizada utilizando uma ou várias resinas cromatográficas. Subsequentemente, a proteína purificada é formulada num tampão concebido para proporcionar uma atividade estável durante um período de tempo prolongado.

Alternativamente, o método para purificar a PAL bacteriana compreende os passos de: (a) lise das bactérias contendo PAL recombinante; (b) tratamento do lisado com calor para inativar vírus; (c) clarificação deste lisado utilizando um segundo passo de centrifugação contínua e/ou filtração em profundidade; (d) passagem do lisado clarificado através de um passo de filtração em carvão vegetal; (e) passagem do filtrado em (d) através de um passo de filtração final (tal como um filtro Sartorious Sartopore de 0,2 pm); (f) passagem do filtrado final sobre uma resina de cromatografia de interação hidrófoba, tal como uma cromatografia de interação hidrófoba de butilo; (g) passagem do eluato em (f) através de uma resina de cromatografia aniónica, tal como uma coluna de permuta iónica Q; (h) recuperação do produto final através de mudança do tampão com filtração com fluxo tangencial; e (i) esterilização do produto final. Os peritos na técnica apreciarão prontamente que um ou mais dos passos de cromatografia podem ser omitidos ou substituídos ou que a ordem dos passos de cromatografia pode ser mudada dentro do âmbito do presente invento. Finalmente, passos de esterilização apropriados podem ser realizados como desejado.

Ainda aqui descritos estão ensaios de pesquisa para identificação de PAL bacteriana que podem prevenir, melhorar ou tratar níveis aumentados de fenilalanina através do contacto de uma célula contendo níveis elevados de fenilalanina com a PAL bacteriana e determinação de se a PAL bacteriana reduz tais níveis elevados de fenilalanina. Tais ensaios de pesquisa podem também incluir os passos de criação de variantes que incluam substituições conservativas ou não conservativas nos locais ativos, p. ex. Glyl42, tríade Thr-Ser-Gly (143-145), Aspl46, Leul47, Asnl96, Ilel95, Leul92, Leu76, Asn79, Met400, Thr428, Gln432 em EncP de Streptomyces maritimus que são equivalentes aos resíduos Ser210, tríade Ala-Ser-Gly (211-213), Asp214, Leu215, Asn270, Val269, Leu266, Leul34, Hisl37, Lys468, Gln496, Gln500 em PAL de Rhodosporidium toruloides, em regiões adjacentes aos locais ativos, ou em toda a sequência polipeptídica, seguidos de testes das variantes quanto à atividade de conversão de fenilalanina in vitro. Especificamente, o método é um ensaio de elevado rendimento. Especificamente, genomas completos de espécies bacterianas são sequenciados e pesquisados quanto à presença de homólogos de PAL utilizando uma abordagem bioinformática. Especificamente, a atividade catalítica de PAL do produto proteico de tais homólogos é confirmada, tal como através do teste da capacidade para converter fenilalanina em transcinamato in vitro. São ainda aqui descritos métodos de utilização de composições de PAL bacteriana para o diagnóstico de doenças, incluindo distúrbios causados no todo ou em parte por uma deficiência na atividade de PAH. Especificamente, a PAL bacteriana é utilizada para medir os níveis de fenilalanina em amostras de sangue. É também descrito um estojo de diagnóstico compreendendo PAL bacteriana para utilização em monitorização de amostras de sangue de sujeitos com níveis elevados de fenilalanina.

Outras características e vantagens do invento serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIGURA 1. Figura IA: Sequência génica de PAL de Nostoc punctiforme (SEQ ID N0:1); FIGURA 1B: Sequência proteica de PAL de Nostoc punctiforme (SEQ ID N0:2). FIGURA 2. FIGURA 2A: Sequência génica de PAL de Anabaena variabilis (SEQ ID N0:3); FIGURA 2B: Sequência proteica de PAL de Anabaena variabilis (SEQ ID NO:4). FIGURA 3. Árvore de parentesco amónia-liases de aminoácidos aromáticos de procariotas e eucariotas. As sequências foram obtidas a partir de Genbank (os números de acesso são indicados em parênteses) e alinhadas com ClustalX (1.83) utilizando o Método de União de Vizinhos. FIGURA 4. Alinhamento de sequências proteicas de cianobactérias de PAL de N. punctiforme (SEQ ID N0:2) e PAL de A. variabilis (SEQ ID N0:4) com PAL de EncP (SEQ ID. No. 5) e HAL de P. putida (SEQ ID NO:6). Os resíduos dos locais ativos, que correspondem à atividade de PAL ou HAL, estão realçados. FIGURA 5. Efeito de (A) NpPAL não peguilada (1,0 IU/ml) e (B) NpPAL peguilada a 1:3 de PAL:PEG (Nippon Oil and Fat, NOF Corporation) (1,0 IU/ml) nos niveis de fenilalanina (μΜ) ao longo de um periodo de 12 dias. FIGURA 6. Efeito de (A) AvPAL não peguilada (1,0 IU/ml) e (B) AvPAL peguilada a 1:3 de PAL:PEG (Nippon Oil and Fat, NOF Corporation) (1,0 IU/ml) nos niveis de fenilalanina (μΜ) ao longo de urn periodo de 12 dias. FIGURA 7. Efeito de NpPAL peguilada a 1:3 de PAL:PEG (Nippon Oil e Fat, NOF Corporation) (1,0 IU/ml) nos niveis de fenilalanina (μΜ) num estudo de tolerância crónica de 90 dias. FIGURA 8. FIGURA 8A: Sequência proteica de amónia-liase de fenilalanina (PAL) de Anabaena variabilis com uma substituição de cisteina para serina na posição 64 (AvPAL_C64S, SEQ ID NO:7) ; FIGURA 8B: Sequência proteica de PAL de Anabaena variabilis com uma substituição de cisteina para serina na posição 318 (AvPAL_C318S, SEQ ID NO:8); FIGURA 8C: Sequência proteica de PAL de Anabaena variabilis com uma substituição de cisteina para serina na posição 503 (AvPAL_C5 0 3S, SEQ ID NO:9); FIGURA 8D: Sequência proteica de PAL de Anabaena variabilis com uma substituição de cisteina para serina na posição 565 (AvPAL_C565S, SEQ ID NO:10); FIGURA 8A: Sequência proteica de PAL de Anabaena variabilis com substituições de cisteina para serina nas posições 503 e 565 (AvPAL_C565SC503S, SEQ ID NO: 11) . As substituições de cisteina para serina estão sublinhadas a negrito. FIGURA 9. FIGURA 9A: Efeito das substituições de cisteina para serina na posição 565 ou em ambas as posições 565 e 503 da AvPAL não peguilada na atividade enzimática especifica de PAL in vitro após incubação durante vários períodos de tempo a 37°C. FIGURA 9B: Efeito das substituições de cisteina para serina na posição 565 ou em ambas as posições 565 e 503 da AvPAL peguilada na atividade enzimática específica de PAL in vitro após incubação durante vários períodos de tempo a 37°C. FIGURA 10. FIGURA 10A: Efeito das substituições de cisteina para serina em AvPAL na formação de agregados proteicos em solução tal como analisado através de electroforese em gel sob condições desnaturantes (painel esquerdo) ou condições nativas (painel direito) . FIGURA 10B: Efeito das substituições de cisteina para serina em AvPAL na formação de agregados proteicos em solução tal como analisados através de SEC-HPLC. FIGURA 11. Efeito de substituições de cisteina para serina nas posições 565 e 503 (Mutante dbl) em AvPAL em peguilação especifica do local a várias concentrações de PEG. FIGURA 12. Efeito do tratamento de AvPAL com Tween 80 a 0,05% ou EDTA 10 mM na formação de agregados proteicos em solução analisado através de SEC-HPLC.

FIGURA 13. FIGURA 13A: Efeito do tratamento de AvPAL através de ditiotreitol (DTT) na formação de agregados proteicos em solução analisado através de SEC-HPLC. FIGURA 13B: Efeito do tratamento de AvPAL através de DTT e N- etilmaleimida (NEM) na formação de agregados proteicos em solução analisado através de SEC-HPLC. FIGURA 14. Efeito das substituições de cisteina para

serina nas posições 565 e 503 (AvPAL_C565SC503S) em AvPAL peguilada nos niveis de fenilalanina (Phe) in vivo em ratinhos ENU2 que receberam doses de 0,25 IU (painel de cima), 1,0 IU (painel do meio) ou 4,0 IU (painel de baixo) de enzima em comparação com ratinhos ENU2 que receberam doses de veiculo ou 4,0 IU de AvPAL peguilada de tipo selvagem. FIGURA 15. Efeito das substituições de cisteina para

serina nas posições 565 e 503 (AvPAL_C565SC503S) em AvPAL peguilada no peso corporal de ratinhos ENU2 que receberam doses de 0,25 IU, 1,0 IU ou 4,0 IU de enzima em comparação com ratinhos ENU2 que receberam doses de veiculo ou 4,0 IU de AvPAL peguilada de tipo selvagem. FIGURA 16. Efeito das substituições de cisteina para

serina nas posições 565 e 503 (AvPAL C503S/565S) em AvPAL peguilada nos niveis de fenilalanina (Phe) in vivo em ratinhos ENU2 que receberam doses de 4 IU de enzima a várias razões de AvPAL:PEG: de 1:1,6 (painel de cima), 1:2,4 (painel do meio) ou 1:3 (painel de baixo), em comparação com ratinhos ENU2 que receberam doses de veiculo ou 4,0 IU de AvPAL peguilada de tipo selvagem a uma razão de AvPAL:PEG de 1:3. FIGURA 17. Efeito das substituições de cisteina para serina nas posições 565 e 503 (AvPAL_C565SC503S) em AvPAL peguilada no peso corporal de ratinhos ENU2 que receberam doses de 4 IU de enzima a várias razões de AvPAL:PEG: de 1:1,6, 1:2,4 ou 1:3, em comparação com ratinhos ENU2 que receberam doses de veiculo ou 4,0 IU de AvPAL peguilada de tipo selvagem a uma razão de AvPAL:PEG de 1:3. FIGURA 18. Efeito da repeguilação de AvPAL_C565SC503S peguilada na atividade especifica de AvPAL in vitro. (Cima) Recuperação da atividade especifica de rAvPAL-PEG, primeiro peguilada a uma razão de PAL:PEG de 1:3 (resíduos de lisina 2 mM:PEG 6 mM, círculos a cheio), após repeguilação sob uma variedade de razões de PAL:PEG e concentrações de resíduos de lisina e moléculas de PEG tal como indicado. (Baixo) Recuperação da atividade específica de rAvPAL-PEG, primeiro peguilada a uma razão de PAL:PEG de 1:1 (resíduos de lisina 2 mM:PEG 2 mM, quadrados a cheio), ou 1:3 resíduos de lisina 2 mM:PEG 6 mM, círculos a cheio), após repeguilação sob uma variedade de razões de PAL:PEG e concentrações de resíduos de lisina e moléculas de PEG tal como indicado. FIGURA 19. FIGURA 19A: Efeito do aumento da razão de PAL:PEG na reação de repeguilação na peguilação global de rAVPAL-PEG, primeiro peguilada a uma razão de PAL:PEG de 1:3 (resíduos de lisina 2 mM:PEG 6 mM) , determinado através de análise de Eletroforese Capilar em Gel (CGE). FIGURA 19B: Efeito do aumento da razão de PAL:PEG na primeira reação de peguilação na peguilação global de rAVPAL-PEG em que a reação de repeguilação é realizada a uma razão fixa de PAL:PEG de 1:3 (resíduos de lisina 2 mM:PEG 6 mM) , determinado através de análise de CGE. FIGURA 20. Efeito da repeguilação de AvPAL_C565SC503S, primeiro peguilada a uma razão de PAL:PEG de 1:3 (resíduos de lisina 2 mM:PEG 6 mM) , na percentagem de peguilação de resíduos de lisina específicos na AvPAL após repeguilação sob uma variedade de razões de PAL:PEG e concentrações de resíduos de lisina e moléculas de PEG tal como indicado. 0 resíduo de lisina na posição 2 (K2) é 100% peguilado sob todas as condições testadas (não mostrado). FIGURA 21. Efeito da repeguilação de AvPAL_C565SC503S, primeiro peguilada a uma razão de PAL:PEG de 1:3 (resíduos de lisina 2 mM:PEG 6 mM), e repeguilada à mesma razão de PAL:PEG e concentração de resíduos de lisina e moléculas de PEG, sobre os níveis plasmáticos de fenilalanina (Phe) in vivo em ratinhos ENU2 que receberam doses por via subcutânea tal como indicado na Tabela 14.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Embora a PAL seja uma enzima ubíqua de plantas superiores que catalisa a desaminação não oxidativa da fenilalanina em ácido cinâmico no passo comprometido com metabolitos fenilpropanoides (Hahlbrock, et al., Annu. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 40:347-369 (1989)), PAL foi apenas verificada nalgumas bactérias onde está envolvida em biossíntese de benzoil-CoA em "S. maritimus" (Xiang, et ai., J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)) e Sorangium cellulosum (Hill, et al., Chem. Commun. 1358-1359 (2003)) e na

biossíntese de cinamamida em Streptomyces verticillatus (Bezanson, et al. , Can. J. Microbiol. 16:147-151 (1970)). O agente bacteriostático enterocina é um produto natural da bactéria marinha "Streptomyces maritimus" cuja biossíntese envolve várias características incomuns (Hertweck, et al., Chem. Biol. 11:461-468 (2004); Piei, et al., Chem. Biol. 7:943-955 (2000); Piei, et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5415-

5416 (2000); Xiang, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101:15609-15614 (2004)). Entre estas está a formação da rara unidade iniciadora benzoil-coenzima A (CoA) de policetido-sintetase (PKS) (Moore, et al., Nat. Prod. Rep. 19:70-99 (2002)) . A reação bioquímica inicial envolve a conversão do aminoácido L-fenilalanina em ácido transcinâmico através da nova amónia-liase de fenilalanina bacteriana (PAL, EC 4.3.1.5) EncP (Xiang, et al. , J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)) . A ativação do ácido cinâmico no seu tioéster CoA seguida por um único ciclo de beta-oxidação produz benzoil-

CoA (Hertweck, et al. , Chem. Bio. Chem. 2:784-786 (2001); Hertweck, et al. , Tetrahedron 56:9115-9120 (2000); Xiang, et al., J. Bacteriol. 185:399-404 (2003)), que inicia a enterocina tipo II PKS para prolongamento da cadeia com sete moléculas de malonil-CoA. O primeiro gene codificando PAL procariótica (encP) (SEQ ID NO: 5) foi caracterizado e a sua inativação resultou na supressão da síntese de novo do ácido cinâmico e da enterocina em "S. maritimus" (Kalaitzis, et al. , J. Am. Chem. Soc. 125:9290-9291 (2003); Xiang, et al., J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)). A biossíntese de enterocina pode ser restaurada em mutantes inativados com encP através de suplementação com ácido cinâmico ou benzoico bem como a complementação com encP transmitida por plasmídeo. Além disso, a expressão heteróloga do gene encP sob o controlo do promotor ermE* em Streptomyces coelicolor levou à produção de ácido cinâmico nas culturas fermentadas (Xiang, et al., J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)). O gene encP codifica uma proteína de 522 aminoácidos que é consideravelmente menor que as PAL eucarióticas em quase 200 resíduos de aminoácidos. Embora homóloga na sequência às PAL vegetais tal como a de Petroselinum crispum (Rõther et al. , Eur. J. Biochem. 269:3065-3075 (2002)) (CAA57056, 30% idêntica e 48% semelhante), partilha uma homologia maior com as amónia-liases de histidina bacterianas (HAL, EC 4.3.1.3) tais como a de Pseudomonas putida (Schwede, et al., Biochemistry 27:5355-5361 (1999)) (A35251, 36% idêntica e 54% semelhante, SEQ ID NO:6, FIGURA 4) e a amónia-liase de tirosina (TAL) de Rhodohacter capsulatus (Kyndt, et al., FEES Lett. 512:240-244 (2002)) (FIGURA 3). A homologia inclui o resíduo de serina do local ativo conservado na posição 143 da família de amónia-liases de fenilalanina/histidina/tirosina que é o provável precursor do resíduo desidroalanina modificado no grupo prostético 4-metilidenoimidazole-5-ona (MIO) (Langer, et al., Adv. Prot. Chem. 58:175-188 (2001); Poppe, Curr. Opin. Chem. Biol. 5:512-524 (2001); Schwede, et al. , Biochemistry 27:5355-5361 (1999)). EncP partilha maior homologia de sequência com AdmH (AAO39102, 63% idêntica e 76% semelhante), uma putativa fenilalanina-aminomutase envolvida na biossíntese de andrimido em Pantoea agglomerans que está relacionada com a tirosina-aminomutase Sgc4 de Streptomyces globisporus (Christenson et al. , J. Am. Chem. Soc. 125:6062-6063 (2003); Christenson, et al., Biochemistry 42:12708-12718 (2003)). Notavelmente, como encP tern uma homologia mais próxima de uma proteína humana (HAL) encP pode ser potencialmente menos imunogénica. Também como são muito semelhantes, seria possível mutar encP para se parecer a HAL humana, uma versão humanizada de encP.

Mostrou-se que HAL e PAL partilham um mecanismo comum para a eliminação quimicamente difícil de amónia da histidina e fenilalanina, respetivamente. Com ambas as enzimas, um grupo prostético supereletrófilo 5-metileno-3,5-di-hidroimidazol-4-ona (MIO) ativa os átomos de hidrogénio beta não ácidos dos seus respetivos substratos através de um ataque do tipo Friedel-Crafts no anel aromático. O complexo sigma que é gerado impede a extração de protões do anel através da exclusão de quaisquer bases do acesso à bolsa de ligação da enzima. A formação de uma ligação dupla exocíclica é chave na eliminação da amónia, rearomatização, e fragmentação. O grupo MIO prostético é regenerado e é formado o produto urocanato ou cinamato (Poppe, et al. , Angew. Chem. Int. Ed. 44:3668-3688 (2005)).

Devido à elevada homologia entre HAL e PAL, as regiões conservadas de HAL e PAL são referidas como a região conservada de HAL/PAL. Esta elevada homologia pode criar algumas ambiguidades em bases de dados como NCBI sobre a potencial atividade enzimática de uma proteína "PAL-HAL" conduzindo a rotulação errada, tal como com sequências proteicas listadas na base de dados NCBI para Nostoc punctiforme e Anabaena variabilis. Portanto algumas enzimas PAL podem ser enzimas HAL mal rotuladas. Embora os locais ativos das PAL e HAL sejam muito semelhantes, está previsto que difiram nalguns resíduos chave (Calabrese et al., Biochemistry 43(36):11403-11416 (2004); Xiang et al., (2002) ibid.; William et al., (2005) ibid.). Particularmente em HAL, a metionina 382 e a glutamina 414 de Pseudomonas putida (SEQ ID NO: 6) são altamente conservadas em todas as HAL mas são sempre substituídas em todas as PAL descritas até agora (eucarióticas ou procarióticas) por lisina e glutamina, respetivamente (FIGURA 4). Assim, pode dizer-se que todas as proteínas com uma região "HAL-PAL" e possuindo os homólogos de lisina382 e glutamina414 têm a assinatura de sequência de uma proteína com atividade de PAL. Esta assinatura de PAL relativamente recém-descrita (Williams et al., (2005) ibid.) permite rotular corretamente algumas enzimas de HAL a PAL e pode ser utilizada para identificar novas enzimas PAL a partir de bases de dados de genes e proteínas já publicadas. O presente pedido refere-se a composições de tal PAL procariótica e a fragmentos, mutantes e variantes desta biologicamente ativos e suas utilizações para fins terapêuticos e industriais.

A. DEFINIÇÕES

Salvo indicação em contrário, os seguintes termos utilizados neste pedido, incluindo a descrição e as reivindicações, têm as definições dadas abaixo. Deve-se notar que, tal como utilizado na descrição e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a" incluem referentes plurais a menos que o contexto dite claramente o contrário. A definição de termos padrão da química pode ser verificada em trabalhos de referência, incluindo Carey e Sundberg, "Advanced Organic Chemistry", 3a Edição, Vols. A e B (Plenum Press, Nova Iorque 1992). A prática do presente invento empregará, salvo indicação em contrário, métodos convencionais de química orgânica sintética, espectroscopia de massa, métodos preparativos e analíticos de cromatografia, química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante e farmacologia, dentro da perícia na técnica. Ver, p. ex., T.E. Creighton, "Proteins: Structures and Molecular Properties" (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 4a Edição, 2004); Sambrook, et al. , "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2a Edição, 1989); "Methods In Enzymology" (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18a Edição (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1996) .

As seguintes abreviaturas de aminoácidos são utilizadas ao longo do texto:

Alanina: Ala (A) Arginina: Arg (R)

Asparagina: Asn (N) Ácido aspártico: Asp (D)

Cisteina: Cys (C) Glutamina: Gin (Q) Ácido glutâmico: Glu (E) Glicina: Gly (G)

Histidina: His (H) Isoleucina: lie (I)

Leucina: Leu (L) Lisina: Lys (K)

Metionina: Met (M) Fenilalanina: Phe (F)

Prolina: Pro (P) Serina: Ser (S)

Treonina: Thr (T) Triptofano: Trp (W)

Tirosina: Tyr (Y) Valina: Vai (V) "Polinucleótido" refere-se a um polímero composto por unidades de nucleótidos. Os polinucleótidos incluem ácidos nucleicos de ocorrência natural, tais como ácido desoxirribonucleico ("ADN") e ácido ribonucleico ("ARN"), bem como análogos de ácidos nucleicos. Análogos de ácidos nucleicos incluem aqueles que incluem bases de ocorrência não natural, nucleótidos que se envolvem em ligações com outros nucleótidos para além da ligação fosfodiéster de ocorrência natural ou que incluem bases ligadas através de ligações para além das ligações fosfodiéster. Assim, os análogos de nucleótidos incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, fosforotriésteres, fosforamidatos, boranofosfatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirais, ribonucleótidos de 2-0-metilo, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), e semelhantes. Tais polinucleótidos podem ser sintetizados, por exemplo, utilizando um sintetizador de ADN automatizado. 0 termo "ácido nucleico" refere-se tipicamente a polinucleótidos grandes. 0 termo "oligonucleótido" refere-se tipicamente a polinucleótidos curtos, em geral não superiores a cerca de 50 nucleótidos. Deve entender-se que quando uma sequência nucleotídica é representada por uma sequência de ADN (i.e., A, T, G, C), isto também inclui uma sequência de ARN (i.e., A, U, G, C) em que "U" substitui "T". "ADNc" refere-se a um ADN que é complementar ou idêntico a um ARNm, quer na forma de cadeia simples quer de cadeia dupla.

Notação convencional é aqui utilizada para descrever sequências polinucleotidicas: a extremidade do lado esquerdo de uma sequência polinucleotidica de cadeia simples é a extremidade 5'; o sentido para a esquerda de uma sequência polinucleotidica de cadeia dupla é referido como o sentido 5'. 0 sentido da adição de nucleótidos 5' para 3' aos transcritos de ARN nascentes é referido como o sentido da transcrição. A cadeia de ADN possuindo a mesma sequência que um ARNm é referida como a "cadeia de codificação"; as sequências na cadeia de ADN possuindo a mesma sequência que um ARNm transcrito a partir desse ADN e que estão localizadas a 5' da extremidade 5' do transcrito de ARN são referidas como "sequências a montante"; as sequências na cadeia de ADN possuindo a mesma sequência que o ARN e que estão a 3' da extremidade 3' do transcrito de ARN de codificação são referidas como "sequências a jusante". "Complementar" refere-se à compatibilidade topológica ou à correspondência de superficies interatuantes de dois polinucleotidos. Assim, as duas moléculas podem ser descritas como complementares, e além disso, as caracteristicas de contacto das superficies são complementares uma à outra. Um primeiro polinucleotido é complementar com um segundo polinucleotido se a sequência nucleotidica do primeiro polinucleotido for idêntica à sequência nucleotidica do parceiro de ligação polinucleotidica do segundo polinucleotido. Assim, o polinucleotido cuja sequência seja 5'-TATAC-3' é complementar a um polinucleotido cuja sequência seja 5'-GTATA-3'.

Uma sequência nucleotidica é "substancialmente complementar" a uma sequência nucleotidica de referência se a sequência complementar à sequência nucleotidica sujeita for substancialmente idêntica à sequência nucleotidica de referência. "Codificando" refere-se à propriedade inerente de sequências de nucleótidos especificas num polinucleótido, tal como um gene, um ADNc, ou um ARNm, para servir como moldes para a síntese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos possuindo uma sequência definida de nucleótidos (i.e., ARNr, ARNt e ARNm) ou uma sequência definida de aminoácidos e as propriedades biológicas resultando destas. Assim, um gene codifica uma proteína se a transcrição e a tradução do ARNm produzido por esse gene produzir a proteína numa célula ou noutro sistema biológico. Tanto a cadeia de codificação, cuja sequência nucleotídica é idêntica à sequência de ARNm e é habitualmente proporcionada nas listagens de sequências, como a cadeia de não codificação, utilizada como molde para a transcrição, de um gene ou ADNc podem ser referidas como codificando a proteína ou outro produto desse gene ou ADNc. Salvo se especificado em contrário, uma "sequência nucleotídica codificando uma sequência de aminoácidos" inclui todas as sequências nucleotídicas que sejam versões degeneradas uma da outra e que codifiquem para a mesma sequência de aminoácidos. As sequências nucleotídicas que codificam para proteínas e ARN podem incluir intrões. "Polinucleótido recombinante" refere-se a um polinucleótido possuindo sequências que não estejam naturalmente ligadas. Um polinucleótido recombinante amplificado ou montando pode ser incluído num vetor adequado, e o vetor pode ser utilizado para transformar uma célula hospedeira adequada. Uma célula hospedeira que compreende o polinucleótido recombinante é referida como uma "célula hospedeira recombinante". 0 gene é então expresso na célula hospedeira recombinante para produzir, p. ex., um "polipéptido recombinante". Um polinucleótido recombinante pode também ter uma função de não codificação (p. ex., promotor, origem de replicação, local de ligação ao ribossoma, etc.). "Sequência de controlo da expressão" refere-se a uma sequência nucleotídica num polinucleótido que regula a expressão (transcrição e/ou tradução) de uma sequência nucleotídica operativamente ligada a ela. "Operativamente ligado" refere-se a uma relação funcional entre duas partes em que a atividade de uma parte (p. ex., a capacidade para regular a transcrição) resulta numa ação sobre a outra parte (p. ex., transcrição da sequência). Sequências de controlo da expressão podem incluir, por exemplo e sem limitação, sequências de promotores (p. ex., indutíveis ou constitutivos), estimuladores, terminadores da transcrição, um codão de início (i.e., ATG), sinais de processamento para intrões, e codões de terminação. "Vector de expressão" refere-se a um vetor compreendendo um polinucleótido recombinante compreendendo sequências de controlo da expressão operativamente ligadas a uma sequência nucleotídica a expressar. Um vetor de expressão compreende suficientes elementos de ação em cis para expressão; ouros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou sistema de expressão in vitro. Vetores de expressão incluem todos os conhecidos na técnica, tais como cosmídeos, plasmídeos (p. ex., nus ou contidos em lipossomas) e vírus que incorporem o polinucleótido recombinante. "Amplificação" refere-se a qualquer meio através do qual uma sequência polinucleotídica é copiada e assim expandida para um número maior de moléculas polinucleotídicas, p. ex., através de transcrição inversa, reação em cadeia da polimerase, e reação em cadeia da ligase. "Iniciador" refere-se a um polinucleótido que é capaz de hibridar especificamente com um designado polinucleótido molde e proporcionar um ponto de iniciação para a síntese de um polinucleótido complementar. Tal síntese ocorre quando o iniciador do polinucleótido é colocado sob condições nas quais é induzida a síntese, i.e., na presença de nucleótidos, um polinucleótido molde complementar, e um agente para polimerização tal como ADN-polimerase. Um iniciador é tipicamente de cadeia simples, mas pode ser de cadeia dupla. Os iniciadores são tipicamente ácidos desoxirribonucleicos, mas uma grande variedade de iniciadores sintéticos e de ocorrência natural é útil para muitas aplicações. Um iniciador é complementar ao molde para o qual foi concebido que hibridasse para servir como um local para a iniciação da síntese, mas não precisa de refletir a sequência exata do molde. Em tal caso, a hibridação específica do iniciador com o molde depende do rigor das condições de hibridação. Os iniciadores podem ser marcados com, p. ex., porções cromogénicas, radioativas ou fluorescentes e utilizados como porções detetáveis. "Sonda", quando utilizado em referência a um polinucleótido, refere-se a um polinucleótido que é capaz de hibridar especificamente com uma sequência designada de outro polinucleótido. Uma sonda híbrida especificamente com um polinucleótido complementar alvo, mas não precisa de refletir a sequência complementar exata do molde. Em tal caso, a hibridação específica da sonda com o alvo depende do rigor das condições de hibridação. As sondas podem ser marcadas com, p. ex., porções cromogénicas, radioativas ou fluorescentes e utilizadas como porções detetáveis.

Uma primeira sequência é uma "sequência antissentido" em relação a uma segunda sequência se um polinucleótido cuja sequência é a primeira sequência hibridar especificamente com um polinucleótido cuja sequência é a segunda sequência. "Hibridar especificamente com" ou "hibridação específica" ou "hibridar seletivamente com" refere-se à ligação, duplexação, ou hibridação de uma molécula de ácido nucleico, de preferência com uma determinada sequência nucleotídica sob condições rigorosas quando essa sequência está presente numa mistura complexa ADN ou ARN (p. ex., celular total). 0 termo "condições rigorosas" refere-se a condições sob as quais uma sonda hibridará de preferência com a sua subsequência alvo e numa menor extensão com, ou de todo com, outras sequências. A "hibridação rigorosa" e as "condições de lavagem de hibridação rigorosas" no contexto de experiências de hibridação de ácidos nucleicos, tais como hibridações Southern e Northern são dependentes da sequência, e são diferentes sob diferentes parâmetros ambientais. Um guia extensivo para a hibridação de ácidos nucleicos é verificado em Tijssen (1993) "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes" parte I capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, Nova Iorque. Geralmente, as condições de hibridação e lavagem altamente rigorosas são selecionadas para serem cerca de 5°C inferiores ao ponto de fusão térmico (Tf) para a sequência específica, a uma força iónica e pH definidos. A Tf é a temperatura (sob força iónica e pH definidos) à qual 50% da sequência alvo híbrida com uma sonda perfeitamente correspondente. Condições muito rigorosas são selecionadas para serem iguais à Tf para uma determinada sonda.

Um exemplo de condições de hibridação rigorosas para hibridação de ácidos nucleicos complementares que tenham mais de 100 resíduos complementares num filtro num Southern ou Northern blot é formalina a 50% com 1 mg de heparina a 42°C, com a hibridação a ser realizada de um dia para o outro. Um exemplo de condições de lavagem altamente rigorosas é NaCl 0,15 M a 72°C durante cerca de 15 minutos. Um exemplo de condições de lavagem rigorosas é uma lavagem de SSC 0,2x a 65°C durante 15 minutos (ver, Sambrook, et al. (1989) ibid. para uma descrição do tampão SSC). Frequentemente, uma lavagem de elevado rigor é precedida por uma lavagem de baixo rigor para remover o sinal de fundo da sonda. Um exemplo de lavagem de rigor médio para um dúplex de, p. ex., mais de 100 nucleótidos, é SSC lx a 45°C durante 15 minutos. Um exemplo de uma lavagem de baixo rigor para um dúplex de, p. ex., mais de 100 nucleótidos, é SSC 4-6x a 40°C durante 15 minutos. Em geral, uma razão de sinal para ruído de 2x (ou superior) a observada para uma sonda não relacionada no ensaio de hibridação particular indica a deteção de uma hibridação específica. "Polipéptido" refere-se a um polímero constituído por resíduos de aminoácidos, variantes estruturais de ocorrência natural relacionadas, e análogos sintéticos destes de ocorrência não natural ligados através de ligações peptídicas, variantes estruturais de ocorrência natural relacionadas, e análogos sintéticos destas de ocorrência não natural. Os polipéptidos sintéticos podem ser sintetizados, por exemplo, utilizando um sintetizador de polipéptidos automático. O termo "proteína" refere-se tipicamente a polipéptidos grandes. O termo "péptido" refere-se tipicamente a polipéptidos curtos. A notação convencional é aqui utilizada para descrever sequências polipeptídicas: a extremidade esquerda de uma sequência polipeptídica é o terminal amino; a extremidade direita de uma sequência polipeptídica é o terminal carboxilo. "Substituição conservativa" refere-se à substituição num polipéptido de um aminoácido com um aminoácido funcionalmente semelhante. Os seis grupos seguintes contêm cada um aminoácidos gue são substituições conservativas entre si: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

Os aminoácidos podem também ser agrupados como se segue: (1) hidrófobos: Met, Ala, Vai, Leu, lie; (2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: Asn, Gin, His, Lys, Arg; (5) resíduos gue influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. "Variante alélica" refere-se a gualguer uma de duas ou mais formas polimórficas de um gene ocupando o mesmo locus genético. As variações alélicas surgem naturalmente através de mutação e podem resultar em polimorfismo fenotípico dentro das populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (sem alteração no polipéptido codificado) ou podem codificar polipéptidos com seguências de aminoácidos alteradas. As "variantes alélicas" referem-se também a ADNc derivados de transcritos de ARNm de variantes alélicas genéticas, bem como às proteínas codificadas por eles.

Os termos "idêntico" ou percentagem de "identidade", no contexto de duas ou mais seguências polinucleotídicas ou polipeptídicas, referem-se a duas ou mais seguências ou subsequências que são iguais ou têm uma percentagem especificada de nucleótidos ou resíduos de aminoácidos que são iguais, quando comparadas e alinhadas para uma correspondência máxima medida utilizando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências ou através de inspeção visual. A frase "substancialmente homólogos" ou "substancialmente idênticos" no contexto de dois ácidos nucleicos ou polipéptidos, refere-se geralmente a duas ou mais sequências ou subsequências que têm pelo menos 40%, 60%, 80%, 90%, 95%, 98% de identidade de nucleótidos ou resíduos de aminoácidos, quando comparadas e alinhadas para uma correspondência máxima, medida utilizando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências ou através de inspeção visual. A identidade substancial pode existir ao longo de uma região das sequências que tenha pelo menos cerca de 50 resíduos de comprimento, ao longo de uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, ou ao longo de pelo menos cerca de 150 resíduos. As sequências podem ser substancialmente idênticas ao longo de todo o comprimento de um ou ambos os biopolímeros de comparação.

Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência atua como sequência de referência, com a qual as sequências de teste são comparadas. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são introduzidas num computador, são designadas as coordenadas das subsequências, se necessário, e são designados os parâmetros do programa do algoritmo de sequências. O algoritmo de comparação de sequências calcula então a percentagem de identidade de sequências para a ou as sequências de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designados. O alinhamento ótimo das sequências para comparação pode ser realizado, p. ex., através do algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), através do algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), através do método de pesquisa de semelhanças de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), através de implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou através de inspeção visual.

Um exemplo de um algoritmo útil é PILEUP. PILEUP cria um alinhamento de múltiplas sequências a partir de um grupo de sequências relacionadas utilizando alinhamentos progressivos aos pares para mostrar a relação e a percentagem de identidade das sequências. Além disso, traça uma árvore ou dendograma mostrando as relações de agrupamento utilizadas para criar o alinhamento. PILEUP utiliza uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987) . O método utilizado é semelhante ao método descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). O programa pode alinhar até 300 sequências, cada uma com um comprimento máximo de 5000 nucleótidos ou aminoácidos. O procedimento de alinhamento múltiplo começa com o alinhamento aos pares das duas sequências mais semelhantes, produzindo um agrupamento de duas sequências alinhadas. Este agrupamento é então alinhado com a próxima sequência ou conjunto de sequências alinhadas mais aparentado. Dois agrupamentos de sequências são alinhados através de uma simples extensão do alinhamento aos pares de duas sequências individuais. O alinhamento final é alcançado através de uma série de alinhamentos progressivos, aos pares. O programa é corrido designando sequências específicas e as coordenadas dos seus aminoácidos ou nucleótidos para regiões de comparação de sequências e designando os parâmetros do programa. Por exemplo, uma sequência de referência pode ser comparada a outras sequências de teste para determinar a relação de percentagem de identidade de sequências utilizando os seguintes parâmetros: peso do intervalo por defeito (3,00), peso do comprimento do intervalo por defeito (0,10), e intervalos finais ponderados. Outro algoritmo que é útil para gerar múltiplos alinhamentos de sequências é Clustal W (Thompson, et al., Nucleic Acids Research 22:4673-4680 (1994)).

Outro exemplo de algoritmo que é adequado para determinar a percentagem de identidade de sequências e a semelhança de sequências é o algoritmo BLAST, que é descrito em Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990) . O suporte lógico para a realização de análises BLAST está disponível publicamente através do National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo envolve primeiro a identificação de pares de sequências de elevada pontuação (HSP) através da identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de busca, que ou correspondem ou satisfazem alguma pontuação T limiar de valor positivo quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento numa sequência da base de dados. T é referido como o limiar da pontuação da palavra vizinha (Altschul et al. (1990), supra) . Estes acertos iniciais da palavra vizinha atuam como sementes para iniciar buscas para encontrar HSP mais longas que as contenham. Os acertos de palavras são então estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência, tão longe quanto a pontuação de alinhamento cumulativa possa ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas utilizando, para sequências nucleotidicas, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre >0) e N (pontuação de penalidade para resíduos que não correspondam; sempre <0). Para sequências de aminoácidos, é utilizada uma matriz de pontuação para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acertos de palavras em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativa cai numa quantidade X do seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa cai para zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos com pontuação negativa; ou a extremidade de qualquer sequência é alcançada. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências nucleotidicas) utiliza por defeito um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as cadeias. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza por defeito um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915 (1989)).

Além do cálculo da percentagem de identidade de sequências, o algoritmo BLAST realiza também uma análise estatística da semelhança entre duas sequências (ver, p. ex., Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5787 (1993)). Uma medida de semelhança fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade da menor soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade com que uma correspondência entre duas sequências de nucleótidos ou de aminoácidos ocorre por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado semelhante a uma sequência de referência se a probabilidade da menor soma numa comparação entre o ácido nucleico de teste e o ácido nucleico de referência for menor que cerca de 0,1, menos que cerca de 0,01, ou menos que cerca de 0,001.

Outra indicação de que duas sequências de ácido nucleico ou polipéptidos são substancialmente idênticos é que o polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico seja imunologicamente reativo de forma cruzada com o polipéptido codificado pelo segundo ácido nucleico, tal como descrito abaixo. Assim, um polipéptido é tipicamente substancialmente idêntico a um segundo polipéptido, por exemplo, quando os dois péptidos diferem apenas através em substituições conservativas. Outra indicação de que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é que as duas moléculas hibridem uma com a outra sob condições rigorosas, tal como aqui descrito. "Substancialmente puro" ou "isolado" significa que uma espécie objeto é a espécie predominante presente (isto é, numa base molar, mais abundante que qualquer outra espécie macromolecular individual na composição), e uma fração substancialmente purificada é uma composição em que a espécie objeto compreende pelo menos cerca de 50% (numa base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Geralmente, uma composição substancialmente pura significa que cerca de 80% a 90% ou mais das espécies macromoleculares presentes na composição são a espécie purificada de interesse. A espécie objeto é purificada essencialmente até à homogeneidade (espécies contaminantes não podem ser detetadas na composição através de métodos de deteção convencionais) se a composição consistir essencialmente numa única espécie macromolecular. Espécies solventes, pequenas moléculas (<500 Daltons), estabilizadores (p. ex., BSA) e espécies de iões elementares não são consideradas espécies macromoleculares para os fins desta definição. Nalgumas concretizações, os compostos ou conjugados do invento são substancialmente puros ou isolados. Nalgumas concretizações, os compostos ou conjugados do invento são substancialmente puros ou isolados no que diz respeito aos materiais macromoleculares de partida utilizados na sua síntese. Nalgumas concretizações, as composições farmacêuticas para utilização de acordo com o invento compreendem um conjugado substancialmente purificado ou isolado de um polipéptido PAL e o agente ativo misturado com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. "De ocorrência natural" tal como aplicado a um objeto refere-se ao facto de esse objeto poder ser encontrado na natureza. Por exemplo, um polipéptido ou uma sequência polinucleotidica que esteja presente num organismo (incluindo virus) que possa ser isolado a partir de uma fonte na natureza e que não tenha sido intencionalmente modificado pelo homem no laboratório é de ocorrência natural. "Tipo selvagem" (wt) é um termo que se refere à forma genética natural de um organismo. Um tipo selvagem é distinguido de uma forma mutante (um organismo com uma mutação genética).

Os temos "polipéptido" e "proteína" referem-se a um polímero de resíduos de aminoácidos e não estão limitados a um comprimento mínimo do produto. Assim, péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros, e semelhantes, estão incluídos dentro da definição. Tanto as proteínas completas como fragmentos destas, estão englobados pela definição. Os termos incluem também modificações do polipéptido pós-expressão, por exemplo, glicosilação, acetilação, fosforilação e semelhantes. Além disso, para os fins do presente invento, um "polipéptido" refere-se a uma proteína que inclui modificações, tais como deleções, adições e substituições (geralmente de natureza conservativa), da sequência nativa, desde que a proteína mantenha a atividade desejada. Estas modificações podem ser deliberadas, tal como através de mutagénese dirigida ao local, ou podem ser acidentais, tal como através de mutações resultantes com hospedeiros que produzam as proteínas ou erros devidos à amplificação por PCR.

Tal como aqui utilizado, um "análogo" ou "derivado" é um composto, p. ex., um péptido, possuindo mais de cerca de 70% mas menos de 100% de semelhança de sequência com um dado composto, p. ex., um péptido. Tais análogos ou derivados podem ser constituídos por resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural, incluindo a título de exemplo e não de limitação, homoarginina, ornitina, penicilamina, e norvalina, bem como resíduos de aminoácidos de ocorrência natural. Tais análogos ou derivados podem também ser constituídos por um ou uma pluralidade de resíduos de D-aminoácidos, e podem conter interligações não peptídicas entre dois ou mais resíduos de aminoácidos. 0 termo "quantidade eficaz" significa uma dosagem suficiente para produzir um resultado desejado numa condição de saúde, patologia e doença de um sujeito ou com um propósito de diagnóstico. 0 resultado desejado pode compreender uma melhoria subjetiva ou objetiva no recetor da dosagem. "Quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de um agente eficaz para produzir o efeito benéfico sobre a saúde pretendido. Uma quantidade "eficaz" apropriada em qualquer caso individual pode ser determinada por um vulgar perito na técnica utilizando experimentação de rotina. "Tratamento" refere-se a tratamento profilático ou tratamento terapêutico ou tratamento de diagnóstico.

Um tratamento "profilático" é um tratamento administrado a um sujeito que não exiba sinais de uma doença ou exiba apenas os primeiros sinais com a finalidade de diminuir o risco de desenvolver patologia. Os compostos ou conjugados do invento podem ser dados como um tratamento profilático para reduzir a probabilidade de desenvolvimento de uma patologia ou para minimizar a gravidade da patologia, se desenvolvida.

Um tratamento "terapêutico" é um tratamento administrado a um sujeito que exiba sinais ou sintomas de patologia com o objetivo de diminuir ou eliminar esses sinais ou sintomas. Os sinais ou sintomas podem ser bioquímicos, celulares, histológicos, funcionais, subjetivos ou objetivos. Os compostos ou conjugados do invento podem ser dados como um tratamento terapêutico ou para diagnóstico. "Diagnóstico" significa a identificação da presença ou natureza de uma condição patológica. Os métodos de diagnóstico diferem na sua especificidade e seletividade. Embora um método de diagnóstico particular possa não proporcionar um diagnóstico definitivo de uma condição, é suficiente que o método proporcione uma indicação positiva que auxilie no diagnóstico. "Composição farmacêutica" refere-se a uma composição adequada para utilização farmacêutica no sujeito animal, incluindo humanos e mamíferos. Uma composição farmacêutica compreende uma quantidade farmacologicamente eficaz de um polipéptido PAL e compreende também um transportador farmaceuticamente aceitável. Uma composição farmacêutica engloba uma composição compreendendo o ou os ingredientes ativos, e o ou os ingredientes inertes que constituem o transportador, bem como qualquer produto que resulte, direta ou indiretamente, da combinação, complexação ou agregação de quaisquer dois ou mais dos ingredientes, ou da dissociação de um ou mais dos ingredientes, ou de outros tipos de reações ou interações de um ou mais dos ingredientes. Por conseguinte, as composições farmacêuticas para utilização de acordo com o presente invento englobam qualquer composição produzida através de mistura de um composto ou conjugado do presente invento e um transportador farmaceuticamente aceitável. "Transportador farmaceuticamente aceitável" refere-se a qualquer um dos transportadores, tampões, e excipientes farmacêuticos padrão, tais como uma solução salina tamponada com fosfato, solução aquosa a 5% de dextrose, e emulsões, tais como uma emulsão óleo/água ou uma emulsão água/óleo, e vários tipos de agentes e/ou adjuvantes molhantes. Transportadores farmacêuticos e formulações adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 19a Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995) . Os transportadores farmacêuticos dependem do modo de administração pretendido do agente ativo. Modos de administração típicos incluem entérica (p. ex., oral) ou parentérica (p. ex., injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou intraperitoneal; ou administração tópica, transdérmica, ou transmucosa). Um "sal farmaceuticamente aceitável" é um sal que pode ser formulado num composto ou conjugado para utilização farmacêutica incluindo, p. ex., sais de metais (sódio, potássio, magnésio, cálcio, etc.) e sais de amónia ou aminas orgânicas.

Por "farmaceuticamente aceitável" ou "farmacologicamente aceitável" entenda-se um material que não é biologicamente ou de outro modo indesejável, i.e., o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar quaisquer efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de um modo prejudicial com qualquer um dos componentes da composição na qual está contido. 0 termo "forma de dosagem unitária", tal como aqui utilizado, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para sujeitos humanos e animais, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada do composto ou conjugado do presente invento calculada numa quantidade suficiente para produzir o efeito desejado em associação com um diluente, transportador ou veículo farmaceuticamente aceitável. As especificações para as novas formas de unidade de dosagem dependem do composto ou conjugado particular empregue e do efeito a alcançar, e da farmacodinâmica associada a cada composto ou conjugado no hospedeiro.

Por "pH fisiológico" ou um "pH no intervalo fisiológico" entende-se um pH no intervalo de aproximadamente 7,2 a 8,0 inclusive, mais tipicamente no intervalo de aproximadamente 7,2 a 7,6 inclusive.

Tal como aqui utilizado, o termo "sujeito" engloba mamíferos e não mamíferos. Exemplos de mamíferos incluem, mas não estão limitados a, qualquer membro da classe dos mamíferos: humanos, primatas não humanos tais como chimpanzés e outros símios e espécies de macacos; animais de quinta, tais como gado, cavalos, ovelhas, cabras, porcos; animais domésticos tais como coelhos, cães, e gatos; animais de laboratório incluindo roedores, tais como ratos, ratinhos e cobaias, e semelhantes. Exemplos de não mamíferos incluem, mas não estão limitados a, aves, peixes, e semelhantes. O termo não denota uma idade ou sexo particular. A peguilação da variante de PAL pode ser descrita em referência à razão de PAL:PEG ou PEG:PAL. Tal como é aqui usado, e a menos que indicado de outro modo, a razão de "PAL:PEG" refere-se à razão de resíduos de lisina na variante de PAL para moléculas de PEG na reação de peguilação. Semelhantemente, tal como aqui utilizado, e a menos que indicado de outro modo, a razão de "PEG:PAL" refere-se à razão de moléculas de PEG para resíduos de lisina na variante de PAL na reação de peguilação.

B. ENGENHARIA DE PROTEÍNAS BASEADA NA ESTRUTURA São conhecidos numeroso métodos para engenharia de proteínas utilizando otimização racional baseada principalmente na informação estrutural das proteínas (Brannigan, et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3(12) :964-970 (2002) ; Marshall, et al., Drug Discov. Today 8(5):212-221 (2003) ). A substituição sistemática de características estruturais pode levar a melhores propriedades das proteínas e/ou a um redesenho da especificidade do substrato. O recrutamento da função de um membro de uma família de genes num outro membro homólogo pode ser conseguido através da introdução de um número limitado de substituições de aminoácidos na vizinhança imediata da ligação do substrato. Tais melhorias na função das proteínas através da geração de variantes melhoradas das proteínas pode conduzir a proteínas úteis para aplicações industriais, agrícolas, e terapêuticas (Bocanegra, et al., Biochemistry 32(11):2737-2740 (1993);

Failla, et al., Fold Des. 1(1):35-42 (1996); Hayes, et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(25):15926-15931 (2002); Voigt, et al. , Nat. Struct. Biol., 9(7):553-558 (2002);

Malashkevich, et al., Nat. Struct. Biol. 2(7):548-553 (1995); Wells, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(15):5167-5171 (1987); Wilks, et al., Science 242(4885):1541-1544 (1988)).

C. A ESTRUTURA DE PAL A estrutura tridimensional da PAL de tipo selvagem procariótica pode ser determinada utilizando cristalografia de raios X. A proteína PAL é um homotetrâmero, com cada monómero consistindo principalmente em hélices alfa e subdivisível em quatro domínios - um domínio catalítico central, um domínio N-terminal, e um domínio C-terminal pequeno com semelhança com a estrutura da amónia-liase de histidina de Pseudomonas putida (HAL, Schwede, et al.,

Biochemistry 38(17):5355-5361 (1999)) mais um domínio adicional inserido na região C-terminal que se projeta a partir das extremidades da molécula do tetrâmero intata. Os primeiros 25 resíduos N-terminais não são visíveis na estrutura para todos os quatro monómeros no tetrâmero, e esta região é provavelmente perturbada. As regiões de volta entre os resíduos 109-123 e 350-353 são perturbadas para o monómero B, com as regiões 103-123 e 350-353 perturbadas para os monómeros A, C, e D no tetrâmero de PAL. Duas outras estruturas de raios X de PAL de Rhodosporidium toruloides foram determinadas utilizando transcinamato e adição de iões NH4 durante o processo de cristalização, com resoluções de 2,1 À (grupo espacial P3221) e 2,7 À (grupo espacial P21; Calabrese, et ai., Biochemistry 43(36):11403-11416 (2004)). O pH mais baixo utilizado para cristalização e a resolução inferior destas estruturas levaram a mais distúrbios inerentes nas estruturas (especialmente nas regiões N-terminais) e a incapacidade para atribuir inequivocamente mais densidade de eletrões presente no cofator MIO a um aduto NH2.

Existem várias estruturas relacionadas (utilizando DALI, Holm, et ai., J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993)) nesta família de enzimas tetraméricas que catalisam a eliminação de vários grupos de ácidos carboxílicos, incluindo as amónia-liases (PAL, HAL, e amónia-liase de aspartato (AAL)), fumarase, e arginossuccinato-liase (Schwede, et ai., Biochemistry 38(17):5355-5361 (1999)). Além disso, a proteína do cristalino do olho de ave -cristalina tem uma dobra semelhante mas é uma forma não enzimática desta família estrutural (Schwede, et ai., (1999) ibid.).

As estruturas tridimensionais de raios X de HAL de P. putida (Rother et ai., Eur. J. Biochem. 268:6011-6019 (2001); Schwede, et al., Biochemistry 27:5355-5361 (1999), e mais recentemente da PAL de Rhodosporidium toruloides (Calabrese, et al. , Biochemistry 43:11403-11416 (2004)), revelaram os resíduos do local ativo destas enzimas tetraméricas que são importantes para a ligação ao substrato, catálise e formação de MIO. Todos os resíduos do local ativo em HAL estão presentes em EncP exceto H83 e E414, que são substituídos por resíduos de valina e glutamina, respetivamente (Xiang, L., et al., J. Biol. Chem. 277: 32505-3250924 (2002)). É proposto que H83 em HAL se liga e orienta a porção imidazol da L-histidina no local ativo e estabiliza um intermediário catiónico ligado à enzima, enquanto o grupo carboxilato de E414 pode atuar como uma base na catálise. A estrutura cristalina tridimensional da proteína de alta resolução de PAL pode ser utilizada em métodos envolvendo engenharia de proteínas para melhorar as propriedades bioquímicas e biofísicas da PAL, e para aumentar a eficácia terapêutica in vivo de PAL. Além disso, a estrutura proporciona informação em relação a que regiões da estrutura são mais flexíveis (para remover e gerar uma forma mais compacta e estável de PAL), quais os resíduos que estão localizados próximo do local ativo (para mutar a fim de aumentar a atividade e/ou minimizar o tamanho da proteína, bem como proporcionar informação para a concepção de inibidores com base na estrutura), e quais as localizações da superfície que estão próximas de locais sensíveis imunogénicos (p. ex. epitopos lineares identificados em estudos de mapeamento) e/ou proteolíticos (a partir de estudos de mapeamento de proteases), permitindo a introdução de mutantes específicos do local para destruição direta de locais problemáticos ou, alternativamente, para peguilação de superfície ou outra derivação química para proteger locais sensíveis presentes na PAL nativa.

D. UTILIZAÇÕES DAS COORDENADAS ESTRUTURAIS DE PAL A estrutura cristalina tridimensional de alta resolução de PAL pode ser utilizada em métodos computorizados para seleção de regiões da proteína para mutação, modificação ou mutação e modificação combinadas. Por exemplo, o programa disponível comercialmente GETAREA calcula a exposição à superfície para resíduos de aminoácidos com base nas coordenadas cristalográficas de raios X. A estrutura cristalina tridimensional de alta resolução pode além disso ser utilizada em métodos in silico para conceber ligandos para o local ativo da enzima. Por exemplo, programas de suporte lógico comercialmente disponíveis para ancoragem e concepção de pequenas moléculas com base na estrutura podem ser utilizados para conceber inibidores de PAL (Billett, et al. , Biochim. Biophys. Acta 524(1):219-230 (1978); Janas, et al. , Acta Biochim. Pol. 32(2):131-143 (1985); Zon, et al., Phytochemistry 59(1): 9-21 (2002);

Alunni, et al. , Arch. Biochem. Biophys. 412(2):170-175 (2003) ) .

Engenharia de PAL com base na estrutura A elucidação de uma estrutura tridimensional de confiança ou modelo estrutural para uma macromolécula específica permite que o desenho racional se torne um método produtivo para otimização da estrutura e/ou função específicas da referida macromolécula (Penning; et al., Chem. Rev. 101(10) :3027-3046 (2001)) . Abordagens de otimização incluem, mas não estão limitadas a reengenharia da especificidade de coenzimas (Bocanegra, et al., Biochemistry 32(11):2737-2740 (1993)); melhoria das estabilidades das proteínas (Malakauskas, et al., Nat. Struct. Biol. 5(6):470-475 (1998); Jiang, et al., Protein Sci. 10(7):1454-1465 (2001); Luo, Protein Sci. 11(5):1218-1226 (2002); Filikov, et al., Protein Sci. 11(6):1452-1461 (2002); O'Fagain, Enz.

Microb. Technol. 33:137-149 (2003); Cammett, et al. , J. Mol.

Biol. 327(1):285-297 (2003)), redesenho das especificidades dos substratos (Hedstrom, et al., Science 255(5049):1249-1253 (1992); Failla, et al., Fold Des. 1(1):35-42 (1996);

Malashkevich, et al., Nat. Struct. Biol. 2(7):548-553 (1995); Wilks, et al., Biochemistry 31(34):7802-7806 (1992); Feil, et al., Protein Eng. 10(3):255-262 (1997); Whittle, et al., J.

Biol. Chem. 276(24):21500-21505 (2001)), alteração das especificidades dos ligados ou dos recetores (Cunningham, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(8):3407-3411 (1991);

Reddy, et al., Nat. Biotechnol. 14(13):1696-1699 (1996);

Doyle, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 4(1):60-63 (2000)), e reengenharia das atividades biológicas (Chen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12): 5618-5622 (1993); Sarkar, et al., Nat. Biotechnol. 20:908-913 (2002); Blatt, et al., J.

Interferon Cytokine Res. 16(7):489-499 (1996)).

Engenharia baseada na estrutura pode ser usada para gerar variantes de PAL incluindo mutantes racionais tais como truncagens, deleções, inserções, variantes de processamento, mutações pontuais, substituições, quimeras, mutantes de reengenharia de volta, mutantes de troca de volta, mutantes de revestimento da superfície, bem como mutantes derivados estocasticamente (incluindo mutantes derivados de evolução dirigida, isoladamente ou em combinação com mutantes racionalmente desenvolvidos). Além disso, podem ser produzidas variantes de PAL compreendendo mutantes de PAL em que as mutações foram introduzidas para peguilação específica do local e/ou outras derivações químicas. Os mutantes de PAL para utilização em tais métodos incluem qualquer variante de PAL possuindo substancialmente a mesma atividade funcional que a PAL de tipo selvagem de R. toruloides, incluindo variantes, fragmentos e derivados químicos da proteína PAL parental.

Otimização da Proteína por Evolução Dirigida

Os métodos de evolução dirigida mutam de forma aleatória um ou genes de interesse para explorar mais completamente regiões maiores do espaço mutacional da proteína. Existem numerosos métodos de evolução dirigida, incluindo PCR propensa a erros e mutagénese por inserção e deleção aleatórias (RID) para introduzir diversidade ao longo de uma sequência de ADN, e métodos de geração de diversidade mais focados ou "dirigidos" tais como mutagénese de saturação do local e outros métodos de mutagénese baseados em oligonucleótidos (Brannigan, et al. , (2002) ibid.) . Além disso, métodos de recombinação da sequência de ADN foram utilizados para combinar locais de mutação vantajosos e simultaneamente remover mutações deletérias, produzindo novas sequências de ADN (p. ex., métodos de baralhamento de ADN, StEP, RACHITT, ITCHY). Finalmente, foram utilizadas técnicas de evolução dirigida baseadas na estrutura para redesenhar proteínas para vantagem terapêutica (métodos de engenharia combinatória baseada na estrutura, SCOPE, e automação do desenho de proteínas, PDA) . O método SCOPE é baseado numa abordagem de engenharia de proteínas semirracional que usa a informação da estrutura da proteína juntamente com técnicas de manipulação de ADN para conceber e criar várias bibliotecas de variantes proteicas de múltiplos cruzamentos de genes não homólogos (O'Maille, et al., J. Mol. Biol. 321(4):677-691 (2002)). Em PDA, uma pré-pesquisa computacional do espaço mutacional permite a inclusão de apenas mutações compatíveis com uma dobra específica de proteína, reduzindo assim o número de variantes de sequência para um tamanho passível de pesquisa experimental (Patente U.S. No, 6403312; Dahiyat, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94(19):10172-10177 (1997); Dahiyat, et al., Protein Sei. 6(6):1333-1337 (1997); Hayes, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99(25):15926-15931 (2002) Orencia, et al., Nature Struct. Biol. 8:238-242 (2001) .

Existe um grande número de exemplos onde a utilização de evolução dirigida (conjugada com uma seleção eficaz ou protocolo de pesquisa) levou a uma melhor função catalítica e propriedades biofísicas (p. ex., imunogenicidade reduzida, estabilidade aumentada), começando a partir de uma espécie de enzima inicial e mutando essa espécie para uma função alterada e/ou melhorada (Vasserot, et al., Drug Discovery Today 8(3):118-126 (2003)). Por exemplo, mutantes bem-sucedidos foram obtidos utilizando evolução dirigida e outros métodos de mutagénese "aleatória" em várias proteínas diferentes (Triosefosfato-isomerase, Hermes, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(2):696-700 (1990); Beta-lactamase, Stemmer, W.P., Nature 370(6488):389-391 (1994), Orencia, M.C., et al. , Nature Struct. Biol. 8:238-242 (2001), Voigt, C.A., et al., (2002) ibid.; para-nitrobenzil-esterase, Moore, et al., Nature Biotechnol. 14:458-467 (1996); Galactosidase em fucosidase, Zhang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(9):4504-4509 (1997); Aspartato-aminotransferase, Yano, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(10):5511-5515 (1998); Proteína fluorescente verde, Crameri, et al., Nat. Biotechnol. 14(3):315-319 (1996); Peroxidase de rábano, Lin, et al. , Biotechnol. Prog. 15: 467-471 (1999); Cytochrome P450, Joo, et al., Nature 399(6737):670-673 (1999); Bifenil-dioxigenase, Kumamaru, et al., Nat. Biotechnol. 16(7):663-666 (1998); Via da desintoxicação de arsenato, Crameri, et al. , Nat. Biotechnol. 15(5):436-438 (1997); Cefalosporinase, Crameri, et al. , Nature 391(6664):288-291 (1998); várias proteínas, Shao, et al. , Curr. Opin. Struct. Biol. 6(4) :513-518 (1996), várias proteínas, Skandalis, et al., Chem. Biol. 4:889-898 (1997); Subtilisina, Cunningham, et al., Protein Eng. 1(4):319-325 (1987); Nitrilase, DeSantis, et al. , J. Am. Chem. Soc. 125(38):111476-11477 (2003); Alfa-aspartil-dipeptidase, Kong, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 289(1):137-142 (2001); Aspartato-aminotransferase, Rothman, et al. , Protein Science 13(3):7 63-772 (2004); L-aspartase, Wang, et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 276(1):346-349 (2000); e lactato-desidrogenase, Wilks, et al. , Biochemistry 31 (34) :7802-7806 (1992) .

Estes estudos demonstraram repetidamente a utilidade da aplicação de técnicas de mutagénese "aleatória" para o desenvolvimento de variantes de enzimas melhoradas com maior estabilidade, atividade e resistência às vias de degradação. A análise estrutural de clones de proteínas evoluídas leva a uma perspetiva sobre as alterações moleculares que estão envolvidas com as propriedades físicas e químicas melhoradas que são obtidas (Orencia, et al. , em "Advances in Protein Chemistry: Evolutionary protein design", F.H. Arnold, Editor, Academic Press: San Diego, págs. 227-259 (2001)). As recompensas a obter com as técnicas de evolução dirigida são especialmente evidentes à luz da ocorrência repetida de mutações benéficas que envolvem resíduos de locais não ativos, com alguns locais de mutação localizados ao longo de 15-20 À das regiões do local ativo da enzima possuindo efeitos benéficos (Oue, et al. , J. Biol. Chem. 274(4) :2344-2349 (1999)). A evolução dirigida e outras técnicas de mutagénese aleatória, conjugadas com procedimentos de seleção e pesquisa, podem ser utilizadas para desenvolver formas de PAL mais proteoliticamente estáveis e quimicamente robustas para utilizar em aplicações industriais ou, alternativamente, para terapia de substituição enzimática, p. ex., para PKU.

E. PAL MODIFICADA

Experiências anteriores descreveram formas modificadas de PAL, tais como mutantes de PAL (Schuster et al., FEBS Lett. 349(2):252-254 (1994); Schuster, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(18):8433-8437 (1995); Langer, et al., Biochemistry 36:10867-10871 (1997); El-Batal, et al. , Acta Microbiol. Pol. 49(1):51-61 (2000); Rõther, et al., Eur. J. Biochem. 269:3065-3075 (2002)) e mutantes de HAL (Taylor, et al., J. Biol. Chem. 269(44):27473-27477 (1994); Baedeker, et al., Eur. J. Biochem. 269(6):1790-1797 (2002)).

Otimização da Cinética de PAL - Mutantes Procarióticos com Atividade Catalítica Melhorada

Os locais biologicamente ativos de PAL de tipo selvagem podem ser modificados conforme desejado para otimizar as características cinéticas de PAL. Km, a concentração de substrato gue dá uma atividade semimáxima, está intimamente associada à eficácia terapêutica de PAL na manutenção dos níveis de Phe dentro de um intervalo aceitável, isto é, 120 μΜ a 240 μΜ. Km é a afinidade da enzima para o substrato. Ao controlar a afinidade, pode-se limitar ou controlar a eficácia de gualguer enzima contra o substrato a diferentes concentrações. Por exemplo, se a Km for 1000 M (Rhodosporidium toruloides), a atividade da enzima será reduzida para cerca de 12,5% a níveis de Phe no sangue de 240 M e para cerca de 3% a níveis de Phe no sangue de 60 μΜ. Se a Km for de 240 μΜ, a atividade da enzima será reduzida para cerca de 50% a níveis de Phe no sangue de 240 μΜ e para cerca de 12% a níveis de Phe no sangue de 60 μΜ. Se a Km for de 120 μΜ, a atividade da enzima será reduzida para cerca de 70% a níveis de Phe no sangue de 240 μΜ e para cerca de 35% a níveis de Phe no sangue de 60 μΜ. Idealmente, um objetivo terapêutico seria ter uma enzima com atividade suficiente para reduzir, mas também manter Phe dentro do intervalo ótimo de cerca de 120 μΜ a cerca de 240 μΜ. Uma enzima com uma elevada Km (i.e., 1000 μΜ) perderá atividade rapidamente à medida gue os níveis de Phe caiem para dentro do intervalo normal e exigirá também a administração impraticável de doses altamente concentradas ou de volumes grandes. Por outro lado, uma enzima com uma Km muito baixa pode esgotar rapidamente os níveis de Phe, o gue pode ser fatal para hiperfenilanemias mas pode ser útil na gestão de cancro.

Tal como agui descrito, a PAL modificada biologicamente ativa tem uma kcat de pelo menos cerca de 0,1 s_1 ou mais de cerca de 0,5 s_1. Alternativamente, a PAL modificada biologicamente ativa tem uma kcat de pelo menos cerca de 0,2 s_1 ou mais de cerca de 1,0 s_1. Tal como agui descrito, a PAL modificada biologicamente ativa tem uma Km de entre cerca de 10 μΜ a cerca de 1000 μΜ. Alternativamente, a PAL modificada biologicamente ativa tem uma Km de entre cerca de 100 μΜ a cerca de 1000 μΜ. Tal como agui descrito, a PAL modificada biologicamente ativa exibe uma atividade enzimática que é de cerca de duas vezes a cerca de 1000 vezes maior que a do tipo selvagem. Tal como aqui descrito, a PAL modificada biologicamente ativa exibe uma atividade enzimática que é de cerca de 10% a cerca de 100% mais elevada que a do tipo selvagem. Tais proteínas PAL modificadas biologicamente ativas podem ser formadas utilizando métodos bem conhecidos na especialidade, tais como mutagénese dirigida ao local.

Mostrou-se que todos os resíduos do local ativo em HAL estavam presentes em EncP exceto para H83 e E414, que são substituídos com resíduos de valina e glutamina, respetivamente (Xiang, L., et ai., J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)). O papel de H83 em HAL na ligação e orientação da porção imidazol de L-histidina no local ativo e na estabilização de um intermediário catiónico ligado a enzima foi investigado (Xiang, et al., J. Bacteriology 187(12):4286-4289 (2005); Xiang, et al., J. Bacteriology 188(14):5331 (2006)) . Foi proposto que o grupo carboxilato de E414 pode atuar como uma base em catálise. No estudo, foram gerados mutantes de EncP através de mutagénese dirigida ao local para avaliar o contributo de V83 para formação de ácido cinâmico através de EncP. A substituição de valina por histidina gerou um mutante, V83H, que foi caracterizado por uma perda de atividade de PAL. A substituição da valina por alanina resultou num mutante, V83A, que era mais ativo que a EncP de tipo selvagem V83A, tinha uma afinidade ligeiramente inferior a L-fenilalanina com uma Km de 120 μΜ versus 23 μΜ para a enzima de tipo selvagem. No entanto, em comparação com a EncP de tipo selvagem, V83A tinha uma kcat mais elevada e era mais ativa que a enzima de tipo selvagem.

Variantes Específicas das Proteínas: Variantes Possuindo Imunogenicidade Reduzida Várias estratégias são atualmente utilizadas para reduzir a imunogenicidade das proteínas. Tal como aqui descrito, modificações que são introduzidas para minimizar a resposta imunitária não destroem a estrutura, função ou estabilidade da macromolécula. Estratégias eficazes utilizadas incluem o aumento do teor de sequência humana (quimeras e/ou outras abordagens de "humanização")/· melhoramento das propriedades em solução, remoção de epitopos de anticorpos, introdução de derivação química (tal como peguilação), e/ou identificação e remoção de agretopos de MHC. Para uma terapêutica injetada, a imunorreatividade in vivo pode ser solucionada através da realização de mapeamento de epitopos seguido por mutagénese racional para modificar e/ou de outro modo mutar estes locais de imunogenicidade, sozinha e em combinação com peguilação específica do local (Hershfield et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:7185-7189 (1991); Leong, et ai., Cytokine 16(3):106-119 (2001); Lee, et al., Pharm. Res. 20(5):818-825 (2003)) ou outros métodos de derivação química para reduzir a imunorreatividade da proteína para um nível aceitável. A modificação de regiões antigénicas da superfície da proteína reduz a imunogenicidade (Chirino, et al. , Drug Discov. Today 9(2):82-90 (2004)). Um método de melhoria envolve a construção de proteínas de menor tamanho que retenham a atividade catalítica (p. ex., é utilizado um ensaio de absorvância para medição da atividade). Um segundo método de melhoria, engenharia de proteínas ligada a pesquisa por ELISA, pode também ser utilizado para identificar mutantes com imunorreatividade reduzida. Outro método introduz mutações pontuais em locais adicionais Lys à superfície para derivação de peguilação, um método que se mostrou reduzir a imunogenicidade com a enzima de teste, nucleósido purina-fosforilase (Hershfield, et al. (1991) ibid.). Uma via alternativa utiliza a mutação de resíduos localizados em regiões de epitopo de proteínas para remover locais imunogénicos (Yeung et al., J. Immunol. 172(11):6658-6665 (2004)). Numa abordagem que é análoga à humanização de anticorpos, regiões de volta homólogas e/ou resíduos de anticorpos humanos são substituídos nas regiões de volta correspondentes de uma proteína homóloga. A melhoria das propriedades em solução das proteínas pode aumentar a atividade específica da enzima e/ou reduzir a imunogenicidade. Uma propriedade em solução típica de proteínas recombinantes expressas em bactérias, é a formação de agregados de proteína, devido, por exemplo, à formação de ligações dissulfureto intercadeias, interações hidrófobas e/ou catiões bivalentes (Chi, et al., Pharm. Res. 20(9):1325-1336 (2003) ) . A agregação de proteínas expressas de forma recombinante pode aumentar a resposta imunitária (Hermeling, et al., Pharm. Res. 21(6):897-903 (2994); Schllekens, Nephrol. Dial. Transplant 20(supl 6):vi3-9 (2005)). Um método de melhoria envolve a substituição de resíduos de cisteína da superfície com outros resíduos de aminoácidos (p. ex., serina) para minimizar a possibilidade de formação de ligações dissulfureto intercadeias. Por exemplo, a substituição de dois resíduos de cisteína da superfície por resíduos de serina reduziu a agregação da corismato-liase com efeitos menores na atividade enzimática (Holden, et al., Biochim. Biophys. Act a 1594(1):160-167 (2002)). A remoção de locais de processamento proteolítico terapêutico da proteína pode também proporcionar uma redução na imunogenicidade, impedindo o processamento proteossómico, evitando assim o corte e o processamento em fragmentos peptídicos para ligação à célula de apresentação do antigénio. Um fenómeno semelhante foi observado na alteração das regiões flanqueadoras para determinantes de MHC de classe II, evitando a apresentação a células T autorreativas (Maverakis, et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 100 (9) :5342-5347 (2003) ) .

Mapeamento de Epitopos

Os epitopos terapêuticos de proteínas podem ser calculados utilizando vários algoritmos ou determinados experimentalmente com abordagens in vitro ou in vivo. Programas de computador, tais como "Peptide Companion" e "Protean" no conjunto de programas Lasergene de DNAStar são vulgarmente utilizados para estimar as regiões de epitopo da superfície de uma proteína com base na composição química e conformação de uma proteína. As regiões imunogénicas numa sequência proteica são aquelas regiões de hidrofilicidade mais elevada, calculada com base num índice de hidrofilicidade, e antigenicidade, com base na anfipaticidade e outros parâmetros conformacionais de regiões da proteína de superfície calculada. Alternativamente, os agretopos de uma sequência proteica podem ser localizados com base em predições modeladas em computador da potencial ligação a HLA (Robinson, et al. , Nucleic Acids Res. 31(1):311-314 (2003); De Groot, et al., Novartis Found. Symp. 254:57-72 (2003)). Além disso, os epitopos podem ser identificados utilizando métodos bioquímicos in vitro (Tangri, et ai., Curr. Med. Chem. 9(24):2191-2199 (2002)) e baseados em células in vitro (Stickler, et ai., J. Immunother. 23(6):654-660 (2000); Stickler, et al.r J. Immunol. Methods 281(1-2):95-108 (2003)). Para engenharia de proteínas, a redução relativa da imunogenicidade pode ser monitorizada utilizando ensaios semelhantes ao ensaio baseado em células in vitro de Stickler et ai. (Toxicol. Sci. 77(2):280-289 (2004)). A análise de Pepscan (mapeamento de epitopos) envolve a utilização de uma biblioteca de péptidos que se sobrepõem cobrindo regiões de superfície da sequência da enzima, e sondagem com anticorpos policlonais de coelho criados contra péptidos que se sobrepõem cobrindo toda a sequência proteica da enzima, e revelando desse modo epitopos lineares presentes na enzima. Com base na estrutura tridimensional da enzima, os locais de antigenicidade identificados experimentalmente são mutados através da mutação aleatória de resíduos da região de epitopo para remover os locais de reconhecimento do epitopo ou utilizando mutação específica do local para introduzir resíduos Lys ou Cys na superfície próximo destes locais de epitopo para proporcionar localizações para peguilação para cobrir e proteger estes locais do reconhecimento imunogénico. A pesquisa por ELISA destes mutantes de enzimas potencialmente não imunogénicos (ou formas peguiladas destes mutantes de enzimas) proporciona identificação in vitro de subconjuntos de mutantes de enzimas que apresentam imunorreatividade diminuída.

Identificação e Mutação de Resíduos da Superfície

Os resíduos expostos à superfície em ou próximo de regiões imunogénicas da enzima podem ser identificados. Estas localizações serão um subconjunto do número total de localizações à superfície acessíveis ao solvente presentes na proteína, dependentes da proximidade à superfície bem como da proximidade a regiões de imunogenicidade/antigenicidade. A estrutura tridimensional da proteína, determinada utilizando cristalografia de raios X, RMN ou modelação de homologia, pode ser utilizada em programas de suporte lógico comercialmente disponíveis para calcular a área da superfície acessível ao solvente da macromolécula. O resultado proporcionado utilizando o programa GETAREA 1.1 (Fraczkiewicz, et al. , J. Comp. Chem. 19:319-333 (1998)) dá uma estimativa fiável da acessibilidade à superfície para a PAL de R. toruloides. GETAREA e PARAREA e programas semelhantes calculam a área da superfície acessível ao solvente utilizando métodos contínuos com uma abordagem paramétrica com base no teorema de Gauss-Bonnet. PARAREA encontra potenciais pontos de intersecção na via de Gauss-Bonnet usando todos os pares de átomos na lista de vizinhos de cada átomo, enquanto GETAREA calcula de forma mais eficiente os vértices expostos ao solvente usando interseção de semiespaços definidos por planos de interseções de duas esferas.

Na PAL nativa, GETAREA identificou doze resíduos Lys expostos à superfície, distribuídos ao longo da superfície da proteína PAL tetramérica, bem como um resíduo Cys parcialmente exposto à superfície (Cysl40). Estas posições estão diretamente disponíveis para derivação por peguilação. Além disso, a estrutura tridimensional de PAL pode ser usada para identificar resíduos à superfície adicionais disponíveis para mutagénese dirigida ao local. Estes locais adicionais podem ser mutados usando técnicas padrão de engenharia de proteínas para gerar mutantes de PAL mais favoráveis com imunogenicidade reduzida, melhor resistência proteolítica, e/ou melhor estabilidade/atividade.

As estratégias para mutação da proteína para proporcionar proteínas mutantes com propriedades melhoradas, tais como imunogenicidade reduzida são conhecidas na técnica. Uma via popular muta todos os resíduos que não sejam alanina num epitopo para Ala, e muta todos os resíduos de alanina num epitopo para Gly. Outros métodos removem os resíduos com carga e hidrófobos das regiões de epitopo, quer através de mutação quer de deleção. Outras estratégias de mutação adicionais introduzem mutações específicas do local, seguido de derivação química específica do local.

Podem também ser utilizadas truncagens para a produção de melhorias nas proteínas. A análise bioinformática de PAL em relação à amónia-liase de histidina (HAL) sugeriu mutantes de truncagem (resíduos 23-716 e 1-564). Além disso, a análise da estrutura 3D de PAL proporciona uma região alternativa para truncagem, com base na ausência de uma região do domínio C-terminal na estrutura da proteína HAL altamente homóloga. Mutantes de deleção do domínio C-terminal, incluindo mutantes onde a região de volta correspondente de HAL se funde na sequência de PAL para substituir o domínio C-terminal que se projeta a partir da região da estrutura de PAL (calculada para ter regiões principais de epitopo), formam variantes de PAL menores, mais robustas e que se prevê serem menos imunogénicas.

Noutro método, engenharia de proteínas utilizando mutagénese racional em combinação com evolução dirigida pode ser utilizada para obter formas mutantes de PAL. Por exemplo, a implementação de desenho racional juntamente com desenho experimental e combinatório melhorou a atividade da compstatina (Morikis, et al., Biocheni. Soc. Trans. 32(1):28-32 (2004)). A combinação de mutagénese racional e evolução dirigida mostrou-se também promissora (Bornscheuer, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2):137-143 (2001); Dwyer, et al., Science 304(5679):1967-1971 (2004)).

Formas mutantes de PAL que exibem atividade enzimática sub-ótima podem ser evoluídas quanto à atividade utilizando o método de engenharia de proteínas de evolução molecular dirigida, em que um passo de mutagénese aleatória é seguido por um processo de seleção de mutantes que sejam ativos, produzindo um novo banco de mutantes de proteínas de apenas os clones que possuem atividade. Por exemplo, se uma PAL mutante específica (que se concebeu para introduzir um resíduo de lisina à superfície próximo de uma região da estrutura contendo um epitopo), for inativa, a realização de evolução dirigida sobre este mutante (mutando o mutante inativo e selecionando transformantes com atividade) gera um novo banco de mutantes contendo esta mutação benéfica (o local de lisina à superfície) mais um subconjunto de mutações aleatórias adicionais localizadas ao longo da estrutura que restauram a atividade a cada clone ativo. Além disso, a técnica de evolução dirigida de criação molecular que pode cruzar espécies diferentes da mesma proteína ou sequências semelhantes de proteínas diferentes (Crameri, et al. Nature, 391:288-291 (1998); Minshull, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 3(3):284-290 (1999)) pode substituir a sequência de amónia- liase de histidina humana para substituir algumas das regiões mais imunogénicas de PAL com uma sequência humana que não será reconhecida pelo sistema imunitário.

Formas mutantes de PAL podem ser obtidas produzindo variantes de proteínas híbridas baseadas em abordagens semirracionais permitindo assim um nível mais dirigido de concepção de proteínas em relação a métodos baseados em evolução dirigida pura, bem como proporcionando um nível mais aleatório de manipulação por mutação das regiões de uma estrutura proteica identificada utilizando tais abordagens tendenciosas de engenharia de proteínas. Por exemplo, o método de PDA gera bibliotecas computacionalmente pré-rastreadas de variantes de proteínas, permitindo uma otimização mais rápida das propriedades da proteína em relação a métodos de engenharia de proteínas aleatórios puros ou não tendenciosos (Patente U.S. No. 6403312; Dahiyat, Curr. Opin. Biotechnol. 10(4):387-390 (1999); Filikov, et al. , (2002) ibid.; Hayes, et al., (2002) ibid.; Luo, P., et al., (2002) ibid.). Semelhantemente, o método SCOPE constrói variantes de enzimas híbridas com base em subdomínios da estrutura "equivalentes", permitindo a criação de várias bibliotecas de variantes de proteínas cruzadas a partir de genes não homólogos (0'Maille, et al., (2002) ibid.). De um modo semelhante, o método desenvolvido por Voigt, et al., constrói híbridos com base na aplicação de um algoritmo computacional que identifica fragmentos de proteínas, ou "esquemas", que podem ser recombinados sem perturbar a integridade da estrutura tridimensional de uma proteína (Voigt, et ai., (2002) ibid.) . A análise computacional pode também identificar regiões conservadas centrais de posições estruturalmente e funcionalmente importantes numa dobra da proteína, com base em atribuições de elementos estruturais secundários (Mizuguchi, et ai., Bioin formatics 16(12):1111-1119 (2000)). Formas mutantes de PAL podem ser obtidas seguindo os procedimentos de qualquer um dos métodos da técnica. HAL como Enzima Alternativa Substituta A estrutura de encP de Streptomyces maritimus foi modelada na homologia com base na estrutura de HAL de P. putida. Embora menor que PAL, a estrutura de S. maritimus é mais semelhante à PAL humana, tornando encP uma forma possivelmente menos imunogénica de uma amónia-liase para usar para engenharia de proteínas PAL. Um método alternativo para a obtenção de variantes de PAL não imunogénicas envolve a mutação de encP de S. maritimus ou outra PAL procariótica para substituir sequências imunogénicas por sequências de amónia-liase de histidina humanas (HAL, Suchi, et ai.,

Biochim. Biophys. Acta 1216(2):293-295 (1993)), utilizando mutação seguida de seleção para encP ou outros mutantes

procariót icos com atividade de PAL, para obter uma encP "humanizada" ou outra proteína PAL procariótica que ainda possa ser peguilada após os passos de mutação e seleção quanto à atividade.

Variantes de Proteínas Específicas: Variantes Possuindo

Reduzida Sensibilidade a Proteases Várias estratégias são atualmente utilizadas para reduzir a suscetibilidade das proteínas às proteases. Nalguns exemplos, as modificações introduzidas para minimizar a sensibilidade proteolítica não destroem a estrutura, função ou estabilidade da macromolécula. Estratégias eficazes incluem o proporcionar de uma enzima com uma espécie estabilizadora do local ativo tal como um inibidor competitivo (Gilbert, et ai., (1981) ibid.; Patentes U.S. Nos. 6548644; 6451986; 6,433,158; 6461849), modificação química dos grupos amino em locais Lys e/ou Arg suscetíveis para bloquear locais de ligação a tripsina, mutando resíduos Tyr, Phe, e/ou Trp sensíveis a quimotripsina em aminoácidos menores neutros para suprimir a suscetibilidade à clivagem, ligar ou unir PAL a outras macromoléculas protetoras (tais como domínios de anticorpos Fc ou os componentes não tóxicos da neurotoxina do botulismo) , e/ou introdução de locais Lys ou Cys próximo de locais suscetíveis às proteases para subsequente derivação química com PEG ou outros grupos de proteção química e de estabilização.

F. VARIANTES DE PAL QUIMICAMENTE MODIFICADAS A modificação química de macromoléculas pode ser realizada de uma forma não específica (conduzindo a misturas de espécies derivadas) ou de uma forma específica do local (com base em derivação dirigida à reatividade da macromolécula de tipo selvagem e/ou modificação seletiva do local utilizando uma combinação de mutagénese dirigida ao local e modificação química) ou, alternativamente, utilizando métodos de ligação de proteínas expressas (Hofmann, et ai., Curr. Opin. Biotechnol. 13(4):297-303 (2002)). A modificação química é utilizada para reduzir a imunogenicidade. A peguilação é um método que se demonstrou reduzir a imunogenicidade de proteínas (Bhadra, et al., Pharmazie 57(1):5-29 (2002)), mas a glicosilação e outros procedimentos de derivação química, utilizando modificação com fosforilação, amidação, carboxilação, acetilação, metilação, criação de sais de adição ácida, amidas, ésteres, e derivados N-acilo são também possíveis (Davis, Science 303:480-482. (2004) ) .

Proteínas Peguiladas

Uma série de diferentes reações de peguilação em PAL, utilizando um intervalo de razões de reagente químico PEG para proteína PAL, proporcionará derivados PEG-PAL para cada método de modificação. O grau ótimo de peguilação pode ser determinado com base na atividade residual obtida para cada espécie de PAL derivada utilizando o ensaio de absorvância em combinação com PAGE e análise em gel nativo para determinar a extensão da derivatização de PEG. Após serem determinados intervalos iniciais de modificação ótima, a análise cinética comparativa (incluindo determinações de Vmax e Km, constantes de ligação de substratos, estabilidade proteolítica, dependência da atividade do pH, dependência da atividade da temperatura) e a imunorreatividade das espécies PEG-PAL ótimas pode ser determinada através de ELISA, imunoprecipitação e Western blot. A engenharia de proteínas pode também ser utilizada para gerar o mutante de PAL mais favorável para peguilação utilizando as condições ótimas de derivatização; minimizando o tamanho da proteína PAL e modificando apenas as regiões mais antigénicas da superfície de PAL, o custo da modificação de PEG será reduzido ao mesmo tempo que se mantém uma quantidade máxima de atividade enzimática e uma quantidade mínima de imunogenicidade. Semelhantemente, peguilação específica do local pode ser utilizada para proporcionar derivados da enzima.

Outras modificações químicas tais como fosforilação ou outra modificação química de resíduos Lys, Arg, e Cys podem ser utilizadas para mascarar regiões imunogénicas e/ou regiões sensíveis proteolíticas. Tais modificações químicas incluem o método de adição de polímeros de Bednarsaki e o método de reticulação de Altus Corporation para melhorar a estabilidade de PAL, reduzindo a imunogenicidade, e melhorar a resistência a proteases como exemplos representativos. Bednarsaki demonstrou que a adição de polímeros melhora a estabilidade térmica da proteína (Wang, et al., J. Am. Chem. Soc. 114(1):378-380 (1992)), e a Altus Corporation verificou que a reticulação com glutaraldeído melhora a estabilidade das enzimas.

Para descobrir se a semivida terapêutica in vivo de uma proteína tal como PAL beneficiaria de peguilação, é sintetizada uma variedade de diferentes conjugados PEG:PAL, caracterizados in vitro e testados in vivo quanto à redução de L-Phe. Para otimizar os potenciais efeitos da peguilação e identificar os locais preferidos de ligação do PEG, é empregue uma estratégia de desenho em que o comprimento do polímero, a conformação, e o grau de ligação de PEG são variados. Métodos para preparar a PAL peguilada do presente invento compreendem geralmente os passos de (a) fazer reagir PAL com polietilenoglicol sob condições nas quais PAL se liga a um ou mais grupos PEG, e (b) obtenção do ou dos produtos da reação. Uma vez que os locais específicos da modificação de PAL podem alterar significativamente a atividade intrínseca do conjugado, foram explorados diferentes tipos e quantidades de PEG. A química utilizada para peguilação de PAL foi a acilação das aminas primárias de PAL utilizando o NHS-éster de metoxi-PEG (O-[ (N-Succinimidiloxicarbonil)-metil]-O'-metilpolietilenoglicol). A acilação com metoxi-PEG-NHS ou metoxi-PEG-SPA resulta numa ligação amida que elimina a carga da amina primária original.

Os presentes métodos proporcionam uma mistura substancialmente homogénea de conjugado polímero:proteína. "Substancialmente homogénea" tal como aqui utilizado significa que apenas são observadas moléculas de conjugado polímero:proteína. 0 conjugado polímero:proteína tem atividade biológica e as presentes preparações de PAL peguilada "substancialmente homogéneas" aqui proporcionadas são as que são suficientemente homogéneas para apresentar as vantagens de uma preparação homogénea, p. ex., facilidade de aplicação clínica com previsibilidade da farmacocinética de lote para lote.

As moléculas de polímero contempladas para utilização nas abordagens de peguilação aqui descritas podem ser selecionadas de entre polímeros solúveis em água ou uma mistura destes. 0 polímero solúvel em água pode ser selecionado a partir do grupo que consiste, por exemplo, em polietilenoglicol, monometoxi-polietilenoglicol, dextrano, poli-(N-vinilpirrolidona), homopolímeros de propilenoglicol, um copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (p. ex., glicerol), HPMA, Fleximer™, e álcool polivinílico, mono(Cl-Cl0)alcoxi-PEG, ariloxi-PEG, tresilmonometoxi-PEG, PEG propionaldeído, carbonato de bis-succinimidilo-PEG, celulose, ou outros polímeros baseados em hidratos de carbono. 0 polímero selecionado deve ser solúvel em água de modo a que a proteína à qual está ligado não precipite num ambiente aquoso, tal como um ambiente fisiológico. 0 polímero pode ser ramificado ou não ramificado. Para utilização terapêutica da preparação do produto final, o polímero será farmaceuticamente aceitável.

Nalgumas concretizações, um polímero solúvel em água para utilização aqui é polietilenoglicol, abreviado PEG. Tal como aqui utilizado, polietilenoglicol destina-se a englobar qualquer uma das formas de PEG que foram utilizadas para derivar outras proteínas, tais como mono-(Cl-Cl0)alcoxi- ou ariloxi-polietilenoglicol. A proporção de moléculas de polietilenoglicol para moléculas de proteína variará, bem como as suas concentrações na mistura reacional. Em geral, a razão ótima (em termos de eficiência de reação por não haver excesso de proteína ou polímero que não reagiu) será determinada através do peso molecular do polietilenoglicol selecionado e do número de grupos reativos disponíveis (tipicamente grupos amino ) presentes. Como se refere ao peso molecular, em geral, quanto mais elevado for o peso molecular do polímero utilizado, menor o número de moléculas de polímero que se podem ligar à proteína. Semelhantemente, a ramificação do polímero deve ser tida em conta quando se otimizam estes parâmetros. Geralmente, quanto maior for o peso molecular (ou quanto mais ramificações) maior será a razão polímero:proteína. 0 presente invento contempla vários comprimentos do polímero PEG linear diferentes incluindo mas não se limitando a 5 kDa e 20 kDa, conjugados de dois polímeros PEG ramificados com dois braços, incluindo mas não se limitando a 10 kDa e 40 kDa. Nalgumas concretizações, para as reações de peguilação aqui contempladas, o peso molecular médio é de cerca de 2 kDa a cerca de 100 kDa (o termo "cerca de" indica +/- 1 kDa) . Noutras concretizações, o peso molecular médio é de cerca de 5 kDa a cerca de 40 kDa. A razão de polímero solúvel em água para PAL estará geralmente no intervalo de 1:1 para monoPEG, 2:1 para diPEG, etc.

Os Exemplos 6 a 8 descrevem os efeitos de formas peguiladas de não peguiladas de PAL mutante de lisina R91K de Rhodosporidium toruloides, PAL produzida pela cianobactéria Nostoc punctiforme (NpPAL), e PAL produzida pela cianobactéria Anabaena variabilis (AvPAL) nos níveis de fenilalanina no ratinho ENU2 ou BTBRenu2 ao longo de um período de 12 dias. Este modelo animal é um mutante homozigótico no locus do gene da fenilalanina-hidroxilase (PAH) resultando num animal com hiperfenilalanemia grave. Assim, os elevados níveis plasmáticos de fenilalanina (Phe) tornam este animal no modelo apropriado para avaliar a capacidade da amónia-liase de fenilalanina (PAL) para reduzir a Phe plasmática. Os efeitos da forma peguilada e não peguilada da PAL mutante de lisina R91K e da NpPAL nos níveis de fenilalanina neste modelo animal de PKU foram também avaliados ao longo de um período de 90 dias. Os resultados mostraram que as formas peguiladas de NpPAL e AvPAL resultaram em maior redução na fenilalanina no modelo animal de PKU em comparação com a NpPAL e AvPAL não peguiladas, respetivamente. Além disso, tais efeitos da NpPAL peguilada na redução de níveis elevados de fenilalanina foram mantidos ao longo de um período de dez semanas. Estes estudos mostram que a peguilação de PAL a partir das cianobactérias, Nostoc punctiforme e Anabaena variabilis, é essencial na redução dos níveis de fenilalanina nos ratinhos afetados com PKU. As descobertas sugerem que uma variante peguilada da PAL bacteriana pode servir como produto terapêutico eficaz na gestão da PKU. 0 invento contempla variantes peguiladas de PAL com imunogenicidade reduzida. Uma concretização é uma forma peguilada da variante de PAL de Anabaena variabilis (AvPAL) com imunogenicidade reduzida. Concretizações específicas contemplam variantes de AvPAL em que a peguilação é alcançada fazendo reagir a variante de AvPAL com um polímero solúvel em água, p. ex., polietilenoglicol (PEG). Nalgumas concretizações, a peguilação é alcançada fazendo reagir a variante de AvPAL uma vez com PEG a uma razão de pelo menos 1:1, pelo menos 1:1,5, pelo menos 1:2, pelo menos 1:3, ou pelo menos 1:4 de PAL:PEG. Numa concretização, a variante de PAL é uma variante de AvPAL, e a peguilação é alcançada utilizando uma razão de PAL:PEG de 1:3. Os métodos para a preparação das variantes de PAL peguiladas do presente invento são descritos acima. 0 invento contempla também repeguilação das variantes de PAL peguiladas para imunogenicidade reduzida. Nalgumas concretizações, a peguilação é alcançada fazendo reagir a variante de AvPAL duas vezes ou mais com PEG, cada peguilação a uma razão de pelo menos 1:1, pelo menos 1:1,5, pelo menos 1:2, pelo menos 1:3, ou pelo menos 1:4 de PAL:PEG. Nalgumas concretizações, a peguilação é alcançada fazendo reagir a variante de AvPAL duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, ou mais, com PEG, cada peguilação a uma razão de pelo menos 1:1, pelo menos 1:1,5, pelo menos 1:2, pelo menos 1:3, ou pelo menos 1:4 de PAL:PEG. Noutra concretização, a variante de PAL é uma variante de AvPAL, e a peguilação é alcançada utilizando uma razão de PAL:PEG de 1:3 tanto para a primeira como para a segunda reação de peguilação.

Os métodos para preparação das variantes de PAL repeguiladas do presente invento compreendem geralmente os passos de (a) fazer reagir uma variante de PAL com polietilenoglicol sob condições em que a variante de PAL se liga a um ou mais grupos PEG, (b) obtenção do ou dos produtos reacionais, (c) fazer reagir a variante de PAL peguilada com polietilenoglicol sob condições em que a variante de PAL peguilada se liga a um ou mais grupos PEG nas posições não ocupadas por PEG do passo (a) , e (d) obtenção do ou dos produtos reacionais. Uma vez que os locais específicos de modificação da PAL podem alterar significativamente a atividade intrínseca da variante de PAL, foram explorados diferentes tipos e quantidades de PEG. A química usada para peguilação da PAL foi a acilação das aminas primárias de PAL utilizando NHS-éster de metoxi-PEG(0- [ (N- succinimidiloxicarbonil)-metil]-0'-metilpolietilenoglicol). A acilação com metoxi-PEG-NHS ou metoxi-PEG-SPA resulta numa ligação amida que elimina a carga da amina primária inicial.

G. ENSAIOS DE SELEÇÃO E PESQUISA

Para produção e pesquisa de variantes de PAL ou HAL ativas, a expressão do clone mutante inicial pode utilizar qualquer um dos sistemas de vetores de expressão conhecidos, tais como o sistema de vetor de expressão etiquetado com His, que facilita um passo de purificação com quelato metálico de elevada tiragem para isolamento da variante de proteína. Um sistema de pesquisa de três camadas pode ser utilizado para identificar variantes de proteína favoráveis. A identificação inicial de um clone positivo pode usar transformação e seleção para crescimento numa estirpe de E. coli auxotrófica para fenilalanina. Um segundo ciclo de seleção pode utilizar a medição da absorvância a DO290 (Hodgins, Biochem. Biophys. Res. Commun., 32:246-253 (1968)) passível de processamento de elevado rendimento. Finalmente, pode ser utilizada pesquisa de resistência à proteólise (utilizando incubação na presença de uma mistura de proteases) ou, alternativamente, redução da imunogenicidade (utilizando medições de ELISA competitivo), para identificar variantes de proteína favoráveis.

H. UTILIZAÇÕES TERAPÊUTICAS E ADMINISTRAÇÃO DE PROTEÍNAS PAL OTIMIZADAS I. VÁRIAS FORMAS DE HIPERFENILALANEMIA (HPA) 0 presente invento refere-se geralmente ao tratamento de uma variedade de populações de pacientes de HPA com métodos que compreendem a utilização de composições de PAL, quer isoladamente quer em combinação com outros regimes terapêuticos, para a gestão de HPA e/ou PKU. Em particular, está contemplado que composições de PAL possam ser utilizadas para tratar essa população de pacientes com concentrações de fenilalanina que sejam suficientemente baixas para que a intervenção dietética não seja normalmente utilizada (isto é, pacientes com HPA leve), pacientes com PKU moderada, pacientes com PKU clássica ou grave, e quaisquer subpopulações desta. Tais pacientes que são passíveis de tratamento com composições de PAL para melhorar os efeitos de HPA leve incluem mulheres grávidas e bebés com concentrações séricas de menos de 200 M. As ávias populações de pacientes, e as suas necessidades terapêuticas diferentes, são discutidas com mais detalhe na presente secção. É aqui descrito o tratamento de PKU clássica grave através de administração ao sujeito de uma dieta com restrição de proteínas em combinação com uma composição compreendendo PAL ou uma variante, um mutante, ou um fragmento biologicamente ativo desta, em que a administração combinada da dieta com restrição de proteínas e PAL é eficaz para reduzir a concentração de fenilalanina no plasma do referido sujeito em comparação com a referida concentração na ausência da referida administração combinada. Além disso, é também aqui descrito o tratamento de uma mulher grávida que tenha HPA através da administração à mulher de uma dieta com restrição de proteínas em combinação com PAL ou um derivado biologicamente ativo desta, de modo a que a administração combinada da dieta com restrição de proteínas e PAL seja eficaz a reduzir a concentração de fenilalanina no plasma da mulher grávida em comparação com uma tal concentração na ausência da referida administração combinada.

Especificamente, a terapia está contemplada para um paciente que manifeste niveis de Phe superiores a 420 M. É aqui descrita a administração de uma composição de PAL a qualquer indivíduo que tenha HPA, caracterizada por uma concentração plasmática de Phe superior a 180 μΜ antes da administração de PAL, numa quantidade eficaz para produzir uma diminuição em tal concentração plasmática de Phe do paciente. Os métodos serão úteis no tratamento de um bebé possuindo PKU caracterizada por concentrações elevadas de Phe de mais de 300 μΜ com composições de PAL aqui descritas. Por "bebé" o presente pedido refere-se a um paciente que tem entre o 0 e cerca de 36 meses de idade.

Características de PKU Clássica Grave e Métodos de Tratamento Desta A PKU grave manifesta-se numa concentração plasmática de Phe superior a 1200 μΜ e pode verificar-se ser tão elevada como 4800 μΜ. Os pacientes que tenham este distúrbio têm de ser tratados com uma dieta sem Phe para fazer descer as suas concentrações plasmáticas de Phe até um nivel que seja clinicamente aceitável (tipicamente, menos de 600 μΜ ou menos de 300 μΜ) . Estes pacientes só são capazes de tolerar um máximo de entre 250-350 mg de Phe na dieta por dia (Spaapen et al. , Mol. Genet. Metab. 78:93-99 (2003)). Como tal, estes pacientes iniciam uma dieta com uma fórmula com restrições de Phe entre os 7-10 dias após o nascimento e ficam com o fardo desta restrição dietética para o resto das suas vidas. Qualquer alívio das estritas restrições dietéticas com que estes indivíduos são onerados seria benéfico.

Os testes utilizados para o diagnóstico de indivíduos com Phe clássica são descritos com maior detalhe abaixo. Estes testes revelaram que os pacientes com PKU clássica grave necessitam de uma dieta pobre em fenilalanina (Lucke et al., Pediatr. Neurol. 28:228-230 (2003)). Assim, está contemplado que os métodos aqui descritos implicarão a determinação de que o paciente sofre de PKU clássica através da monitorização da concentração plasmática de Phe do indivíduo. O paciente é então tratado através da administração de composições de PAL procariótica sozinha ou de um regime combinado de uma dieta pobre em proteína e PAL de modo a que seja produzida uma diminuição de pelo menos 25% nas concentrações plasmáticas de Phe do paciente.

Especificamente, o método produzirá uma diminuição de 30% na concentração plasmática de Phe. Especificamente, o método produzirá uma diminuição de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais na concentração plasmática de Phe do indivíduo (por exemplo, quando um paciente com PKU clássica grave tem uma concentração de Phe de 4800 μΜ uma diminuição de 90% na concentração de Phe produzirá uma concentração plasmática de Phe de 480 μΜ, uma concentração que é suficientemente baixa para requerer pouca restrição dietética) . Claro que deve entender-se que os métodos de tratamento (quer para tratamento de PKU clássica grave quer qualquer outra HPA aqui descrita), devem tentar baixar as concentrações plasmáticas de Phe do paciente para níveis tão próximos de um intervalo de cerca de 120 μΜ a cerca de 360 μΜ ± 15 μΜ quanto possível, ou para um intervalo ótimo de cerca de 120 μΜ a cerca de 240 μΜ.

Tal como aqui descrito, as concentrações plasmáticas de Phe do paciente de PKU clássica a tratar são reduzidas de qualquer quantidade de concentração plasmática de Phe sem restrições que seja superior a 1000 μΜ para qualquer nível plasmático de Phe que seja inferior a 600 μΜ. Claro que, mesmo que o tratamento combinado com PAL e a dieta com restrição de proteínas produza uma diminuição menor na concentração plasmática de Phe, p. ex., para um nível de entre 800 M a cerca de 1200 M, isto será visto como um resultado clinicamente útil da terapia porque os pacientes que têm uma concentração plasmática de Phe neste intervalo podem gerir a doença limitando simplesmente a quantidade de proteína na dieta em oposição a comer uma fórmula com restrições de Phe, resultando assim numa melhoria acentuada na qualidade de vida do indivíduo, bem como levando a uma maior adesão do paciente com a restrição dietética.

Qualquer aumento na quantidade de níveis de Phe na dieta que possam ser tolerados pelo paciente como resultado do tratamento será considerado como sendo um resultado terapeuticamente eficaz. Por exemplo, está contemplado que como resultado da administração da terapia de PAL, o paciente será capaz de aumentar a sua ingestão de Phe na dieta de 250-350 mg/dia para 350-400 mg/dia (i.e., o fenótipo de tolerância a Phe do paciente é alterado do de um paciente de PKU clássica para o de um paciente de PKU moderada) . Claro que seria desejável que a intervenção terapêutica aqui ensinada permitisse ao paciente aumentar a sua ingestão de Phe na dieta de 250-350 mg/dia para 400-600 mg/dia (isto é, o fenótipo de tolerância a Phe do paciente é alterado do de um paciente de PKU clássica para o de um paciente de PKU leve), ou, nalguns casos, permitir ao paciente ter uma ingestão superior a 600 mg de Phe/dia (i.e., ingestão dietética normal).

Características de Pacientes de PKU que não respondem a BH4 e Métodos de Tratamento Destes

Um segundo grupo de pacientes que podem ser tratados com os métodos aqui descritos são os indivíduos que foram determinados como tendo uma concentração plasmática elevada de Phe i.e., qualquer concentração que seja superior a 200 μΜ, mas que tenham sido diagnosticados como sendo não responsivos a terapia de BH4 (determinado através do teste de carga de BH4 descrito abaixo). Tais pacientes podem incluir aqueles indivíduos que tenham PKU leve (i.e., concentrações plasmáticas de Phe de até 600 μΜ), indivíduos que tenham PKU moderada (i.e., concentrações plasmáticas de Phe de entre 600 μΜ a cerca de 1200 μΜ) , bem como pacientes que tenham PKU grave clássica (i.e., concentrações plasmáticas de Phe que sejam superiores a 1200 μΜ).

Aos pacientes que são não responsivos a terapia de BH4 é dada PAL em combinação com uma quantidade reduzida de proteína na sua dieta para diminuir as concentrações plasmáticas de Phe do paciente. Os métodos aqui descritos tal como a administração de PAL produzem uma maior diminuição nas concentrações plasmáticas de Phe do paciente em comparação com a diminuição que é produzida com o mesmo protocolo de dieta administrado na ausência de terapia de PAL. As restrições dietéticas podem ser uma dieta que restrinja a ingestão de Phe, proporcionando uma fórmula médica sintética de proteínas que possua uma quantidade reduzida de Phe ou, alternativamente, a restrição dietética pode ser uma que requeira simplesmente que o paciente limite a sua ingestão de proteína total, mas permita no entanto que o paciente coma alimentos normais em quantidades limitadas.

Os resultados terapêuticos para pacientes de PKU clássica são discutidos na literatura. Os resultados terapêuticos para pacientes com PKU moderada (i.e., pacientes que tenham uma concentração plasmática de Phe sem restrições de 600 μΜ a 1200 μΜ) incluem pelo menos uma diminuição de 25% nas concentrações plasmáticas de Phe do paciente. O método pode produzir uma diminuição de 30% na concentração plasmática de Phe. O método pode produzir uma diminuição de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais na concentração plasmática de Phe do indivíduo (por exemplo, quando um paciente com PKU clássica moderada tem uma concentração de Phe de 1000 μΜ, uma diminuição de 90% na concentração de Phe produzirá uma concentração plasmática de Phe de 100 μΜ, uma concentração que é suficientemente baixa para requerer pouca ou nenhuma restrição dietética).

Tal como aqui descrito, as concentrações plasmáticas de Phe do paciente de PKU moderada a tratar são reduzidas de qualquer quantidade de concentração plasmática de Phe sem restrições que esteja entre 600 μΜ e 1200 μΜ para qualquer nível plasmático de Phe que seja inferior a 300 μΜ. Especificamente, o tratamento com PAL (quer sozinha quer em combinação com uma restrição dietética) produz uma diminuição na concentração plasmática de Phe, p. ex., para um nível de entre 200 μΜ a cerca de 400 μΜ, que será considerado como um resultado clinicamente útil da terapia porque os pacientes que tenham uma concentração plasmática de Phe neste intervalo podem gerir a doença restringido simplesmente a quantidade de proteína na dieta em oposição a comer uma fórmula com restrição de Phe. De facto, em muitos estudos, é ensinado que tais pacientes podem mesmo comer uma dieta normal.

Qualquer aumento na quantidade dos níveis de Phe da dieta que podem ser tolerados pelo paciente, como resultado do tratamento será considerado como sendo um resultado terapeuticamente eficaz. Por exemplo, está contemplado que como resultado da administração da terapia de PAL (quer sozinha quer em combinação com outra intervenção terapêutica), o paciente será capaz de aumentar a sua ingestão de Phe dietética de 350-400 mg/dia para 400-600 mg/dia (isto é, o fenótipo de tolerância a Phe do paciente é alterado do de um paciente de PKU moderada para o de um paciente de PKU leve) . Claro que seria desejável que a intervenção terapêutica aqui ensinada permitisse ao paciente aumentar a sua ingestão de Phe na dieta de 350-400 mg/dia para uma ingestão superior a 600 mg de Phe/dia (i.e., ingestão dietética normal).

Mesmo que o paciente a tratar seja um que manifeste PKU apenas ligeira, isto é, tenha uma ingestão dietética de 400-600 mg de Phe/dia, beneficiará das terapias baseadas em PAL aqui descritas porque é desejável produzir uma concentração plasmática de Phe normalizada que esteja tão perto de 360 M ±15 M quanto poásel. Para tais pacientes, um resultado terapêutico vantajoso incluirá uma diminuição de pelo menos 25% nas concentrações plasmáticas de Phe do paciente. Especificamente, o método produzirá uma diminuição de 30% na concentração plasmática de Phe. Especificamente, o método produzirá uma diminuição de 40%, 50%, 60%, ou maior na concentração plasmática de Phe do indivíduo (por exemplo, quando um paciente com PKU leve tem uma concentração de Phe de 600 μΜ, uma diminuição de 60% na concentração de Phe produzirá uma concentração plasmática de Phe de 360 μΜ, i.e., um nível de concentração plasmática de Phe aceitável, normal).

Tal como aqui descrito, as concentrações plasmáticas de Phe do paciente de PKU leve a tratar são reduzidas de qualquer quantidade da concentração plasmática de Phe sem restrições que esteja entre 400 μΜ e 600 μΜ para qualquer nível plasmático de Phe que seja inferior de 100 μΜ. Claro que mesmo que o tratamento com PAL (quer sozinha quer em combinação com uma restrição dietética) produza uma menor diminuição da concentração plasmática de Phe, p. ex., para um nível de entre 200 μΜ e cerca de 400 μΜ, isto será considerado como um resultado clinicamente útil da terapia.

Qualquer aumento na quantidade de níveis de Phe da dieta que podem ser tolerados pelo paciente como resultado do tratamento será considerado como sendo um resultado terapeuticamente eficaz. Por exemplo, está contemplado que como resultado da administração da terapia de PAL (quer sozinha quer em combinação com outra intervenção terapêutica), o paciente será capaz de aumentar a sua ingestão dietética de Phe de 400-600 mg/dia (i.e., o fenótipo de tolerância de Phe do paciente é alterado do de um paciente que PKU leve para o de uma paciente de HPA leve) para permitir que o paciente tenha uma ingestão de mais de 600 mg de Phe/dia (isto é, ingestão dietética normal).

Além disso, mesmo que o paciente seja um que só manifesta os sintomas de HPA não PKU, i.e., tem uma elevada concentração plasmática de Phe de até 600 μΜ, mas está de outro modo autorizado a comer uma dieta normal de proteína, beneficiará da terapia de PAL do invento porque se mostrou que que concentrações elevadas de Phe têm efeitos significativos no QI de tais indivíduos. Além disso, tal como discutido abaixo, a intervenção terapêutica de PAL de sujeitos com necessidades especiais, p. ex., mulheres grávidas e bebés, é particularmente importante mesmo que os níveis plasmáticos de Phe do paciente estejam dentro do nível considerado como "seguro" de menos de 200 μΜ. PKU Materna e Métodos de Tratamento Desta O controlo metabólico dos níveis plasmáticos de Phe em mulheres com PKU que planeiem concepção e daquelas que estejam grávidas é importante devido às consequências graves para o feto exposto a níveis de Phe in utero mesmo que moderados, independentemente do estado de PAH do feto. O controlo terapêutico da concentração plasmática de Phe é especialmente importante no primeiro trimestre da gravidez, uma vez que a incapacidade de alcançar um controlo adequado resultará em distúrbios incluindo microcefalia, deficiência mental e cardiopatia congénita.

Por exemplo, o NIH Consensus Statement (vol 17 #3, outubro de 2000) em fenilcetonúria relatou que a exposição de um feto a níveis maternos de Phe de 3-10 mg/dl, produzia uma incidência de 24% de microcefalia, enquanto os expostos a mais de 20 mg/dl (isto é, mais de 1200 M) tinham uma incidência de 73% de microcefalia. Da mesma forma, verificou- se cardiopatia congénita em mais de 10% dos bebés expostos a níveis maternos de Phe que eram superiores a 20 mg/dl. Mais importante, verificou-se que níveis de Phe superiores a 6 mg/dl diminuem significativamente o QI da criança. Assim, é imperativo assegurar que a concentração plasmática de Phe de mulheres com todas as formas de fenilcetonúria, mesmo aquelas manifestando a HPA mais leve, deve ser rigorosamente controlada de modo a evitar o risco de síndroma de PKU materna. No entanto, os níveis alvo aceitáveis para as concentrações plasmáticas de Phe de mulheres com PKU que têm sido usados nas clínicas dos EUA têm variado entre 10 mg/dl e 15 mg/dl, que são muito mais elevados que os níveis de 2-6 mg/dl recomendados para mulheres grávidas ou os 1-4 mg/dl que são utilizados nas clínicas britânicas e alemãs para diminuir os riscos de desenvolvimento de síndroma de PKU materna.

Outra consideração importante para as mulheres grávidas é a sua ingestão total de proteínas. Durante a gravidez, é importante que as mulheres comam proteína suficiente porque foi sugerido que uma dieta pobre em proteínas durante a gravidez resultará no desenvolvimento de atraso renal e subsequente redução do número de nefrónios e leva potencialmente a hipertensão na idade adulta. (D'Agostino, N. Engl. J. Med. 348(17):1723-1124, (2003)). A seguinte tabela proporciona diretrizes exemplares para a ingestão de proteína na dieta total recomendada para vários indivíduos.

Tal como pode ser observado a partir das orientações exemplares acima, nos Estados Unidos a ingestão recomendada de proteína para mulheres em idade fértil (p. ex. , menos de 51) é de cerca de 44 a 50 g/dia, enquanto às mulheres grávidas é recomendada uma ingestão de cerca de 60 g/dia. No Canadá e no Reino Unido, a ingestão de proteína recomendada às mulheres grávidas está na ordem de cerca de 70 g/dia e 52 g/dia. Assim, a necessidade de assegurar que os níveis de concentração plasmática de Phe de mulheres grávidas são rigidamente controlados é ainda mais complicada pelo facto deste grupo de pacientes de PKU precisar de mais proteína que as mulheres com PKU não grávidas em idade comparável.

Tendo em vista o acima exposto, está contemplado que as terapias de PAL aqui descritas serão particularmente úteis em mulheres grávidas. Está contemplado que uma mulher sofrendo de qualquer forma de HPA que esteja grávida ou a considerar engravidar será colocada no curso de uma terapia de PAL para assegurar que os seus níveis de concentração plasmática de Phe são mantidos tão próximo de 180 M a cerca de 360 M quanto possível. Tal curso de terapia permitiria que a mulher aumentasse seu nível de ingestão de proteína normal. A discussão dos níveis de concentrações plasmáticas de Phe e dos graus a que tais concentrações de Phe devem ser diminuídas aqui acima discutidas é incorporada na presente secção para mulheres grávidas.

Gestão de PKU em Bebés e Métodos de Tratamento Desta

Tal como aqui discutido ao longo do texto, determinou-se que uma elevação da concentração plasmática de Phe em bebés (dos zero aos 3 anos de idade) resulta numa queda significativa no QI da criança. No entanto, tal como foi já discutido noutra parte do fascículo, os pacientes que têm elevadas concentrações plasmáticas de Phe, de qualquer valor até 400 M, não recebem uranalmente qualquer intervenção dietética. Assim, os bebés com zero a 3 anos de idade sofrem de efeitos deletérios significativos das terapias atuais. O presente pedido contempla o tratamento de qualquer bebé possuindo uma concentração plasmática de Phe sem restrições que seja superior a 360 μΜ ± 15 μΜ com uma composição terapêutica que compreende PAL para produzir uma diminuição benéfica da concentração plasmática de Phe nesse sujeito.

Tal como aqui descrito, o bebé tem entre zero e 3 anos de idade e tem uma concentração plasmática de Phe sem restrições de cerca de 1200 μΜ antes da administração de PAL e a referida administração diminui a concentração plasmática de Phe. Especificamente, a concentração plasmática de Phe é diminuída para de mais de 1800 a cerca de 1500 μΜ, cerca de 1200 μΜ, cerca de 1100 μΜ, cerca de 1000 μΜ, cerca de 900 μΜ, cerca de 800 μΜ, cerca de 700 μΜ, cerca de 600 μΜ, cerca de 550 μΜ, cerca de 500 μΜ, cerca de 450 μΜ, cerca de 400 μΜ, cerca de 350 μΜ, cerca de 300 μΜ, cerca de 275 μΜ, cerca de 250 μΜ após administração. Especificamente, o bebé tem entre zero e 3 anos de idade e tem uma concentração plasmática de Phe sem restrições superior a 1200 μΜ e esta concentração plasmática de Phe é diminuída para cerca de 800 μΜ, para cerca de 500 μΜ, ou para cerca de 360 μΜ, após administração de PAL, quer sozinha quer em combinação com a dieta. Os peritos na técnica entenderão que o invento contempla o tratamento de bebés com concentrações plasmáticas de Phe sem restrições superiores a 360 μΜ com PAL para produzir uma diminuição em tais concentrações plasmáticas de Phe. A discussão das reduções terapêuticas das concentrações plasmáticas de Phe acima é aqui incorporada por referência. Além disso, qualquer diminuição acima de 10% da concentração plasmática de Phe sem restrições inicial será considerada um resultado terapêutico para os regimes terapêuticos para os bebés. Deve entender-se que as terapias de PAL podem ser combinadas com restrições dietéticas para realizar a diminuição terapêutica nas concentrações plasmáticas de Phe em tais bebés. A Tabela 2 lista várias condições de doença em que a administração de quantidades terapeuticamente eficazes de PAL seria benéfica. A via de administração padrão parentérica, oral, ou outra e a dosaqem podem ser determinadas utilizando métodos padrão.

2. COMPOSIÇÕES PARA UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO 0 presente invento contempla intervenção terapêutica em PKU/HPA. Tal intervenção baseia-se inicialmente na utilização de PAL, que pode ser utilizada sozinha ou em combinação com restrições dietéticas. Além disso, PAL e/ou restrições dietéticas podem também ser combinadas com outras composições terapêuticas que sejam concebidas, por exemplo, para combater outras manifestações de PKU, tais como por exemplo, aminoácidos grandes e neutros para evitar a acumulação de Phe no cérebro (ver Koch, et al.r Mol. Genet. Metabol. 79:110-113 (2003)) ou suplementação de tirosina. A presente seção proporciona uma discussão das composições que podem ser utilizadas nos tratamentos aqui contemplados.

Composições de PAL

Em geral, o presente invento contempla composições farmacêuticas para utilização compreendendo quantidades eficazes da proteína ou produtos derivados do invento juntamente com diluentes, estabilizadores, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adjuvantes e/ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições incluem diluentes de vários teores de tampão (p. ex., Tris-HCl, fosfato), pH e força iónica; aditivos tais como detergentes e agentes solubilizantes (p. ex., Polissorbato 20, Polisorbato 80), antioxidantes (p. ex., ácido ascórbico, metabissulfito de sódio), conservantes (p. ex., Timerosol, álcool benzílico) e substâncias espessantes (p. ex., lactose, manitol) ; ver, p. ex., "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18a Edição (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.) páginas 1435:1712. Uma quantidade eficaz do ingrediente ativo é uma quantidade eficaz terapeuticamente, profilaticamente ou em termos de diagnóstico, que possa ser facilmente determinada por um perito na técnica tendo em consideração fatores tais como o peso corporal, a idade, e o objetivo terapêutico.

As composições de PEG:PAL para utilização de acordo com o presente invento podem também incluir um agente de tamponamento para manter o pH da solução dentro de um intervalo desejado. Agentes exemplares incluem acetato de sódio, fosfato de sódio e citrato de sódio. Podem também ser utilizadas misturas destes agentes de tamponamento. A quantidade de agente de tamponamento útil na composição depende em grande medida do tampão particular utilizado e do pH da solução. Por exemplo, acetato é um tampão mais eficiente a pH 5 que a pH 6, assim pode ser utilizado menos acetato numa solução a pH 5 que a pH 6. Numa concretização, o intervalo de pH para as composições do presente invento é pH 3,0-7,5.

As composições para utilização de acordo com o presente invento podem além disso incluir um agente de ajuste da isotonicidade para tornar a solução isotónica e mais compatível para injeção. Um exemplo é cloreto de sódio dentro de um intervalo de concentrações de 0-150 mM.

Tal como aqui utilizado, e quando contempla conjugados PEG:PAL, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade, que dá uma diminuição da L-fenilalanina sérica que proporciona benefícios a um paciente. A quantidade variará de um indivíduo para outro e dependerá de vários fatores, incluindo a condição física geral do paciente. A quantidade de PAL utilizada para terapia dá uma taxa aceitável de diminuição da L-fenilalanina sérica e mantém este valor a um nível benéfico (geralmente pelo menos cerca de 30% e tipicamente no intervalo de 10% a 50%) . Uma quantidade terapeuticamente eficaz das presentes composições pode ser facilmente determinada por um perito na técnica utilizando materiais e procedimentos disponíveis ao público.

Os conjugados PEG:PAL podem ser administrados menos frequentemente que a PAL nativa. A frequência de dosagem variará dependendo da condição a tratar, mas será em geral de cerca de uma vez por semana. Entende-se que as frequências de dosagem realmente utilizadas podem variar um pouco das frequências aqui divulgadas devido a variações nas respostas dos diferentes indivíduos aos conjugados PEG:PAL; o termo "cerca de" destina-se a refletir essas variações.

Os compostos do invento podem ser assim utilizados para reduzir os níveis de L-fenilalanina sérica. Mais vulgarmente, os níveis de L-fenilalanina sérica estão aumentados devido a hiperfenilalaninamia. Entre as condições tratáveis através do composto da invenção estão hiperfenilalaninamia associada a fenilcetonúria. São também tratáveis condições que possam levar a um aumento dos níveis de L-tirosina sérica tal como verificado em tirosinemia. Além disso, numerosas condições relacionadas com cancro, onde a depleção de L-fenilalanina sérica e/ou dos níveis de L-tirosina sérica seria benéfica, podem também ser tratadas com os conjugados PEG:PAL do invento.

Tal como aqui descrito, os conjugados PEG:PAL preparados de acordo com o presente invento são administrados através de injeção por via intraperitoneal, subcutânea, ou intramuscular. No entanto, será evidente para um perito na técnica que outras vias de distribuição podem também ser utilizadas de forma eficaz utilizando as composições do presente invento.

Os métodos aqui descritos utilizam composições farmacêuticas compreendendo as moléculas acima descritas, juntamente com um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, outros ingredientes terapêuticos e/ou profilácticos. Tais excipientes incluem líquidos tais como água, solução salina, glicerol, polietilenoglicol, ácido hialurónico, etanol, ciclodextrinas, ciclodextrinas modificadas (i.e., éter sufobutílico-ciclodextrinas), etc. Excipientes adequados para formulações não líquidas são também conhecidos dos peritos na técnica.

Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados nas composições para utilização de acordo com o presente invento e incluem, por exemplo, sais de ácidos minerais tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos, e semelhantes; e os sais de ácidos orgânicos tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, e semelhantes. Uma discussão completa de excipientes e sais farmaceuticamente aceitáveis está disponível em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18a Edição (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990) .

Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, substâncias de tamponamento biológicas, tensioativos, e semelhantes, podem estar presentes em tais veículos. Um tampão biológico pode ser virtualmente qualquer solução que seja farmacologicamente aceitável e que proporcione a formulação com o pH desejado, isto é, um pH no intervalo fisiologicamente aceitável. Exemplos de soluções tampão incluem solução salina, solução salina tamponada com fosfato, solução salina tamponada com Tris, solução salina tamponada de Hank, e semelhantes.

Dependendo do modo de administração pretendido, as composições farmacêuticas podem estar na forma de dosagem sólidas, semissólidas ou líquidas, tais como, por exemplo, comprimidos, supositórios, pílulas, cápsulas, pós, líquidos, suspensões, cremes, pomadas, loções ou semelhantes, e na forma de dosagem unitária adequada para administração única de uma dosagem precisa. As composições incluirão uma quantidade eficaz do fármaco selecionado em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável e, além disso, podem incluir outros agentes farmacêuticos, adjuvantes, diluentes, tampões, etc.

Em geral, os compostos ou conjugados do presente invento podem ser administrados como formulações farmacêuticas incluindo as apropriadas para administração oral (incluindo bucal e sublingual), retal, nasal, tópica, pulmonar, vaginal ou parentérica (incluindo intramuscular, intra-arterial, intratecal, subcutânea e intravenosa) ou numa forma adequada para administração através de inalação ou insuflação. Um modo exemplar de administração é a intravenosa usando um regime de dosagem diária conveniente, que pode ser ajustado de acordo com o grau de aflição.

Para composições sólidas, veículos sólidos não tóxicos convencionais incluem, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de magnésio, e semelhantes. Composições líquidas farmaceuticamente administráveis podem, por exemplo, ser preparadas através da dissolução, dispersão, etc., um composto ativo ou conjugado tal como aqui descrito e adjuvantes farmacêuticos opcionais num excipiente, tal como, por exemplo, água, solução salina, dextrose aquosa, glicerol, etanol, e semelhantes, para assim formar uma solução ou suspensão. Se desejado, a composição farmacêutica a administrar pode também conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes de tamponamento do pH, agentes tonificantes, e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, monolaurato de sorbitano, acetato de sódio de trietanolamina, oleato de trietanolamina, etc. Métodos atuais de preparação de tais formas de dosagem são conhecidos, ou serão evidentes, para os peritos nesta técnica; por exemplo, ver "Remington's Pharmaceutical Sciences", referenciado acima.

Para administração oral, a composição terá geralmente a forma de um comprimido, uma cápsula, ou uma cápsula softgel, ou pode ser uma solução aquosa ou não aquosa, suspensão ou xarope. Os comprimidos e as cápsulas são algumas das formas de administração oral. Comprimidos e cápsulas para administração oral incluirão geralmente um ou mais transportadores vulgarmente utilizados tais como lactose e amido de milho. Agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, são também tipicamente adicionados. Quando são utilizadas suspensões líquidas, o agente ativo pode ser combinado com agentes emulsionantes e de suspensão. Se desejado, agentes aromatizantes, corantes e/ou edulcorantes podem também ser adicionados. Outros componentes opcionais para incorporação numa formulação oral aqui incluem conservantes, agentes de suspensão, agentes espessantes, e semelhantes.

Formulações parentéricas podem ser preparadas em formas convencionais, quer como soluções liquidas quer como suspensões, formas sólidas adequadas para solubilização ou suspensão num liquido antes da injeção, ou como emulsões. Especificamente, são formuladas suspensões injetáveis estéreis de acordo com técnicas conhecidas na especialidade utilizando transportadores, agentes de dispersão ou molhantes e agentes de suspensão adequados. A formulação injetável estéril pode também ser uma solução injetável estéril ou uma suspensão num diluente ou solvente não tóxico parentericamente aceitável. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregues estão água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotónica. Além disso, óleos fixos, ésteres gordos ou polióis estéreis, são convencionalmente empregues como solventes ou meios de suspensão. Além disso, a administração parentérica pode envolver a utilização de um sistema de libertação lenta ou de libertação sustida de modo a que seja mantido um nível constante de dosagem.

Os conjugados PEG:PAL identificados descritos acima podem ser administrados a um paciente a doses terapeuticamente eficazes para tratar ou melhorar uma doença cardiovascular. A toxicidade e eficácia terapêutica de tais conjugados podem ser determinadas através de procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, tais como, por exemplo, através da determinação da LD50 (a dose letal para 50% da população) e da ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de doses entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expresso como a razão LD50/ED50. Conjugados exibindo grandes índices terapêuticos podem ser empregues.

Os dados obtidos a partir dos ensaios de culturas celulares e estudos animais podem ser utilizados na formulação de um intervalo de dosagem para utilização em humanos. Especificamente, a dosagem reside dentro de um intervalo de concentrações em circulação que incluem a ED50 com pouca ou minima toxicidade. A dosagem pode variar dentro deste intervalo dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizadas. A dose terapeuticamente eficaz pode ser determinada a partir de ensaios de cultura de células, e a partir de modelos animais.

Proteína da Dieta

Além da administração de PAL e de análogos relacionados a pacientes com HPA/PKU, está contemplado que a proteína da dieta dos pacientes pode também ser restringida ou modificada. Os peritos na técnica estão cientes de várias fórmulas de proteínas comercialmente disponíveis para uso no tratamento de PKU. Tais fórmulas incluem MAXIMAID, MAXIMAID, PHENEX 1, PHENEX 2 (Ross Laboratories, Liverpool, UK), LOFENALAC, FENIL-FREE (Mead-Johnson), e semelhantes.

Os peritos na técnica podem utilizar as fórmulas proteicas referenciadas que em geral são livres de concentrações de Phe. As fórmulas proteicas são frequentemente suplementadas com aminoácidos que estão deficientes em pacientes com PKU. Tais aminoácidos incluem, por exemplo, L-tirosina, e L-glutamina. Foi sugerido que pode ser desejável suplementar a dieta de pacientes com PKU com valina, isoleucina e leucina (ver Patente U.S. No. 4252822) . Em certas manifestações clínicas, os efeitos tóxicos de PKU são causados por Phe bloqueando a captação no cérebro de outros aminoácidos tais como tirosina e triptofano. Verificou-se que a suplementação da dieta de um paciente de PKU com excesso de tais aminoácidos grandes neutros bloqueia a captação de Phe no cérebro e reduz os níveis cerebrais de Phe. Assim, está contemplado que para os métodos aqui descritos o regime dietético pode ser além disso suplementado com composições que compreendem um ou mais destes aminoácidos (Koch, et al., Mol. Genet. Metabol. 79:110-113 (2003)).

Além disso, sabe-se que a L-carnitina e a taurina, que são normalmente verificadas no leite humano e noutros produtos alimentares de origem animal, devem também ser fornecidas para além da restrição de proteínas. Especificamente, a L-carnitina pode ser fornecida como 20 mg/100 g de suplemento de proteína, e a taurina pode ser fornecida como 40 mg/100 g de suplemento de proteína, para ajudar a fornecer quantidades destes fatores normalmente verificados no leite humano e alimentos de origem animal.

Além disso, os peritos na técnica referem-se a 2000 National Academy of Sciences-National Research Council Dietary Reference Intakes para mais uma listagem de outros componentes, tais como vitaminas e minerais essenciais que devem ser fornecidos ao paciente para assegurar que outros suplementos estão a ser proporcionados apesar da restrição de proteínas na dieta.

Em relação à discussão acima relativa às quantidades totais de proteína e concentrações plasmáticas de Phe desejáveis, um perito na técnica será capaz de determinar a quantidade de restrição de proteína na dieta que é necessária e ajustar assim a dieta do paciente em conformidade. Tomando por exemplo, um rapaz de cerca de 11-14 anos de idade, esse indivíduo deve receber 45 g de proteína/dia. No caso em que o indivíduo é um que tem PKU clássica grave, a sua concentração plasmática de Phe sem restrições será provavelmente superior a 1200 M, e mais, se nem toda a fonte de proteína da dieta para esse indivíduo for de um suplemento de proteína em pó, o que pode diminuir as suas concentrações plasmáticas de Phe para menos de 600 M. Através da administração de PAL a esse sujeito, um resultado terapêutico seria um que produzisse uma maior diminuição nas concentrações plasmáticas de Phe do paciente ou, alternativamente, o resultado terapêutico é um em que as concentrações plasmáticas de Phe do indivíduo são reduzidas até um grau semelhante, mas esse indivíduo é capaz de tolerar a proteína a partir de uma dieta normal em vez de a partir de uma fórmula dietética.

Semelhantemente, para um rapaz de cerca de 11-14 anos de idade que tenha PKU moderada, pode ser possível utilizando os métodos aqui descritos dar-lhe os 45 g de proteína/dia atribuídos através de uma ingestão normal de proteína em vez de uma fórmula restrita. A determinação de se os métodos aqui descritos são eficazes implicará a determinação das concentrações plasmáticas de Phe do paciente numa base regular para assegurar que as concentrações plasmáticas de

Phe permanecem abaixo de pelo menos 400 M. Os testes para a determinação de tais concentrações são descritos abaixo. Especificamente, concentrações de menos de ou cerca de 360 M são alcançadas.

3. IDENTIFICAÇÃO E MONITORIZAÇÃO DE POPULAÇÕES DE PACIENTES

Tal como aqui discutido ao longo do texto, será necessário determinar se um dado paciente é responsivo à terapia de PAL, e determinar a concentração de fenilalanina do paciente tanto inicialmente para identificar a classe de paciente de PKU a tratar como durante um regime terapêutico em curso para monitorizar a eficácia do regime. Exemplos de tais métodos são aqui descritos abaixo.

Teste de Carga de BH4 O teste de carga de BH4 permite a discriminação dos pacientes que têm HPA devido a um défice de BH4 ou a uma deficiência em PAH. O teste de carga de BH4 mais simples é aquele em que BH4 exógena é administrada e os efeitos da administração na redução das concentrações plasmáticas de Phe são determinados. Uma carga intravenosa de BH4 de 2 mg/kg foi inicialmente proposta por Danks, et al., Lancet 1:1236 (1976), mas à medida que se tornou disponível BH4 de maior pureza tornou-se possível realizar o teste usando uma administração oral de BH4 em quantidades de cerca de 2,5 mg/kg de peso corporal. Finalmente, foi proposta uma abordagem padronizada por Niederwieser et al. em que é administrada uma dose única oral de 7,5 mg/kg de BH4 (Niederwieser, et al. , Eur. J. Pediatr. 138:441 (1982)), embora alguns laboratórios ainda utilizem mais de 20 mg de BH4/kg de peso corporal.

Para que o teste de carga de BH4 simples produza resultados fiáveis, os níveis de Phe no sangue do paciente precisam de ser maiores que 400 M. Portanto, é frequentemente habitual que o paciente seja retirado da dieta de PKU durante 2 dias antes da realização do teste de carga.

Um estojo de teste de BH4 está disponível e é distribuído por

Dr. Schircks Laboratories (Jona, Suiça). Este estojo recomenda uma dosagem de 20 mg de BH4/kg de peso corporal cerca de 30 minutos após a ingestão de uma refeição normal.

Determinação das Concentrações de Phe

Existem numerosos métodos para a determinação de Phe no sangue (Shaw et ai., "Analytical Methods in Phenylketonuria-Clinical Biochemistry", em Bickett et al. Eds., "Phenylketonuria and Some Other Inborn Errors of Amino acid Metabolism", Stuttgart, Georg Thiem Verlag, 47-56 (1971)).

Tipicamente, as concentrações de fenilalanina e tirosina são determinadas a partir do soro de um paciente utilizando um ensaio fluorométrico. Este ensaio baseia-se na formação de substância fluorescente quando a fenilalanina é aquecida com ninidrina na presença de leucilalanina (McCaman, et al., J. Lab. Clin. Med. 59:885-890 (1962)). O método mais popular para a determinação de concentrações de Phe é o teste de Guthrie em que são puncionados discos a partir de papel de filtro que foi saturado com uma amostra de sangue do paciente. Os discos uniformes são incubados numa bandeja de agar que foi semeada com Bacillus subtilis e contém um inibidor especifico do crescimento de Bacillus subtilis. Uma vez que a fenilalanina se transfere dos discos uniformes para o agar, a Phe reverte a inibição do crescimento bacteriano originando assim uma área de crescimento bacteriano que pode ser correlacionada com a concentração de fenilalanina através de comparação com ensaios semelhantes realizados utilizando discos contendo quantidades conhecidas de Phe.

Outros métodos de quantificação da concentração de Phe incluem HPLC, espectrometria de massa, cromatografia em camada fina e semelhantes. Tais métodos podem ser usados para determinar a concentração plasmática de Phe de um paciente antes da terapia e para monitorizar a concentração de Phe durante o regime terapêutico para determinar a eficácia desta.

Está contemplado que os niveis plasmáticos de Phe nos pacientes serão monitorizados em intervalos convenientes (p. ex., diariamente, de dois em dois dias ou semanalmente) ao longo do curso de tempo do regime terapêutico. Através da monitorização dos niveis plasmáticos de Phe com tal regularidade, o médico será capaz de avaliar a eficácia do tratamento e ajustar a PAL e/ou os requisitos de proteína na dieta em conformidade.

4. TERAPIA DE COMBINAÇÃO

Certos métodos aqui descritos envolvem a utilização combinada de PAL e restrição de proteínas na dieta para efetuar um resultado terapêutico em pacientes com várias formas de HPA. Para alcançar o efeito terapêutico adequado nas terapias de combinação aqui contempladas, pode-se geralmente administrar ao sujeito a composição de PAL e a restrição dietética numa quantidade combinada eficaz para produzir o resultado terapêutico desejado (isto é, um abaixamento da concentração plasmática de Phe e/ou a capacidade de tolerar maiores quantidades de ingestão de Phe/proteína sem produzir um aumento concomitante nas concentrações plasmáticas de Phe) . Este processo pode envolver a administração da composição de PAL e a composição terapêutica de proteína da dieta ao mesmo tempo. Isto pode ser conseguido através da administração de uma única composição ou formulação de proteína farmacológica que inclua todos os requisitos de proteína da dieta e inclui também a PAL dentro da referida formulação de proteína. Alternativamente, a proteína da dieta (suplemento ou refeição proteica normal) é tomada a cerca do mesmo tempo que uma formulação farmacológica (comprimido, injeção ou bebida) de PAL. A PAL pode também ser formulada numa barra proteica ou outros produtos alimentares, tais como bolos de chocolate, panquecas, bolo, adequados para ingestão.

Noutras alternativas, o tratamento de PAL pode preceder ou seguir-se à terapia dietética de proteína em intervalos variando de minutos a horas. Nos casos em que a proteína e as composições de PAL são administradas separadamente, pode-se geralmente assegurar que um período de tempo significativo não expira entre o tempo de cada distribuição, de modo que a PAL será ainda capaz de exercer um efeito vantajoso no paciente. Em tais casos, está contemplado que se poderia administrar a PAL dentro de cerca de 2-6 horas (antes ou depois) da ingestão de proteína da dieta, com um tempo de atraso de apenas cerca de 1 hora nalguns casos. Especificamente, está contemplado que a terapia de PAL será uma terapia contínua, onde uma dose diária de PAL é administrada ao paciente indefinidamente. Noutras situações, p. ex., em mulheres grávidas possuindo apenas as formas mais leves de PKU e HPA, pode ser que a terapia de PAL seja mantida apenas durante o tempo em que a mulher está grávida e/ou a amamentar.

Além disso, além das terapias baseadas apenas na distribuição de PAL e regulação da proteína da dieta, os métodos aqui descritos contemplam também terapia de combinação com uma terceira composição que se dirija especificamente a um ou mais dos sintomas de HPA. Por exemplo, sabe-se que o défice em tirosina causado por HPA resulta numa deficiência nos neurotransmissores dopamina e serotonina. Assim, está contemplado que os métodos baseados em PAL e proteína da dieta possam, além disso, combinar-se com administração dos neurotransmissores L-dopa, carbidopa e 5-hidroxitriptofano para corrigir os defeitos que resultam da diminuição da quantidade de tirosina na dieta.

Uma vez que a administração de PAL não gerará tirosina (ao contrário da administração de PAH), tal tratamento resultará ainda em que a tirosina seja um aminoácido essencial para tais pacientes. Portanto, suplementação dietética com tirosina pode ser desejável para pacientes recebendo PAL em combinação com a terapia de BH4.

I. PESQUISA E CARACTERIZAÇÃO DE HOMÓLOGOS DE PAL

Ainda aqui descrito está um ensaio de pesquisa para identificação de PAL bacteriana que pode prevenir, melhorar, ou reduzir níveis aumentados de fenilalanina colocando uma célula contendo níveis de fenilalanina elevados em contacto com PAL bacteriana e determinando se a PAL bacteriana reduz tais níveis de fenilalanina elevados. Especificamente, o método é um ensaio de elevado rendimento. Especificamente, genomas completos das espécies bacterianas são sequenciados e pesquisados quanto à presença de homólogos de PAL utilizando uma abordagem bioinformática. Os genes com homologia com encP podem ser identificados e a análise BLAST da sequência proteica relacionada é conduzida para determinar a percentagem de identidade. Os alinhamentos da sequência primária de tais proteínas são avaliados quanto à presença de resíduos conservados essenciais para a atividade de PAL. A posição 83 (HAL de P. putida) de todas as enzimas HAL é uma histidina enquanto em enzimas com atividade de PAL é um aminoácido alifático, por exemplo, leucina ou valina. A análise na posição 83 elucidará se as enzimas HAL anotadas podem estar mal classificadas e se de facto demonstram terem atividade de PAL. Por exemplo, a posição 413 é uma glutamina (Q) na maioria das enzimas HAL e é seguida na posição 414 por um ácido glutâmico (E) em todas as enzimas HAL. Por comparação, a posição 414 é uma glutamina (Q) seguida na posição 415 por um ácido aspártico (D), ou uma asparagina (N) na maioria das enzimas PAL identificadas até agora. As enzimas HAL anotadas representativas que através deste método bioinformático se determinam como estando mais provavelmente erroneamente classificadas como enzimas PAL procariotas incluem as enzimas HAL de Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 (ZP 00005404), de Rubrobacter xylanophilus DSM9941 (ZP 00188602), de Photorhhabdus luminescens subsp. Laumondii TT01 (NP 930421), de Thermoanaerobacter tengcongensis (AA051415).

Especificamente, a atividade catalítica de PAL do produto proteico de tal homologia é confirmada. Os genomas de homólogos de PAL podem ser amplificados através de PCR e clonados em pHIS8 ou num vetor semelhante. As putativas proteínas PAL são expressas de forma heteróloga em E. coli como proteínas etiquetadas com His, purificadas e ensaiadas quanto à atividade de PAL. Ensaios para a atividade de PAL podem incluir a capacidade para converter fenilalanina em cinamato in vitro, a incapacidade para converter tirosina em p-coumarato in vitro, ensaios para testar a atividade de HAL e ensaios para caracterizar a cinética das enzimas.

J. PRODUÇÃO DE PAL PROCARIÓTICA

É também aqui descrito um método de produção de PAL procariótica. Especificamente, a PAL recombinante é sobre-expressa como uma proteína de fusão etiquetada no terminal N com octa-hist idilo num vetor, por exemplo, E. coli BL21 (DE3)/pLysS (Invitrogen) com um promotor indutível tal como com IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido). Alternativamente, a PAL recombinante é sobre-expressa em células de E. coli BL21(DE3)/pLysS sem uma etiqueta N-terminal. A cultura de sementeira para urn biorreator/fermentador é cultivada a partir de uma reserva em glicerol em frascos de agitação. Tal cultura de sementeira é então utilizada para entrar num biorreator controlado em modo de alimentação em lotes. A glicose é suplementada e o pH é controlado com base (NH4OH) e a agitação é até 1200 rpm. A alimentação de O2 mantém o oxigénio dissolvido a mais de 20%. As células são cultivadas a uma temperatura de 30 °C até alcançarem uma DCboo de 70-100 (-22-25 h) e em seguida induzidas com IPTG 0,4 mM. A temperatura é reduzida até 22 a 26°C e cultivadas até a mudança de atividade ser <0,1 Ul/ml (aproximadamente 40-48 h e uma DCboo tipicamente de 200) . O meio de cultura celular é definido tipicamente e composto por extrato proteico de levedura, peptona-triptona, glicose, glicerol, casaminoácidos, sais vestigiais e sais de tampão fosfato. O produto PAL recombinante é produzido intracelularmente e não segregado. As bactérias são colhidas através de centrifugação contínua (Alfa-Laval, Carr, Ceba, ou equivalente).

K. PURIFICAÇÃO DE PAL PROCARIÓTICA É ainda aqui descrito um método para purificar PAL bacteriana ou um fragmento, mutante ou análogo biologicamente ativo desta. Especificamente, uma massa de células transformadas é cultivada e rompida deixando a enzima recombinante bruta. Os materiais exógenos são normalmente separados da massa bruta para evitar a incrustação das colunas. A purificação cromatográfica é conduzida utilizando uma ou várias resinas cromatográficas. Subsequentemente, a proteína purificada é formulada num tampão concebido para proporcionar uma atividade estável ao longo de um período de tempo prolongado. Especificamente, o método para purificar a PAL bacteriana compreende: (a) lise das bactérias contendo a PAL recombinante, utilizando um homogeneizador de pressão (mas potencialmente através de outros meios físicos tais como lise com contas de vidro); (b) tratamento térmico; (c) clarificação deste lisado usando um segundo passo de centrifugação contínua e/ou filtração em profundidade (tal como com Cuono Zeta Plus ou Maximizer, Pall Filtron, ou Millipore Millistak ou filtros Opticao); (d) passagem através de um passo de filtração em carvão vegetal (tal como Millipore Millistak 40AC); (e) passagem através de um passo final de filtração (tal como com um filtro Sartorius

Sartopore de 0,2); (f) passagem sobre uma cromatografia de interação hidrófoba de butilo (tal como em Toyopearl Butyl 650M de Tosoh Biosciences); (g) passagem sobre uma coluna de permuta iónica Q (tal como numa Macroprep High Q de BioRad); e (h) recuperação do produto final através de mudança do tampão com filtração de fluxo tangencial (tal como com uma membrana Sartorious Hidrosart ou PES de 100 kDa). Os peritos na técnica apreciarão facilmente que um ou mais dos passos de cromatografia podem ser suprimidos ou substituídos, ou que a ordem dos passos de cromatografia pode ser alterada. Finalmente, passos de esterilização apropriados podem ser realizados tal como desejado.

Tendo agora descrito geralmente o invento, o mesmo pode ser mais facilmente compreendido através da seguinte referência aos exemplos que se seguem. Foram feitos esforços para assegurar exatidão em relação aos números utilizados (p. ex., quantidades, temperaturas, etc.), mas devem ser permitidos, claro, alguns erros e desvios experimentais. EXEMPLO 1

Clonagem de PAL de Nostoc punctiforme e Anabaena variabilis Manipulações de ADN ADN genómico de N. punctiforme foi adquirido em ATCC (29133D) e o gene de PAL (ZP_00105927) foi amplificado por PCR a partir dos iniciadores 5'- CACTGTCATATGAATATAACATCTCTACAACAGAACAT-3' (SEQ ID NO:12) e 5'-GACAGTGGCGGCCGCTCACGTTGACTTTAAGCTCGAAAAAATATG-3' (SEQ ID NO: 13) . O produto de PCR resultante foi digerido com Ndel e NotI e o fragmento de 1,7 kb foi ligado em pET-28a(+) e pET-30a(+) (Novagen) para a sua forma etiquetada em N com His e não etiquetada, respetivamente. Células de A. variabilis foram adquiridas em ATCC (29413). 0 ADN genómico foi extraído (Qiagen) e o gene de PAL (YP_324488) foi amplificado por SOE-PCR para remover um local Nhel. 0 iniciador 1 (5'— CACTGTGCTAGCATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3') (SEQ ID N0:14) e iniciador 2 (5'— GGAAATTTCCTCCATGATAGCTGGCTTGGTTATCAACATCAATTAGTGG -3') (SEQ ID NO:15) foram utilizados para amplificar os nucleótidos 1-1190 e o iniciador 3 (5' — CCACTAATTGATGTTGATAACCAAGCCAGCTATCATGGAGGAAATTTCC-3' ) (SEQ ID NO:16) e iniciador 4 (5' — CACTGTGCGGCCGCTTAATGCAAGCAGGGTAAGATATCTTG-3') (SEQ ID NO:17) foram utilizados para amplificar os nucleótidos 1142-1771. Estes dois produtos de PCR foram combinados para amplificar o gene inteiro com os iniciadores 1 e 4. O produto de PCR resultante foi digerido com Nhel, tornado cego com Klenow (NEB), depois digerido com NotI. O fragmento de 1,7 kb foi ligado em pET-28a(+) e pET-30a(+) (Novagen).

Estirpes Bacterianas e Condições de Cultura Células de E. coli BL21 (DE3) (Stratagene) foram transformadas com pGro7 (TaKaRa) e células competentes BL21(DE3)pGro7 foram preparadas através do Método de Inoue (Sambrook e Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3a Edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001)). Estas células foram transformadas com pET-28-NpPAL e cultivadas em 25 ml de LB com canamicina a 50 mg/1 e cloranfenicol a 20 mg/1 de um dia para o outro a 37°C. Vinte mililitros desta cultura foram semeados em 1 1 de meio LB com canamicina, cloranfenicol, e L-arabinose a 500 mg/1 e cultivados a 37°C. A uma ϋΟεοο de 0,6, a cultura foi arrefecida em gelo. Após 5 minutos a cultura foi induzida com IPTG 0,3 mM e cultivada durante 16 horas a 20°C. As células foram colhidas através de centrifugação. Células BL21(DE3)pLysS (Stratagene) foram transformadas com AvPAL e cultivadas de forma idêntica a NpPAL sem a indução de arabinose. EXEMPLO 2

Purificação de NpPAL e AvPAL

As culturas foram centrifugadas numa centrífuga de bancada a 5000 g durante 20 minutos e o sobrenadante foi descartado. Os sedimentos celulares foram tipicamente congelados a -70°C antes de mais processamentos. Após descongelação, os sedimentos celulares foram suspensos a aproximadamente 80 unidades de densidade ótica (600 nm) em TBS (Tris 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,8) . As células foram lisadas através de duas passagens por um homogeneizador de pressão APV a 12-14000 psi. O lisado bruto foi então tratado termicamente a 55°C durante 2 horas. O lisado foi centrifugado a 10000 g durante 30 minutos e o sobrenadante retido e filtrado com um filtro de 0,2 m emáçuo (Corning). A PAL foi purificada a partir do lisado clarificado através de passagem sequencial através de uma coluna de butilo 650M (Tosoh Biosciences) e uma coluna MacroPrep High Q (BioRad). O produto eluído mostrou um elevado nível de pureza através tanto de SDS-PAGE como de HPLC de fase reversa. EXEMPLO 3

Geração de Variantes Peguiladas de PAL Peguilação da Proteína A peguilação utiliza modificações de métodos da literatura (Hershfield, et al. , ibid.; Patente U.S. No. 6057292; Lu, et al., Biochemistry 40(44):13288-13301 (2001);

Nektar Therapeutics, catálogo de 2003). PEG ativadas incluem tanto os succinatos de succinimidilo de PEG lineares (mPEG-SPA, PM 5 kDa ou PM 20 kDa) como as hidrosuccinimidas de PEG ramificadas (mPEG2~éster de NHS, PM 10 kDa ou PM 40 kDa) , que são ambos protegidos numa extremidade com um grupo metoxilo e disponíveis a partir de Nektar Therapeutics; a determinação experimental de proteínas peguiladas ótimas é normalmente requerida (Veronese, F.M., et al., J. Bioactive Compatible Polimers 12:196-207 (1997)). As condições ótimas de peguilação são determinadas utilizando diferentes razões de PAL:PEG (tendo em conta a razão molar de proteína em conjunto com o número de lisinas por monómero da proteína), diferentes pH, diferentes tampões, várias temperaturas e tempos de incubação. São necessárias elevadas razões de derivação proteína PAL:PEG uma vez que a PAL nativa tem um grande número de lisinas (29 e 18 por monómero de Rhodosporidium toruloides (Rt) e Anabaena variabilis (Av), respetivamente) e porque a PAL não modificada apresenta imunorreatividade após injeção repetida em ratinhos e uma vez que a PAL nua (tipo selvagem) é rapidamente inativada após exposição a proteases. As reações de peguilação são paradas através de congelação a -20°C, e as amostras serão analisadas através de SDS-PAGE, espetrometria de massa MALDI-TOF, avaliação da atividade, atividade proteolítica, e imunorreatividade.

Antes da atividade, proteólise, e avaliação imunológica, e para remover o excesso de PEG não reagido, as reações são dialisadas contra pH 8,5, tampão fosfato de potássio 0,05 M de um dia para o outro a 4°C com agitação utilizando Tube-O-Dialyzers (GenoTechnology). Após a concentração da proteína ser determinada utilizando o estojo de ensaio de proteínas NI (Geno Technology) , as medições da atividade de PAL serão realizadas em amostras de PAL não derivadas e derivadas com PEG utilizando condições reacionais padrão, tal como anteriormente descrito. Após a caraterização in vitro, serão conduzidos ensaios in vivo com os candidatos terapêuticos peguilados mais promissores utilizando o modelo de ratinho de PKU.

Caracterização A concentração proteica é determinada utilizando o coeficiente de extinção de PAL (0,5 e 0,83 mg ml_1cm_1 para RtPAL e AvPAL, respetivamente) a 280 nm para amostras de proteína não modificadas e para amostras de proteína peguilada a concentração é calculada utilizando o Ensaio de Proteínas NI (GenoTechnology) que inclui processamento das amostras para remover contaminantes não proteicos que possam interferir com a determinação precisa da concentração de proteína.

Os produtos PEG-PAL são caracterizados com MS MALDI-TOF para determinar o número de moléculas de PEG ligadas a cada mondmero de PAL, bem como caracterizados utilizando avaliação da atividade e SDS-PAGE e análise do gel nativo, para assegurar a retenção de atividade, derivação completa, e ausência de perda de formação de PAL tetramérica, respetivamente. Para amostras de PAL e PEG-PAL, a análise por espetroscopia de massa MALDI-TOF requer a utilização de ureia 0,5 M ou guanidina-HCl 0,025 M para melhorar a dissociação das subunidades e a reprodutibilidade da deteção de espécies.

Ensaio de Atividade de PAL O ensaio de atividade de PAL é conduzido usando um espetrof otómetro de UV Cary (Cary 50) no modo cinético. A atividade de PAL com substrato de L-fenilalanina é ensaiada à temperatura ambiente (25°C) através da medição da produção de trans-cinamato monitorizada através do aumento da absorvância a 290 nm (Hodgins, (1968) ibid.). O coeficiente de extinção molar do ácido trans-cinâmico a 290 nm é de 10,2381 litro M~ 1cm_1. As misturas reacionais contêm fenilalanina 22,5 mM em tampão Tris-HCl 100 mM, pH 8,5. Para medições padrão, a concentração final da enzima é de 0,0035 mg/ml, mas para estudos de cinética a concentração da enzima no ensaio é ajustada de modo a que o declive a 290 nm por min esteja no intervalo de 0,005 a 0,02. Os dados da atividade são expressos como atividade especifica (pmolxmih_1m_1) . Uma unidade de PAL é definida como a quantidade de enzima que produz 1 pmol de ácido trans-cinâmico por minuto à temperatura ambiente. EXEMPLO 4

Teste da Semivida In vitro e Imunogenicidade

Após caraterização bioquímica, os candidatos PEG-PAL mais promissores são pesquisados quanto à imunorreatividade contra anticorpos produzidos por ratinhos com PKU injetados com PAL nativa (não peguilada) utilizando três técnicas diferentes e complementares (Western blot, ELISA e imunoprecipitação (IP)) .

Para análise Western blot, antissoro de PAL (de ratinhos injetados com PAL nativa) é utilizado numa diluição de 1:10000. Como controlo negativo, o soro de ratinhos tratados com tampão é também utilizado na mesma diluição. O anticorpo secundário, IgG de cabra anti-ratinho conjugado com fosfatase alcalina (Promega), é diluído para 1:5000 e a cor é revelada utilizando o substrato de AP Western Blue (Promega). O teste ELISA é realizado utilizando placas Nunc/Immuno Maxisorp (Nalge Nunc International) seguindo procedimentos padrão utilizando 1 mg/ml de PAL em PBS e bloqueio com PBS, Tween-20 a 0,05%, BSA a 2%. Os antissoros de ratinho (de ratinhos expostos a PAL nativa) são diluídos 1:10000 em solução de bloqueio EB (PBS, Tween-20 a 0,05%, BSA a 2%), e uma IgG de cabra anti-ratinho marcada com HRP é utilizada como anticorpo secundário com TMB utilizado para deteção a 450 nm. É utilizada imunoprecipitação para testar a ligação do anticorpo a PAL. Amostras de proteína (PAL ou PAL peguilada) são incubadas em tampão TTBS (solução salina tamponada com Tris com Tween a 0,1%) e a atividade de PAL é medida antes da adição da amostra de anticorpo. Cada amostra é incubada com excesso de 8 vezes de soro anti-PAL de controlo positivo e uma reação de controlo negativo em duplicado utilizando soro de ratinho não imune. Após a incubação, proteína G-Sepharose 4 (50%, v/v) é adicionada em excesso, tendo em conta a capacidade de ligação a IgG de ratinho das contas, e as amostras são incubadas novamente a 4°C de um dia para o outro com rotação. Os sobrenadantes são recuperados através de centrifugação e a atividade de PAL de cada amostra é ensaiada nos sobrenadantes. Os sedimentos das contas não são descartados, de modo a que possa ser realizada mais análise através de Western blot. Para confirmar que ocorreu a ligação anticorpo-conta, é usado Western blot para detetar o antigénio de PAL nas contas. As contas que foram recuperadas através de centrifugação após o passo de ligação a PAL são lavadas várias vezes com tampões TTBS e TBS. Após estas lavagens, é adicionado às contas tampão de carga de SDS-PAGE e as amostras são aquecidas a 95°C durante 5 minutos. As amostras são então analisadas através de Western blot utilizando antissoro de PAL. As variantes de enzima mostrando fraca ligação ao anticorpo têm pouca PAL correspondente nas frações de contas sedimentadas tal como detetado através de

Western blot e mostram atividades mais elevadas permanecendo no sobrenadante em comparação com a PAL nativa não modificada que apresenta elevada ligação ao anticorpo. EXEMPLO 5

Teste de Sensibilidade a Proteases

Estudos de mapeamento de proteases na PAL nativa de R. toruloides indicaram locais primários de sensibilidade proteolitica. A remoção de tais locais pode reduzir ou eliminar a sensibilidade proteolítica e contribuir para o desenvolvimento de um substituto enzimático eficaz em PKU. No entanto, a eliminação de tais locais de sensibilidade proteolítica pode resultar na redução ou perda de atividade enzimática.

Após a engenharia de proteínas ter criado mutantes de PAL melhorados (e PEG-PAL) que retêm a atividade, a pesquisa de resistência a proteases utilizando incubação com uma mistura de proteases tripsina/quimiotripsina, seguido por monitorização da retenção da atividade (através de medição da DO290) e reduzida clivagem da proteína (através de análise em gel PAGE) permite a identificação de mutantes com as propriedades in vitro apropriadas para serem utilizados para testes in vivo. A estabilidade proteolítica será avaliada utilizando incubação com uma mistura de proteases que se aproxima do ambiente intestinal e contém tripsina 2,3 mM, quimiotripsina 3,5 mM, carboxipeptidase A 3,05 mM, e carboxipeptidase B 3,65 mM. Os testes de proteólise envolverão incubações enzimáticas, adição de proteases às soluções de PAL, para determinar o grau de sensibilidade às proteases para as diferentes variantes da proteína a examinar (proteína nativa ou mutante com ou sem peguilação ou outra modificação química), incluindo decurso dos tempos de retenção de atividade e retenção de estabilidade após a exposição às proteases. Experiências de mapeamento de SDS-PAGE e espetrometria de massa MALDI-TOF serão utilizadas para determinar a localização de quaisquer locais sensíveis a proteases (Kriwacki, R.W., et ai., J. Biomol. Tech. 9(3):5-15 (1980)) . Os resultados deste mapeamento serão importantes para determinar locais primários de suscetibilidade a proteases (tais como os dois locais primários já identificados), de modo a que todos os principais locais de sensibilidade possam ser removidos usando proteção de peguilação e/ou mutação para remover e/ou proteger regiões sensíveis da arquitetura de PAL. EXEMPLO 6

Geração de NpPAL e AvPAL Peguiladas

Em geral, a peguilação tanto para NpPAL como para AvPAL envolve a mistura da proteína com PEG ativado com NHS SUNBRIGHT ME-200HS 20 kDa (NOF).

Protocolo para PEGuilação, método "HC" padrão utilizando PEG linear de 20 kDa ativado com NHS: 1) A proteína foi avaliada quanto à presença de endotoxina.

Uma solução proteica (0,1 ml) foi diluída em 0,9 ml de água MQ fresca e testada com um aparelho manual de Charles River (EndoPTS) para endotoxina ao nível de sensibilidade de 0,5 EU/ml. Se a endotoxina fosse superior a 0,5 EU/ml então a endotoxina era inicialmente reduzida através de filtração em Mustang E, seguido por resina Sterogene Etox, e, opcionalmente ainda através de purificação cromatográfica. A redução foi limitada mas suficientemente útil através de passagem em DEAE FF (Amersham) a pH 7,8. 2) Concentração e mudança de tampão da proteína: A proteína foi concentrada a mais de 25 mg/ml mas menos de ou igual a 75 mg/ml e o tampão foi mudado para KPCh 50 mM, pH 8,5. Se fosse utilizado um filtro giratório para preparar esta concentração, o filtro era primeiro testado quanto à endotoxina através de centrifugação a velocidade e tempo reduzidos (3000 rpm, 3 minutos) apenas com tampão, em seguida testando o tampão retido quanto à endotoxina do mesmo modo que a proteína no passo 1. O registo do lote/receita de tampão para KPO4 50 mM, pH 8,5 consistiu em água (qb até 1 1), fosfato de potássio dibásico (8,4913 g/1 de 48,75 mM) e fosfato de potássio monobásico (0,17011 g/1 de 1,25 mM) . A solução foi filtrada através de um filtro de 0,2 me armazenada à temperatura ambiente. O produto concentrado foi lentamente filtrado (1-2 ml/min) através de um filtro Acrodisc Mustang E. Uma amostra diluída e normalizada para o branco com TBS estéril, pH 7,5 foi medida a A280 para determinar a concentração de proteína. O coeficiente de extinção foi de 0,83 para NpPAL e 0,75 para AvPAL. 3) PEGuilação de NpPAL e AvPAL: PEG normalmente armazenado a -80°C foi aquecido até à temperatura ambiente. Tampão KPO4 foi adicionado ao PEG para voltar a suspender em vórtice à velocidade máxima, e agitando bem o tubo na mão para assegurar que todos os grandes pedaços eram suspensos. A proteína foi adicionada à solução de PEG bem suspenso dentro de um minuto após se ter primeiro humedecido o PEG e misturada através de inversão muito suave.

Os tubos embrulhados em folha de alumínio foram colocados sobre o eixo de um agitador de rolos e agitados muito suavemente à temperatura ambiente durante 3 horas. Os tubos foram cheios com TBS (pH 7,5) e filtrados em condições estéreis. As suspensões foram formuladas imediatamente ou armazenadas a 4°C até estarem prontas para formulação. 4) Formulação O registo da receita/lote do tampão de formulação consistiu em água (qb até 1 1), Tris-Base (3,2 mM), Tris-HCl (16,8 mM), e cloreto de sódio; a solução tampão foi filtrada através de um filtro de 0,2 me armazenada à temperatura ambiente. A solução tampão foi submetida a filtração de fluxo tangencial utilizando um Vivalow 50 (lotes mais pequenos) ou Vivalfow 200 (lotes maiores) com uma membrana de celulose regenerada de 100 MWCO (PML) . A solução foi lavada com água MQ, NaOH 0,1 N, e novamente 200 ml de água. A solução foi equilibrada com TBS, pH 7,5 a 50 ml/min de fluxo cruzado. O pH do permeado foi determinado para assegurar um pH de 7,5.

Foi mudado o tampão da solução diluindo primeiro com TBS aproximadamente 3 vezes e voltando ao volume original pelo menos quatro vezes. 0 fluxo cruzado foi tipicamente de 180-200 ml/min para ambos os Vivaflow 50 e 200. O produto final foi filtrado através de Mustang E. A presença de endotoxina foi avaliada após diluição de 0,1 ml com 1,9 ml de água estéril fresca. Se a endotoxina fosse superior a 1 EU/ml, a redução era realizada com gel de Sterogene Etox. NpPAL ou AvPAL PEGuilada formulada e estéril foi selada em frascos e colocada a -70°C até estar pronta para estudos in vivo. EXEMPLO 7 (apenas para referência)

Efeito de PAL de Nostoc punctiforme (NpPAL) e a sua Forma PEGuilada em Ratinhos Afetados com PKU O objetivo deste estudo foi determinar os niveis plasmáticos de fenilalanina (Phe) após administrações subcutâneas de NpPAL ou NpPAL peguilada.

Os efeitos de (1) uma PAL de Rhodosporidium toruloides mutante de lisina R91K e a sua forma peguilada (1:3 PA::PEG) (PEG de Nippon Oil and Fat, NOF) a uma dose de 3,0 Ul/ml; (2) NpPAL e a sua forma peguilada (1:3 PAL:PEG NOF) a doses variando de 0,6 Ul/ml a 3,0 Ul/ml; e (3) veiculo, foram testados em ratinhos ENU2 homozigóticos (também conhecidos como ratinhos BTBRenu2) . Foi anteriormente mostrado que a PAL R91K tem atividade melhorada relativamente à PAL de R. toruloides de tipo selvagem. R91K localiza-se na hélice abrangendo Asp86 a LeulOl, próximo da superfície da proteína. Todas as soluções tinham menos de 1,0 EU/ml de endotoxina e foram armazenadas a -75 - -80 °C. O ratinho ENU2 ou BTBRenu2 é mutante homozigótico no locus do gene de fenilalanina-hidroxilase (PAH) resultando num animal com hiperfenilalanemia grave. Os elevados níveis plasmáticos de fenilalanina (Phe) tornam este animal o modelo apropriado para avaliação da capacidade da amónia-liase de fenilalanina (PAL) para reduzir a Phe plasmática.

Desenho Experimental

As soluções foram administradas através de bolo subcutâneo entre as omoplatas no dia 1, no abdómen direito no dia 4, no abdómen esquerdo no dia 8. As soluções foram administradas usando uma agulha de calibre 25 e uma seringa de 1 ou 3 cm3 no espaço subcutâneo. Cada animal recebeu 0,2, 0,4, 0,6 ou 1,0 UI de artigo de teste nos volumes de dose descritos na tabela acima. Os animais foram ligeiramente anestesiados através de inalação de halotano (1-3% mg/kg) e também restringidos manualmente. A administração da dose foi realizada aproximadamente ao mesmo tempo a cada dia de administração da dose.

Os animais foram observados diariamente quanto à morbidez, mortalidade e estado de saúde geral. Em particular, o local de injeção foi observado quanto a sinais de vermelhidão ou edema. Os Pesos Corporais foram medidos e registados nos Dias -3, 8 e 12 e usados como um parâmetro clínico mas não usados para determinar o volume da dose. As colheitas de sangue (P-plasma, S-soro) foram realizadas no Dia -3 (P,S), Dia 2 (P) , Dia 4 Pré-dose (P) , Dia 5 (P) , Dia 8 Pré-dose (P,S), Dia 9 (P,S), Dia 12 (P) , e Dia 23 (S) . Aproximadamente 50-100 1 de sangue inteiro foram colhidos a

cada ponto temporal (para 25-50 1 de plasma ou soro). O sangue foi colhido a partir da veia da cauda. O plasma ou soro foi colhido tal como indicado no esquema acima. A veia da cauda foi puncionada e as gotas de sangue foram colhidas utilizando RAM Scientific Green-Top Capillary Blood Collection Tubes (#07 7250). Para colheita de soro, gotas de sangue foram colhidas num tubo sem aditivos. O plasma/soro foram colhidos e transferidos para um tubo de armazenamento para serem armazenados a -20°C (plasma) ou -80°C (soro).

Resultados

Os resultados para estudos de dosagem de NpPAL a curto prazo demonstram a eficácia das enzimas PEGuiladas no abaixamento de níveis excessivos de fenilalanina.

Notavelmente, NpPAL não PEGuilada não baixou os níveis de fenilalanina após qualquer injeção, mesmo antes de poder haver qualquer resposta imunogénica. Portanto, a PEGuilação é um requisito absoluto para que a NpPAL seja um potencial tratamento para PKU (FIGURA 5). EXEMPLO 8 (apenas para referência)

Efeito de PAL de Anabaena variabilis (AvPAL) e da sua Forma PEGuilada em Ratinhos Afetados com PKU O objetivo deste estudo foi determinar os níveis plasmáticos de fenilalanina (Phe) após administrações subcutâneas de AvPAL ou AvPAL peguilada.

Os efeitos de (1) uma PAL de Rhodosporidium toruloides mutante de lisina R91K na sua forma peguilada (1:3 PAL::PEG) (PEG de Nippon Oil and Fat, NOF) a uma dose de 3,0 Ul/ml; (2) AvPAL e a sua forma peguilada (1:3 PAL:PEG NOF) a doses de 0,6 Ul/ml e 3,0 Ul/ml; e (3) veículo, foram testados em ratinhos homozigóticos ENU2 (também conhecidos como ratinhos BTBenu2) # Mostrou-se anteriormente que a PAL R91K tem atividade melhorada relativamente à PAL de R. toruloides de tipo selvagem. R91K é localizada na hélice abrangendo Asp86 a LeulOl, próximo da superfície da proteína. Todas as soluções tiveram menos de 1,0 EU/ml de endotoxina e foram armazenadas a -75 - -80°C. O ratinho ENU2 ou BTBRenu2 é um mutante homozigótico no locus do gene da fenilalanina-hidroxilase (PAH) resultando num animal com hiperfenilalanemia grave. Os elevados níveis plasmáticos de fenilalanina (Phe) tornam este animal o modelo apropriado para avaliação da capacidade da amónia-liase de fenilalanina (PAL) para reduzir a Phe plasmática.

Desenho Experimental

As soluções foram administradas através de bolo subcutâneo nas costas do animal nos dias 1, 4 e 8. As soluções foram administradas usando uma agulha de calibre 25 e uma seringa de 1 ou 3 cm3 no espaço subcutâneo. Cada animal recebeu 0,2, 0,4, 0,6 ou 1,0 UI de artigo de teste nos volumes de dose descritos na tabela acima. Os animais foram ligeiramente anestesiados através de inalação de halotano (1-3% mg/kg) e também restringidos manualmente. A administração da dose foi realizada aproximadamente ao mesmo tempo a cada dia de administração da dose.

Os animais foram observados diariamente quanto à morbidez, mortalidade e estado de saúde geral. Em particular, o local de injeção foi observado quanto a sinais de vermelhidão ou edema. Os Pesos Corporais foram medidos e registados nos Dias -3, 8 e 12 e usados como parâmetro

clínico mas não foram usados para determinar o volume da dose. Colheitas de sangue (P-plasma, S-soro) foram realizadas no Dia -3 (P,S), Dia 2 (P) , Dia 4 Pré-dose (P) , Dia 5 (P) , Dia 8 Pré-dose (P,S), Dia 9 (P,S), Dia 12 (P), e Dia 22 (S) . Aproximadamente 50-100 μΐ de sangue inteiro foram colhidos a cada ponto temporal (para 25-50 1 de plasma ou soro). O sangue foi colhido a partir da veia da cauda. O plasma ou soro foi colhido tal como indicado no esquema acima. A veia da cauda foi puncionada e as gotas de sangue foram colhidas utilizando RAM Scientific Green-Top Capillary Blood Collection Tubes (#07 7250) . Para a colheita de soro, gotas de sangue foram colhidas num tubo sem aditivos. O plasma/soro foram colhidos e transferidos para um tubo de armazenamento para serem armazenados a -20°C (plasma) ou -80°C (soro) .

Resultados

Os resultados para estudos de dosagem de AvPAL a curto prazo demonstram a eficácia das enzimas PEGuiladas no abaixamento de níveis excessivos de fenilalanina. Notavelmente, AvPAL não PEGuilada não baixou os níveis de fenilalanina após qualquer injeção, mesmo antes de poder haver qualquer resposta imunogénica. Portanto, mostrou-se que a PEGuilação é um requisito absoluto para que a AvPAL seja um potencial tratamento para PKU (FIGURA 6). EXEMPLO 9 (apenas para referência)

Estudo de Tolerância Crónica (90 dias) de PAL R91K Não PEGuilada e Peguilada e NpPAL PEGuilada em Ratinhos Afetados

com PKU O objetivo deste estudo foi avaliar os parâmetros farmacodinâmicos e os efeitos de imunogenicidade da dosagem crónica (90 dias) com PAL R91K peguilada e não peguilada e NpPAL peguilada em ratinhos ENU/2, um modelo de doença de fenilcetonúria.

Dois lotes de cada artigo de teste (R91K e a sua forma PEGuilada R91KPAL:PEG 1:3, npPAL e sua forma PEGuilada npPAL:PEG 1:3 NOF, e veículo Tris-HCl) foram produzidos, um utilizado para a primeira metade do estudo e o segundo para a segunda metade do estudo. As soluções de teste foram armazenadas a de -70°C a -80°C. Foi utilizado um total de 55 (n = 3-7 por grupo de dose) ratinhos ENU2 homozigóticos (também conhecidos como BTBRenu2) , e sob nenhuma circunstância foram utilizados animais não ingénuos (ratinhos anteriormente injetados com PAL).

Desenho Experimental

b.i.w.: duas vezes por semana; s.i.d.: uma vez por dia; s.i.w.: uma vez por semana a Dose no dia 1 e 4 num esquema de 7 dias (exemplo, cada segunda-feira e quinta-feira) b Grupos 3 e 7 receberão a dose no dia 1 e 8, e começando no dia 22 seguirão o mesmo esquema de 7 dias que os grupos 2 e 6. c Dose no dia 1 num esquema de 7 dias (exemplo, cada segunda-feira)

A administração da dose foi realizada uma vez por dia para os grupos 1, 4, 5, 8 e 9. Aos grupos 2 e 6 (b.i.w.) a dose foi dada duas vezes por semana nos dias 1 e 4, p. ex., a cada segunda-feira e quinta-feira. Aos grupos 3 e 7 (b.i.w. após a semana 3) foi dada a dose nos dias 1 e 8 e depois novamente no dia 22, após o que o esquema coincidiu com o dos grupos 2 e 6 (cada segunda-feira e quinta-feira). Ao grupo 10 foi dada uma dose uma vez por semana. As soluções de teste foram administradas através de injeção subcutânea (bolo) utilizando uma agulha de calibre 25 ou 26 e uma seringa de 1 cm3 no espaço subcutâneo entre as omoplatas. Cada animal recebeu um volume de dose predeterminado calculado utilizando o Teste de atividade em solução (Ul/ml) e o nivel de dose (IU/ratinho). A administração da dose foi realizada aproximadamente ao mesmo tempo a cada dia de administração de dose.

Os animais foram observados diariamente quanto a morbidez, mortalidade e estado de saúde geral. Em particular, o local de injeção foi observado quanto a sinais de vermelhidão ou edema. Os Pesos Corporais foram medidos e registados uma vez por semana, (dia -3, 5, 12, ..., p. ex. , todas as sextas-feiras) e no final do estudo. Se houvesse uma morte ou terminação não programada devida ao estado moribundo, o peso corporal era registado nesse momento. Aproximadamente 100 μΐ de sangue inteiro foram colhidos a cada ponto temporal (para 25 μΐ de plasma e 25 μΐ de soro). O sangue foi colhido através de punção da veia da cauda de animais conscientes. As gotas de sangue para plasma foram colhidas utilizando RAM Scientific Green-Top Capillary Blood Collection Tubes (#07 7250). Para colheita de soro, o sangue foi colhido num tubo sem aditivos. Amostras de sangue foram armazenadas em gelo húmido durante não mais de 2 horas antes da separação através de centrifugação em plasma/soro e armazenou-se a de -70 a -80°C até à avaliação em ensaios. O sangue foi colhido para se obter plasma e soro para a determinação dos títulos tanto de fenilalanina como de anticorpo nos seguintes dias: -3 (pré-início do estudo), 9, 17, 24, 31, 38, 45, 52, 59, 66, 73, 80, 87 e 91. No dia 89, o sangue e o plasma foram também colhidos a partir dos animais do Grupo 1, 5, 9 e 10. Instantes únicos a cada semana podem não proporcionar uma perspetiva correta da resposta da Phe sanguínea à dosagem. Instantes adicionais mostraram se os níveis de Phe estavam ou não a variar entre as doses. A amostra do dia 9 foi de vital importância para a integridade do estudo uma vez que marca o momento em que o efeito PD se perdia em todos os regimes de dosagem tentados até à data. Uma amostra final de sangue de 100 μΐ foi colhida.

Resultados O estudo de dosagem a longo prazo mostrado na FIGURA 7 mostra uma eficácia continuada após numerosas injeções semanais ao longo de um período de dez semanas (com NpPAL-PEG) . EXEMPLO 10

Geração de Variantes de AvPAL (Mutantes de Cisterna)

Substituições de aminoácidos foram feitas no polipéptido AvPAL para reduzir a agregação que ocorre em proteínas recombinantes expressas em bactérias. A agregação de proteínas pode reduzir a atividade da enzima e/ou aumentar a imunogenicidade in vivo. Uma tal forma de agregação ocorre em resultado da formação de ligações dissulfureto intercadeias. Para minimizar esta possibilidade, vários resíduos de cisteína de AvPAL, isoladamente ou em combinação, foram substituídos por resíduos de serina. 0 polipéptido AvPAL tem 6 resíduos de cisteína, nas posições 64, 235, 318, 424, 503 e 565 (SEQ ID NO:4) . Foram gerados os seguintes mutantes únicos de cisteína de AvPAL: AvPAL_C64S (SEQ ID NO:7), AvPAL_C318S (SEQ ID NO:8), AvPAL_C503S (SEQ ID NO:9), e AvPAL_C565S (SEQ ID NO:10). Um duplo mutante de cisteína de AvPAL, AvPAL_S565SC503S (SEQ ID NO:ll), foi também gerado. A FIGURA 8 mostra as sequências de aminoácidos destes mutantes de cisteína de AvPAL.

Clonagem O gene de AvPAL foi amplificado a partir de ADN genómico de Anabaena variabilis (ATCC 29413-U, Estojo Qiagen DNeasy) com o iniciador direto AvarPALfor (5' — CACTGTCATATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3') (SEQ ID NO:18) e o iniciador reverso AvarPALrev (5' — CACTGTCTCGAGATGCAAGCAGGGTAAGATATCTTG-3') (SEQ ID NO :19). O produto de PCR resultante foi tratado com Taq e depois ligado em pCR2.1 TOPO TA (Invitrogen). O plasmídeo resultante foi designado lp40.

Um local Nhel a 5' foi adicionado e um local Nhel interno foi removido por SOE-PCR. O fragmento de AvPAL a montante foi amplificado a partir de lp40 com o iniciador direto N-Nhe-AvPAL (5'— CACTGTGCTAGCATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3') (SEQ ID NO:20) e o iniciador reverso Nhe-AvPALrev (5' — GGAAATTTCCTCCATGATAGCTGGCTTGGTTATCAACATCAATTAGTGG-3') (SEQ ID NO:21), e o fragmento de AvPAL a jusante foi amplificado a partir de lp40 com o iniciador direto Nhe-AvPALfor (5' — CCACTAATTGATGTTGATAACCAAGCCAGCTATCATGGAGGAAATTTCC-3') (SEQ ID NO:22) e o iniciador reverso AvPALr6v-r (5'— ACAGTGGCGGCCGCTTAATGCAAGCAGGGTAAGATATCTTG-3') (SEQ ID NO:23). Numa única reação de PCR, os dois produtos de PCR foram ligados e prolongados com ADN-polimerase para produzir o gene inteiro de AvPAL, e depois amplificou-se com os iniciadores N-Nhe-AvPAL e AvPALrev-r. 0 produto de PCR resultante foi digerido com Nhel, terminado de forma cega com Klenow, digerido com Notl, e ligado no vetor pET28a+ (preparado através de digestão com Ndel, terminando de forma cega com Klenow, e digestão com Notl). 0 plasmídeo resultante foi designado 3p86-23.

Foram adicionados novos locais de restrição por PCR. AvPAL foi amplificado a partir do plasmídeo 3p86-23 com o iniciador direto AvEcoRIfor (5' — CACTGTGAATTCATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3') (SEQ ID NO:24) e o iniciador reverso AvSmalrev (5' — CACTGTCCCGGGTTAATGCAAGCAGGGTAAGATATCT-3') (SEQ ID NO:25). 0 produto de PCR resultante foi digerido com EcoRI e Smal e ligado no vetor pIBX7 digerido com EcoRI e Smal. 0 plasmídeo resultante foi designado 7p56 Av3.

Mutantes de Cisteína

Dois codões de cisteína no gene de AvPAL, correspondendo às posições 503 e 565 do polipéptido AvPAL, foram substituídos por codões de serina através de mutagénese dirigida ao local (QuickChange XL II, Stratagene). O codão de cisteína na posição 503 foi mudado para um codão de serina no plasmídeo 7p56 Av3 por PCR com o iniciador direto Av_C503S (5'-GTCATTACGATGCACGCGCCTCTCTATCACCTGCAACTGAG-3' ) (SEQ ID NO:26) e o iniciador reverso Av_C503Srev (5'-CTCAGTTGCAGGTGATAGAGAGGCGCGTGCATCGTAATGAC-3') (SEQ ID NO:27). O codão de serina está sublinhado e a mutação de G para C na cadeia de codificação (mutação de C para G na cadeia de não codificação) é indicado a negrito. O plasmídeo resultante foi designado j282. O codão de cisteína na posição 565 foi mudado para um codão de serina no plasmídeo j282 com o iniciador direto Av_C565S (5'-CAGTTCAAGATATCTTACCCTCCTTGCATTAACCCGGGCTGC-3' ) (SEQ ID NO :28) e o iniciador reverso Av_C565Srev (5' — GCAGCCCGGGTTAATGCAAGGAGGGTAAGATATCTTGAACTG-3') (SEQ ID NO:29) . O codão de serina está sublinhado e a mutação de G para C na cadeia de codificação (mutação de C para G na cadeia de não codificação) é indicada a negrito. O plasmídeo resultante foi designado j298a.

Os codões de cisteína no gene de AvPAL nas posições 64, 318 e 565 do polipéptido AvPAL foram substituídos de forma semelhante com codões de serina utilizando os seguintes pares de iniciadores: C64S, iniciador direto Av_C64S (5' —

GCAGGGTATTCAGGCATCTTCTGATTACATTAATAATGCTGTTG-3') (SEQ ID NO:30) e iniciador reverso Av_C64Srev (5'—

CAACAGCATTATTAATGTAATCAGAAGATGCCTGAATAGCCTGC-3') (SEQ ID NO:31); C318S, iniciador direto Av_C318S (5' —

CAAGATCGTTACTCACTCCGATCCCTTCCCCAGTATTTGGGGC-3') (SEQ ID NO:32) e iniciador reverso Av_C318Srev (5' —

GCCCCAAATACTGGGGAAGGGATCGGAGTGAGTAACGATCTTG-3'.) (SEQ ID NO:33); e C565S, iniciador direto Av_C565S (SEQ ID NO:28) e iniciador reverso Av_C565Srev (SEQ ID NO:29). Os codões de serina estão sublinhados, e as mutações de G para C nas cadeias de codificação e as mutações de C para G nas cadeias de não codificação estão indicadas a negrito. EXEMPLO 11

Atividade Enzimática In vitro de Variantes de AvPAL (Mutantes de Cisteina) O objetivo deste estudo foi determinar o efeito da substituição de serina dos vários resíduos de cisteína no polipéptido AvPAL na atividade da enzima amónia-liase de fenilalanina (PAL) in vitro.

Variantes de AvPAL (i.e., mutantes de cisteína) foram clonadas tal como é descrito no EXEMPLO 10. Os plasmídeos de expressão dos mutantes de cisteína de AvPAL foram transformados em bactérias e os polipéptidos AvPAL mutantes de cisteína foram expressos tal como é descrito no EXEMPLO 1 e purificados tal como descrito no EXEMPLO 2. A AvPAL de tipo selvagem (WT) e os mutantes de cisteína de AvPAL foram testados quanto à atividade enzimática de PAL in vitro tal como é descrito no EXEMPLO 3. A Tabela 7 mostra que em comparação com a AvPAL WT não peguilada, a atividade específica de PAL in vitro das proteínas mutantes de cisteína de AvPAL não peguiladas purificadas era reduzida através da substituição por serina do resíduo de cisteína na posição 64 (AvPAL_C64S), mas não era adversamente afetada pela substituição por serina dos resíduos de cisteína na posição 503 ou 565, ou em ambas as posições 503 e 565 (AvPAL_C503S, AvPAL_C565S, e AvPAL_C565SC503S, respetivamente).

Para determinar se a introdução dos resíduos de serina tinha qualquer efeito na atividade enzimática das proteínas AvPAL peguiladas, a AvPAL WT e os duplos mutantes de cisteína, AvPAL_C565SC503S, foram peguilados tal como descrito no EXEMPLO 6. A Tabela 7 mostra que a atividade específica de PAL in vitro da proteína AvPAL peguilada não era afetada adversamente pela substituição por serina dos resíduos de cisteína em ambas as posições 503 e 565. EXEMPLO 12

Caraterização Bioquímica In vitro de Variantes de AvPAL (Mutantes de Cisteína) O objetivo deste estudo foi determinar o efeito da substituição por serina dos vários resíduos de cisteína no polipéptido AvPAL na: (1) estabilidade acelerada; (2) formação de agregados; e (3) peguilação específica do local.

Estabilidade Acelerada O efeito da substituição por serina de resíduos de cisteína em AvPAL na estabilidade in vitro foi determinado através de armazenamento dos mutantes de cisteína de AvPAL purificados, peguilados ou não peguilados, durante vários períodos de tempo a 37°C, e depois medindo a atividade específica de PAL in vitro destas proteínas tal como é descrito no EXEMPLO 3. A AvPAL de tipo selvagem e os mutantes de cisteína de AvPAL, não peguilados ou peguilados, foram preparados tal como é descrito no EXEMPLO 11.

Tal como mostrado na FIGURA 9A, as atividades específicas das proteínas AvPAL não peguiladas eram estáveis durante pelo menos 5 dias a 37°C, e não foram afetadas negativamente através da substituição por serina dos resíduos de cisteína na posição 565, ou em ambas as posições 503 e 565. Semelhantemente, tal como mostrado na FIGURA 9B, as atividades específicas das proteínas AvPAL peguiladas eram estáveis durante pelo menos 6 dias a 37 °C. O mutante de uma cisteína de AvPAL, AvPAL_C565S, mostrou estabilidade algo reduzida em comparação com a AvPAL de tipo selvagem e o duplo mutante de cisteína de AvPAL, AvPAL_C565SC503S, após 6 dias a 37 °C.

Formação de Agregados O efeito da substituição por serina de resíduos de cisteína em AvPAL na formação de agregados proteicos em solução foi determinado através da separação da AvPAL de tipo selvagem não peguilada, purificada e dos mutantes de cisteína de AvPAL através de desnaturação e eletroforese em gel nativo ou através de SEC-HPLC.

As preparações de AvPAL purificada foram separadas através de eletroforese em gel sob condições desnaturantes (NuPAGE Bis-Tris a 4-12%) ou condições nativas (Tris-Gly a 8%, pH 8,3) . As proteínas AvPAL separadas foram coradas com Azul Coomassie.

As preparações de AvPAL purificadas foram separadas através de SEC-HPLC. As proteínas AvPAL foram carregadas numa coluna de gel TSK (G3000SWxl, 7,8 mm x 30 cm, 5 ym (Tosoh Bioscience, LLC) ) em fosfato de Na 20 mM, NaCl 300 mM, pH 6,9, e eluídas a um caudal de 0,5 ml/min. As proteínas AvPAL separadas foram analisadas num espetrómetro Agilent série 1100 .

Agregados estavam presentes na preparação de AvPAL de tipo selvagem e nas preparações AvPAL_C503S e AvPAL_C64S, mas não nas preparações de AvPAL_C565S e AvPAL_C565SC503S, tal como avaliado através de eletroforese em gel (FIGURA 10A) ou SEC-HPLC (FIGURA 10B).

Peguilação Específica do Local O efeito da substituição por serina de resíduos de cisteína em AvPAL na peguilação específica do local foi determinado através de peguilação da AvPAL de tipo selvagem e do duplo mutante de cisteína AvPAL_G503SC565S tal como descrito no EXEMPLO 6, e comparando depois a peguilação relativa nos resíduos de lisina de AvPAL: K2, K10, K32, K115, Kl45, Kl95, K301, K335, K413, K419, K493, K494 e K522.

Aproximadamente 100 yg (10 μΐ a 10 yg/μΐ) de proteínas AvPAL não peguiladas ou peguiladas foram desnaturadas em ureia 8 M. As proteínas desnaturadas foram então digeridas num volume reacional de 100 μΐ com tripsina a pH 8,2 de um dia para o outro (20 horas) a 37°C. As proteínas digeridas com tripsina foram reduzidas através de tratamento com 1 μΐ de DTT 1 M durante 1 hora a 37°C, seguido por extinção com 3 μΐ de TFA a 15%. As proteínas digeridas foram separadas numa coluna de fase reversa C18. A percentagem de peguilação de cada um dos péptidos AvPAL peguilados foi calculada através de mapeamento de péptidos subtrativo do péptido não peguilado correspondente.

Tal como mostrado na FIGURA 11, a uma razão de proteína AvPAL:PEG de 1:3, não houve uma diferença marcante na percentagem de peguilação de qualquer um dos resíduos de lisina (K) com a possível exceção de K419, em que a percentagem de peguilação do duplo mutante de cisteína C565SC503S foi inferior em comparação com a AvPAL de tipo selvagem. No entanto, os resultados obtidos utilizando o duplo mutante de cisteína a razões crescentes de proteína AvPAL:PEG, em que não foi observada uma relação dose-resposta, tomados em conjunto com uma percentagem de peguilação relativamente pequena, indica que as diferenças observadas em K1419 não são suscetíveis de ser significativas. Assim, a substituição por serina de resíduos de cisteína nas posições 503 e 565 não parece afetar a peguilação específica do local de AvPAL. EXEMPLO 13

Mecanismo de Agregação de Proteínas AvPAL

Foram realizados estudos para investigar o mecanismo de agregação de proteínas AvPAL expressas em bactérias.

Concentrando as preparações de AvPAL purificada, e incubando as soluções de proteína concentrada durante 2 horas a 37°C, acelerou a agregação de proteínas AvPAL purificadas em solução. A agregação foi detetada através da separação das proteínas AvPAL através de SEC-HPLC. Para determinar se reticulação de dissulfureto era responsável pela agregação, ditiotreitol 50 mM (DTT) foi adicionado à solução de proteína concentrada, seguido por incubação durante 2 horas a 37°C.

As proteínas AvPAL expressas em bactérias foram purificadas tal como é descrito no EXEMPLO 2, e concentradas utilizando um filtro giratório (Millipore Biomax -10K NPML). As proteínas foram centrifugadas a cerca de 15000 g durante alguns minutos numa Centrífuga Eppendorf 5415C. Para os mutantes de cisteína que tendem a agregar (p. ex.,

AvPAL_C503S e AvPAL_C64S), as proteínas foram concentradas a cerca de 20 mg/ml e incubadas durante 2 horas a 37°C. Para os mutantes de cisteína que são resistentes à agregação (p. ex., AvPAL_C565S e AvPAL_C565SC503S), as proteínas foram concentradas a cerca de 40 mg/ml e incubadas durante 2 horas a 37 °C.

Tal como mostrado na Tabela 8, as preparações dos mutantes de cisteína de AvPAL purificados AvPAL_C64S e AvPAL_C503S formaram agregados após incubação durante 2 horas a 37°C. Tal como esperado, esta agregação foi exacerbada quando as proteínas AvPAL foram concentradas antes da incubação durante 2 horas a 37°C. A agregação pode ser bloqueada através de exposição das proteínas concentradas a DTT, indicando que a agregação é devida à reticulação de dissulfureto. Em contraste, as preparações dos mutantes de cisteina de AvPAL purificados AvPAL_C565S e AvPAL_C565SC503S não formaram agregados após incubação durante 2 horas a 37°C, indicando que o resíduo cisteina na posição 565 está envolvido na agregação de AvPAL através da reticulação de dissulfureto.

Para determinar que resíduos de cisteina existem como sulfidrilos livres, uma preparação de AvPAL purificada foi desnaturada na presença de ureia 8 M, alquilada através de iodoacetamida, digerida com tripsina e analisada através de LC/MS. Todos os resíduos de cisteina de AvPAL foram marcados através de iodoacetamida, indicando que todos os resíduos de cisteina de AvPAL expressa em bactérias existem como sulfidrilos livres.

Para determinar quais os resíduos de cisteina que estão presentes na superfície da proteína nativa, uma preparação de AvPAL purificada foi tratada primeiro com N-etilmaleimida (NEM), depois desnaturada na presença de ureia 8 M, alquilada através de iodoacetamida, digerida com tripsina e analisada através de LC/MS. Os resíduos de cisteína nas posições 235 e 424 não foram alquiladas através de NEM, e o resíduo de cisteína na posição 318 foi apenas parcialmente alquilado através de NEM, indicando que os resíduos de cisteína nas posições 64, 503 e 565 estão na superfície da AvPAL nativa e o resíduo de cisteína na posição 318 está parcialmente exposto na superfície da AvPAL nativa.

Para determinar quais os resíduos de cisteína que estão envolvidos na reticulação de dissulfureto intercadeias, 67 μΐ de uma solução a 0,7 mg/ml da preparação de AvPAL de tipo selvagem purificada, não peguilada foram desnaturados em ureia 8 M durante 1 hora a 37°C, e depois digeridos num volume reacional de 100 μΐ com tripsina a pH 8,2 de um dia para o outro (17,5 horas) a 25°C. As proteínas digeridas com tripsina foram separadas e analisadas através de espetrometria de massa, em que os péptidos correspondendo aos pares de dissulfureto previstos foram identificados e quantificados como contagens totais de iões (TIC). A Tabela 9 mostra que foram detetados pares dissulfureto para C503-C503, C503-C565, C565 e C565-C318 e C565-C565. Os resíduos de cisteína na posição 565, e numa menor extensão na posição 503, foram verificados em pares dissulfureto na preparação de AvPAL purificada.

#não detetado

Foram realizados estudos para determinar se mecanismos adicionais para além da reticulação de dissulfureto podem estar envolvidos na agregação de proteínas AvPAL.

Preparações de AvPAL purificadas foram incubadas com Tween a 0,05% ou EDTA 10 mM, e depois separadas através de SEC-HPLC tal como descrito no EXEMPLO 12. O Tween reduz a agregação de proteínas devido a interações hidrófobas, e o EDTA reduz a agregação de proteínas devido à presença de catiões bivalentes. Tal como mostrado na FIGURA 12, a exposição a Tween a 0,05% ou EDTA 10 mM não teve efeito na agregação de proteínas AvPAL. O pico adicional a 10 minutos na AvPAL tratada com EDTA 10 mM é devido à absorvância de EDTA a 210 nm.

Para investigar mais o papel da reticulação de dissulfureto na agregação de proteínas AvPAL, a AvPAL purificada foi reduzida através de tratamento com DTT e depois dessalgada antes da separação através de SEC-HPLC. Tal como mostrado na FIGURA 13A, a agregação de proteína AvPAL foi minimizada através de tratamento com DTT, e agregados e novamente formados após incubação durante 18 horas a 37°C. Em contraste, tal como mostrado na FIGURA 13B, os agregados não de voltaram a formar uma vez que as cisteínas da superfície da AvPAL estavam modificadas (i.e., alquiladas) através de tratamento com N-metilmaleimida (NEM) após exposição a DTT, mas antes da dessalga e incubação durante 18 horas a 37°C.

Com base no de cima, a agregação de AvPAL expressa em bactérias parece ser unicamente devida a formação de ligações dissulfureto intercadeias, e não devida a efeitos hidrófobos ou presença de catiões bivalentes. Os resíduos de cisteína nas posições 565 e 503 estão envolvidos na formação de ligações dissulfureto intercadeias nas preparações de AvPAL. EXEMPLO 14

Efeitos de Variantes de AvPAL (Mutantes de Cisteina) e suas

Formas PEGiladas em Ratinhos O propósito destes estudos era determinar o efeito da substituição por serina dos resíduos de cisteína nas posições 503 e 565 no polipéptido AvPAL nos níveis de fenilalanina (Phe) in vivo em ratinhos.

As formas peguiladas do duplo mutante de cisteina de

AvPAL AvPAL_C565SC503S foram testadas quanto à atividade in vivo em ratinhos ENU2 homozigóticos (também conhecidos como BTBRenu2) basicamente tal como descrito no EXEMPLO 8. O ratinho ENU2 é um mutante homozigótico no locus de PAH resultando num animal com HPA grave. Os elevados níveis plasmáticos de Phe tornam este animal o modelo apropriado para avaliação da capacidade de PAL para reduzir a Phe plasmática.

No primeiro estudo, o duplo mutante de cisteína de AvPAL AvPAL_C565SC503S foi testado a várias doses. Ratinhos ENU2 (machos e fêmeas) foram divididos em 5 grupos de dose: 4 grupos de teste (n=4) e um grupo de veículo (n=2) . A cada ratinho foram dadas 8 doses s.c. semanais de veículo, uma dose baixa de duplo mutante de cisteína de AvPAL peguilado (0,25 UI), dose média de duplo mutante de cisteína de AvPAL peguilado (1,0 UI), dose elevada de duplo mutante de cisteína de AvPAL peguilado (4,0 UI), ou AvPAL de tipo selvagem peguilada (4,0 UI) . O plasma foi colhido pré-dose e às 48 horas pós-dose (até ao dia 57) e analisado para os níveis de

Phe. O soro foi também colhido pré-dose e 48 horas pós-dose (até ao dia 57) para análise dos níveis de anticorpo anti-AvPAL. Os ratinhos foram também pesados uma vez por semana começando 2 dias antes da primeira dose (até ao dia 40).

Dois ratinhos morreram durante o estudo, um ratinho tratado com veículo e uma dose baixa de duplo mutante de cisteína de AvPAL peguilado. Tal como mostrado na FIGURA 14, uma redução dependente da dose nos níveis de Phe foi observada no plasma 48 horas após cada injeção s.c. de duplo mutante de cisteína de AvPAL peguilado. A doses equivalentes, não houve diferença nos níveis plasmáticos de Phe entre ratinhos tratados com AvPAL de tipo selvagem peguilada ou duplo mutante de cisteína de AvPAL peguilado. Tal como mostrado na FIGURA 15, também não houve diferença significativa nos pesos corporais entre ratinhos tratados com veículo, AvPAL de tipo selvagem peguilada, ou duplo mutante de cisteína de AvPAL peguilado. É provável que não sejam observadas diferenças significativas nos pesos corporais porque foram utilizados no estudo ratinhos machos e fêmeas.

Os títulos de anticorpo anti-AvPAL nestes ratinhos foram analisados com um ensaio ELISA indireto. Neste ensaio, placas de microtitulação foram revestidas com AvPAL, bloqueadas, e em seguida expostas a soros diluídos de cada ratinho sangrado de forma adequada. AvPAL, que foi ligada à superfície das placas de microtitulação, foi reconhecida e ligou-se a anticorpos específicos de AvPAL presentes nas amostras de soro. Anticorpos de cabra anti-IgG de ratinho marcados de forma detetável detetaram os anticorpos anti-AvPAL ligados. As amostras de soro foram inicialmente diluídas 1:50, e analisadas em comparação com "ponto de corte", que resultou de soro de ratinho reunido diluído 1:50. As amostras com sinal mais baixo que o ponto de corte foram relatadas como <50, ou "Negativas". O resto das amostras, consideradas "Positivas", foram ainda diluídas em séries de 1:3 titulando até uma diluição em que o sinal caiu abaixo do ponto de corte. O fator de diluição mais elevado que deu um sinal positivo (i.e., mais elevado que o ponto de corte) foi relatado como o título dessa amostra. Durante esta série de títulos, uma alteração de 3 vezes do título pode não refletir uma diferença significativa do anticorpo detetado porque a diferença poderia ser o resultado de uma alteração mínima do sinal ao nível do ponto de corte.

Tal como mostrado na Tabela 10, os títulos do anticorpo anti-AvPAL eram mais baixos em ratinhos tratados com a AvPAL dupla mutante de cisteína peguilada em comparação com os ratinhos tratados com uma dose equivalente (4,0 UI) de AvPAL de tipo selvagem peguilada. Embora não tenha sido observada nenhuma resposta clara à dose, os ratinhos tratados com a dose elevada (4,0 UI) de AvPAL dupla mutante de cisteína peguilada tiveram títulos de anticorpo anti-AvPAL mais elevados que os ratinhos tratados com a dose mais baixa (0,25 UI) de AvPAL dupla mutante de cisteína peguilada.

*Sem amostra/dados não disponíveis

Os reduzidos títulos de IgG anti-AvPAL em ratinhos aos quais foram administradas 4,0 UI de AvPAL dupla mutante de cisteína peguilada em comparação com 4,0 UI de AvPAL de tipo selvagem peguilada foram mantidos ao longo do estudo.

No segundo estudo, o duplo mutante de cisteína de AvPAL AvPAL_C565SC503S foi testado a diferentes razões de peguilação. Ratinhos machos ENU2 foram divididos em 5 grupos de dose: 4 grupos de teste (n=4) e um grupo de veículo (n=2). A cada ratinho foram dadas 8 doses semanais s.c. de veículo, dose baixa de AvPAL dupla mutante de cisteína peguilada (4 UI e razão AvPAL:PEG 1:1,6), dose média de AvPAL dupla mutante de cisteína peguilada (4 UI e razão AvPAL:PEG 1:2,4), dose elevada de AvPAL dupla mutante de cisteína peguilada (4 UI e razão AvPAL:PEG 1:3), ou AvPAL de tipo selvagem peguilada (4 UI e razão AvPAL:PEG 1:3) . O plasma foi colhido pré-dose e aos 4 dias pós-dose (até ao dia 61) e analisado quanto aos níveis de Phe. O soro foi também colhido pré-dose aos 4 dias pós-dose (até ao dia 57) para análise dos níveis de anticorpo anti-AvPAL. Os ratinhos foram também pesados uma vez por semana começando 2 dias antes da primeira dose (até ao dia 40) .

Um ratinho tratado com veículo morreu durante o estudo. Tal como é mostrado na FIGURA 16, uma redução dependente da razão de PEG nos níveis de Phe foi observada no plasma 4 dias após cada injeção s.c. de AvPAL dupla mutante de cisteína peguilada. A razões equivalentes de PEG, não houve diferença nos níveis plasmáticos de Phe entre os ratinhos tratados com AvPAL de tipo selvagem peguilada ou AvPAL dupla mutante de cisteína peguilada. Tal como mostrado na FIGURA 17, os pesos corporais de ratinhos tratados com AvPAL de tipo selvagem peguilada ou AvPAL dupla mutante de cisteína peguilada eram significativamente superiores aos dos ratinhos tratados com veículo.

Os títulos de anticorpo anti-AvPAL nestes ratinhos foram analisados com o ensaio ELISA indireto descrito acima.

Tal como mostrado na Tabela 11, os títulos de anticorpo anti-AvPAL eram inferiores nos ratinhos tratados com a AvPAL dupla mutante de cisteína peguilada em comparação com os ratinhos tratados com uma dose equivalente de AvPAL de tipo selvagem peguilada possuindo a mesma razão (1:3) de AvPAL para PEG. Uma resposta à dose inversa foi observada entre os títulos de anticorpo anti-AvPAL e a razão de AvPAL para PEG, consistente com a expectativa de que a peguilação de proteínas, tais como AvPAL, esteja associada a imunogenicidade reduzida in vivo.

*N/A: sem amostra de soro para este instante

Os resultados acima mostram que a AvPAL dupla mutante de cisteína peguilada AvPAL_C565SG503S tem atividade enzimática de PAL in vivo que é comparável à da AvPAL de tipo selvagem peguilada. Como a AvPAL de tipo selvagem não peguilada não tinha atividade enzimática de PAL in vivo detetável (ver EXEMPLO 8), conclui-se que as variantes de AvPAL, incluindo a AvPAL dupla mutante de cisteína peguilada, AvPAL_C565SC503S, e a AvPAL de tipo selvagem peguilada têm maior atividade conversora da fenilalanina que a AvPAL de tipo selvagem.

Os resultados acima mostram também que a variante de AvPAL peguilada, que tem reduzida agregação de proteínas in vitro devido a substituições de cisteína para serina em ambas as posições 503 e 565, tem imunogenicidade reduzida em comparação com a AvPAL de tipo selvagem peguilada. Como a peguilação está em si mesma associada com imunogenicidade reduzida, conclui-se que as variantes de AvPAL têm imunogenicidade reduzida in vivo em comparação com a AvPAL de tipo selvagem. EXEMPLO 15

Geração de Formas de Variantes de AvPAL Re-peguiladas

Foram realizados estudos para determinar se as formas peguiladas de variantes de AvPAL podiam ser sujeitas a re-peguilação para aumentar a quantidade de peguilação, i.e., a percentagem de moléculas de PEG nos resíduos de lisina de AvPAL, e, se sim, se as formas re-peguiladas de variantes de AvPAL mantêm a atividade enzimática in vitro e têm qualquer propriedade melhorada in vivo, nomeadamente, imunogenicidade reduzida.

Peguilação de Variantes de AvPAL A AvPAL dupla mutante de cisteína, AvPAL_C565SC503S, foi peguilada basicamente tal como descrito no EXEMPLO 6 a diferentes razões de PAL:PEG (i.e., AvPAL_C565SC503S:PEG SUNBRIGHT ME-200HS de 20 kDa ativado com NHS (NOF)).

Resumidamente, a mistura reacional padrão continha: 7 mg/ml (correspondendo a 2 mM de resíduos de lisina) AvP AL_C 565SC503S e mPEG2 OK-NHS 2, 3, 4 ou 6 mM (éster metoxipolietilenoglicol-carboximetil-N-hidroxisuccinimida, 2 0 kDa, SUNBRIGHT ME-200HS, NOF) em tampão fosfato de potássio 50 mM pH 8,5, correspondendo à razão molar 1:1, 1:1,5, 1:2 ou 1:3, respetivamente, dos resíduos totais de lisina de AvPAL para moléculas de PEG (ver Tabela 12). Após uma incubação de 3 horas à temperatura ambiente, foi mudado o tampão à mistura reacional para fosfato de potássio 200 mM, pH 8,5, e concentrou-se até um valor superior a 20 mg/ml usando filtração de fluxo tangencial (Vivaflow 50 ou 200, polietersulfona ou membrana de celulose regenerada, MWCO de 100 kDa, Sartorius), em preparação para o passo subsequente de re-peguilação.

Re-peguilação de Variantes de AvPAL Peguiladas

AvPAL_C565SC503S, peguilada a diferentes razões PAL:PEG, foi re-peguilada basicamente tal como descrito no EXEMPLO 6 utilizando várias concentrações de enzima peguilada, e diferentes quantidades e diferentes razões de resíduos de lisina na enzima AvPAL e moléculas de PEG SUNBRIGHT ME-200HS de 20 kDa ativado com NHS (NOF).

Para cada reação de re-peguilação, o material de partida foi uma AvPAL_C565SC503S peguilada (rAvPAL-PEG) que foi concentrada até mais de 20 mg/ml em fosfato de potássio 200 mM, pH 8,5. mPEG20K-NHS foi pesada separadamente para cada reação de re-peguilação, e novamente suspensa num volume mínimo de água. rAvPAL-PEG, diluída no tampão conforme necessário, foi adicionada diretamente à solução de mPEG20K-NHS ressuspensa para alcançar a concentração final indicada na Tabela 12. As reações de re-peguilação foram deixadas prosseguir durante 3 horas à temperatura ambiente, e depois extintas através de diluição de duas vezes com TrisHCl 25 mM, pH 7,3. 0 método de filtração de fluxo tangencial (Vivaflow 50 ou 200, membrana de polietersulfona ou de celulose regenerada, PMCO de 100 kDa, Sartorius) foi utilizado para mudar o tampão e concentrar as amostras de rAvPAL-PEG re-peguiladas em Tris-HCl 10 mM, NaCl 135 mM, L-Phe 1 mM, pH 7,3. As amostras finais de rAvPAL-PEG re-peguilada foram mais concentradas, conforme necessário, utilizando concentração centrífuga. Métodos de Caraterização In Vitro

Ensaio de Proteína Total: As concentrações de amostras de rAvPAL-PEG peguilada e re-peguilada foram determinadas através de ensaio de ácido bicinconínico (BCA), utilizando um estojo de ensaio comercialmente disponível de Pierce (cat#23227) com uma albumina de soro bovino como padrão.

Resumidamente, 25 μΐ de amostras e padrões foram incubados com 200 μΐ do reagente BCA a 37°C durante 30 min. A absorvância a 562 nm foi lida no espetrofotómetro de microplacas SPECTRAmax PLUS (Molecular Devices Corporation).

Ensaio de Atividade de rAvPAL: As atividades específicas das amostras de rAvPAL-PEG peguilada e re-peguilada foram determinadas com base no protocolo de ensaio de atividade de PAL estabelecido tal como descrito no EXEMPLO 3. Resumidamente, após a adição de amostras de proteína (25-50 l)à reação de ensaio de 1 ml, o aumento na D029o é monitorizado à medida que a L-Phe é convertida em ácido trans-cinâmico. Quando necessário, as amostras eram diluídas no tampão de diluição do ensaio (TrisHCl 10 mM, NaCl 135 mM, pH 7,3) antes do ensaio. Cada ponto de dados representa um valor médio de três medições independentes.

Eletroforese em Gel Capilar (CGE): Análises CGE foram realizadas utilizando o Estojo de Análise ProteomeLab SDS-PM de Beckman-Coulter (cat #390953). As amostras de AvPAL-PEG e rAvPAL-PEG-RPl peguilada e re-peguilada foram aquecidas a 95°C durante 5 minutos na presença de SDS e -mercaptoetanol, e depois carregadas nos capilares (PA800 CE, 23 cm de silica fundida) no Sistema de Eletroforese Capilar P/ACE MDQ de Beckman-Coulter. Os perfis de CGE apresentam a quantidade de absorvância de UV a 214 nm. Cada amostra de CGE continha um marcador de migração de 10 kDa como referência para as análises. Os capilares foram recondicionados entre as amostras de rAvPAL-PEG.

Ensaio_de_TNBS : Um ensaio de ácido trinitrobenzenossulfónico (TNBS) foi utilizado para proporcionar uma estimativa dos grupos amina livres presentes nas amostras de rAvPAL-PEG peguilada e re-peguilada.

Mapeamento de Péptidos: O mapeamento de péptidos tripticos de amostras de rAvPAL-PEG e rAvPAL-PEG foi realizado tal como descrito no EXEMPLO 10 para determinar a percentagem de peguilação nos resíduos de lisina nas proteínas variantes de AvPAL. A quantidade de peguilação, i.e., a percentagem de moléculas de PEG nos resíduos de lisina de AvPAL, K10, K32, K115, K145, K195, K301, K335, K413, K493/K494 e K522, da AvPAL_C565SC503S re-peguilada foi determinada.

Caraterização In Vitro de Variantes de AvPAL Peguiladas e Re-peguiladas

Atividade Enzimática de rAvPAL: Tal como mostrado na FIGURA 18 (topo), a peguilação ou re-peguilação causou uma diminuição temporária na atividade enzimática de rAvPAL in vitro. Isto parecia ser devido a peguilação reversível em resíduos de tirosina específicos próximos do local ativo catalítico. Em comparação com a peguilação única, a re-peguilação pareceu aumentar o efeito das reações de peguilação na atividade enzimática de rAvPAL, i.e., para reduzir temporariamente a sua atividade específica, que recuperou gradualmente ao longo do tempo. Uma concentração mais elevada de PEG na reação de peguilação correlacionou-se com uma maior redução temporária da atividade específica. No entanto, após algumas semanas a 4°C, a atividade específica da rAvPAL-PEG re-peguilada, gerada primeiro utilizando uma variedade de razões PAL:PEG e concentrações de enzima e moléculas de PEG (as concentrações de mM dos resíduos de lisina em AvPAL e PEG estão indicadas), alcançou pelo menos cerca de 80% a da AvPAL-PEG unicamente peguilada gerada utilizando uma razão PAL:PEG de 1:3 (resíduos de lisina 2 mM:PEG 6 mM, círculos a cheio). Além disso, as enzimas AvPAL-PEG re-peguilada e peguilada foram submetidas a taxas de recuperação de atividade comparáveis após peguilação.

Tal como mostrado na FIGURA 18 (abaixo), foi observada uma tendência semelhante quando a AvPAL-PEG peguilada foi primeiro gerada utilizando uma razão PAL:PEG de 1:1 (resíduos de lisina 2 mM:PEG 2 mM, quadrados a cheio). Em geral, embora a re-peguilação afetasse temporariamente a atividade de AvPAL, as atividades específicas resultantes da rAvPAL-PEG re-peguilada estavam dentro de intervalos aceitáveis em comparação com a AvPAL-PEG unicamente peguilada gerada a uma razão PAL : PEG de 1:3.

Análise de CGE de rAvPAL Peguilada e Re-peguilada: As análises de CGE indicaram que a re-peguilação aumentou a extensão global de peguilação, relativamente à peguilação única. Tal como mostrado na FIGURA 19A, a re-peguilação resultou em menor mobilidade eletroforética de rAvPAL-PEG, implicando um aumento do tamanho molecular devido à ligação de moléculas de PEG adicionais. Além disso, o grau de PEGuilação correlacionou-se bem com a concentração de PEG utilizada durante o passo de re-peguilação. Tal como mostrado na FIGURA 19B, independentemente das condições reacionais durante o primeiro passo de peguilação, uma concentração de 6 mM ou mais de mPEG20K-NHS foi igualmente eficaz no aumento da peguilação da rAVPAL-PEG. Em resumo, em comparação com a rAvPAL unicamente peguilada, a reAvPAL-PEG re-peguilada mostrou claramente uma mobilidade reduzida em CGE e aumentou assim a massa molecular.

Aminas Livres em rAvPAL-PEG após Re-peguilação: O ensaio de TNBS foi realizado para estimar a quantidade de grupos amina livres presentes na rAVPAL-PEG re-peguilada, relativamente à rAvPAL-PEG unicamente peguilada. Tal como mostrado na Tabela 13, a re-peguilação na presença de concentrações mais elevadas de PEG, tais como 6 mM, diminuiu muito significativamente a quantidade de aminas livres presentes na proteína rAvPAL, indicando um aumento global na peguilação. Sob as condições aqui utilizadas, a maioria das aminas livres na rAvPAL não peguilada que estão disponíveis para modificação química são peguiladas eficazmente após a re-peguilação.

Percentagem de Peguilação de Resíduos de Lisina após Re-peguilação: Tal como mostrado na FIGURA 20, o mapeamento de péptidos trípticos indicou que a re-peguilação melhorou a percentagem de peguilação de resíduos de lisina na rAvPAL-PEG. Exceto para o resíduo de lisina na posição 10 da AvPAL, que já era 100% peguilado durante o passo de peguilação única, os restantes resíduos de lisina não conjugados foram alvo de peguilação após re-peguilação. Mais notavelmente, a peguilação no resíduo de lisina na posição 301 de AvPAL aumentou em tanto como 500% após re-peguilação. As condições de re-peguilação na presença de concentrações mais elevadas de mPEG20K-NHS ativada, tais como 6 mM, pareceram ser mais eficazes no aumento da extensão de peguilação em rAvPAL-PEG que concentrações inferiores de PEG, tais como 2 mM. EXEMPLO 16

Efeito de Re-peguilação de uma Variante de AvPAL-PEG em

Ratinhos A AvPAL_C565SC503S re-peguilada (rAvPAL-PEG-RPl), gerada utilizando uma razão PAL:PEG de 1:3 tanto na primeira como na segunda reações de peguilação tal como é descrito no EXEMPLO 15, foi comparada com a AvPAL_C565SC503S unicamente peguilada (rAvPAL-PEG) , gerada utilizando uma razão PAL:PEG de 1:3 tal como descrito nos EXEMPLOS 6 e 15, em relação à sua capacidade para reduzir os niveis plasmáticos de Phe num modelo de ratinho de PKU e para induzir uma resposta de anticorpos in vivo. A atividade especifica das duas enzimas variantes de AvPAL peguilada e re-peguilada, foi medida tal como descrito no EXEMPLO 3. Verificou-se gue rAvPAL-PEG-RPl tem uma atividade especifica (1,17 U/mg), gue foi cerca de 20% inferior à atividade especifica de rAvPAL-PEG (1,47 U/mg).

As formas peguilada e re-peguilada de AvPAL_C565SC503S, rAvPAL-PEG e rAvPAL-PEG-RPl, respetivamente, foram testadas guanto à atividade in vivo em ratinhos ENU2 homozigóticos (também conhecidos como BTBRenu2) basicamente tal como descrito no EXEMPLO 8. O desenho do estudo é mostrado abaixo na Tabela 14.

A dois grupos de ratinhos, grupos 1 e 2, foi administrada por via subcutânea uma dose elevada (80 mg/kg) semanalmente de rAvPAL-PEG ou rAvPAL-PEG-RPl, respetivamente, durante 8 semanas, seguido por uma dose baixa (20 mg/kg) semanalmente de rAvPAL-PEG ou rAvPAL-PEG-RPl, respetivamente, durante 6 semanas. A um grupo de ratinhos, grupo 3, foi administrada a dose elevada de rAvPAL-PEG seguida pela dose baixa de rAvPAL-PEG-RPl. O plasma foi colhido pré-dose e a vários dias pós-dose, e analisado quanto aos níveis de Phe. Os níveis plasmáticos de Phe foram medidos tal como descrito no EXEMPLO 8, e os dados obtidos são mostrados na FIGURA 21. 0 soro foi também colhido pré-dose e a vários dias pós-dose para análise dos níveis de anticorpo anti-AvPAL. Os títulos séricos de IgG anti-rAvPAL foram medidos tal como é descrito no EXEMPLO 14, e os dados obtidos são mostrados na Tabela 15.

Tal como mostrado na FIGURA 21, para todos os 3 grupos, a dosagem subcutânea semanal de 80 mg/kg durante 7-8 semanas de rAvPAL-PEG (DP, círculos a cheio ou triângulos invertidos a cheio) ou rAvPAL-PEG-RPl (2xPEG, círculos vazios) resultaram em estabilização dos níveis plasmáticos de Phe a <200 μΜ. Após estabilização, uma diminuição para uma dosagem subcutânea semanal de rAvPAL-PEG de 20 mg/kg resultou em 4 dias de níveis plasmáticos de Phe a <200 μΜ. Os níveis plasmáticos de Phe em ratinhos ENU2 tratados com rAvPAL-PEG a 20 mg/kg (DP, círculos a cheio) foram inferiores aos dos ratinhos tratados com rAvPAL-PEG-RPl a 20 mg/kg (2xPEG, círculos vazios ou triângulos invertidos a cheio), possivelmente devido para a maior atividade específica de AvPAL-PEG unicamente peguilada em comparação com a da rAvPAL-PEG-RP1 duplamente peguilada.

Tal como mostrado na Tabela 15, os títulos de IgG anti-AvPAL foram menores em ratinhos ENU2 injetados com rAvPAL-PEG-RP1 (grupo 2) que os dos injetados com rAvPAL-PEG (grupos 1 e 3). Isto indicou que a re-peguilação da variante de AvPAL para ter uma quantidade de peguilação aumentada, em particular com moléculas de PEG linear de 20 kDa, estava associada a uma menor imunogenicidade in vivo.

Em resumo, a re-peguilação da variante de AvPAL-PEG com moléculas de PEG linear de 20 kDa para aumentar a percentagem de peguilação em vários resíduos de lisina em AvPAL estava associada a uma atividade enzimática ligeiramente diminuída in vitro, mas, mais importante, uma imunogenicidade in vivo reduzida. EXEMPLO 17

Avaliação Clínica Com Composições de PAL Procariótica O exemplo seguinte proporciona diretrizes sobre os parâmetros a utilizar para a avaliação clínica das composições compreendendo PAL procariótica ou variantes, mutantes, e fragmentos biologicamente ativa desta ("PAL") nos métodos terapêuticos do presente invento. Tal como discutido aqui ao longo do texto, a PAL será utilizada no tratamento de HPA incluindo HPA, fenilcetonúria (PKU) leve e PKU clássica. Serão realizados ensaios clínicos que proporcionarão uma avaliação das doses orais ou subcutâneas de PAL quanto à segurança, farmacocinética e resposta inicial de pontos finais clínicos tanto substitutos como definidos. O ensaio será realizado durante um mínimo, mas não necessariamente limitado a, 24 semanas para recolher informação de segurança suficiente para 100 pacientes avaliáveis. A dose inicial para os ensaios variará de cerca de 0,001 a cerca de 1,0 mg/kg/semana. No caso de esta dose não produzir uma redução nos niveis plasmáticos de fenilalanina (PHE) em excesso num paciente, ou produzir um beneficio clinico direto significativo medido como uma capacidade para aumentar a ingestão oral diária de Phe sem aumentos nos niveis plasmáticos de Phe, a dose deve ser aumentada conforme necessário, e mantida durante um período mínimo adicional de, mas necessariamente limitado a, 24 semanas para estabelecer a segurança e avaliar melhor a eficácia.

Medições de segurança incluirão eventos adversos, reações alérgicas, painel de química clínica completo (função renal e hepática), análise da urina, e hemograma com diferencial. Além disso, outros parâmetros incluindo a redução nos níveis de níveis sanguíneos de Phe, testes neuropsicológicos e cognitivos, e avaliações globais serão também monitorizados. O presente exemplo contempla também a determinação de parâmetros farmacocinéticos do fármaco em circulação, e distribuição geral e semivida de PAL no sangue. Antecipa-se que estas medições ajudarão a relacionar a dose com a resposta clínica. Métodos

Os pacientes que tenham níveis elevados de Phe plasmático serão submetidos no limiar à história clínica e a um exame físico, testes neuropsicológicos e cognitivos, um conjunto padrão de testes laboratoriais clínicos (hemograma completo, Painel 20, CH50, UA), níveis de pterinas urinárias, níveis de di-hidropteridina-redutase (DHPR), e um painel de aminoácidos séricos de sangue (plasma) em jejum. O paciente será seguido de perto com visitas semanais à clínica. Os pacientes regressarão à clínica para uma avaliação completa uma semana após a conclusão do período de tratamento. Se for necessário uma subida da dose, os pacientes seguirão o mesmo esquema descrito acima. A segurança será monitorizada durante todo o ensaio.

Diagnóstico e Critérios de Inclusão/Exclusão 0 paciente pode ser masculino ou feminino, com um diagnóstico documentado de HPA ou PKU leve confirmado através de testes genéticos e provas dos elevados niveis de Phe no sangue. 0 estudo incluirá pacientes de HPA ou PKU que não sigam com precisão o controlo dietético. As pacientes do sexo feminino em idade fértil devem fazer um teste de gravidez negativo ( -HCG na urina) imediatamente antes de cada dosagem e devem ser aconselhadas a utilizar um método de contraceção medicamente aceite ao longo do estudo. Uma paciente será excluída deste estudo se estiver grávida ou a amamentar; recebeu um fármaco de investigação no prazo de 30 dias antes da participação no estudo; ou tem uma condição médica, doença intercorrente grave, ou outra circunstância atenuante que possa diminuir significativamente a adesão ao estudo.

Intervenção Dietética

Após a distribuição aleatória inicial e o período de tratamento de duas semanas, todos os participantes no estudo serão submetidos a orientação dietética e seguirão uma dieta padrão e/ou uma dieta padrão com restrição de Phe complementada com alimentos médicos específicos de Phe durante um total de quatro a seis semanas. As dietas serão geridas em casa e a ingestão dietética será registada em registos diários. As análises das ingestões de nutrientes e alimentos médicos e a percentagem de Ingestões Dietéticas Recomendadas (IDI) serão comparadas entre os grupos de tratamento.

Segurança de PAL A terapia de PAL será determinada como segura se não ocorrerem reações significativas agudas ou crónicas ao fármaco durante o curso do estudo. A administração de longo prazo do fármaco será determinada como segura se não forem observadas anomalias significativas nos exames clínicos, laboratoriais clínicos ou noutros estudos apropriados. EXEMPLO 18

Avaliação Clínica de uma Variante de AvPAL Peguilada A AvPAL dupla mutante de cisteína peguilada, AvPAL_C565SC503S será avaliada clinicamente AvPAL_C565SC503S será clinicamente avaliada em humanos. 0 objetivo da avaliação clínica é determinar a segurança, tolerabilidade, farmacocinética (PK), e eficácia em pacientes de PKU. Os níveis sanguíneos de fenilalanina (Phe) servirão como ponto final clínico.

Fase 1 A Fase 1 é um estudo aberto, de aumento da dose única em 35 pacientes de PKU com idades entre 16 e 50 anos. O objetivo primário é avaliar a segurança e tolerabilidade da AvPAL dupla mutante de cisteína peguilada, AvPAL_C565SC503S, e os objetivos secundários são para avaliar a PK da enzima peguilada e a redução de Phe. A sete coortes de 5 sujeitos é administrada AvPAL_C565SC503S peguilada sequencialmente com doses crescentes de 0, 001, 0,003, 0, 01, 0,03, 0, 1, 0,3 e 1 mg/kg. Os sujeitos em cada coorte recebem uma dose única, e em seguida são seguidos durante um total de 6 semanas. Os critérios de inclusão são que o nível sanguíneo de Phe na triagem e o nível sanguíneo de Phe médio ao longo dos últimos 3 anos sejam >600 M.

Fase 2 O estudo da Fase 2 é dividido em duas partes sem interrupção:

Parte 1-16 semanas - administração de 8 semanas, em seguida otimização da dose

Parte 2-40 semanas - prolongamento A Fase 2 é um estudo de otimização da dose em duas partes, aberto, em 35 sujeitos com PKU. A Parte 1 conduzida ao longo de um período de 16 semanas de duração envolve a administração de doses de AvPAL_C565SC503S peguilada uma vez por semana durante 8 semanas, seguindo por um período de otimização da dose. A dose de cada sujeito é ajustada para atingir concentrações de Phe no sangue abaixo de 600 Μ. O objetivo primário é avaliar a segurança e a tolerabilidade da administração múltipla da AvPAL_C565SC503S peguilada, e os objetivos secundários são avaliar os efeitos da enzima peguilada nas concentrações de Phe no sangue, resposta imunitária, p. ex., títulos de anticorpo anti-AvPAL, e PK em estado estacionário. Na parte 2, aos sujeitos é administrada AvPAL_C565SC503S peguilada durante 40 semanas, com dose e frequência de administração otimizadas individualizadas.

Fase 3

Uma vez completos os estudos de Fase 1 e 2, estudos adicionais podem incluir potencialmente um estudo de Fase 3 de seis meses duplamente cego num maior número de sujeitos, com estudos adicionais em populações especiais, tais como, por exemplo e não para limitação, pacientes de hiperfenilalanemia (HPA) não PKU, paciente de PKU responsivos a BH4 e pacientes de PHU não responsivos a BH4.

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> BioMarin Pharmaceutical Inc.

Vellard, Michel, C.

Fitzpatrick, Paul, A.

Kakkis, Emil, D.

Wendt, Dan <120> Composições de amónia-liase de fenilalanina procariótica e métodos de utilização de composições destas <130> 0165 PC10 <150> US 11/451,999 <151> 2006-06-12 <160> 33 <170> Patentln versão 3.4 <210> 1 <211> 1710

<212> ADN <213> Nostoc punctiforme <4 0 0> 1

atgaatataa catctctaca acagaacata acgcgttctt ggcaaatacc tttcactaat SO agtteagatt caatcgtaac tgtsggcgat cgcaatctga caatcgacga ggttgtaaat 120 gttgctcgtc atggaacaca ggtgcgctta actgataatg cagatgtcat tcggggtgtt 180 caagcatctt gtgattacat taacaatgca gtcgaaacag cacageeaat ttacggggtg 240 acatctggct ttggeggtat ggcagatgtt gtcatctctc gcgaacaãgc agtsggââett 300 cagactaatt taatttggtt tctgaaatcc ggcgcaggaa acaaattatc gttagcagac 360 gtgcgtgcag ctatgctctt acgtgcaaat tcacatttgt atggtgcgtc tggtatacga 420 ctcgaactta ttcagcggat tgaaactttc ctcaaegctg gcgtgacacc ccatgtctat 480 gagtttggct ctatcggtgc tagcggcgat ttggtgccat tatcctacat tactggggca 540 ctaatcggtc tagatcctag ctttaeagtt gacttcgacg gtaaagaaat ggatgccgtt 600 acagccttgt ctcgtttggg tttgccaaag ttgcaattgc aaccgaaaga aggtttagca 660 atgatgaatg gcacctcagt catgacaggt attgcagcta actgtgtgta cgatgcgaaa 720

gttttgctcg ctctgacaat gggtgtacac gccttagcca tccaaggttt atacggaacg 7BD aatcaatctt tccacccgtt tattcatcag tgcaagccac atcccggtca actatggaca 840 gcagatcaaa tgttttctct gctgaaagat tcatctttag ttcgtgaaga gttggatggt 900 aaacacgaat accgtggtaa agatctgata caggatcgtt attctctccg ctgtctggca 960 cagttcatag ggecaatcgt tgatggggta tcagagatta ccaagcaaat cgaggtagaa 1020 atgaactcag tcaccgataa cccattgatt gatgtcgaga accaagttag ttatcacggc 1080 ggcaattttc tcggacagta tgtgggtgtg aeaatggatc gcctacgtta ttacataggg 1140 ctattggcca aacacatcga tgtgcagatt gcacttcttg tctcgccaga gtttagcaac 1200 ggcttaccac cctctttagt tggtaatagc gatcgcaaag ttaatatggg actcaaaggt 1260 ttgcaaatca gtggaaactc gattatgcca ctgttgagct tctatggaaa ttccctagcc 1320 gatcgctttc ctacccacgc cgagcaattt aatcaaaata ttaacagcca aggctatatt 1380 tccgcaaatt tgacacgtcg ttccgtagac atatttcaga attatatggc gatcgcgttg 1440 atgtttggag ttcaagctgt tgacetcegc acatataaga tgaaaggtca ttatgatgca 1500 cgtacatgcc tctcacccaa tactgtgcag ttatacacag cagtctgcga ggtagttgga 1560 aagccactaa cgtctgtgcg tccatacatt tggaacgaca acgagcaatg tttagatgag 1620 catattgccc ggatttcagc tgatatcgct ggtggtggtt taattgtgca agcagttgag 1680 catatttttt cgagcttaaa gtcaacgtaa 1710

<210> 2 <211> 569 <212> PRT <213> Nostoc punctiforme <400> 2

Met Asn He Thr Ser Leu Gin Gin Asn lie Thr Arg Ser Trp Gin lie 15 10 15

Pro Phe Thr Asn Ser Ser Asp Ser lie Val Thr Val Gly Asp Arg Asn 20 25 30

Leu Thr He Asp Glu Val Val Asn Val Ala Arg His Gly Thr Gin Val 35 40 45

Arg Leu Thr Asp Asn Ala Asp Val lie Arg Gly val Gin Ala Ser Cys 50 55 60

Asp Tyr He Asn Asn Ala Val Glu Thr Ala Gin Pro He Tyr Gly Val 65 70 75 80

Thr Ser Gly Phe Gly Gly Met Ala Asp Val Val lie Ser Arg Glu Gin 85 90 95

Ala Ala Glu Leu Gin Thr Asn Leu He Trp Phe Leu Lys Ser Gly Ala 100 105 110

Gly Asn Lys Leu Ser Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg 115 120 125

Ala Asn Ser His Leu Tyr Gly Ala Ser Gly lie Arg Leu Glu Leu He 130 135 140

Gin Arg lie Glu Thr Phe Leu Asn Ala Gly Vai Thr Pro His Vai Tyr 145 150 155 160

Glu Phe Gly Ser lie Gly Ala Ser Gly Asp Leu Vai Pro Leu Ser Tyr 165 170 175

He Thr GÍy Ala Leu He Gly Leu Asp Pro Ser Phe Thr Vai Asp Phe 180 185 190

Asp Gly Lys Glu Met Asp Ala Vai Thr Ala Leu Ser Arg Leu Gly Leu 195 200 205

Pro Lys Leu Gin Leu Gin Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Met Asn Gly 210 215 220

Thr Ser Vai Met Thr Gly Ile Ala Ala Asn Cys Vai Tyr Asp Ala Lys 225 230 235 240

Vai Leu Leu Ala Leu Thr Met Gly Vai His Ala Leu Ala Ile Gin Gly 245 250 255

Leu Tyr Gly Thr Asn Gin Ser Phe His Pro Phe Ile His Gin Cys Lys 260 265 270

Pro His Pro Gly Gin Leu Trp Thr Ala Asp Gin Met Phe Ser Leu Leu 275 280 285

Lys Asp Ser Ser Leu Vai Arg Glu Glu Leu Asp Gly Lys His Glu Tyr 290 295 300

Arg Gly Lys Asp Leu Ile Gin Asp Arg Tyr Ser Leu Arg Cys Leu Ala 305 310 315 ‘ 320

Gin Phe He Gly Pro lie Vai Asp Gly Vai Ser Glu Ile Thr Lys Gin 325 330 335

Ile Glu Vai Glu Met Asn Ser Vai Thr Asp Asn Pro Leu Ile Asp Vai 340 345 350

Glu Asn Gin Vai Ser Tyr His Gly Gly Asn Phe Leu Gly Gin Tyr Vai 355 360 365

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Gin Phe Asn Gin Asn lie Asn Ser Gin Gly Tyr lie Ser Ala Asn Leu 450 455 460

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Hi3 lie Phe Ser Ser Leu Lys Ser Thr 565

<210> 3 <211> 1704 <212> ADN <213> Anabaena variabilis <4Ο0> 3 atgaagacac tatctcaagc acaaagcaaa acctcatctc aacaattttc ttttactgga 60 aattcttctg ccaatgeaat tattggtaac cagaaactca caatcaatga tgttgcaagg 120 gtagcgcgta atggcacctt agtgtcttta aecaataaca ctgatatttt gcagggtatt 180 caggcatctt gtgattacat taataatgct gttgaatctg gggaaccaat ttatggagtg 240 acatctggtt ttggcggtat ggccaatgtt gccatatccc gtgaacaagc atctgaactc 300 caaaccaact tagtttggtt cctgaaaaca ggtgcaggga acaaattacc cttggcggat 360 gtgcgcgcag ctatgctctt gcgtgcaaac tctcatatgc gcggtgcatc tggcatcaga 420 ttagaactta tcaagcgtat ggagattttc cttaacgctg gtgtcacacc atacgtgtat 480 gagtttggtt caattggtgc aagtggtgat ttagtgccac tatcctacat tactggttca 540 ctgataggct tagatcccag ctttaaggtt gacttcaacg gtaaagaaat ggatgcgcca 600 acagctctac gtcaactgaa tttgtcaccc ttgacattgt tgccgsagga aggcttggcg 660 atgatgaacg gcactLcagt catgacaggt attgcagcaa actgcgtcta cgatactcaa 720 attttaactg cgategetat gggcgttcac gctctagata tccaagcttt aaacggaacc 760 aatcaatcat tccatccatt tatccataat tccaaaccac atcctggtca attatgggca 840 gcagatcaga tgatttcttt gttagccaat tcccagttag ttcgtgatga gttagatggt 900 aaacacgatt atcgtgatca cgagttgatt caagatcgtt actcactccg atgccttccc 960 cagtatttgg ggccaatcgt tgatggaatt tcccagattg ccaaacaaat tgaaatcgaa 1020 atcaactcag tçaccgataa cccactaatt gatgttgata -accaagctag ctatcatgga 1080 ggaaatetee tcggacagca egtgggtatg ggaacggacc acctgcgtta ctatattggg 1140 ttattggcta aacacctaga tgtgcagatt gccctcctcg cctcaccaga gtttagcaat 1200 ggactaccac catetttatt aggcaaccga gaacgtaaag tcaatatggg actcaaaggt 1260 etgcaaatat gcggtaactc aattatgcca ctgttgacct tctatggaaa ttccatcgcc 1320 gatcgctttc ctacccatgc agaacaattt aatcagaaca tcaacagtca aggatacact 1380 tcagcgactc tagcccgccg ttctgtggat atcttccaga attatgtggc gatcgctctg 1440 atgtttggag tccaagctgt tgacctcegc acatataaaa agactggtca ttaegatgca 1500 cgcgcctgtc tatcacctgc aactgagcgc ttatattcag cagtccgcca cgtagttgga 1560 caaaaaceaa ettcagatcg cccatatatt tggaatgata atgagcaagg actggatgag 1620 catattgccc ggatttctgc tgatatcgct gctggtggtg tgattgtgca agcagttcaa 1660 gatatcttac cctgcttgca ttaa 1704

<210> 4 <211> 567 <212> PRT <213> Anabaena variabilis <4Ο0> 4

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Gly Leu Lys Gly Leu Gin He Cys Gly Asn Ser lie Met Pro Leu Leu 420 425 430

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Tyr lie Trp Asn Asp Asn Glu Gin Gly Leu Asp Glu His He Ala Arg 530 535 540 lie Ser Ala Asp He Ala Ala Gly Gly Val He val Gin Ala val Gin 545 550 555 560

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Ser Thr Arg lie Ala Ser His Asp Leu Glu Asn Leu Gin Arg Ser Leu 65 , 70 75 80 val leu Ser His Ala Ala Gly He Gly Ala Pro Leu Asp Asp Asp Leu 85 90 95

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Gly lie Glu Ala Asn Ala Val Ser Asp Asn Pro Leu Val Phe Ala Ala 305 310 315 320

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His Pro His Ser Val Asp Ser Leu Pro Thr Ser Ala Asn Gin Glu Asp 405 410 415

His Val Ser Met Ala Pro Ala Ala Gly Lys Arg Leu Trp Glu Met Ala 420 425 430

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Gly Met Gly Met Asp His Leu Arg Tyr Tyr He Gly Leu Leu Ala Lys 370 375 380

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Gly Leu Lys Gly Leu Gin He Cys Gly Asn Ser lie Met Pro Leu Leu 420 425 430

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Gin Phe Asn Gin Asn lie Asn Ser Gin Gly Tyr Thr Ser Ala Thr Leu 450 455 460

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Met Phe Gly Val Gin Ala Val Asp Leu Arg Thr Tyr Lys Lys Thr Gly 485 490 495

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Leu Thr lie Asn Asp Val Ala Arg Val Ala Arg Asn Gly Thr Leu Vpl 35 40 45

Ser Leu Thr Asn Asn Thr Asp He Leu Gin Gly He Gin Ala Ser Cys 50 55 60

Asp Tyr lie Asn Asn Ala vai Glu Ser Giy Glu Pro lie Tyr Gly val 65 70 75 80

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Ala Ser Glu Leu Gin Thr Asn Leu Vai Trp Phe Leu Lys Thr Gly Ala 100 105 110

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Ala Asn Ser His Met Arg Gly Ala Ser Gly lie Arg Leu Glu Leu Ile 130 135 140

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Ser Pro Leu Thr Leu Leu Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Met Asn Gly 210 215 220

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Leu Asn Gly Thr Asn Gin Ser Phe His Pro Phe Ile His Asn Ser Lys 260 265 270

Pro His Pro Gly Gin Leu Trp Ala Ala Asp Gin Met lie Ser Leu Leu 275 280 285

Ala Asn Ser Gin Leu Vai Arg Asp Glu Leu Asp Gly Lys His Asp Tyr 290 295 300

Arg Asp His Glu Leu lie Gin Asp Arg Tyr Ser Leu Arg Ser Leu Pro 305 310 315 320

Gin Tyr Leu Gly Pro lie Vai Asp Gly Ile Ser Gin Ile Ala Lys Gin 325 330 335 lie Glu lie Glu lie Asn Ser Vai Thr Asp Asn Pro Leu lie Asp Vai 340 345 350

Asp Asn Gin Ala Ser Tyr His Gly Gly Asn Phe Leu Gly Gin Tyr Vai 355 360 365

Gly Met Gly Met Asp His Leu Arg Tyr Tyr Ile Gly Leu Leu Ala Lys 370 375 380

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Gly Leu Pro Pro Ser Leu Leu Gly Asn Arg Glu Arg Lys Vai Asn Met 405 410 415

Gly Leu Lys Gly Leu Gin Ile Cys Gly Asn Ser lie Met Pro Leu Leu 420 425 430

Thr Phe Tyr Gly Asn Ser Ile Ala Asp Arg Phe Pro Thr His Ala Glu 435 440 445

Gin Phe Asn Gin Asn He Asn Ser Gin Gly Tyr Thr Ser Ala Thr leu 450 455 460

Ala Arg Arg Ser Vai Asp Ile Phe Gin Asn Tyr Vai Ala Ile Ala Leu 465 470 475 480

Met Phe Gly Vai Gin Ala Vai Asp Leu Arg Thr Tyr Lys Lys Thr Gly 485 490 495

His Tyr Asp Ala Arg Ala Cys Leu Ser Pro Ala Thr Glu Arg Leu Tyr 500 505 510

Ser Ala Vai Arg His Vai Vai Gly Gin Lys Pro Thr Ser Asp Arg Pro 515 520 525

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He Ser Ala Asp Ile Ala Ala Gly Gly Vai Ile Vai Gin Ala Vai Gin 545 550 555 560

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Leu Thr lie Asn Asp Val Ala Arg Val Ala Arg Asn Gly Thr Leu Val 35 40 45

Ser Leu Thr Asn Asn Thr Asp lie Leu Gin Gly He Gin Ala Ser Cys 50 55 eo

Asp Tyr He Asn Asn Ala Val Glu Ser Gly Glu Pro lie Tyr Gly Val 65 70 75 80

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Ala Ser Glu leu Gin Thr Asn Leu Val Trp Phe Leu Lys Thr Gly Ala 100 105 110

Gly Asn Lys Leu Pro Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg 115 120 125

Ala Asn Ser His Met Arg Gly Ala Ser Gly He Arg Leu Glu Leu lie 130 135 140

Lys Arg Met Glu He Phe Leu Asn Ala Gly Val Thr Pro Tyr Val Tyr 145 150 155 160

Glu Phe Gly Ser lie Gly Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser Tyr 165 170 175 lie Thr Gly Ser Leu lie Gly Leu Asp Pro Ser Phe Lya Val Asp Phe 180 185 190

Asn Gly Lys Glu Met Asp Ala Pro Thr Ala Leu Arg Gin Leu Asn Leu 195 200 205

Ser Pro Leu Thr Leu Leu Pro Lys Glu Gly Leu Alô Met Met Asn Gly 210 215 220

Thr Ser Vai Met Ttir Gly lie Ala Ala Asa Cys Vai Tyr Asp Thr Gin 225 230 235 240 lie Leu Thr Ala He Ala Met Gly Vai His Ala Léu Asp Ile Gin Ala 245 250 255

Leu Asn Gly Thr Asn Gin Ser Fhe His Pro Phe lie His Asn Ser Lys 260 265 270

Pro His Pro Gly Gin Leu Trp Ala Ala Asp Gin Met lie Ser Leu Leu 275 280 285

Ala Asn Ser Gin Leu Vai Arg Asp Glu Leu Asp Gly Lys His Asp Tyr 290 295 300

Arg Asp His Glu Leu Ile Gin Asp Arg Tyr Ser Leu Arg Cys Leu Pro 305 310 315 320

Gin Tyr Leu Gly Pro lie VaL Asp Gly Ile Ser Gin Ile Ala Lys Gin 325 330 335

Ile Glu Ile Glu Ile Asn Ser Vai Thr Asp Asn Pro Lou Ile Asp Vai 340 345 350

Asp Asn Gin Ala Ser Tyr His Gly Gly Asn Phe Leu Gly Gin Tyr Val 355 360 365

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Gly Leu Lys Gly Leu Gin lie Cys Gly Asn Ser Ile Met Pro Leu Leu 420 425 430

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Gin Phe Asn Gin Asn lie Asn Ser Gin Gly Tyr Thr Ser Ala Thr Leu 450 455 4 60

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Met Phe Gly Val Gin Ala Val Asp Leu Arg Thr Tyr Lys Lys Thr Gly 485 490 495

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Asp lie Leu Pro Cys Leu His 565 <210> 10 <211> 567 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Substituição de cisteína para serina na posição 565 na PAL de Anabaena variabilis <4 0 0> 10

Met Lys Thr Leu Ser Gin Ala Gin Ser Lys Thr Ser Ser Gin Gin Phe 15 10 15

Ser Phe Thr Gly Asn Ser Ser Ala Asn Val lie lie Gly Asn Gin Lys 20 25 30

Leu Thr lie Asn Asp Val Ala Arg Val Ala Arg Asn Gly Thr Leu Val 35 40 45

Ser Leu Thr Asn Asn Thr Asp He Leu Gin Gly lie Gin Ala Ser Cys 50 55 60

Asp Tyr lie Asn Asn Ala Val Glu Ser Gly Glu Pro He Tyr Gly Val 65 70 75 80

Thr Ser Gly Phe Gly Gly Met Ala Asn Val Ala lie Ser Arg Glu Gin B5 90 95

Ala Ser Glu Leu Gin Thr Asn Leu Val Trp Phe Leu Lys Thr Gly Ala 100 105 110

Gly Asn Lys Leu Pro Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg 115 120 125

Ala Asn Ser His Met Arg Gly Ala Ser Gly lie Arg Leu Glu Leu lie 130 135 140

Lys Arg Met Glu lie Phe Leu Asn Ala Gly val Thr Pro Tyr Val Tyr 145 150 155 160

Glu Phe Gly Ser lie Gly Ala Ser Gly Asp Leu Val pro Leu Ser Tyr 165 170 175

He Thr Gly Ser Leu lie Gly Leu Asp Pro Ser Phe Lys Val Asp Phe ISO 135 190

Asn Gly Lys Glu Met Asp Ala Pro Thr Ala Leu Arg Gin Leu Asn Leu 195 200 205

Ser Pro Leu Thr Leu Leu Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Met Asn Gly 210 215 220

Thr Ser Val Met Thr Gly lie Ala Ala Asn Cys Val Tyr Asp Thr Gin 225 230 235 240 lie Leu Thr Ala He Ala Met Gly val His Ala Leu Asp He Gin Ala 245 250 255

Leu Asn Gly Thr Asn Gin Ser Phe His Pro Phe lie His Asn Ser Lys 260 265 270

Pro His Pro Gly Gin Leu Trp Ala Ala Asp Gin Met lie Ser Leu Leu 275 280 285

Ala Asn Ser Gin Leu Val Arg Asp Glu Leu Asp Gly Lys His Asp Tyr 290 295 300

Arg Asp His Glu Leu lie Gin Asp Arg Tyr Ser Leu Arg Cy3 Leu Pro 305 310 315 320

Gin Tyr Leu Gly Pro lie Val Asp Gly He Ser Gin lie Ala Lys Gin 325 330 335 lie Glu lie Glu lie Asn Ser val Thr Asp Asn Pro Leu lie Asp val 340 345 350

Asp Asn Gin Ala Ser Tyr His Gly Gly Asn Phe leu Gly Gin Tyr Val 355 360 365

Gly Met Gly Met Asp His Leu Arg Tyr Tyr lie Gly Leu Leu Ala Lys 370 375 380

His Leu Asp Val Gin lie Ala Leu Leu Ala Ser Pro Glu Phe Ser Asn 385 390 395 400

Gly Leu Pro Pro Ser Leu Leu Gly Asn Arg Glu Arg Lys Val Asn Met 405 410 415

Gly Leu Lys Gly Leu Gin lie Cys Gly Asn Ser lie Met Pro leu Leu 420 425 430

Thr Phe Tyr Gly Asn Ser lie Ala Asp Arg Phe Pro Thr His Ala Glu 435 440 445

Gin Phe Asn Gin Asn lie Asn Ser Gin Gly Tyr Thr Ser Ala Thr Leu 450 455 460

Ala Arg Arg Ser Val Asp lie Phe Gin Asn Tyr Val Ala lie Ala Leu 465 470 475 480

Met Phe Gly Val Gin Ala Val Asp Leu Arg Thr Tyr Lys Lys Thr Gly 485 490 495

His Tyr Asp Ala Arg Ala Cys Leu Ser Pro Ala Thr Glu Arg Leu Tyr 500 505 510

Set Ala Val Arg His val val Gly Gin Lys Pro Thr Ser Asp Arg Pro 515 520 525

Tyr lie Trp Asn Asp Asn Glu Gin Gly Leu Asp Glu His He Ala Arg 530 535 540 lie ser Ala Asp He Ala Ala Gly Gly Val He Val Gin Ala Val Gin 545 550 555 560

Asp He Leu Pro $er Leu His 565 <210> 11 <211> 567 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Substituições de cisteina para serina nas posições 565 e 503 na PAL de Anabaena variabilis <4 Ο 0> 11

Met Lys Thr Leu Ser Gin Ala Gin Ser Lys Thr Ser Ser Gin Gin Phe 15 10 15

Ser Phe Thr Gly Asn Ser Ser Ala Asn Val lie He Gly Asn Gin Lys 20 25 30

Leu Thr lie Asn Asp Val Ala Arg Val Ala Arg Asn Gly Thr Leu Val 35 40 45

Ser Leu Thr Asn Asn Thr Asp lie Leu Gin Gly lie Gin Ala Ser Cys 50 55 60 Αδρ Tyr lie Asn Asn Ala Val Glu Ser Gly Glu Pro lie Tyr Gly Val 65 "70 75 80

Thr Ser Gly Phe Gly Gly Met Ala Asn Val Ala lie Ser Arg Glu Gin 85 90 95

Ala Ser Glu Leu Gin Thr Asn Leu Val Trp Phe Leu Lys Thr Gly Ala 100 105 110

Gly Asn Lys Leu Pro Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg 115 120 125

Ala Asn Ser Hie Met Arg Gly Ala Ser Gly He Arg Leu Glu Leu lie 130 135 140

Lys Arg Met Glu He Phe Leu Asn Ala Gly Val Thr Pro Tyr Val Tyr 145 150 155 160

Glu Phe Gly Ser lie Gly Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser Tyr 165 170 175 lie Thr Gly Ser Leu lie Gly Leu Asp Pro Ser Phe Lys Val Asp Phe 100 185 190

Asn Gly Lys Glu Met Asp Ala Pro Thr Ala Leu Arg Gin Leu Asn Leu 195 200 205

Ser Pro Leu Thr Leu Leu Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Met Asn Gly 210 215 220

Thr Ser Val Met Thr Gly lie Ala Ala Asn Cys Val Tyr Asp Thr Gin 225 230 235 240

He Leu Thr Ala lie Ala Met Gly Val His Ala Leu Asp lie Gin Ala 245. 250 255

Leu Asn Gly Thr Asn Gin Ser Phe His Pro Phe lie His Asn Ser Lys 260 265 270

Pro His Pro Gly Gin Leu Trp Ala Ala Asp Gin Met lie Ser Leu Leu 275 280 285

Ala Asn Ser Gin Leu Val Arg Asp Glu Leu Asp Gly Lys His Asp Tyr 290 235 300

Arg Asp His Glu Leu lie Gin Asp Arg Tyr Ser Leu Arg Cys Leu Pro 305 310 315 320

Gin Tyr Leu Gly Pro lle Val Asp Gly He Ser Gin lie Ala Lys Gin 325 330 335 lie Glu lie Glu lie Asn Ser Val Thr Asp Asn Pro Leu lie Asp Val 340 345 350

Asp Asn. Gin Ala Ser Tyr His Gly Gly Asn Phe Leu Gly Gin Tyr Val 355 360 365

Gly Met Gly Met Asp His Leu Arg Tyr Tyr lie Gly Leu Leu Ala Lys 370 375 380

His Leu Asp Val Gin He Ala Leu Leu Ala Ser Pro Glu Phe Ser Asn 385 390 395 400

Gly Leu Pro Pro Ser Leu Leu Gly Asn Arg Glu Arg Lys Val Asn Met 405 410 415

Gly Leu Lys Gly Leu Gin lie Cys Gly Asn Ser lie Met Pro Leu Leu 420 425 430

Thr Phe Tyr Gly Asn Ser lie Ala Asp Arg Phe Pro Thr His Ala Glu 435 440 445

Gin Phe Asn Gin Asn He Asn Ser Gin Gly Tyr Thr $er Ala Thr Leu 450 455 460

Ala Arg Arg Ser.val Asp lie Phe Gin Asn Tyr Val Ala He Ala Leu 465 470 475 4B0

Met Phe Gly Val Gin Ala Val Asp Leu Arg Thr Tyr Lys Lys Thr Gly 4S5 490 495

His Tyr Asp Ala Arg Ala Ser Leu Ser Pro Ala Thr Glu Arg Leu Tyr 500 505 510

Ser Ala Val Arg His Val Val Gly Gin Lys Pro Thr Ser Asp Arg Pro 515 520 525

Tyr He Trp Asn Asp Asn Glu Gin Gly Leu Asp Glu His lie Ala Arg 530 535 540

He Ser Ala Asp He Ala Ala Gly Gly Val He Val Gin Ala Val Gin 545 550 555 560

Asp He Leu Pro Ser Leu His 565 <210> 12 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador 1 de PAL de Nostoc punctiforme (direto) <4 0 0> 12 cactgtcata tgaatataac atctctacaa cagaacat 38 <210> 13 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador 2 de PAL de Nostoc punctiforme (reverso) <4 Ο 0> 13 gacagtggcg gccgctcacg ttgactttaa gctcgaaaaa atatg 45 <210> 14 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador 1 de PAL de Anabaena variabilis (direto, fragmento N-terminal) <4 0 0> 14 cactgtgcta gcatgaagac actatctcaa gcacaaag 38 <210> 15 <211> 49 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador 2 de PAL de Anabaena variabilis (reverso, fragmento N-terminal) <4 0 0> 15 ggaaatttcc tccatgatag ctggcttggt tatcaacatc aattagtgg 49 <210> 16 <211> 49 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador 3 de PAL de Anabaena variabilis (direto, fragmento C-terminal) <4 0 0> 16 ccactaattg atgttgataa ccaagccagc tatcatggag gaaatttcc 49

<210> 17 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador 4 de PAL de Anabaena variabilis (reverso, fragmento C-terminal) <4 0 0> 17 cactgtgcgg ccgcttaatg caagcagggt aagatatctt g 41 <210> 18 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador direto de PAL de Anabaena variabilis <4 0 0> 18 cactgtcata tgaagacact atctcaagca caaag 35 <210> 19 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador reverso de PAL de Anabaena variabilis <4 0 0> 19 cactgtctcg agatgcaagc agggtaagat atcttg 36 <210> 20 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de PAL de Anabaena variabilis para criar o local 5' Nhel e suprimir o local interno Nhel (direto, N-terminal) <4Ο0> 20 cactgtgcta gcatgaagac actatctcaa gcacaaag 38 <210> 21 <211> 49 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de PAL de Anabaena variabilis para criar o local 5' Nhel e suprimir o local interno Nhel (reverso, N-terminal) <400> 21 ggaaatttcc tccatgatag ctggcttggt tatcaacatc aattagtgg 49 <210> 22 <211> 49 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de PAL de Anabaena variabilis para criar o local 5' Nhel e suprimir o local interno Nhel (direto, fragmento C-terminal) <400> 22 ccactaattg atgttgataa ccaagccagc tatcatggag gaaatttcc 49 <210> 23 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de PAL de Anabaena variabilis para criar o local 5' Nhel e suprimir o local interno Nhel (reverso, fragmento C-terminal) <400> 23 acagtggcgg ccgcttaatg caagcagggt aagatatctt g 41 <210> 24 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de PAL de Anabaena variabilis para criar o local 5' Nhel e o local 3' Smal (direto) <400> 24 cactgtgaat tcatgaagac actatctcaa gcacaaag 38 <210> 25 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de PAL de Anabaena variabilis para criar o local 5' Nhel e o local 3' Smal (reverso) <400> 25 cactgtcccg ggttaatgca agcagggtaa gatatct 37 <210> 26 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de PAL de Anabaena variabilis para criar a substituição de cisteina para serina na posição 503 (direto) <400> 26 gtcattacga tgcacgcgcc tctctatcac ctgcaactga g 41 <210> 27 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de PAL de Anabaena variabilis para criar a substituição de cisteina para serina na posição 503 (reverso) <400> 27 ctcagttgca ggtgatagag aggcgcgtgc atcgtaatga c 41 <210> 28 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de PAL de Anabaena variabilis para criar a substituição de cisteina para serina na posição 565 (direto) <400> 28 cagttcaaga tatcttaccc tccttgcatt aacccgggct gc 42 <210> 29 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de PAL de Anabaena variabilis para criar a substituição de cisteina para serina na posição 565 (reverso) <400> 29 gcagcccggg ttaatgcaag gagggtaaga tatcttgaac tg 42 <210> 30 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de PAL de Anabaena variabilis para criar a substituição de cisteina para serina na posição 64 (direto) <400> 30 gcagggtatt caggcatctt ctgattacat taataatgct gttg 44 <210> 31 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de PAL de Anabaena variabilis para criar a substituição de cisteína para serina na posição 64 (reverso) <400> 31 caacagcatt attaatgtaa tcagaagatg cctgaatacc ctgc 44 <210> 32 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de PAL de Anabaena variabilis para criar a substituição de cisteina para serina na posição 318 (direto) <400> 32 caagatcgtt actcactccg atcccttccc cagtatttgg ggc 43 <210> 33 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de PAL de Anabaena variabilis para criar a substituição de cisteina para serina na posição 318 (reverso) <400> 33 gccccaaata ctggggaagg gatcggagtg agtaacgatc ttg 43

Lisboa, 2015-10-26

Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Variante de amónia-liase de fenilalanina de Anabaena variabilis (AvPAL) em que a referida variante de AvPAL tem uma maior atividade conversora de fenilalanina e/ou uma imunogenicidade reduzida em comparação com uma AvPAL de tipo selvagem (SEQ ID N0:4), em que um ou mais resíduos de cisteína selecionados a partir do grupo consistindo em resíduos de cisteína nas posições 503 e 565 foram substituídos por um resíduo de serina.
2. 2. Variante de AvPAL da reivindicação 1, em que o resíduo de cisteína na posição 565 de AvPAL foi substituído por um resíduo de serina (SEQ ID NO:10).
3. 3. Variante de AvPAL da reivindicação 1, em que os resíduos de cisteína nas posições 503 e 565 de AvPAL foram substituídos por um resíduo de serina (SEQ ID NO:11).
4. 4. Variante de AvPAL de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, compreendendo ainda um polímero solúvel em água.
5. 5. Variante de AvPAL da reivindicação 4, em que o polímero solúvel em água é um polietilenoglicol.
6. 6. Variante de AvPAL da reivindicação 5, em que a variante de AvPAL é obtenível fazendo reagir a variante de AvPAL com polietilenoglicol ativado com NHS a uma razão de 3 de polietilenoglicol por resíduo de lisina da variante de AvPAL.
7. 7. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de uma doença de metabolismo de aminoácidos compreendendo a variante de AvPAL de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
8. 8. Composição compreendendo a variante de AvPAL de qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para utilização no tratamento de uma doença causada no todo ou em parte por uma deficiência em fenilalanina-hidroxilase (PAH).
9. 9. Composição para utilização da reivindicação 8, em que a doença é caracterizada por niveis elevados de fenilalanina; ou em que a composição é preparada para tratamento de um sujeito possuindo 10% ou menos de uma atividade de PAH normal.
10. 10. Variante de AvPAL de qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para utilização no tratamento de um humano sofrendo de fenilcetonúria (PKU).
11. 11. Composição compreendendo a variante de AvPAL de qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para utilização no tratamento de PKU grave clássica, em que a composição é eficaz para baixar a concentração de fenilalanina no plasma de um sujeito em comparação com a referida concentração na ausência de administração da referida composição.
12. 12. Composição para utilização da reivindicação 11, em que o referido sujeito foi diagnosticado como possuindo um mutante de PAH.
13. 13. Composição para utilização da reivindicação 12, em que a referida PAH mutante compreende uma mutação no domínio catalítico de PAH, ou uma ou mais mutações selecionadas a partir do grupo consistindo em F39L, L48S, I65T, R68S, A104D, S110C, D129G, E178G, V190A, P211T, R241C, R261Q, A300S, L308F, A313T, K320N, A373T, V388M E390G, A395P, P407S, e Y414C.
14. 14. Composição compreendendo a variante de AvPAL de qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para utilização no tratamento de uma fêmea grávida possuindo hiperfenilalaninemia (HPA), em que a composição é preparada para ser administrada em combinação com uma dieta com restrição de proteínas, em que a administração combinada da composição e a dieta com restrição de proteínas é eficaz para baixar a concentração de fenilalanina no plasma da referida fêmea em comparação com a referida concentração na ausência de administração da referida combinação.
15. 15. Composição compreendendo a variante de AvPAL de qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para utilização no tratamento de um bebé possuindo PKU, em que a composição é preparada para ser administrada a um bebé entre os 0 e os 3 anos de idade e possuindo uma concentração plasmática de fenilalanina de entre 360 μΜ a 4800 μΜ, e em que a composição é preparada para ser administrada numa quantidade eficaz para produzir uma diminuição na concentração plasmática de fenilalanina do referido bebé.
16. 16. Variante de AvPAL em que os resíduos de cisteína nas posições 503 e 565 de AvPAL foram substituídos com resíduos de serina (SEQ ID. NO. 11).
17. 17. Variante de AvPAL da reivindicação 16, que é peguilada.
18. 18. Variante de AvPAL da reivindicação 17, em que a referida peguilação é alcançável fazendo reagir a variante de AvPAL com polietilenoglicol ativado com NHS a uma razão de pelo menos 1,6 de polietilenoglicol por resíduo de lisina de variante de AvPAL; fazendo reagir a variante de AvPAL com poliet ilenoglicol ativado com NHS a uma razão de pelo menos 2,4 de polietilenoglicol por resíduo de lisina de variante de AvPAL; ou fazendo reagir a variante de AvPAL com poliet ilenoglicol ativado com NHS a uma razão de 3 de polietilenoglicol por resíduo de lisina de variante de AvPAL.
19. 19. Variante de AvPAL da reivindicação 17, em que pelo menos 28 porcento dos resíduos de lisina nas posições 2, 10, 32, 145, 195, 301, 413, 493, e 522 da variante de AvPAL são peguilados; em que pelo menos 51 porcento dos resíduos de lisina nas posições 2, 10, 195, 413, 493, e 522 da variante de AvPAL são peguilados; ou em que pelo menos 75 porcento dos resíduos de lisina nas posições 2, 10, 195, 493, e 522 da variante de AvPAL são peguilados. Lisboa, 2015-10-26