KR20150038753A - 원핵생물 페닐알라닌 암모니아-리아제의 조성물, 및 상기 조성물의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 야생형 페닐알라닌 암모니아-리아제 (PAL)와 비교하여 페닐알라닌-전환 활성이 더 크고/크거나 면역원성이 감소된, 원핵생물에 의해 생산된 PAL 변이체에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 박테리아 PAL 및 이의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 및 유사체의 조성물, 뿐만 아니라 치료적 및 산업적 목적을 위한 이같은 조성물의 생산, 정제 및 사용 방법을 제공한다.

Description

원핵생물 페닐알라닌 암모니아-리아제의 조성물, 및 상기 조성물의 사용 방법{COMPOSITIONS OF PROKARYOTIC PHENYLALANINE AMMONIA-LYASE AND METHODS OF USING SAID COMPOSITIONS}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 미국 출원 번호 11/807,227 (2007년 5월 25일 출원)의 일부 계속 출원이고, 이는 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.

원핵생물 페닐알라닌 암모니아-리아제(lyase) (PAL) 및 이의 조성물, 및 PAL의 면역원성 및/또는 단백질분해 감도를 감소시키면서 PAL 촉매 활성 및 안정성을 강화시키기 위한 이같은 조성물의 최적화가 본원에서 제공된다. 치료적 및 산업적 목적을 위한 PAL의 이같은 최적 조성물의 용도가 본원에서 또한 제공된다.

PAL은 식물 ([Koukol, et al., J. Biol. Chem. 236:2692-2698 (1961)]; [Hanson, et al., The Enzymes 7:75-166 (1972)]; [Poppe, et al., Curr. Org. Chem. 7:1297-1315 (2003)]), 일부 진균 ([Rao, et al., Can. J. Biochem. 4512:1863-1872 (1967)]; [Abell, et al., Methods Enzymol. 142:242-253 (1987)]) 및 박테리아 ([Bezanson, et al., Can. J. Microbiol. 16:147-151. (1970)]; [Xiang, et al., J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)]; [Hill, et al., Chem. Commun. 1358-1359 (2003)])에 광범위하게 분포되어 있는 비-포유동물 효소이고, 대장균에서 재조합에 의해 생산될 수 있다.

PAL의 대표적인 목록에는 하기의 것들이 포함된다: Q9ATN7 아가스타체 루고사(Agastache rugosa); O93967 아마니타 무스카리아(Amanita muscaria) (광대 버섯); P35510, P45724, P45725, Q9SS45, Q8RWP4 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) (애기장대); Q6ST23 밤부사 올드하미이(Bambusa oldhamii) (왕대); Q42609 브롬헤아디아 핀라이소니아나(Bromheadia finlaysoniana) (난초); P45726 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) (차); Q9MAX1 카타란투스 로세우스(Catharanthus roseus) (매일초) (마다가스카르 페리윙클(Madagascar periwinkle)); Q9SMK9 시서 아리에티눔(Cicer arietinum) (병아리콩); Q9XFX5, Q9XFX6 시트러스 클레멘티나(Citrus Clementina) × 시트러스 레티쿨레이트(Citrus reticulate); Q42667 시트러스 리몬(Citrus limon) (레몬); Q8H6V9, Q8H6W0 코페아 케이 카네포라(Coffea canephora) (로부스타(Robusta) 커피); Q852S1 다우쿠스 카로타(Daucus carota) (당근); O23924 디기탈리스 라나타(Digitalis lanata) (폭스글로브(Foxglove)); O23865 다우쿠스 카로타 (당근); P27991 글리세나 막스 (대두); O04058 헬리안투스 안누우스(Helianthus annuus) (일반 해바라기); P14166 (Q42858) 이포모에아 바타타스(Ipomoea batatas) (고구마); Q8GZR8, Q8W2E4 락투카 사티바(Lactuca sativa) (양상추); O49835, O49836 리토스페르뭄 에리트로리존(Lithospermum erythrorhizon); P35511, P26600 리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum) (토마토); P35512 말루스 도메스티카(Malus domestica) (사과) (말루스 실베스트리스(Malus sylvestris)); Q94C45, Q94F89 마니호트 에스쿨렌타(Manihot esculenta) (카사바(Cassava)) (마니혹(Manioc)); P27990 메티카고 사티바(Medicago sativa) (알팔파(Alfalfa)); P25872, P35513, P45733 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) (일반 담배); Q6T1C9 퀘르쿠스 수베르(Quercus suber) (코르크 나무); P14717, P53443, Q7M1Q5, Q84VE0, Q84VE0 오리자 사티바(Oryza sativa) (벼); P45727 페르시아 아메리카나 (아보카도); Q9AXI5 파르비티스 닐(Pharbitis nil) (바이올렛) (일본 나팔꽃); P52777 피누스 타에다(Pinus taeda) (미송(Loblolly pine)); Q01861, Q04593 피숨 사티붐(Pisum sativum) (완두콩); P24481, P45728, P45729 페트로셀리눔 크리스품(Petroselinum crispum) (파슬리) (페트루셀리눔 호르텐스(Petroselinum hortense)); Q84LI2 팔라에놉시스(Phalaenopsis) × 도리타에놉시스(Doritaenopsis) 하이브리드 재배종; P07218, P19142, P19143 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) (강낭콩); Q7XJC3, Q7XJC4 피누스 피나스테르(Pinus pinaster) (해안송); Q6UD65 포풀루스 발사미페라 아종 트리코카르파(Populus balsamifera subsp . trichocarpa) × 포풀루스 델토이데스(Populus deltoides); P45731, Q43052, O24266 포풀르스 키타카미엔시스(Populus kitakamiensis) (미루나무); Q8H6V5, Q8H6V6 포풀루스 트레물로이데스(Populus tremuloides) (사시나무); P45730 포풀루스 트리코카르파(Populus trichocarpa) (미국 포플러); O64963 프루누스 아비움(Prunus avium) (체리); Q94EN0 레흐마니아 글루티노사(Rehmannia glutinosa); P11544 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides) (효모) (로도토룰라 그라실리스(Rhodotorula gracilis)); P10248 로도토룰라 루브라(Rhodotorula rubra) (효모) (로도토룰라 무실라기노사(Rhodotorula mucilaginosa)); Q9M568, Q9M567 루부스 이다에우스(Rubus idaeus) (나무딸기); P31425, P31426 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum) (감자); Q6SPE8 스텔라리아 론기페스(Stellaria longipes) (롱스톡 스타워트(Longstalk starwort)); P45732 스틸로산테스 후밀리스(Stylosanthes humilis) (타운스빌 스틸로(Townsville stylo)); P45734 트리폴리움 서브테라네움(Trifolium subterraneum) (서브터레이니언(Subterranean) 클로버); Q43210, Q43664 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum) (밀); Q96V77 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis) (깜부기균); P45735 비티스 비니페라(Vitis vinifera) (포도); 및 Q8VXG7 제아 메이스(Zea mays) (옥수수).

수많은 연구들이 페닐케톤뇨증 (PKU)의 효소 치환 치료를 위한 페닐알라닌 암모니아-리아제 (PAL, EC 4.3.1.5) 효소의 용도에 초점을 맞추었다 ([Hoskins, et al., Lancet 1(8165):392-394 (1980)]; [Gilbert, et al., Biochem. J. 199(3):715-723 (1981)]; [Hoskins, J.A., et al., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 35(2):275-282 (1982)]; [Sarkissian, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(5):2339-2344 (1999)]; [Liu, et al., Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 30(4):243-257 (2002)]; [Wieder, K. J., J Biol. Chem. 254(24):12579-12587 (1979)]; [Gamez, et al., Mol. Ther. 11(6):986-989 (2005)]; [Ambrus, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 224(3):598-602 (1983)]; [Ambrus, et al., Science 201(4358):837-839 (1978)]; [Kalghatgi, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 27(3):551-561 (1980)]; [Ambrus, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 37(1):105-111 (1982)]; [Gilbert, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 131(2):557-563 (1985)]; [Pedersen, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 20(3):559-569 (1978)]; [Marconi, et al., Biochimie 62(8-9):575-580 (1980)]; [Larue, et al., Dev. Pharmacol. Ther. 9(2):73-81 (1986)]; [Ambrus, C.M., et al., Ann. Intern. Med. 106(4):531-537 (1987)]; [Bourget, et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 10:57-59 (1984)]; [Bourget, et al., FEBS Lett. 180(1):5-8 (1985)]; [Bourget, et al., Biochim. Biophys. Acta 883(3):432-438 (1986)]; [Chang, et al., Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 23(1):1-21 (1995)]; [Chang, et al., Mol Biotechnol. 17(3):249-260 (2001)]; 미국 특허 번호 5,753,487).

PKU는 페닐알라닌의 대사를 담당하는 효소인 간 페닐알라닌 히드록실라제(hydroxylase) (PAH)의 손상된 활성으로부터 초래되는 아미노산 대사의 선천적인 이상이다. PKU 및 고페닐알라닌혈증 (HPA)에 이르는 PAH 돌연변이가 있는 환자는 상승된 수준의 페닐알라닌, 손상된 신경생리학 기능화 및 감소된 인지 발달을 나타낸다. 중증 PKU 환자의 경우, 식이 제한을 사용하여 페닐알라닌 수준이 낮은 수준에서 유지되지 않으면, 비가역적인 정신 지체 가능성이 있다. PAL은 페닐알라닌을 암모니아 및 트랜스-신남산 (무해한 대사물질)으로 전환시키고, 이는 추가로 대사되어 히퓨레이트(hippurate)로서 소변에서 배설된다 ([Hoskins et al., (1980) 동일 문헌]; [Hoskins, et al., Biomed Mass Spectrom 11(6): 296-300 (1984)]).

PKU에 대한 현재의 치료는 아미노산 페닐알라닌이 낮은 식이를 평생 지속하는 것을 수반한다 ([Levy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(5):1811-1813 (1999)]). 이러한 식이 요법은 유지하기가 어렵고 ([Matalon, et al., Genet. Med. 6(1): 27-32 (2004)]; [Woolf, et al., Arch. Dis. Child. 33(167):31-45 (1958)]; [Kim, Mol Ther. 10(2):220-224 (2004)]), 상승된 페닐알라닌 수준에 의해 야기될 수 있는 해로운 신경학적 효과를 항상 제거하지는 않는다 ([Sarkissian, et al., Mol. Genet. Metab. 69:188-194 (2000)]). 임신 기간 동안의 이상적이지 못한 식이 조절은 출생 결함을 초래할 수 있다 ([Levy, (1999) 동일 문헌]). 또한, PKU/HPA 환자가 제한적인 식이를 따르면서 정상적인 삶을 살기가 매우 어렵고, 식이 요법은 몇몇 영양소의 결핍과 관련될 수 있으며, 이러한 결핍들 중 일부는 뇌 발달에 불리하다 ([Levy, (1999) 동일 문헌]). 대부분의 저-페닐알라닌 식이 제품에는 충분히 만족스럽지 않은 감각수용성(organoleptic) 성질이 있어서, 이러한 치료의 순응도를 손상시킨다 (Levy, (1999) 동일 문헌.). 따라서, 치료적 치료의 개발은 현재의 식이 치료를 교체하거나 보충하고, PKU에 걸린 개체들, 특히 가장 중증인 형태의 이러한 질환에 걸린 환자들에게 가해지는 신경학적 손상을 방지할 것이다.

1999년에, Scriver 및 동료들은 PKU 효소 치환 용도를 위해 로도스포리디움 토룰로이데스로부터의 PAL 효소 ([Sarkissian, et al., (1999) 동일 문헌])를 사용하는 것에 대한 최초의 연구를 보고하였다. 마우스 PKU 및 HPA 모델 연구에서, PAL 투여 (아프로티닌 프로테아제(protease) 억제제와 조합된 PAL 또는 재조합적으로 발현되어 대장균 세포 내부에 존재하는 PAL을 사용하는 복강내 주사에 의한 투여 또는 경구 투여)가 더 낮은 혈장 페닐알라닌 수준과 관련되었음이 실연되었다. 또한, PAL를 PKU 환자에서 사용하는 것을 기술하는 예비 연구는 장용 코팅된 젤라틴 캡슐에서 투여되는 PAL을 사용하여 ([Hoskins, et al., (1980) 동일 문헌]), 또는 체외 효소 공장을 사용하여 ([Ambrus, et al., Ann. Intern. Med. 106(4):531-537 (1987)]), 페닐알라닌 수준에서의 감소를 나타냈다. 이러한 연구들은 PAL이 단백질분해성 분해에 대해 보호되면, 경구 투여 시 혈장 Phe의 현저한 감소가 달성될 수 있다는 것을 제안한다.

암 세포로의 페닐알라닌의 영양소 공급을 제한하고, 이에 의해 신생물성 성장을 억제하는 PAL의 능력을 기초로 암 치료를 위한 PAL의 사용이 또한 제안되었다 ([Fritz, et al., J Biol Chem. 251(15):726 (1976)]; [Roberts, et al., Cancer Treat Rep. 60(3):261-263 (1976)]; [Shen, et al., Cancer Res. 37(4):1051-1056 (1977)]; [Shen, et al., Cancer Treat Rep. 63(6):1063-1068 (1979)]; [Wieder, et al., J Biol Chem. 254(24):12579-12587 (1979)]). 그러나, 정맥내 주사된 PEG화 PAL이 13번째 주사 후 순환 혈액으로부터 급속하게 소거되었다. 또한, 페닐알라닌에서의 PAL-매개 감소는 뮤린(murine) 백혈병 및 전이성 흑색종의 증식을 방지하였다 ([Abell, et al., Cancer Res. 33:2529-2532 (1973)]; [Roberts, et al., (1976) 동일 문헌]; [Shen, et al., (1977) 동일 문헌]).

해양 박테리아 스트렙토마이세스 마리티무스(Streptomyces maritimus)로부터의 박테리아 PAL이 정균제 엔테로신(enterocin)의 중요한 공급원으로 작용할 수 있다. 스트렙토마이세스 마리티무스 PAL인 EncP는 페닐알라닌의 트랜스-신남산으로의 전환인, 엔테로신 합성에서의 초기 단계를 촉매한다 ([Xiang, et al., J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)]).

PAL은 L-페닐알라닌 메틸 에스테르 (아스파테임(Aspartame) 생산용) ([D'Cunha, et al., Enzyme and Microbial Technology 19(6):421-427 (1996)]; [Hamilton, et al., Trends in Biotechnol. 3(3):64-68 (1985)]), 및 제약 전구물질로서 사용되는 또다른 치환된 L-페닐알라닌 유도체 (미국 특허 출원 20020102712)의 산업적인 합성에 사용될 수 있다.

PAL에는 또한 농업적 용도가 있고, 이때 PAL은 식물, 진균 및 박테리아에서 리그닌, 쿠마린 및 플라보노이드를 생산하는 페닐프로파노이드에 이르는 초기 효소 프로세스에 참여한다. 따라서, PAL 활성의 조정은 다수의 농업적 현상 예컨대 과실의 갈변에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 활성 부위 PAL 억제제의 구조-기반 약물 디자인은 효과적인 제초제에 이를 수 있다 ([Poppe, et al., (2003) 동일 문헌]).

잠재적으로 PAL에 다양한 산업적 및 치료적 용도가 있지만, 감소된 비(比) 활성 및 단백질분해 불안정성에 의해 PAL의 사용이 제한될 수 있다. 다른 치료적 단백질들과 유사하게, 효소 치료법으로서의 PAL의 사용에는 면역원성 및 단백질분해 감도와 같은 여러 단점이 동반된다. 추가로, 고페닐알라닌혈증을 특징으로 하는 장애에서 정상적인 다소 좁은 범위 내의 혈장 페닐알라닌 수준을 달성하고 유지하기 위해 기질 친화력과 효소 활성 사이의 섬세한 규형이 요구된다. 아직까지, 이러한 파라미터들의 개선을 향하는 협동된 노력이 이러한 단백질에 관한 구조적 및 생화학적 지식의 부족으로 인해 이루어지지 않았다.

따라서, 강력한 촉매 활성 및 더 큰 생물학적 반감기가 포함되는 최적의 동역학 특성, 더 큰 생화학적 안정성 및/또는 약화된 면역원성이 있는 PAL 분자가 여전히 요구된다.

발명의 개요

여러 박테리아 PAL이 HAL/PAL 패밀리의 일부로서 이미 확인되어 있고, 여기에는 스트렙토마이세스 마리티무스로부터의 PAL (EncP로 또한 공지됨, 서열 5, 도 4), 노스톡 푼크티포르메(Nostoc punctiforme)로부터의 PAL/HAL (2004년 10월 1일 제출된 노스톡 푼크티포르메 ATCC 29133으로부터의 접속 ZP_00105927, <NCBI Microbial Genomes Annotation Project>) (서열 2, 도 4), 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis) (유전자 ID 3679622, Ava_3988 페닐알라닌/히스티딘 암모니아-리아제 [아나바에나 바리아빌리스 ATCC 29413, 2006년 3월 31일 (서열 4, 도 4), 광합성 원핵생물 아나시스티스 니둘란스(Anacystis nidulans) ([Lofflehardt, Z. Naturforsch 31(11-12):693-9 (1976)]), 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과로부터의 그람(gram)-음성 박테리아, 포토랍두스 루미네센스(Photorabdus luminescens) TT01 ([Williams, et al., Microbiology 151:2543-2550 (2005)]), 및 스트렙토마이세스 베르티실라투스(Streptomyces verticillatus) ([Bezanson, et al., Can. J. Microbiol. 16(3):147-51 (1970)])로부터의 PAL/HAL이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, PAL 활성이 스트렙토마이세스 마리티무스에서 평가되었다 ([Xiang, L., et al., J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)]). 시아노박테리아(cyanobacteria), 예컨대 아나바에나(Anabaena) 및 노스톡(Nostoc)이 혼합형 폴리케타이드-펩티드 생합성 경로를 통해 생성되는 생체활성 천연 생성물의 생산과 관련하여 연구되었다 ([Moore, B.S., Natural Products Reports 22(5):580-593 (2005)]; [Becker, et al., Gene 325:35-42 (2004); Hoffman, et al., Gene 311:171-180 (2003)]). 본 발명은 원핵생물 또는 박테리아 PAL이 PKU 및 기타 장애를 위한 효과적인 치료로서 작용할 수 있다는 발견을 기초로 한다. 더욱 강력한 촉매 활성, 더 큰 생화학적 안정성, 및 치료 용도를 위한 약화된 면역원성 및 더 큰 생물학적 반감기과 같은 강화된 성질이 있는 박테리아 PAL 및 이의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 및 유사체의 조성물이 본 발명에서 구현된다. 본 발명은 박테리아 PAL 및 이의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 및 유사체의 생산 및 정제 방법, 및 치료적 및 산업적 목적을 위해 이같은 조성물을 사용하는 방법을 또한 제공한다.

본원에서 사용된 "박테리아 PAL" 및 "원핵생물 PAL"은 (1) 스트렙토마이세스 마리티무스 (이로부터의 PAL은 EncP로 또한 공지됨, 서열 5, 도 4), 노스톡 푼크티포르메 (서열 2, 도 4), 아나바에나 바리아빌리스 (서열 4, 도 4), 아나시스티스 니둘란스 ([Lofflehardt, (1976) 동일 문헌]), 포토랍두스 루미네센스 TT01 ([Williams, et al., (2005) 동일 문헌]), 및 스트렙토마이세스 베르티실라투스 ([Bezanson, et al., (1970) 동일 문헌])로부터의 PAL을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 원핵생물로부터의 야생형 PAL; (2) 페닐알라닌에 대한 유사한 (즉, 50％ 이상의) 촉매 활성을 유지하고, 일부 실시양태에서는 증가된 촉매 활성 및/또는 증가된 반감기 및/또는 감소된 면역원성을 나타내는, 이같은 야생형 효소의 단편, 돌연변이체, 변이체 및 유사체, 및 (3) 또다른 유리한 효과, 예컨대 강화된 반감기를 제공하는 또다른 화학적 모이어티(moiety)에 연결된 이같은 야생형 효소, 이의 단편, 돌연변이체, 변이체 및 유사체의 화학적으로 변형된 버젼을 의미하도록 상호교환가능하게 사용된다. 예를 들어, 치료적 또는 산업적 목적을 위한 원핵생물 PAL, 단편, 돌연변이체, 변이체, 유사체 또는 이들의 화학적으로 변형된 버젼, 및 이같은 효소(들)의 조성물의 제조 또는 사용 방법에 대한 모든 언급은 모든 이같은 야생형, 단편, 돌연변이체, 변이체, 유사체 또는 이들의 화학적 변형물의 제조, 사용 또는 제형화 방법을 지칭하는 것으로 의도된다.

첫번째 양상에서, 본 발명은 박테리아 PAL 및 이의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유사체를 제공한다. 한 실시양태는 노스톡 푼크티포르메로부터의 박테리아 PAL (서열 2) 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유사체이다. 또다른 실시양태는 아나바에나 바리아빌리스로부터의 박테리아 PAL (서열 4) 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유사체이다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 로도스포리디움 토룰로이데스로부터의 PAL 내의 Ser210, Ala-Ser-Gly 트라이애드(triad) (211-213) Asp214, Leu215, Asn270, Val269, Leu266, Leu134, His137, Lys468, Glu496, Gln500에 상응하는 위치에서의 야생형 활성 부위 잔기, 또는 이러한 활성 부위 잔기(들)의 보존적 치환(들)을 유지하고, 이때 211-213의 Ala-Ser-Gly 트라이애드는 페닐알라닌에 대한 결합 부위인 것으로 여겨진다.

바람직한 변이체는 감소된 효소 활성, 증가된 면역원성, 및/또는 생체 내에서의 또다른 불리한 효과와 관련될 수 있는 단백질 응집을 감소시키기 위해 하나 이상의 시스테인 잔기가 또다른 아미노산 (예를 들어, 세린) 잔기로 교체된 단백질을 포함할 수 있다.

바람직한 변이체는 또다른 이종성 폴리펩티드, 예컨대 반감기를 증가시키는 것으로 당업계에 공지된, 면역글로불린의 천연 또는 변형된 불변 영역 또는 샐비지(salvage) 에피토프가 유지된 이의 단편에 효소가 융합될 수 있는 융합 단백질을 포함할 수 있다.

또다른 유리한 효과를 제공하는 화학적 모이어티에 연결된, 이같은 폴리펩티드들의 화학적으로 변형된 버젼이 본 발명에서 추가로 구현된다. 예를 들어, 폴리펩티드에의 수용성 중합체의 비-특이적 또는 부위-특이적 (예를 들어, N-말단) 연결은 반감기를 개선시키는 것으로 당업계에 공지되어 있고, 화학적 모이어티의 연결은 또한 면역원성을 감소시키고 프로테아제 저항성을 개선시킬 수 있다.

이같은 박테리아 PAL은 본 발명의 방법에 따라 단리 및 정제되고, 이에 의해 효소를 치료적으로 사용할 수 있게 하는 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 완전 또는 야생형 박테리아 PAL을 코딩하는 cDNA가 사용된다. 그러나, 또다른 실시양태에서, 이의 생물학적으로 활성인 단편 또는 돌연변이체를 코딩하는 cDNA가 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명은 구조-기반 분자 공학 접근법에 의해 수득된 최적화된 박테리아 PAL 및/또는 화학적으로 변형된 (예를 들어, PEG화) 형태의 PAL의 조성물을 제공한다. 개선된 비 활성, 강화된 안정성, 치료적 사용에 적합한 감소된 면역원성 및/또는 단백질분해 감도가 있는 PAL의 최적 조성물이 특정 실시양태에서 구현된다. 한 실시양태는 비 활성이 개선된 PEG화 형태의 노스톡 푼크티포르메 PAL이다. 또다른 실시양태는 비 활성이 개선된 PEG화 형태의 아나바에나 바리아빌리스 PAL이다.

다양한 실시양태에서, PAL:PEG 또는 PEG:PAL의 비율과 관련하여 PAL 변이체의 PEG화가 기술된다. 본원에서 사용된 "PAL:PEG"의 비율은, 달리 지시되지 않는 한, PEG화 반응에서의 PAL 변이체 상의 라이신 잔기 대 PEG 분자의 비율을 지칭한다. 유사하게, 본원에서 사용된 "PEG:PAL"의 비율은, 달리 지시되지 않는 한, PEG화 반응에서의 PEG 분자 대 PAL 변이체 상의 라이신 잔기의 비율을 지칭한다.

한 실시양태에서, 면역원성이 감소된 PEG화 PAL 변이체가 본 발명에서 구현된다. 또다른 실시양태는 면역원성이 감소된 PEG화 형태의 노스톡 푼크티포르메 PAL (NpPAL) 변이체이다. 또다른 실시양태는 면역원성이 감소된 PEG화 형태의 아나바에나 바리아빌리스 PAL (AvPAL) 변이체이다. NpPAL 또는 AvPAL 변이체를 수용성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 반응시킴으로써 PEG화가 달성된 NpPAL 또는 AvPAL 변이체가 특정 실시양태에서 구현된다. 일부 실시양태에서, NpPAL 또는 AvPAL 변이체를 1:1 이상, 1:1.5 이상, 1:2 이상, 1:3 이상, 또는 1:4 이상의 PAL:PEG의 비율로 PEG와 1회 반응시킴으로써 PEG화가 달성된다. 한 실시양태에서, PAL 변이체는 AvPAL 변이체이고, 1:3의 PAL:PEG 비율을 사용하여 PEG화가 달성된다.

감소된 면역원성을 위해 PEG화 PAL 변이체를 재-PEG화시키는 것이 본 발명에서 또한 구현된다. 일부 실시양태에서, 각각의 PEG화를 1:1 이상, 1:1.5 이상, 1:2 이상, 1:3 이상, 또는 1:4 이상의 PAL:PEG의 비율로 하여 NpPAL 또는 AvPAL 변이체를 PEG와 2회 이상 반응시킴으로써 PEG화가 달성된다. 일부 실시양태에서, 각각의 PEG화를 1:1 이상, 1:1.5 이상, 1:2 이상, 1:3 이상, 또는 1:4 이상의 PAL:PEG의 비율로 하여 NpPAL 또는 AvPAL 변이체를 2회, 3회, 4회, 5회 또는 그 이상으로 PEG와 반응시킴으로써 PEG화가 달성된다. 한 실시양태에서, PAL 변이체는 AvPAL 변이체이고, 제1 PEG화 반응 및 제2 PEG화 반응 양쪽 모두에 대해 1:3의 PAL:PEG 비율을 사용하여 PEG화가 달성된다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 야생형 PAL의 생물학적으로 활성인 부위가 원한다면 PAL 동역학 특징을 최적화하기 위해 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, 변형된 PAL은 혈장 페닐알라닌 수준을 감소시키지만 또한 이를 약 120 μM 내지 약 240 μM의 최적 범위 내에서 유지시키는데 충분한 활성을 갖는다. 또다른 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 변형된 PAL은 kcat이 약 0.1 s-1 이상 또는 약 0.5 s-1 초과이다. 일부 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 변형된 PAL은 kcat이 약 0.2 s-1 이상 또는 약 1.0 s-1 초과이다. 또다른 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 변형된 PAL은 Km이 약 10 μM 내지 약 1000 μM이다. 또다른 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 변형된 PAL은 Km이 약 100 μM 내지 약 1000 μM이다. 또다른 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 변형된 PAL은 야생형의 활성보다 약 2배 내지 약 1000배 더 큰 효소 활성을 나타낸다. 또다른 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 변형된 PAL는 야생형의 활성보다 약 10％ 내지 100％ 더 높은 효소 활성을 나타낸다. 당업계에 주지된 방법을 사용하여, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발에 의해 이같은 생물학적으로 활성인 변형된 PAL 단백질이 형성될 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 페닐알라닌을 대사하는 (즉, 페닐알라닌을 또다른 물질로 전환시키는) 박테리아 PAL의 포유동물, 특히 인간에서의 PAH 활성 결핍의 치료를 위한 의약의 제조에서의 용도, 뿐만 아니라 PAH 활성 결핍을 치료하는데 사용하기 위한 박테리아 PAL을 함유하는 제약 조성물이 본 발명에서 구현된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 고도로 정제된, 박테리아로부터 유래된 PAL, 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체 또는 유사체를 단독으로 또는 제약상 허용되는 담체와 함께 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 박테리아 PAL을 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 99.2％, 99.5％, 99.6％, 99.7％, 99.8％, 또는 99.9％를 초과하는 순도로 함유한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 박테리아 PAL의 상대적인 비 활성은 야생형 PAL의 비 활성의 약 110％를 초과한다.

두번째 양상에서, 본 발명은 치료적 및 산업적 목적을 위해 PAL 조성물을 사용하는 신규 방법을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, PAH 활성 결핍에 의해 전적으로 또는 부분적으로 야기되는 장애의 치료를 필요로 하는 대상에게 박테리아 PAL을 포함하는 제약 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, PAH 활성 결핍에 의해 전적으로 또는 부분적으로 야기되는 장애의 치료 방법이 본 발명에서 구현된다. PAH 활성 결핍은, 예를 들어, PAH 활성의 정상 수준과 비교하여 50％ 이하, 25％ 이하, 또는 10％ 이하 또는 1％ 이하인 활성 수준으로 관찰될 수 있고, 예를 들어, 고페닐알라닌혈증, 경미한 페닐케톤뇨증 또는 고전적인 중증 페닐케톤뇨증에서와 같이, 상승된 페닐알라닌 수준으로 나타날 수 있다. 일부 실시양태에서, 질환은 페닐케톤뇨증 (PKU)이다.

특정 실시양태에서, 대상은 돌연변이체 페닐알라닌 히드록실라제 (PAH)가 있는 것으로 진단된 개체이다. 돌연변이체 PAH는 PAH의 촉매 도메인에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예시적인 이같은 돌연변이는 돌연변이 F39L, L48S, I65T, R68S, A104D, S110C, D129G, E178G, V190A, P211T, R241C, R261Q, A300S, L308F, A313T, K320N, A373T, V388M, E390G, A395P, P407S, 및 Y414C를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

대상의 혈장 페닐알라닌 농도의 감소를 일으키는데 효과적인 양의 박테리아 PAL 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈장 페닐알라닌의 농도가 정상을 초과하는 (예를 들어, 180 μM 또는 360 μM을 초과하는) 대상을 치료하는 방법이 또한 구현된다. 박테리아 PAL의 투여 전에 대상은 혈장 페닐알라닌 농도가 180 μM를 초과할 것이다. 더욱 특히, 대상의 혈장 페닐알라닌 농도는 120 μM 내지 200 μM이다. 또다른 실시양태에서, 대상의 혈장 페닐알라닌 농도는 200 μM 내지 600 μM이다. 또다른 실시양태에서, 대상의 혈장 페닐알라닌 농도는 600 μM 내지 1200 μM이다. 또다른 부류의 치료될 대상은 제한되지 않은 혈장 페닐알라닌 농도가 1200 μM를 초과한다.

특정 실시양태에서, 대상은 유아, 더욱 특히 혈장 페닐알라닌 농도가 1200 μM을 초과하는 유아이다. 박테리아 PAL 조성물을 유아의 혈장 페닐알라닌 농도의 감소를 일으키는데 효과적인 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 이때 유아는 0세 내지 3세이고, 유아의 혈장 페닐알라닌 농도는 약 360 μM 내지 약 4800 μM인, 페닐케톤뇨증에 걸린 유아의 치료 방법이 본 발명에서 구현된다. 박테리아 PAL의 투여 전에, 유아의 페닐알라닌 농도는 약 1200 μM이고, 박테리아 PAL의 투여는 혈장 페닐알라닌 농도를 약 1000 μM로 감소시킨다. 또다른 실시양태에서, 박테리아 PAL의 투여 전에, 유아의 페닐알라닌 농도는 약 800 μM이고, PAL의 투여는 혈장 페닐알라닌 농도를 약 600 μM로 감소시킨다. 추가적인 실시양태에서, PAL의 투여 전에, 유아의 페닐알라닌 농도는 약 400 μM이고, PAL의 투여는 혈장 페닐알라닌 농도를 약 300 μM로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에서 구현된 치료 방법은 유아의 혈장 페닐알라닌 농도를 약 120 μM 내지 약 360 μM의 범위 또는 약 120 μM 내지 약 240 μM의 범위로 감소시켜야 한다.

대상에게 박테리아 PAL을 단독으로 또는 단백질-제한 식이와 함께 투여하는 단계를 포함하며, 이때 박테리아 PAL의 단독 투여 또는 단백질-제한 식이와의 조합 투여가 조합 투여의 부재시 농도에 비해 대상의 혈장에서 페닐알라닌 농도를 저하시키는데 효과적인, 고페닐알라닌혈증 (HPA)이 있는 임산부를 치료하는 방법이 본원에서 또한 구현된다. 특정 실시양태에서, 대상은 제한되지 않은 혈장 페닐알라닌 농도가 180 μM 초과, 600 μM 미만이다. 또다른 실시양태에서, 대상은 제한되지 않은 혈장 페닐알라닌 농도가 500 μM 초과, 1200 μM 미만이다. 또다른 실시양태에서, 대상은 제한되지 않은 혈장 페닐알라닌 농도가 1200 μM을 초과한다. 혈장 페닐알라닌 농도가 1200 μM을 초과하는 임산부 대상이 이러한 유형의 치료법에 대한 특히 흥미로운 후보이고, 또한 임신을 계획하고 있는 가임 연령의 여성인 대상이 또한 그러하다. 대상의 혈장 페닐알라닌 농도가 1200 μM을 초과하는 실시양태들에서, 방법은 대상에게 단백질-제한 식이를 투여하는 단계를 더 포함한다.

본 발명은 박테리아 PAL 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유사체를 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 이때 박테리아 PAL의 투여는 박테리아 PAL 투여의 부재시 농도에 비해 대상의 혈장에서 페닐알라닌 농도를 저하시키는데 효과적인, 대상에서 고전적인 중증 페닐케톤뇨증 (PKU)을 치료하는 방법을 기술한다. 본 발명의 방법에 따른 치료를 위해 선택되는 대상은 혈장 Phe 농도가 상승되었을 것이고, 이같은 농도는 치료제의 부재 시에 1800 μM을 초과할 수 있다. 치료 요법의 부재 시에 혈장 페닐알라닌 농도가 1000 μM을 초과하는 대상이 또다른 실시양태에서 구현된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조합 투여 방법은 대상의 혈장 페닐알라닌 농도를 600 μM 미만으로 감소시킨다. 한 실시양태에서, 농도가 500 μM 미만으로 감소된다. 또다른 실시양태에서, 조합 투여는 대상의 혈장 페닐알라닌 농도를 약 120 μM 내지 약 360 μM 범위로 감소시킨다. 또다른 실시양태에서, 대상의 혈장 페닐알라닌 농도가 120 μM 내지 약 240 μM의 범위로 감소된다.

특정 실시양태들은 질환 증상을 효과적으로 경감시키기 위해, 치료될 생물, 예를 들어, 포유동물 또는 인간의 요구에 투여량을 최적화하는 단계를 포함한다. PAL은 1일 1회 용량으로, 매일 다중 용량으로, 매주 1회 용량으로 또는 매주 다중 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, PAL 치료법은 연속적이지 않고, 대상의 혈장 페닐알라닌 농도가 360 μM 미만으로 감소될 때까지 PAL이 매일 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상의 혈장 페닐알라닌 농도가 매일 모니터링되고, 혈장 페닐알라닌 농도에서의 10％ 증가가 관찰되는 경우에 PAL이 투여된다. 또다른 실시양태에서, 일주일에 한번씩 용량이 전달된다. 주 당 적어도 0.001 ㎎/㎏, 0.005 ㎎/㎏, 0.01 ㎎/㎏, 0.05 ㎎/㎏의 용량이 본 발명에서 구현되고, 이는 0.1 ㎎/㎏, 0.5 ㎎/㎏, 1.0 ㎎/㎏ 또는 그 이상까지의 범위에 이를 수 있다. 일부 실시양태에서, 용량은 1 ㎎/㎏/주, 0.1 ㎎/㎏/주, 또는 0.01 ㎎/㎏/주이다.

구강, 경피, 경점막, 폐내 (에어로졸화 포함), 근육내, 피하, 또는 정맥내 경로가 포함되는, 등가의 투여량을 전달하는 다양한 경구 또는 비경구 투여 경로가 구현된다. 관절 또는 CSF 내로의 직접적인 볼루스(bolus) 주사 또는 주입에 의한 투여 예컨대 경막내 투여, 뇌내 투여, 뇌실내 투여, 요추천자를 통한 투여 또는 뇌의 대조를 통한 투여가 또한 명확하게 구현된다. 일부 실시양태에서, 용량이 피하로 또는 구강으로 전달된다.

유전자 요법이 포함되는, 인간 대상에서 PAL 활성을 증가시키는 또다른 수단이 또한 구현된다. 바이러스 벡터, 상동 재조합 또는 직접적인 DNA 주입이 포함되는 당업계에 공지된 다양한 수단을 통해 PAL 유전자의 전달이 가능하다. 이러한 양상의 범주 내에는 PAH 결핍증에 걸린 세포 내로 생체 내에서 투여될 수 있는, 박테리아 PAL 또는 이의 생물학적으로 활성인 돌연변이체 또는 유사체 전체 또는 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 특징으로 하는 실시양태가 있다.

또다른 실시양태에서, 박테리아 PAL은 단백질-제한 식이와 조합되어 또한 투여될 수 있다. 본원의 방법에서 투여되는 단백질-제한 식이는 대상의 총 페닐알라닌 섭취가 600 ㎎/일 미만으로 제한되는 페닐알라닌-제한 식이이다. 또다른 실시양태에서, 단백질-제한 식이는 총 페닐알라닌이 300 ㎎/일 미만으로 제한되는 페닐알라닌-제한 식이이다. 또다른 실시양태에서, 단백질-제한 식이는 타이로신, 발린, 이소류신 및 류신과 같은 아미노산들이 보충된 식이이다. 박테리아 PAL 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물이 또한 구현된다. 조성물은 의료용 단백질 보충물을 더 포함할 수 있다. 또다른 실시양태에서, PAL 조성물은 유아용 조제식의 일부분이다. 또다른 실시양태에서, 단백질 보충물에는 페닐알라닌이 없다. 단백질 보충물이 L-타이로신, L-글루타민, 보충물 100 g 당 20 mg 농도의 L-카르니틴, 보충물 100 g 당 40 mg 농도의 L-타우린, 및 셀레늄으로 강화될 수 있다. 이는 일일 권장 용량의 미네랄, 예를 들어, 칼슘, 인 및 마그네슘을 더 포함할 수 있다. 보충물은 일일 권장 용량의, L-류신, L-프롤린, L-라이신 아세테이트, L-발린, L-이소류신, L-아르기닌, L-알라닌, 글리신, L-아스파라긴 모노하이드레이트, L-트립토판, L-세린, L-트레오닌, L-히스티딘, L-메티오닌, L-글루탐산, 및 L-아스파르트산으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 더 포함할 수 있다. 또한, 보충물이 일일 권장 용량의 비타민 A, D 및 E로 강화될 수 있다. 보충물은 보충물의 에너지의 40％ 이상을 제공하는 지방 함량을 포함할 수 있다. 이같은 보충물은 분말 보충물의 형태로 또는 단백질 바(bar)의 형태로 제공될 수 있다.

림프모구성 백혈병, 유방 종양, 및 흑색종을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 형태의 신생물성 성장 및 암을 치료하는 방법이 본 발명에서 구현된다.

암모니아 및 트랜스-신나메이트로부터의 페닐알라닌의 상업적인 생산을 위해 박테리아 PAL을 사용하는 방법이 본 발명에서 구현된다. 페닐알라닌은 감미료인 아스파테임, 및 음료, 시리얼, 케이크, 디저트, 계란 및 치즈 요리, 지방, 오일, 어류 및 기타 해산물, 고기 및 육류 제품, 밀크 및 유제품, 견과류, 소스 및 양념, 수프, 설탕, 잼 및 스프레드, 및 채소가 포함되는 기타 식품에서 사용된다.

박테리아 PAL이 엔테로신 및 에리트로마이신이 포함되는 제초제 및 항균제의 생산에 사용될 수 있다는 것이 추가로 구현된다.

세번째 양상에서, 본 발명은 효소를 치료적으로 사용할 수 있게 하는 양으로 원핵생물 PAL 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유사체를 생산하는 방법을 특징으로 한다. 스트렙토마이세스(Streptomyces), 소란기움(Sorangium), 슈도모나스(Pseudomonas), 및 시아노박테리아 예컨대 노스톡 및 아나바에나를 포함하지만 이에 한정되지 않는 박테리아에 의해 생산된 PAL이 본 발명에서 구현된다. 일부 실시양태에서, 스트렙토마이세스 마리티무스, 스트렙토마이세스 베르티실라투스, 소가리움 셀룰로숨(Soragium cellulosum), 노스톡 푼크티포르메, 노스톡 토바쿰(Nostoc tobacum), 아나바에나 바리아빌리스, 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 박테리아 종에 의해 PAL이 생산된다. 또다른 실시양태에서, HAL 활성을 코딩하거나 PAL-HAL 모티프를 특징으로 하지만, HAL과 상이한 주요 PAL 잔기를 보유하는 것으로 때때로 기술되는 서열로부터 유래되는 cDNA 또는 DNA 서열을 사용하여 원핵생물 PAL 효소 활성이 생성된다.

광범위한 실시양태에서, 상기 방법은 원핵생물 PAL 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유사체 전체 또는 일부분을 코딩하는 cDNA 또는 DNA를 이의 발현에 적절한 세포 내로 형질전환시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA를 이의 발현을 위한 적절한 세포 또는 세포주 내로 형질전환시키기 위해 발현 벡터가 사용된다. 한 실시양태에서, cDNA가 대장균 내로 형질전환되고, 재조합 박테리아 PAL이 융합 단백질로서 과잉생산된다. 추가적인 실시양태에서, 원핵생물 PAL의 생산 방법은 (a) 원핵생물 PAL 전체 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체, 단편 또는 돌연변이체를 코딩하는 cDNA로 형질전환된 세포를 적절한 성장 배지 내에서 적합한 밀도로 성장시켜, 종자 배양물을 생산하는 단계, (b) 형질전환된 세포를 생물반응장치 내로 도입하는 단계, (c) 적절한 성장 배지를 생물반응장치에 공급하는 단계, 및 (d) 형질감염된 세포를 효소를 함유하는 배지로부터 분리하는 단계를 포함한다.

한 실시양태에서, 유도성 프로모터 예컨대 IPTG (이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드)를 사용하여 벡터 예컨대 대장균 BL21(DE3)/pLyseS (Invitrogen)에서 N-말단 옥타히스티딜 태그(tag)가 있는 융합 단백질로서 재조합 PAL이 과잉-생산된다. 또다른 실시양태에서, 대장균 BL21(DE3)/pLysS 세포에서 N-말단 태그 없이 재조합 PAL이 과잉-생산된다. 또다른 실시양태에서, 원핵생물 PAL의 생산 방법은 (1) 진탕 플라스크 내에서 글리세롤 스톡(stock)으로부터 생물반응장치/발효기용 종자 배양물을 성장시키는 단계; (2) 이같은 종자 배양물을 페드-뱃치(fed-batch) 방식으로 제어형 생물반응장치 내로 도입하는 단계; (3) 70-100의 OD600의 세포 밀도에 도달할 때까지 (약 22-25시간), 상기 배양물을 글루코스-보충 배지 (pH 7.8), 20％ 초과의 용해 산소, 1200 rpm 이하의 진탕, 30℃에서 성장시키는 단계; (4) 상기 배양물을 0.4 mM IPTG로 유도하는 단계; (5) 활성 변화가 0.1 IU/㎖ 미만일 때까지 (대략 40-48시간 및 전형적으로 200의 OD600), 상기 배양물을 22 내지 26℃의 감소된 온도에서 성장시키는 단계; 및 (5) 연속 원심분리에 의해 박테리아를 회수하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 전형적으로 규정 배지이고, 효모 추출물 단백질, 펩톤-트리톤, 글루코스, 글리세롤, 카사미노산, 미량 염 및 포스페이트 완충 염으로 구성된다.

4번째 양상에서, 본 발명은 박테리아 PAL 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체 또는 유사체의 정제 방법을 특징으로 한다. 첫번째 실시양태에 따르면, 형질전환된 세포 덩어리를 성장시키고, 파열시켜 미정제 재조합 효소를 남긴다. 일반적으로 미정제 벌크(bulk)로부터 외인성 물질을 제거하여, 컬럼이 막히는 것을 방지한다. 1개 또는 여러개의 크로마토그래피 수지를 사용하여 크로마토그래피 정제를 수행한다. 이어서, 정제된 단백질을 장기간에 걸친 안정적인 활성을 제공하도록 디자인된 완충제 내로 제형화한다. 또다른 실시양태에서, 박테리아 PAL의 정제 방법은 (a) 재조합 PAL을 함유하는 박테리아를 용해시키는 단계; (b) 용해물을 열로 처리하여 바이러스를 불활성화시키는 단계; (c) 이러한 용해물을 제2의 연속적인 원심분리 단계 및/또는 다층 여과(depth filtration)를 사용하여 정화하는 단계; (d) 정화된 용해물을 목탄 여과 단계에 통과시키는 단계; (e) (d)에서의 여과액을 최종 여과 단계 (예컨대 Sartorious의 Sartopore 0.2 ㎛ 필터로의 여과)에 통과시키는 단계; (f) 최종 여과액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지, 예컨대 부틸 소수성 상호작용 크로마토그래피에 통과시키는 단계; (g) (f)의 용출물을 음이온성 크로마토그래피 수지, 예컨대 Q 이온 교환 컬럼에 통과시키는 단계; (h) 접선형 유동 여과로의 완충제 교환에 의해 최종 생성물을 회수하는 단계; 및 (i) 최종 생성물을 멸균하는 단계를 포함한다. 당업자는 크로마토그래피 단계들 중 하나 이상이 생략 또는 치환될 수 있거나, 또는 크로마토그래피 단계들의 순서가 본 발명의 범주 내에서 변화될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 마지막으로, 원한다면 적합한 멸균 단계들을 수행할 수 있다.

다섯번째 양상에서, 상승된 수준의 페닐알라닌을 함유하는 세포를 박테리아 PAL과 접촉시키고, 박테리아 PAL이 이같은 상승된 수준의 페닐알라닌을 감소시키는지 여부를 결정함으로써, 페닐알라닌의 수준 증강을 예방하거나, 경감시키거나 치료할 수 있는 박테리아 PAL을 확인하기 위한 스크리닝 분석법이 본 발명에서 구현된다. 이같은 스크리닝 분석법은 활성 부위, 예를 들어, 스트렙토마이세스 마리티무스로부터의 EncP에서의 Gly 142, Thr-Ser-Gly 트라이애드 (143-145), Asp 146, Leu 147, Asn 196, Ile 195, Leu 192, Leu 76, Asn 79, Met 400, Thr 428, Gln 432 (로도스포리디움 토룰로이데스로부터의 PAL에서의 잔기 Ser 210, Ala-Ser-Gly 트라이애드 (211-213), Asp214, Leu 215, Asn270, Val269, Leu266, Leu 134, His 137, Lys468, Glu496, Gln 500과 등가임)에서, 활성 부위에 인접한 영역에서, 또는 폴리펩티드 서열 전반에 걸쳐 보존적 또는 비-보존적 치환을 포함하는 변이체를 생성시키는 단계에 이어서 시험관내 페닐알라닌 전환 활성에 대해 변이체들을 테스트하는 단계를 또한 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 고처리량 분석법이다. 한 실시양태에서, 박테리아 종의 완전한 게놈이 서열분석되고, 생물정보학(bioinformatics) 접근법을 사용하여 PAL 상동체의 존재에 대해 스크리닝된다. 또다른 실시양태에서, 예컨대 시험관내에서 페닐알라닌을 트랜스-신나메이트로 전환시키는 능력을 테스트함으로써, 이같은 상동체의 단백질 생성물의 PAL 촉매 활성이 확인된다.

여섯번째 양상에서, 본 발명은 PAH 활성 결핍에 의해 전적으로 또는 부분적으로 야기되는 장애를 포함하지만 이에 한정되지 않는 질환의 진단을 위해 박테리아 PAL 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 박테리아 PAL이 혈액 샘플 내의 페닐알라닌의 수준을 측정하기 위해 사용된다. 추가적인 실시양태에서, 페닐알라닌 수준이 상승된 대상의 혈액 샘플을 모니터링하는 것에서 사용하기 위한, 박테리아 PAL을 포함하는 진단 키트가 본 발명에서 구현된다.

본 발명의 기타 특징 및 장점들이 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적인 예들은, 본 발명의 특정 실시양태들을 가리키지는 하지만, 본 발명의 취지 및 범주 내의 다양한 변화 및 변형이 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이기 때문에 단지 예시의 목적으로만 제공된다는 것을 이해하여야 한다.

도 1. 도 1A: 노스톡 푼크티포르메 PAL의 유전자 서열 (서열 1); 도 1B: 노스톡 푼크티포르메 PAL의 단백질 서열 (서열 2).
도 2. 도 2A: 아나바에나 바리아빌리스 PAL의 유전자 서열 (서열 3); 도 2B: 아나바에나 바리아빌리스 도 7PAL의 단백질 서열 (서열 4).
도 3. 원핵생물 및 진핵생물로부터의 방향족 아미노산 암모니아-리아제들의 관련성 수형도. 서열들은 GenBank로부터 회수되었고 (접속 번호가 괄호 안에 제공됨), 이웃 연결 방법(Neighbor Joining Method)을 사용하여 ClustalX (1.83)로 정렬되었다.
도 4. 노스톡 푼크티포르메 PAL (서열 2) 및 아나바에나 바리아빌리스 PAL (서열 4)과 EncP PAL (서열 5) 및 슈도모나스 푸티다 HAL (서열 6)의 시아노박테리아 단백질의 서열 정렬. PAL 또는 HAL 활성에 상응하는 활성 부위 잔기들이 강조된다.
도 5. 12일 기간에 걸친 페닐알라닌 수준 (μM)에 대한 (A) 비-PEG화 NpPAL (1.0 IU/㎖) 및 (B) PEG화 NpPAL 1:3 PAL:PEG (Nippon Oil and Fat, NOF Corporation) (1.0 IU/㎖)의 효과.
도 6. 12일 기간에 걸친 페닐알라닌 수준 (μM)에 대한 (A) 비-PEG화 AvPAL (1.0 IU/㎖) 및 (B) PEG화 AvPAL 1:3 PAL:PEG (Nippon Oil and Fat, NOF Corporation) (1.0 IU/㎖)의 효과.
도 7. 90일의 장기 내성 연구에서의 페닐알라닌 수준 (μM)에 대한 PEG화 NpPAL 1:3 PAL:PEG (Nippon Oil and Fat, NOF Corporation) (1.0 IU/㎖)의 효과.
도 8. 도 8A: 위치 64에서 시스테인이 세린으로 치환된 아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아-리아제 (PAL)의 단백질 서열 (AvPAL_C64S, 서열 7); 도 8B: 위치 318에서 시스테인이 세린으로 치환된 아나바에나 바리아빌리스 PAL의 단백질 서열 (AvPAL_C318S, 서열 8); 도 8C: 위치 503에서 시스테인이 세린으로 치환된 아나바에나 바리아빌리스 PAL의 단백질 서열 (AvPAL_C503S, 서열 9); 도 8D: 565에서 시스테인이 세린으로 치환된 아나바에나 바리아빌리스 PAL의 단백질 서열 (AvPAL_C565S, 서열 10); 도 8E: 위치 503 및 565에서 시스테인이 세린으로 치환된 아나바에나 바리아빌리스 PAL의 단백질 서열 (AvPAL_C565SC503S, 서열 11). 시스테인 → 세린 치환에 볼드체로 밑줄이 그어진다.
도 9. 도 9A: 다양한 길이의 시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후의 시험관내 PAL 비 효소 활성에 대한 비-PEG화 AvPAL의 위치 565 또는 위치 565 및 503에서의 시스테인 → 세린 치환의 효과. 도 9B: 다양한 길이의 시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후의 시험관내 PAL 비 효소 활성에 대한 PEG화 AvPAL의 위치 565 또는 위치 565 및 503에서의 시스테인 → 세린 치환의 효과.
도 10. 도 10A: 변성 조건 (왼쪽 패널) 또는 천연 조건 (오른쪽 패널) 하에서의 젤 전기영동에 의해 분석된, 용액 내에서의 단백질 응집물의 형성에 대한 AvPAL에서의 시스테인 → 세린 치환의 효과. 도 10B: SEC-HPLC에 의해 분석된, 용액 내에서의 단백질 응집물의 형성에 대한 AvPAL에서의 시스테인 → 세린 치환의 효과.
도 11. 다양한 PEG 농도에서의 부위-특이적 PEG화에 대한 AvPAL에서의 위치 565 및 503에서의 시스테인 → 세린 치환 (이중 돌연변이체)의 효과.
도 12. SEC-HPLC에 의해 분석된, 용액 내에서의 단백질 응집물의 형성에 대한 0.05％ 트윈(Tween)80 또는 10 mM EDTA로의 AvPAL 처리의 효과.
도 13. 도 13A: SEC-HPLC에 의해 분석된, 용액 내에서의 단백질 응집물의 형성에 대한 디티오트레이톨 (DTT)에 의한 AvPAL 처리의 효과. 도 13B: SEC-HPLC에 의해 분석된, 용액 내에서의 단백질 응집물의 형성에 대한 DTT 및 N-에틸말레이미드 (NEM)에 의한 AvPAL 처리의 효과.
도 14. 비히클 또는 4.0 IU 야생형 PEG화 AvPAL이 투약된 ENU2 마우스와 비교된, 0.25 IU (위쪽 패널), 1.0 IU (중간 패널) 또는 4.0 IU (아래쪽 패널) 효소가 투약된 ENU2 마우스의 생체내 페닐알라닌 (Phe) 수준에 대한 PEG화 AvPAL에서의 위치 565 및 503에서의 시스테인 → 세린 치환 (AvPAL_C565SC503S)의 효과.
도 15. 비히클 또는 4.0 IU 야생형 PEG화 AvPAL이 투약된 ENU2 마우스와 비교된, 0.25 IU, 1.0 IU 또는 4.0 IU 효소가 투약된 ENU2 마우스의 체중에 대한 PEG화 AvPAL에서의 위치 565 및 503에서의 시스테인 → 세린 치환 (AvPAL_C565SC503S)의 효과.
도 16. 비히클 또는 AvPAL:PEG 비율 1:3의 4.0 IU 야생형 PEG화 AvPAL이 투약된 ENU2 마우스와 비교된, 1:1.6 (위쪽 패널), 1:2.4 (중간 패널) 또는 1:3 (아래쪽 패널)의 다양한 AvPAL:PEG 비율의 4.0 IU 효소가 투약된 ENU2 마우스의 생체내 페닐알라닌 (Phe) 수준에 대한 PEG화 AvPAL에서의 위치 565 및 503에서의 시스테인 → 세린 치환 (AvPAL_C503S/565S)의 효과.
도 17. 비히클 또는 AvPAL:PEG 비율 1:3의 4.0 IU 야생형 PEG화 AvPAL이 투약된 ENU2 마우스와 비교된, 1:1.6, 1:2.4 또는 1:3의 다양한 AvPAL:PEG 비율의 4 IU 효소가 투약된 ENU2 마우스의 체중에 대한 PEG화 AvPAL에서의 위치 565 및 503에서의 시스테인 → 세린 치환 (AvPAL_C565SC503S)의 효과.
도 18. 시험관내 AvPAL 비 활성에 대한 PEG화 AvPAL_C565SC503S의 재-PEG화의 효과. (위쪽) PAL:PEG 비율 1:3 (2 mM 라이신 잔기:6 mM PEG, 흑색 원)에서의 1차 PEG화 후, 지시된 바와 같은 다양한 PAL:PEG 비율 및 라이신 잔기 및 PEG 분자의 농도 하에서 재-PEG화된 rAvPAL-PEG의 비 활성의 회복. (아래쪽) PAL:PEG 비율 1:1 (2 mM 라이신 잔기:2 mM PEG, 흑색 사각형), 또는 1:3 (2 mM 라이신 잔기:6 mM PEG, 흑색 원)에서의 1차 PEG화 후, 지시된 바와 같은 다양한 PAL:PEG 비율 및 라이신 잔기 및 PEG 분자의 농도에서 재-PEG화된 rAvPAL-PEG의 비 활성의 회복.
도 19. 도 19A: 모세관 젤 전기영동 (CGE) 분석에 의해 결정된, rAVPAL-PEG의 전체적인 PEG화에 대한, 재-PEG화 반응에서 PAL:PEG 비율을 증가시키는 것의 효과 (PAL:PEG 비율 1:3 (2 mM 라이신 잔기:6 mM PEG)에서 1차 PEG화됨). 도 19B: CGE 분석에 의해 결정된, rAVPAL-PEG의 전체적인 PEG화에 대한, 제1 PEG화 반응에서 PAL:PEG 비율을 증가시키는 것의 효과 (재-PEG화 반응은 1:3 (2 mM 라이신 잔기:6 mM PEG)의 고정된 PAL:PEG 비율에서 수행됨).
도 20. 지시된 바와 같은 다양한 PAL:PEG 비율 및 라이신 잔기 및 PEG 분자의 농도 하에서의 재-PEG화 후 AvPAL 내의 특정 라이신 잔기의 PEG화 백분율에 대한, PAL:PEG 비율 1:3 (2 mM 라이신 잔기:6 mM PEG)에서 1차 PEG화된 AvPAL_C565SC503S의 재-PEG화의 효과. 위치 2의 라이신 잔기 (K2)는 테스트된 모든 조건 하에 100％ PEG화된다 (제시되지 않음).
도 21. 표 14에 지시된 바와 같이 피하 투약된 ENU2 마우스의 생체내 혈장 페닐알라닌 (Phe) 수준에 대한, PAL:PEG 비율 1:3 (2 mM 라이신 잔기:6 mM PEG)에서 1차 PEG화되고, 동일한 PAL:PEG 비율 및 라이신 잔기 및 PEG 분자의 농도 하에서 재-PEG화된 AvPAL_C565SC503S의 재-PEG화의 효과.

PAL이 페닐프로파노이드 대사물로의 결정(committed) 단계에서 페닐알라닌의 신남산으로의 비-산화적 탈아미노화를 촉매하는 편재성 고등 식물 효소이긴 하지만 ([Hahlbrock, et al., Annu. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 40:347-369 (1989)]), PAL은 소수의 박테리아에서만 나타났고, 이때 PAL은 "스트렙토마이세스 마리티무스" ([Xiang, et al., J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)]) 및 소란지움 셀룰로숨(Sorangium cellulosum) ([Hill, et al., Chem. Commun. 1358-1359 (2003)])에서의 벤조일-CoA 생합성 및 스트렙토마이세스 베르티실라투스에서의 신남아미드의 생합성 ([Bezanson, et al., Can. J. Microbiol. 16:147-151 (1970)])에서 수반된다. 정균제 엔테로신은 해양 박테리아 "스트렙토마이세스 마리티무스"의 천연 생성물이고, 이의 생합성은 다수의 일상적이지 않은 양상들을 수반한다 ([Hertweck, et al., Chem. Biol. 11:461-468 (2004)]; [Piel, et al., Chem. Biol. 7:943-955 (2000)]; [Piel, et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5415-5416 (2000)]; [Xiang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:15609-15614 (2004)]). 이들 중 하나는 희귀한 폴리케타이드 신타제(synthase) (PKS) 시작물 유닛(unit) 벤조일-조효소 A (CoA)의 형성이다 ([Moore, et al., Nat. Prod. Rep. 19:70-99 (2002)]). 초기의 생화학적 반응은 신규 박테리아 페닐알라닌 암모니아-리아제 (PAL, EC 4.3.1.5) EncP에 의한 아미노산 L-페닐알라닌의 트랜스-신남산으로의 전환을 수반한다 ([Xiang, et al., J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)]). 신남산의 이의 CoA 티오에스테르로의 활성화에 이은 단일 라운드의 베타-산화로 벤조일-CoA가 산출되고 ([Hertweck, et al., Chem Bio Chem 2:784-786 (2001)]; [Hertweck, et al., Tetrahedron 56:9115-9120 (2000)]; [Xiang, et al., J. Bacterid. 185:399-404 (2003)]), 이는 엔테로신 제II형 PKS를 말로닐-CoA 분자 7개로의 사슬 연장에 대해 프라이밍(priming)시킨다.

"스트렙토마이세스 마리티무스"에서 첫번째 원핵생물 PAL-코딩 유전자 (encP) (서열 5)가 특성화되었고, 이의 불활성화는 디노보(de novo) 신남산 및 엔테로신 합성의 폐지를 초래하였다 ([Kalaitzis, et al., J. Am. Chem. Soc. 125:9290-9291 (2003)]; [Xiang, et al., J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)]). encP-불활성화 돌연변이체에서 신남산 또는 벤조산의 보충, 뿐만 아니라 플라스미드가 보유하는 encP로의 보완을 통해 엔테로신 생합성이 복구될 수 있다. 또한, 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor)에서의 ermE* 프로모터의 제어 하의 encP 유전자의 이종성 발현으로 발효 배지에서 신남산이 생산되었다 ([Xiang, et al., J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002)]). encP 유전자는 거의 200개의 아미노산 잔기 만큼 원핵생물 PAL보다 상당히 작은 아미노산 522개의 단백질을 코딩한다. 페트로셀리눔 크리스품(Petroselinum crispum)으로부터의 것 ([Rother, et al., Eur. J. Biochem. 269:3065-3075 (2002)]) (CAA57056, 30％ 동일 및 48％ 유사)과 같은 식물 PAL과 유사한 서열에도 불구하고, 이는 슈도모나스 푸티다로부터의 것 ([Schwede, et al., Biochemistry 27:5355-5361 (1999)]) (A35251, 36％ 동일 및 54％ 유사, 서열 6, 도 4)과 같은 박테리아 히스티딘 암모니아-리아제 (HAL, EC 4.3.1.3) 및 로도박테르 캅술라투스(Rhodobacter capsulatus)로부터의 타이로신 암모니아-리아제 (TAL) ([Kyndt, et al., FEBS Lett. 512:240-244 (2002)])에 대해 더 큰 상동성을 공유한다 (도 3). 상동성은 4-메틸리덴이미다졸-5-온 (MIO) 보결분자단(prosthetic group) 내의 변형된 데히드로알라닌 잔기의 가능한 전구물질인, 페닐알라닌/히스티딘/타이로신 패밀리의 암모니아-리아제의 위치 143에서의 보존된 활성 부위 세린 잔기이다 ([Langer, et al., Adv. Prot. Chem. 58:175-188 (2001)]; [Poppe, Curr. Opin. Chem. Biol. 5:512-524 (2001)]; [Schwede, et al., Biochemistry 27:5355-5361 (1999)]). EncP는 판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans)에서의 안드리미드 생합성에서 수반되는 추정 페닐알라닌 아미노뮤타제(aminomutase)인 AdmH (AAO39102, 63％ 동일 및 76％ 유사)에 대해 가장 큰 서열 상동성을 공유하고, 이는 스트렙토마이스세스 글로비스포루스(Streptomyces globisporus)로부터의 타이로신 아미노뮤타제 Sgc4에 관련된다 ([Christenson, et al., J. Am. Chem. Soc. 125:6062-6063 (2003)]; [Christenson, et al., Biochemistry 42:12708-12718 (2003)]). 특히, encP에는 인간 단백질 (HAL)에 대한 더 가까운 상동성이 있기 때문에, encP는 잠재적으로 덜 면역원성일 수 있다. 또한, 이들이 매우 유사하기 때문에, encP를 encP의 인간화 버젼인 인간 HAL처럼 보이도록 돌연변이시키는 것이 가능할 수 있다.

HAL 및 PAL은 화학적으로 어려운, 각각 히스티딘 및 페닐알라닌으로부터 암모니아를 제거하기 위한 메커니즘을 공통으로 공유하는 것으로 나타났다. 양쪽 효소와 함께, 초-친전자성(superelectrophilic) 보결분자단 5 메틸렌-3,5-디히드로이미다졸-4-온 (MIO)이 방향족 고리에서의 프리델-크라프츠(Friedel-Crafts) 유형 공격에 의해 각각의 기질의 비-산성 베타 수소 원자를 활성화시킨다. 생성된 시그마 복합체는 모든 염기가 효소의 결합 주머니에 접근하지 못하게 함으로써 고리로부터의 양성자의 추출을 방지한다. 고리밖(exocyclic) 이중 결합의 형성이 암모니아의 제거, 재-방향족화 및 단편화에서의 관문이다. MIO 보결분자단이 재생성되고, 생성물 유로카네이트 또는 신나메이트가 형성된다 ([Poppe, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 44:3668-3688 (2005)]).

HAL과 PAL 간의 높은 상동성으로 인해, HAL 및 PAL의 보존 영역은 HAL/PAL 보존 영역으로 지칭된다. 이러한 높은 상동성은 "PAL-HAL" 단백질의 잠재적인 효소 활성에 대해 NCBI와 같은 데이터베이스 내에 약간의 모호함을 일으켜, 잘못된 표지화, 예컨대 노스톡 푼크티포르메 및 아나바에나 바리아빌리스에 대한 NCBI 데이터베이스에 열거된 단백질 서열의 잘못된 표지화에 이를 수 있다. 따라서, 일부 PAL 효소는 잘못 표지된 HAL 효소일 수 있다. PAL 및 HAL의 활성 부위가 매우 유사하기는 하지만, 일부 주요 잔기에서는 상이한 것으로 예측된다 ([Calabrese et al., Biochemistry 43(36):11403-11416 (2004)]; [Xiang et al., (2002) 동일 문헌]; [Williams et al., (2005) 동일 문헌]). 특히 HAL에서, 슈도모나스 푸티다 (서열 6)로부터의 메티오닌 382 및 글루타민 414가 모든 HAL에서 고도로 보존되지만, 지금까지 기술된 모든 PAL (진핵생물 또는 원핵생물)에서는 각각 라이신 및 글루타민으로 항상 교체된다 (도 4). 따라서, "PAL-HAL" 영역이 있고 라이신382 및 글루타민414의 상동체가 있는 모든 단백질은 PAL 활성이 있는 단백질의 서열 서명이 있는 것으로 말할 수 있다. 이러한 비교적 새롭게 기술된 PAL 서명 ([Williams et al., (2005) 동일 문헌])은 일부 효소를 HAL에서 PAL로 올바르게 표지하도록 하고, 이미 공개되어 있는 유전자 및 단백질 데이터베이스로부터 일부 새로운 PAL 효소를 확인하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 이같은 원핵생물 PAL 및 이의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체 및 변이체의 조성물, 및 치료적 및 산업적 목적을 위한 이들의 용도에 관한 것이다.

A. 정의

달리 언급되지 않는 한, 본 출원 (명세서 및 청구항 포함)에서 사용된 하기의 용어들은 하기에서 제공된 정의를 나타낸다. 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 단수형 형태 "a," "an" 및 "the"는 문맥적으로 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 것을 유념하여야 한다. 표준 화학 용어의 정의는 [Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry, 3rd Edition, Vols. A and B (Plenum Press, New York 1992)]가 포함되는 참고문헌에서 확인할 수 있다. 본 발명의 실행은, 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 속하는 합성 유기 화학, 질량 분광법, 분취용 및 분석용 크로마토그래피 방법, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 예를 들어, [T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)]; [A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 4th Edition, 2004)]; [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)]; [Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)]; [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)] 참조.

본원에서 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원 (상기 또는 하기)은 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.

하기의 아미노산 약자가 본문 전반에 걸쳐 사용된다:

알라닌: Ala (A) 아르기닌: Arg (R)

아스파라긴: Asn (N) 아스파르트산: Asp (D)

시스테인: Cys (C) 글루타민: Gln (Q)

글루탐산: Glu (E) 글리신: Gly (G)

히스티딘: His (H) 이소류신: Ile (I)

류신: Leu (L) 라이신: Lys (K)

메티오닌: Met (M) 페닐알라닌: Phe (F)

프롤린: Pro (P) 세린: Ser (S)

트레오닌: Thr (T) 트립토판: Trp (W)

타이로신: Tyr (Y) 발린: Val (V)

"폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위들로 구성된 중합체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 천연 발생 핵산, 예컨대 데옥시리보핵산 ("DNA") 및 리보핵산 ("RNA"), 뿐만 아니라 핵산 유사체를 포함한다. 핵산 유사체는 비-천연 발생 염기, 천연 발생 포스포디에스테르 결합 이외의 다른 뉴클레오티드와의 연결에 관여하는 뉴클레오티드, 또는 천연 발생 포스포디에스테르 결합 이외의 연결을 통해 부착된 염기를 포함하는 것들을 포함한다. 따라서, 뉴클레오티드 유사체는, 예를 들어, 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로트리에스테르, 포스포르아미데이트, 보라노포스페이트, 메틸포스포네이트, 키랄(chiral)-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA) 등을 포함한다. 예를 들어, 자동화 DNA 합성기를 사용하여 이같은 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 용어 "핵산"은 전형적으로 대형 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 전형적으로 짧은 폴리뉴클레오티드 (일반적으로 뉴클레오티드 약 50개 이하)를 지칭한다. 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열 (즉, A, T, G, C)로 표시되는 경우, 이는 "U"가 "T"를 대신하는 RNA 서열 (즉, A, U, G, C)을 또한 포함하는 것으로 이해될 것이다.

"cDNA"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의, mRNA에 상보적이거나 이와 동일한 DNA를 지칭한다.

폴리뉴클레오티드 서열을 기술하기 위해 통상적인 표기법이 본원에서 사용된다: 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 끝부분은 5'-끝부분이고, 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5'-방향으로 지칭된다. 신생 RNA 전사물에 대한 뉴클레오티드의 5' → 3' 부가의 방향은 전사 방향으로 지칭된다. mRNA와 서열이 동일한 DNA 가닥은 "코딩 가닥"으로 지칭되고; DNA로부터 전사된 mRNA와 서열이 동일한 DNA 가닥 상에 있고, RNA 전사물의 5'-끝부분에 대해 5'에 위치하는 서열은 "상류 서열"로 지칭되며; RNA와 서열이 동일한 DNA 가닥 상에 있고, 코딩 RNA 전사물의 3' 끝부분에 대해 3'인 서열은 "하류 서열"로 지칭된다.

"상보적"은 2개의 폴리뉴클레오티드의 상호작용 표면들의 위상 융화성 또는 함께 매칭(matching)됨을 지칭한다. 따라서, 2개의 분자가 상보적인 것으로 기술될 수 있고, 더욱이, 접촉 표면 특성들이 서로에 대해 상보적이다. 제1 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 제2 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드-결합 파트너의 뉴클레오티드 서열과 동일하다면, 제1 폴리뉴클레오티드가 제2 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적이다. 따라서, 서열이 5'-TATAC-3인 폴리뉴클레오티드는 서열이 5'-GTATA-3'인 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적이다.

뉴클레오티드 서열은, 대상 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 서열이 기준 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일하다면, 기준 뉴클레오티드 서열에 대해 "실질적으로 상보적"이다.

"코딩"은 규정된 서열의 뉴클레오티드들 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 규정된 서열의 아미노산들 및 이로부터 초래되는 생물학적 성질을 갖는 생물학적 프로세스 내의 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는, 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드들의 특정 서열의 고유의 성질을 지칭한다. 따라서, 유전자에 의해 생산된 mRNA의 전사 및 번역으로 세포 또는 기타 생물학적 시스템에서 단백질이 생산된다면, 유전자가 이러한 단백질을 코딩한다. 유전자 또는 cDNA의 코딩 가닥 (가닥의 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 목록에서 제공됨) 및 비-코딩 가닥 (전사를 위한 주형으로 사용됨) 양쪽 모두 이러한 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 생성물을 코딩하는 것으로 지칭될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 다의성(degenerate) 버젼이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.

"재조합 폴리뉴클레오티드"는 천연적으로는 함께 연결되지 않는 서열들이 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 증폭된 또는 조립된 재조합 폴리뉴클레오티드는 적절한 벡터 내에 포함될 수 있고, 이러한 벡터는 적절한 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포는 "재조합 숙주 세포"로 지칭된다. 그후, "재조합 폴리펩티드"를 예를 들어 생산하도록 유전자가 재조합 숙주 세포 내에서 발현된다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 비-코딩 기능 (예를 들어, 프로모터, 복제 기원, 리보솜-결합 부위 등)을 또한 수행할 수 있다.

"발현 제어 서열"은 이러한 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 발현 (전사 및/또는 번역)을 조절하는 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. "작동가능하게 연결된"은 한 부분의 활성 (예를 들어, 전사를 조절하는 능력)이 또다른 부분에 대한 작용 (예를 들어, 서열의 전사)을 초래하는, 2개의 부분 간의 기능적인 관계를 지칭한다. 발현 제어 서열은, 예를 들어 비제한적으로, 프로모터 (예를 들어, 유도성 또는 구성성), 인핸서, 전사 종결인자, 시작 코돈 (즉, ATG), 인트론에 대한 스플라이싱(splicing) 신호 및 정지 코돈의 서열을 포함할 수 있다.

"발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함한다; 발현을 위한 기타 요소들은 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에 의해 공급될 수 있다. 발현 벡터는 당업계에 공지된 것들 모두, 예컨대 재조합 폴리뉴클레오티드가 혼입된 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 네이키드(naked) 플라스미드 또는 리포솜에 함유된 플라스미드) 및 바이러스를 포함한다.

"증폭"은, 예를 들어, 역전사, 중합효소 연쇄 반응, 및 리가제(ligase) 연쇄 반응에 의한, 폴리뉴클레오티드 서열이 복사되고, 따라서 다수의 폴리뉴클레오티드 분자로 확장되는 임의의 수단을 지칭한다.

"프라이머"는 지정된 폴리뉴클레오티드 주형에 특이적으로 혼성화할 수 있고 상보적인 폴리뉴클레오티드의 합성을 위한 시작점을 제공할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이같은 합성은 폴리뉴클레오티드 프라이머가 합성이 유도되는 조건 하에, 즉 뉴클레오티드, 상보적인 폴리뉴클레오티드 주형, 및 중합용 작용제 예컨대 DNA 중합효소의 존재 하에 놓일 때 발생한다. 프라이머는 전형적으로 단일-가닥이지만, 이중-가닥일 수 있다. 프라이머는 전형적으로 데옥시리보핵산이지만, 광범위한 합성 및 천연 발생 프라이머가 다수의 용도에 유용하다. 프라이머는 합성의 시작을 위한 부위로 작용하기 위해 자신이 혼성화하도록 디자인된 주형에 대해 상보적이지만, 주형의 정확한 서열을 반영할 필요는 없다. 이같은 경우에, 주형에 대한 프라이머의 특이적 혼성화는 혼성화 조건의 엄격도에 좌우된다. 프라이머는, 예를 들어, 발색성, 방사성 또는 형광 모이어티로 표지되어 검출가능한 모이어티로 사용될 수 있다.

"프로브"는, 폴리뉴클레오티드에 대한 언급에서 사용되는 경우, 또다른 폴리뉴클레오티드의 지정된 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 프로브는 상보적인 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지만, 주형의 정확한 상보적인 서열을 반영할 필요는 없다. 이같은 경우에, 표적에 대한 프로브의 특이적 혼성화는 혼성화 조건의 엄격도에 좌우된다. 프로브는, 예를 들어, 발색성, 방사성 또는 형광 모이어티로 표지되어 검출가능한 모이어티로 사용될 수 있다.

서열이 제1 서열인 폴리뉴클레오티드가 서열이 제2 서열인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화한다면 제1 서열은 제2 서열에 관하여 "안티센스 서열"이다.

"~에 특이적으로 혼성화함" 또는 "특이적 혼성화" 또는 "~에 선택적으로 혼성화한다"는 특정 뉴클레오티드 서열이 복합적인 혼합물 (예를 들어, 전체 세포성) DNA 또는 RNA 내에 존재하는 경우에 엄격한 조건 하에 핵산 분자가 이러한 특정 뉴클레오티드 서열에 우선적으로 결합하거나, 듀플렉스(duplex)를 형성하거나, 혼성화하는 것을 지칭한다.

용어 "엄격한 조건"은 프로브가 이의 표적 하위서열에 우선적으로 혼성화하고, 다른 서열에는 더 적은 정도로 혼성화하거나 전혀 혼성화하지 않을 조건을 지칭한다. 핵산 혼성화 실험 예컨대 서던(Southern) 및 노던(Northern) 혼성화의 정황에서의 "엄격한 혼성화" 및 "엄격한 혼성화 세정 조건"은 서열 의존적이고, 상이한 실험 파라미터 하에 상이하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침이 [Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York]에서 확인된다. 일반적으로, 규정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 용융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 고도로 엄격한 혼성화 및 세정 조건이 선택된다. Tm은 표적 서열의 50％가 완전하게 매칭되는 프로브에 혼성화하는 혼성화하는 온도 (규정된 이온 강도 및 pH 하에서의 온도)이다. 매우 엄격한 조건은 특정 프로브에 대한 Tm과 동일하도록 선택된다.

서던 또는 노던 블롯의 필터 상에서의 100개를 초과하는 상보적인 잔기들이 있는 상보적인 핵산들의 혼성화를 위한 엄격한 혼성화 조건의 예는 50％ 포르말린 + 1 ㎎의 헤파린, 42℃이고, 이때 혼성화는 하룻밤 동안 수행된다. 고도로 엄격한 세정 조건의 예는 0.15 M NaCl, 72℃, 약 15분이다. 엄격한 세정 조건의 예는 65℃에서 15분 동안의 0.2× SSC 세정이다 (SSC 완충제의 설명에 대해서 [Sambrook, et al. (1989) 동일 문헌] 참조). 종종, 배경 프로브 신호를 제거하기 위해 낮은 엄격성의 세정이 높은 엄격성의 세정에 선행한다. 예를 들어 뉴클레오티드가 100개를 초과하는 듀플렉스에 대한 중간 엄격성 세정의 예는 45℃에서 15분 동안의 1× SSC이다. 예를 들어 뉴클레오티드가 100개를 초과하는 듀플렉스에 대한 낮은 엄격성 세정의 예는 40℃에서 15분 동안의 4-6× SSC이다. 일반적으로, 특정 혼성화 분석법에서 관련되지 않은 프로브에 대해 관찰되는 것의 2× (또는 그 이상)인 신호 대 노이즈 비율은 특이적 혼성화를 가리킨다.

"폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산 잔기, 관련된 천연 발생 구조 변이체 및 이의 비-천연 발생 합성 유사체로 구성된 중합체, 관련된 천연 발생 구조 변이체, 및 이의 비-천연 발생 합성 유사체를 지칭한다. 예를 들어, 자동화 폴리펩티드 합성기를 사용하여 합성 폴리펩티드를 합성할 수 있다. 용어 "단백질"은 전형적으로 대형 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "펩티드"는 전형적으로 짧은 폴리펩티드를 지칭한다.

폴리펩티드 서열을 묘사하기 위해 통상적인 표기법이 본원에서 사용된다: 폴리펩티드 서열의 왼쪽 끝부분은 아미노-말단이고; 폴리펩티드 서열의 오른쪽 끝부분은 카르복실-말단이다.

"보존적 치환"은 한 아미노산의 기능적으로 유사한 아미노산으로의 폴리펩티드에서의 치환을 지칭한다. 하기의 6가지 군은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산들을 각각 함유한다:

1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T);

2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);

3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);

4) 아르기닌 (R), 라이신 (K);

5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 및

6) 페닐알라닌 (F), 타이로신 (Y), 트립토판 (W).

아미노산은 하기와 같은 군으로 또한 분류될 수 있다:

(1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

"대립유전자 변이체"는 동일한 유전자좌를 차지하는 유전자의 2개 이상의 다형성 형태들 중 임의의 것을 지칭한다. 대립유전자 변이는 돌연변이를 통해 잔연적으로 발생하고, 집단 내에 표현형 다형성을 초래할 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵성일 수 있거나 (코딩되는 폴리펩티드에서의 변화 없음), 또는 아미노산 서열이 변경된 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. "대립유전자 변이체"는 대립유전자 변이체의 mRNA 전사물로부터 유래된 cDNA, 뿐만 아니라 이에 의해 코딩되는 단백질을 또한 지칭한다.

2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 정황에서, 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율은, 하기의 서열 비교 알고리즘들 중 하나를 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정 시, 최대의 상응을 위해 비교 및 정렬되었을 때, 동일하거나 특정한 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다.

2개의 핵산 또는 폴리펩티드의 정황에서, "실질적으로 상동성인" 또는 "실질적으로 동일한"이라는 구절은, 하기의 서열 비교 알고리즘들 중 하나를 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정 시, 최대의 상응을 위해 비교 및 정렬되었을 때, 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성이 적어도 40％, 60％, 80％, 90％, 95％, 98％인 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 일반적으로 지칭한다. 일부 실시양태에서, 실질적인 동일성은 길이가 잔기 약 50개 이상인 서열의 영역, 잔기 약 100개 이상의 영역 또는 잔기 약 150개 이상에 걸쳐 존재한다. 또다른 실시양태에서, 비교되는 생체중합체들 중 하나 또는 양쪽 모두의 전체 길이에 걸쳐 서열이 실질적으로 동일하다.

서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 기준 서열로 작용하고, 여기에 테스트 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 테스트 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요하다면 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램을 지정한다. 그후, 지정된 프로그램 파라미터를 기초로, 서열 비교 알고리즘이 기준 서열과 비교하여 테스트 서열(들)에 대해 서열 동일성 백분율을 계산한다.

비교를 위한 서열들의 최적의 정렬을, 예를 들어, [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소적인 상동성 알고리즘에 의해, [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, [Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이러한 알고리즘들의 컴퓨터 실행 (<Wisconsin Genetics Software Package> (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 육안 검사에 의해 수행할 수 있다.

유용한 알고리즘의 한 예는 PILEUP이다. PILEUP은 관계 및 서열 동일성 백분율을 나타내기 위해 점진적인 쌍-방식(pairwise) 정렬을 사용하여 관련된 서열들의 군으로부터 다중 서열 정렬을 생성시킨다. 이는 정렬을 생성시키는데 사용된 클러스터링 관계를 나타내는 수형도 또는 계통수를 또한 플롯팅한다. PILEUP은 [Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)]의 점진적 정렬 방법의 간이화를 사용한다. 사용된 방법은 [Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989)]에 기술된 방법과 유사하다. 이 프로그램은 각각 최대 길이가 뉴클레오티드 또는 아미노산 5,000개인 서열 300개까지를 정렬할 수 있다. 다중 서열 정렬 절차는 2개의 가장 유사한 서열을 쌍-방식으로 정렬하여, 2개의 정렬된 서열의 클러스터를 만드는 것으로 시작되된다. 그후, 이러한 클러스터를 그 다음으로 가장 관련된 서열 또는 정렬된 서열들의 클러스터에 정렬한다. 서열들의 2개의 클러스터는 2개의 개별적인 서열의 쌍-방식 정렬의 단순 확장에 의해 정렬된다. 일련의 점진적인 쌍-방식 정렬들에 의해 최종 정렬이 달성된다. 이 프로그램은 특정 서열 및 이의 아미노산 또는 뉴클레오티드 좌표를 서열 비교 영역에 지정하고, 프로그램 파라미터를 지정함으로써 실행된다. 예를 들어, 하기의 파라미터를 사용하여 기준 서열을 또다른 테스트 서열에 비교하여 서열 동일성 관계 백분율을 결정할 수 있다: 디폴트 갭 가중치 (3.00), 디폴트 갭 길이 가중치 (0.10), 및 가중치를 준 끝부분 갭. 서열들의 다중 정렬을 생성시키는데 유용한 또다른 알고리즘은 Clustal W이다 ([Thompson, et al., Nucleic Acids Research 22: 4673-4680 (1994)]).

서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는데 적절한 알고리즘의 또다른 예는 BLAST 알고리즘이고, 이는 [Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 <National Center for Biotechnology Information>을 통해 공개적으로 입수가능하다. 이러한 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 워드(word)와 정렬되는 경우 약간의 양성 값의 역치 점수 T에 매칭되거나 이를 충족시키는, 질의 서열 내의 길이 W의 짧은 워드들을 확인함으로써 높은 점수의 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 수반한다. T는 이웃 워드 점수 역치로 지칭된다 ([Altschul et al. (1990), 상기 문헌]). 이러한 초기 이웃 워드 히트(hit)는 이를 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 시작하기 위한 시드(seed)로 작용한다. 그후, 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한도까지 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 워드 히트가 확장된다. 뉴클레오티드 서열에 대해, 파라미터 M (매칭되는 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 0 초과) 및 N (미스매칭된 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 0 미만)을 사용하여 누적 점수가 계산된다. 아미노산 서열에 대해, 누적 점수를 계산하기 위해 채점 매트릭스가 사용된다. 누적 정렬 점수가 이의 최대 달성치로부터 X의 양만큼 하락한 경우, 하나 이상의 음성으로 채점된 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 점수가 0 이하가 된 경우, 또는 어느 한쪽 서열의 끝부분에 도달한 경우, 각각의 방향으로의 워드 히트의 확장이 정지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열용)은 디폴트로서 워드길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M = 5, N = -4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열용으로, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드 길이 (W) 3, 기대값 (E) 10, 및 BLOSUM62 채점 매트릭스 ([Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)] 참조)를 사용한다.

서열 동일성 백분율을 계산하는 것에 더하여, BLAST 알고리즘은 2개의 서열 간의 유사성의 통계적 분석을 또한 수행한다 (예를 들어, [Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 한 측정치는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 발생할 가능성을 가리키는 최소 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들어, 기준 핵산에 대한 테스트 핵산의 비교에서의 최소 합계 확률이 약 0.1 미만, 약 0.01 미만, 또는 약 0.001 미만이면 핵산이 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다 .

2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 것의 추가적인 표시는, 하기 기술되는 바와 같이, 제1 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 예를 들어, 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우, 폴리펩티드는 전형적으로 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 것의 또다른 표시는 2개의 분자가 본원에 기술된 바와 같은 엄격한 조건 하에 서로 혼성화한다는 것이다.

"실질적으로 순수한" 또는 "단리된"은 대상 종이 우세하게 존재하는 종이라는 것을 의미하고 (즉, 몰 농도 기준으로, 조성물 내의 어떠한 다른 개별적인 거대분자 종보다 풍부함), 실질적으로 정제된 분획은 대상 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 약 50％ 이상 (몰농도 기준)을 이루는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물 내에 존재하는 거대분자 종의 약 80％ 내지 90％ 또는 그 이상이 관심이 있는 정제된 종이라는 것을 의미한다. 조성물이 단일 거대분자 종으로 본질적으로 구성된다면, 대상 종이 본질적인 균질성으로 정제된 것이다 (통상적인 검출 방법에 의해 조성물 내에서 오염 종이 검출될 수 없다). 용매 종, 소형 분자 (500 달톤 미만), 안정화제 (예를 들어, BSA), 및 원소성 이온 종은 이러한 정의의 목적을 위해 거대분자 종으로 간주되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물 또는 접합체는 실질적으로 순수하거나 단리된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물 또는 접합체는 이들의 합성에서 사용된 거대분자성 출발 물질과 관련하여 실질적으로 순수하거나 단리된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제와 부가혼합된, PAL 폴리펩티드와 활성 작용제의 실질적으로 정제된 또는 단리된 접합체를 포함한다.

대상에 적용될 때의 "천연 발생"은 대상이 천연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 천연의 공급원으로부터 단리될 수 있는 생물 (바이러스 포함) 내에 존재하고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 발생 서열이다.

"야생형" (wt)은 생물의 천연의 유전자 형태를 지칭하는 용어이다. 야생형은 돌연변이체 형태 (유전자 돌연변이가 있는 생물)와 구별된다.

용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기들의 중합체를 지칭하고, 최소 길이의 생성물에 한정되지 않는다. 따라서, 펩티드, 올리고펩티드, 이량체, 다량체 등이 이러한 정의 내에 포함된다. 전장 단백질 및 이의 단편 양쪽 모두 이러한 정의에 포함된다. 이 용어는 폴리펩티드의 번역후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등을 또한 포함한다. 또한, 본 발명의 목적을 위해, "폴리펩티드"는, 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 천연 서열에 대한 변형, 예컨대 결실, 부가 및 치환 (천연적으로 일반적으로 보존적)을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이러한 변형은 부위-지정 돌연변이유발을 통해서와 같이 계획적일 수 있거나, 또는 단백질을 생산하는 숙주에서 기인하는 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 에러를 통해서와 같이 우발적일 수 있다.

본원에서 사용된 "유사체" 또는 "유도체"는 소정의 화합물, 예를 들어, 펩티드와의 서열 동일성이 약 70％를 초과하지만 100％ 미만인 화합물, 예를 들어, 펩티드이다. 이같은 유사체 또는 유도체는 호모아르기닌, 오르니틴, 페니실라민 및 노르발린이 예를 들어 포함되지만 이에 한정되지 않는 비-천연 발생 아미노산 잔기, 뿐만 아니라 천연 발생 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 이같은 유사체 또는 유도체는 하나 또는 다수의 D-아미노산 잔기로 또한 구성될 수 있고, 2개 이상의 아미노산 잔기 사이의 비-펩티드 상호연결을 함유할 수 있다.

용어 "유효량"은 건강한 상태, 병리학, 및 대상의 질환에 원하는 결과를 일으키는데 충분하거나, 진단 목적을 위한 투여량을 의미한다. 원하는 결과는 이러한 투여량의 수용자의 주관적 또는 객관적 개선을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"은 건강에 대해 의도한 이로운 효과를 일으키는데 효과적인 작용제의 양을 지칭한다. 모든 개별적인 사례에서의 적합한 "효과적인" 양은 일상적인 실험을 사용하여 당업자가 결정할 수 있다.

"치료"는 예방적 치료 또는 치료적 치료 또는 진단적 치료를 지칭한다.

"예방적" 치료는 질환의 징후를 나타내지 않거나 초기 징후만을 나타내는 대상에게 병리학이 발달될 위험을 감소시키기 위한 목적으로 투여되는 치료이다. 병리학이 발달될 가능성을 감소시키거나, 발달된 경우에는 병리학의 중증도를 최소화하기 위해 본 발명의 화합물 또는 접합체가 예방적 치료로서 제공될 수 있다.

"치료적" 치료는 병리학의 징후 또는 증상을 나타내는 대상에게 이러한 징후 또는 증상을 감소시키거나 제거하기 위한 목적으로 투여되는 치료이다. 징후 또는 증상은 생화학적, 세포성, 조직학적, 기능적, 주관적 또는 객관적 징후 또는 증상일 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 접합체는 치료적 치료로서 또는 진단용으로 제공될 수 있다.

"진단적"은 병리학적 상태의 존재 또는 성질을 확인하는 것을 의미한다. 진단 방법들은 특이성 및 선택성이 상이하다. 특정 진단 방법이 상태의 명확한 진단을 제공하지 않을 수 있지만, 이 방법이 진단을 돕는 양성 표시를 제공한다면 충분한다.

"제약 조성물"은 인간 및 포유동물이 포함되는 대상 동물에서의 제약학적 용도에 적절한 조성물을 지칭한다. 제약 조성물은 약리학적 유효량의 PAL 폴리펩티드를 포함하고, 제약상 허용되는 담체를 또한 포함한다. 제약 조성물은 활성 성분(들), 및 담체를 구성하는 불활성 성분(들), 뿐만 아니라 성분들 중 임의의 2개 이상의 조합, 복합체형성 또는 응집으로부터, 또는 성분들 중 하나 이상의 해리로부터, 또는 성분들 중 하나 이상의 또다른 유형의 반응 또는 상호작용으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 초래된 임의의 생성물을 포함하는 조성물을 포함한다. 따라서, 본 발명의 제약 조성물은 본 발명의 화합물 또는 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 부가혼합함으로써 제조된 임의의 조성물을 포함한다.

"제약상 허용되는 담체"는 임의의 표준 제약 담체, 완충제 및 부형제, 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액, 덱스트로스의 5％ 수성 용액, 및 에멀션, 예컨대 유/수 또는 수/유 에멀션, 및 각종 유형의 습윤화제 및/또는 보조제를 지칭한다. 적절한 제약 담체 및 제형이 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995)]에 기술되어 있다. 제약 담체는 활성 작용제의 의도된 투여 방식에 좌우된다. 전형적인 투여 방식에는 장 투여 (예를 들어, 경구 투여) 또는 비경구 투여 (예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 복강내 주사; 또는 국소, 경피, 또는 경점막 투여)가 포함된다. "제약상 허용되는 염"은 금속 염 (나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등) 및 암모니아 또는 유기 아민의 염이 예를 들어 포함되는, 제약 용도용으로 화합물 또는 접합체로 제형화될 수 있는 염이다.

"제약상 허용되는" 또는 "약리학적으로 허용되는"은 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직하지 않지 않은 물질, 즉 어떠한 바람직하지 않은 생물학적 효과도 야기하지 않으면서 또는 물질이 함유된 조성물의 어떠한 성분과도 해로운 방식으로 상호작용하지 않으면서 개체에게 투여될 수 있는 물질을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "단위 투약 형태"는 인간 및 동물 대상에게 단위성으로 투약하기에 적절한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고, 이때 각각의 단위는 제약상 허용되는 희석제, 담체 또는 비히클과 함께 원하는 효과를 일으키는데 충분한 양으로 계산된 미리 정해진 양의 본 발명의 화합물 또는 접합체를 함유한다. 본 발명의 신규 단위 투약 형태에 대한 상세사항은 사용된 특정 화합물 또는 접합체 및 달성하려는 효과, 및 숙주 내에서의 각각의 화합물 또는 접합체와 관련된 약역학에 좌우된다.

"생리학적 pH" 또는 "생리학적 범위 내의 pH"는 약 7.2 내지 8.0 (경계 포함) 범위, 더욱 전형적으로는 약 7.2 내지 7.6 (경계 포함) 범위의 pH를 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "대상"은 포유동물 및 비-포유동물을 포함한다. 포유동물의 예로는 하기와 같은 포유류 강의 임의의 구성원이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다: 인간, 비-인간 영장류 예컨대 침팬지, 및 기타 유인원 및 원숭이 종; 농장 동물 예컨대 소, 말, 양, 염소, 돼지; 가축 예컨대 토끼, 개 및 고양이; 설치류, 예컨대 래트, 마우스 및 기니 피그 등이 포함되는 실험용 동물. 비-포유동물의 예로는 조류, 어류 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이 용어는 특정 연령 또는 성별을 나타내지 않는다.

다양한 실시양태에서, PAL 변이체의 PEG화가 PAL:PEG 또는 PEG:PAL의 비율과 관련하여 기술된다. 본원에서 사용된 "PAL:PEG"의 비율은, 달리 지시되지 않는 한, PEG화 반응에서의 PAL 변이체 상의 라이신 잔기 대 PEG 분자의 비율을 지칭한다. 유사하게, 본원에서 사용된 "PEG:PAL"의 비율은, 달리 지시되지 않는 한, PEG화 반응에서의 PEG 분자 대 PAL 변이체 상의 라이신 잔기의 비율을 지칭한다.

B. 구조-기반 단백질 조작

주로 단백질 구조 정보를 주로 기초로 하는 논리적인 최적화를 사용하는 단백질 조작을 위해 수많은 방법이 공지되어 있다 ([Brannigan, et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3(12):964-970 (2002)]; [Marshall, et al., Drug Discov. Today 8(5):212-221 (2003)]). 구조적 특색의 체계적인 교체는 개선된 단백질 성질 및/또는 기질 특이성의 재-디자인에 이를 수 있다. 유전자 패밀리의 한 구성원으로부터의 기능을 또다른 상동성 구성원 내로 보충하는 것은 기질 결합부 바로 가까이에 제한된 숫자의 아미노산 치환을 도입하는 것에 의해 달성될 수 있다. 개선된 단백질 변이체를 생성시키는 것에 의한 단백질 기능에서의 이같은 개선은 산업적, 농업적 및 치료적 용도를 위한 유용한 단백질에 이를 수 있다 ([Bocanegra, et al., Biochemistry 32(11):2737-2740 (1993)]; [Failla, et al., Fold Des. 1(1):35-42 (1996)]; [Hayes, et al., Proc Natl Acad Sci USA 99(25):15926-15931 (2002)]; [Voigt, et al., Nat. Struct. Biol. 9(7):553-558 (2002)]; [Malashkevich, et al., Nat Struct Biol. 2(7):548-553 (1995)]; [Wells, et al., Proc Natl Acad Sci USA 84(15):5167-5171 (1987)]; [Wilks, et al., Science 242(4885):1541 -1544 (1988)]).

C. PAL 의 구조

x-선 결정학을 사용하여 야생형 원핵생물 PAL의 3차원 구조를 결정할 수 있다. PAL 단백질은 동종사량체이고, 이때 각각의 단량체는 주로 알파-나선으로 구성되고, 4개의 도메인 (중앙의 촉매 도메인, N-말단 도메인, 및 슈도모나스 푸티다 히스티딘 암모니아-리아제 구조 (HAL, [Schwede, et al., Biochemistry 38(17):5355-5361 (1999)])에 대한 유사성이 있는 소형 C-말단 도메인, 및 무손상 사량체 분자의 끝부분으로부터 튀어나온 C-말단 영역 내로 삽입된 추가적인 도메인)으로 세분될 수 있다. N-말단의 처음 25개의 잔기는 사량체 내의 4개의 단량체 모두에 대해 구조물 내에서 가시적이지 않고, 이러한 영역은 아마도 무질서할 것이다. 잔기 109-123과 350-353 사이의 루프 영역은 단량체 B에 대해 무질서하고, 영역 103-123 및 350-353이 PAL 사량체 내의 단량체 A, C, 및 D에 대해 무질서하다. 2.1 Å (P3221 공간군) 및 2.7 Å (P21 공간군; [Calabrese, et al., Biochemistry 43(36):11403-11416 (2004)])의 해상력으로, 결정화 프로세스 동안의 트랜스-신나메이트 및 NH4 이온 부가를 사용하여 로도스포리디움 토룰로이데스 PAL의 2개의 또다른 X선 구조가 결정되었다. 결정화에 사용된 pH가 낮을수록, 그리고 이러한 구조의 해상력이 낮을수록, 구조물 내의 고유의 무질서 (특히, N-말단 영역 내에서)가 많아질 것이고, MIO 보조인자 상에 존재하는 추가적인 전자 밀도를 NH2 부가물에 모호하지 않게 할당하지 못하게 될 것이다.

암모니아-리아제 (PAL, HAL, 및 아스파르테이트 암모니아-리아제 (AAL)), 푸마라제(fumarase), 및 아르기로숙시네이트 리아제를 포함하여 ([Schwede, et al., Biochemistry 38(17):5355-5361 (1999)]), 카르복실산으로부터 다양한 기들을 제거하는 것을 촉매하는 이러한 사량체성 효소 패밀리에 다수의 관련된 구조물들이 있다 (DALI 사용, [Holm, et al., J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993)]). 또한, δ-크리스탈린 조류 눈 수정체 단백질에 유사한 폴드(fold)가 있지만, 이는 이러한 구조적 패밀리의 비-효소 형태이다 ([Schwede, et al., (1999) 동일 문헌]).

슈도모나스 푸티다로부터의 HAL의 3차원 X선 구조 (Roether, et al., Eur. J. Biochem. 268:6011-6019 (2001)]; [Schwede, et al., Biochemistry 27:5355-5361 (1999)]), 및 더욱 최근에는 로도스포리디움 토룰로이데스로부터의 PAL의 3차원 X선 구조 ([Calabrese, et al., Biochemistry 43:11403-11416 (2004)])에서 기질 결합, 촉매 및 MIO 형성에 중요한 이러한 사량체성 효소들의 활성 부위 잔기가 드러났다. HAL 내의 모든 활성 부위 잔기는 각각 발린 및 글루타민 잔기로 교체되는 H83 및 E414를 제외하고는 모두 EncP 내에 존재한다 ([Xiang, L., et al., J. Biol. Chem. 277:32505-3250924 (2002)]). HAL 내의 H83은 활성 부위에서 L-히스티딘의 이미다졸 모이어티에 결합하여 이를 배향시키고, 효소에 결합된 양이온성 중간체를 안정화시키는 것으로 제안되는 한편, E414의 카르복실레이트 기는 촉매작용에서 염기로서 작용할 수 있다.

PAL의 고해상력 3차원 단백질 결정 구조는 PAL의 생화학적 및 생물물리학적 성질을 개선시키고 PAL의 생체내 치료 유효성을 증가시키기 위해 단백질 조작을 수반하는 방법에서 사용될 수 있다. 또한, 이러한 구조는 구조물의 어떤 영역이 가장 유연한지 (제거하여 더욱 조밀하고 안정적인 형태의 PAL을 생성시키기 위해), 어떤 잔기가 활성 부위 근처에 위치하는지 (단백질의 활성을 강화시키고/시키거나 크기를 최소화하기 위해 돌연변이시키기 위해, 뿐만 아니라 구조-기반 억제제 디자인을 위한 정보를 제공하기 위해), 및 어떤 표면 위치가 면역원성 부위 (예를 들어, 매핑(mapping) 연구에서 확인된 선형 에피토프) 및/또는 단백질분해성 민감성 부위 (프로테아제 매핑 연구로부터의 부위)에 가까운지에 관한 정보를 제공하여, 문제 부위의 직접적인 파괴, 또는 별법적으로 천연 PAL 내에 존재하는 민감성 부위를 보호하기 위한 표면 PEG화 또는 기타 화학적 유도체화를 위한, 부위-특이적 돌연변이체의 도입을 허용한다.

D. PAL 의 구조 좌표의 용도

돌연변이, 변형 또는 돌연변이와 변형의 조합을 위한 단백질의 영역을 선별하기 위한 컴퓨터처리 방법에서 PAL의 고해상력 3차원 결정 구조를 사용할 수 있다. 예를 들어, 시판되는 프로그램인 GETAREA는 X선 결정학 좌표를 기초로 아미노산 잔기에 대한 표면 노출을 계산한다.

고해상력 3차원 결정 구조는 효소의 활성 부위에 대한 리간드를 디자인하기 위한 인-실리코(in-silico) 방법에서 추가로 사용될 수 있다. 예를 들어, 구조-기반 소형 분자의 도킹(docking) 및 디자인을 위한 시판되는 소프트웨어 프로그램을 사용하여 PAL 억제제를 디자인할 수 있다 ([Billett, et al., Biochim Biophys Acta 524(1):219-230 (1978)]; [Janas, et al., Acta Biochim Pol. 32(2):131-143 (1985)]; [Zon, et al., Phytochemistry 59(1): 9-21 (2002)]; [Alunni, et al., Arch Biochem Biophys. 412(2):170-175 (2003)]).

구조-기반 PAL 조작

특정 거대분자에 대한 신뢰할 수 있는 3차원 구조 또는 구조 모델의 해명은 상기 거대분자의 특이적 구조 및/또는 기능의 최적화를 위한 생산적인 방법이 되기 위한 논리적인 디자인을 허용한다 ([Penning, et al., Chem Rev. 101(10):3027-3046 (2001)]). 최적화 접근법은 조효소 특이성의 재조작 ([Bocanegra, et al., Biochemistry 32(11):2737-2740 (1993)]), 단백질 안정성의 개선 ([Malakauskas, et al., Nat Struct Biol. 5(6): 470-475 (1998)]; [Jiang, et al., Protein Sci. 10(7):1454-1465 (2001)]; [Luo, Protein Sci. 11(5):1218-1226 (2002)]; [Filikov, et al., Protein Sci. 11(6):1452-1461 (2002)]; [O'Fagain, Enz Microb Technol. 33:137-149 (2003)]; [Cammett, et al., J Mol Biol. 327(1):285-297 (2003)]), 기질 특이성의 재디자인 ([Hedstrom, et al., Science 255(5049):1249-1253 (1992)]; [Failla, et al., Fold Des. 1(1):35-42 (1996)]; [Malashkevich, et al., Nat Struct Biol. 2(7):548-553 (1995)]; [Wilks, et al., Biochemistry 31 (34):7802-7806 (1992)]; [Feil, et al., Protein Eng. 10(3):255-262 (1997)]; [Whittle, et al., J Biol Chem. 276(24):21500-21505 (2001)]), 리간드 또는 수용체 결합 특이성의 변경 ([Cunningham, et al., Proc Natl Acad Sci USA 88(8):3407-3411 (1991)]; [Reddy, et al., Nat Biotechnol. 14(13):1696-1699 (1996)]; [Doyle, et al., Curr Opin Chem Biol. 4(1):60-63 (2000)]), 및 생물학적 활성의 재조작 ([Chen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5618-5622 (1993)]; [Sarkar, et al., Nat Biotechnol. 20:908-913 (2002)]; [Blatt, et al., J Interferon Cytokine Res. 16(7):489-499 (1996)])을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

구조-기반 조작은 논리적인 돌연변이체 예컨대 말단절단, 결실, 삽입, 스플라이스 변이체, 점 돌연변이, 치환, 키메라, 루프 재조작 돌연변이체, 루프 교환 돌연변이체, 표면 베니어링(veneering) 돌연변이체, 뿐만 아니라 확률적으로 유래된 돌연변이체 (단독의 또는 논리적으로 개발된 돌연변이체와 조합된, 지향성 진화-유래 돌연변이체 포함)가 포함되는 PAL 변이체를 생성시키는데 사용될 수 있다. 또한, 부위-특이적 PEG화 및/또는 기타 화학적 유도체화를 위해 돌연변이가 도입된 PAL 돌연변이체를 포함하는 PAL 변이체가 제조될 수 있다. 이같은 방법에서 사용하기 위한 PAL 돌연변이체에는 야생형 로도스포리디움 토룰로이데스 PAL와 기능적 활성이 실질적으로 동일한 임의의 PAL 변이체 (어버이 PAL 단백질의 변이체, 단편 및 화학적 유도체 포함)가 포함된다.

지향성 진화 단백질 최적화

지향성 진화 방법은 관심 유전자(들)을 무작위로 돌연변이시켜, 단백질 돌연변이 공간의 더 큰 영역을 더욱 완전하게 탐구한다. DNA 서열 전반에 걸쳐 다양성을 도입하기 위한, 에러 경향이 있는 PCR 및 무작위 삽입 및 결실 (RID) 돌연변이유발, 및 더욱 집중적인 또는 "지향성"인 다양성-생성 방법 예컨대 부위-포화 돌연변이유발 및 기타 올리고뉴클레오티드-기반 돌연변이유발 방법 ([Brannigan, et al., (2002) 동일 문헌])을 포함하여, 수많은 지향성 진화 방법이 존재한다. 또한, 유리한 돌연변이 부위들을 조합하고 동시에 해로운 돌연변이들을 제거하여 신규 DNA 서열을 생산하는데 DNA 서열 재조합 방법이 사용되었다 (예를 들어, DNA 셔플링(shuffling), StEP, RACHITT, ITCHY의 방법). 마지막으로, 치료적 장점을 위해 단백질을 재디자인하는데 구조-기반 지향성 진화 기술이 사용되었다 (구조-기반 조합형 조작 (SCOPE) 및 단백질 디자인 자동화 (PDA) 방법). SCOPE 방법은 DNA 조작 기술과 커플링된 단백질 구조 정보를 사용하여 비-상동성 유전자들로부터 다중 교차 단백질 변이체 라이브러리를 디자인하고 생성시키는 반((半))-논리적 단백질 조작 접근법을 기초로 한다 ([O'Maille, et al., J Mol Biol. 321(4):677-691 (2002)]). PDA에서는, 돌연변이 공간의 컴퓨터 예비-스크리닝이 특정 단백질 폴드와 상용성인 돌연변이만 포함하도록 하여, 서열 변이체의 개수를 실험적 스크리닝을 받을 수 있는 크기로 감소시킨다 (미국 특허 번호 6,403,312; [Dahiyat, et al., Proc Natl Acad Sci USA 94(19):10172-10177 (1997)]; [Dahiyat, et al., Protein Sci. 6(6):1333-1337 (1997)]; [Hayes, et al., Proc Natl Acad Sci USA 99(25):15926-15931 (2002)]; [Orencia, et al., Nature Struct Biol. 8:238-242 (2001)]).

최초의 효소 종으로부터 시작하여 이러한 종을 변경 및/또는 개선된 기능에 대해 돌연변이시키면서, 지향성 진화의 사용 (효과적인 선별 또는 스크리닝 프로토콜과 커플링됨)이 개선된 촉매 기능 및 생물물리학적 성질 (예를 들어, 감소된 면역원성, 증가된 안정성)에 이른 다수의 예가 존재한다 ([Vasserot, et al., Drug Discovery Today 8(3):118-126 (2003)]). 예를 들어, 다수의 상이한 단백질 (트리오스-포스페이트 아이소마라제(isomerase), [Hermes, et al., Proc Natl Acad Sci USA 87(2):696-700 (1990)]; 베타-락타마제(lactamase), [Stemmer, W.P., Nature 370(6488):389-391 (1994)], [Orencia, M.C., et al., Nature Struct Biol 8:238-242 (2001)], [Voigt, C. A., et al., (2002) 동일 문헌]; 파라-니트로벤질 에스테라제(esterase), [Moore, et al., Nature Biotechnol. 14:458-467 (1996)]; 갈락토시다제(Galactosidase) → 푸코시다제(fucosidase), [Zhang, et al., Proc Natl Acad Sci USA 94(9):4504-4509 (1997)]; 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(aminotransferase), [Yano, et al., Proc Natl Acad Sci USA 95(10):5511-5515 (1998)]; 녹색 형광 단백질, [Crameri, et al., Nat Biotechnol 14(3):315-319 (1996)]; 양고추냉이 퍼옥시다제(peroxidase), [Lin, et al., Biotechnol Prog 15:467-471 (1999)]; 사이토크롬 P450, [Joo, et al., Nature 399(6737):670-673 (1999)]; 비페닐 디옥시게나제(dioxygenase), [Kumamaru, et al., Nat Biotechnol 16(7):663-666 (1998)]; 아르세네이트 해독 경로, [Crameri, et al., Nat Biotechnol 15(5):436-438 (1997)]; 세팔로스포리나제(Cephalosporinase), [Crameri, et al., Nature 391(6664):288-291 (1998)]; 각종 단백질, [Shao, et al., Curr Opin Struct Biol 6(4):513-518 (1996)], 각종 단백질, [Skandalis, et al., Chem Biol 4:889-898 (1997)]; 서브틸리신(Subtilisin), [Cunningham, et al., Protein Eng. 1(4):319-325 (1987)]; 니트릴라제(Nitrilase), [DeSantis, et al., J Am Chem Soc. 125(38):11476-11477 (2003)]; 알파-아스파르틸 디펩티다제(dipeptidase), [Kong, et al., Biochem Biophys Res Commun. 289(1):137-142 (2001)]; 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, [Rothman, et al., Protein Science 13(3):763-772 (2004)]; L-아스파르타제(aspartase), [Wang, et al., Biochem Biophys Res Commun. 276(1):346-349 (2000)]; 및 락테이트 디히드로게나제(dehydrogenase), [Wilks, et al., Biochemistry 31(34):7802-7806 (1992)])에 대한 지향성 진화 및 기타 "무작위" 돌연변이유발 방법을 사용하여 성공적인 돌연변이체들이 수득되었다.

이러한 연구들은 "무작위" 돌연변이유발 기술을 증가된 안정성, 활성 및 분해 경로에 대한 저항성이 있는 개선된 효소 변이체의 개발에 적용하는 것의 유용성을 반복적으로 실연하였다. 진화된 단백질 클론의 구조 분석은 수득되는 개선된 물리적 및 화학적 성질과 관계되는 분자적인 변화에 대한 통찰에 이른다 ([Orencia, et al., Advances in Protein Chemistry: Evolutionary Protein design, F.H. Arnold, Editor, Academic Press: San Diego, pp. 227-259 (2001)]). 지향성 진화 기술로 수득되는 이익은 비-활성 부위 잔기를 수반하는 이로운 돌연변이의 반복된 발생의 견지에서 특히 자명하고, 이때 효소 활성 부위 영역으로부터 15-20 Å에 걸쳐 위치하는 일부 돌연변이 부위에 이로운 효과가 있다 ([Oue, et al., J. Biol. Chem. 274(4) :2344-2349 (1999)]). 선별 및 스크리닝 절차와 커플링된, 지향성 진화 및 기타 무작위 돌연변이유발 기술은 산업적 용도에서 또는 별법적으로 효소 치환 치료법 (예를 들어, PKU)을 위해 사용될, 단백질분해적으로 더욱 안정적이고 화학적으로 더욱 로버스트한(robust) 형태의 PAL을 개발하는데 사용될 수 있다.

E. 변형된 PAL

변형된 형태의 PAL, 예컨대 PAL 돌연변이체 ([Schuster, et al., FEBS Lett. 349(2):252-254 (1994)]; [Schuster, et al., Proc Natl Acad Sci USA 92(18):8433-8437 (1995)]; [Langer, et al., Biochemistry 36:10867-10871 (1997)]; [El-Batal, et al., Acta Microbiol Pol. 49(1):51-61 (2000)]; [Roether, et al., Eur. J. Biochem. 269:3065-3075 (2002)]) 및 HAL 돌연변이체 ([Taylor, et al., J. Biol. Chem. 269(44):27473-27477 (1994)]; [Baedeker, et al., Eur. J. Biochem. 269(6):1790-1797 (2002)])가 기존의 실험들에서 기술되었다.

PAL 동역학의 최적화 - 촉매 활성이 강화된 원핵생물 돌연변이체

PAL 동역학 특징을 최적화하기를 원한다면 본 발명에 따른 야생형 PAL의 생물학적으로 활성인 부위가 변형될 수 있다. 절반-최대 활성을 제공하는 기질의 농도인 Km은 Phe 수준을 허용되는 범위, 즉, 120 μM 내지 240 μM 내에서 유지하는 것에서의 PAL의 치료적 효능과 밀접하게 관련된다. Km은 기질에 대한 효소의 친화력이다. 친화력을 제어함으로써, 상이한 농도에서 기질에 대한 모든 효소의 효능을 제한하거나 제어할 수 있다. 예를 들어, Km이 1000 μM이라면 (로도스포리디움 토룰로이데스), 효소의 활성이 240 μM의 혈액 Phe 수준에서는 약 12.5％로, 60 μM의 혈액 Phe 수준에서는 약 3 ％로 감소될 것이다. Km이 240 μM이라면, 효소의 활성이 240 μM의 혈액 Phe 수준에서는 약 50％로, 60 μM의 혈액 Phe 수준에서는 약 12 ％로 감소될 것이다. Km이 120 μM이라면, 효소의 활성이 240 μM의 혈액 Phe 수준에서는 약 70％로, 60 μM의 혈액 Phe 수준에서는 약 35 ％로 감소될 것이다. 최적으로는, 치료적 목표물은 Phe를 감소시키지만 또한 약 120 μM 내지 약 240 μM의 최적 범위 내에서 유지시키는데 충분한 활성이 있는 효소일 것이다. Km이 높은 (즉, Km이 1000 μM인) 효소는 Phe 수준이 정상 수준 내로 떨어짐에 따라 급속하게 활성을 잃을 것이고, 또한 고도로 농축된 용량 또는 대형 부피의 용량의 비실용적인 투여를 또한 필요로 할 것이다. 반면에, Km이 매우 낮은 효소는 Phe 수준을 급속하게 결핍시킬 수 있고, 이는 고페닐알라닌혈증에 대해서는 치사성일 수 있지만, 암의 관리에서는 유용할 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 변형된 PAL은 kcat이 약 0.1 s-1 이상 또는 약 0.5 s-1 초과이다. 또다른 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 변형된 PAL은 kcat이 약 0.2 s-1 이상 또는 약 1.0 s-1 초과이다. 또다른 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 변형된 PAL은 Km이 약 10 μM 내지 약 1000 μM이다. 또다른 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 변형된 PAL은 Km이 약 100 μM 내지 약 1000 μM이다. 또다른 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 변형된 PAL은 야생형의 활성보다 약 2배 내지 약 1000배 더 큰 효소 활성을 나타낸다. 또다른 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 변형된 PAL은 야생형의 활성보다 약 10％ 내지 약 100％ 더 높은 효소 활성을 나타낸다. 당업계에 주지된 방법을 사용하여, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발에 의해 이같은 생물학적으로 활성인 변형된 PAL 단백질이 형성될 수 있다.

HAL 내의 모든 활성 부위 잔기는 각각 발린 및 글루타민 잔기로 교체되는 H83 및 E414를 제외하고는 모두 EncP 내에 존재하는 것으로 나타났다 ([Xiang, L., et al., J. Biol. Chem. 277:32505-3250924 (2002)]). 활성 부위에서 L-히스티딘의 이미다졸 모이어티에 결합하여 이를 배향시키는 것 및 효소에 결합된 양이온성 중간체를 안정화시키는 것에서의 HAL 내의 H83의 역할이 연구되었다 ([Xiang, et al., J. Bacteriology 187(12):4286-4289 (2005)]; [Xiang, et al., J. Bacteriology 188(14):5331 (2006)]). E414의 카르복실레이트 기는 촉매작용에서 염기로서 작용할 수 있다는 것이 제안되었다. 연구에서, EncP에 의한 신남산 형성에 대한 V83의 기여를 평가하기 위해 부위-지정 돌연변이유발에 의해 EncP 돌연변이체가 생성되었다. 발린을 히스티딘으로 교체하여 돌연변이체 V83H가 생성되었고, 이는 PAL 활성에서의 손실을 특징으로 하였다. 발린을 알라닌으로 교체하여 돌연변이체 V83A이 생성되었고, 이는 야생형 EncP보다 더욱 활성이었다. V83A는 야생형 효소에 대한 23 μM에 비해 120 μM의 Km으로 L-페닐알라닌에 대한 친화력이 약간 더 낮았다. 그러나, 야생형 EncP와 비교했을 때, V83A는 야생형 효소보다 kcat이 더 높았고 더 활성이었다.

특정 단백질 변이체 : 면역원성이 감소된 변이체

단백질 면역원성을 감소시키기 위해 다수의 전략이 현재 사용된다. 일부 실시양태에서, 면역 응답을 최소화하기 위해 도입되는 변형은 거대분자의 구조, 기능 또는 안정성을 파괴하지 않는다. 사용되는 효과적인 전략에는 인간 서열 함량을 증가시키는 것 (키메라 및/또는 기타 '인간화' 접근법), 용해 성질을 개선시키는 것, 항체 에피토프를 제거하는 것, 화학적 유도체화 (예컨대 PEG화)를 도입하는 것, 및/또는 MHC 애그리토프(agretope)를 확인하고 제거하는 것이 포함된다. 주사 치료제에 대해, 단독으로 및 단백질 면역반응성을 허용되는 수준으로 감소시키기 위한 부위-특이적 PEG화 ([Hershfield, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7185-7189 (1991)]; [Leong, et al., Cytokine 16(3):106-119 (2001)]; [Lee, et al., Pharm. Res. 20(5):818-825 (2003)]) 또는 기타 화학적 유도체화 방법과 조합하여, 에피토프 매핑에 이어서 논리적인 돌연변이유발을 수행하여 이러한 면역원성 부위를 변형시키고/시키거나 다른 방식으로 돌연변이시킴으로써 생체내 면역반응성을 다룰 수 있다. 항원성 표면 단백질 영역의 변형은 면역원성을 감소시킨다 ([Chirino, et al., Drug Discov. Today 9(2):82-90 (2004)]). 한 개선 방법은 촉매 활성 (예를 들어, 흡광도 분석법이 활성 측정에 사용됨)을 유지하는 더 작은 크기의 단백질의 구축을 수반한다. 두번째 개선 방법인, ELISA 스크리닝과 커플링된 단백질 조작이 면역반응성이 감소된 돌연변이체를 확인하는데 또한 사용될 수 있다. 또다른 방법은 PEG화 유도체화를 위한 추가적인 표면 Lys 부위를 위한 점 돌연변이를 도입하고, 이 방법은 테스트 효소 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제(phosphorylase)로 면역원성을 감소시키는 것으로 나타났다 ([Hershfield, et al. (1991) 동일 문헌]). 별법적인 경로는 단백질 에피토프 영역 내에 위치하는 잔기의 돌연변이를 사용하여 면역원성 부위를 제거한다 ([Yeung, et al., J Immunol. 172(11):6658-6665 (2004)]). 항체 인간화와 유사한 접근법에서, 인간 항체로부터의 상동성 루프 영역 및/또는 잔기가 상동성 단백질의 상응하는 루프 영역 내로 치환된다.

단백질의 용해 성질을 개선시키는 것은 특이적 효소 활성을 증가시키고/시키거나 면역활성을 감소시킬 수 있다. 박테리아에서 발현된 재조합 단백질에 전형적인 한 용해 성질은, 예를 들어 사슬간 디술피드 결합 형성, 소수성 상호작용 및/또는 2가 양이온으로 인한, 단백질 응집물의 형성이다 ([Chi, et al., Pharm Res 20(9):1325-1336 (2003)]). 재조합에 의해 발현된 단백질의 응집은 면역 응답을 강화시킬 수 있다 ([Hermeling, et al., Pharm Res 21(6):897-903 (2994)]; [Schllekens, Nephrol Dial Transplant 20(suppl 6):vi3-9 (2005)]). 한 개선 방법은 사슬간 디술피드 결합 형성의 가능성을 최소화하기 위해 표면 시스테인 잔기를 다른 아미노산 잔기 (예를 들어, 세린)으로 치환하는 것을 수반한다. 예를 들어, 2개의 표면 시스테인 잔기의 세린 잔기로의 치환은 코리스메이트 리아제의 응집을 감소시켰고, 이때 효소 활성에 대한 효과는 미미하였다 ([Holden, et al., Biochim Biophys Acta 1594(1):160-167 (2002)]).

프로테오솜성 프로세싱을 방지하고, 이에 의해 항원 제시 세포 결합을 위한 펩티드 단편으로의 절단 및 프로세싱을 방지함으로써, 단백질 치료제의 단백질분해성 프로세싱 부위의 제거가 면역원성에서의 감소를 또한 제공할 수 있다. 클래스 II MHC 결정인자에 대한 플랭킹(flanking) 영역이 변경되어, 자가반응성 T 세포에의 디스플레이를 방지하는 것에서 유사한 현상이 관찰되었다 (Maverakis, et al., Proc Natl Acad Sci, USA 100(9):5342-5347 (2003)]).

에피토프 매핑

단백질 치료제의 에피토프를 다수의 알고리즘을 사용하여 계산할 수 있거나 또는 시험관내 또는 생체내 접근겁으로 실험적으로 결정할 수 있다. DNAStar로부터의 Lasergene 프로그램 내의 "Peptide Companion" 및 "Protean"과 같은 컴퓨터 프로그램이 단백질의 화학 조성 및 형상을 기초로 단백질의 표면 에피토프 영역을 추정하는데 통상적으로 사용된다. 단백질 서열의 면역원성 영역은 친수성 지수를 기초로, 계산된 친수성이 가장 높고, 계산된 표면 단백질 영역의 양친매성(amphipathicity) 및 기타 형상 파라미터를 기초로, 항원성이 가장 높은 영역이다. 별법적으로, 단백질 서열 내의 애그리토프는 잠재적인 HLA 결합의 컴퓨터-모델링 예측을 기초로 위치가 정해질 수 있다 ([Robinson, et al., Nucleic Acids Res. 31(1):311-314 (2003)]; [De Groot, et al., Novartis Found. Symp. 254:57-72 (2003)]). 또한, 시험관내 생화학적 방법 ([Tangri, et al., Curr. Med. Chem. 9(24):2191-2199 (2002)]) 및 시험관내 세포-기반 방법 ([Stickler, et al., J Immunother. 23(6):654-660 (2000)]; [Stickler, et al., J Immunol Methods 281(1-2):95-108 (2003)])을 사용하여 에피토프를 확인할 수 있다. 단백질 조작을 위해, [Stickler, et al., Toxicol Sci. 77(2):280- 289 (2004)]의 시험관내 세포-기반 분석법과 유사한 분석법을 사용하여 면역원성에서의 상대적인 감소를 모니터링할 수 있다.

Pepscan 분석 (에피토프 매핑)은 효소 서열의 표면 영역을 커버하는 중첩 펩티드들의 라이브러리를 사용하고, 전체 효소 단백질 서열을 커버하는 중첩 펩티드들에 대해 생성된 토끼 폴리클로날 항체로 프로빙함으로써, 효소 내에 존재하는 선형 에피토프를 밝히는 것을 수반한다. 효소의 3차원 구조를 기초로, 에피토프 인식 부위를 제거하기 위해 에피토프 영역 잔기들을 무작위로 돌연변이시킴으로써, 또는 이러한 에피토프 부위 근처의 표면 상에 Lys 또는 Cys 잔기를 도입하여, 이러한 부위들을 커버하고 면역원성 인식으로부터 보호하기 위한 PEG화를 위한 부위를 제공하기 위해 부위-특이적 돌연변이를 사용함으로써, 실험적으로 확인된 항원성 부위들이 돌연변이된다. 이러한 잠재적으로 비-면역원성인 효소 돌연변이체들 (또는 이러한 효소 돌연변이체들의 PEG화 형태물)의 ELISA 스크리닝은 감소된 면역반응성을 디스플레이하는 효소 돌연변이체들의 하위집합의 시험관내 확인을 제공한다.

표면 잔기 확인 및 돌연변이

효소의 면역원성 영역 내의 또는 근처의 표면-노출 잔기를 확인할 수 있다. 표면에의 근접성, 뿐만 아니라 면역원성/항원성 영역에의 근접성에 따라, 이러한 위치들은 단백질 내에 존재하는, 용매가 접근가능한 전체 표면 위치들의 하위집합일 것이다. X선 결정학, NMR 또는 상동성 모델링을 사용하여 결정된 단백질의 3차원 구조를 시판되는 소프트웨어 프로그램에서 사용하여 거대분자의 용매-접근가능 표면 구역을 계산할 수 있다. GETAREA 1.1 프로그램 ([Fraczkiewicz, et al., J. Comp. Chem. 19:319-333 (1998)])을 사용하여 제공된 결과는 로도스포리디움 토룰로이데스 PAL에 대한 용매 접근성의 신뢰할 수 있는 추정값을 제공한다. GETAREA 및 PARAREA 및 유사 프로그램은 가우스-보네(Gauss-Bonnet) 정리를 기초로 하는 파라미터 접근법과 함께 연속체 방법을 사용하여 용매-접근가능성 표면 구역을 계산한다. PARAREA는 각각의 원자의 이웃 목록 내의 모든 원자쌍을 사용하여 가우스-보네 경로에서 잠재적인 교차점을 확인하는 반면, GETAREA는 2개의 구의 교차 평면에 의해 정의되는 교차 절반-공간을 사용하여 용매-노출 정점을 더욱 효율적으로 계산한다.

천연 PAL에서, GETAREA로 사량체성 PAL 단백질 표면 전반에 걸쳐 분포된 12개의 표면-노출 Lys 잔기, 뿐만 아니라 1개의 부분적으로 노출된 표면 Cys 잔기 (Cys140)이 확인되었다. 이러한 위치들이 PEG화 유도체화에 직접적으로 이용가능하다. 또한, PAL의 3차원 구조를 사용하여, 부위-지정 돌연변이유발에 이용가능한 추가적인 표면 잔기를 확인할 수 있다. 감소된 면역원성, 개선된 단백질분해 저항성 및/또는 개선된 안정성/활성이 있는, 더욱 유리한 PAL 돌연변이체가 생성되도록 이러한 추가적인 부위들을 표준 단백질 조작 기술을 사용하여 돌연변이시킬 수 있다.

성질이 개선된, 예컨대 면역원성이 감소된 단백질 돌연변이체를 제공하기 위한 단백질의 돌연변이를 위한 전략이 당업계에 공지되어 있다. 한 대중적인 경로는 에피토프 내의 모든 비-알라닌 잔기를 Ala로 돌연변이시키고, 에피토프 내의 모든 알라닌 잔기를 Gly로 돌연변이시킨다. 또다른 방법은 돌연변이 또는 결실에 의해 에피토프 영역으로부터 전하를 띤 잔기 및 소수성 잔기를 제거한다. 추가적인 돌연변이 전략에서는 부위-특이적 돌연변이를 도입한 후, 부위-특이적 화학적 유도체화가 이어진다.

단백질 개선을 일으키기 위해 말단절단이 또한 사용될 수 있다. 히스티딘 암모니아-리아제 (HAL)에 비교된 PAL의 생물정보학 분석은 말단절단 돌연변이체 (잔기 23-716 및 1-564)를 제안하였다. 또한, PAL 3-D 구조의 분석은, 고도로 상동성인 HAL 단백질의 구조에서의 C-말단 도메인 영역의 부재를 기초로, 말단절단을 위한 별법적인 영역을 제공한다. PAL 구조의 C-말단 도메인 돌출 영역 (주요 에피토프 영역이 있는 것으로 계산됨)을 치환하기 위해 HAL로부터의 상응하는 루프 영역이 PAL 서열 내로 융합된 돌연변이체가 포함되는 C-말단 도메인 결실 돌연변이체는 PAL의 더 작고, 더욱 로버스트하며, 덜 면역원성인 것으로 예측되는 변이체를 형성한다.

또다른 방법에서, 지향성 진화와 함께 논리적인 돌연변이유발을 사용하는 단백질 조작이 PAL의 돌연변이체 형태를 수득하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 실험적 및 조합형 디자인과 함께 실행된 논리적인 디자인은 콤프스타틴(compstatin)의 활성을 개선시켰다 ([Morikis, et al., Biochem. Soc. Trans. 32(1):28-32 (2004)). 논리적인 돌연변이유발과 지향성 진화의 조합은 전망을 또한 나타냈다 ([Bornscheuer, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2):137-143 (2001)]; [Dwyer, et al., Science 304(5679):1967-1971 (2004)]).

지향성 분자 진화의 단백질 조작 방법을 사용하여 최적의 효소 활성 미만의 활성을 나타내는 PAL의 돌연변이체 형태가 활성에 대해 진화될 수 있고, 이때 무작위 돌연변이유발 단계에 활성인 돌연변이체에 대한 선별 절차가 이어져서, 활성이 있는 클론들만의 새로운 단백질 돌연변이체 풀(pool)이 생산된다. 예를 들어, 특정 돌연변이체 PAL (구조물의 에피토프-함유 영역 근처에 표면 라이신 잔기를 도입하도록 본 발명가들이 디자인한 것)이 불활성인 경우, 이러한 돌연변이체의 지향성 진화의 수행 (불활성 돌연변이체를 돌연변이시키고 활성이 있는 형질전환체를 선별함)으로 이러한 이로운 돌연변이 (표면 라이신 부위) + 각각의 활성 클론에 활성을 복원시키는, 구조물 전반에 걸쳐 위치하는 추가적인 무작위 돌연변이들의 하위집합을 함유하는 새로운 돌연변이체 풀이 생성된다. 또한, 동일한 단백질의 상이한 종들 또는 상이한 단백질들의 유사한 서열들을 교차시킬 수 있는 분자 육종의 지향성 진화 기술 ([Crameri, et al., Nature, 391:288-291 (1998)]; [Minshull, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 3(3):284-290 (1999)])은 PAL의 가장 면역원성인 영역들 중 일부를 면역계에 의해 인식되지 않을 인간 서열로 교체하도록 인간 히스티딘 암모니아-리아제의 서열로 치환할 수 있다.

반(半)-논리적 접근법을 기초로 하이브리드 단백질 변이체를 제조하여 순수한 지향성 진화-기반 방법에 비해 더욱 지향성인 수준의 단백질 디자인을 허용함으로써, 뿐만 아니라 이같은 편향된 단백질 조작 접근법을 사용하여 확인된 단백질 구조물의 영역들에 대한 더욱 무작위 수준의 돌연변이성 조작을 제공함으로써, PAL의 돌연변이체 형태들을 수득할 수 있다. 예를 들어, PDA 방법에서, 단백질 변이체들의 컴퓨터처리로 예비-스크리닝된 라이브러리가 생성되어, 순수한 무작위, 또는 비-편향 단백질 조작 방법에 비해 단백질 성질의 더욱 신속한 최적화를 허용한다 (미국 특허 번호 6,403,312; [Dahiyat, Curr Opin Biotechnol. 10(4):387-390 (1999)]; [Filikov, et al., (2002) 동일 문헌]; [Hayes, et al., (2002) 동일 문헌]; [Luo, P., et al., (2002) 동일 문헌]). 유사하게, SCOPE 방법에서는 구조물의 "등가"의 서브도메인을 기초로 하이브리드 효소 변이체가 구축되어, 비-상동성 유전자로부터 시작되는 다중 교차 단백질 변이체 라이브러리의 생성을 허용한다 ([O'Maille, et al., (2002) 동일 문헌]). 유사한 방식으로, Voigt 등에 의해 개발된 방법에서는, 단백질의 단편을 확인하는 컴퓨터 알고리즘의 적용 또는 '스키머(schema)'을 기초로 하이브리드가 구축되고, 이는 단백질의 3차원 구조의 통합성을 파괴하지 않으면서 재조합될 수 있다 ([Voigt, et al., (2002) 동일 문헌]). 2차 구조 요소 평가를 기초로, 단백질 폴드 내의 구조적으로 및 기능적으로 중요한 위치의 보존된 코어(core) 영역을 컴퓨터 분석으로 또한 확인할 수 있다 ([Mizuguchi, et al., Bioinformatics 16(12):1111-1119 (2000)]). 당업계의 방법들 중 임의의 것의 절차를 따라 PAL의 돌연변이체 형태들을 수득할 수 있다.

별법적인 효소 대용물로서의 HAL

스트렙토마이세스 마리티무스로부터의 encP의 구조를 슈도모나스 푸티다 HAL의 구조를 기초로 상동성-모델링하였다. PAL보다 작긴 하지만, 스트렙토마이세스 마리티무스의 구조는 인간 PAL에 더욱 유사하여, encP를 PAL 단백질 조작을 위해 사용하기 위한 아마도 덜 면역원성일 형태의 암모니아-리아제가 되게 한다. 비-면역원성 PAL 변이체를 수득하기 위한 별법적인 방법은 돌연변이에 이은 PAL 활성이 있는 encP 또는 기타 원핵생물 돌연변이체의 선별을 사용하여 "인간화" encP 또는 기타 원핵생물 PAL 단백질 (돌연변이 및 활성에 대한 선별 단계 후에 추가로 PEG화될 수 있음)을 수득하는, 면역원성 서열을 인간 히스티딘 암모니아-리아제 서열 (HAL, [Suchi, et al., Biochim. Biophys. Acta 1216(2):293-295 (1993)])로 교체하기 위한 스트렙토마이세스 마리티무스 encP 또는 기타 원핵생물 PAL의 돌연변이를 수반한다.

특정 단백질 변이체 : 프로테아제 감도가 감소된 변이체

단백질 프로테아제 감수성을 감소시키기 위해 다수의 전략이 현재 사용된다. 일부 실시양태에서, 단백질분해 감도를 최소화하도록 도입된 변형은 거대분자의 구조, 기능 또는 안정성을 파괴하지 않는다. 효과적인 전략에는 효소에 활성-부위 안정화 종 예컨대 경쟁적 억제제를 제공하는 것 ([Gilbert, et al., (1981) 동일 문헌]; 미국 특허 번호 6,548,644; 6,451,986; 6,433,158; 6,461,849), 감수성 Lys 및/또는 Arg 부위 내의 아미노 기를 화학적으로 변형시켜 트립신 결합 부위를 차단하는 것, 키모트립신-민감성 Tyr, Phe, 및/또는 Trp 잔기를 더 작은 중성 아미노산으로 돌연변이시켜 절단 감수성을 폐지시키는 것, PAL을 또다른 보호성 거대분자 (예컨대 Fc 항체 도메인 또는 보툴리눔 신경독 비-독성 성분)에 결찰 또는 커플링시키는 것, 및/또는 이어지는 PEG 또는 또다른 화학적 보호기 또는 안정화기로의 화학적 유도체화를 위해 프로테아제 감수성 부위 근처에 Lys 또는 Cys 부위를 도입하는 것이 포함된다.

F. 화학적으로 변형된 PAL 변이체

거대분자의 화학적 변형을 비-특이적 방식 (유도체화 종들의 혼합물에 이름)으로 또는 부위-특이적 방식 (부위-지정 돌연변이유발 및 화학적 변형의 조합을 사용하는 야생형 거대분자의 반응성-지향성 유도체화 및/또는 부위-선별적 변형을 기초로 함)으로, 또는 별법적으로 발현 단백질 결찰 방법 ([Hofmann, et al., Curr Opin Biotechnol. 13(4):297-303 (2002)])을 사용하여 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적 변형이 면역원성을 감소시키기 위해 사용된다. PEG화가 단백질의 면역원성을 감소시키는 증명된 방법이지만 ([Bhadra, et al., Pharmazie 57(1):5-29 (2002)]), 글리코실화 및 기타 화학적 유도체화 절차 (인산화, 아미드화, 카르복실화, 아세틸화, 메틸화, 산 부가 염, 아미드, 에스테르 및 N-아실 유도체의 생성으로의 변형 사용)가 또한 가능하다 ([Davis, Science 303:480-482 (2004)]).

PEG 화 단백질

광범위한 PEG 화학 시약 대 PAL 단백질 비율을 사용하는, PAL에 대한 일련의 상이한 PEG화 반응이 각각의 변형 방법에 PEG-PAL 유도체를 제공할 것이다. PEG 유도체화의 정도를 결정하기 위한 PAGE 및 천연 젤 분석과 조합된 흡광도 분석을 사용하여 각각의 유도체화 PAL 종에 대해 수득된 잔여 활성을 기초로 최적의 PEG화 정도를 결정할 수 있다. 최적 변형의 초기 범위를 결정한 후, 최적의 PEG-PAL 종의 동역학 비교 분석 (Vmax 및 Km 결정, 기질의 결합 상수, 단백질분해 안정성, 활성의 pH 의존성, 활성의 온도 의존성 포함) 및 면역반응성을 ELISA, 면역침전, 및 웨스턴 블롯에 의해 결정할 수 있다. 최적의 유도체화 조건을 사용하는 PEG화를 위한 가장 유리한 PAL 돌연변이체를 생성시키는데 단백질 조작을 또한 사용할 수 있다; PAL 단백질의 크기를 최소화시키고, PAL 표면의 가장 항원성인 영역만을 변형시킴으로써, 최대량의 효소 활성 및 최소량의 면역원성을 유지하면서 동시에 PEG 변형 비용이 감소될 것이다. 유사하게, 효소 유도체를 제공하기 위해 부위-특이적 PEG화를 사용할 수 있다.

또다른 화학적 변형 예컨대 Lys, Arg, 및 Cys 잔기의 인산화 또는 또다른 화학적 변형이 면역원성 영역 및/또는 단백질분해 민감성 영역을 차폐하는데 사용될 수 있다. 이같은 화학적 변형에는 대표적인 예인, Bednarsaki의 중합체 부가 방법, 및 PAL 안정성 개선, 면역원성 감소 및 프로테아제 저항성 개선을 위한 Altus Corporation의 가교 방법이 포함된다. Bednarsaki는 중합체 부가가 단백질 온도 안정성을 개선시킨다는 것을 실연하였고 ([Wang, et al., J. Am. Chem. Soc. 114(1):378-380 (1992)]), Altus Corporation은 글루타르알데히드 가교가 효소 안정성을 개선시킨다는 것을 발견하였다.

PAL과 같은 단백질의 생체내 치료 반감기에 PEG화가 이로울지를 알아내기 위해, 다양한 상이한 PEG:PAL 접합체들을 합성하고, 시험관내에서 특성화하고, L-Phe 감소에 대해 생체내에서 테스트하였다. PEG화의 잠재적인 효과의 최적화 및 바람직한 PEG 부착 부위의 확인 양쪽 모두를 위해, 중합체 길이, 형상 및 PEG 부착 정도가 다양한 디자인 전략이 사용된다.

본 발명의 PEG화 PAL 제조 방법은 (a) PAL이 하나 이상의 PEG 기에 부착되는 조건 하에 PAL을 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계, 및 (b) 반응 생성물(들)을 수득하는 단계를 포함한다. 특정 PAL 변형 부위는 접합체의 고유의 활성을 현저하게 변경시킬 수 있기 때문에, 여러 유형 및 양의 PEG를 조사하였다. PAL의 PEG화에 사용된 화학은 메톡시-PEG (O-[(N-숙신이미딜옥시카르보닐)-메틸]-O'-메틸폴리에틸렌 글리콜)의 NHS-에스테르를 사용하는 PAL의 1차 아민의 아실화였다. 메톡시-PEG-NHS 또는 메톡시-PEG-SPA로의 아실화로 아미드 결합이 초래되고, 이는 원래의 1차 아민으로부터 전하를 제거한다.

본 방법은 중합체:단백질 접합체의 실질적으로 균질한 혼합물을 제공한다. 본원에서 사용된 "실질적으로 균질한"은 단 하나의 중합체:단백질 접합체가 관찰된다는 것을 의미한다. 중합체:단백질 접합체는 생물학적 활성이 있고, 본원에서 제공된 이러한 "실질적으로 균질한" PEG화 PAL 제제는 균질한 제제의 장점, 예를 들어, 로트 대 로트 약동학의 예측성에서의 임상 용도에서의 용이성을 나타내는데 충분한 제제이다.

본원에 기술된 PEG화 접근법에서 사용하기 위해 구현되는 중합체 분자는 수용성 중합체들 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 폴리-(N-비닐 피롤리돈), 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸린 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), HPMA, 플렉시머(Fleximer)™, 및 폴리비닐 알콜, 모노-(C1-C10)알콕시-PEG, 아릴옥시-PEG, 트레실 모노메톡시 PEG, PEG 프로피온알데히드, 비스-숙신이미딜 카르보네이트 PEG, 셀룰로스, 또는 기타 탄수화물계 중합체로 예를 들어 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 선택된 중합체는 자신이 부착되는 단백질이 수성 환경, 예컨대 생리 환경에서 침전되지 않도록 수용성이어야 한다. 중합체는 분지형 또는 비-분지형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 최종 생성물 제제의 치료적 사용을 위해, 중합체는 제약상 허용가능하여야 한다.

일부 실시양태에서, 본원에서 사용하기 위한 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG로 약기)이다. 본원에서 사용된 폴리에틸렌 글리콜은 다른 단백질을 유도체화시키는데 사용된 PEG 형태들 중 임의의 것, 예컨대 모노-(C1-C10)알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜을 포함하도록 의도된다.

폴리에틸렌 글리콜 분자 대 단백질 분자의 비율은 다양할 것이고, 반응 혼합물 내의 이들의 농도도 그러할 것이다. 일반적으로, 최적의 비율 (과량의 미반응 단백질 또는 중합체가 없는 반응의 효율의 관점에서)은 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량에 의해, 그리고 존재하는 이용가능한 반응성 기 (전형적으로, ε 아미노기)의 개수에 대해 결정될 것이다. 분자량과 관련하여, 일반적으로, 사용된 중합체의 분자량이 높을수록, 단백질에 부착될 수 있는 중합체 분자의 숫자가 적어진다. 유사하게, 이러한 파라미터들을 최적화할 때 중합체의 분지화를 고려하여야 한다. 일반적으로, 분자량이 높을수록 (또는 분지가 많을수록), 중합체:단백질 비율이 높아진다. 5 kDa 및 20 kDa을 포함하지만 이에 한정되지 않는 여러 상이한 선형 PEG 중합체 길이, 10 kDa 및 40 kDa을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 팔이 2개인 분지형 PEG 중합체의 접합체가 본 발명에서 구현된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 구현되는 PEG화 반응에 대해, 평균 분자량은 약 2 kDa 내지 약 100 kDa 이다 (용어 "약"은 +/-1 kDa을 가리킴). 또다른 실시양태에서, 평균 분자량은 약 5 kDa 내지 약 40 kDa이다. 수용성 중합체 대 PAL의 비율은 일반적으로 모노PEG에 대해 1:1, 디PEG에 대해 2:1 등의 범위일 것이다.

실시예 6 내지 8은 12일 기간에 걸친 ENU2 또는 BTBR^enu2 마우스에서의 페닐알라닌 수준에 대한 PEG화 및 비-PEG화 형태의 로도스포리디움 토룰로이데스로부터의 라이신 돌연변이체 R91K PAL, 시아노박테리움 노스톡 푼크티포르메에 의해 생산된 PAL (NpPAL), 및 시아노박테리움 아나바에나 바리아빌리스에 의해 생산된 (AvPAL)의 효과를 기술한다. 이러한 동물 모델은 중증 고페닐알라닌혈증에 걸린 동물을 초래하는 페닐알라닌 히드록실라제 유전자 (PAH) 유전자좌에서의 동종접합성 돌연변이체이다. 따라서, 높은 혈장 페닐알라닌 (Phe) 수준은 이러한 동물이 혈장 Phe를 감소시키는 페닐알라닌 암모니아-리아제 (PAL)의 능력을 평가하기 위한 적합한 모델이게 만든다. 이러한 PKU 동물 모델에서의 페닐알라닌 수준에 대한 PEG화 및 비-PEG화 형태의 라이신 돌연변이체 R91K PAL 및 NpPAL의 효과를 90일 기간에 걸쳐 또한 평가하였다. 결과는 PEG화 형태의 NpPAL 및 AvPAL가 비-PEG화 NpPAL 및 AvPAL 각각과 비교하여 PKU 동물 모델에서 페닐알라닌의 더 큰 감소를 초래하였음을 나타냈다. 또한, 상승된 페닐알라닌 수준을 감소시키는 PEG화 NpPAL의 이같은 효과가 10주 기간에 걸쳐 유지되었다. 이러한 연구들은 시아노박테리아, 노스톡 푼크티포르메 및 아나바에나 바리아빌리스로부터의 PAL의 PEG화가 PKU에 걸린 마우스에서 페닐알라닌 수준을 감소시키는데 필수적이라는 것을 나타낸다. 이러한 발견은 박테리아 PAL의 PEG화 변이체가 PKU의 관리에서 효과적인 치료제로 작용할 수 있음을 시사한다.

면역원성이 감소된 PEG화 PAL 변이체가 본 발명에서 구현된다. 한 실시양태는 면역원성이 감소된 PEG화 형태의 노스톡 푼크티포르메 PAL (NpPAL) 변이체이다. 또다른 실시양태는 면역원성이 감소된 PEG화 형태의 아나바에나 바리아빌리스 PAL (AvPAL) 변이체이다. NpPAL 또는 AvPAL 변이체를 수용성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 반응시킴으로써 PEG화가 달성되는 NpPAL 또는 AvPAL 변이체가 특정 실시양태에서 구현된다. 일부 실시양태에서, NpPAL 또는 AvPAL 변이체를 1:1 이상, 1:1.5 이상, 1:2 이상, 1:3 이상, 또는 1:4 이상의 PAL:PEG의 비율로 PEG와 1회 반응시킴으로써 PEG화가 달성된다. 한 실시양태에서, PAL 변이체는 AvPAL 변이체이고, 1:3의 PAL:PEG 비율을 사용하여 PEG화가 달성된다. 상기에 본 발명의 PEG화 PAL 변이체의 제조 방법이 기술되어 있다.

감소된 면역원성을 위해 PEG화 PAL 변이체를 재-PEG화시키는 것이 본 발명에서 또한 구현된다. 일부 실시양태에서, 각각의 PEG화를 1:1 이상, 1:1.5 이상, 1:2 이상, 1:3 이상, 또는 1:4 이상의 PAL:PEG의 비율로 하여 NpPAL 또는 AvPAL 변이체를 PEG와 2회 이상 반응시킴으로써 PEG화가 달성된다. 일부 실시양태에서, 각각의 PEG화를 1:1 이상, 1:1.5 이상, 1:2 이상, 1:3 이상, 또는 1:4 이상의 PAL:PEG의 비율로 하여 NpPAL 또는 AvPAL 변이체를 2회, 3회, 4회, 5회 또는 그 이상으로 PEG와 반응시킴으로써 PEG화가 달성된다. 또다른 실시양태에서, PAL 변이체는 AvPAL 변이체이고, 제1 PEG화 반응 및 제2 PEG화 반응 양쪽 모두에 대해 1:3의 PAL:PEG 비율을 사용하여 PEG화가 달성된다.

본 발명의 재-PEG화 PAL 변이체의 제조 방법은 (a) PAL 변이체가 하나 이상의 PEG 기에 부착되는 조건 하에 PAL 변이체를 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계, (b) 반응 생성물(들)을 수득하는 단계, (c) PEG화 PAL 변이체가 단계 (a)로부터의 PEG가 차지하지 않은 위치에서 하나 이상의 PEG 기에 부착되는 조건 하에 PEG화 PAL 변이체를 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계, 및 (d) 반응 생성물(들)을 수득하는 단계를 일반적으로 포함한다. 특정 PAL 변형 부위는 PAL 변이체의 고유의 활성을 현저하게 변경시킬 수 있기 때문에, 여러 유형 및 양의 PEG를 조사하였다. PAL의 PEG화에 사용된 화학은 메톡시-PEG (O-[(N-숙신이미딜옥시카르보닐)-메틸]-O'-메틸폴리에틸렌 글리콜)의 NHS-에스테르를 사용하는 PAL의 1차 아민의 아실화였다. 메톡시-PEG-NHS 또는 메톡시-PEG-SPA로의 아실화로 아미드 결합이 초래되고, 이는 원래의 1차 아민으로부터 전하를 제거한다.

G. 선별 및 스크리닝 방법

활성 PAL 또는 HAL 변이체의 생산 및 선별을 위해, 초기의 돌연변이체 클론 발현은 임의의 공지된 벡터 발현 시스템, 예컨대 His-태그 벡터 발현 시스템을 활용하여, 단백질 변이체 단리를 위한 고처리량 금속 킬레이트 정제 단계를 용이하게 할 수 있다. 3단 스크리닝 시스템을 사용하여 유리한 단백질 변이체를 확인할 수 있다. 초기의 양성 클론 확인은 페닐알라닌 영양요구성 대장균 균주에서의 성장에 대한 형질전환 및 선별을 사용할 수 있다. 제2 라운드의 스크리닝은 고처리량 프로세싱을 받을 수 있는 OD290 흡광도 측정 ([Hodgins, Biochem. Biophys. Res. Commun., 32:246-253 (1968)])을 이용할 수 있다. 마지막으로, 단백질분해 저항성 에 대한 스크리닝 (프로테아제 칵테일의 존재 하에서의 인큐베이션을 사용함), 또는 별법적으로 면역원성 감소에 대한 스크리닝 (경쟁적 ELISA 측정을 사용함)이 유리한 단백질 변이체를 확인하는데 사용될 수 있다.

H. 최적화 PAL 단백질의 치료적 사용 및 투여

1. 고페닐알라닌혈증 ( HPA )의 각종 형태

본 발명은 HPA 및/또는 PKU를 관리하기 위해 PAL 조성물을 단독으로 또는 다른 치료법과 함께 사용하는 것을 포함하는 방법으로 다양한 HPA 환자 집단을 치료하는 것에 관한 것이다. 특히, 페닐알라닌 농도가 충분히 낮아서 식이 개입이 일반적으로 사용되지 않는 환자 집단 (즉, 경미한 HPA 환자), 중증 PKU 환자, 고전적 또는 중증 PKU 환자, 및 임의 임의의 하위집단을 치료하는데 PAL 조성물이 사용될 수 있다는 것이 구현된다. 경미한 HPA의 효과를 경감시키기 위해 PAL 조성물로의 치료를 받을 수 있는 이같은 환자에는 혈청 농도가 200 μM 미만인 임산부 및 유아가 포함된다. 다양한 환자 집단, 및 이들의 상이한 치료적 요구사항이 본 섹션에서 추가로 상세하게 논의된다.

본 발명의 특정 실시양태는 단백질-제한 식이를 PAL 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체, 돌연변이체 또는 단편을 포함하는 조성물과 조합하여 대상에게 투여함으로써 고전적인 중증 PKU를 치료하는 것에 관한 것이고, 이때 단백질-제한 식이 및 PAL의 조합 투여는 상기 대상의 혈장내 페닐알라닌 농도를 상기 조합 투여의 부재 하에서의 농도와 비교하여 저하시키는데 효과적이다. 또한, 단백질-제한 식이 및 PAL의 조합 투여가 임산부의 혈장내 페닐알라닌 농도를 상기 조합 투여의 부재 하에서의 농도와 비교하여 저하시키는데 효과적이도록, 단백질-제한 식이를 PAL 또는 이의 생물학적으로 활성인 유도체와 조합하여 여성에게 투여함으로써 HPA에 걸린 임산부를 치료하는 것이 본 발명에서 또한 구현된다. 특정 실시양태에서, 420 μM를 초과하는 Phe 수준을 나타내는 환자에게 치료법이 구현된다.

본 발명의 또다른 실시양태는 PAL의 투여 전에 180 μM을 초과하는 혈장 Phe 농도를 특징으로 하는 HPA에 걸린 임의의 개체에게 환자의 이같은 혈장 Phe 농도의 감소를 일으키는데 효과적인 양으로 PAL 조성물을 투여하는 것을 수반한다. 본 발명의 방법은 300 μM을 초과하는 상승된 Phe 농도를 특징으로 하는 PKU에 걸린 유아를 본원에 기술된 PAL 조성물로 치료하는데 유용할 것이다. 본 출원에서, "유아"는 연령이 0개월 내지 약 36개월인 환자를 지칭한다.

중증의 고전적 PKU 의 특징 및 이의 치료 방법

중증 PKU는 1200 μM 초과의 혈장 Phe 농도를 나타내고, 4800 μM만큼 높은 것으로 발견될 수 있다. 이러한 장애에 걸린 환자는 이들의 혈장 Phe 농도가 임상적으로 허용되는 수준 (전형적으로, 600 μM 미만 또는 300 μM 미만)이 되게 하기 위하여 Phe이 없는 식이로 치료되어어 한다. 이러한 환자들은 하루에 최대 250-350 mg의 식이 Phe만을 허용할 수 있다 ([Spaapen et al., Mol. Genet Metab. 78:93-99 (2003)]). 따라서, 이러한 환자들은 생후 7-10일 사이에 Phe-제한 조제식을 시작하여야 하고, 나머지 수명 동안 이러한 식이 제한이 부담지워진다. 이러한 개체들을 번거롭게 하는 엄격한 식이 제한의 모든 완화가 이로울 것이다.

고전적인 Phe의 개체의 진단에서 사용하기 위한 테스트들이 하기에 추가로 상세하게 기술된다. 이러한 테스트들은 고전적인 중증 PKU 환자들이 저-페닐알라닌 식이를 필요로 한다는 것을 드러냈다 ([Lucke et al., Pediatr. Neurol. 28:228-230 (2003)]). 따라서, 본 발명의 방법이 개체의 혈장 Phe 농도를 모니터링함으로써 환자가 고전적인 PKU를 앓고 있는지를 결정하는 것을 수반할 것으로 구현된다. 그후, 환자의 혈장 Phe 농도에서의 25％ 이상의 감소가 일어나도록 원핵생물 PAL 조성물을 단독으로 투여하거나 저-단백질 식이와 PAL의 조합 요법을 투여함으로써 환자를 치료한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 혈장 Phe 농도에서의 30％ 감소를 일으킬 것이다. 또다른 실시양태에서, 상기 방법은 개체의 혈장 Phe 농도에서의 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 그 이상의 감소를 일으킬 것이다 (예를 들어, 중증의 고전적인 PKU 환자의 Phe 농도가 4800 μM인 경우, Phe 농도에서의 90％ 감소로 혈장 Phe 농도가 식이 제한을 거의 필요로 하지 않도록 충분히 낮은 농도인 480 μM가 될 것이다). 물론, 본 발명의 치료 방법 (중증의 고전적인 PKU 또는 본원에 기술된 임의의 또다른 HPA의 치료를 위한 방법)이 환자의 혈장 Phe 농도를 가능한 한 약 120 μM 내지 약 360 μM ± 15 μM 의 범위에 가까운 수준으로, 또는 약 120 μM 내지 약 240 μM의 최적 범위로 저하시키도록 시도하여야 함을 이해하여야 한다.

일부 실시양태에서, 치료될 고전적인 PKU 환자의 혈장 Phe 농도가 1000 μM를 초과하는 제한되지 않은 혈장 Phe 농도의 임의의 양으로부터 600 μM 미만의 임의의 혈장 Phe 수준으로 감소된다. 물론, PAL 및 단백질-제한 식이의 조합 치료로 혈장 Phe 농도가 덜 감소되는 경우에도 (예를 들어, 800 μM 내지 약 1200 μM의 수준으로 감소), 혈장 Phe 농도가 이러한 범위 내인 환자는 Phe-제한 조제식을 먹는 것과 대조적으로 단순히 식이 내의 단백질의 양을 제한하는 것에 의해 질환을 관리할 수 있고, 이에 의해 개체의 삶의 질에서의 현저한 개선이 초래될 뿐만 아니라 식이 제한에 대한 더 큰 환자 순응도에 이르기 때문에, 이는 임상적으로 유용한 결과로서 간주될 것이다.

치료 결과로서의 환자가 허용할 수 있는 식이 Phe 수준의 양에서의 모든 증가는 치료적으로 효과적인 결과로 간주될 것이다. 예를 들어, PAL 치료법의 투여 결과로, 환자가 이의 식이 Phe 섭취를 250-350 ㎎/일로부터 350-400 ㎎/일로 증가시킬 수 있을 것으로 구현된다 (즉, 환자의 Phe 내성 표현형이 고전적인 PKU 환자의 표현형에서 중증 PKU 환자로 변경된다). 물론, 본원에서 교시된 치료적 개입이 환자가 이의 식이 Phe 섭취를 250-350 ㎎/일로부터 400-600 ㎎/일로 증가시킬 수 있게 하거나 (즉, 환자의 Phe 내성 표현형이 고전적인 PKU 환자의 표현형에서 경미한 PKU 환자로 변경됨), 또는 일부 경우에는, 환자가 600 ㎎ Phe/일을 초과하여 섭취 (즉, 정상적인 식이 섭취)하도록 하는 것이 바람직할 것이다.

BH4 -비-응답성 PKU 환자의 특징 및 이의 치료 방법

본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 환자들의 두번째 군은 혈장 Phe 농도가 상승된 것으로, 즉, 200 μM를 초과하는 임의의 농도를 나타내는 것으로 결정되었지만, BH4 치료법에 비-응답성인 것으로 진단 (하기 기술되는 BH4 로딩 테스트에 의해 결정됨)된 개체들이다. 이같은 환자들에는 경미한 PKU에 걸린 개체들 (즉, 600 μM 이하의 혈장 Phe 농도), 중증 PKU에 걸린 개체들 (즉, 600 μM 내지 약 1200 μM의 혈장 Phe 농도), 뿐만 아니라 고전적인 중증 PKU에 걸린 환자들 (즉, 1200 μM을 초과하는 혈장 Phe 농도)이 포함될 수 있다.

BH4 치료법에 비-응답성인 환자에게 환자의 혈장 Phe 농도를 감소시키기 위해 PAL을 단백질 양이 감소된 식이와 조합하여 제공한다. 본 발명의 방법은 PAL의 투여가 PAL 치료법의 부재 하에 투여된 동일한 식이 프로토콜로 일어난 감소와 비교하여 환자의 혈장 Phe 농도에서의 더 큰 감소를 일으키도록 한다. 식이 제한은 Phe의 양이 감소된 합성 의료 단백질 조제식을 제공함으로써 Phe 섭취를 제한하는 식이일 수 있거나, 또는 별법적으로, 식이 제한은 단순히 환자가 이의 전체적인 단백질 섭취를 제한하는 것을 필요로 하지만 환자가 제한된 양으로 정상적인 음식물을 먹도록 허용하는 제한일 수 있다.

고전적인 PKU 환자에 대해 논의된 치료적 결과가 거명에 의해 본 섹션에 포함된다. 중증 PKU 환자 (즉, 제한되지 않은 혈장 Phe 농도가 600 μM 내지 1200 μM인 환자)에 대한 치료적 결과는 환자의 혈장 Phe 농도에서의 25％ 이상의 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 혈장 Phe 농도에서의 30％ 감소를 일으킬 것이다. 또다른 실시양태에서, 상기 방법은 개체의 혈장 Phe 농도에서의 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 그 이상의 감소를 일으킬 것이다 (예를 들어, 중증의 고전적인 PKU 환자의 Phe 농도가 1000 μM인 경우, Phe 농도에서의 90％ 감소로 혈장 Phe 농도가 식이 제한을 거의 필요로 하지 않거나 필요로 하지 않도록 충분히 낮은 농도인 100 μM가 될 것이다).

일부 실시양태에서, 치료될 중증 PKU 환자의 혈장 Phe 농도가 600 μM 내지 1200 μM의 제한되지 않은 혈장 Phe 농도의 임의의 양으로부터 300 μM 미만의 임의의 혈장 Phe 수준으로 감소된다. 한 실시양태에서, PAL로의 치료 (단독 치료 또는 식이 제한과의 조합 치료)는 혈장 Phe 농도를, 예를 들어, 200 μM 내지 약 400 μM의 범위로 감소시키고, 혈장 Phe 농도가 이러한 범위 내인 환자는 Phe-제한 조제식을 먹는 것과 대조적으로 단순히 식이 내의 단백질의 양을 제한하는 것에 의해 질환을 관리할 수 있기 때문에, 이는 치료법의 임상적으로 유용한 결과로서 간주될 것이다. 실제로, 다수의 연구에서, 이같은 환자는 심지어 정상 식이를 먹을 수 있는 것으로 교시된다.

치료 결과로서의 환자가 허용할 수 있는 식이 Phe 수준의 양에서의 모든 증가는 치료적으로 효과적인 결과로 간주될 것이다. 예를 들어, PAL 치료법 (단독 또는 다른 치료적 개입과 조합됨)의 투여 결과로, 환자가 이의 식이 Phe 섭취를 350-400 ㎎/일로부터 400-600 ㎎/일로 증가시킬 수 있을 것으로 구현된다 (즉, 환자의 Phe 내성 표현형이 중증 PKU 환자의 표현형에서 경미한 PKU 환자로 변경된다). 물론, 본원에서 교시된 치료적 개입이 환자가 이의 식이 Phe 섭취를 350-400 ㎎/일로부터 600 ㎎ Phe/일을 초과하여 섭취 (즉, 정상적인 식이 섭취)하도록 증가시킬 수 있게 하는 것이 바람직할 것이다.

치료될 환자가 오직 경도의 PKU만을 나타내는 경우, 즉, 식이 허용량이 400-600 mg Phe 섭취/일인 경우에도, 혈장 Phe 농도가 가능한 한 360 μM ± 15 μM에 가까운 정상화된 혈장 Phe 농도가 되게 하는 것이 바람직하기 때문에, 본 발명의 PAL-기반 치료법이 환자에게 이로울 것이다. 이같은 환자에 대해, 유리한 치료적 결과는 환자의 혈장 Phe 농도에서의 25％ 이상의 감소를 포함할 것이다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 혈장 Phe 농도에서의 30％ 감소를 일으킬 것이다. 또다른 실시양태에서, 상기 방법은 개체의 혈장 Phe 농도에서의 40％, 50％, 60％ 또는 그 이상의 감소를 일으킬 것이다 (예를 들어, 경미한 PKU 환자의 Phe 농도가 600 μM인 경우, Phe 농도에서의 60％ 감소로 혈장 Phe 농도가 혈장 Phe의 허용되는 정상 농도인 360 μM가 될 것이다).

일부 실시양태에서, 치료될 경미한 PKU 환자의 혈장 Phe 농도가 400 μM 내지 600 μM의 제한되지 않은 혈장 Phe 농도의 임의의 양으로부터 100 μM 미만의 임의의 혈장 Phe 수준으로 감소된다. 물론, PAL로의 치료 (단독 치료 또는 식이 제한과의 조합 치료)로 혈장 Phe 농도가 덜 감소되는 경우에도 (예를 들어, 200 μM 내지 약 400 μM의 수준으로 감소), 이는 치료법의 임상적으로 유용한 결과로서 간주될 것이다.

치료 결과로서의 환자가 허용할 수 있는 식이 Phe 수준의 양에서의 모든 증가는 치료적으로 효과적인 결과로 간주될 것이다. 예를 들어, PAL 치료법 (단독 또는 다른 치료적 개입과 조합됨)의 투여 결과로, 환자가 이의 식이 Phe 섭취를 400-600 ㎎/일로부터 증가시킬 수 있어 (즉, 환자의 Phe 내성 표현형이 경미한 PKU 환자의 표현형에서 경미한 HPA 환자로 변경된다), 환자가 600 ㎎ Phe/일을 초과하여 섭취 (즉, 정상적인 식이 섭취)하도록 하는 것이 구현된다.

또한, 환자가 PKU HPA의 증상을 나타내지 않는 경우에도, 즉 혈장 Phe 농도가 600 μM까지 상승되었지만, 정상적인 단백질 식이를 먹도록 허용되는 경우에도, 상승된 Phe 농도가 이같은 개체의 IQ에 상당한 효과가 있는 것으로 나타났기 때문에 본 발명의 PAL 치료법이 환자에게 이로울 것이다. 또한, 하기 논의되는 바와 같이, 특수한 요구사항이 있는 대상, 예를 들어, 임산부 및 유아의 PAL 치료 개입이 이러한 환자의 혈장 Phe 수준이 200 μM 미만의 인지되는 "안전한" 수준 내에 있는 경우에도 특히 중요하다.

모체 PKU 및 이의 치료 방법

태아의 PAH 상태와 관계 없이 자궁 내의 적당히 상승된 Phe 수준에 노출된 태아에 대한 심각한 영향력으로 인해, 임신을 계획하고 있거나 임신한 PKU 여성에서의 혈장 Phe 수준의 대사 제어가 중요하다. 혈장 Phe 농도의 치료적인 제어가 임신 기간 중 처음 3개월에 특히 중요한데, 알맞은 제어를 달성하지 못하면 소두증, 정신 박약증 및 선천성 심장 질환이 포함되는 장애가 초래될 것이기 때문이다.

예를 들어, 페닐케톤뇨증에 대한 [NIH Consensus Statement (vol 17 #3, October 2000)]에서, 3-10 ㎎/dL의 모체 Phe 수준에 태아가 노출되면 24％ 발병률로 소두증이 일어났고, 20 ㎎/dL를 초과하는 (즉, 1200 μM를 초과하는) 수준에 노출된 태아에서는 소두증의 발병률이 73％였음이 보고되었다. 유사하게, 선천성 심장 질환이 20 ㎎/dL를 초과하는 모체 Phe 수준에 노출된 아동의 10％ 초과에서 발견되었다. 중요하게, 6 ㎎/dL를 초과하는 Phe 수준이 아동의 IQ를 상당히 감소시킨다는 것이 주지되었다. 따라서, 모든 형태의 페닐케톤뇨증에 걸린 여성, 심지어 가장 경증의 HPA를 나타내는 여성의 혈장 Phe 농도가 모체 PKU 증후군의 위험을 피하기 위해 엄격하게 제어되어야 한다. 그러나, 미국 병원에서 사용된 PKU 여성의 혈장 Phe 농도에 대한 허용되는 표적 수준은 10 ㎎/dL 내지 15 ㎎/dL의 범위였고, 이는 임산부에게 권장되는 2-6 ㎎/dL 수준 또는 모체 PKU 증후군이 발달될 위험을 감소시키기 위해 영국 및 독일 병원에서 사용되는 1-4 ㎎/dL보다 훨씬 더 높다.

임산부에 대한 또다른 중요한 고려사항은 이의 전체적인 단백질 섭취이다. 임신 기간 동안의 저-단백질 식이는 지연된 신장 발달 및 이어지는 네프론 개수 감소를 초래할 것이고, 잠재적으로 성인기의 고혈압에 이를 것으로 제안되었기 때문에, 임신 기간 동안 여성이 충분한 단백질을 먹는 것이 중요하다 ([D'Agostino, N. Engl. J. Med. 348(17)1723-1724, (2003)]). 하기의 표는 다양한 개체들에 대한 전체 식이 단백질 섭취 권장량에 대한 예시적인 지침을 제공한다.

상기의 예시적인 지침으로부터 볼 수 있듯이, 미국에서는, 가임 연령의 여성 (예를 들어, 51세 미만)에 대한 단백질 섭취 권장량이 약 44 내지 50 g/일인 반면, 임산부 필요량은 약 60 g/일의 섭취가 권장된다. 캐나다 및 영국에서는, 임산부에 대한 단백질 섭취 권장량은 약 70 g/일 및 52 g/일 정도이다. 따라서, 이러한 군의 PKU 환자는 유사한 연령의 임신하지 않은 PKU 여성보다 더 많은 단백질을 필요로 한다는 사실로 인해 임산부의 혈장 Phe 농도 수준이 엄격하게 제어되는 것을 확실하게 할 필요가 더욱 복잡해진다.

상기의 견지에서, 본 발명의 PAL 치료법이 임산부에서 특히 유용할 것임이 구현된다. 임신한 또는 임신을 계획 중인, 임의의 형태의 HPA를 앓고 있는 여성이 혈장 Phe 농도 수준을 가능한 한 180 μM 내지 약 360 μM에 가깝게 유지하는 것을 확실하게 하기 위해 PAL 치료법의 과정에 놓일 것이 구현된다. 이같은 치료법 과정은 상기 여성이 이의 정상적인 단백질 섭취를 증가시키도록 할 것이다.

본원에서 상기에서 논의된, 혈장 Phe 농도의 수준 및 이같은 Phe 농도가 감소되어야 하는 수준의 논의가 임산부에 대한 본 섹션에 포함된다.

유아에서의 PKU 관리 및 이의 치료 방법

본원에서 전반에 걸쳐 논의된 바와 같이, 유아 (0세 내지 3세)에서의 혈장 Phe 농도 상승이 아동의 IQ에서의 상당한 하락을 초래하는 것으로 결정되었다. 그러나, 명세서의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 혈장 Phe 농도가 400 μM 이하까지 상승된 환자에게는 일반적으로 어떠한 식이 개입도 제공되지 않는다. 따라서, 0세 내지 3세의 유아가 현재의 치료법으로부터의 상당한 해로운 효과를 앓는다. 제한되지 않은 혈장 Phe 농도가 360 μM ± 15 μM를 초과하는 모든 유아를 이러한 대상의 혈장 Phe 농도에서의 이로운 감소를 일으키기 위해 PAL을 포함하는 치료 조성물로 치료하는 것이 본 출원에서 구현된다.

일부 실시양태에서, 유아는 0세 내지 3세이고, PAL의 투여 전의 제한되지 않은 혈장 Phe 농도가 약 1200 μM이며, 상기 투여는 혈장 Phe 농도를 감소시킨다. 한 실시양태에서, 투여 시 혈장 Phe 농도가 1800 초과에서 약 1500 μM, 약 1200 μM, 약 1100 μM, 약 1000 μM, 약 900 μM, 약 800 μM, 약 700 μM, 약 600 μM, 약 550 μM, 약 500 μM, 약 450 μM, 약 400 μM, 약 350 μM, 약 300 μM, 약 275 μM, 약 250 μM으로 감소된다. 또다른 실시양태에서, 유아는 0세 내지 3세이고, 제한되지 않은 혈장 Phe 농도가 약 1200 μM 초과이며, PAL의 투여 (단독 투여 또는 식이와의 조합 투여) 시 이러한 혈장 Phe 농도가 약 800 μM, 약 500 μM, 또는 약 360 μM로 감소된다. 당업자는 제한되지 않은 혈장 Phe 농도가 360 μM를 초과하는 유아를 PAL로 치료하여 이같은 혈장 Phe 농도를 감소시키는 것이 본 발명에서 구현된다는 것을 이해할 것이다. 상기의 혈장 Phe 농도의 치료적 감소의 논의가 거명에 의해 여기에 포함된다. 추가로, 초기의 제한되지 않은 혈장 Phe 농도의 10％를 초과하는 모든 감소는 유아를 위한 치료적 요법에 대한 치료적 결과로 간주될 것이다. 이같은 유아에서의 혈장 Phe 농도의 치료적 감소를 초래하기 위해 PAL 치료법이 식이 제한과 조합될 수 있음을 이해하여야 한다.

표 2는 치료적 유효량의 PAL의 투여가 이로울 다수의 질환 상태를 열거한다. 표준 방법을 사용하여 비경구, 경구, 또는 기타 표준 투여 경로 및 투여량을 결정할 수 있다.

PAL 단백질 치료법을 받을 수 있는 예시적인 질환 상태

페닐케톤뇨증

고페닐알라닌혈증

타이로신혈증

암

2. 치료에서 사용하기 위한 조성물

PKU/HPA의 치료적 개입이 본 발명에서 구현된다. 이같은 개입은 우선 PAL의 사용을 기초로 하고, 이는 단독으로 또는 식이 제한과 조합되어 사용될 수 있다. 추가적으로, PAL 및/또는 식이 제한이 PKU의 또다른 징후에 대항하도록 예를 들어 디자인된 또다른 치료 조성물, 예컨대 뇌에서의 Phe 축적을 방지하기 위한 대형 중성 아미노산 ([Koch, et al., Mol. Genet. Metabol. 79:110-113 (2003)] 참조) 또는 타이로신 보충물과 추가로 조합될 수 있다. 본 섹션은 본원에서 구현된 치료에서 사용될 수 있는 조성물의 논의를 제공한다.

PAL 조성물

일반적으로, 유효량의 본 발명의 단백질 또는 유도체 생성물을 제약상 허용되는 희석제, 안정화제, 방부제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물이 본 발명에서 구현된다. 이같은 조성물은 다양한 완충제 함량 (예를 들어, 트리스-HCl, 포스페이트), pH 및 이온 강도의 희석제; 첨가제 예컨대 세제 및 가용화제 (예를 들어, 폴리소르베이트(Polysorbate) 20, 폴리소르베이트 80), 항산화제 (예를 들어, 아스코르브산, 메타중아황산나트륨), 방부제 (예를 들어, 티메로졸(Thimerosol), 벤질 알콜) 및 증량(bulking) 물질 (예를 들어, 락토스, 만니톨)을 포함한다; 예를 들어, 거명에 의해 본원에 포함된 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.) pp. 1435:1712] 참조. 활성 성분의 유효량은 체중, 연령 및 치료 목표와 같은 인자들을 고려함으로써 당업자가 쉽게 결정할 수 있는, 치료적, 예방적 또는 진단적 유효량이다.

본 발명의 PEG:PAL 조성물은 용액의 pH를 원하는 범위 내에서 유지하기 위한 완충제를 또한 포함할 수 있다. 예시적인 완충제에는 아세트산나트륨, 인산나트륨 및 시트르산나트륨이 포함된다. 이러한 완충제들의 혼합물을 또한 사용할 수 있다. 조성물에서 유용한 완충제의 양은 사용된 특정 완충제 및 용액의 pH에 크게 좌우된다. 예를 들어, 아세테이트는 pH 6보다 pH 5에서 더욱 효율적인 완충제여서, pH 6보다 pH 5의 용액에서 아세테이트가 덜 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물에 대한 pH 범위는 pH 3.0-7.5이다.

본 발명의 조성물은 용액을 등장성이게 하고 주사에 더욱 적합하게 하기 위해 등장성 조정제를 더 포함할 수 있다. 이의 예는 농도 범위가 0-150 mM 이내인 염화나트륨이다.

본원에서 사용된, 그리고 PEG:PAL 접합체가 구현될 때의 용어 "치료적 유효량"은 환자에게 이익을 제공하는 혈청 L-페닐알라닌에서의 감소를 제공하는 양을 지칭한다. 이러한 양은 개체마다 다를 것이고, 환자의 전체적인 건강 상태가 포함되는 다수의 인자들에 좌우될 것이다. 치료법용으로 사용된 PAL의 양은 허용되는 정도의 혈청 L-페닐알라닌 감소를 제공하고, 이로운 수준 (일반적으로 약 30％ 이상, 전형적으로 10％ 내지 50％ 범위)에서 이러한 값을 유지한다. 공개적으로 이용가능한 물질 및 절차를 사용하여 당업자에 의해 본 조성물의 치료적 유효량이 쉽게 확정될 수 있다.

본 발명은 천연 PAL보다 덜 빈번하게 PEG:PAL 접합체를 투여하는 것을 제공한다. 투약 빈도는 치료될 상태에 따라 변할 것이지만, 일반적으로 일주일 당 약 1회일 것이다. 실제로 사용되는 투약 빈도는 PEG:PAL 접합체에 대한 상이한 개체들에 의한 응답에서의 변동으로 인해 본원에 개시된 빈도로부터 다소 변할 수 있는 것으로 이해된다; 용어 "약"은 이같은 변동을 반영하도록 의도된다.

따라서 본 발명은 혈청 L-페닐알라닌 수준을 감소시키는데 사용될 수 있다. 가장 통상적으로, 고페닐알라닌혈증으로 인해 혈청 L-페닐알라닌 수준이 증가된다. 본 발명에 의해 치료가능한 상태에는 페닐케톤뇨증과 관련된 고페닐알라닌혈증이 포함된다. 타이로신혈증에서 발견되는 것과 같은 증가된 혈청 L-타이로신에 이를 수 있는 상태가 또한 치료가능하다. 더욱이, 혈청 L-페닐알라닌 및/또는 혈청 L-타이로신 수준의 결핍이 이로울 수많은 암-관련 상태를 본 발명의 PEG:PAL 접합체로 또한 치료할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따라 제조된 PEG:PAL 접합체가 주사에 의해 복강내, 피하, 또는 근육내 투여된다. 그러나, 본 발명의 조성물을 사용하여 또다른 전달 경로가 효과적으로 사용될 수 있다는 것이 당업자에게 명확할 것이다.

본원에 기술된 방법은 상기 기술된 분자를 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 비히클, 및 임의적으로 또다른 치료적 및/또는 예방적 성분과 함께 포함하는 제약 조성물을 사용한다. 이같은 부형제에는 액체 예컨대 물, 염수, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 히알루론산, 에탄올, 시클로덱스트린, 변형된 시클로덱스트린 (즉, 술포부틸 에테르 시클로덱스트린) 등이 포함된다. 비-액체 제형을 위한 적절한 부형제가 또한 당업자에게 공지되어 있다.

제약상 허용되는 염이 본 발명의 조성물에서 사용될 수 있고, 여기에는, 예를 들어, 무기산 염 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 술페이트 등; 및 유기산의 염 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등이 포함된다. [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)]에서 제약상 허용되는 부형제 및 염의 완전한 논의가 입수가능하다.

추가적으로, 보조 물질, 예컨대 습윤화 또는 유화 작용제, 생물학적 완충 물질, 계면활성제 등이 이같은 비히클 내에 존재할 수 있다. 약리학적으로 허용가능하고, 원하는 pH, 즉 생리학적으로 허용되는 범위의 pH의 제형을 제공하는 실질적으로 임의의 용액이 생물학적 완충제일 수 있다. 완충제 용액의 예로는 염수, 포스페이트 완충 염수, 트리스 완충 염수, 행크(Hank) 완충 염수 등이 포함된다.

의도되는 투여 방식에 따라, 제약 조성물은 고체, 반고체 또는 액체 투약 형태, 예컨대, 예를 들어, 정제, 좌약, 알약, 캡슐, 분말, 액체, 현탁액, 크림, 연고, 로션 등일 수 있고, 일부 실시양태에서는, 정확한 투여량의 단일 투여를 위한 단위 투약 형태일 수 있다. 조성물은 제약상 허용되는 담체와 조합된 유효량의 선택된 약물을 포함할 것이고, 추가적으로, 기타 제약 작용제, 보조제, 희석제, 완충제 등을 포함할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 화합물 또는 접합체는 경구 (구강 및 설하 포함), 직장, 비강, 국소, 폐, 질 또는 비경구 (근육내, 동맥내, 수막강내, 피하 및 정맥내 포함) 투여에 적절한 제형을 포함하는 제약 제형으로서, 또는 흡입 또는 통기에 의한 투여에 적절한 형태로 투여될 것이다. 한 예시적인 투여 방식은 고통 정도에 따라 조정될 수 있는, 편리한 일일 투여량 요법을 사용하는 정맥내 방식이다.

고체 조성물에 대해, 통상적인 비-독성 고체 담체에는, 예를 들어, 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 탈크, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등이 포함된다. 제약상 투여가능한 액체 조성물은, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 활성 화합물 또는 접합체 및 임의적인 제약 보조제의 부형제, 예를 들어, 물, 염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등에의 용해, 분산 등에 의해 용액 또는 현탁액을 형성시키는 것에 의해 제조될 수 있다. 원한다면, 투여될 제약 조성물은 미량의 비-독성 보조 물질 예컨대 습윤화 또는 유화 작용제, pH 완충제, 등장화제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소듐 아세테이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 또한 함유할 수 있다. 이같은 투여 형태를 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 명백할 것이다; 예를 들어, 상기 언급된 [Remington's Pharmaceutical Sciences] 참조.

경구 투여를 위해, 조성물은 일반적으로 정제, 캡슐 또는 연질 캡슐의 형태를 취할 것이거나, 또는 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 또는 시럽일 수 있다. 정제 및 캡슐은 경구 투여 형태 중 일부이다. 경구 사용을 위한 정제 및 캡슐은 일반적으로 하나 이상의 통상적으로 사용되는 담체 예컨대 락토스 및 옥수수 전분을 포함할 것이다. 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘이 또한 전형적으로 포함된다. 액체 현탁액이 사용되는 경우, 활성 성분이 유화 및 현탁 작용제와 조합될 것이다. 원한다면, 풍미제, 착색제 및/또는 감미제가 또한 첨가될 수 있다. 본원에서의 경구 제형 내로 포함시키기 위한 기타 임의적인 성분에는 방부제, 현탁제, 증점제 등이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

경구 제형은 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전 액체에서의 용해 또는 현탁에 적절한 고체 형태, 또는 에멀션으로서 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 적절한 담체, 분산 또는 습윤화 작용제 및 현탁제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 무균성 주사용 현탁액이 제형화된다. 또한 무균성 주사 제형은 비경구적으로 허용되는 비-독성 희석제 또는 용매 내의 무균성 주사 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매에는 링거(Ringer) 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 무균성의 고정유, 지방 에스테르 또는 폴리올이 용매 또는 현택 매질로서 통상적으로 사용된다. 또한, 비경구 투여는 일정한 수준의 투여량이 유지되도록 저속 방출 또는 지속 방출 시스템의 사용을 수반할 수 있다.

상기에서 기술된 확인된 PEG:PAL 접합체는 심혈관 질환을 치료하거나 경감시키기 위해 치료적 유효량으로 환자에게 투여될 수 있다. 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해, 예를 들어, LD₅₀ (집단의 50％에 치사성인 용량) 및 ED₅₀ (집단의 50％에 치료적으로 효과적인 용량)을 결정함으로써 이같은 접합체의 독성 및 치료 효능을 결정할 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 간의 용량 비율이 치료 지수이고, 이는 LD₅₀/ED₅₀ 비율로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 접합체가 일부 실시양태에서 사용된다.

세포 배양 분석법 및 동물 연구로부터 수득된 데이터가 인간에서 사용하기 위한 광범위한 투여량을 처방하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여량은 독성이 없거나 최소인 ED₅₀을 포함하는 광범위한 혈중 농도 내에 존재한다. 투여량은 사용된 투약 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 변할 수 있다. 세포 배양 분석법 및 동물 모델로부터 치료적 유효 용량이 결정될 수 있다.

식이 단백질

PAL 및 관련된 유사체를 HPA/PKU 환자에게 투여하는 것에 더하여, 환자의 식이 단백질이 또한 제한 또는 변형될 수 있는 것이 구현된다. 당업자는 PKU의 치료에서 사용하기 위한 다양한 시판되는 단백질 조제식을 알고 있다. 이같은 조제식에는 MAXIMAID, PHENEX 1, PHENEX 2 (Ross Laboratories, Liverpool, UK), LOFENALAC, PHENYL-FREE (Mead- Johnson) 등이 포함된다.

당업자는 언급된 단백질 조제식들을 사용할 수 있고, 이들은 일반적으로 Phe 농도가 없다. PKU 환자에서 부족한 아미노산들이 이러한 단백질 조제식들에 종종 보충된다. 이같은 아미노산에는, 예를 들어, L-타이로신, 및 L-글루타민이 포함된다. PKU 환자의 식이에 발린, 이소류신 및 류신을 보충하는 것이 바람직할 수 있는 것으로 제안되었다 (미국 특허 번호 4,252,822 참조). 특정 임상 징후에서, 타이로신 및 트립토판과 같은 다른 아미노산의 뇌 흡수를 차단하는 Phe에 의해 PKU의 독성 효과가 야기된다. PKU 환자의 식이에 과량의 이같은 대형 중성 아미노산을 보충하는 것이 뇌 내로의 Phe 흡수를 차단하고 뇌의 Phe 수준을 저하시킨다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 방법을 위해, 하나 이상의 이러한 아미노산을 포함하는 조성물을 식이 요법에 추가로 보충할 수 있는 것이 구현된다 ([Koch, et al., Mol. Genet. Metabol. 79:110-113 (2003)]).

추가로, 공지된 바와 같이, 인간의 유액 및 동물 기원의 또다른 음식물에서 정상적으로 발견되는 L-카르니틴 및 타우린이 단백질 제한에 더하여 또한 공급되어야 한다. 특정 실시양태에서, 인간의 유액 및 동물 기원의 음식에서 정상적으로 발견되는 이러한 인자들의 양을 공급하는 것을 돕기 위해 L-카르니틴이 단백질 100 g 당 20 ㎎으로 보충될 수 있고, 타우린이 단백질 100 g 당 40 ㎎으로 보충될 수 있다.

또한, 식이 단백질 제한에도 불구하고 다른 보충물은 제공되고 있는 것을 확실하게 하기 위해 환자에게 공급되어야 하는 필수 비타민 및 미네랄과 같은 기타 성분들의 추가적인 목록을 위해 당업자는 <2000 National Academy of Sciences-National Research Council Dietary Reference Intakes>를 참조한다.

전체 단백질 양 및 바람직한 혈장 Phe 농도와 관련된 상기의 논의를 참조로, 당업자는 필요한 식이 단백질 제한의 양을 결정할 수 있을 것이고, 따라서 이에 따라 환자의 식이를 조정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 약 11-14세의 남성을 고려하면, 이러한 개체에게 45 g 단백질/일을 제공하여야 한다. 개체가 중증의 고전적인 PKU에 걸린 개체인 경우, 이의 제한되지 않은 혈장 Phe 농도는 1200 μM을 초과할 것이고, 이러한 개체에 대한 식이 단백질 공급원의 대부분 (전부는 아니지만)은 개체의 혈장 Phe 농도를 600 μM 미만으로 저하시킬 수 있는 분말화된 단백질 보충물로부터 유래될 것이다. 이러한 대상에게 PAL을 투여함으로써, 환자의 혈장 Phe 농도의 더 많은 감소를 일으키는 것이 치료적 결과일 것이거나, 또는 별법적으로, 개체의 혈장 Phe 농도가 유사한 정도로 저하되지만, 개체가 식이 조제식보다는 정상 식이로부터의 단백질을 허용할 수 있는 것이 치료적 결과이다.

유사하게, 중증의 PKU에 걸린 약 11-14세의 남성에 대해, 본 발명의 방법을 사용하여, 할당된 45 g 단백질/일을 제한된 조제식보다는 정상적인 단백질 섭취를 통해 이러한 남성에게 제공하는 것이 가능할 수 있다. 본 발명의 방법이 효과적인지 여부를 결정하는 것은 혈장 Phe 농도가 적어도 400 μM 미만으로 유지되는 것을 확실히 하기 위해 정기적으로 환자의 혈장 Phe 농도를 결정하는 것을 수반할 것이다. 이같은 농도를 결정하기 위한 테스트가 하기에 기술된다. 일부 실시양태에서, 약 360 μM 이하의 농도가 달성된다.

3. 환자 집단의 확인 및 모니터링

본원에서 전반에 걸쳐 논의된 바와 같이, 소정의 환자가 PAL 치료법에 응답성인지 여부를 결정하는 것 및 초기 (치료될 PKU 환자의 클래스를 확인하기 위해), 및 진행 중인 치료 요법 동안 (치료 요법의 효능을 모니터링하기 위해)의 양쪽 모두의 시기에 환자의 페닐알라닌 농도를 결정하는 것이 본 발명의 다양한 실시양태에서 필요할 것이다. 예시적인 이같은 방법들이 본원에서 하기에서 논의된다.

BH4 로딩 테스트

BH4 로딩 테스트는 BH4의 결핍으로 인해 또는 PAH 결핍증을 통해 HPA에 걸린 환자들을 구별하도록 한다.

가장 간단한 BH4 로딩 테스트는 외인성 BH4를 투여하고, 혈장 Phe 농도의 저하에 대한 투여 효과를 결정하는 테스트이다. 2 ㎎/㎏ BH4의 정맥내 로딩이 [Danks, et al., Lancet 1:1236 (1976)]에 의해 최초로 제안되었다. 더욱 순수한 BH4가 입수가능해졌기 때문에, 체중 1 ㎏ 당 약 2.5 ㎎의 양으로 BH4를 경구 투여하는 것을 사용하여 테스트를 수행할 수 있게 되었다. 최종적으로, 7.5 ㎎/㎏ 단일 경구 용량의 BH4가 투여되는 표준화된 접근법이 Niederwieser 등에 의해 제안되었지만 ([Niederwieser, et al., Eur. J. Pediatr. 138:441 (1982)]), 일부 실험실에서는 여전히 체중 1 ㎏ 당 20 mg 이상의 BH4를 사용한다.

단순한 BH4 로딩 테스트로 신뢰할 수 있는 결과를 일으키기 위해, 환자의 혈액 Phe 수준이 400 μM보다 높을 필요가 있다. 따라서, 로딩 테스트를 수행하기 2일 전에 환자에게서 PKU 식이를 제거하는 것이 종종 관례적이다. Dr. Schircks Laboratories (Jona, Switzerland)로부터 BH4 테스트 키트가 입수가능하고 공급된다. 이러한 키트는 정상적인 식사를 섭취하고 나서 약 30분 후의 체중 1 ㎏ 당 BH4 20 mg의 투여량을 권장한다.

Phe 농도의 결정

혈액 내의 Phe의 존재를 결정하기 위한 수많은 방법들이 있다 ([Shaw et al., Analytical Methods in Phenylketonuria-Clinical Biochemistry, In Bickett et al. Eds., Phenylketonuria and Some Other Inborn Errors of Amino Acid Metabolism, Stuttgart, Georg Thiem Verlag, 47-56 (1971)]). 전형적으로, 형광측정 분석법을 사용하여 환자의 혈청으로부터 페닐알라닌 및 타이로신 농도가 결정된다. 이러한 분석법은 페닐알라닌이 류실알라닌의 존재 하에 닌히드린과 함께 가열될 때 형광 물질이 형성되는 것에 의존한다 ([McCaman, et al., J. Lab. Clin. Med. 59:885-890 (1962)]).

Phe 농도를 결정하기 위한 가장 대중적인 방법은 환자로부터의 혈액 샘플로 포화된 여과지로부터 원반 모양으로 구멍을 내는 거트리(Guthrie) 테스트이다. 균일한 원반들을 바실루스 서브틸리스가 파종되어 있고 바실루스 서브틸리스 성장의 특이적 억제제를 함유하는 한천 트레이에서 인큐베이션한다. 페닐알라닌이 균일한 원반들로부터 한천 상으로 이동되면, Phe이 박테리아 성장의 억제를 역전시킴으로써 박테리아 성장 구역이 산출되고, 이러한 구역은 기지량의 Phe을 함유하는 원반들을 사용하여 수행된 유사한 분석법에 대한 비교에 의해 페닐알라닌 농도와 상관될 수 있다.

Phe 농도를 정량하기 위한 또다른 방법에는 HPLC, 질량 분광법, 박층 크로마토그래피 등이 포함된다. 이같은 방법들을 사용하여, 치료 전에 환자의 혈장 Phe 농도를 결정할 수 있고, 치료 요법의 효능을 결정하기 위해 치료 요법 도중에 Phe 농도를 모니터링할 수 있다.

환자의 혈장 Phe 수준이 치료 요법 과정 전반에 걸쳐 편리한 간격으로 모니터링될 것이다 (예를 들어, 매일, 격일 또는 매주). 이같이 규칙적으로 혈장 Phe 수준을 모니터링함으로써, 임상의는 치료의 효능을 평가할 수 있을 것이고, 이에 따라 PAL 및/또는 식이 단백질 요구량을 조정할 수 있을 것이다.

4. 조합 치료법

특정한 본 발명의 방법들은 다양한 형태의 HPA에 걸린 환자에서 치료적인 결과를 초래하기 위해 PAL과 식이 단백질 제한의 조합 사용을 수반한다. 본원에서 구현되는 조합 치료법에서 적합한 치료적 결과를 달성하기 위해, 원하는 치료적 결과 (즉, 혈장 Phe 농도의 저하, 및/또는 수반되는 혈장 Phe 농도에서의 증가를 일으키지 않으면서 더 많은 양의 Phe/단백질 섭취를 허용하는 능력)를 일으키는데 효과적인 조합된 양으로 PAL 조성물 및 식이 제한이 대상에게 일반적으로 투여될 것이다. 이러한 프로세스는 PAL 조성물 및 식이 단백질 치료 조성물을 동시에 투여하는 것을 수반할 수 있다. 이는 모든 식이 단백질 요구량을 포함하고 이러한 단백질 제형 내에 PAL을 또한 포함하는 단일 조성물 또는 약리학적 단백질 제형을 투여함으로써 달성될 수 있다. 별법적으로, 식이 단백질 (보충물 또는 정상적인 단백질 식사)이 PAL의 약리학적 제형 (정제, 주사 또는 음용물)과 거의 동시에 섭취된다. PAL은 단백질 바 또는 섭취에 적절한 기타 음식물 예컨대 브라우니, 팬케이크, 케이크로 또한 제형화될 수 있다.

별법적으로, PAL 치료가 수분 내지 수시간 범위의 간격으로 식이 단백질 치료법에 선행 또는 후행할 수 있다. 단백질 및 PAL 조성물이 별도로 투여되는 실시양태에서, 각각의 전달 시간 사이에 상당한 기간의 시간이 지나지 않아서, PAL이 환자에 대한 유리한 효과를 여전히 발휘할 것임이 일반적으로 보장될 것이다. 이같은 경우에, 식이 단백질을 섭취하고 나서 또는 식이 단백질을 섭취하기 전 약 2-6시간 이내에 PAL을 투여하는 것이 구현되고, 일부 실시양태에서는 오직 약 1시간의 지연 시간이 있다. 특정 실시양태에서, PAL 치료법이 PAL의 일일 용량이 환자에게 무기한으로 투여되는 연속 치료법일 것이 구현된다. 또다른 상황에서, 예를 들어, 단지 경미한 형태의 PKU 및 HPA에 걸린 임산부에서, 여성이 임신 중 및/또는 수유 중인 동안에만 PAL 치료법이 계속될 수 있다.

추가적으로, PAL 및 식이 단백질 조절의 전달만을 기초로 하는 치료법에 더하여, HPA의 증상들 중 하나 이상을 특이적으로 표적으로 하는 제3의 조성물과의 조합 치료법이 본 발명의 방법에서 또한 구현된다. 예를 들어, HPA에 의해 야기되는 타이로신의 결핍이 신경전달물질 도파민 및 세로토린의 결핍증을 초래하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 정황에서, PAL 및 식이 단백질을 기초로 하는 방법이 식이 내의 타이로신 양 감소로부터 초래되는 결함을 고치기 위해 L-도파, 카르비도파 및 5-히드록시트립토판 신경전달물질의 투여와 추가로 조합될 수 있는 것이 구현된다.

PAL의 투여는 타이로신을 생성시키지 않을 것이기 때문에 (PAH의 투여와 달리), 이같은 치료는 여전히 타이로신이 이같은 환자에게 필수 아미노산인 것을 초래할 것이다. 따라서, 타이로신의 식이 보충이 BH4 치료법과 조합되어 PAL이 제공되는 환자에게 바람직할 수 있다.

I. PAL 상동체의 스크리닝 및 특성화

본 발명의 또다른 양상은 상승된 수준의 페닐알라닌을 함유하는 세포를 박테리아 PAL과 접촉시키고, 이러한 박테리아 PAL이 이같은 상승된 수준의 페닐알라닌을 감소시키는지 여부를 결정하는 것에 의한, 페닐알라닌의 수준 강화를 방지하거나, 경감시키거나 또는 감소시킬 수 있는 박테리아 PAL을 확인하기 위한 스크리닝 분석법이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 고처리량 분석법이다. 한 실시양태에서, 박테리아 종의 완전한 게놈을 서열분석하고, 생물정보학 접근법을 사용하여 PAL 상동체의 존재에 대해 스크리닝한다. 또다른 실시양태에서, encP에 대한 상동성이 있는 유전자를 확인하고, 관련된 단백질 서열의 BLAST 분석을 수행하여 동일성 백분율을 결정한다. 이같은 단백질들의 1차 서열 정렬물들을 PAL 활성에 필수적인 보존 잔기의 존재에 대해 평가한다. 모든 HAL 효소의 위치 83 (슈도모나스 푸티다로부터의 HAL)은 히스티딘인 반면, PAL 활성이 있는 효소에서는 이는 지방족 아미노산, 예를 들어, 류신 또는 발린이다. 위치 83에서의 분석으로, HAL로 주석된 효소가 잘못 표지된 것일 수 있고 실제로는 PAL 활성을 나타내는지 여부가 해명될 것이다. 예를 들어, 위치 413은 대부분의 HAL 효소에서 글루타민 (Q)이고, 모든 HAL 효소에서 위치 414에서 글루탐산 (E)이 이어진다. 반면에, 현재까지 확인된 대부분의 PAL 효소에서는 위치 414가 글루타민 (Q)이고, 위치 415에서 아스파르트산 (D) 또는 아스파라긴 (N)이 이어진다. 원핵생물 PAL 효소로서, 아마도 잘못 표지된 것으로 이러한 생물정보학 방법에 의해 결정되는 대표적인 HAL로 주석된 효소에는 로도박테르 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides) 2.4.1 (ZP 00005404), 로도박테르 자일라노필루스(Rubrobacter xylanophilus) DSM9941 (ZP 00188602), 포로라브두스 루미네센스 아종 라우몬디이TT01(Photorhhabdus luminescens subsp . LaumondiiTT01) (NP 930421), 테르모아나에로박테르 텡콘젠시스(Thermoanaerobacter tengcongensis) (AA051415)로부터의 HAL 효소가 포함된다.

추가적인 실시양태에서, 이같은 상동체의 단백질 생성물의 PAL 촉매 활성이 확증된다. 또다른 실시양태에서, PAL 상동체의 게놈을 PCR 증폭하고, pHIS8 또는 유사한 벡터 내로 클로닝한다. 추정 PAL 단백질이 His-태그가 부착된 단백질로서 대장균 내에서 이종성으로 발현되고, 이를 정제하여 PAL 활성에 대해 분석한다. PAL 활성에 대한 분석은 시험관 내에서 페닐알라닌을 신나메이트로 전환시키는 능력, 시험관내에서 타이로신을 p-쿠마레이트로 전환시킬 수 없음, 및 HAL 활성에 대해 테스트하기 위한 분석법 및 효소의 동역학을 특성화하기 위한 분석법을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

J. 원핵생물 PAL 의 생산

본 발명의 또다른 양상은 원핵생물 PAL의 생산 방법이다. 한 실시양태에서, 재조합 PAL이 유도성 프로모터 예컨대 IPTG (이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드)로 벡터, 예를 들어, 대장균 BL21(DE3)/pLysS (Invitrogen)에서 N-말단 옥타히스티딜 태그가 부착된 융합 단백질로서 과발현된다. 또다른 실시양태에서, 재조합 PAL이 N-말단 태그 없이 대장균 BL21(DE3)/pLysS 세포에서 과발현된다. 생물반응장치/발효기에 대한 종자 배양물을 진탕 플라스크 내에서 글리세롤 스톡으로부터 성장시킨다. 그후, 이같은 종자 배양물을 사용하여, 페드-뱃치 방식으로 제어형 생물반응장치 내로 스파이킹한다. 글루코스를 보충하고, 염기 (NH₄OH)로 pH를 제어하고, 1200 rpm까지 진탕시킨다. O₂를 공급하여, 용해 산소를 20％ 초과로 유지한다. 70-100의 OD₆₀₀에 도달할 때까지 (약 22-25시간), 세포를 30℃의 온도에서 성장시킨 후, 0.4 mM IPTG로 유도한다. 온도를 22 내지 26℃로 감소시키고, 활성 변화가 0.1 IU/㎖ 미만일 때까지 (대략 40-48시간 및 전형적으로 200의 OD₆₀₀), 성장시킨다. 세포 배양 배지는 전형적으로 규정 배지이고, 효모 추출물 단백질, 펩톤-트립톤, 글루코스, 글리세롤, 카사미노산, 미량의 염 및 포스페이트 완충 염으로 구성된다. 재조합 PAL 생성물은 세포 내에서 생산되고, 분비되지 않는다. 연속 원심분리 (Alfa-Laval, Carr, Ceba, 또는 등가물)에 의해 박테리아를 수확한다.

K. 원핵생물 PAL 의 정제

본 발명의 추가적인 양상은 박테리아 PAL 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편, 돌연변이체 또는 유사체를 정제하는 방법을 특징으로 한다. 첫번째 실시양태에 따르면, 형질전환된 세포 덩어리를 성장시키고, 파열시켜 미정제 재조합 효소를 남긴다. 일반적으로 미정제 벌크(bulk)로부터 외인성 물질을 제거하여, 컬럼이 막히는 것을 방지한다. 1개 또는 여러개의 크로마토그래피 수지를 사용하여 크로마토그래피 정제를 수행한다. 이어서, 정제된 단백질을 장기간에 걸친 안정적인 활성을 제공하도록 디자인된 완충제 내로 제형화한다. 또다른 실시양태에서, 박테리아 PAL의 정제 방법은 (a) 압력식 균질화기를 사용하여 재조합 PAL을 함유하는 박테리아를 용해시키는 단계 (유리 비드 용해와 같은 다른 물리적 수단에 의해서도 가능함); (b) 열 처리 단계; (c) 이러한 용해물을 제2의 연속적인 원심분리 단계 및/또는 다층 여과 (예컨대 Cuono Zeta Plus 또는 Maximizer, Pall Filtron, 또는 Millipore Millistak 또는 Opticao 필터로의 여과)를 사용하여 정화하는 단계; (d) 목탄 여과 단계 (예컨대 Millipore Millistak 40AC로의 여과)에 통과시키는 단계; (e) 최종 여과 단계 (예컨대 Sartorious의 Sartopore 0.2 ㎛ 필터로의 여과)에 통과시키는 단계; (f) 부틸 소수성 상호작용 크로마토그래피 (예컨대 Tosoh Biosciences의 Toyopearl Butyl 650M)에 통과시키는 단계; (g) Q 이온 교환 컬럼 (예컨대 BioRad로부터의 Macroprep High Q)에 통과시키는 단계; 및 (h) 접선형 유동 여과 (예컨대 Sartorious Hydrosart 또는 PES 100 kDa 막)로의 완충제 교환에 의해 최종 생성물을 회수하는 단계를 포함한다. 당업자는 크로마토그래피 단계들 중 하나 이상이 생략 또는 치환될 수 있거나, 또는 크로마토그래피 단계들의 순서가 본 발명의 범주 내에서 변화될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 마지막으로, 원한다면 적합한 멸균 단계들을 수행할 수 있다.

지금까지 본 발명이 일반적으로 기술되었지만, 하기의 실시예를 참조로 하기로부터 본 발명의 더욱 쉽게 이해될 수 있다. 이러한 실시예들은 설명의 목적으로만 제공되고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 온도 등)에 관하여 정확성을 확실하게 하도록 노력하였지만, 약간의 실험 오차 및 편차는 당연히 허용되어야 한다.

<실시예>

실시예 1

노스톡 푼크티포르메 및 아나바에나 바리아빌리스 PAL 의 클로닝

DNA 조작

노스톡 푼크티포르메 게놈 DNA를 ATCC (29133D)로부터 구입하고, PAL 유전자 (ZP_OO105927)를 프라이머 5'-CACTGTCATATGAATATAACATCTCTACAACAGAACAT-3' (서열 12) 및 5'-GACAGTGGCGGCCGCTCACGTTGACTTTAAGCTCGAAAAAATATG-3' (서열 13)으로부터PCR-증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물을 NdeI 및 NotI으로 소화시키고, 1.7 kb 단편을 N-His 태그 부착 및 태그 미부착 각각에 대해 pET-28a(+) 및 pET-30a(+) (Novagen) 내로 결찰시켰다.

아나바에나 바리아빌리스 세포를 ATCC (29413)로부터 구입하였다. 게놈 DNA를 추출하고 (Qiagen), PAL 유전자 (YP_324488)를 SOE-PCR에 의해 증폭시켜 NheI 부위를 제거하였다. 프라이머 1 (5'-CACTGTGCTAGCATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3') (서열 14) 및 프라이머 2 (5'-GGAAATTTCCTCCATGATAGCTGGCTTGGTTATCAACATCAATTAGTGG -3') (서열 15)를 사용하여 뉴클레오티드 1-1190을 증폭시켰고, 프라이머 3 (5'-CCACTAATTGATGTTGATAACCAAGCCAGCTATCATGGAGGAAATTTCC-3') (서열 16) 및 프라이머 4 (5'-CACTGTGCGGCCGCTTAATGCAAGCAGGGTAAGATATCTTG-3') (서열 17)를 사용하여 뉴클레오티드 1142-1771을 증폭시켰다. 이러한 2개의 PCR 생성물을 조합하여, 전장 유전자를 프라이머 1 및 4로 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물을 NheI로 소화시키고, 클레노우(Klenow) (NEB)로 평활화시킨 후, NotI으로 소화시켰다. 1.7 kb 단편을 pET-28a(+) 및 pET-30a(+) (Novagen) 내로 결찰시켰다.

박테리아 균주 및 배양 조건

대장균 BL21(DE3) 세포 (Stratagene)를 pGro7 (TaKaRa)로 형질전환시키고, 수용성 BL21(DE3)pGro7 세포를 이노우에(Inoue) 방법에 의해 제조하였다 ([Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001)]). 이러한 세포들을 pET-28-NpPAL로 형질전환시키고, 50 ㎎/ℓ 카나마이신 및 20 ㎎/ℓ 클로람페니콜이 있는 25 ㎖ LB에서 하룻밤 동안 37℃에서 배양하였다. 이러한 배양물 20 ㎖를 카나마이신, 클로람페니콜 및 500 ㎎/ℓ L-아라비노스가 있는 1 ℓ의 LB 배지 내로 파종하고, 37℃에서 성장시켰다. 0.6의 OD₆₀₀에서, 배양물을 얼음 상에서 냉각하였다. 5분 후, 배양물을 0.3 mM IPTG로 유도하고, 16시간 동안 20℃에서 성장시켰다. 원심분리에 의해 세포를 수확하였다.

아라비노스 유도 없이 NpPAL와 동일하게 BL21(DE3)pLysS 세포 (Stratagene)를 AvPAL로 형질전환시키고 성장시켰다.

실시예 2

NpPAL 및 AvPAL 의 정제

배양물을 벤치-탑 원심분리기에서 5,000 g에서 20분 동안 원심분리하고, 상등액을 폐기하였다. 전형적으로, 추가적인 프로세싱 전에 세포 펠렛을 -70℃에서 동결시켰다. 해동 시, 세포 펠렛을 TBS (25 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 7.8)에 약 80의 광학 밀도 단위 (600 nm)로 현탁시켰다. 12-14,000 psi의 APV 압력식 균질화기에 2회 통과시켜 세포를 용해시켰다. 그후, 미정제 용해물을 55℃에서 2시간 동안 열-처리하였다. 용해물을 10,000 g에서 30분 동안 원심분리하고, 상등액을 유지시키고, 0.2 ㎛ 진공 필터 (Corning)로 여과하였다.

부틸 650M 컬럼 (Tosoh BioSciences) 및 MacroPrep High Q 컬럼 (BioRad)에 순차적으로 통과시킴으로써, 청정화된 용해물로부터 PAL을 정제하였다. 용출된 생성물은 SDS PAGE 및 역상 HPLC 양쪽 모두에 의해 높은 수준의 순도를 나타냈다.

실시예 3

PEG 화 PAL 변이체의 생성

단백질 PEG 화

PEG화는 문헌의 방법의 변형을 사용하였다 ([Hershfield, et al., (1991) 동일 문헌]; 미국 특허 번호 6,057,292; [Lu, et al., Biochemistry 40(44):13288-13301 (2001)]; Nektar Therapeutics, 2003 카탈로그). 활성화된 PEG는 선형 PEG 숙신이미딜 숙시네이트 (mPEG-SPA, MW 5 kDa 또는 MW 20 kDa) 및 분지형 PEG 히드로숙신이미드 (mPEG₂-NHS 에스테르, MW 10 kDa 또는 MW 40 kDa) 양쪽 모두를 포함하였고, 이들은 양쪽 모두 한쪽 끝부분 상에 메톡시 기가 캡핑(capping)되어 있으며, Nektar Therapeutics로부터 입수가능하였다; 최적의 PEG화 단백질의 실험적인 결정이 일반적으로 요구되었다 ([Veronese, F. M., et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:196-207 (1997)]). 상이한 비율의 PAL:PEG (단백질 단량체 당 라이신의 개수와 함께 단백질의 몰비를 고려함), 상이한 pH, 상이한 완충제, 각종 온도 및 인큐베이션 시간을 사용하여 최적의 PEG화 조건이 결정되었다. 천연 PAL은 라이신의 개수가 크고 (로도스포리디움 토룰로이데스 (Rt) 및 아나바에나 바리아빌리스 (Av) 단량체 당 각각 29개 및 18개), 변형되지 않은 PAL은 마우스에서의 반복 주사시 면역반응성을 나타내며, 네이키드(naked) (야생형) PAL은 프로테아제에의 노출 시 빠르게 불활성화되기 때문에, 높은 PAL 단백질:PEG 유도체화 비율이 필요하였다. -20℃에서 동결시킴으로써 PEG화 반응을 정지시키고, 샘플을 SDS-PAGE, MALDI-TOF 질량 분광법, 활성 평가, 단백질분해 감도, 및 면역반응성에 의해 분석하였다.

활성, 단백질분해 및 면역 평가 전에, 그리고 과량의 미반응 PEG를 제거하기 위해, Tube-O-투석기 (GenoTechnology)를 사용하여 교반하면서 4℃에서 하룻밤 동안 반응물을 pH 8.5, 0.05 M 인산칼슘 완충제에 대해 투석하였다. NI 단백질 분석 키트 (Geno Technology)를 사용하여 단백질 농도를 결정한 후, 앞서 기술된 바와 같은 표준 반응 조건을 사용하여 유도체화되지 않은 PAL 및 PEG-유도체화 PAL 샘플에 대해 PAL 활성 측정을 수행하였다. 시험관내 특성화 후, PKU 마우스 모델을 사용하여 가장 전망이 있는 PEG화 치료제 후보물로 생체내 실험을 수행하였다.

특성화

변형되지 않은 단백질 샘플 및 PEG화 단백질 샘플에 대해 280 nm에서의 PAL 흡광 계수 (RtPAL 및 AvPAL에 대해 각각 0.5 및 0.83 mg ㎖^-1㎝^-1)를 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 정확한 단백질 농도 결정을 방해할 수 있는 비-단백질 오염물을 제거하기 위한 샘플 프로세싱을 포함하는 NI 단백질 분석법 (GenoTechnology)을 사용하여 농도를 계산하였다.

PEG-PAL 생성물을 MALDI-TOF MS로 특성화하여 각각의 PAL 단량체에 부착된 PEG 분자의 개수를 결정하였을 뿐만 아니라, 활성 평가 및 SDS-PAGE 및 천연 젤 분석을 사용하여 특성화하여 활성의 유지, 완전한 유도체화 및 4량체성 PAL 형성의 손실 없음을 각각 확실히 하였다. PAL 및 PEG-PAL 샘플에 대해, MALDI-TOF 질량 분광법 분석은 서브유닛 해리 및 종 검출의 재현성을 개선하기 위해 0.5 M 요소 또는 0.025 M 구아니딘-HCl을 사용하는 것을 필요로 하였다.

PAL 활성 분석법

동역학 방식으로 캐리(Cary) UV 분광광도계 (Cary 50)를 사용하여 PAL 활성 분석법을 수행하였다. 290 nm에서의 흡광도 증가에 의해 모니터링되는 트랜스-신나메이트의 생산을 측정함으로써 PAL의 L-페닐알라닌 기질과의 활성을 실온 (25℃)에서 분석하였다 ([Hodgins, (1968) 동일 문헌]). 290 nm에서의 트랜스-신남산의 몰 흡광 계수는 10.2381 ℓ M^-1㎝^-1이다. 반응 혼합물은 100 mM 트리스-HCl 완충제 (pH 8.5) 내에 22.5 mM 페닐알라닌을 함유하였다. 표준 측정을 위해, 최종 효소 농도는 0.0035 ㎎/㎖이었지만, 동역학 연구를 위해, 1분 당 290 nm에서의 경사가 0.005 내지 0.02의 범위이도록 분석법에서의 효소 농도를 조정하였다. 활성 데이터는 비 활성 (㎛ol×분^-1㎎^-1)으로 표시된다. PAL 1 유닛은 실온에서 1분 당 1 ㎛ol의 트랜스-신남산을 생산하는 효소의 양으로 정의된다.

실시예 4

시험관내 반감기 및 면역원성의 테스트

생화학적 특성화 후, 가장 전망이 있는 PEG-PAL 후보물들을 천연 PAL (비-PEG화)가 주사된 PKU 마우스에 의해 생성된 항체에 대한 면역반응성에 대해 상이하고 상보적인 3가지 기술 (웨스턴 블롯, ELISA, 및 면역침전 (IP))을 사용하여 스크리닝하였다.

웨스턴 블롯 분석을 위해, PAL 항-혈청 (천연 PAL이 주사된 마우스로부터의 혈청)을 1:10,000로 희석하여 사용하였다. 음성 대조군으로서, 완충제로 처리된 마우스로부터의 혈청을 동일하게 희석하여 또한 사용하였다. 2차 항체인 알칼리성 포스파타제-접합 염소 항-마우스 IgG (Promega)를 1:5,000으로 희석하고, AP 기질 웨스턴 블루(Western Blue) (Promega)를 사용하여 발색시켰다. PBS 내의 1 ㎎/㎖의 PAL을 사용하고, PBS, 0.05％ 트윈-20, 2％ BSA로 차단하여, 표준 절차에 따라 Nunc/Immuno Maxisorp 플레이트 (Nalge Nunc International)를 사용하여 ELISA 테스트를 수행하였다. 마우스 항혈청 (천연 PAL에 노출된 마우스로부터의 혈청)을 1:10,000으로 EB 차단 용액 (PBS, 0.05％ 트윈-20, 2％ BSA)에 희석하고, HRP-염소 항-마우스 IgG를 450 nm에서의 검출을 위해 사용되는 TMB와 함께 2차 항체로 사용하였다.

면역침전을 사용하여 PAL 항체 결합을 테스트하였다. 단백질 샘플 (PAL 또는 PEG화 PAL)을 TTBS 완충제 (트리스 완충 염수 + 0.1％ 트윈)에서 인큐베이션하고, 항체 샘플을 첨가하기 전에 PAL 활성을 측정하였다. 비-면역 마우스 혈청을 사용하여 각각의 샘플을 8배 과량의 양성 대조군 항-PAL 혈청 및 2배의 음성 대조군 반응물과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 비드의 마우스 IgG 결합 용량을 고려하여 단백질 G 세파로스 4 (50％, v/v)를 과량으로 첨가하고, 샘플을 다시 4℃에서 하룻밤 동안 회전시키면서 인큐베이션하였다. 원심분리에 의해 상등액을 회수하고, 각각의 샘플의 PAL 활성을 상등액 상에서 분석하였다. 웨스턴 블롯에 의한 추가적인 분석을 수행할 수 있도록 비드 펠렛을 폐기하지 않았다. 항체-비드 결합이 발생하였음을 확증하기 위해, 웨스턴 블롯을 사용하여 비드 상의 PAL 항원을 검출하였다. PAL 결합 단계 후 원심분리에 의해 회수된 비드를 TTBS 및 TBS 완충제로 여러번 세정하였다. 이러한 헹굼 단계 후, SDS-PAGE 로딩 완충제를 비드에 첨가하고, 샘플을 95℃에서 5분 동안 가열하였다. 그후, PAL 항-혈청을 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 샘플을 분석하였다. 불량한 항체 결합을 나타내는 효소 변이체는 웨스턴 블롯에 의해 검출된 바와 같이 펠렛화 비드 분획 내에 PAL이 거의 없었고, 높은 항체 결합을 나타내는 변형되지 않은 천연 PAL과 비교하여 상등액 내에 더 높은 활성이 남아 있는 것을 나타냈다.

실시예 5

프로테아제 감도의 테스트

로도스포리디움 토룰로이데스로부터의 천연 PAL에 대한 프로테아제 매핑 연구는 단백질분해 감도의 1차 부위를 가리켰다. 이같은 부위의 제거는 단백질분해 감도를 감소 또는 삭제시킬 수 있고, 효과적인 PKU 효소 대용물의 개발에 기여할 수 있다. 그러나, 단백질분해 감도에 대한 이같은 부위의 삭제는 효소 활성의 감소 또는 상실을 초래할 수 있다.

활성을 유지하는 개선된 PAL (및 PEG-PAL) 돌연변이체가 단백질 조작으로 생성된 후, 트립신/키모트립신 프로테아제 칵테일과의 인큐베이션을 사용하는 프로테아제 저항성에 대한 스크리닝에 이어서, 활성의 유지 (OD₂₉₀ 측정을 통한 모니터링) 및 감소된 단백질 절단 (PAGE 젤 분석을 통한 모니터링)에 대해 모니터링하는 것은 생체내 테스트에 사용될 적합한 시험관내 성질이 있는 돌연변이체를 확인하도록 한다.

장 환경과 유사하고 2.3 mM 트립신, 3.5 mM 키모트립신, 3.05 mM 카르복시펩티다제(carboxypeptidase) A 및 3.65 mM 카르복시펩티다제 B를 함유하는 프로테아제 칵테일과의 인큐베이션을 사용하여 단백질분해 안정성을 평가하였다. 단백질분해 테스트는 효소 인큐베이션, 프로테아제를 PAL 용액에 첨가하여, 시험될 여러 단백질 변이체 (PEG화 또는 기타 화학적 변형이 있거나 없는, 천연 또는 돌연변이체 단백질)에 대한 프로테아제 감도의 정도 (프로테아제 노출 후 활성 유지 및 안정성 유지의 시간에 따른 추이 포함)를 결정하는 것을 수반한다. SDS-PAGE 및 MALDI-TOF 질량 분광법 매핑 실험이 임의의 프로테아제-민감성 부위의 위치를 결정하는데 사용될 것이다 ([Kriwacki, R. W., et al., J. Biomol. Tech. 9(3):5-15 (1980)]). PAL 구조로부터 감수성 영역을 제거 및/또는 보호하기 위해 PEG화 보호 및/또는 돌연변이를 사용하여 모든 주요 감도 부위가 제거될 수 있도록, 이러한 매핑 결과는 프로테아제 감수성의 주요 부위 (예컨대 이미 확인된 2개의 1차 부위)를 결정하는데 중요할 것이다.

실시예 6

PEG 화 NpPAL 및 AvPAL 의 생성

일반적으로, NpPAL 및 AvPAL 양쪽 모두에 대한 PEG화는 단백질을 SUNBRIGHT ME-200HS 20 kDa NHS-활성화 PEG (NOF)와 혼합하는 것을 수반한다.

PEG화에 대한 프로토콜, NHS-활성화 20 kDa 선형 PEG를 사용하는 표준 "HC" 방법:

1) 단백질을 내독소의 존재에 대해 평가하였다.

단백질 용액 (0.1 ㎖)을 0.9 ㎖의 신선한 MQ 물에 희석하고, 0.5 EU/㎖ 감도 수준으로 내독소에 대해 소형(hand-held) Charles River 기구 (EndoPTS)로 테스트하였다. 내독소가 0.5 EU/㎖를 초과하면, 먼저 Mustang E 여과에 의해, 이어서 Sterogene Etox 수지에 의해, 그리고 임의적으로 추가적인 크로마토그래프 정제에 의해 내독소를 감소시켰다. 감소가 제한되었지만, pH 7.8의 DEAE FF (Amersham)에 통과시키는 것에 의해 충분히 유용하였다.

2) 단백질의 농축 및 완충제 교환:

단백질을 25 ㎎/㎖ 초과, 75 ㎎/㎖ 이하로 농축하고, 완충제를 50 mM KPO₄, pH 8.5로 교환하였다. 이러한 농도를 제조하기 위해 스핀 필터가 사용된 경우, 먼저 필터를 완충제 단독으로 감소된 속도 및 시간 (3000 rpm, 3분)에서의 스피닝에 의해 내독소에 대해 테스트한 후, 유지된 완충제를 단계 1에서의 단백질과 동일한 방식으로 내독소에 대해 테스트하였다. 50 mM KPO₄, pH 8.5에 대한 완충제 뱃치 기록/처방은 물 (1 ℓ로 맞춤), 2염기성 인산칼슘 (8.4913 g/ℓ의 48.75 mM), 및 1염기성 인산칼슘 (0.17011 g/ℓ의 1.25 mM)으로 구성되었다. 용액을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 실온에서 보관하였다. 농축 생성물을 Mustang E 필터 애크로디스크를 통해 천천히 여과하였다 (1-2 ㎖/분). 희석되고, 무균성 TBS, pH 7.5로 블랭크화된 샘플을 A280에서 측정하여 단백질 농도를 결정하였다. 흡광 계수는 NpPAL에 대해 0.83, AvPAL에 대해 0.75였다.

3) NpPAL 및 AvPAL 의 PEG 화:

일반적으로 -80℃에서 보관된 PEG를 실온으로 가온하였다. KPO4 완충제를 PEG에 첨가하고, 최대 속도로 와동시키고 튜브를 손으로 세게 흔듦으로써 재현탁시켜, 모든 대형 덩어리가 현탁되는 것을 확실하게 하였다. PEG를 최초로 습윤화시키고 나서 1분 이내에 단백질을 잘 현탁된 PEG 용액에 첨가하고, 매우 부드럽게 뒤집어서 혼합하였다. 알루미늄 호일로 싸인 튜브를 로커(rocker)의 축 상에 놓고, 실온에서 3시간 동안 매우 부드럽게 로킹하였다. 튜브에 TBS (pH 7.5)를 채우고, 무균 여과시켰다. 현탁액을 즉각적으로 제형화하거나, 또는 제형화할 때까지 4℃에서 보관하였다.

4) 제형화

제형 완충제 처방/뱃치 기록은 물 (1ℓ로 맞춤), 트리스-염기 (3.2 mM), 트리스-HCl (16.8 mM), 및 염화나트륨으로 구성되었다; 완충제 용액을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 실온에서 보관하였다. 100 MWCO 재생 셀룰로스 막과 함께 Vivalow 50 (소형 로트) 또는 Vivalfow 200 (대형 로트)를 사용하는 접선형 유동 여과에 완충제 용액을 적용하였다. 용액에 MQ 물, 0.1 N NaOH, 및 또다시 200 ㎖의 물을 플러싱하였다. 용액을 50 ㎖/분 횡단 유동의 TBS, pH 7.5로 평형화시켰다. pH 7.5를 확실히 하도록 투과액의 pH를 결정하였다.

먼저 4회 이상 TBS로 약 3배 희석하고 원래의 부피로 돌려보냄으로써 용액의 완충제를 교환하였다. 횡단 유동은 Vivaflow 50 및 200 양쪽 모두에 대해 전형적으로 180-200 ㎖/분이었다.

최종 생성물을 Mustang E를 통해 여과하였다. 0.1 ㎖를 1.9 ㎖의 신선한 무균수로 희석한 후 내독소의 존재를 평가하였다. 내독소가 1 EU/㎖을 초과하면, Sterogene Etox 젤로 감소시켰다. 제형화된 무균성 PEG화 NpPAL 또는 AvPAL를 바이알 내에 밀봉하고, 생체내 연구에 사용할 때까지 -70℃에서 보관하였다.

실시예 7

PKU 에 걸린 마우스에서의

노스톡 푼크티포르메 PAL ( NpPAL ) 및 이의 PEG 화 형태의 효과

본 연구의 목적은 NpPAL 또는 PEG화 NpPAL의 피하 투여 후의 혈장 페닐알라닌 (Phe) 수준을 결정하는 것이었다.

(1) 3.0 IU/㎖ 용량의 로도스포리디움 토룰로이데스로부터의 라이신 돌연변이체 R91K PAL 및 이의 PEG화 형태 (1:3 PAL:PEG) (Nippon Oil and Fat, NOF으로부터의 PEG); (2) 0.6 IU/㎖ 내지 3.0 IU/㎖ 범위의 용량의 NpPAL 및 이의 PEG화 형태 (1:3 PAL:PEG NOF); 및 (3) 비히클의 효과를 동종접합성 ENU2 마우스 (BTBR^enu2로 또한 공지됨)에서 테스트하였다. R91K PAL는 야생형 로도스포리디움 토룰로이데스 PAL에 비해 활성이 개선된 것으로 기존에 나타났다. R91K는 단백질의 표면 근처의, Asp86 내지 Leu101에 스패닝되는 나선 내에 위치한다. 모든 용액은 내독소가 1.0 EU/㎖ 미만이었고, -75-80℃에서 보관되었다. ENU2 또는 BTBR^enu2 마우스는 중증 고페닐알라닌혈증에 걸린 동물을 초래하는 페닐알라닌 히드록실라제 유전자 (PAH) 유전자좌에서의 동종접합성 돌연변이체이다. 높은 혈장 페닐알라닌 (Phe) 수준은 이러한 동물이 혈장 Phe를 감소시키는 페닐알라닌 암모니아-리아제 (PAL)의 능력을 평가하기 위한 적합한 모델이게 만든다.

실험 디자인

용액을 제1일에 어깨뼈 사이에, 제4일에 오른쪽 복부에, 제8일에 왼쪽 복부에 피하 볼루스를 통해 투여하였다. 25-게이지 바늘 및 1 또는 3cc 주사기를 사용하여 피하 공간 내로 용액을 투여하였다. 각각의 동물에게 상기 표에 기술된 투약 부피의 0.2, 0.4, 0.6 또는 1.0 IU의 테스트 물품을 제공하였다. 할로세인 (1-3％ ㎎/㎏)의 흡입에 의해 동물을 가볍게 마취하고, 또한 손으로 구속하였다. 각각의 용량 투여일과 거의 같은 시기에 용량 투여를 수행하였다.

이환률, 사망률 및 일반적인 건강에 대해 동물들을 매일 관찰하였다. 특히, 발적 또는 부종의 징후에 대해 주사 부위를 관찰하였다. 제-3일, 제8일 및 제12일에 체중을 측정하여 기록하고, 임상 파라미터로 사용하였지만, 투약 부피를 결정하는데 사용하지는 않았다. 혈액 수집 (P-혈장, S-혈청)을 제-3일 (P,S), 제2일 (P), 제4일 투약전 (P), 제5일 (P), 제8일 투약전 (P,S), 제9일 (P,S), 제12일 (P), 및 제23일 (S)에 수행하였다. 약 50-100 ㎕의 전혈을 각각의 시점에 수집하였다 (25-50 ㎕의 혈장 또는 혈청을 위해). 꼬리 정맥으로부터 혈액을 수집하였다. 상기 일정에 지시된 바와 같이 혈장 또는 혈청을 수집하였다. 꼬리 정맥을 천공하고, RAM Scientific Green-Top 모세관 혈액 수집 튜브 (#07 7250)를 사용하여 핏방울을 수집하였다. 혈청 수집을 위해, 핏방울을 첨가물이 없는 튜브 내로 수집하였다. 혈장/혈청을 수확하고, 보관용 튜브 내로 옮겨 -20℃ (혈장) 또는 -80℃ (혈청)에서 보관하였다.

결과

NpPAL 단기 투약 연구에 대한 결과는 과도한 페닐알라닌 수준을 저하시키는 것에서의 PEG화 효소의 효능을 설명하였다. 명백하게, 비-PEG화 NpPAL은 어떠한 주사 후에도, 심지어 면역원성 응답이 있을 수 있기 전에도, 페닐알라닌 수준을 저하시키지 않았다. 따라서, PEG화는 NpPAL이 PKU를 위한 잠재적인 치료가 되기 위한 절대적인 필요조건이다 (도 5).

실시예 8

PKU 에 걸린 마우스에서의

아나바에나 바리아빌리스 PAL ( AvPAL ) 및 이의 PEG 화 형태의 효과

본 연구의 목적은 AvPAL 또는 PEG화 AvPAL의 피하 투여 후의 혈장 페닐알라닌 (Phe) 수준을 결정하는 것이었다.

(1) 3.0 IU/㎖ 용량의 로도스포리디움 토룰로이데스로부터의 라이신 돌연변이체 R91K PAL 및 이의 PEG화 형태 (1:3 PAL:PEG) (Nippon Oil and Fat, NOF으로부터의 PEG); (2) 0.6 IU/㎖ 및 3.0 IU/㎖ 용량의 AvPAL 및 이의 PEG화 형태 (1:3 PAL:PEG NOF); 및 (3) 비히클의 효과를 동종접합성 ENU2 마우스 (BTBR^enu2로 또한 공지됨)에서 테스트하였다. R91K PAL는 야생형 로도스포리디움 토룰로이데스 PAL에 비해 활성이 개선된 것으로 기존에 나타났다. R91K는 단백질의 표면 근처의, Asp86 내지 Leu101에 스패닝되는 나선 내에 위치한다. 모든 용액은 내독소가 1.0 EU/㎖ 미만이었고, -75-80℃에서 보관되었다. ENU2 또는 BTBR^enu2 마우스는 중증 고페닐알라닌혈증에 걸린 동물을 초래하는 페닐알라닌 히드록실라제 유전자 (PAH) 유전자좌에서의 동종접합성 돌연변이체이다. 높은 혈장 페닐알라닌 (Phe) 수준은 이러한 동물이 혈장 Phe를 감소시키는 페닐알라닌 암모니아-리아제 (PAL)의 능력을 평가하기 위한 적합한 모델이게 만든다.

실험 디자인

용액을 제1일, 제4일 및 제8일에 동물의 등에 피하 볼루스를 통해 투여하였다. 25-게이지 바늘 및 1 또는 3cc 주사기를 사용하여 피하 공간 내로 용액을 투여하였다. 각각의 동물에게 상기 표에 기술된 투약 부피의 0.2, 0.4, 0.6 또는 1.0 IU의 테스트 물품을 제공하였다. 할로세인 (1-3％ ㎎/㎏)의 흡입에 의해 동물을 가볍게 마취하고, 또한 손으로 구속하였다. 각각의 용량 투여일과 거의 같은 시기에 용량 투여를 수행하였다.

이환률, 사망률 및 일반적인 건강에 대해 동물들을 매일 관찰하였다. 특히, 발적 또는 부종의 징후에 대해 주사 부위를 관찰하였다. 제-3일, 제8일 및 제12일에 체중을 측정하여 기록하고, 임상 파라미터로 사용하였지만, 투약 부피를 결정하는데 사용하지는 않았다. 혈액 수집 (P-혈장, S-혈청)을 제-3일 (P,S), 제2일 (P), 제4일 투약전 (P), 제5일 (P), 제8일 투약전 (P,S), 제9일 (P,S), 제12일 (P), 및 제23일 (S)에 수행하였다. 약 50-100 ㎕의 전혈을 각각의 시점에 수집하였다 (25-50 ㎕의 혈장 또는 혈청을 위해). 꼬리 정맥으로부터 혈액을 수집하였다. 상기 일정에 지시된 바와 같이 혈장 또는 혈청을 수집하였다. 꼬리 정맥을 천공하고, RAM Scientific Green-Top 모세관 혈액 수집 튜브 (#07 7250)를 사용하여 핏방울을 수집하였다. 혈청 수집을 위해, 핏방울을 첨가물이 없는 튜브 내로 수집하였다. 혈장/혈청을 수확하고, 보관용 튜브 내로 옮겨 -20℃ (혈장) 또는 -80℃ (혈청)에서 보관하였다.

결과

AvPAL 단기 투약 연구에 대한 결과는 과도한 페닐알라닌 수준을 저하시키는 것에서의 PEG화 효소의 효능을 설명하였다. 명백하게, 비-PEG화 AvPAL은 어떠한 주사 후에도, 심지어 면역원성 응답이 있을 수 있기 전에도, 페닐알라닌 수준을 저하시키지 않았다. 따라서, PEG화가 AvPAL이 PKU를 위한 잠재적인 치료가 되기 위한 절대적인 필요조건인 것으로 나타났다 (도 6).

실시예 9

PKU 에 걸린 마우스에서의

비- PEG 화 및 PEG 화 R91K PAL 및 PEG 화 NpPAL 의 장기 (90일) 내성 연구

본 연구의 목적은 페닐케톤뇨증의 질환 모델인 ENU/2 마우스에서 PEG화 및 비-PEG화 R91K PAL 및 PEG화 NpPAL을 장기 (90일) 투약하는 것의 약역학 파라미터 및 면역원성 효과를 평가하는 것이었다.

각각의 테스트 물품 (R91K 및 이의 PEG화 형태인 R91KPAL:PEG 1:3, npPAL 및 이의 PEG화 형태인 npPAL:PEG 1:3 NOF, 및 비히클 트리스-HCl)의 2개의 뱃치를 생산하여, 하나는 연구의 처음 절반에 사용하고, 나머지는 연구의 후반 절반에 사용하였다. 테스트 용액을 -70℃ 내지 -80℃에서 보관하였다. 총 55마리 (n= 용량 군 당 3-7마리)의 동종접합성 ENU2 마우스 (BTBR^enu2로 또한 공지됨)을 사용하였고, 어떠한 상황에서도 나이브(naive)하지 않은 동물 (이전에 PAL이 주사된 마우스)이 사용되지 않았다.

실험 디자인

용량 투여를 제1군, 제4군, 제5군, 제8군 및 제9군에 대해 하루에 1번 수행하였다. 제2군 및 제6군 (b.i.w.)은 일주일에 2번씩 제1일 및 제4일에, 예를 들어, 월요일 및 목요일마다 투약하였다. 제3군 및 제7군 (b.i.w. 3주후)은 제1일 및 제8일에 투약한 후 다시 제22일에 투약하고, 이후부터는 일정이 제2군 및 제6군에 필적하였다 (매주 월요일 및 목요일). 제10군은 일주일에 한번 투약하였다. 어깨뼈 사이의 피하 공간 내로 25 또는 26-게이지 바늘 및 1 cc 주사기를 사용하여 피하 주사 (볼루스)에 의해 테스트 용액을 투여하였다. 테스트 용액 활성 (IU/㎖) 및 용량 수준 (IU/마우스)를 사용하여 계산된 미리 정해진 투약 부피를 각각의 동물에게 제공하였다. 각각의 용량 투여일과 거의 같은 시기에 용량 투여를 수행하였다.

이환률, 사망률 및 일반적인 건강에 대해 동물들을 매일 관찰하였다. 특히, 발적 또는 부종의 징후에 대해 주사 부위를 관찰하였다. 일주일에 한번씩 (제-3일, 제5일, 제12일 등, 예를 들어 매주 금요일), 및 연구 종료 시에 체중을 측정하여 기록하였다. 마우스가 사망하거나, 빈사 상태로 인해 예정에 없이 종료된 경우, 그 시점을 기록하였다. 약 100 ㎕의 전혈을 각각의 시점에 수집하였다 (25 ㎕의 혈장 및 25 ㎕의 혈청을 위해). 의식이 있는 동물로부터 꼬리 정맥 천공을 통해 혈액을 수집하였다. RAM Scientific Green-Top 모세관 혈액 수집 튜브 (#07 7250)를 사용하여 혈장용 핏방울을 수집하였다. 혈청 수집을 위해, 핏방울을 첨가물이 없는 튜브 내로 수집하였다. 혈액 샘플을 얼음물 상에서 2시간 이하로 보관한 후, 원심분리에 의해 혈장/혈청으로 분리하고, 분석법에서 평가할 때까지 -70 내지 -80℃에서 보관하였다. 페닐알라닌 및 항체 역가 양쪽 모두의 결정을 위해 혈장 및 혈청용으로 혈액을 하기의 날짜에 수집하였다: 제-3일 (연구 시작 전), 제9일, 제17일, 제24일, 제31일, 제38일, 제45일, 제52일, 제59일, 제66일, 제73일, 제80일, 제87일 및 제91일. 제89일에, 제1군, 제5군, 제9군 및 제10군의 동물로부터 혈액 및 혈장을 또한 수집하였다. 각각의 주의 단일 시점은 투약에 대한 혈액 Phe 응답의 정확한 개관을 제공하지 않을 수 있다. 추가적인 시점들이 Phe 수준이 투약들 간에 변하는지 여부를 나타냈다. 현재까지 시도된 모든 투약 요법에서 PD 효과가 상실된 시점을 표시하기 때문에, 제9일 샘플이 연구 통합성에 매우 중요하였다. 100 ㎕의 최종 혈액 샘플을 수집하였다.

결과

도 7에 나타난 장기 투약 연구는 10주 기간에 걸친 수많은 매주 주사 후의 지속적인 효능을 나타낸다 (NpPAL-PEG).

실시예 10

AvPAL 변이체 (시스테인 돌연변이체)의 생성

박테리아에서 발현된 재조합 단백질에서 발생하는 응집을 감소시키기 위해 AvPAL 폴리펩티드에 아미노산 치환을 일으켰다. 단백질 응집은 생체 내에서 효소 활성을 감소시킬 수 있고/있거나 면역원성을 증가시킬 수 있다. 한 이같은 형태의 응집은 사슬간 디술피드 결합이 형성된 결과로 발생한다. 이러한 가능성을 최소화하기 위해, 다양한 AvPAL 시스테인 잔기가, 단독으로 또는 조합되어, 세린 잔기로 교체되었다.

AvPAL 폴리펩티드에는 위치 64, 235, 318, 424, 503 및 565에 6개의 시스테인 잔기가 있다 (서열 4). 하기의 AvPAL 단일 시스테인 돌연변이체가 생성되었다: AvPAL_C64S (서열 7), AvPAL_C318S (서열 8), AvPAL_C503S (서열 9) 및 AvPAL_C565S (서열 10). AvPAL 이중 시스테인 돌연변이체인 AvPAL_S565SC503S (서열 11)이 또한 생성되었다. 도 8은 이러한 AvPAL 시스테인 돌연변이체들의 아미노산 서열을 나타낸다.

클로닝

AvPAL 유전자를 전방향 프라이머 AvarPALfor (5'-CACTGTCATATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3') (서열 18) 및 역방향 프라이머 AvarPALrev (5'-CACTGTCTCGAGATGCAAGCAGGGTAAGATATCTTG-3') (서열 19)으로 아나바에나 바리아빌리스 게놈 DNA (ATCC 29413-U, Qiagen DNeasy 키트)로부터 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물을 Taq으로 처리한 후, pCR2.1 TOPO TA (Invitrogen) 내로 결찰시켰다. 생성된 플라스미드 1p40으로 명명하였다.

SOE-PCR에 의해 5' NheI 부위를 부가하고 내부 NheI 부위를 제거하였다. 상류 AvPAL 단편을 1p40으로부터 전방향 프라이머 N-Nhe-AvPAL (5'-CACTGTGCTAGCATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3') (서열 20) 및 역방향 프라이머 Nhe-AvPALrev (5'-GGAAATTTCCTCCATGATAGCTGGCTTGGTTATCAACATCAATTAGTGG-3') (서열 21)으로 증폭시켰고, 하류 AvPAL 단편을 1p40으로부터 전방향 프라이머 Nhe-AvPALfor (5'-CCACTAATTGATGTTGATAACCAAGCCAGCTATCATGGAGGAAATTTCC-3') (서열 22) 및 역방향 프라이머 AvPALrev-r (5'-ACAGTGGCGGCCGCTTAATGCAAGCAGGGTAAGATATCTTG-3') (서열 23)으로 증폭시켰다. 단일 PCR 반응에서, 2개의 PCR 생성물을 어닐링시키고 DNA 중합효소로 확장시켜 전장 AvPAL 유전자가 생산된 후, 이를 프라이머 N-Nhe-AvPAL 및 AvPALrev-r로 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물을 NheI로 소화시키고, 클레노우로 평활말단화시키고, NotI으로 소화시키고, pET28a+ 벡터 (NdeI로의 소화, 클레노우로의 평활말단화 및 NotI으로의 소화에 의해 제조됨) 내로 결찰시켰다. 생성된 플라스미드를 3p86-23으로 명명하였다.

새로운 제한 부위를 PCR에 의해 부가하였다. AvPAL을 플라스미드 3p86-23으로부터 전방향 프라이머 AvEcoRIfor (5'-CACTGTGAATTCATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3') (서열 24) 및 역방향 프라이머 AvSmaIrev (5'-CACTGTCCCGGGTTAATGCAAGCAGGGTAAGATATCT-3') (서열 25)로 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물을 EcoRI 및 SmaI으로 소화시키고, EcoRI 및 SmaI으로 소화된 pIBX7 벡터 내로 결찰시켰다. 생성된 플라스미드를 7p56 Av3으로 명명하였다.

시스테인 돌연변이체

AvPAL 폴리펩티드의 위치 503 및 565에 상응하는, AvPAL 유전자 내의 2개의 시스테인 코돈을 부위-지정 돌연변이유발 (QuickChange XL II, Stratagene)에 의해 세린 코돈으로 치환하였다. 전방향 프라이머 Av_C503S (5'-GTCATTACGATGCACGCGCCTCTCTATCACCTGCAACTGAG-3') (서열 26) 및 역방향 프라이머 Av_C503Srev (5'-CTCAGTTGCAGGTGATAGAGAGGCGCGTGCATCGTAATGAC-3') (서열 27)으로의 PCR에 의해 플라스미드 7p56 Av3에서 위치 503의 시스테인 코돈을 세린 코돈으로 교환하였다. 세린 코돈에 밑줄이 그어지고, 코딩 가닥에서의 G→C 돌연변이 (비-코딩 가닥에서의 C→G 돌연변이)가 볼드체로 표시된다. 생성된 플라스미드를 J282로 명명하였다. 전방향 프라이머 Av_C565S (5'-CAGTTCAAGATATCTTACCCTCCTTGCATTAACCCGGGCTGC-3') (서열 28) 및 역방향 프라이머 Av_C565Srev (5'-GCAGCCCGGGTTAATGCAAGGAGGGTAAGATATCTTGAACTGO') (서열 29)로 플라스미드 J282에서 위치 565의 시스테인 코돈을 세린 코돈으로 교환하였다. 세린 코돈에 밑줄이 그어지고, 코딩 가닥에서의 G→C 돌연변이 (비-코딩 가닥에서의 C→G 돌연변이)가 볼드체로 표시된다. 생성된 플라스미드를 j298a로 명명하였다.

AvPAL 폴리펩티드의 위치 64, 318 및 565에서의 AvPAL 유전자 내의 시스테인 코돈을 하기의 프라이머 쌍들을 사용하여 유사하게 세린 코돈으로 치환하였다: C64S, 전방향 프라이머 Av_C64S (5'-GCAGGGTATTCAGGCATCTICTGATTACATTAATAATGCTGTTG-3') (서열 30) 및 역방향 프라이머 Av_C64Srev (5'-CAACAGCATTATTAATGTAATCAGAAGATGCCTGAATACCCTGC-3') (서열 31); C318S, 전방향 프라이머 Av_C318S (5'-CAAGATCGTTACTCACTCCGAICCCTTCCCCAGTATTTGGGGC-3') (서열 32) 및 역방향 프라이머 Av_C318Srev (5'-GCCCCAAATACTGGGGAAGGGATCGGAGTGAGTAACGATCTTG-3') (서열 33); 및 C565S, 전방향 프라이머 Av_C565S (서열 28) 및 역방향 프라이머 Av_C565Srev (서열 29). 세린 코돈에 밑줄이 그어지고, 코딩 가닥에서의 G→C 돌연변이 및 비-코딩 가닥에서의 C→G 돌연변이가 볼드체로 표시된다.

실시예 11

AvPAL 변이체 (시스테인 돌연변이체)의 시험관내 효소 활성

본 연구의 목적은 시험관내 페닐알라닌 암모니아-리아제 (PAL) 효소 활성에 대한 AvPAL 폴리펩티드 내의 다양한 시스테인 잔기의 세린 치환의 효과를 결정하는 것이었다.

AvPAL 변이체 (즉, 시스테인 돌연변이체)를 실시예 10에 기술된 바와 같이 클로닝하였다. AvPAL 시스테인 돌연변이체 발현 플라스미드를 박테리아 내로 형질전환시키고, AvPAL 시스테인 돌연변이체 폴리펩티드를 실시예 1에 기술된 바와 같이 발현시키고, 실시예 2에 기술된 바와 같이 정제하였다.

야생형 (WT) AvPAL 및 AvPAL 시스테인 돌연변이체를 실시예 3에 기술된 바와 같이 시험관내 PAL 효소 활성에 대해 테스트하였다. 표 7은 비-PEG화 WT AvPAL와 비교하여, 정제된 비-PEG화 AvPAL 시스테인 돌연변이체 단백질의 시험관내 PAL 비 활성이 위치 64의 시스테인 잔기의 세린 치환 (AvPAL_C64S)에 의해 감소되었지만, 위치 503 또는 565 중 하나, 또는 위치 503 및 565 양쪽 모두의 시스테인 잔기의 세린 치환 (각각 AvPAL_C503S, AvPAL_C565S, 및 AvPAL_C565SC503S)에 의해 불리하게 영향을 받지 않았음을 나타낸다.

세린 잔기의 도입이 PEG화 AvPAL 단백질의 효소 활성에 대한 효과가 있는지 여부를 결정하기 위해, WT AvPAL 및 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL_C565SC503S를 실시예 6에 기술된 바와 같이 PEG화시켰다. 표 7은 PEG화 AvPAL 단백질의 시험관내 PAL 비 활성이 위치 503 및 565 양쪽 모두에서의 시스테인 잔기의 세린 치환에 의해 불리하게 영향을 받지 않았음을 나타낸다.

실시예 12

AvPAL 변이체 (시스테인 돌연변이체)의 시험관내 생화학적 특성화

본 연구의 목적은 (1) 가속 안정성; (2) 응집물 형성; 및 (3) 부위-특이적 PEG화에 대한 AvPAL 폴리펩티드 내의 다양한 시스테인 잔기의 세린 치환의 효과를 결정하는 것이었다.

가속 안정성

정제된 PEG화 또는 비-PEG화 AvPAL 시스테인 돌연변이체를 다양한 기간 동안 37℃에서 보관한 후, 이러한 단백질들의 시험관내 PAL 비 활성을 실시예 3에 기술된 바와 같이 측정함으로써, 시험관내 안정성에 대한 AvPAL 내의 시스테인 잔기의 세린 치환의 효과를 결정하였다.

PEG화되지 않은 또는 PEG화된, 야생형 AvPAL 및 AvPAL 시스테인 돌연변이체를 실시예 11에 기술된 바와 같이 제조하였다.

도 9A에 나타난 바와 같이, 비-PEG화 AvPAL 단백질의 비 활성은 37℃에서 5일 이상 동안 안정적이었고, 위치 565, 또는 위치 503 및 565에서의 시스테인 잔기의 세린 치환에 의해 불리하게 영향을 받지 않았다. 유사하게, 도 9B에 나타난 바와 같이, PEG화 AvPAL 단백질의 비 활성은 37℃에서 6일 이상 동안 안정적이었다. 단일 시스테인 AvPAL 돌연변이체 AvPAL_C565S는 37℃에서의 6일 후 야생형 AvPAL 및 이중 시스테인 AvPAL 돌연변이체 AvPAL_C565SC503S에 비해 다소 감소된 안정성을 나타냈다.

응집물 형성

정제된 비-PEG화 야생형 AvPAL 및 AvPAL 시스테인 돌연변이체를 변성 및 천연 젤 전기영동에 의해 또는 SEC-HPLC에 의해 분리함으로써, 용액 내에서의 단백질 응집물 형성에 대한 AvPAL 내의 시스테인 잔기의 세린 치환의 효과를 결정하였다.

정제된 AvPAL 제제를 변성 조건 (4-12％ NuPAGE 비스-트리스) 또는 천연 조건 (8％ 트리스-Gly, pH 8.3) 하에서의 젤 전기영동에 의해 분리하였다. 분리된 AvPAL 단백질을 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로 염색하였다.

정제된 AvPAL 제제를 SEC-HPLC에 의해 분리하였다. AvPAL 단백질을 TSK 젤 컬럼 (G3000SWxl 7.8 ㎜×30 ㎝, 5 ㎛ (Tosoh Bioscience, LLC))에서 20 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl, pH 6.9에 로딩하고, 0.5 ㎖/분의 유속으로 용출시켰다. 분리된 AvPAL 단백질을 Agilent의 1100 시리즈 분광계에서 분석하였다.

젤 전기영동 (도 10A) 또는 SEC-HPLC (도 10B)에 의해 판단된 바와 같이, 야생형 AvPAL 제제 및 AvPAL_C503S 및 AvPAL_C64S 제제 내에는 응집물이 존재하였지만, AvPAL_C565S 및 AvPAL_C565SC503S 제제 내에는 존재하지 않았다.

부위-특이적 PEG 화

야생형 AvPAL 및 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL_C503SC565S를 실시예 6에 기술된 바와 같이 PEG화시킨 후, AvPAL 라이신 잔기 K2, K10, K32, K115, K145, K195, K301, K335, K413, K419, K493, K494 및 K522에서의 상대적인 PEG화를 비교함으로써, 부위-특이적 PEG화에 대한 AvPAL 내의 시스테인 잔기의 세린 치환의 효과를 결정하였다.

약 100 ㎍ (10 ㎍/㎕의 경우 10 ㎕)의 비-PEG화 또는 PEG화 AvPAL 단백질을 8 M 요소에서 변성시켰다. 그후, 변성된 단백질을 100 ㎕ 반응 부피로 트립신으로 pH 8.2에서 하룻밤 (약 20시간) 동안 37℃에서 소화시켰다. 트립신으로 소화된 단백질을 37℃에서 1시간 동안 1 ㎕의 1 M DTT로 처리하여 환원시킨 후, 3 ㎕ 15％ TFA로 켄칭(quenching)시켰다. 소화된 단백질들을 C18 역상 컬럼에서 분리하였다. 상응하는 비-PEG화 펩티드의 차감 펩티드 매핑에 의해 PEG화 AvPAL 펩티드 각각의 PEG화 백분율을 계산하였다.

도 11에 나타난 바와 같이, 1:3의 AvPAL 단백질:PEG 비율에서, 이중 시스테인 돌연변이체 C565SC503S의 PEG화 백분율이 야생형 AvPAL과 비교하여 더 낮은 K419는 제외될 수 있지만, 모든 라이신 (K) 잔기의 PEG화 백분율에서의 인상적인 차이가 없었다. 그러나, 증가되는 AvPAL 단백질:PEG 비율에서 이중 시스테인 돌연변이체를 사용하여 수득된 결과에서 용량-응답 관계가 관찰되지 않았고, 이를 비교적 작은 PEG화 백분율과 함께 고려하면, K1419에서 관찰된 차이가 의미가 있는 것 같지 않음을 가리킨다. 따라서, 위치 503 및 565에서의 시스테인 잔기의 세린 치환은 AvPAL의 부위-특이적 PEG화에 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다.

실시예 13

AvPAL 단백질의 응집 메커니즘

박테리아에서 발현된 AvPAL 단백질의 응집 메커니즘을 조사하기 위해 연구를 수행하였다.

정제된 AvPAL 제제를 농축하는 것, 및 농축된 단백질 용액을 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하는 것은 정제된 AvPAL 단백질의 용액 내에서의 응집을 가속화하였다. SEC-HPLC에 의해 AvPAL 단백질을 분리함으로써 응집을 검출하였다. 디술피드 가교가 응집을 초래하는지 여부를 결정하기 위해, 농축된 단백질 용액에 50 mM 디티오트레이톨 (DTT)을 첨가한 후, 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.

박테리아에서 발현된 AvPAL 단백질을 실시예 2에 기술된 바와 같이 정제하고, 스핀 필터 (Millipore Biomax -10K NMWL)를 사용하여 농축하였다. 단백질을 에펜도르프 원심분리기 5415C에서 수분 동안 약 15,000 g에서 스피닝하였다. 응집하는 경향이 있는 시스테인 돌연변이체 (예를 들어, AvPAL_C503S 및 AvPAL_C64S)에 대해, 단백질을 약 20 ㎎/㎖로 농축하고, 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 응집에 대해 저항성인 시스테인 돌연변이체 (예를 들어, AvPAL_C565S 및 AvPAL_C565SC503S)에 대해, 단백질을 약 40 ㎎/㎖로 농축하고, 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.

표 8에 나타난 바와 같이, 정제된 AvPAL 시스테인 돌연변이체 AvPAL_C64S 및 AvPAL_C503S의 제제는 37℃에서 2시간 동안의 인큐베이션 시 응집물을 형성하였다. 예상대로, AvPAL 단백질이 37℃에서 2시간 동안의 인큐베이션 전에 농축되었을 때 이러한 응집이 악화되었다. 농축된 단백질이 DTT에 노출됨으로써 응집이 차단될 수 있었고, 이는 응집이 디술피드 가교로 인한 것임을 가리킨다. 반면에, 정제된 AvPAL 시스테인 돌연변이체 AvPAL_C565S 및 AvPAL_C565SC503S의 제제는 37℃에서 2시간 동안의 인큐베이션 시 응집물을 형성하지 않았고, 이는 위치 565의 시스테인 잔기가 디술피드 가교를 통해 AvPAL의 응집에서 수반된다는 것을 가리킨다.

어떤 시스테인 잔기가 유리 술프히드릴로 존재하는지를 결정하기 위해, 정제된 AvPAL 제제를 8 M 요소의 존재 하에 변성시키고, 요오도아세트아미드에 의해 알킬화시키고, 트립신으로 소화시키고, LC/MS에 의해 분석하였다. 모든 AvPAL 시스테인 잔기가 요오도아세트아미드로 표지되었고, 이는 박테리아에서 발현된 AvPAL의 모든 시스테인 잔기가 유리 술프히드릴로 존재한다는 것을 가리킨다.

어떤 시스테인 잔기가 천연 단백질의 표면 상에 존재하는지를 결정하기 위해, 정제된 AvPAL 제제를 먼저 N-에틸말레이미드 (NEM)로 처리한 후, 8 M 요소의 존재 하에 변성시키고, 요오도아세트아미드에 의해 알킬화시키고, 트립신으로 소화시키고, LC/MS에 의해 분석하였다. 위치 235 및 424의 시스테인 잔기는 NEM에 의해 알킬화되지 않았고, 위치 318의 시스테인 잔기는 NEM에 의해 부분적으로만 알킬화되었으며, 이는 위치 64, 503 및 565의 시스테인 잔기는 천연 AvPAL의 표면 상에 있고 위치 318의 시스테인 잔기는 천연 AvPAL의 표면 상에 부분적으로 노출된다는 것을 가리킨다.

어떤 시스테인 잔기가 사슬간 디술피드 가교에 수반되는지를 결정하기 위해, 정제된 비-PEG화 야생형 AvPAL 제제의 0.7 ㎎/㎖ 용액 67 ㎕를 8M 요소에서 1시간 동안 변성시킨 후, 100 ㎕ 반응 부피로 트립신으로 pH 8.2에서 하룻밤 (약 17.5시간) 동안 25℃에서 소화시켰다. 트립신으로 소화된 단백질을 분리하고, 예측되는 디술피드 쌍에 상응하는 펩티드들이 전체 이온 카운트 (TIC)로서 확인 및 정량되는 질량 분광법에 의해 분석하였다.

표 9는 C503-C503, C503-C565, C565-C318 및 C565-C565에 대해 디술피드 쌍이 검출되었음을 나타낸다. 위치 565의 시스테인 잔기 및 더 적은 정도로 위치 503의 시스테인 잔기가 정제된 AvPAL 제제 내의 디술피드 쌍에서 발견되었다.

디술피드 가교 이외의 어떤 추가적인 메커니즘이 AvPAL 단백질 응집에서 수반될 수 있는지를 결정하기 위해 연구를 수행하였다.

정제된 AvPAL 제제를 0.05％ 트윈 또는 10 mM EDTA와 함께 인큐베이션한 후, 실시예 12에 기술된 바와 같이 SEC-HPLC에 의해 분리하였다. 트윈은 소수성 상호작용으로 인한 단백질 응집을 감소시키고, EDTA는 2가 양이온의 존재로 인한 단백질 응집을 감소시킨다. 도 12에 나타난 바와 같이, 0.05％ 트윈 또는 10 mM EDTA에의 노출은 AvPAL 단백질 응집에 대한 효과가 없었다. 10 mM EDTA로 처리된 AvPAL의 10분에서의 추가적인 피크는 210 nm에서의 EDTA의 흡광도로 인한 것이다.

AvPAL 단백질 응집에서의 디술피드 가교의 역할을 추가로 조사하기 위해, 정제된 AvPAL을 DTT로의 처리에 의해 환원시킨 후, SEC-HPLC에 의한 분리 전에 탈염시켰다. 도 13A에 나타난 바와 같이, AvPAL 단백질 응집이 DTT로의 처리에 의해 최소화되었고, 37℃에서 18시간 동안의 인큐베이션 후 응집물이 재형성되었다. 반면에, 도 13B에 나타난 바와 같이, DTT에 노출된 후, 탈염되고 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션되기 전에, N-메틸말레이미드 (NEM)로의 처리에 의해 AvPAL 표면 시스테인이 변형되면 (즉, 알킬화되면), 응집물이 재형성되지 않았다.

상기를 기초로, 박테리아에서 발현된 AvPAL의 응집이 단지 사슬간 디술피드 결합의 형성으로 인한 것이고, 소수성 효과 또는 2가 양이온의 존재로 인한 것이 아닌 것으로 보인다. 위치 565 및 503에서의 시스테인 잔기가 AvPAL 제제에서의 사슬간 디술피드 결합 형성에 수반된다.

실시예 14

마우스에서의 AvPAL 변이체 (시스테인 돌연변이체) 및 이의 PEG 화 형태의 효과

본 연구의 목적은 마우스에서의 생체내 페닐알라닌 (Phe) 수준에 대한 AvPAL 폴리펩티드 내의 위치 503 및 565에서의 시스테인 잔기의 세린 치환의 효과를 결정하는 것이었다.

PEG화 형태의 AvPAL 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL_C565SC503S를 기본적으로 실시예 8에 기술된 바와 같이 동종접합성 ENU2 (BTBR^enu2로 또한 공지됨) 마우스에서 생체내 활성에 대해 테스트하였다. ENU2 마우스는 중증 HPA에 걸린 동물을 초래하는 PAH 유전자좌에서의 동종접합성 돌연변이체이다. 높은 혈장 Phe 수준은 이러한 동물이 혈장 Phe를 감소시키는 PAL의 능력을 평가하기 위한 적합한 모델이게 만든다.

첫번째 연구에서, AvPAL 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL_C565SC503S를 다양한 용량에서 테스트하였다. ENU2 마우스 (수컷 및 암컷)을 5개의 용량 군으로 나누었다: 4개의 테스트 군 (n=4) 및 1개의 비히클 군 (n=2). 각각의 마우스에게 비히클, 낮은 용량의 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL (0.25 IU), 중간 용량의 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL (1.0 IU), 높은 용량의 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL (4.0 IU), 또는 PEG화 야생형 AvPAL (4.0 IU)을 1주일에 1번씩 8회 피하 투여로 제공하였다. 혈장을 투약 전 및 투약하고 나서 48시간 후에 수집하였고 (제57일까지), Phe 수준에 대해 분석하였다. 항-AvPAL 항체 수준의 분석을 위해 투약 전 및 투약하고 나서 48시간 후에 혈청을 또한 수집하였다 (제57일까지). 또한 최초의 투약 2일 전부터 시작하여 1주일에 1번씩 마우스를 칭량하였다 (제40일까지).

연구 도중 2마리의 마우스가 사망하였는데, 1마리는 비히클로 처리된 마우스였고, 1마리는 낮은 용량의 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL로 처리된 마우스였다. 도 14에 나타난 바와 같이, PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL의 각각의 피하 주사 48시간 후 Phe 수준에서의 용량-의존적 감소가 혈장에서 관찰되었다. 등가의 용량에서, PEG화 야생형 AvPAL 또는 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL로 처리된 마우스들 간에 혈장 Phe 수준에서의 차이가 없었다. 도 15에 나타난 바와 같이, 또한 비히클, PEG화 야생형 AvPAL, 또는 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL로 처리된 마우스들 간에 체중에서의 상당한 차이가 없었다. 수컷 및 암컷 마우스 양쪽 모두가 연구에서 사용되었기 때문에 체중에서의 상당한 차이가 관찰되지 않았을 것이다.

이러한 마우스들에서의 항-AvPAL 항체 역가를 간접적인 ELISA 분석법으로 분석하였다. 이러한 분석법에서, 미량역가 플레이트를 AvPAL로 코팅하고, 차단한 후, 각각의 마우스 혈액으로부터의 적합하게 희석된 혈청에 노출시켰다. 혈청 샘플 내에 존재하는 AvPAL-특이적 항체가 미량역가 플레이트의 표면에 결합된 AvPAL를 인식하여 이에 결합하였다. 결합된 항-AvPAL 항체를 검출가능하게 표지된 염소 항-마우스 IgG 항체가 검출하였다. 초기에 혈청 샘플을 1:50으로 희석하였고, 1:50으로 희석된 풀링된 마우스 혈청으로부터 유래된 "차단점(cutpoint)"과 비교하여 분석하였다. 차단점보다 신호가 낮은 샘플은 <50, 또는 "음성"으로 보고되었다. "양성"으로 간주되는 나머지 샘플들을 신호가 차단점 미만으로 떨어진 희석물로 1:3 시리즈의 적정에서 추가로 희석하였다. 양성 신호 (즉, 차단점보다 높은 신호)를 제공한 가장 높은 희석 인자가 샘플의 역가로 보고되었다. 이러한 역가 시리즈에서, 변화가 차단점 수준에서의 신호의 최소 변화의 결과일 수 있기 때문에 역가의 3배 변화는 검출된 항체의 유의한 차이를 반영하지 않을 수 있다.

표 10에 나타난 바와 같이, 등가의 용량 (4.0 IU)의 PEG화 야생형 AvPAL로 처리된 마우스와 비교하여 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL로 처리된 마우스에서 항-AvPAL 항체 역가가 더 낮았다. 명확한 용량 응답이 관찰되지는 않았지만, 높은 용량 (4.0 IU)의 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL로 처리된 마우스는 낮은 용량 (0.25 IU)의 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL로 처리된 마우스보다 항-AvPAL 항체 역가가 더 높았다.

4.0 IU PEG화 야생형 AvPAL과 비교하여 4.0 IU의 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL이 투여된 마우스에서의 감소된 항-AvPAL IgG 역가가 연구 전반에 걸쳐 유지되었다.

두번째 연구에서, AvPAL 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL_C565SC503S를 상이한 PEG화 비율에서 테스트하였다. 수컷 ENU2 마우스를 5개의 용량 군으로 나누었다: 4개의 테스트 군 (n=4) 및 1개의 비히클 군 (n=2). 각각의 마우스에게 비히클, 낮은 용량의 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL (4 IU 및 1:1.6 AvPAL:PEG 비율), 중간 용량의 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL (4 IU 및 1:2.4 AvPAL:PEG 비율), 높은 용량의 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL (4 IU 및 1:3 AvPAL:PEG 비율), 또는 PEG화 야생형 AvPAL (4 IU 및 1:3 AvPAL:PEG 비율)을 1주일에 1번씩 8회 피하 투여로 제공하였다. 혈장을 투약 전 및 투약하고 나서 4일 후에 수집하였고 (제61일까지), Phe 수준에 대해 분석하였다. 항-AvPAL 항체 수준의 분석을 위해 투약 전 및 투약하고 나서 4일 후에 혈청을 또한 수집하였다 (제57일까지). 또한 최초의 투약 2일 전부터 시작하여 1주일에 1번씩 마우스를 칭량하였다 (제40일까지).

연구 도중 1마리의 비히클로 처리된 마우스가 사망하였다. 도 16에 나타난 바와 같이, PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL의 각각의 피하 주사 4일 후 Phe 수준에서의 PEG 비율-의존적 감소가 혈장에서 관찰되었다. 등가의 PEG 비율에서, PEG화 야생형 AvPAL 또는 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL로 처리된 마우스들 간에 혈장 Phe 수준에서의 차이가 없었다. 도 17에 나타난 바와 같이, PEG화 야생형 AvPAL 또는 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL로 처리된 마우스의 체중이 비히클로 처리된 마우스보다 상당히 더 높았다.

이러한 마우스들에서의 항-AvPAL 항체 역가를 상기에 기술된 간접적인 ELISA 분석법으로 분석하였다.

표 11에 나타난 바와 같이, 등가의 용량의, AvPAL 대 PEG의 비율 (1:3)이 동일한 PEG화 야생형 AvPAL로 처리된 마우스와 비교하여 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL로 처리된 마우스에서 항-AvPAL 항체 역가가 더 낮았다. 단백질, 예컨대 AvPAL의 PEG화가 감소된 생체내 면역원성과 관련된다는 예상과 일치하여, 항-AvPAL 항체 역가와 AvPAL 대 PEG 비율 간에 반비례하는 용량 응답이 관찰되었다.

상기의 결과는 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL AvPAL_C565SC503S에 PEG화 야생형 AvPAL에 필적하는 생체내 PAL 효소 활성이 있다는 것을 나타낸다. 비-PEG화 야생형 AvPAL에는 검출가능한 생체내 PAL 효소 활성이 없었기 때문에 (실시예 8 참조), PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL인 AvPAL_C565SC503S이 포함되는 AvPAL 변이체, 및 PEG화 야생형 AvPAL이 야생형 AvPAL보다 페닐알라닌 전환 활성이 더 많은 것으로 결론지어진다.

상기의 결과는 위치 503 및 565 양쪽 모두에서의 시스테인 → 세린 치환으로 인해 시험관내 단백질 응집이 감소된 PEG화 AvPAL 변이체가 PEG화 야생형 AvPAL과 비교하여 면역원성이 감소되었음을 또한 나타낸다. PEG화 자체가 감소된 면역원성과 관련되기 때문에, AvPAL 변이체가 야생형 AvPAL과 비교하여 생체내 면역원성이 감소된 것으로 결론지어진다.

실시예 15

재- PEG 화 형태의 AvPAL 변이체의 생성

PEG화 형태의 AvPAL 변이체가 PEG화의 양, 즉, AvPAL 라이신 잔기 상의 PEG 분자의 백분율을 증가시키기 위해 재-PEG화에 적용될 수 있는지 여부, 및 그렇다면 재-PEG화 형태의 AvPAL 변이체가 시험관내 효소 활성을 유지하고 생체 내에서의 개선된 성질이 있는지, 즉 면역원성이 감소되는지 여부를 결정하기 위해 연구를 수행하였다.

AvPAL 변이체의 PEG 화

이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL인 AvPAL_C565SC503S를 여러 PAL:PEG 비율 (즉, AvPAL_C565SC503S:SUNBRIGHT ME-200HS 20 kDa NHS-활성화 PEG (NOF))에서 기본적으로 실시예 6에 기술된 바와 같이 PEG화시켰다.

간략하게, 표준 반응 혼합물은 각각 1:1, 1:1.5, 1:2 또는 1:3 몰비의 전체 AvPAL 라이신 잔기 대 PEG 분자에 상응하는, 50 mM 인산칼륨 완충제 (pH 8.5) 내의 7 ㎎/㎖ (2 mM 라이신 잔기에 상응)의 AvPAL_C565SC503S 및 2, 3, 4 또는 6 mM의 mPEG20K-NHS (메톡시폴리에틸렌글리콜-카르복시메틸-N-히드록시숙신이미드 에스테르, 20 kDa, SUNBRIGHT ME-200HS, NOF)를 함유하였다 (표 12 참조). 실온에서의 3시간 인큐베이션 후, 반응 혼합물을 200 mM 인산칼륨 (pH 8.5)으로 완충제-교환하고, 이어지는 재-PEG화 단계에 대비하여 접선형 유동 여과 (Vivaflow 50 또는 200, 폴리에테르술폰 또는 재생 셀룰로스 막, 100 kDa MWCO, Sartorius)를 사용하여 20 ㎎/㎖ 초과로 농축하였다.

PEG 화 AvPAL 변이체의 재- PEG 화

여러 PAL:PEG 비율에서 PEG화된 AvPAL_C565SC503S를 다양한 농도의 PEG화 효소, 및 여러 양 및 비율의 AvPAL 효소 내의 라이신 잔기 및 SUNBRIGHT ME-200HS 20 kDa NHS-활성화 PEG (NOF) 분자를 사용하여 기본적으로 실시예 6에 기술된 바와 같이 재-PEG화시켰다.

각각의 재-PEG화 반응에 대해, 출발 물질은 200 mM 인산 칼륨 (pH 8.5) 내에 20 ㎎/㎖ 초과로 농축된 PEG화 AvPAL_C565SC503S (rAvPAL-PEG)였다. mPEG20K-NHS를 각각의 재-PEG화 반응을 위해 별도로 칭량하였고, 최소 부피의 물에 재현탁시켰다. 표 12에 지시된 최종 농도에 도달하도록 rAvPAL-PEG (필요하다면 완충제에 희석됨)를 재현탁된 mPEG20K-NHS 용액에 직접 첨가하였다. 재-PEG화 반응을 3시간 동안 실온에서 진행시킨 후, 25 mM 트리스HCl (pH 7.3)으로 2배 희석함으로써 켄칭시켰다. 접선형 유동 여과 방법 (Vivaflow 50 또는 200, 폴리에테르술폰 또는 재생 셀룰로스 막, 100 kDa MWCO, Sartorius)를 사용하여 완충제를 교환하고 재-PEG화 rAvPAL-PEG 샘플을 10 mM 트리스 HCl, 135 mM NaCl, 1 mM L-Phe (pH 7.3)에 농축시켰다. 원심분리 농축을 사용하여, 필요하다면, 최종 재-PEG화 rAvPAL-PEG 샘플을 추가로 농축시켰다.

시험관내 특성화 방법

전체 단백질 분석법: PEG화 및 재-PEG화 rAvPAL-PEG 샘플의 농도를 표준물로서의 소 혈청 알부민과 함께 Pierce로부터의 시판되는 분석법 키트 (카탈로그# 23227)를 사용하여 바이신코닌산 (BCA) 분석법에 의해 결정하였다. 간략하게, 25 ㎕의 샘플 및 표준물을 200 ㎕의 BCA 시약과 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 562 nm에서의 흡광도를 SPECTRAmax PLUS 마이크로플레이트 분광광도계 (Molecular Devices Corporation)에서 판독하였다.

rAvPAL 활성 분석법: PEG화 및 재-PEG화 rAvPAL-PEG 샘플의 비 활성을 실시예 3에 기술된 바와 같은 확립된 PAL 활성 분석법 프로토콜을 기초로 결정하였다. 간략하게, 단백질 샘플 (25-50 ㎕)을 1 ㎖의 분석 반응에 첨가했을 때, L-Phe이 트랜스-신남산으로 전환됨에 따라 OD290에서의 증가가 모니터링된다. 필요하다면, 샘플을 분석 전에 분석 희석 완충제 (10 mM 트리스HCl, 135 mM NaCl, pH 7.3)에서 희석하였다. 3회의 독립적인 측정의 평균값으로 각각의 데이터가 표시되었다.

모세관 젤 전기영동 ( CGE ): Beckman-Coulter로부터의 ProteomeLab SDS-MW 분석 키트 (카탈로그# 390953)를 사용하여 CGE 분석을 수행하였다. PEG화 및 재-PEG화 rAvPAL-PEG 및 rAvPAL-PEG-RP1 샘플을 SDS 및 β-메르캅토에탄올의 존재 하에 95℃에서 5분 동안 가열한 후, Beckman-Coulter로부터의 P/ACE MDQ 모세관 전기영동 시스템 내의 모세관 (PA800 CE, 23 cm 용융 실리카)에 로딩하였다. CGE 프로파일은 214 nm에서의 UV 흡광도의 양을 나타낸다. 각각의 CGE 샘플은 분석용 기준물로서 10 kDa 이동 마커를 함유하였다. rAvPAL-PEG 샘플들 사이에 모세관들이 재-컨디셔닝되었다.

TNBS 분석법: 트리니트로벤젠술폰산 (TNBS) 분석법을 사용하여 PEG화 및 재-PEG화 rAvPAL-PEG 샘플 내에 존재하는 유리 아민 기의 추정값을 제공하였다.

펩티드 매핑: rAvPAL-PEG 및 rAvPAL-PEG-샘플의 트립신 펩티드 매핑을 실시예 10에 기술된 바와 같이 수행하여, AvPAL 변이체 단백질 상의 라이신 잔기에서의 PEG화 백분율을 결정하였다. 재-PEG화 AvPAL_C565SC503S의 PEG화의 양, 즉, AvPAL 라이신 잔기 K10, K32, K115, K145, K195, K301, K335, K413, K493/K494 및 K522 상의 PEG 분자의 백분율을 결정하였다.

PEG 화 및 재- PEG 화 AvPAL 변이체의 시험관내 특성화

rAvPAL 효소 활성: 도 18 (위쪽)에 나타난 바와 같이, PEG화 또는 재-PEG화는 시험관 내에서의 rAvPAL 효소 활성에서 일시적인 감소를 야기하였다. 이는 촉매적 활성 부위 근처의 특정 타이로신 잔기에서의 가역적인 PEG화 때문인 것으로 보였다. 단일 PEG화와 비교하여, 재-PEG화는 rAvPAL 효소 활성에 대한 PEG화 반응의 효과를 강화시키는 것으로, 즉, 이의 비 활성을 일시적으로 감소시키는 것으로 나타났고, 이는 시간이 지남에 따라 점차 회복되었다. PEG화 반응에서의 PEG의 더 높은 농도는 비 활성에서의 더 큰 일시적인 감소와 상관되었다. 그러나, 4℃에서의 몇주 후, 처음에 다양한 PAL:PEG 비율 및 농도의 효소 및 PEG 분자 (AvPAL 내의 라이신 잔기 및 PEG의 mM 농도가 지시됨)를 사용하여 생성된 재-PEG화 rAvPAL-PEG의 비 활성이 1:3의 PAL:PEG 비율 (2 mM 라이신 잔기:6 mM PEG, 흑색 원)을 사용하여 생성된 단일 PEG화 AvPAL-PEG의 약 80％ 이상에 도달하였다. 또한, PEG화 및 재-PEG화 AvPAL-PEG 효소는 PEG화 후 유사한 속도의 활성 회복을 경험하였다.

도 18 (아래쪽)에 나타난 바와 같이, PEG화 rAvPAL-PEG이 처음에 1:1의 PAL:PEG 비율 (2 mM 라이신 잔기:2 mM PEG, 흑색 사각형)을 사용하여 생성되었을 때 비슷한 경향이 관찰되었다. 총괄적으로, 재-PEG화가 일시적으로 AvPAL 활성에 영향을 미쳤지만, 결과적인 재-PEG화 rAvPAL-PEG의 비 활성은 1:3의 PAL:PEG 비율에서 생성된 단일 PEG화 rAvPAL-PEG와 비교하여 허용되는 범위 이내였다.

PEG 화 및 재- PEG 화 rAvPAL 의 CGE 분석: CGE 분석은 단일 PEG화에 비해 재-PEG화가 전체적인 PEG화 정도를 증가시켰음을 가리켰다. 도 19A에 나타난 바와 같이, 재-PEG화로 rAvPAL-PEG의 감소된 전기영동 이동성이 초래되었고, 이는 추가적인 PEG 분자의 부착으로 인한 증가된 분자 크기를 시사한다. 또한, PEG화 정도가 재-PEG화 단계 동안 사용된 PEG의 농도와 잘 상관되었다. 도 19B에 나타난 바와 같이, 제1 PEG화 단계 동안의 반응 조건과 관계 없이, 6 mM 이상 농도의 mPEG20K-NHS가 rAVPAL-PEG의 PEG화를 증가시키는데 동등하게 효과적이었다. 요약하면, 단일 PEG화 rAvPAL과 비교하여, 재-PEG화 rAvPAL-PEG은 감소된 CGE 이동성, 및 따라서 증가된 분자 질량을 명확하게 나타냈다.

재- PEG 화 시의 rAvPAL - PEG 내의 유리 아민: TNBS 분석법을 수행하여, 단일 PEG화 rAvPAL-PEG와 비교하여 재-PEG화 rAVPAL-PEG 내에 존재하는 유리 아민 기의 양을 추정하였다. 표 13에 나타난 바와 같이, 더 높은 PEG 농도, 예컨대 6 mM의 존재 하에서의 재-PEG화가 rAvPAL 단백질 상에 존재하는 유리 아민의 양을 가장 현저하게 감소시켰고, 이는 PEG화에서의 전체적인 증가를 가리킨다. 여기에서 사용된 조건들 하에, 화학적 변형에 이용가능한, 비-PEG화 rAvPAL 내의 유리 아민의 대부분은 재-PEG화 후 효과적으로 PEG화된다.

재- PEG 화 시의 라이신 잔기의 PEG 화 백분율: 도 20에 나타난 바와 같이, 트립신 펩티드 매핑은 재-PEG화가 rAvPAL-PEG 상의 라이신 잔기의 PEG화 백분율을 개선시켰음을 가리켰다. 단일 PEG화 단계에서 이미 100％ PEG화된 AvPAL의 위치 10의 라이신 잔기를 제외하고, 접합되지 않은 나머지 라이신 잔기들이 재-PEG화 시 PEG화에 표적화되었다. 가장 두드러지게, AvPAL의 위치 301의 라이신 잔기에서의 PEG화가 재-PEG화시 500％만큼 증가하였다. 더 높은 농도의 활성화 mPEG20K-NHS, 예컨대 6 mM의 존재 하에서의 재-PEG화 조건이 더 낮은 PEG 농도, 예컨대 2 mM보다 rAvPAL-PEG에서의 PEG화 정도를 증대시키는데 더욱 효과적인 것으로 나타났다.

실시예 16

마우스에서의 AvPAL - PEG 변이체의 재- PEG 화의 효과

실시예 15에 기술된 바와 같이 제1 및 제2 PEG화 반응 모두에서 1:3의 PAL:PEG 비율을 사용하여 생성된 재-PEG화 AvPAL_C565SC503S (rAvPAL-PEG-RP1)를, PKU의 마우스 모델에서 혈장 Phe 수준을 감소시키고 생체내에서 항체 응답을 유도하는 능력에 관하여, 실시예 6 및 15에 기술된 바와 같이 1:3의 PAL:PEG 비율을 사용하여 생성된 단일 PEG화 AvPAL_C565SC503S (rAvPAL- PEG)와 비교하였다.

2개의 PEG화 및 재-PEG화 AvPAL 변이체 효소의 비 활성을 실시예 3에 기술된 바와 같이 측정하였다. rAvPAL-PEG-RP1의 비 활성 (1.17 U/mg)이 rAvPAL-PEG의 비 활성 (1.47 U/mg)보다 약 20％ 더 낮은 것으로 발견되었다.

PEG화 및 재-PEG화 형태의 AvPAL_C565SC503S, rAvPAL-PEG 및 rAvPAL-PEG-RP1 각각을 기본적으로 실시예 8에 기술된 바와 같이 동종접합성 ENU2 (BTBR^enu2로 또한 공지됨) 마우스에서 생체내 활성에 대해 테스트하였다. 연구 디자인이 하기 표 14에 제시된다.

2개의 마우스 군 (제1군 및 제2군)에 높은 용량 (80 ㎎/㎏)의 rAvPAL-PEG 또는 rAvPAL-PEG-RP1 각각을 8주 동안 1주일에 1번씩 피하 투여한 후, 낮은 용량 (20 ㎎/㎏)의 rAvPAL-PEG 또는 rAvPAL-PEG-RP1 각각을 6주 동안 1주일에 1번씩 피하 투여하였다. 1개의 마우스 군 (제3군)에게는 높은 용량의 rAvPAL-PEG를 투여한 후 낮은 용량의 rAvPAL-PEG-RP1을 투여하였다. 혈장을 투약 전 및 투약하고 나서의 다양한 날에 수집하고, Phe 수준에 대해 분석하였다. 실시예 8에 기술된 바와 같이 혈장 Phe 수준을 측정하였고, 수득된 데이터가 도 21에서 제시된다. 항-AvPAL 항체 수준의 분석을 위해 투약 전 및 투약하고 나서의 다양한 날에 혈청을 또한 수집하였다. 실시예 14에 기술된 바와 같이 혈청 항-rAvPAL IgG 역가를 측정하였고, 수득된 데이터가 표 15에서 제시된다.

도 21에 나타난 바와 같이, 3개의 군 모두에 대해, rAvPAL-PEG (DP, 흑색 원 또는 흑색 역삼각형) 또는 rAvPAL-PEG-RP1 (2×PEG, 백색 원)을 7-8주 동안 매주 피하 투약하는 것은 혈장 Phe 수준의 200 μM 미만으로의 안정화를 초래하였다. 안정화 후, rAvPAL-PEG을 매주 20 ㎎/㎏으로 감소시켜 피하 투약하는 것은 4일의 200 μM 미만의 혈장 Phe 수준을 초래하였다. 20 ㎎/㎏ rAvPAL-PEG로 처리된 ENU2 마우스에서의 혈장 Phe 수준 (DP, 흑색 원)이 20 ㎎/㎏ rAvPAL-PEG-RP1 (2×PEG, 백색원 또는 흑색 역삼각형)으로 처리된 마우스보다 낮았고, 이는 아마도 이중 PEG화 rAvPAL-PEG-RP1의 비 활성과 비교하여 더 큰 단일 PEG화 rAvPAL-PEG의 비 활성때문일 것이다.

표 15에 나타난 바와 같이, 항-AvPAL IgG 역가가 rAvPAL-PEG가 주사된 마우스 (제1군 및 제3군)보다 rAvPAL-PEG-RP1이 주사된 ENU2 마우스 (제2군)에서 더 낮았다. 이는 PEG화의 양이 증가되도록 AvPAL 변이체를 재-PEG화시키는 것, 특히 20 kDa 선형 PEG 분자로 재-PEG화시키는 것이 생체 내에서 감소된 면역원성과 관련되었음을 가리켰다.

요약하면, AvPAL 내의 다양한 라이신 잔기에서의 PEG화 백분율을 증가시키기 위해 AvPAL-PEG 변이체를 20 kDa 선형 PEG 분자로 재-PEG화시키는 것이 시험관 내에서는 약간 감소된 효소 활성과 관련되었지만, 중요하게, 생체 내에서 감소된 면역원성과 관련되었다.

실시예 17

원핵생물 PAL 조성물로의 임상 평가

하기의 실시예는 본 발명의 치료 방법에서의 원핵생물 PAL 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체, 돌연변이체 및 단편 ("PAL")을 포함하는 조성물의 임상 평가에 사용되는 파라미터들에 대한 지침을 제공한다. 본원에서 전반에 걸쳐 논의된 바와 같이, HPA, 경미한 페닐케톤뇨증 (PKU) 및 고전적인 PKU가 포함되는 HPA의 치료에서 PAL이 사용될 것이다. 안정성, 약동학, 및 대용 및 규정 임상 종점 양쪽 모두의 초기 응답에 대해 PAL의 경구 또는 피하 투약의 평가를 제공할 임상 시험이 수행될 것이다. 100명의 평가 환자에 대해 충분한 안전성 정보를 수집하기 위해 최소 24주 (그러나 반드시 이에 한정되지는 않음) 동안 시험이 수행될 것이다. 시험을 위한 초기 용량은 약 0.001 내지 약 1.0 ㎎/㎏/주일 것이다. 이러한 용량이 환자에서 과도한 혈장 페닐알라닌 (Phe) 수준의 감소를 일으키지 않거나 또는 혈장 Phe 수준에서의 증가 없이 일일 경구 Phe 섭취를 증가시키는 능력으로 측정되는 현저한 직접적인 임상 이득을 일으키지 않는 경우, 필요하다면 용량이 증가되어야 하고, 안정성을 확립하고 추가적인 효능을 평가하기 위해 24주의 추가적인 최소 기간 (그러나 반드시 이에 한정되지는 않음) 동안 유지되어야 한다.

안정성의 측정은 부작용, 알러지 반응, 완전한 임상 화학 패널 (신장 및 간 기능), 소변검사, 및 감별 CBC를 포함할 것이다. 또한, 혈액 Phe 수준에서의 감소, 신경심리학적 및 인지 테스트, 및 포괄 평가가 포함되는 기타 파라미터들이 또한 모니터링될 것이다. 순환에서의 약물의 약동학 파라미터, 및 혈액 내에서의 PAL의 일반적인 분포 및 반감기의 결정이 본 실시예에서 또한 구현된다. 이러한 측정들이 용량을 임상 응답에 관련시키는 것을 도울 것으로 예상된다.

방법

혈장 Phe 수준이 상승된 환자에게 기초적인 의학 병력 및 신체 검사, 신경심리학적 및 인지 테스트, 표준 셋트의 임상 실험 테스트 (CBC, Panel 20, CH50, UA), 소변 프테린 수준, 디히드로프테리딘 리덕타제(reductase) (DHPR) 수준, 및 혈청 아미노산의 공복 혈액 (혈장) 패널을 진행한다. 매주 병원에 방문하도록 하여 환자를 면밀히 추적한다. 치료 기간 완료 1주일 후 완전한 평가를 위해 환자가 병원으로 돌아온다. 용량 상승이 필요하면, 환자는 상기에 개요된 것과 동일한 일정을 따른다. 실험 전반에 걸쳐 안정성을 모니터링한다.

진단 및 포함/제외 기준

환자는 유전학 테스트 및 혈액 내의 상승된 Phe 수준의 증거에 의해 확증된, HPA 또는 경미한 PKU로 진단된 기록이 있는 남성 또는 여성일 수 있다. 이 연구는 식이 조절을 정확하게 따르지 않는 HPA 또는 PKU 환자를 포함한다. 임신 가능성이 있는 여성 환자는 각각의 투약 직전에 임신 테스트 (소변 β-hCG)가 음성이어야 하고, 연구 전반에 걸쳐 의학적으로 승인된 피임법을 사용하도록 조언받아야 한다. 환자가 임신했거나 수유 중인 경우, 연구 등록 30일전 이내에 시험용 약물을 제공받은 경우, 또는 연구 순응도를 현저하게 감소시킬 수 있는 의학적 상태, 심각한 병발성 질병 또는 기타 참작 상황인 경우, 환자가 이러한 연구로부터 제외된다.

식이 개입

초기 무작위화 및 2주 치료 기간 후, 모든 연구 참가자들은 식이 상담을 받고, 총 4주 내지 6주 동안 Phe-특이적 의료 식품이 보충된 표준 Phe-제한 식이 및/또는 표준 식이를 따른다. 가정에서 식이를 관리하고, 식이 섭취를 일지에 기록한다. 처리군들 간에 영양소 및 의료 식품의 섭취, 및 식이 섭취 권장량 (RDI)의 백분율을 비교한다.

PAL 안정성

연구 과정 동안 현저한 급성 또는 만성 약물 반응이 발생하지 않으면 PAL 치료법이 안정적인 것으로 결정된다. 임상 검사, 임상 실험 또는 기타 적합한 연구에서 현저한 이상이 관찰되지 않으면 더 긴 기간의 약물 투여가 안정적인 것으로 결정된다.

실시예 18

PEG 화 AvPAL 변이체의 임상 평가

PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL인 AvPAL_C565SC503S를 인간에서 임상 평가한다. 임상 평가의 목표는 PKU 환자에서의 안정성, 내성, 약동학 (PK) 및 효능을 결정하는 것이다. 혈액 페닐알라닌 (Phe) 수준이 임상 종점으로 작용한다.

1상

1상은 16세 내지 50세의 PKU 환자 35명에서의, 개방형(open-label) 단일 용량 상승 연구이다. 1차 목표는 PEG화 이중 시스테인 돌연변이체 AvPAL인 AvPAL_C565SC503S의 안정성 및 내성을 평가하는 것이고, 2차 목표는 PEG화 효소의 PK 및 Phe 감소를 정하는 것이다. 피실험자 5명의 코호트 7개에 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3 및 1 ㎎/㎏의 증가하는 용량의 PEG화 AvPAL_C565SC503S를 순차적으로 투여한다. 각각의 코호트 내의 피실험자에게 단일 용량을 제공한 후, 총 6주 동안 추적한다. 포함 기준은 스크리닝 시의 혈액 Phe 수준 및 지난 3년 동안에 걸친 평균 혈액 Phe 수준이 600 μM 이상인 것이다.

2상

2상 연구는 중단되지 않는 2개의 파트로 나뉜다:

o 제1파트 - 16주 - 8주 투여 후 용량 최적화

o 제2파트 - 40주 - 확장

2상은 PKU에 걸린 피실험자 35명에서의 2-파트 개방형 용량 최적화 연구이다. 16주의 기간에 걸쳐 수행되는 제1파트는 PEG화 AvPAL_C565SC503S의 용량을 8주 동안 1주일에 한번씩 투여한 후의 용량 최적화 기간을 수반한다. 600 μM 미만의 혈액 Phe 농도를 달성하도록 각각의 피실험자의 용량이 조정된다. 1차 목표는 PEG화 AvPAL_C565SC503S의 다중 투여의 안정성 및 내성을 평가하는 것이고, 2차 목표는 혈액 Phe 농도에 대한 PEG화 효소의 효과, 면역 응답, 예를 들어, 항-AvPAL 항체 역가, 및 항정 상태 PK를 평가하는 것이다. 제2파트에서, 개별화된 최적화 용량 및 투여 빈도로 40주 동안 피실험자에게 PEG화 AvPAL_C565SC503S가 투여된다.

3상

1상 및 2상 연구가 완료되면, 특정 집단, 예를 들어 비제한적으로, 비-PKU 고페닐알라닌혈증 (HPA) 환자, BH4-응답성 PKU 환자 및 비-BH4-응답성 PHU 환자에서의 추가적인 연구와 함께, 더 많은 피실험자에서의 3상 6개월 이중 맹검 연구가 추가적인 연구에 잠재적으로 포함될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> BioMarin Pharmaceutical Inc. Vellard, Michel C Fitzpatrick, Paul A Kakkis, Emil D Wendt, Dan <120> Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of using compositions thereof <130> 0165 PC10 <150> US 11/451,999 <151> 2006-06-12 <160> 33 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1710 <212> DNA <213> Nostoc punctiforme <400> 1 atgaatataa catctctaca acagaacata acgcgttctt ggcaaatacc tttcactaat 60 agttcagatt caatcgtaac tgtaggcgat cgcaatctga caatcgacga ggttgtaaat 120 gttgctcgtc atggaacaca ggtgcgctta actgataatg cagatgtcat tcggggtgtt 180 caagcatctt gtgattacat taacaatgca gtcgaaacag cacagccaat ttacggggtg 240 acatctggct ttggcggtat ggcagatgtt gtcatctctc gcgaacaagc agcggaactt 300 cagactaatt taatttggtt tctgaaatcc ggcgcaggaa acaaattatc gttagcagac 360 gtgcgtgcag ctatgctctt acgtgcaaat tcacatttgt atggtgcgtc tggtatacga 420 ctcgaactta ttcagcggat tgaaactttc ctcaacgctg gcgtgacacc ccatgtctat 480 gagtttggct ctatcggtgc tagcggcgat ttggtgccat tatcctacat tactggggca 540 ctaatcggtc tagatcctag ctttacagtt gacttcgacg gtaaagaaat ggatgccgtt 600 acagccttgt ctcgtttggg tttgccaaag ttgcaattgc aaccgaaaga aggtttagca 660 atgatgaatg gcacctcagt catgacaggt attgcagcta actgtgtgta cgatgcgaaa 720 gttttgctcg ctctgacaat gggtgtacac gccttagcca tccaaggttt atacggaacg 780 aatcaatctt tccacccgtt tattcatcag tgcaagccac atcccggtca actatggaca 840 gcagatcaaa tgttttctct gctgaaagat tcatctttag ttcgtgaaga gttggatggt 900 aaacacgaat accgtggtaa agatctgata caggatcgtt attctctccg ctgtctggca 960 cagttcatag ggccaatcgt tgatggggta tcagagatta ccaagcaaat cgaggtagaa 1020 atgaactcag tcaccgataa cccattgatt gatgtcgaga accaagttag ttatcacggc 1080 ggcaattttc tcggacagta tgtgggtgtg acaatggatc gcctacgtta ttacataggg 1140 ctattggcca aacacatcga tgtgcagatt gcacttcttg tctcgccaga gtttagcaac 1200 ggcttaccac cctctttagt tggtaatagc gatcgcaaag ttaatatggg actcaaaggt 1260 ttgcaaatca gtggaaactc gattatgcca ctgttgagct tctatggaaa ttccctagcc 1320 gatcgctttc ctacccacgc cgagcaattt aatcaaaata ttaacagcca aggctatatt 1380 tccgcaaatt tgacacgtcg ttccgtagac atatttcaga attatatggc gatcgcgttg 1440 atgtttggag ttcaagctgt tgacctccgc acatataaga tgaaaggtca ttatgatgca 1500 cgtacatgcc tctcacccaa tactgtgcag ttatacacag cagtctgcga ggtagttgga 1560 aagccactaa cgtctgtgcg tccatacatt tggaacgaca acgagcaatg tttagatgag 1620 catattgccc ggatttcagc tgatatcgct ggtggtggtt taattgtgca agcagttgag 1680 catatttttt cgagcttaaa gtcaacgtaa 1710 <210> 2 <211> 569 <212> PRT <213> Nostoc punctiforme <400> 2 Met Asn Ile Thr Ser Leu Gln Gln Asn Ile Thr Arg Ser Trp Gln Ile 1 5 10 15 Pro Phe Thr Asn Ser Ser Asp Ser Ile Val Thr Val Gly Asp Arg Asn 20 25 30 Leu Thr Ile Asp Glu Val Val Asn Val Ala Arg His Gly Thr Gln Val 35 40 45 Arg Leu Thr Asp Asn Ala Asp Val Ile Arg Gly Val Gln Ala Ser Cys 50 55 60 Asp Tyr Ile Asn Asn Ala Val Glu Thr Ala Gln Pro Ile Tyr Gly Val 65 70 75 80 Thr Ser Gly Phe Gly Gly Met Ala Asp Val Val Ile Ser Arg Glu Gln 85 90 95 Ala Ala Glu Leu Gln Thr Asn Leu Ile Trp Phe Leu Lys Ser Gly Ala 100 105 110 Gly Asn Lys Leu Ser Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg 115 120 125 Ala Asn Ser His Leu Tyr Gly Ala Ser Gly Ile Arg Leu Glu Leu Ile 130 135 140 Gln Arg Ile Glu Thr Phe Leu Asn Ala Gly Val Thr Pro His Val Tyr 145 150 155 160 Glu Phe Gly Ser Ile Gly Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser Tyr 165 170 175 Ile Thr Gly Ala Leu Ile Gly Leu Asp Pro Ser Phe Thr Val Asp Phe 180 185 190 Asp Gly Lys Glu Met Asp Ala Val Thr Ala Leu Ser Arg Leu Gly Leu 195 200 205 Pro Lys Leu Gln Leu Gln Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Met Asn Gly 210 215 220 Thr Ser Val Met Thr Gly Ile Ala Ala Asn Cys Val Tyr Asp Ala Lys 225 230 235 240 Val Leu Leu Ala Leu Thr Met Gly Val His Ala Leu Ala Ile Gln Gly 245 250 255 Leu Tyr Gly Thr Asn Gln Ser Phe His Pro Phe Ile His Gln Cys Lys 260 265 270 Pro His Pro Gly Gln Leu Trp Thr Ala Asp Gln Met Phe Ser Leu Leu 275 280 285 Lys Asp Ser Ser Leu Val Arg Glu Glu Leu Asp Gly Lys His Glu Tyr 290 295 300 Arg Gly Lys Asp Leu Ile Gln Asp Arg Tyr Ser Leu Arg Cys Leu Ala 305 310 315 320 Gln Phe Ile Gly Pro Ile Val Asp Gly Val Ser Glu Ile Thr Lys Gln 325 330 335 Ile Glu Val Glu Met Asn Ser Val Thr Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val 340 345 350 Glu Asn Gln Val Ser Tyr His Gly Gly Asn Phe Leu Gly Gln Tyr Val 355 360 365 Gly Val Thr Met Asp Arg Leu Arg Tyr Tyr Ile Gly Leu Leu Ala Lys 370 375 380 His Ile Asp Val Gln Ile Ala Leu Leu Val Ser Pro Glu Phe Ser Asn 385 390 395 400 Gly Leu Pro Pro Ser Leu Val Gly Asn Ser Asp Arg Lys Val Asn Met 405 410 415 Gly Leu Lys Gly Leu Gln Ile Ser Gly Asn Ser Ile Met Pro Leu Leu 420 425 430 Ser Phe Tyr Gly Asn Ser Leu Ala Asp Arg Phe Pro Thr His Ala Glu 435 440 445 Gln Phe Asn Gln Asn Ile Asn Ser Gln Gly Tyr Ile Ser Ala Asn Leu 450 455 460 Thr Arg Arg Ser Val Asp Ile Phe Gln Asn Tyr Met Ala Ile Ala Leu 465 470 475 480 Met Phe Gly Val Gln Ala Val Asp Leu Arg Thr Tyr Lys Met Lys Gly 485 490 495 His Tyr Asp Ala Arg Thr Cys Leu Ser Pro Asn Thr Val Gln Leu Tyr 500 505 510 Thr Ala Val Cys Glu Val Val Gly Lys Pro Leu Thr Ser Val Arg Pro 515 520 525 Tyr Ile Trp Asn Asp Asn Glu Gln Cys Leu Asp Glu His Ile Ala Arg 530 535 540 Ile Ser Ala Asp Ile Ala Gly Gly Gly Leu Ile Val Gln Ala Val Glu 545 550 555 560 His Ile Phe Ser Ser Leu Lys Ser Thr 565 <210> 3 <211> 1704 <212> DNA <213> Anabaena variabilis <400> 3 atgaagacac tatctcaagc acaaagcaaa acctcatctc aacaattttc ttttactgga 60 aattcttctg ccaatgtaat tattggtaat cagaaactca caatcaatga tgttgcaagg 120 gtagcgcgta atggcacctt agtgtcttta accaataaca ctgatatttt gcagggtatt 180 caggcatctt gtgattacat taataatgct gttgaatctg gggaaccaat ttatggagtg 240 acatctggtt ttggcggtat ggccaatgtt gccatatccc gtgaacaagc atctgaactc 300 caaaccaact tagtttggtt cctgaaaaca ggtgcaggga acaaattacc cttggcggat 360 gtgcgcgcag ctatgctctt gcgtgcaaac tctcatatgc gcggtgcatc tggcatcaga 420 ttagaactta tcaagcgtat ggagattttc cttaacgctg gtgtcacacc atatgtgtat 480 gagtttggtt caattggtgc aagtggtgat ttagtgccac tatcctacat tactggttca 540 ctgataggct tagatcccag ttttaaggtt gacttcaacg gtaaagaaat ggatgcgcca 600 acagctctac gtcaactgaa tttgtcaccc ttgacattgt tgccgaagga aggcttggcg 660 atgatgaacg gcacttcagt catgacaggt attgcagcaa actgcgtcta cgatactcaa 720 attttaactg cgatcgctat gggcgttcac gctctagata tccaagcttt aaacggaacc 780 aatcaatcat tccatccatt tatccataat tccaaaccac atcctggtca attatgggca 840 gcagatcaga tgatttcttt gttagccaat tcccagttag ttcgtgatga gttagatggt 900 aaacacgatt atcgtgatca cgagttgatt caagatcgtt actcactccg atgccttccc 960 cagtatttgg ggccaatcgt tgatggaatt tcccagattg ccaaacaaat tgaaatcgaa 1020 atcaactcag tcaccgataa cccactaatt gatgttgata accaagctag ctatcatgga 1080 ggaaatttcc tcggacagta cgtgggtatg ggaatggatc acctgcgtta ctatattggg 1140 ttattggcta aacacctaga tgtgcagatt gccctcctcg cctcaccaga gtttagcaat 1200 ggactaccac catctttatt aggcaaccga gaacgtaaag tcaatatggg actcaaaggt 1260 ctgcaaatat gcggtaactc aattatgcca ctgttgacct tctatggaaa ttccatcgcc 1320 gatcgctttc ctacccatgc agaacaattt aatcagaaca tcaacagtca aggatacact 1380 tcagcgactc tagcccgccg ttctgtggat atcttccaga attatgtggc gatcgctctg 1440 atgtttggag tccaagctgt tgacctccgc acatataaaa agactggtca ttacgatgca 1500 cgcgcctgtc tatcacctgc aactgagcgc ttatattcag cagtccgcca cgtagttgga 1560 caaaaaccaa cttcagatcg cccatatatt tggaatgata atgagcaagg actggatgag 1620 catattgccc ggatttctgc tgatatcgct gctggtggtg tgattgtgca agcagttcaa 1680 gatatcttac cctgcttgca ttaa 1704 <210> 4 <211> 567 <212> PRT <213> Anabaena variabilis <400> 4 Met Lys Thr Leu Ser Gln Ala Gln Ser Lys Thr Ser Ser Gln Gln Phe 1 5 10 15 Ser Phe Thr Gly Asn Ser Ser Ala Asn Val Ile Ile Gly Asn Gln Lys 20 25 30 Leu Thr Ile Asn Asp Val Ala Arg Val Ala Arg Asn Gly Thr Leu Val 35 40 45 Ser Leu Thr Asn Asn Thr Asp Ile Leu Gln Gly Ile Gln Ala Ser Cys 50 55 60 Asp Tyr Ile Asn Asn Ala Val Glu Ser Gly Glu Pro Ile Tyr Gly Val 65 70 75 80 Thr Ser Gly Phe Gly Gly Met Ala Asn Val Ala Ile Ser Arg Glu Gln 85 90 95 Ala Ser Glu Leu Gln Thr Asn Leu Val Trp Phe Leu Lys Thr Gly Ala 100 105 110 Gly Asn Lys Leu Pro Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg 115 120 125 Ala Asn Ser His Met Arg Gly Ala Ser Gly Ile Arg Leu Glu Leu Ile 130 135 140 Lys Arg Met Glu Ile Phe Leu Asn Ala Gly Val Thr Pro Tyr Val Tyr 145 150 155 160 Glu Phe Gly Ser Ile Gly Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser Tyr 165 170 175 Ile Thr Gly Ser Leu Ile Gly Leu Asp Pro Ser Phe Lys Val Asp Phe 180 185 190 Asn Gly Lys Glu Met Asp Ala Pro Thr Ala Leu Arg Gln Leu Asn Leu 195 200 205 Ser Pro Leu Thr Leu Leu Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Met Asn Gly 210 215 220 Thr Ser Val Met Thr Gly Ile Ala Ala Asn Cys Val Tyr Asp Thr Gln 225 230 235 240 Ile Leu Thr Ala Ile Ala Met Gly Val His Ala Leu Asp Ile Gln Ala 245 250 255 Leu Asn Gly Thr Asn Gln Ser Phe His Pro Phe Ile His Asn Ser Lys 260 265 270 Pro His Pro Gly Gln Leu Trp Ala Ala Asp Gln Met Ile Ser Leu Leu 275 280 285 Ala Asn Ser Gln Leu Val Arg Asp Glu Leu Asp Gly Lys His Asp Tyr 290 295 300 Arg Asp His Glu Leu Ile Gln Asp Arg Tyr Ser Leu Arg Cys Leu Pro 305 310 315 320 Gln Tyr Leu Gly Pro Ile Val Asp Gly Ile Ser Gln Ile Ala Lys Gln 325 330 335 Ile Glu Ile Glu Ile Asn Ser Val Thr Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val 340 345 350 Asp Asn Gln Ala Ser Tyr His Gly Gly Asn Phe Leu Gly Gln Tyr Val 355 360 365 Gly Met Gly Met Asp His Leu Arg Tyr Tyr Ile Gly Leu Leu Ala Lys 370 375 380 His Leu Asp Val Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Pro Glu Phe Ser Asn 385 390 395 400 Gly Leu Pro Pro Ser Leu Leu Gly Asn Arg Glu Arg Lys Val Asn Met 405 410 415 Gly Leu Lys Gly Leu Gln Ile Cys Gly Asn Ser Ile Met Pro Leu Leu 420 425 430 Thr Phe Tyr Gly Asn Ser Ile Ala Asp Arg Phe Pro Thr His Ala Glu 435 440 445 Gln Phe Asn Gln Asn Ile Asn Ser Gln Gly Tyr Thr Ser Ala Thr Leu 450 455 460 Ala Arg Arg Ser Val Asp Ile Phe Gln Asn Tyr Val Ala Ile Ala Leu 465 470 475 480 Met Phe Gly Val Gln Ala Val Asp Leu Arg Thr Tyr Lys Lys Thr Gly 485 490 495 His Tyr Asp Ala Arg Ala Cys Leu Ser Pro Ala Thr Glu Arg Leu Tyr 500 505 510 Ser Ala Val Arg His Val Val Gly Gln Lys Pro Thr Ser Asp Arg Pro 515 520 525 Tyr Ile Trp Asn Asp Asn Glu Gln Gly Leu Asp Glu His Ile Ala Arg 530 535 540 Ile Ser Ala Asp Ile Ala Ala Gly Gly Val Ile Val Gln Ala Val Gln 545 550 555 560 Asp Ile Leu Pro Cys Leu His 565 <210> 5 <211> 523 <212> PRT <213> Streptomyces maritimus <400> 5 Met Thr Phe Val Ile Glu Leu Asp Met Asn Val Thr Leu Asp Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asp Ala Ala Arg Gln Arg Thr Pro Val Glu Leu Ser Ala Pro Val 20 25 30 Arg Ser Arg Val Arg Ala Ser Arg Asp Val Leu Val Lys Phe Val Gln 35 40 45 Asp Glu Arg Val Ile Tyr Gly Val Asn Thr Ser Met Gly Gly Phe Val 50 55 60 Asp His Leu Val Pro Val Ser Gln Ala Arg Gln Leu Gln Glu Asn Leu 65 70 75 80 Ile Asn Ala Val Ala Thr Asn Val Gly Ala Tyr Leu Asp Asp Thr Thr 85 90 95 Ala Arg Thr Ile Met Leu Ser Arg Ile Val Ser Leu Ala Arg Gly Asn 100 105 110 Ser Ala Ile Thr Pro Ala Asn Leu Asp Lys Leu Val Ala Val Leu Asn 115 120 125 Ala Gly Ile Val Pro Cys Ile Pro Glu Lys Gly Ser Leu Gly Thr Ser 130 135 140 Gly Asp Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ile Ala Leu Val Cys Ala Gly Gln 145 150 155 160 Trp Lys Ala Arg Tyr Asn Gly Gln Ile Met Pro Gly Arg Gln Ala Leu 165 170 175 Ser Glu Ala Gly Val Glu Pro Met Glu Leu Ser Tyr Lys Asp Gly Leu 180 185 190 Ala Leu Ile Asn Gly Thr Ser Gly Met Val Gly Leu Gly Thr Met Val 195 200 205 Leu Gln Ala Ala Arg Arg Leu Val Asp Arg Tyr Leu Gln Val Ser Ala 210 215 220 Leu Ser Val Glu Gly Leu Ala Gly Met Thr Lys Pro Phe Asp Pro Arg 225 230 235 240 Val His Gly Val Lys Pro His Arg Gly Gln Arg Gln Val Ala Ser Arg 245 250 255 Leu Trp Glu Gly Leu Ala Asp Ser His Leu Ala Val Asn Glu Leu Asp 260 265 270 Thr Glu Gln Thr Leu Ala Gly Glu Met Gly Thr Val Ala Lys Ala Gly 275 280 285 Ser Leu Ala Ile Glu Asp Ala Tyr Ser Ile Arg Cys Thr Pro Gln Ile 290 295 300 Leu Gly Pro Val Val Asp Val Leu Asp Arg Ile Gly Ala Thr Leu Gln 305 310 315 320 Asp Glu Leu Asn Ser Ser Asn Asp Asn Pro Ile Val Leu Pro Glu Glu 325 330 335 Ala Glu Val Phe His Asn Gly His Phe His Gly Gln Tyr Val Ala Met 340 345 350 Ala Met Asp His Leu Asn Met Ala Leu Ala Thr Val Thr Asn Leu Ala 355 360 365 Asn Arg Arg Val Asp Arg Phe Leu Asp Lys Ser Asn Ser Asn Gly Leu 370 375 380 Pro Ala Phe Leu Cys Arg Glu Asp Pro Gly Leu Arg Leu Gly Leu Met 385 390 395 400 Gly Gly Gln Phe Met Thr Ala Ser Ile Thr Ala Glu Thr Arg Thr Leu 405 410 415 Thr Ile Pro Met Ser Val Gln Ser Leu Thr Ser Thr Ala Asp Phe Gln 420 425 430 Asp Ile Val Ser Phe Gly Phe Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Glu Val 435 440 445 Leu Thr Asn Ala Ala Tyr Val Val Ala Phe Glu Leu Leu Cys Ala Cys 450 455 460 Gln Ala Val Asp Ile Arg Gly Ala Asp Lys Leu Ser Ser Phe Thr Arg 465 470 475 480 Pro Leu Tyr Glu Arg Thr Arg Lys Ile Val Pro Phe Phe Asp Arg Asp 485 490 495 Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Glu Lys Leu Ala Ala Asp Leu Ile Ala 500 505 510 Gly Glu Pro Val Asp Ala Ala Val Ala Ala His 515 520 <210> 6 <211> 510 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 6 Met Thr Glu Leu Thr Leu Lys Pro Gly Thr Leu Thr Leu Ala Gln Leu 1 5 10 15 Arg Ala Ile His Ala Ala Pro Val Arg Leu Gln Leu Asp Ala Ser Ala 20 25 30 Ala Pro Ala Ile Asp Ala Ser Val Ala Cys Val Glu Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Glu Asp Arg Thr Ala Tyr Gly Ile Asn Thr Gly Phe Gly Leu Leu Ala 50 55 60 Ser Thr Arg Ile Ala Ser His Asp Leu Glu Asn Leu Gln Arg Ser Leu 65 70 75 80 Val Leu Ser His Ala Ala Gly Ile Gly Ala Pro Leu Asp Asp Asp Leu 85 90 95 Val Arg Leu Ile Met Val Leu Lys Ile Asn Ser Leu Ser Arg Gly Phe 100 105 110 Ser Gly Ile Arg Arg Lys Val Ile Asp Ala Leu Ile Ala Leu Val Asn 115 120 125 Ala Glu Val Tyr Pro His Ile Pro Leu Lys Gly Ser Val Gly Ala Ser 130 135 140 Gly Asp Leu Ala Pro Leu Ala Thr Met Ser Leu Val Leu Leu Gly Glu 145 150 155 160 Gly Lys Ala Arg Tyr Lys Gly Gln Trp Leu Ser Ala Thr Glu Ala Leu 165 170 175 Ala Val Ala Gly Leu Glu Pro Leu Thr Leu Ala Ala Lys Glu Gly Leu 180 185 190 Ala Leu Leu Asn Gly Thr Gln Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Leu Arg Gly 195 200 205 Leu Phe Tyr Ala Glu Asp Leu Tyr Ala Ala Ala Ile Ala Cys Gly Gly 210 215 220 Leu Ser Val Glu Ala Val Leu Gly Ser Arg Ser Pro Phe Asp Ala Arg 225 230 235 240 Ile His Glu Ala Arg Gly Gln Arg Gly Gln Ile Asp Thr Ala Ala Cys 245 250 255 Phe Arg Asp Leu Leu Gly Asp Ser Ser Glu Val Ser Leu Ser His Lys 260 265 270 Asn Cys Asp Lys Val Gln Asp Pro Tyr Ser Leu Arg Cys Gln Pro Gln 275 280 285 Val Met Gly Ala Cys Leu Thr Gln Leu Arg Gln Ala Ala Glu Val Leu 290 295 300 Gly Ile Glu Ala Asn Ala Val Ser Asp Asn Pro Leu Val Phe Ala Ala 305 310 315 320 Glu Gly Asp Val Ile Ser Gly Gly Asn Phe His Ala Glu Pro Val Ala 325 330 335 Met Ala Ala Asp Asn Leu Ala Leu Ala Ile Ala Glu Ile Gly Ser Leu 340 345 350 Ser Glu Arg Arg Ile Ser Leu Met Met Asp Lys His Met Ser Gln Leu 355 360 365 Pro Pro Phe Leu Val Glu Asn Gly Gly Val Asn Ser Gly Phe Met Ile 370 375 380 Ala Gln Val Thr Ala Ala Ala Leu Ala Ser Glu Asn Lys Ala Leu Ser 385 390 395 400 His Pro His Ser Val Asp Ser Leu Pro Thr Ser Ala Asn Gln Glu Asp 405 410 415 His Val Ser Met Ala Pro Ala Ala Gly Lys Arg Leu Trp Glu Met Ala 420 425 430 Glu Asn Thr Arg Gly Val Pro Ala Ile Glu Trp Leu Gly Ala Cys Gln 435 440 445 Gly Leu Asp Leu Arg Lys Gly Leu Lys Thr Ser Ala Lys Leu Glu Lys 450 455 460 Ala Arg Gln Ala Leu Arg Ser Glu Val Ala His Tyr Asp Arg Asp Arg 465 470 475 480 Phe Phe Ala Pro Asp Ile Glu Lys Ala Val Glu Leu Leu Ala Lys Gly 485 490 495 Ser Leu Thr Gly Leu Leu Pro Ala Gly Val Leu Pro Ser Leu 500 505 510 <210> 7 <211> 567 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Cysteine to serine substitution at position 64 in Anabaena variabilis PAL <400> 7 Met Lys Thr Leu Ser Gln Ala Gln Ser Lys Thr Ser Ser Gln Gln Phe 1 5 10 15 Ser Phe Thr Gly Asn Ser Ser Ala Asn Val Ile Ile Gly Asn Gln Lys 20 25 30 Leu Thr Ile Asn Asp Val Ala Arg Val Ala Arg Asn Gly Thr Leu Val 35 40 45 Ser Leu Thr Asn Asn Thr Asp Ile Leu Gln Gly Ile Gln Ala Ser Ser 50 55 60 Asp Tyr Ile Asn Asn Ala Val Glu Ser Gly Glu Pro Ile Tyr Gly Val 65 70 75 80 Thr Ser Gly Phe Gly Gly Met Ala Asn Val Ala Ile Ser Arg Glu Gln 85 90 95 Ala Ser Glu Leu Gln Thr Asn Leu Val Trp Phe Leu Lys Thr Gly Ala 100 105 110 Gly Asn Lys Leu Pro Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg 115 120 125 Ala Asn Ser His Met Arg Gly Ala Ser Gly Ile Arg Leu Glu Leu Ile 130 135 140 Lys Arg Met Glu Ile Phe Leu Asn Ala Gly Val Thr Pro Tyr Val Tyr 145 150 155 160 Glu Phe Gly Ser Ile Gly Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser Tyr 165 170 175 Ile Thr Gly Ser Leu Ile Gly Leu Asp Pro Ser Phe Lys Val Asp Phe 180 185 190 Asn Gly Lys Glu Met Asp Ala Pro Thr Ala Leu Arg Gln Leu Asn Leu 195 200 205 Ser Pro Leu Thr Leu Leu Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Met Asn Gly 210 215 220 Thr Ser Val Met Thr Gly Ile Ala Ala Asn Cys Val Tyr Asp Thr Gln 225 230 235 240 Ile Leu Thr Ala Ile Ala Met Gly Val His Ala Leu Asp Ile Gln Ala 245 250 255 Leu Asn Gly Thr Asn Gln Ser Phe His Pro Phe Ile His Asn Ser Lys 260 265 270 Pro His Pro Gly Gln Leu Trp Ala Ala Asp Gln Met Ile Ser Leu Leu 275 280 285 Ala Asn Ser Gln Leu Val Arg Asp Glu Leu Asp Gly Lys His Asp Tyr 290 295 300 Arg Asp His Glu Leu Ile Gln Asp Arg Tyr Ser Leu Arg Cys Leu Pro 305 310 315 320 Gln Tyr Leu Gly Pro Ile Val Asp Gly Ile Ser Gln Ile Ala Lys Gln 325 330 335 Ile Glu Ile Glu Ile Asn Ser Val Thr Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val 340 345 350 Asp Asn Gln Ala Ser Tyr His Gly Gly Asn Phe Leu Gly Gln Tyr Val 355 360 365 Gly Met Gly Met Asp His Leu Arg Tyr Tyr Ile Gly Leu Leu Ala Lys 370 375 380 His Leu Asp Val Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Pro Glu Phe Ser Asn 385 390 395 400 Gly Leu Pro Pro Ser Leu Leu Gly Asn Arg Glu Arg Lys Val Asn Met 405 410 415 Gly Leu Lys Gly Leu Gln Ile Cys Gly Asn Ser Ile Met Pro Leu Leu 420 425 430 Thr Phe Tyr Gly Asn Ser Ile Ala Asp Arg Phe Pro Thr His Ala Glu 435 440 445 Gln Phe Asn Gln Asn Ile Asn Ser Gln Gly Tyr Thr Ser Ala Thr Leu 450 455 460 Ala Arg Arg Ser Val Asp Ile Phe Gln Asn Tyr Val Ala Ile Ala Leu 465 470 475 480 Met Phe Gly Val Gln Ala Val Asp Leu Arg Thr Tyr Lys Lys Thr Gly 485 490 495 His Tyr Asp Ala Arg Ala Cys Leu Ser Pro Ala Thr Glu Arg Leu Tyr 500 505 510 Ser Ala Val Arg His Val Val Gly Gln Lys Pro Thr Ser Asp Arg Pro 515 520 525 Tyr Ile Trp Asn Asp Asn Glu Gln Gly Leu Asp Glu His Ile Ala Arg 530 535 540 Ile Ser Ala Asp Ile Ala Ala Gly Gly Val Ile Val Gln Ala Val Gln 545 550 555 560 Asp Ile Leu Pro Cys Leu His 565 <210> 8 <211> 567 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Cysteine to serine substitution at position 318 in Anabaena variabilis PAL <400> 8 Met Lys Thr Leu Ser Gln Ala Gln Ser Lys Thr Ser Ser Gln Gln Phe 1 5 10 15 Ser Phe Thr Gly Asn Ser Ser Ala Asn Val Ile Ile Gly Asn Gln Lys 20 25 30 Leu Thr Ile Asn Asp Val Ala Arg Val Ala Arg Asn Gly Thr Leu Val 35 40 45 Ser Leu Thr Asn Asn Thr Asp Ile Leu Gln Gly Ile Gln Ala Ser Cys 50 55 60 Asp Tyr Ile Asn Asn Ala Val Glu Ser Gly Glu Pro Ile Tyr Gly Val 65 70 75 80 Thr Ser Gly Phe Gly Gly Met Ala Asn Val Ala Ile Ser Arg Glu Gln 85 90 95 Ala Ser Glu Leu Gln Thr Asn Leu Val Trp Phe Leu Lys Thr Gly Ala 100 105 110 Gly Asn Lys Leu Pro Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg 115 120 125 Ala Asn Ser His Met Arg Gly Ala Ser Gly Ile Arg Leu Glu Leu Ile 130 135 140 Lys Arg Met Glu Ile Phe Leu Asn Ala Gly Val Thr Pro Tyr Val Tyr 145 150 155 160 Glu Phe Gly Ser Ile Gly Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser Tyr 165 170 175 Ile Thr Gly Ser Leu Ile Gly Leu Asp Pro Ser Phe Lys Val Asp Phe 180 185 190 Asn Gly Lys Glu Met Asp Ala Pro Thr Ala Leu Arg Gln Leu Asn Leu 195 200 205 Ser Pro Leu Thr Leu Leu Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Met Asn Gly 210 215 220 Thr Ser Val Met Thr Gly Ile Ala Ala Asn Cys Val Tyr Asp Thr Gln 225 230 235 240 Ile Leu Thr Ala Ile Ala Met Gly Val His Ala Leu Asp Ile Gln Ala 245 250 255 Leu Asn Gly Thr Asn Gln Ser Phe His Pro Phe Ile His Asn Ser Lys 260 265 270 Pro His Pro Gly Gln Leu Trp Ala Ala Asp Gln Met Ile Ser Leu Leu 275 280 285 Ala Asn Ser Gln Leu Val Arg Asp Glu Leu Asp Gly Lys His Asp Tyr 290 295 300 Arg Asp His Glu Leu Ile Gln Asp Arg Tyr Ser Leu Arg Ser Leu Pro 305 310 315 320 Gln Tyr Leu Gly Pro Ile Val Asp Gly Ile Ser Gln Ile Ala Lys Gln 325 330 335 Ile Glu Ile Glu Ile Asn Ser Val Thr Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val 340 345 350 Asp Asn Gln Ala Ser Tyr His Gly Gly Asn Phe Leu Gly Gln Tyr Val 355 360 365 Gly Met Gly Met Asp His Leu Arg Tyr Tyr Ile Gly Leu Leu Ala Lys 370 375 380 His Leu Asp Val Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Pro Glu Phe Ser Asn 385 390 395 400 Gly Leu Pro Pro Ser Leu Leu Gly Asn Arg Glu Arg Lys Val Asn Met 405 410 415 Gly Leu Lys Gly Leu Gln Ile Cys Gly Asn Ser Ile Met Pro Leu Leu 420 425 430 Thr Phe Tyr Gly Asn Ser Ile Ala Asp Arg Phe Pro Thr His Ala Glu 435 440 445 Gln Phe Asn Gln Asn Ile Asn Ser Gln Gly Tyr Thr Ser Ala Thr Leu 450 455 460 Ala Arg Arg Ser Val Asp Ile Phe Gln Asn Tyr Val Ala Ile Ala Leu 465 470 475 480 Met Phe Gly Val Gln Ala Val Asp Leu Arg Thr Tyr Lys Lys Thr Gly 485 490 495 His Tyr Asp Ala Arg Ala Cys Leu Ser Pro Ala Thr Glu Arg Leu Tyr 500 505 510 Ser Ala Val Arg His Val Val Gly Gln Lys Pro Thr Ser Asp Arg Pro 515 520 525 Tyr Ile Trp Asn Asp Asn Glu Gln Gly Leu Asp Glu His Ile Ala Arg 530 535 540 Ile Ser Ala Asp Ile Ala Ala Gly Gly Val Ile Val Gln Ala Val Gln 545 550 555 560 Asp Ile Leu Pro Cys Leu His 565 <210> 9 <211> 567 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Cysteine to serine substitution at position 503 in Anabaena variabilis PAL <400> 9 Met Lys Thr Leu Ser Gln Ala Gln Ser Lys Thr Ser Ser Gln Gln Phe 1 5 10 15 Ser Phe Thr Gly Asn Ser Ser Ala Asn Val Ile Ile Gly Asn Gln Lys 20 25 30 Leu Thr Ile Asn Asp Val Ala Arg Val Ala Arg Asn Gly Thr Leu Val 35 40 45 Ser Leu Thr Asn Asn Thr Asp Ile Leu Gln Gly Ile Gln Ala Ser Cys 50 55 60 Asp Tyr Ile Asn Asn Ala Val Glu Ser Gly Glu Pro Ile Tyr Gly Val 65 70 75 80 Thr Ser Gly Phe Gly Gly Met Ala Asn Val Ala Ile Ser Arg Glu Gln 85 90 95 Ala Ser Glu Leu Gln Thr Asn Leu Val Trp Phe Leu Lys Thr Gly Ala 100 105 110 Gly Asn Lys Leu Pro Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg 115 120 125 Ala Asn Ser His Met Arg Gly Ala Ser Gly Ile Arg Leu Glu Leu Ile 130 135 140 Lys Arg Met Glu Ile Phe Leu Asn Ala Gly Val Thr Pro Tyr Val Tyr 145 150 155 160 Glu Phe Gly Ser Ile Gly Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser Tyr 165 170 175 Ile Thr Gly Ser Leu Ile Gly Leu Asp Pro Ser Phe Lys Val Asp Phe 180 185 190 Asn Gly Lys Glu Met Asp Ala Pro Thr Ala Leu Arg Gln Leu Asn Leu 195 200 205 Ser Pro Leu Thr Leu Leu Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Met Asn Gly 210 215 220 Thr Ser Val Met Thr Gly Ile Ala Ala Asn Cys Val Tyr Asp Thr Gln 225 230 235 240 Ile Leu Thr Ala Ile Ala Met Gly Val His Ala Leu Asp Ile Gln Ala 245 250 255 Leu Asn Gly Thr Asn Gln Ser Phe His Pro Phe Ile His Asn Ser Lys 260 265 270 Pro His Pro Gly Gln Leu Trp Ala Ala Asp Gln Met Ile Ser Leu Leu 275 280 285 Ala Asn Ser Gln Leu Val Arg Asp Glu Leu Asp Gly Lys His Asp Tyr 290 295 300 Arg Asp His Glu Leu Ile Gln Asp Arg Tyr Ser Leu Arg Cys Leu Pro 305 310 315 320 Gln Tyr Leu Gly Pro Ile Val Asp Gly Ile Ser Gln Ile Ala Lys Gln 325 330 335 Ile Glu Ile Glu Ile Asn Ser Val Thr Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val 340 345 350 Asp Asn Gln Ala Ser Tyr His Gly Gly Asn Phe Leu Gly Gln Tyr Val 355 360 365 Gly Met Gly Met Asp His Leu Arg Tyr Tyr Ile Gly Leu Leu Ala Lys 370 375 380 His Leu Asp Val Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Pro Glu Phe Ser Asn 385 390 395 400 Gly Leu Pro Pro Ser Leu Leu Gly Asn Arg Glu Arg Lys Val Asn Met 405 410 415 Gly Leu Lys Gly Leu Gln Ile Cys Gly Asn Ser Ile Met Pro Leu Leu 420 425 430 Thr Phe Tyr Gly Asn Ser Ile Ala Asp Arg Phe Pro Thr His Ala Glu 435 440 445 Gln Phe Asn Gln Asn Ile Asn Ser Gln Gly Tyr Thr Ser Ala Thr Leu 450 455 460 Ala Arg Arg Ser Val Asp Ile Phe Gln Asn Tyr Val Ala Ile Ala Leu 465 470 475 480 Met Phe Gly Val Gln Ala Val Asp Leu Arg Thr Tyr Lys Lys Thr Gly 485 490 495 His Tyr Asp Ala Arg Ala Ser Leu Ser Pro Ala Thr Glu Arg Leu Tyr 500 505 510 Ser Ala Val Arg His Val Val Gly Gln Lys Pro Thr Ser Asp Arg Pro 515 520 525 Tyr Ile Trp Asn Asp Asn Glu Gln Gly Leu Asp Glu His Ile Ala Arg 530 535 540 Ile Ser Ala Asp Ile Ala Ala Gly Gly Val Ile Val Gln Ala Val Gln 545 550 555 560 Asp Ile Leu Pro Cys Leu His 565 <210> 10 <211> 567 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Cysteine to serine substition at position 565 in Anabaena variabilis PAL <400> 10 Met Lys Thr Leu Ser Gln Ala Gln Ser Lys Thr Ser Ser Gln Gln Phe 1 5 10 15 Ser Phe Thr Gly Asn Ser Ser Ala Asn Val Ile Ile Gly Asn Gln Lys 20 25 30 Leu Thr Ile Asn Asp Val Ala Arg Val Ala Arg Asn Gly Thr Leu Val 35 40 45 Ser Leu Thr Asn Asn Thr Asp Ile Leu Gln Gly Ile Gln Ala Ser Cys 50 55 60 Asp Tyr Ile Asn Asn Ala Val Glu Ser Gly Glu Pro Ile Tyr Gly Val 65 70 75 80 Thr Ser Gly Phe Gly Gly Met Ala Asn Val Ala Ile Ser Arg Glu Gln 85 90 95 Ala Ser Glu Leu Gln Thr Asn Leu Val Trp Phe Leu Lys Thr Gly Ala 100 105 110 Gly Asn Lys Leu Pro Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg 115 120 125 Ala Asn Ser His Met Arg Gly Ala Ser Gly Ile Arg Leu Glu Leu Ile 130 135 140 Lys Arg Met Glu Ile Phe Leu Asn Ala Gly Val Thr Pro Tyr Val Tyr 145 150 155 160 Glu Phe Gly Ser Ile Gly Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser Tyr 165 170 175 Ile Thr Gly Ser Leu Ile Gly Leu Asp Pro Ser Phe Lys Val Asp Phe 180 185 190 Asn Gly Lys Glu Met Asp Ala Pro Thr Ala Leu Arg Gln Leu Asn Leu 195 200 205 Ser Pro Leu Thr Leu Leu Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Met Asn Gly 210 215 220 Thr Ser Val Met Thr Gly Ile Ala Ala Asn Cys Val Tyr Asp Thr Gln 225 230 235 240 Ile Leu Thr Ala Ile Ala Met Gly Val His Ala Leu Asp Ile Gln Ala 245 250 255 Leu Asn Gly Thr Asn Gln Ser Phe His Pro Phe Ile His Asn Ser Lys 260 265 270 Pro His Pro Gly Gln Leu Trp Ala Ala Asp Gln Met Ile Ser Leu Leu 275 280 285 Ala Asn Ser Gln Leu Val Arg Asp Glu Leu Asp Gly Lys His Asp Tyr 290 295 300 Arg Asp His Glu Leu Ile Gln Asp Arg Tyr Ser Leu Arg Cys Leu Pro 305 310 315 320 Gln Tyr Leu Gly Pro Ile Val Asp Gly Ile Ser Gln Ile Ala Lys Gln 325 330 335 Ile Glu Ile Glu Ile Asn Ser Val Thr Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val 340 345 350 Asp Asn Gln Ala Ser Tyr His Gly Gly Asn Phe Leu Gly Gln Tyr Val 355 360 365 Gly Met Gly Met Asp His Leu Arg Tyr Tyr Ile Gly Leu Leu Ala Lys 370 375 380 His Leu Asp Val Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Pro Glu Phe Ser Asn 385 390 395 400 Gly Leu Pro Pro Ser Leu Leu Gly Asn Arg Glu Arg Lys Val Asn Met 405 410 415 Gly Leu Lys Gly Leu Gln Ile Cys Gly Asn Ser Ile Met Pro Leu Leu 420 425 430 Thr Phe Tyr Gly Asn Ser Ile Ala Asp Arg Phe Pro Thr His Ala Glu 435 440 445 Gln Phe Asn Gln Asn Ile Asn Ser Gln Gly Tyr Thr Ser Ala Thr Leu 450 455 460 Ala Arg Arg Ser Val Asp Ile Phe Gln Asn Tyr Val Ala Ile Ala Leu 465 470 475 480 Met Phe Gly Val Gln Ala Val Asp Leu Arg Thr Tyr Lys Lys Thr Gly 485 490 495 His Tyr Asp Ala Arg Ala Cys Leu Ser Pro Ala Thr Glu Arg Leu Tyr 500 505 510 Ser Ala Val Arg His Val Val Gly Gln Lys Pro Thr Ser Asp Arg Pro 515 520 525 Tyr Ile Trp Asn Asp Asn Glu Gln Gly Leu Asp Glu His Ile Ala Arg 530 535 540 Ile Ser Ala Asp Ile Ala Ala Gly Gly Val Ile Val Gln Ala Val Gln 545 550 555 560 Asp Ile Leu Pro Ser Leu His 565 <210> 11 <211> 567 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Cysteine to serine substitutions at positions 565 and 503 in Anabaena variabilis PAL <400> 11 Met Lys Thr Leu Ser Gln Ala Gln Ser Lys Thr Ser Ser Gln Gln Phe 1 5 10 15 Ser Phe Thr Gly Asn Ser Ser Ala Asn Val Ile Ile Gly Asn Gln Lys 20 25 30 Leu Thr Ile Asn Asp Val Ala Arg Val Ala Arg Asn Gly Thr Leu Val 35 40 45 Ser Leu Thr Asn Asn Thr Asp Ile Leu Gln Gly Ile Gln Ala Ser Cys 50 55 60 Asp Tyr Ile Asn Asn Ala Val Glu Ser Gly Glu Pro Ile Tyr Gly Val 65 70 75 80 Thr Ser Gly Phe Gly Gly Met Ala Asn Val Ala Ile Ser Arg Glu Gln 85 90 95 Ala Ser Glu Leu Gln Thr Asn Leu Val Trp Phe Leu Lys Thr Gly Ala 100 105 110 Gly Asn Lys Leu Pro Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg 115 120 125 Ala Asn Ser His Met Arg Gly Ala Ser Gly Ile Arg Leu Glu Leu Ile 130 135 140 Lys Arg Met Glu Ile Phe Leu Asn Ala Gly Val Thr Pro Tyr Val Tyr 145 150 155 160 Glu Phe Gly Ser Ile Gly Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser Tyr 165 170 175 Ile Thr Gly Ser Leu Ile Gly Leu Asp Pro Ser Phe Lys Val Asp Phe 180 185 190 Asn Gly Lys Glu Met Asp Ala Pro Thr Ala Leu Arg Gln Leu Asn Leu 195 200 205 Ser Pro Leu Thr Leu Leu Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Met Asn Gly 210 215 220 Thr Ser Val Met Thr Gly Ile Ala Ala Asn Cys Val Tyr Asp Thr Gln 225 230 235 240 Ile Leu Thr Ala Ile Ala Met Gly Val His Ala Leu Asp Ile Gln Ala 245 250 255 Leu Asn Gly Thr Asn Gln Ser Phe His Pro Phe Ile His Asn Ser Lys 260 265 270 Pro His Pro Gly Gln Leu Trp Ala Ala Asp Gln Met Ile Ser Leu Leu 275 280 285 Ala Asn Ser Gln Leu Val Arg Asp Glu Leu Asp Gly Lys His Asp Tyr 290 295 300 Arg Asp His Glu Leu Ile Gln Asp Arg Tyr Ser Leu Arg Cys Leu Pro 305 310 315 320 Gln Tyr Leu Gly Pro Ile Val Asp Gly Ile Ser Gln Ile Ala Lys Gln 325 330 335 Ile Glu Ile Glu Ile Asn Ser Val Thr Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val 340 345 350 Asp Asn Gln Ala Ser Tyr His Gly Gly Asn Phe Leu Gly Gln Tyr Val 355 360 365 Gly Met Gly Met Asp His Leu Arg Tyr Tyr Ile Gly Leu Leu Ala Lys 370 375 380 His Leu Asp Val Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Pro Glu Phe Ser Asn 385 390 395 400 Gly Leu Pro Pro Ser Leu Leu Gly Asn Arg Glu Arg Lys Val Asn Met 405 410 415 Gly Leu Lys Gly Leu Gln Ile Cys Gly Asn Ser Ile Met Pro Leu Leu 420 425 430 Thr Phe Tyr Gly Asn Ser Ile Ala Asp Arg Phe Pro Thr His Ala Glu 435 440 445 Gln Phe Asn Gln Asn Ile Asn Ser Gln Gly Tyr Thr Ser Ala Thr Leu 450 455 460 Ala Arg Arg Ser Val Asp Ile Phe Gln Asn Tyr Val Ala Ile Ala Leu 465 470 475 480 Met Phe Gly Val Gln Ala Val Asp Leu Arg Thr Tyr Lys Lys Thr Gly 485 490 495 His Tyr Asp Ala Arg Ala Ser Leu Ser Pro Ala Thr Glu Arg Leu Tyr 500 505 510 Ser Ala Val Arg His Val Val Gly Gln Lys Pro Thr Ser Asp Arg Pro 515 520 525 Tyr Ile Trp Asn Asp Asn Glu Gln Gly Leu Asp Glu His Ile Ala Arg 530 535 540 Ile Ser Ala Asp Ile Ala Ala Gly Gly Val Ile Val Gln Ala Val Gln 545 550 555 560 Asp Ile Leu Pro Ser Leu His 565 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nostoc punctiforme PAL primer 1 (forward) <400> 12 cactgtcata tgaatataac atctctacaa cagaacat 38 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nostoc punctiforme PAL primer 2 (reverse) <400> 13 gacagtggcg gccgctcacg ttgactttaa gctcgaaaaa atatg 45 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer 1 (forward, N-terminal fragment) <400> 14 cactgtgcta gcatgaagac actatctcaa gcacaaag 38 <210> 15 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer 2 (reverse, N-terminal fragment) <400> 15 ggaaatttcc tccatgatag ctggcttggt tatcaacatc aattagtgg 49 <210> 16 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer 3 (forward, C-terminal fragment) <400> 16 ccactaattg atgttgataa ccaagccagc tatcatggag gaaatttcc 49 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer 4 (reverse, C-terminal fragment) <400> 17 cactgtgcgg ccgcttaatg caagcagggt aagatatctt g 41 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL forward primer <400> 18 cactgtcata tgaagacact atctcaagca caaag 35 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL reverse primer <400> 19 cactgtctcg agatgcaagc agggtaagat atcttg 36 <210> 20 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer to create 5' NheI site and delete internal NheI site (forward, N-terminal) <400> 20 cactgtgcta gcatgaagac actatctcaa gcacaaag 38 <210> 21 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer to create 5' NheI site and delete internal NheI site (reverse, N-terminal ) <400> 21 ggaaatttcc tccatgatag ctggcttggt tatcaacatc aattagtgg 49 <210> 22 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer to create 5' NheI site and delete internal NheI site (forward, C-terminal fragment) <400> 22 ccactaattg atgttgataa ccaagccagc tatcatggag gaaatttcc 49 <210> 23 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer to create 5' NheI site and delete internal NheI site (reverse, C-terminal fragment) <400> 23 acagtggcgg ccgcttaatg caagcagggt aagatatctt g 41 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer to create 5' NheI site and 3' SmaI site (forward) <400> 24 cactgtgaat tcatgaagac actatctcaa gcacaaag 38 <210> 25 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer to create 5' NheI site and 3' SmaI site (reverse) <400> 25 cactgtcccg ggttaatgca agcagggtaa gatatct 37 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer to create cysteine to serine substitution at position 503 (forward) <400> 26 gtcattacga tgcacgcgcc tctctatcac ctgcaactga g 41 <210> 27 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer to create cysteine to serine substitution at position 503 (reverse) <400> 27 ctcagttgca ggtgatagag aggcgcgtgc atcgtaatga c 41 <210> 28 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer to create cysteine to serine substitution at position 565 (forward) <400> 28 cagttcaaga tatcttaccc tccttgcatt aacccgggct gc 42 <210> 29 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer to create cysteine to serine substitution at position 565 (reverse) <400> 29 gcagcccggg ttaatgcaag gagggtaaga tatcttgaac tg 42 <210> 30 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer to create cysteine to serine substitution at position 64 (forward) <400> 30 gcagggtatt caggcatctt ctgattacat taataatgct gttg 44 <210> 31 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer to create cysteine to serine substitution at position 64 (reverse) <400> 31 caacagcatt attaatgtaa tcagaagatg cctgaatacc ctgc 44 <210> 32 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer to create cysteine to serine substitution at position 318 (forward) <400> 32 caagatcgtt actcactccg atcccttccc cagtatttgg ggc 43 <210> 33 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anabaena variabilis PAL primer to create cysteine to serine substitution at position 318 (reverse) <400> 33 gccccaaata ctggggaagg gatcggagtg agtaacgatc ttg 43

Claims (1)

1. 야생형 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis) 페닐알라닌 암모니아-리아제 (AvPAL)(서열 4)에 비해 페닐알라닌-전환 활성이 더 크거나, 면역원성이 감소되거나, 페닐알라닌-전환 활성이 더 크고 면역원성이 감소된 AvPAL 변이체로서, 위치 503 및 565의 시스테인 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 변이체를 이용한 치료 방법.

Images