ES2350754T3 - Formulaciones de anticuerpos anti-rsv líquidas y estabilizadas. - Google Patents

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Abstract

Una formulación de palivizumab acuosa y estable que comprende, en un vehículo acuoso: (a) al menos 65 mg/ml de palivizumab o uno de sus fragmentos de unión a sus antígenos; (b) histidina 10 mM a 50 mM; y (c) menos de glicina 3 mM, en donde dicho palivizumab o fragmento que se une a antígenos de palivizumab de la formulación es estable 38ºC-42ºC, durante al menos 60 días, según se determina por cromatografía de exclusión por tamaños de alta resolución (HPSEC).

Description

1. INTRODUCCIÓN
La presente invención se refiere a formulaciones líquidas de palivizumab o de uno de sus fragmentos que se une a antígenos, las cuales presentan estabilidad, niveles de fragmentación de anticuerpos bajos o no detectables, niveles de agregación bajos o no detectables y muy poca o ninguna pérdida de actividad biológica (por ejemplo, eficacia terapéutica) del palivizumab o de uno de sus fragmentos que se une a antígenos, incluso durante o después de largos periodos de conservación. En particular, la presente invención se refiere a formulaciones líquidas de palivizumab o de uno de sus fragmentos que se une a antígenos, las cuales están sustancialmente exentas de tensioactivos y/o sales inorgánicas. La presente invención se refiere también a métodos para prevenir, tratar o mejorar los síntomas asociados a una infección por el virus sincitial respiratorio (abreviadamente en lo sucesivo RSV por la expresión inglesa Respiratory Syncytial Virus) utilizando formulaciones líquidas de palivizumab o de uno de sus fragmentos que se une a antígenos.
2. FUNDAMENTO DE LA INVENCIÓN.
El virus sincitial respiratorio (RSV) es la causa principal de graves enfermedades de las vía respiratorias inferiores en bebés y niños (Feigen et al., eds., 1987, en Textbook of Pediatric Infectious Diseases, WB Saunders, Philadelphia, en las páginas 1653-1675; New Vaccine Development, Establishing Priorities, Vol. 1, 1985, National Academy Press, Washington DC, en las páginas 397-409; y Ruuskanen et al., 1993, Curr. Probl. Pediatr. 23:50-79). La naturaleza epidémica anual de la infección por el RSV es evidente en todo el mundo, pero la incidencia y la gravedad de la enfermedad por el RSV en una estación dada varía según las regiones (Hall, C.B., 1993, Contemp. Pediatr. 10:92-110). En regiones templadas del hemisferio norte, comienza generalmente a finales del otoño y termina a finales de la primavera (Hall, C.B., 1995, Mandell G.L., Bernnett J.E., Dolin R., eds., 1995, Principles and Practice of lnfections Diseases. 4th ed., Churchill Livingstone, New York, en las páginas 1501-1519). Se estima que la enfermedad por el RSV da como resultado 90.000 hospitalizaciones y provoca 4.500 muertes anualmente en Estados Unidos. La infección primaria por el RSV se presenta más frecuentemente en niños de 6 semanas a 2 años y con poca frecuencia en las primeras 4 semanas de vida durante epidemias intrahospitalarias (Hall et al., 1979, New Engl. J. Med. 300:393-396). Se estima que el RSV provoca tanto como el 75% de todas las bronquiolitis infantiles y hasta el 40% de todas las neumonías pediátricas (Cunningham, C.K. et al., 1991, Pediatrics 88:527-532). Los niños con mayor riesgo de infección por el RSV incluyen los bebés prematuros (Hall et al., 1979, New Engl. J. Med. 300:393-396) y los niños con displasia broncopulmonar (Groothuis et al., 1988, Pediatrics 82:199-203), cardiopatía congénita (MacDonald et al., New Engl. J. Med. 307:397-400), inmunodeficiencia congénita o adquirida (Ogra et al., 1988, Pediatr. Infect. Dis. J. 7:246-249; y Pohl et al., 1992, J. Infect. Dis. 165:166-169) y fibrosis quística (Abman et al., 1988, J. Pediatr. 113:826-830). El índice de mortalidad en bebés con enfermedad cardíaca o pulmonar que son hospitalizados con infección por el RSV es 3%-4% (Navas et al., 1992, J. Pediatr. 121:348-354).
El RSV infecta adultos así como bebés y niños. En adultos sanos, el RSV provoca predominantemente enfermedades de las vías respiratorias superiores. Recientemente se ha comprobado que algunos adultos, especialmente las personas mayores, tienen infecciones sintomáticas por el RSV más frecuentemente que lo que se había descrito anteriormente (Evans, A.S., eds., 1989, Viral Infections of Humans. Epidemiology and Control, 3rd ed., Plenum Medical Book, New York, páginas 525-544). También se han descrito varias epidemias entre los pacientes de residencias de ancianos y jóvenes adultos internados en establecimientos sanitarios (Falsey, A.R., 1991, Infect. Control Hosp. Epidemiol. 12:602-608; y Garvie et al., 1980, Br. Med. J. 281:1253-1254). Finalmente, el RSV puede provocar graves enfermedades en personas inmunodeprimidas, particularmente en pacientes con trasplante de médula ósea (Hertz et al., 1989, Medicine 68:269-281).
Las opciones de tratamiento de una enfermedad por el RSV establecida son limitadas. La enfermedad grave de las vías respiratorias inferiores por el RSV requiere con frecuencia un tratamiento de apoyo considerable, incluyendo la administración de oxígeno humidificado y asistencia respiratoria (Fields et al., eds, 1990, Fields Virology, 2nd ed., Vol. 1, Raven Press, New York, en las páginas 1045-1072). El único fármaco aprobado para el tratamiento de la infección es el agente antiviral ribavirina (American Academy of Pediatrics Committee on Infectious Diseases, 1993, Pediatrics 92:501504). Se ha demostrado que es eficaz en el tratamiento de neumonía y bronquiolitis por el RSV, modificando el curso de la enfermedad grave por el RSV en niños inmunocompetentes (Smith et al., 1991, New Engl. J. Med. 325:24-29). Sin embargo, la ribavirina tiene ciertas limitaciones que incluyen alto coste, necesidad de administración prolongada por aerosol y riesgo potencial para las mujeres embarazadas, así como para el personal sanitario expuesto a ella. The American Academy of Pediatrics Committee on Infectious Diseases revisó su recomendación de uso de la ribavirina. La recomendación actual es que la decisión de utilizar ribavirina debe basarse en las circunstancias clínicas particulares y en la experiencia del médico (American Academy of Pediatrics. Summaries of Infectious Diseases, en Pickering L.K., ed., 2000 Red Book: Report of the Committee on Infectious Diseases. 25th ed., Elk Grove Village, IL, American Academy of Pediatrics, 2000, pp. 483-487).
Aunque una vacuna podría prevenir la infección por el RSV, ninguna vacuna está autorizada hasta ahora para esta indicación. Un obstáculo importante para el desarrollo de la vacuna es la seguridad. Una vacuna inactivada con formalina, aunque inmunógena, provocó inesperadamente en bebés inmunizados una incidencia mayor y más grave de la enfermedad de las vías respiratorias inferiores debida al RSV, que en bebés inmunizados con una vacuna paragripal trivalente preparada de modo similar (Kim et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89:422-434; y Kapikian et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89:405-421). Varias vacunas candidatas contra el RSV han sido abandonadas y otras están en desarrollo (Murphy et al., 1994, Virus Res. 32:13-36), pero incluso si se resuelven los problemas de seguridad, debe mejorarse también la eficacia de la vacuna. Quedan por resolver varios problemas. Se requeriría la inmunización en el periodo neonatal inmediato puesto que la incidencia máxima de la enfermedad de las vías respiratorias inferiores se presenta a la edad de 2-5 meses. Puede esperarse que la inmadurez de la respuesta inmune neonatal junto con los altos títulos de anticuerpos contra el RSV adquiridos por vía materna reduzcan la inmunogenicidad de la vacuna en el periodo neonatal (Murphy et al., 1988, J. Virol. 62:3907-3910; y Murphy et al., 1991, Vaccine 9:185-189). Por último, la infección y enfermedad primaria por el RSV no protege bien contra la enfermedad subsiguiente por el RSV (Henderson et al., 1979, New Engl. J. Med. 300:530-534).
Actualmente, la única propuesta aprobada para la profilaxis de la enfermedad por el RSV es la inmunización pasiva. La prueba inicial que sugiere un papel protector para la IgG se obtuvo de las observaciones que implican anticuerpos maternos en hurones (Prime, G.A., Ph.D. diss., University of California, Los Angeles, 1975) y seres humanos (Lambrecht et al, 1976, J. lnfect. Dis. 134:211-217; y Glezen et al., 1981, J. Pediatr. 98:708-715). Hemming et al. (Morell et al., eds., 1986, Clinical Use of Intravenous lmmunoglobulins, Academic Press, London, en las páginas 285-294) reconocieron la posible utilidad de anticuerpos contra el RSV en el tratamiento o prevención de la infección por el RSV durante estudios que implicaban la farmacocinética de una inmunoglobulina intravenosa (abreviadamente en lo sucesivo IVIG por la expresión inglesa intravenous immnunoglobulin) en recién nacidos que se sospechaba que padecían septicemia neonatal. Estos autores observaron que un bebé, cuyas secreciones respiratorias proporcionaban el RSV, se recuperó rápidamente después de infusión de IVIG. Un análisis posterior del lote de IVIG reveló un título inusualmente alto de anticuerpo neutralizante del RSV. Este mismo grupo de investigadores examinó a continuación la capacidad de suero o inmunoglobulina hiperinmunes, enriquecidos por anticuerpo neutralizante del RSV, para proteger ratas del algodón y primates contra la infección por el RSV (Prince et al., 1985, Virus Res. 3:193-206; Prince et al., 1990, J. Virol. 64:3091-3092; Hemming et al., 1985, J. lnfect. Dis. 152:1083-1087; Prince et al., 1983, Infect. Immun. 42:81-87; y Prince et al., 1985, J. Virol. 55:517-520). Los resultados de estos estudios sugirieron que el anticuerpo neutralizante del RSV administrado profilácticamente inhibía la replicación en las vías respiratorias del RSV en ratas del algodón. Cuando se administra terapéuticamente, el anticuerpo contra el RSV reducía la replicación en el tracto pulmonar tanto en el modelo de las ratas del algodón como en el modelo de primates no humanos. Además, la infusión pasiva de antisuero o inmunoglobulina no produjo un aumento de la patología pulmonar en ratas del algodón sometidas posteriormente a una prueba de virulencia con el RSV.
Un anticuerpo humanizado dirigido a un epítopo en el sitio antigénico A de la proteína F del RSV, SYNAGIS®, que comprende regiones determinantes de la complementariedad (abreviadamente en lo sucesivo CDR por la expresión inglesa Complementarity Determining Regions) pesadas y variables (abreviadamente por la expresión inglesa variable heavy) que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:1-3 y CDR ligeras y variables (abreviadamente en lo sucesivo VL por la expresión inglesa variable light) que tienen las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO:4-6, ha sido aprobado para administración intramuscular a pacientes pediátricos para la prevención de enfermedades graves de las vías respiratorias inferiores provocadas por el RSV a dosis mensuales recomendadas de 15 mg/kg de peso corporal durante la estación del RSV (noviembre a abril en el hemisferio norte). SYNAGIS® es una composición de secuencias de anticuerpos humanos (95%) y de múridos (5%). Véase, Johnson et al., 1997, J. Infect. Diseases 176:1215-1224 y la patente de EE.UU. Nº.
5.824.307. La secuencia de la cadena pesada humana procedía de los dominios constantes de la IgG1 humana y las regiones de marco variable de los genes VH de Cor (Press et al., 1970, Biochem. J. 117:641-660) y Cess (Takashi et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81:194-198). La secuencia de la cadena ligera humana procedía del dominio constante de C6 y las regiones del marco variables del gen VL K104 con J6-4 (Bentley et al., 1980, Nature 288:5194-5198). Las secuencias de múridos procedían de un anticuerpo monoclonal de múridos, Mab 1129 (Beeler et al., 1989, J. Virology 63:2941-2950), en un procedimiento que implicaba el injerto de las regiones determinantes de la complementariedad de múridos en los marcos de anticuerpos humanos.
El SYNAGIS® tiene una alta actividad específica contra el RSV in vitro (aproximadamente 50-100 veces la del RespiGam®) y se sabe que neutraliza una amplia gama de aislados del RSV. Puesto que no procede de plasma humano, el tratamiento profiláctico con SYNAGIS® no conlleva el riesgo de transmisión de agentes patógenos de transmisión por la sangre.
El SYNAGIS® se formuló inicialmente como un líquido para administración IV, a una concentración de 10 mg/ml de SYNAGIS® en solución salina tamponada con fosfato (abreviadamente en lo sucesivo PBS por la expresión inglesa Phosphate Buffered Saline. Una formulación liofilizada de SYNAGIS®, que permite una concentración mayor (100 mg/ml después de reconstitución, en histidina 50 mM y tampón de glicina 3,2 mM con manitol al 6% (p/v) a pH 6,0) del anticuerpo que esta formulación líquida inicial, se produjo más tarde para permitir la administración intramuscular. La formulación liofilizada del SYNAGIS® se prepara liofilizando SYNAGIS® a 54 mg/ml en una solución acuosa que contenga histidina 25 mM, glicina 1,6 mM y manitol al 3% (p/v) a pH 6,0. La formulación líquida inicial en PBS y la formulación liofilizada de SYNAGIS® ha sido ensayada en estudios clínicos de fase I en adultos sanos. La formulación liofilizada se ensayó en estudios de fase I a fase IV en pacientes pediátricos. Se encuentra que el SYNAGIS®, a dosis de 15 mg/kg a 30 mg/kg para adultos es bien tolerado y a 15 mg/kg para niños es seguro y eficaz para la profilaxis del RSV. La formulación liofilizada fue aprobada en 1998 por la FDA para su uso en la prevención de una enfermedad grave de las vías respiratorias inferiores provocada por el RSV en niños con alto riesgo de enfermedad por el RSV.
Sin embargo, la formulación liofilizada presenta varias limitaciones, incluyendo un proceso prolongado de liofilización y un alto coste resultante de fabricación. Además, la formulación liofilizada ha de ser reconstituida aséptica y exactamente por profesionales sanitarios antes de su administración a los pacientes. La etapa de reconstitución propiamente dicha requiere ciertos procedimientos específicos: (1) al vial que contiene SYNAGIS® liofilizado se añade, lenta y asépticamente, un diluyente estéril (es decir, agua o dextrosa al 5% en agua para administración intravenosa y agua para administración intramuscular) y el vial debe removerse muy suavemente durante 30 segundos para evitar la formación de espuma; (2) el SYNAGIS® reconstituido necesita reposar a la temperatura ambiente durante un mínimo de 20 minutos hasta que se clarifique la solución; y (3) la preparación reconstituida debe administrarse en las seis
(6) horas siguientes a la reconstitución. Dicho procedimiento de reconstitución es engorroso y lento y la limitación del tiempo después de la reconstitución es un gran inconveniente para la administración de la formulación a los pacientes, produciendo desechos significativos, si no se realiza apropiadamente o si la dosis reconstituida no se utiliza antes de seis (6) horas y debe desecharse.
Por tanto, se necesita una formulación líquida de SYNAGIS® a una concentración comparable o superior a la de la formulación liofilizada reconstituida de modo que no sea necesario reconstituir la formulación antes de su administración. Esto permite a los profesionales sanitarios realizar una administración mucho más rápida y fácil de SYNAGIS® a un paciente. Wang publicó una revisión exhaustiva sobre la estabilización de productos farmacéuticos proteínicos líquidos (Int. J. Pharm. (1999), 185:12988).
Las preparaciones de anticuerpos líquidas anteriores tienen cortos periodos de validez y pueden perder la actividad biológica de los anticuerpos debido a inestabilidades químicas y físicas durante la conservación. La inestabilidad química puede ser provocada por desamidación, racemización, hidrólisis, oxidación, eliminación beta o cambio de disulfuros y la inestabilidad física puede ser provocada por desnaturalización del anticuerpo, agregación, precipitación o adsorción. Entre estas, se sabe que la agregación, la desamidación y la oxidación son las causas más frecuentes de degradación de los anticuerpos (Wang et al., 1988, J. of Parenteral Science & Technology 42(Suppl):S4-S26; Cleland et al., 1993, Critical Reviews in Terapeutic Drug Carrier Systems 10(4):307-377). Por tanto, se necesita una formulación líquida estable de SYNAGIS® o de uno de sus fragmentos que se une a antígenos eficaz para prevenir la infección por el RSV.
3. SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se basa, en parte, en el desarrollo de formulaciones líquidas estables a una concentración alta de palivizumab (SYNAGIS®), o de uno de sus fragmentos que se une a antígenos, de acuerdo con la reivindicación 1. Las formulaciones líquidas de la presente invención facilitan la administración de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, para la prevención, tratamiento, gestión y/o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. En particular, las formulaciones líquidas de la presente invención permiten a un profesional sanitario administrar rápidamente una dosis estéril de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, sin tener que reconstituir exacta y asépticamente el anticuerpo o fragmento de anticuerpo antes de su administración como se requería para la forma de dosificación liofilizada. Dichas formulaciones líquidas de SYNAGIS® también pueden ser preparadas más fácil y rentablemente que la formulación liofilizada puesto que las formulaciones líquidas no requieren un etapa de secado prolongado, tal como liofilización, etc. Las formulaciones líquidas se preparan por un proceso en el que el anticuerpo que ha de ser formulado está en una fase acuosa durante el proceso de purificación y formulación. Preferiblemente, las formulaciones líquidas se preparan por un proceso que no incluye una etapa de secado, por ejemplo, pero de ningún modo de limitación, una etapa de liofilización, secado por pulverización o secado al aire.
La presente invención proporciona formulaciones líquidas de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, sustancialmente exentas de tensioactivos, sales inorgánicas, azúcares y/u otros excipientes comunes, comprendiendo dichas formulaciones histidina y una concentración de aproximadamente 65 mg/ml o superior de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos. Opcional-mente, la formulación puede comprender además glicina. Alternativamente, la formulación de la presente invención puede comprender además otros excipientes comunes, tales como sacáridos, polioles y aminoácidos, incluyendo, aunque sin limitación, arginina, lisina y metionina. La presente invención también proporciona formulaciones líquidas sustancialmente exentas de tensioactivos, sales inorgánicas, azúcares y/u otros excipientes conocidos usualmente, teniendo dicha formulación un pH que varía desde aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0, preferiblemente aproximadamente 5,5 a 6,5, de modo más preferible aproximadamente 5,8 a alrededor de 6,2, y del modo más preferible aproximadamente 6,0 y que comprende histidina y una concentración de aproximadamente 15 mg/ml o superior de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos.
La presente invención abarca formulaciones líquidas y estables de SYNAGIS® que presentan niveles de agregación y/o fragmentación de anticuerpos bajos o no detectables con muy poca o ninguna pérdida de la(s) actividad(es) biológica(s) del SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, durante la fabricación, preparación, transporte y largos periodos de conservación. La presente invención también abarca formulaciones líquidas y estables de formas modificadas de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, que tiene aumentadas in vivo las semividas con relación al SYNAGIS® no modificado o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, presentando dichas formulaciones niveles de agregación y/o fragmentación de anticuerpos bajos o no detectables y muy poca o ninguna pérdidas de la(s) actividad(es) biológica(s) del SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos.
La presente invención abarca formulaciones líquidas de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, teniendo dichas formulaciones estabilidad a 38ºC -42ºC como ha sido demostrado por cromatografía de exclusión por tamaños molecular de alta resolución (abreviadamente en los sucesivo HPSEC por la expresión inglesa High Performance Size Exclusion Chromatography. Las formulaciones líquidas de la presente invención presentan estabilidad, determinada por HSPEC, a intervalos de temperatura de 38ºC -42ºC durante al menos 60 días (en realizaciones específicas, no más de 120 días), de 20ºC -24ºC durante al menos 1 año y de 2ºC -8ºC durante al menos 3 años. La presente invención también abarca formulaciones líquidas de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, teniendo dichas formulaciones una agregación baja o no detectable medida por HPSEC. En una realización preferida, las formulaciones líquidas de la presente invención presentan estabilidad a 38ºC -42ºC durante al menos 60 días y presentan niveles de agregación de anticuerpos bajos o no detectables por HPSEC y además, presentan muy poca o ninguna pérdida de la(s) actividad(es) biológica(s) de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, en comparación con los anticuerpos de referencia medidos por valoraciones de unión a anticuerpos, tales como, por ejemplo, ELISA.
La presente invención proporciona métodos para preparar formulaciones líquidas de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos. Las formulaciones líquidas de la presente invención se preparan manteniendo SYNAGIS® o uno sus fragmentos que se une a antígenos, en una solución acuosa en cualquier momento durante la preparación. En otras palabras, las formulaciones líquidas se preparan sin implicar ninguna etapa de secado de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos o de las formulaciones propiamente dichas, por ejemplo, por liofilización, secado a vacío, etc.
La presente invención proporciona métodos para preparar formulaciones líquidas de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, comprendiendo dichos métodos concentrar una fracción de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos purificados, hasta una concentración final de aproximadamente 60 mg/ml, aproximadamente 70 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 90 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 250 mg/ml o aproximadamente 300 mg/ml, utilizando una membrana se-mi-permeable con un límite de exclusión de peso molecular (MW) apropiado (por ejemplo, límite de exclusión de 30 kD para SYNAGIS® y sus fragmentos F(ab')2; y un límite de exclusión de 10 kD para fragmentos de SYNAGIS®, tales como fragmentos Fab) y diafiltrar la fracción de anticuerpo concentrada en el tampón de formulación utilizando la misma membrana. El tampón de formulación de la presente invención comprende histidina a una concentración que varía desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 50 mM, desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 30 mM o desde aproximadamente 23 mM hasta aproximadamente 27 mM y de modo más preferiblemente 25 mM. Para obtener un pH apropiado para SYNAGIS®, o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, es preferible que la histidina (y la glicina, si se añade) se disuelva en primer lugar en agua para obtener una solución tampón con mayor pH que el pH deseado y a continuación se lleva el pH al nivel deseado por adición de HCl. De este modo, puede evitarse la formación de sales inorgánicas (por ejemplo, la formación de NaCI cuando se utiliza, por ejemplo, hidrocloruro de histidina como fuente de histidina y se aumenta el pH hasta el nivel deseado por adición de NaOH).
Las formulaciones líquidas de la presente invención pueden estabilizarse por filtración estéril utilizando un filtro de 0,2 µ o de 0,22 µ. Las formulaciones líquidas esterilizadas de la presente invención pueden administrarse a un sujeto para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados a una infección por el RSV.
La presente invención también proporciona kits que comprenden las formulaciones líquidas de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, para ser utilizados, por ejemplo, por un profesional sanitario. La presente invención proporciona además métodos para prevenir, tratar, gestiona o mejorar una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas administrando las formulaciones líquidas de la presente invención.
3.1 Terminología
Como se utiliza en la presente memoria, todas las formulaciones líquidas de SYNAGIS® y/o sus fragmentos que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno del RSV descrito anteriormente se denominan colectivamente "formulaciones líquidas de la invención," "formulaciones líquidas de SYNAGIS® de la invención" o "formulaciones líquidas de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos".
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "modulador de los receptores de citoquinas" se refiere a un agente que modula la fosforilación de un receptor de citoquinas, la activación de una vía de transducción de señales asociada a un receptor de citoquinas y/o la expresión de una proteína particular, tal como una citoquina. Dicho agente puede modular directa o indirectamente la fosforilación de un receptor de citoquinas, la activación de una vía de transducción de señales asociada a un receptor de citoquinas y/o la expresión de una proteína particular, tal como una citoquina. Por tanto, ejemplos de moduladores de receptores de citoquinas incluyen, aunque sin limitación, citoquinas, fragmentos de citoquinas, proteínas de fusión y anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de citoquinas o uno de sus fragmentos. Además, ejemplos de moduladores de los receptores de citoquinas incluyen, aunque sin limitación, péptidos, polipéptidos (por ejemplo, receptores de citoquinas solubles), proteínas de fusión y anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a una citoquina o uno de sus fragmentos.
Como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "fragmento de SYNAGIS®", "fragmento que se une a antígenos" y expresiones similares utilizadas en el contexto de SYNAGIS® se refiere a un fragmento de SYNAGIS® que se une inmunoespecíficamente a un antígeno del RSV. Los fragmentos de SYNAGIS® pueden generarse por cualquier método conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 pueden producirse por escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la cadena ligera completa y la región variable, la región de CH1 y la región bisagra de la cadena pesada. Preferiblemente, el fragmento se une también a un antígeno del RSV, más preferiblemente al mismo epítopo que el SYNAGIS®.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de una terapia (por ejemplo, un agente profiláctico o terapéutico), que es suficiente para reducir la gravedad y/o duración de una infección por el RSV, mejorar uno o más de sus síntomas, evitar el avance de una infección por el RSV o provocar la regresión de una infección por el RSV o que es suficiente para dar como resultado la prevención del desarrollo, recurrencia, inicio o progresión de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas, o mejorar o aumentar el (los) efecto(s) profiláctico(s) y/o terapéutico(s) de otra terapia (por ejemplo, otro agente terapéutico). En una realización específica, una cantidad eficaz de un agente terapéutico o profiláctico reduce una o más de las siguientes etapas de un ciclo de vida del RSV: el acoplamiento de la partícula del virus a una célula, la introducción de la información genética viral en una célula, la expresión de las proteínas virales, la producción de nuevas partículas del virus y la liberación de partículas del virus de una célula en al menos 5%, preferiblemente al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 100%. En otra realización específica, una cantidad eficaz de un agente terapéutico o profiláctico reduce la replicación, multiplicación
o propagación de un virus en al menos 5%, preferiblemente al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 100%.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "epítopo" se refiere a una porción de un polipéptido o proteína del RSV que tiene actividad antigénica o inmunógena en un animal, preferiblemente un mamífero y más preferiblemente en un ser humano. Un epítopo que tiene actividad inmunógena es una porción de un polipéptido
o proteína que provoca una respuesta de anticuerpos en un animal. Un epítopo que tiene actividad antigénica es una porción de un polipéptido o proteína del RSV al que se une inmunoespecíficamente un anticuerpo determinado por un método bien conocido en la técnica, por ejemplo, por los inmunoensayos descritos en esta memoria. Los epítopos antigénicos no necesitan ser necesariamente inmunógenos. Específicamente, el epítopo de SYNAGIS® es el sitio antigénico A de la proteína F del RSV.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "excipientes" se refiere a sustancias inertes que se utilizan generalmente como un diluyente, vehículo, conservantes, aglutinantes o agente estabilizante para fármacos e incluye, aunque sin limitación, proteínas (por ejemplo, seroalbúmina, etc.), aminoácidos (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, glicina, histidina, etc.), ácidos grasos y fosfolípidos (por ejemplo, alquilsulfonatos, caprilato, etc.), tensioactivos (por ejemplo, SDS, polisorbato, tensioactivos no iónicos, etc.), sacáridos (por ejemplo, sacarosa, maltosa, trehalosa, etc.) y polioles (por ejemplo, manitol, sorbitol, etc.). Véase también Remington's Pharmaceutical Sciences (de Joseph P. Remington, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA). Preferiblemente, los excipientes le confieren una propiedad física beneficiosa a la formulación, tal como un aumento de la estabilidad de la proteína, un aumento de la solubilidad de la proteína y una disminución de la viscosidad.
La expresión "fragmento" como se utiliza en la presente memoria se refiere a un péptido, polipéptido o proteína (incluyendo un anticuerpo) que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 60 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 70 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 80 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 90 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 125 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 150 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 175 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 200 residuos de aminoácidos contiguos o al menos 250 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido o proteína. En una realización específica, un fragmento de una proteína o polipéptido retiene al menos una función de la proteína o polipéptido. En otra realización, un fragmento de una proteína o polipéptido retiene al menos dos, tres o cuatro funciones de la proteína o polipéptido. Preferiblemente un fragmento de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un antígeno del RSV retiene la capacidad de unión a un antígeno de RSV.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "proteína de fusión" se refiere a un polipéptido o proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de una primera proteína, polipéptido o fragmento, análogo o uno de sus derivados y una secuencia de aminoácidos de una proteína o polipéptido heterólogo (es decir, una segunda proteína, polipéptido o fragmento, análogo o uno de sus derivados diferente de la primera proteína o fragmento funcional, análogo o uno de sus derivados). En una realización, una proteína de fusión comprende un agente profiláctico o terapéutico fusionado a una proteína, polipéptido o péptido heterólogo. De acuerdo con esta realización, la proteína, polipéptido o péptido heterólogo puede ser o no un tipo diferente de agente profiláctico o terapéutico.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "bebé humano" se refiere a un ser humano menor de 24 meses, preferiblemente menor de 16 meses, menor de 12 meses, menor de 6 meses, menor de 3 meses, menor de 2 meses o menor de 1 mes.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "bebé humano nacido prematuramente" se refiere a un ser humano nacido antes de 40 semanas de gestación, preferiblemente antes de 35 semanas de gestación, que tiene menos de 6 meses, preferiblemente menos de 3 meses, más preferiblemente menos de 2 meses y más preferiblemente menos de 1 mes.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "concentración alta" se refiere a una concentración de 50 mg/ml o superior, preferiblemente 95 mg/ml o superior de un anticuerpo o uno de sus fragmentos que se une inmunoespecíficamente a un antígeno del RSV, en una formulación de anticuerpos.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "célula hospedante" incluye una célula transfectada o transformada con una molécula de ácido nucleico y la progenie o progenie potencial de dicha célula. La progenie de dicha célula puede no ser idéntica a la célula madre transfectada con la molécula de ácido nucleico debido a las mutaciones o influencias ambientales que pueden tener lugar en las generaciones sucesivas o a la integración de la molécula del ácido nucleico en el genoma de la célula hospedante.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "que se une inmunoespecíficamente a un antígeno del RSV" y expresiones análogas se refiere a anticuerpos
o sus fragmentos que se unen específicamente a uno de sus antígenos del RSV y no se unen específicamente a otros polipéptidos. Los anticuerpos o fragmentos que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno del RSV pueden tener reacción cruzada con antígenos relacionados. Preferiblemente, los anticuerpos o fragmentos que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno del RSV no reaccionan de forma cruzada con otros antígenos. Los anticuerpos o fragmentos que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno de RSV pueden identificarse, por ejemplo, por inmunoensayos, BlAcore, calorimetría isotérmica de titulación u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. Un anticuerpo, o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, se une específicamente a un antígeno del RSV cuando se une con mayor afinidad que a cualquier antígeno de reacción cruzada como se determina utilizando técnicas experimentales, tales como radioinmunoensayos (RIA) y ensayos inmunoenzimáticos (ELISA). Véase, por ejemplo, Paul, ed., 1989, Fundamental lmmunology, Second Edition, Raven Press, New York, páginas 332-336 para un estudio sobre la especificidad de los anticuerpos.
La expresión "en combinación" como se utiliza en la presente memoria se refiere al uso de más de una terapia (por ejemplo, agentes profilácticos y/o terapéuticos). El uso de la expresión "en combinación" no está restringido al orden en el que se administran las terapias (por ejemplo, agentes profilácticos y/o terapéuticos) a un sujeto con una infección por el RSV. Una primera terapia (por ejemplo, un agente profiláctico
o terapéutico) puede administrarse antes de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas,
72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), simultáneamente o posteriormente (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas después) de la administración de una segunda terapia (por ejemplo, un agente profiláctico o terapéutico) a un sujeto con una infección por el RSV.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "sal inorgánica" se refiere a cualquier compuesto, que no contenga carbono, que resulte de la sustitución de parte o todo el hidrógeno ácido de un ácido por un metal o un grupo que actúe como un metal y se usa con frecuencia como un compuesto para ajustar la tonicidad en composiciones y preparaciones farmacéuticas de materiales biológicos. Las sales in-orgánicas más frecuentes son NaCl, KCI, NaH2PO4, etc.
Un anticuerpo "aislado" o "purificado" está sustancialmente exento de material celular u otras proteínas contaminantes procedentes de fuentes celulares o tisulares de las que se deriva la proteína, o sustancialmente exento de precursores químicos u otros compuestos químicos cuando se sintetizan químicamente. La expresión "sustancialmente exenta de material celular" incluye preparaciones de un anticuerpo en las que el polipéptido/proteína está separado de los componentes celulares de las células a partir de las que se aísla o se produce por recombinación. Por tanto, un anticuerpo que está sustancialmente exento de material celular incluye preparaciones del anticuerpo que tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5%, 2,5% o 1%, (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando el anticuerpo se produce por recombinación, también está con preferencia sustancialmente exento de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, 10% o 5% del volumen de la preparación proteínica. Cuando el anticuerpo se produce por síntesis química, está de preferencia sustancialmente exento de precursores químicos u otros compuestos químicos, es decir, está separado de los precursores químicos u otros compuestos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. Por consiguiente, dichas preparaciones del anticuerpo tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de precursores o compuestos químicos distintos del anticuerpo de interés. En una realización preferida de la presente invención, los anticuerpos están aislados y purificados.
Como se utiliza en la presente memoria, la frase "niveles de agregación bajos
o no detectables" se refiere a muestras que contienen no más del 5%, no más del 4%, no más del 3%, no más del 2%, no más del 1% y más preferiblemente no más del 0,5%, de agregación en peso de proteína medida por cromatografía de exclusión por tamaño molecular de alta resolución (HPSEC).
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "niveles de fragmentación bajos o no detectables" se refiere a muestras que contienen igual o más del 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%, de la proteína total, por ejemplo, en un único pico determinado por cromatografía de exclusión por tamaño molecular de alta resolución (HPSEC) o en dos (2) picos (cadenas pesada y ligera) por electroforesis en gel capilar reductora (abreviadamente en lo sucesivo rCGE por la expresión inglesa reducing capillary gel electrophoresis), que representa el SYNAGIS® no degradado o uno de sus fragmentos no degradados que se une inmunoespecíficamente a un antígeno del RSV y que no contiene otros picos únicos que tengan cada uno más del 5%, más del 4%, más del 3%, más del 2%, más del 1% o más del 0,5% de la proteína total. La expresión "electroforesis capilar en gel reductora (CGE)" como se utiliza en la presente memoria se refiere a electroforesis en gel capilar en condiciones reductoras suficientes para reducir las uniones por puentes disulfuro en SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos.
Como se utiliza en la presente memoria, los términos "gestionar" y "gestión" se refieren a los efectos beneficiosos que obtiene un sujeto de una terapia (por ejemplo, SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos), que no da como resultado la curación de una infección por el RSV. En ciertas realizaciones, se administra a un sujeto una o más terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) para "gestionar" una infección por el RSV o uno de sus síntomas para prevenir la progresión o empeoramiento de la infección.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "modificada" en el contexto de formas modificadas de SYNAGIS® o de uno de sus fragmentos que se une a antígenos, se refiere a SYNAGIS® o a uno de sus fragmentos que se une a antígenos, que ha sido alterado por cualquier método conocido en la técnica para aumentar su semivida (véase, por ejemplo, el apartado 5.1.1., más adelante p). SYNAGIS® y sus fragmentos que se unen a antígenos, con semividas mejoradas in vivo y métodos para prepararlos están descritos en la publicación de la solicitud de patente internacional Nº. WO 02/060919, presentada el 12 de diciembre de 2001, titulada "Molecules with Extended Half-Lives, Compositions and Uses" y por L. Johnson et al. La expresión "modificado" en el contexto de SYNAGIS® o de uno de sus fragmentos que se une a antígenos, se refiere también a SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, modificado por acoplamiento covalente de cualquier tipo de molécula a SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos. Por ejemplo, aunque sin limitación, SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, puede ser modificado, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que está aprobado por una agencia reguladora de un gobierno federal o estatal o recogido en las listas de la Farmacopea de EE.UU., la Farmacopea Europea u otras farmacopeas generalmente reconocidas para uso en animales y más particularmente en seres humanos.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "poliol" se refiere a un azúcar que contiene muchos grupos –OH en comparación con un sacárido normal.
Como se utiliza en la presente memoria, los términos "prevenir" y "prevención" se refiere a la prevención o reducción de la recurrencia, comienzo, desarrollo o progresión de una infección por el RSV o la prevención o reducción de la gravedad y/o duración de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas.
Como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "agente profiláctico" y "agentes profilácticos" se refieren a cualquier agente(s) que pueda(n) ser utilizado(s) en la prevención de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. En ciertas realizaciones, la expresión "agente profiláctico" se refiere a SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos. De acuerdo con estas realizaciones, el anticuerpo
o fragmento de anticuerpo puede ser un componente de una formulación líquida de la invención. En otras realizaciones, la expresión "agente profiláctico" no se refiere a SYNAGIS® ni a ninguno de sus fragmentos que se une a antígenos. Incluso en otras realizaciones, la expresión "agente profiláctico" no se refiere a anticuerpos ni a sus fragmentos distintos de SYNAGIS® que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno del RSV. Preferiblemente, un agente profiláctico es un agente que se sabe que es útil,
o ha sido o está siendo utilizado actualmente para prevenir o impedir el comienzo, desarrollo, progresión y/o gravedad de una infección por el RSV o uno de sus síntomas.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a la cantidad de una formulación líquida de la invención suficiente para la prevención del desarrollo, recurrencia, comienzo o progresión de una infección por el RSV. En una realización específica, una cantidad profilácticamente eficaz de un agente profiláctico reduce una o más de las siguientes etapas de un ciclo vital del RSV: el acoplamiento de la partícula de virus a una célula, la introducción de la información genética viral en una célula, la expresión de proteínas virales, la producción de nuevas partículas de virus y la liberación de partículas de virus procedentes de una célula en al menos 5%, preferiblemente al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 100%. En otra realización específica, una cantidad profilácticamente eficaz de un agente profiláctico reduce la replicación, multiplicación o propagación de un virus en al menos 5%, preferiblemente al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 100%.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "antígeno del RSV" se refiere a una proteína, polipéptido o péptido del RSV al que se une inmunoespecíficamente un anticuerpo.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "sacárido" se refiere a una clase de moléculas que son alcoholes polivalentes. Los sacáridos se refieren generalmente a hidratos de carbono y pueden contener cantidades diferentes de unidades de azúcares (sacárido), por ejemplo, monosacáridos, disacáridos y polisacáridos.
La expresión "molécula pequeña" y expresiones análogas incluyen, aunque sin limitación, péptidos, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácidos, polinucleótidos, análogos de polinucleótidos, nucleótidos, análogos de nucleótidos, compuestos orgánicos o inorgánicos (es decir, incluyendo compuestos heteroorgánicos y/o organometálicos) que tengan un peso molecular inferior a aproximadamente 10.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tengan un peso molecular inferior a aproximadamente 5.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tengan un peso molecular inferior a aproximadamente 1.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tengan un peso molecular inferior a aproximadamente 500 gramos por mol y sales, ésteres y otras formas farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos.
Como se utiliza en la presente memoria, los términos "estabilidad" y "estable" en el contexto de una formulación líquida que comprende SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, se refiere a la resistencia del SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, en la formulación al desplegamiento, agregación, degradación o fragmentación térmico y químico en condiciones dadas de fabricación, preparación, transporte y conservación. Las formulaciones "estables" de la invención retienen una actividad biológica igual o mayor al 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 99,5% en condiciones dadas de fabricación, preparación, transporte y conservación. La estabilidad de SYNAGIS®, o de uno de sus fragmentos que se une a antígenos, puede ser valorada por grados de agregación, degradación o fragmentación por métodos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo aunque sin limitación, electroforesis en gel capilar reductora (rCGE), electroforesis sobre dodecil-sulfato de sodio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y HPSEC, en comparación con una referencia, es decir, SYNAGIS® liofilizado comercialmente disponibles reconstituido hasta 100 mg/ml en tampón de histidina 47 mM/glicina 3 mM con manitol al 5,6% a pH 6,0. La referencia proporciona regularmente un único pico (área � 97%) por HPSEC. La estabilidad global de una formulación líquida que comprende SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de RSV puede ser valorada por diversos ensayos inmunológicos incluyendo, por ejemplo, ELISA y radioinmunoensayo utilizando el epítopo específico de RSV.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "referencia patrón de SYNAGIS®" o expresiones análogas se refieren a SYNAGIS® liofilizado comercialmente disponible, como se ha descrito en Physicians' Desk Reference, 56th edition, 2002. El SYNAGIS® reconstituido puede contener, por ejemplo, los siguientes excipientes: histidina 47 mM, glicina 3,0 mM y manitol al 5,6% y el principio activo, el anticuerpo, a una concentración de 100 miligramos por ml de solución.
Los términos "sujeto" y "paciente" se utilizan en la presente memoria de modo intercambiable. Como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "sujeto" y "sujetos" se refieren a un animal, preferiblemente un mamífero incluyendo un no primate (por ejemplo, una vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata y ratón) y un primate (por ejemplo, un chimpancé, un mono tal como un mono cinomolgo y un ser humano) y más preferiblemente un ser humano.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "sustancialmente exento de tensioactivo" se refiere a una formulación de SYNAGIS® o de uno de sus fragmentos que se une a antígenos, conteniendo dicha formulación menos del 0,0005%, menos del 0,0003% o menos del 0,0001% de tensioactivos y/o menos del 0,0005%, menos del 0,0003% o menos del 0,0001% de tensioactivo.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "sustancialmente exento de sales inorgánicas" se refiere a una formulación de SYNAGIS®, o de uno de sus fragmentos que se une a antígenos, conteniendo dicha formulación menos del 0,0005%, menos del 0,0003% o menos del 0,0001% de sales inorgánicas. Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "tensioactivo" se refiere a sustancias orgánicas que tienen estructuras anfipáticas; es decir, son compuestos con grupos de tendencias de solubilidad opuestas, típicamente una cadena hidrocarbonada soluble en aceite y un grupo iónico soluble en agua. Los tensioactivos pueden clasificarse, dependiendo de la carga del resto tensioactivo en aniónicos, catiónicos y no iónicos. Los tensioactivos se utilizan con frecuencia como agentes humectantes, emulsionantes, solubilizantes y dispersantes para diversas composiciones y preparaciones farmacéuticas de materiales biológicos.
Como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "agente terapéutico" y "agentes terapéuticos" se refieren a cualquier agente(s) que pueda utilizarse en el tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. En ciertas realizaciones, la expresión "agente terapéutico" se refiere a SYNAGIS® o a uno de sus fragmentos que se une a antígenos. De acuerdo con estas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser un componente de una formulación líquida de la invención. En ciertas realizaciones, la expresión "agente terapéutico" no se refiere a SYNAGIS® ni a ninguno de sus fragmentos que se une a antígenos. Incluso en otras realizaciones, la expresión "agente terapéutico" no se refiere a anticuerpos ni a sus fragmentos distintos de SYNAGIS® que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno del RSV. Preferiblemente, un agente terapéutico es un agente que se sabe que es útil, o ha sido o está siendo utilizado para el tratamiento, control o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "cantidad terapéutica-mente eficaz" se refiere a la cantidad de una formulación líquida de la invención que reduce o mejora la progresión, gravedad y/o duración de una infección por el RSV y/o mejora uno o más síntomas asociados a una infección por el RSV. Con relación al tratamiento de una infección por el RSV , una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de un agente terapéutico suficiente para reducir o inhibir la replicación de un virus, inhibir o reducir la infección de células por el virus, inhibir o reducir la producción de las partículas virales, inhibir o reducir la liberación de partículas vira-les, inhibir o reducir la propagación del virus a otros tejidos o sujetos o mejorar uno o más síntomas asociados a la infección. En una realización específica, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico reduce una o más de las siguientes etapas de un ciclo de vida del RSV: el acoplamiento de la partícula de virus a una célula, la introducción de la información genética viral en una célula, la expresión de proteínas virales, la producción de nuevas partículas de virus y la liberación de partículas de virus procedentes de una célula en al menos 5%, preferiblemente al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 100%. En otra realización específica, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico reduce la replicación, multiplicación o propagación de un virus en al menos 5%, preferiblemente al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 100%.
Como se utiliza en la presente memoria, los términos "terapias" y "terapia" pueden referirse a cualquier protocolo(s), método(s) y/o agente(s) que pueden utilizarse en la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. En ciertas realizaciones, los términos "terapia" y/o "terapias" se refieren a una terapia biológica y/o a otras terapias útiles para el tratamiento de una infección por el RSV conocidas por el personal médico experto.
Como se utiliza en la presente memoria, los términos "tratar" y "tratamiento" se refieren a la reducción o mejora de la progresión, gravedad y/o duración de una infección por el RSV y/o reduce o mejora uno o más síntomas de una infección por el RSV. En realizaciones específicas, dichos términos se refieren a la reducción o inhibición de la replicación de un virus respiratorio sincitial (RSV), la inhibición o reducción de la propagación de un virus respiratorio sincitial (RSV) a otros tejidos o sujetos, la inhibición o reducción de una infección de una célula con un virus respiratorio sincitial (RSV) o la mejora de uno o más síntomas asociados a una infección por un virus respiratorio sincitial (RSV).
Como se utiliza en la presente memoria, un "protocolo" incluye programas de dosificación y regímenes de dosificación. Los protocolos de la presente invención son métodos de uso e incluyen protocolos profilácticos y terapéuticos.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "modulador de los receptores de linfocitos T" se refiere a un agente que modula la fosforilación de un receptor de los linfocitos T, la activación de una vía de transducción de señales asociada al receptor de los linfocitos T y/o a la expresión de una proteína particular, tal como una citoquina. Dicho agente puede modular directa o indirectamente la fosforilación de un receptor de los linfocitos T, la activación de una vía de transducción de señales asociado a un receptor de los linfocitos T y/o la expresión de una proteína particular, tal como una citoquina. Ejemplos de moduladores de receptores de los linfocitos T incluyen, aunque sin limitación, péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión y anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de los linfocitos T o a uno de sus fragmentos. Además, ejemplos de moduladores de los receptores de los linfocitos T incluyen, aunque sin limitación, proteínas, péptidos, polipéptidos (por ejemplo, receptores de los linfocitos T solubles), proteínas de fusión y anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un ligando para un receptor de los linfocitos T o uno de sus fragmentos.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "muy poca o ninguna pérdida de las actividades biológicas" se refiere a las actividades de anticuerpos, incluyendo las capacidades de unión específicas de SYNAGIS® o un fragmento que se une a antígenos medidas por diversos ensayos inmunológicos, incluyendo aunque sin limitación, ELISA y radioinmunoensayos. En una realización, SYNAGIS® o un fragmento que se une a antígenos, de las formulaciones líquidas de la invención retiene aproximadamente el 50%, preferiblemente el 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de la capacidad de unirse inmunoespecíficamente a un antígeno del RSV en comparación con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de referencia medido por un ensayo inmunológico conocido por un experto en la técnica o descrito en la presente memoria. Por ejemplo, puede usarse un ensayo basado en ELISA para comparar la capacidad de una formulación líquida de SYNAGIS®, o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, para unirse inmunoespecíficamente a un antígeno de RSV con un patrón de referencia de SYNAGIS®. En este ensayo, se revisten placas con un antígeno de RSV y la señal de unión de una concentración establecida de un patrón de referencia de SYNAGIS® se compara con la señal de unión de la misma concentración de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de ensayo.
4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Fig. 1 es un diagrama esquemático que muestra las líneas generales de preparación de SYNAGIS® purificado.
La Fig. 2 presenta el organigrama de un estudio clínico para comparar la formulación líquida de SYNAGIS® con la formulación liofilizada de SYNAGIS®.
5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Las formulaciones líquidas de la presente invención proporcionan una preparación lista para uso de SYNAGIS® o de uno de sus fragmentos que se une a antígenos, para administrar a un sujeto sin tener que reconstituir la preparación exacta y asépticamente ni esperar un periodo de tiempo hasta que la solución se clarifique antes de administrar la formulación al sujeto. Para el profesional sanitario se simplifica el proceso de administración de la formulación a un sujeto. Además, debido a su alta estabilidad durante la conservación, las formulaciones de la presente invención pueden contener SYNAGIS®, o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, a concentraciones en el intervalo de aproximadamente 65 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml sin provocar ningún efecto adverso sobre la(s) actividad(es) biológica(s) de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, debido a la agregación y/o fragmentación de las proteínas durante una conservación prolongada. Dicha estabilidad no sólo asegura la eficacia de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, sino que también reduce posibles riesgos de provocar efectos adversos en un sujeto. Además, se simplifica el proceso de fabricación de las formulaciones líquidas de la presente invención y lo hace más eficazmente que el proceso de fabricación de la versión liofilizada debido a que todas las etapas de la fabricación de las formulaciones líquidas se realizan en una solución acuosa, no implicando un proceso de secado, tal como liofilización. Por consiguiente, también es más económico.
5.1 Formulaciones líquidas de SYNAGIS®
Las formulaciones líquidas de la presente invención proporciona formulaciones de anticuerpos que están sustancialmente exentas de tensioactivos, sales inorgánicas y/u otros excipientes e incluso presentan alta estabilidad durante largos periodos de conservación. En una realización específica, dichas formulaciones de anticuerpos son homogéneas. Las formulaciones de la presente invención comprenden histidina a concentraciones entre 1 y 100 mM y SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, a concentraciones de aproximadamente 65 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml. En una realización, las formulaciones de la invención no comprenden otros ingredientes excepto agua o disolventes adecuados. En otra realización específica, se utiliza en las formulaciones líquidas de la invención una forma modificada de anticuerpo SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, que tienen una semi-vida y/o afinidad mejoradas.
La concentración de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, que está incluido en las formulaciones líquidas de la invención, es al menos 65 mg/ml, al menos 70 mg/ml, al menos 75 mg/ml, al menos 80 mg/ml, al menos 85 mg/ml, al menos 90 mg/ml, al menos 95 mg/ml, al menos 100 mg/ml, al menos 105 mg/ml, al menos 110 mg/ml, al menos 115 mg/ml, al menos 120 mg/ml, al menos 125 mg/ml, al menos 130 mg/ml, al menos 135 mg/ml, al menos 140 mg/ml, al menos 150 mg/ml, al menos 200 mg/ml, al menos 250 mg/ml o al menos 300 mg/ml.
La concentración de histidina que está incluida en las formulaciones líquidas de la invención varía desde aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, aproximadamente 20 mM a aproximadamente 30 mM o aproximadamente 23 mM a aproximadamente 27 mM y del modo más preferible aproximadamente 25 mM. La histidina puede estar en forma de L-histidina, D-histidina, o una de sus mezclas, pero la más preferible es L-histidina. La histidina puede estar también en forma de hidratos. La histidina puede utilizarse en una forma de sal farmacéuticamente aceptable, tal como hidrocloruro (por ejemplo, monohidrocloruro y dihidrocloruro), hidrobromuro, sulfato, acetato, etc. La pureza de la histidina debe ser al menos 98%, preferiblemente al menos 99% y más preferiblemente al menos 99,5%.
El pH de la formulación debe ser igual al punto isoeléctrico del anticuerpo particular utilizado en la formulación (por ejemplo, el punto isoeléctrico de SYNAGIS® varía de 8,65 a 9,43) y puede variar desde aproximadamente 5,0 hasta aproximadamente 7, de modo preferible aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5, de modo más preferible aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,2 y del modo más preferible aproximadamente 6,0.
Además de la histidina y el SYNAGIS®, o de uno de sus fragmentos que se une a antígenos, las formulaciones de la presente invención pueden comprender glicina a una concentración inferior a 150 mM, inferior a 100 mM, inferior a 50 mM, inferior a 3,0 mM, inferior a 2,0 mM o inferior a 1,8 mM y más preferiblemente 1,6 mM. La cantidad de glicina en la formulación no debe provocar un efecto de tamponamiento significativo de modo que pueda evitarse la precipitación del anticuerpo en su punto isoeléctrico. La glicina puede utilizarse también en forma de una sal farmacéuticamente aceptable, tal como hidrocloruro, hidrobromuro, sulfato, acetato, etc. La pureza de glicina debe ser al menos 98%, preferiblemente al menos 99% y los más preferiblemente 99,5%. En una realización específica, la glicina no está incluida en las formulaciones líquidas de la presente invención.
Opcionalmente, las formulaciones de la presente invención pueden comprender además otros excipientes, tales como sacáridos (por ejemplo, sacarosa, manosa, trehalosa, etc.) y polioles (por ejemplo, manitol, sorbitol, etc.). En una realización, el otro excipiente es un sacárido. En una realización específica, el sacárido es sacarosa, que está en un intervalo de concentración entre aproximadamente 1% y aproximadamente 20%, de modo preferible aproximadamente 5% y aproximadamente 15%, y del modo más preferible aproximadamente 8% y 10%. En otra realización, el otro excipiente es un poliol. Preferiblemente, sin embargo, las formulaciones líquidas de la presente invención no contienen manitol. En una realización específica, el poliol es polisorbato (por ejemplo, Tween 20), que está a un intervalo de concentración entre aproximadamente 0,001% y aproximadamente 1%, de modo preferible aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,1%.
Las formulaciones líquidas de la presente invención presentan estabilidad a intervalos de temperatura de 38ºC-42ºC durante al menos 60 días y, en algunas realizaciones, no más de 120 días, de 20ºC-24ºC durante al menos 1 año, de 2ºC-8ºC (en particular, a 4ºC) durante al menos 3 años, al menos 4 años o al menos 5 años y a 20ºC durante al menos 3 años, al menos 4 años o al menos 5 años, determinada por cromatografía de exclusión por tamaño molecular de alta resolución (HPSEC). Es decir, las formulaciones líquidas de la presente invención tienen niveles bajos o no detectables de agregación y/o fragmentación, como se definen en la presente memoria, después de conservación durante los periodos definidos antes indicados. Preferiblemente, no más del 5%, no más del 4%, no más del 3%, no más del 2%, no más del 1 % y más preferiblemente no más del 0,5%, del SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, forma un agregado medido por HPSEC, después de la conservación durante los periodos definidos antes indicados. Además, las formulaciones líquidas de la presente invención no presentan casi pérdida de actividad(es) biológica(s) del SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, durante la conservación prolongada en las condiciones antes descritas, valorada por ensayos inmunológicos incluyendo, por ejemplo, ensayo inmunoenzimático (ELISA) y radioinmunoensayo para medir la capacidad de unión al antígeno del RSV de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, o, por ejemplo, por un ensayo de C3a/C4a para medir la capacidad de activación de los complementos del SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos. Las formulaciones líquidas de la presente invención retienen después de la conservación durante los periodos antes definidos más del 80%, más del 85%, más del 90%, más del 95%, más del 98%, más del 99% o más del 99,5% de la(s) actividad(es) biológica(s) inicial(es) antes de la conservación.
Las formulaciones líquidas de la presente invención pueden prepararse como formas de dosificación unitarias. Por ejemplo, una dosificación unitaria por vial puede contener 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml o 20 ml de concentraciones diferentes del SYNAGIS® o de uno de sus fragmentos que se une a antígenos, variando desde una concentración de aproximadamente 15 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, que se une inmunoespecíficamente a un RSV. Si es necesario, estas preparaciones pueden ajustarse hasta una concentración deseada añadiendo a cada vial
5 un diluyente estéril.
5.1.1 SYNAGIS®
La invención se refiere a formulaciones líquidas que comprenden SYNAGIS®
o de uno de sus fragmentos que se une a antígenos. En una realización preferida, la invención proporciona formulaciones líquidas de SYNAGIS®, un anticuerpo monoclonal
10 humanizado que neutraliza un amplio intervalo de aislados de RSV. La secuencia de aminoácidos de SYNAGIS® está descrita, por ejemplo, en Johnson et al., 1997, J. lnfectious Disease 176:1215-1224, y en la Patente de EE.UU. Nº 5.824.307, y sus regiones VHCDR y VLCDR se muestran en la Tabla 1, siguiente.
Tabla 1. Secuencias de la CDR de SYNAGIS®
CDR
Secuencia SEQ ID NO:
VH1
TSGMSVG 1
VH2
DIW WDDKKDYNPSLKS 2
VH3
SMTTNWYFDV 3
VL1
KCQLSVGYMH 4
VL2
DTSKLAS 5
VL3
FQGSGYPFT 6
15 Además, la presente invención abarca también formulaciones líquidas estables de formas modificadas de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, que tienen semivida mejoradas. En particular, la presente invención abarca una forma modificada de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, que
20 tiene una semivida en un sujeto, preferiblemente un ser humano, mayor de 3 días, mayor de 7 días, mayor de 10 días, preferiblemente mayor de 15 días, mayor de 25 días, mayor de 30 días, mayor de 35 días, mayor de 40 días, mayor de 45 días, mayor de 2 meses, mayor de 3 meses, mayor de 4 meses o mayor de 5 meses. Prolongando las semividas de SYNAGIS® y de sus fragmentos que se unen a antígenos, es posible
25 reducir la cantidad y/o frecuencia de dosificación del anticuerpo o fragmento que se une al antígeno. Para prolongar la circulación en suero in vivo de un anticuerpo, pueden utilizarse varias técnicas. Por ejemplo, moléculas polímeras inertes, tal como polietilengli
col (PEG) de alto peso molecular, pueden unirse a un anticuerpo con o sin enlazador multifuncional por medio de una conjugación específica del sitio del PEG al extremo N
o C del anticuerpo o por medio de los grupos épsilon-amino presentes en los residuos de lisina. Puede utilizarse una derivatización de polímeros lineales o ramificados que da como resultado una pérdida mínima de actividad biológica. El grado de conjugación puede controlarse adecuadamente por SDS-PAGE y espectrometría de masas para asegurar una conjugación apropiada de moléculas de PEG a los anticuerpos. El PEG que no ha reaccionado puede separarse de los conjugados de anticuerpo-PEG por cromatografía de exclusión por tamaño molecular o por cromatografía de intercambio iónico. En los anticuerpos derivatizados con PEG puede analizarse la actividad de unión, así como la eficacia in vivo utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, por los inmunoensayos descritos en la presente memoria.
También puede generarse un anticuerpo que tienen una mayor semivida in vivo introduciendo una o más modificaciones en los aminoácidos (es decir, sustituciones, inserciones o deleciones) en un dominio constante de IgG o sus fragmentos que se unen a FcRn (preferiblemente un fragmento del dominio Fc o Fc bisagra). Véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional Nº WO 98/23289; la solicitud de patente internacional Nº WO 97/34631; y la Patente de EE.UU Nº. 6.277.375. El SYNAGIS® y sus fragmentos que se une a antígenos con semividas in vivo mejoradas y los métodos para prepararlos están descritos en la solicitud de patente internacional WO 02/060919, presentada el 12 de diciembre de 2001, titulada "Molecules with Extended Half-Lives, Compositions and Uses" y por L. Johnson et al.
Además, un anticuerpo puede conjugarse a albúmina con el fin de hacer más estable in vivo el anticuerpo o uno de sus fragmentos que se une a antígenos o que tenga una semivida in vivo más larga. Las técnicas son muy conocidas, véase por ejemplo, las solicitudes de patentes internacionales Nº WO 93/15199, WO 93/15200 y WO 01/77137; y la Patente Europea Nº. EP 413.622.
La invención comprende además formulaciones líquidas de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, que han sido modificadas, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes, escisión proteolítica, unión a un ligando celular o a otra proteína, etc., y retienen la actividad de unión a antígenos del RSV.
5.1.2 Conjugados de anticuerpos.
La presente invención abarca el uso de formulaciones líquida de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos (incluyendo las formas modificadas que tiene aumentadas las semividas in vivo) que se conjuga con uno o más restos, incluyendo pero sin limitación, péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión, moléculas de ácidos nucleicos, moléculas pequeñas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas y moléculas orgánicas.
La presente invención abarca el uso de formulaciones líquidas de SYNAGIS® fusionado recombinantemente o conjugado químicamente (incluyendo tanto conjugaciones covalentes como no covalentes) a una proteína o polipéptido heterólogo (o un fragmento que se une a antígenos, preferiblemente a un polipéptido de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión. La fusión no necesita necesariamente ser directa, sino que puede ocurrir a través de secuencias enlazadoras. Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo para dirigir un polipéptido heterólogo a un tipo de célula particular, bien sea in vitro o in vivo, fusionando o conjugando el anticuerpo a otro anticuerpo específico para receptores particulares de la superficie celular. También se puede usar un anticuerpo fusionado o conjugado a un polipéptido heterólogo en inmunoensayos in vitro y en métodos de purificación que son conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente internacional Nº WO 93/21232; la patente europea Nº EP 439095; Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99; la patente de EE.UU. Nº 5.474.981; Gillies et al., 1992, PNAS 89:1428-1432; y Fell et al., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452.
La presente invención incluye además composiciones que comprenden una proteína, péptido o polipéptido heterólogo fusionado o conjugado a un fragmento que se une a antígenos de SYNAGIS®. Por ejemplo, un polipéptido heterólogo puede ser fusionado o conjugado a un fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv o fragmento F(ab)2. Se conocen en la técnica métodos para fusionar o conjugar u polipéptido a una porción de anticuerpo. Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851 y 5.112.946; las patentes europeas EP 307434 y EP 367166; las publicaciones de solicitudes de patentes internacionales Nº. WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. lmmunol. 154:5590-5600; y Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341.
Se pueden generar proteínas de fusión adicionales mediante técnicas de barajamiento de genes, barajamiento de restos, barajamiento de exones, y/o barajamiento de codones (denominados colectivamente "barajamiento de DNA"). El barajamiento de DNA se puede emplear para alterar las actividades de SYNAGIS® o sus fragmentos (por ejemplo, un anticuerpo o uno de sus fragmentos que se une a antígenos con afinidades superiores y velocidades de disociación inferiores). Véanse, generalmente las patentes de EE.UU. Nº 5.605,793; 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252; y 5.837.458, y Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33 ; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; y Lorenzo y Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313. El SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, o el ácido nucleico que codifica SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, se puede alterar sometiéndolo a mutagénesis al azar por PCR de prueba y error, inserción de nucleótidos al azar u otros métodos previos a la recombinación. El SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos puede ser recombinado con uno más componentes, restos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.
Además, el SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos se puede fusionar a una secuencia marcadora, tal como un péptido para facilitar la purificación. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un de péptido hexa-histidina, tal como una cola provista en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en el trabajo Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras colas de péptidos útiles para la purificación incluyen, pero sin limitación, la cola de "HA" hemaglutinina, que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina del virus de la gripe (Wilson et al., 1984, Cell 37:767) y la cola "flag".
La presente invención también abarca las formulaciones líquidas de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos conjugado a un agente de diagnóstico o detectable o cualquier otra molécula para la cual se desea aumentar la semivida en suero. Dicho anticuerpo puede ser útil para monitorizar o pronosticar el desarrollo o progresión de una infección por el RSV como parte de un método de ensayo clínico, tal como determinar la eficacia de una terapia particular. Dicho diagnóstico y detección se pueden conseguir acoplando SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos a una sustancia detectable, incluyendo, pero sin limitación, diversas enzimas, tales como, pero sin limitación, peroxidasa de rábano silvestre, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, tales como, pero sin limitación, estreptavidinil-biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero sin limitación, , umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminescentes, tales como, pero sin limitación, luminol; materiales bioluminescentes, tales como, pero sin limitación, Iuciferasa, luciferina, y aequorina; materiales radioactivos, pero sin limitación, yodo (131I, 125I, 123I, 121I,), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In, 111In), y tecnecio (99Tc), talio (99Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo) xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr,105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn,, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117Sn; metales emisores de positrones que usan varios varias tomografías de emisión de positrones, iones metálicos paramagnéticos no radioactivos y moléculas que están radiomarcadas o conjugadas a radioisótopos específicos. La sustancia detectable puede ser acoplada o conjugada directamente a SYNAGIS® o a uno de sus fragmentos que se une a antígenos o indirectamente a través de un compuesto intermedio (tal como, por ejemplo, un enlazador conocido en la técnica) usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 4.741.900 para iones metálicos que se pueden conjugar a anticuerpos para uso como un diagnóstico de acuerdo con la presente invención.
La presente invención abarca además los usos de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos conjugado a un resto terapéutico. Un anticuerpo o fragmento que se une a antígenos puede ser conjugado a un resto terapéutico tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion de metal radioactivo por ejemplo, emisores de partículas alfa. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Ejemplos incluyen paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi-antracin-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y sus análogos u homólogos. Los restos terapéuticos incluyen, pero sin limitación, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil-decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BCNU) y lomustina (CCNU)), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiaminaplatino (II) (DDP) cisplatino)); antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (antes denominada daunomicina) y doxorubicina); antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antes denominda actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)); moléculas de auristatina (por ejemplo, auristatina PHE, briostatina 1, solastatina 10, véase Woyke et al., Antimicrob, Agents Chemother. 46:3802-8 (2002), Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 45:3580-4 (2001), Mohammad et al., Anticancer Drugs 12:735-40 (2001), WalI et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:76-80 (1999), Mohammad et a., lnt. J. Oncol. 15:367-72 (1999); agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina); hormonas (por ejemplo, glucocorticoides, progestatinas, andrógenos y estrógenos); inhibidores de las enzimas reparadoras del DNA (por ejemplo, etopósido
o topotecan); inhibidores de quinasas (por ejemplo, el compuesto ST1571, imatinib mesilato (Kantarjian et al., Clin. Cancer Res. 8(7):2167 76 (2002)), y los compuestos descritos en las patentes de EE.UU. Nº 6.245.759, 6.399.633, 6.383.790, 6.335.156, 6.271.242, 6.242.196, 6.218.410, 6.218.372, 6.057.300, 6.034.053, 5.985.877, 5.958.769, 5.925.376, 5.922.844, 5.911.995, 5.872.223, 5.863.904, 5.840.745, 5.728.868, 5.648.239, y 5.587.459); inhibidores de farnesil-transferasa (por ejemplo, R115777, BMS 214662, y los descritos, por ejemplo en las patentes de EE.UU, Nº: 6.458.935, 6.451.812, 6.440.974, 6.436.960, 6.432.959, 6.420.387, 6.414.145, 6.410.541, 6.410.539, 6.403.581, 6.399.615, 6.387.905, 6.372.747, 6.369.034, 6.362.188, 6.342.765, 6.342.487, 6.300.501, 6.268.363, 6.265.422, 6.248.756, 6.239.140, 6.232.338, 6.228.865, 6.228.856, 6.225.322, 6.218.406, 6.211.193, 6.187.786, 6.169.096, 6.159.984, 6.143.766, 6.133.303, 6.127.366, 6.124.465, 6.124.295, 6.103.723, 6.093.737, 6.090.948, 6.080.870, 6.077.853, 6.071.935, 6.066.738, 6.063.930, 6.054.466, 6.051.582, 6.051.574, y 6.040.305); inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo, camptotecina, irinotecán, SN 38, topotecán, 9aminocamptotecina, GG 211 (GI 147211), DX 8951f; IST 622, rubitecán, pirazoloacridina, XR 5000, saintopina, UCE6, UCE1022, TAN 1518A, TAN 1518B, KT6006, KT6528, ED 110, NB 506, ED 110, NB 506, rebecamicina y bulgareina); fijadores en la ranura del DNA tales como el colorante Hoescht 33342 y el colorante Hoechst 33258; nitidina; fagaronina; epiberberina; coralina; beta-lapacona; BC 41; y sus sales, solvatos, clatratos y profármacos farmacéuticamente aceptables (Véanse, por ejemplo, Rothenberg, M.L., Annals of Oncology 8:837-855(1997); y Moreau et al., J. Med, Chem, 41:1631 1640(1998)). Los restos terapéuticos también pueden ser oligonucleótidos antisentido (por ejemplo, los descritos en las patente de EE.UU. 6.277.832, 5.998.596, 5.885.834, 5.734.033 y 5.618.709); inmunomoduladores (por ejemplo, anticuerpos y citoquinas); anticuerpos (e.g,, rituximab (Rituxan®), caliqueamicina (Mylotarg®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), y tositumomab (Bexxaru®)); e inhibidores de adenosina-desaminasa (por ejemplo, fosfato de fludarabina y 2-clorodesoxiadenosina).
Además, un anticuerpo o uno de sus fragmentos que se une a antígenos puede ser conjugado a un resto terapéutico o resto de fármaco que modifica una respuesta biológica dada. El resto terapéutico o los restos de fármacos no han de entenderse como limitados a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, toxina del cólera o toxina de la difteria; una proteína tal como el factor de necrosis tumoral, �-interferón, �-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno tisular, un agente apoptótico, por ejemplo, TNF-� TNF-�, AIM I (véase la publicación de la solicitud de patente internacional Nº WO 97/33899), AMM II (véase, la publicación de la solicitud de patente internacional Nº WO 97/34911), el ligando Fas (Takahasbi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567-1574), y VEGF (véase, la publicación de la solicitud de patente internacional Nº WO 99/23105); o un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfoquina (por ejemplo, interleuquina-1 ("IL-1"), interleuquina-2 ("IL-2"), interleuquina-4 ("IL-4"), interleuquina-6 ("IL-6"), interleuquina-9 (IL-9), interleuquina-10 (IL-10), interleuquina-12 (IL-12), interferón-�, �, y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos ("GM-CSF"), y factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF")) o un factor de crecimiento (por ejemplo, la hormona del crecimiento ("GH")).
Además, un anticuerpo se puede conjugar a restos terapéuticos tales como un ion de metal radiactivo, por ejemplo, emisores de partículas alfa, tales como 213Bi o agentes quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos, incluyendo pero sin limitación, 311In, 131Lu, 131Y, 131Ho, 131Sm, a polipéptidos. En ciertas realizaciones, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N'',N"'tetraacético (DOTA) que puede estar unido al anticuerpo mediante una molécula enlazadora. Dichas moléculas enlazadoras son usualmente conocidas en la técnica y descritas en Denardo et al., 1998, Clin. Cancer Res, 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; y Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943
50.
Las técnicas para conjugar restos terapéuticos a anticuerpos son muy conocidad, véase, por ejemplo, Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al, (eds.), pp. 243-56 (Alan R, Liss, Inc, 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al, (eds.), pp. 623-53
(Marcel, Dekker, Inc.1987); Thorpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies 84: Biological and Clinics, Applications, Pinchera et al, (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies for Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al, (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58.
Alternativamente, SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos puede ser conjugado a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo como se ha descrito por Segal en la patente de EE.UU. 4.676.980.
SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos también puede ser unido a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación del antígeno diana. Dichos soportes sólidos incluyen, pero sin limitación, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nilón, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno.
El resto terapéutico o el fármaco conjugado a SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos debe elegirse para conseguir el(los) efecto(s) profiláctico(s) o terapéutico(s) deseados para una infección por el RSV en un sujeto. Un facultativo clínico u otro profesional médico debe considerar lo siguiente cuando decida sobre cual resto terapéutico o fármaco ha de conjugar a SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos: gravedad de la infección y el estado del sujeto.
Se puede usar como agente terapéutico el SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, con o sin un resto terapéutico conjugado a él.
5.2 Método de preparar las formulaciones de anticuerpos.
La presente invención proporciona métodos para preparar formulaciones líquidas de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos. La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra la forma de preparar SYNAGIS® purificado. Los métodos para preparar formulaciones líquidas de la presente invención comprenden: purificar el anticuerpo a partir del medio acondicionado (bien sean simples lotes o lotes reunidos de medio) y concentrar un fracción que contiene el SYNAGIS® purificado a una concentración final de anticuerpo de aproximadamente 60 mg/ml, aproximadamente 70 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 90 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 150 mg/ml, aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 250 mg/ml o aproximadamente 300 mg/ml, usando una membrana semipermeable con un límite de exclusión de peso molecular (MW) apropiado (por ejemplo, un límite de exclusión de 30 kD para moléculas de anticuerpo completas y fragmentos F(ab')2; y un límite de exclusión para fragmentos de anticuerpo de 10 kD, tales como fragmentos Fab) y diafiltrar la fracción de anticuerpo concentrada en el tampón de la formulación usando la misma membrana. El tampón de la formulación de la presente invención comprende histidina a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, aproximadamente 20 mM a aproximadamente 30 mM o aproximadamente 23 mM a aproximadamente 27 mM, y es de modo más preferible aproximadamente 25 mM. Las formulaciones pueden comprender además glicina a una concentración de menos de 100 mM, menos de 50 mM, menos de 3,0 mM, menos de 2,0 mM o menos de 1,8 mM, y más preferiblemente de 1,6 mM. La cantidad de glicina en la formulación no debe causar un tamponamiento significativo para evitar la precipitación del anticuerpo en su punto isoeléctrico. El pH de la formulación puede variar desde aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0, de modo preferible aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5, de modo más preferible aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,2, y del modo más preferible aproximadamente 6,0. Para obtener un pH apropiado para un anticuerpo particular, es preferible que la histidina (y la glicina, si se añade) se disuelve primeramente en agua para obtener una solución tampón con un pH mayor que el deseado y luego el pH se lleva al nivel deseado añadiendo HCI. De este modo puede evitarse la formación de sales inorgánicas (por ejemplo, la formación de NaCI, por ejemplo, se usa hidrocloruro de histidina como la histidina y el pH se aumenta a un nivel deseado añadiendo NaOH).
Las formulaciones líquidas de la presente invención se pueden preparar en una forma de dosificación farmacéutica unitaria preparando un vial que contiene una parte alícuota de la formulación líquida para usar usa sola vez. Por ejemplo, una dosificación unitaria por vial puede contener 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml o 20 ml de diferentes concentraciones de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos que varían en concentración desde aproximadamente 65 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos que inmunoespecíficamente se une a un RSV. Si es necesario, estas preparaciones se pueden ajustar a una concentración deseada añadiendo un diluyente estéril a cada vial.
Las formulaciones líquidas de la presente invención pueden ser esterilizadas por diversos métodos de esterilización, incluyendo filtración estéril, radiación, etc. En una realización más preferida, la formulación de anticuerpo diafiltrada es esterilizada en un filtro con un filtro pre-esterilizado de 0,2 o 0,22 micrómetros. Las formulaciones líquidas esterilizadas de la presente invención se pueden administrar a un sujeto para prevenir, tratar, gestionar o mejorar una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas.
Aunque la invención está dirigida formulaciones no liofilizadas líquidas, debe advertirse para fines de equivalentes que las formulaciones de la invención se pueden liofilizar, si se desea. Por tanto, la invención abarca formas liofilizadas de las formulaciones de la invención aunque dichas formulaciones liofilizadas no son necesarias y por tanto no preferidas.
5.3 Métodos de preparar SYNAGIS®
El SYNAGIS® y uno de sus fragmentos que se une a antígenos contenidos en las formulaciones líquidas de la presente invención se pueden preparar por cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular, síntesis química o preferiblemente técnicas de expresión recombinantes.
La secuencia de nucleótidos que codifica los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del SYNAGIS® se puede obtener de la patente de EE.UU. Nº
5.824.307 de Johnson et al. En ciertas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos se puede sintetizar químicamente o ensamblar a partir de oligonucleótidos como es bien conocido en la técnica, y luego ser amplificada por PCR, clonación u otros métodos conocidos en la técnica.
La expresión recombinante de un anticuerpo (tal como SYNAGIS®) requiere la construcción de un vector de expresión que contenga una secuencia de nucleótidos que codifique el anticuerpo. Una vez que ha obtenido una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo se puede producir por tecnología del DNA recombinante empleando métodos muy conocidos en la técnica explicados en los apartados previos. Los métodos que son muy conocidos por los expertos en la técnica se pueden usar para construir vectores de expresión que contienen secuencias codificadoras de anticuerpos y señales apropiadas del control de la transcripción y la traducción. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Las secuencias de nucleótidos que codifican la región variable de las cadenas pesadas, tanto las regiones variables de las cadenas pesadas como de las cadenas ligeras, un fragmento de unión a epítopos de la región variable de la cadena pesada y/o ligera, o una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo se pueden clonar en dicho vector para expresión. El vector de expresión así preparado se puede introducir en células hospedantes apropiadas para la expresión del anticuerpo. Por consiguiente, la descripción incluye células hospedantes que contienen polinucleótidos que codifican SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos.
La célula hospedante puede ser co-transfectada con dos vectores de expresión de la invención, codificando el primer vector un polipéptido derivado de la cadena pesada y codificando el segundo vector un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que facilitan la expresión por igual de los polipéptidos de la cadena pesada y ligera o marcadores seleccionables diferentes para asegurar el mantenimiento de ambos plásmidos. Alternativamente se puede usar un solo vector que codifica, y es capaz de expresar, ambos polipéptidos de cadena ligera y pesada. En dichas situaciones, la cadena ligera debe ser colocada antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, Nature, 322:52, 1986; y Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:2 197, 1980). Las secuencias que codifican las cadenas pesada y ligera pueden comprender cDNA o DNA genómico.
Para la producción a largo plazo con alto rendimiento de anticuerpos recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden manipular por ingeniería genética las líneas celulares que expresan establemente la molécula de anticuerpo. En lugar de usar vectores de expresión que contengan orígenes virales de replicación, las células hospedantes se pueden transformar con DNA controlado por elementos apropiados de control de la expresión (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Después de la introducción del DNA extraño, a las células manipuladas por ingeniería genética se les deja crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido, y luego se cambian a medias selectivos. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección permite a las células integrar establemente el plásmido en sus cromosomas y crecer formando focos que a su vez pueden ser clonados y expandidos en líneas celulares. Este método puede ser usado ventajosamente para manipular líneas celulares que expresan la molécula de anticuerpo. Dichas líneas celulares manipuladas pueden ser particularmente útiles en el escrutinio y evaluación de composiciones que interactúan directamente o indirectamente con la molécula de anticuerpo.
Se puede usar cierto número de sistemas de selección, incluyendo pero sin limitación, genes la timidina-quinasa del virus de herpes simplex (Wigler et al., Cell, 11:223, 1977), hipoxantinaguanina-fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:202, 1992), y adenine-fosforibosiltransferasa (Lowy et al., Cell, 22:8-17, 1980) que pueden emplearse en células tk-, hgprt-o aprt -, respectivemente. También se puede usar, la resistencia a antimetabolitos como base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sci, USA, 77:357, 1980 y O'Hare et al., Proc. Nat., Acad. Sci, USA, 78:1527,1981); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78:2072, 1981); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Wu and Wu, Biotherapy, 3:87-95, 1991; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:573-596,1993; Mulligan, Science, 260:926-932, 1993; y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem., 62: 191-217, 1993; y May, TIB TECH, 11(5):155-2 15, 1993); y hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., Gene, 30:147, 1984). Se pueden aplicar de modo habitual los métodos usualmente conocidos en la técnica del DNA recombinante para seleccionar el clon recombinante deseado, y dichos métodos están descritos, por ejemplo, en Ausubel et al., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al, (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY; y Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1, 1981.
Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden ser aumentados por amplificación del vector (véase para una revisión Bebbington y Hentschel, 1987 para el uso de vectores basados en la amplificación de genes para la expresión de genes clonados en células de mamífero en DNA cloning, Vol.3, Academic Press, New York). Cuando es amplificable un marcador en el sistema vector que expresa un anticuerpo, el aumento del nivel de inhibidor presente en el cultivo de las células hospedantes aumentará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, también aumentará la producción del anticuerpo (Crouse et al., Mol. Cell, Biol., 3:257, 1983).
Una vez que se ha producido una molécula de anticuerpo de la invención por expresión recombinante, puede ser purificada por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, de cambio iónico, de afinidad, particularmente por afinidad para el antígeno específico después de la purificación de la proteína A, y cromatografía en columna de exclusión por tamaños), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualesquiera otra técnicas estándares para la purificación de proteínas. Además, el SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos se puede fusionar a secuencias heterólogas de proteínas, polipéptidos o péptidos descritas en la presente memoria o conocidas de otro modo en la técnica para facilitar la purificación.
Los fragmentos que se une a antígenos de SYNAGIS® que se unen inmunoespecíficamente al RSV pueden ser generados por técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 puede ser producidos por escisión proteolítica de moléculas inmunoglobulinas, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la cadena ligera completa, y la región variable, la región CH1 y la región de bisagra de la cadena pesada.
5.4 Métodos de monitorizar la estabilidad y agregación de formulaciones de anticuerpos.
Existen varios métodos disponibles para determinar la estabilidad de formulaciones de proteínas, incluyendo formulaciones de anticuerpos, basados en las estructuras físicas y químicas de las proteínas, así como en sus actividades biológicas. Por ejemplo, para estudiar la desnaturalización de las proteínas, están disponibles métodos tales como absorción con transferencia de carga, análisis térmico, espectroscopía de fluorescencia, dicroísmo circular, resonancia magnética nuclear (RMN), y HPSEC. Véase, por ejemplo, Wang et al., 1988, J, of Parenteral Science & Technology 42 (supp): S4-S26, La rCGEy la HPSEC son los métodos más comunes y sencillos para determinar la formación de agregados de proteínas, degradación de proteínas y fragmentación de proteínas. Por consiguiente la estabilidad de las formulaciones líquidas de la presente invención puede determinarse por estos métodos.
Por ejemplo, la estabilidad de las formulaciones líquidas de la presente invención puede ser evaluada por HPSEC o rCGE, en donde el porcentaje de área de los picos representa el SYNAGIS® no degradado o los fragmentos que se une a antígenos no degradados de SYNAGIS®. En particular, aproximadamente 250 mg de SYNAGIS®
o uno de sus fragmentos que se une a antígenos (aproximadamente 25 µl de una formulación líquida que comprende 10 mg/ml de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos) se inyecta en una columna TOSQH TSK G3000SWXL (7,8 mm x 30 cm) provista de una columna de protección TSK SWXL (6,0 mm x 4,0 cm), el SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos se eluye isocráticamente con fosfato disódico 0,1 M que contiene sulfato sódico 0,1 M y azida sódica al 0,05%, a un caudal de 0,8 a1,0 ml/min. La proteína eluida se detecta usando absorbancia en el UV a 280 nm. El patrón de referencia de SYNAGIS® se hace circular en el ensayo como control, y los resultados se describen como el porcentaje de área del pico de monómero producto comparado con los otros picos excluyendo el pico del volumen incluido observado aproximadamente a 12 a 14 minutos. Los picos que se eluyen más pronto que el pico monómero se registran como agregado porcentual.
Las formulaciones líquidas de la presente invención exhiben niveles bajos o indetectables de agregación según se miden por HPSEC o rCGE, es decir, no más de 5%, no más de 4%, no más de 3%, no más de 2%, no más de 1%, y más preferiblemente no más de 0,5% de agregado por proteína en peso, y niveles bajos o indetectables de fragmentación, es decir, 80% o superior, 85% o superior, 90% o superior, 95%
o superior, 98% o superior, o 99% o superior, o 99,5% o superior del área total del pico en lo(s) pico(s) que representan anticuerpos intactos o sus fragmentos. En el caso de la SDS-PAGE, se puede medir la densidad o la radioactividad de cada banda teñida o marcada con radioisótopo y puede obtenerse el % de densidad o el % de radioactividad de la banda que representa el SYNAGIS® o sus fragmentos que se une a antígenos no degradados.
La estabilidad de las formulaciones líquidas de la presente invención también se puede determinar por cualquier ensayo que mida la actividad biológica del SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos en la formulación. Las actividades biológicas de un anticuerpo incluyen, pero sin limitación, actividad de unión a antígenos, actividad de activación del complemento, actividad de unión al receptor Fc, etc. La actividad de unión a antígenos del SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos se puede medir por cualquier método conocido por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, ELISA, radioinmunoensayo, transferencia Western y similares. La actividad de activación del complemento se puede medir por un ensayo C3a/C4a en el sistema en el que el SYNAGIS® o uno de sus fragmentos de unión antígenos se hace reaccionar en presencia de los componentes del complemento con células que expresan un antígeno del RSV. Véase también Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed, 1988). Se puede usar un ensayo basado en ELISA, por ejemplo, para comparar la capacidad de una formulación líquida de un fragmento que se une a antígenos basado en SYNAGIS®, para comparar la capacidad de una formulación líquida de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos de unirse inmunoespecíficamente a un antígeno del RSV a un patrón de referencia de SYNAGIS®. En este ensayo, se revisten placas con un antígeno del RSV (en particular, el sitio antigénico A de la proteína F del RSV) y la señal de unión de una concentración establecida de un patrón de referencia de SYNAGIS® se compara con la señal de unión de la misma concentración de la formulación líquida de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos.
La pureza de las formulaciones líquidas de anticuerpos de la invención se puede medir por cualquier método bien conocido por los expertos en la técnica tal como, por ejemplo, HPSEC. La esterilidad de las formulaciones líquidas de anticuerpos se puede determinar como sigue: un medio de digestión estéril de soja-caseína y un medio de tioglicolato fluido se inoculan con una formulación líquida de anticuerpo de ensayo filtrando la formulación líquida de anticuerpos a través de un filtro estéril que tiene una porosidad nominal de 0,45 µm. Cuando se usa el método SterisureTM o SteritestTM, cada dispositivo de filtración se carga asépticamente con aproximadamente 100 ml del medio de digestión estéril de soja-caseína o el medio de tioglicolato fluido. Cuando se usa el método convencional, el filtro empleado se transfiere asépticamente a 100 ml de medio de digestión estéril de soja-caseína o medio de tioglicolato fluido. Los medios se incuban a temperaturas apropiadas y se observan tres veces durante un periodo de 14 días para detectar evidencia de crecimiento bacteriano o fúngico.
5.5 Utilidad profiláctica y terapéutica de las formulaciones de anticuerpos.
La presente invención también se dirige a terapias basadas en anticuerpos que implican administrar a un sujeto, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano, las formulaciones líquidas de anticuerpos de la presente invención para prevenir, tratar, gestionar o mejorar una infección por el RSV o por uno o más de sus síntomas. Las formulaciones profilácticas y terapéuticas de la invención comprenden SYNAGIS o uno de sus fragmentos que se une a antígenos a una concentración de aproximadamente 65 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml en una solución que contiene histidina.
Las formulaciones líquidas de la invención pueden comprender SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos modificados que tienen semividas mejoradas in vivo comparadas con anticuerpos conocidos que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno del RSV (por ejemplo, SYNAGIS® no modificado).
En una realización, las formulaciones líquidas de la presente invención se administran a un mamífero, preferiblemente un ser humano, para prevenir, tratar, gestionar o mejorar una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. En otra realización, las formulaciones líquidas de la invención se administran a un ser humano con fibrosis quística, displasia broncopulmonar, enfermedad cardiaca congénita, inmunodeficiencia congénita o inmunodeficiencia adquirida, o a un ser humano que ha tenido un trasplante de médula ósea para prevenir, tratar, gestionar o mejorar una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. En otra realización, las formulaciones líquidas de la invención se administran a un bebé, preferiblemente un bebé nacido prematuramente o a un bebé con riesgo de hospitalización por una infección por el RSV para prevenir, tratar, gestionar o mejorar una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. En otra realización, las formulaciones líquidas de la invención se administran a una persona anciana para prevenir, tratar, gestionar o mejorar una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. En incluso otra realización, las formulaciones líquidas de la invención se administran a un paciente que reside en una institución o centro de acogida (por ejemplo, una residencia de ancianos o un orfanato).
Las formulaciones líquidas de la presente invención se pueden usar local o sistémicamente en el cuerpo de un sujeto profilácticamente o terapéuticamente. Las formulaciones de la presente invención también se pueden usar ventajosamente en combinación con otras terapias útiles en la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV (por ejemplo, un agente profiláctico o un agente terapéutico distinto de SYNAGIS®). Ejemplos no limitativos de agentes profilácticos o terapéuticos que se pueden usar en combinación como formulaciones líquidas de la presente invención, se pueden ver en el apartado 5.6, más adelante.
Cuando se usan una o más de otras terapias, se pueden administrar separadamente, en cualquier forma apropiada y por cualquier vía adecuada. Una formulación líquida de la invención se puede administrar a un mamífero, preferiblemente un ser humano, concurrentemente con una o más de otras terapias (por ejemplo, uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos) útiles la prevención, tratamiento, gestión
o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. El término "concurrentemente" no está limitado a la administración de terapias exactamente al mismo tiempo, sino que más bien significa que una formulación líquida de la invención y otra terapia se administran a un mamífero en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo, tal como SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos contenidos en la formulación líquida puedan actuar juntos con otra terapia para proporcionar un mayor beneficio que si se administraran de otro modo. Por ejemplo, una formulación líquida de la invención y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos útiles para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV pueden ser administrados al mismo tiempo o secuencialmente en cualquier orden en diferentes momentos; sin embargo, si no se administran al mismo tiempo, deben ser administrados suficientemente próximos en el tiempo de modo que se proporcione el efecto terapéutico o profiláctico deseado.
En diversas realizaciones, una formulación líquida de la invención y una o más otras terapias (por ejemplo, uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos) útiles para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno de sus síntomas se administran espaciadas menos de una 1 hora, espaciadas a aproximadamente 1 hora, espaciadas a aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas, espaciadas a aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas, espaciadas a aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas, espaciadas a aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas, espaciadas a aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas, espaciadas a aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas, espaciadas a aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas, espaciadas a aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas, espaciadas a aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas, espaciadas a aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas, espaciadas a aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas, espaciadas no más de 24 horas o no más de 48 horas. En realizaciones preferidas, una formulación líquida de la invención y una o más de otras terapias (por ejemplo, uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos) útiles para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno de sus síntomas se administran dentro de la misma visita del paciente. En otras realizaciones, una formulación líquida de la invención y una o más de otras terapias (por ejemplo, uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos) útiles para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno de sus síntomas se administran espaciados aproximadamente 2 a 4 días, espaciados aproximadamente 4 a 6 días, espaciados aproximadamente 1 semana, espaciados aproximadamente 1 a 2 semanas, o espaciados más de 2 semanas. En realizaciones preferidas, una formulación líquida de la invención y una o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno de sus síntomas se administran en un marco de tiempo en el que ambos agentes sean todavía activos. Un experto en la técnica sería capaz de determinar dicho marco de tiempo determinando la semivida de los agentes administrados.
En ciertas realizaciones, una formulación líquida de la invención y una o más de otras terapias (por ejemplo, uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos) útiles para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno de sus síntomas se administran cíclicamente a un sujeto. La terapia cíclica implica la administración de una primera terapia durante un periodo de tiempo, seguido por la administración de una segundo terapia y/o una tercera terapia durante un periodo de tiempo y repetir esta administración secuencial. La terapia cíclica puede reducir el desarrollo de una resistencia a una o más de las terapias, evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias, y/o mejorar la eficacia del tratamiento.
En ciertas realizaciones, una formulación líquida de la invención y una o más de otras terapias (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) útiles para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno de sus síntomas se administran en un ciclo de menos de aproximadamente 3 semanas, aproximadamente una vez cada dos semanas, aproximadamente vez cada 10 días o aproximadamente una vez a la semana. Un ciclo puede comprender la administración de una terapia (por ejemplo, un agente terapéutico o profiláctico) por infusión durante aproximadamente 90 minutos cada ciclo, aproximadamente 1 hora cada ciclo, aproximadamente 45 minutos cada ciclo. Cada ciclo puede comprender al menos 1 semana de descanso, al menos 2 semanas de descanso o al menos 3 semanas de descanso. El número de ciclos administrado es de aproximadamente 1 a aproximadamente 12 ciclos, más típicamente de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 ciclos, y más típicamente de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 ciclos.
Generalmente, se prefiere la administración de productos de un origen de especie o reactividad de especie (en el caso de anticuerpos) que sea de la misma especie que la del paciente. Por tanto, en una realización preferida, se administran a un paciente humano para terapia o profilaxis anticuerpos, derivados de fragmentos o análogos humanizados.
5.6 Agentes útiles en combinación con formulaciones de SYNAGIS®.
La presente invención proporciona métodos para prevenir, gestionar, tratar o mejorar una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una formulación líquida de la invención sola o en combinación con una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) distintos de SYNAGIS®. La presente invención proporciona métodos para prevenir, gestionar, tratar o mejorar una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una formulación líquida de la invención sola o en combinación con una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) distintos de SYNAGIS®. La presente invención también proporciona composiciones que comprenden una formulación líquida de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos distintos de SYNAGIS® y métodos para prevenir, gestionar, tratar o mejorar una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas utilizando dichas composiciones. Los agentes terapéuticos o profilácticos incluyen, pero sin limitación, moléculas pequeñas, fármacos sintéticos, péptidos, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos (por ejemplo, nucleótidos de DNA y RNA, pero sin limitación, secuencias de nucleótidos antisentido, hélices triples, RNA de interferencia (RNAi), y secuencias de nucleótidos que codifican proteínas, polipéptidos o péptidos biológicamente activos) anticuerpos, moléculas inorgánicas naturales o sintéticas, agentes miméticos, y moléculas orgánicas naturales o sintéticas.
Cualquier terapia que se sepa que es útil, o que se haya usado o se use actualmente para la prevención, gestión, tratamiento o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas se puede usar en combinación con una formulación líquida de acuerdo con la invención descrita en la presente memoria. Véanse, por ejemplo, Gilman et al., Goodman y Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, 2001; The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Berkow, M.D, et al, (eds.), 17th Ed., Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, Rahway, NJ, 1999; Cecil Textbook of Medicine, 20th Ed., Bennett y Plum (eds.), W.B, Saunders, Philadelphia, 1996, para información respecto a terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) que han sido o que se usan actualmente para prevenir, gestionar, tratar o mejorar una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. Ejemplos de dichos agentes incluyen, pero sin limitación, agentes inmunomoduladores, agentes anti-inflamatorios (por ejemplo, adrenocorticoides, corticosteroides (por ejemplo, beclometasona, budesonida, flunisolida, fluticasona, triamcinolona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, hidrocortisona), glucocorticoides, esteroides, fármacos anti-inflamatorios no esteroides (por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, diclofenaco e inhibidores de COX-2), analgésicos, antagonistas de leucotrienos (por ejemplo, montelukast, metil-xantinas, zafirlukast, y zileuton), agonistas beta 2 (por ejemplo, albuterol, biterol, fenoterol, isoetaria, metaproterenol, pirbuterol, salbutamol, terbutalina formoterol, salmeterol y salbutamol terbutalina), agentes anticolinérgicos (por ejemplo, bromuro de ipratropio y bromuro de oxitropio), sulfasalazina, penicilamina, dapsona, antihistaminas, agentes anti-maláricos (por ejemplo, hidroxicloroquina)), y agentes anti-virales.
En realizaciones específicas, una formulación líquida de la invención se usa en combinación con un anticuerpo monoclonal o quimérico, o con una linfoquina o factor de crecimiento hematopoyético (tal como, por ejemplo, IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-9, IL10, IL-12, e interferón �, � y � que, por ejemplo, sirve para aumentar el número o la actividad de células efectoras que interaccionan con el anticuerpo. Una formulación líquida de la presente invención también se puede utilizar ventajosamente en combinación con otros anticuerpos monoclonales o quiméricos, o con linfoquinas o factores de crecimiento hematopoyéticos (tales como, por ejemplo, IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12 e interferón �, � y �) que, por ejemplo, sirven para aumentar la respuesta inmune. Las formulaciones líquidas de la presente invención también pueden utilizarse ventajosamente en combinación con uno o más fármacos usados para tratar una infección por el RSV, tal como, por ejemplo agentes anti-virales. Las formulaciones líquidas de la presente invención se pueden usar en combinación con uno o más de los siguientes fármacos: NIH-351 (Gemini Technologies), vacuna recombinante para el RSV (MedImmune Vaccines, Inc., solicitudes de patentes de EE.UU, Nº 60/358934 presentada el 21 de febrero de 2002, Nº 10/373567 presentada el 21 de febrero de 2003, Nº 10/371099 presentada el 21 de febrero de 2003, Nº 10/371122 presentada el 21 de febrero de 2003, Nº 10/371264 presentada el 21 de febrero de 2003, Nº 60/466181 presentada el 25 de abril de 2003 y Nº 60/465811 presentada el 25 de abril de 2003), RSVf-2 (Intracel), F-50042 (Pierre Fabre), T-786 (Trimeris), VP-36676 (ViroPharma), RFI-641 (American Home Products), VP-14637 (ViroPharma), PFP-1 y PFP-2 (American Home Products), vacuna contra el RSV (Avant Immunotherapeutics), y F-50077 (Pierre Fabre).
5.6.1 Agentes inmunomoduladores.
Cualquier agente inmunomodulador bien conocido por los expertos en la técnica se puede usar de acuerdo con los métodos de la invención para prevenir, tratar, gestionar o mejorar una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. Los agentes inmunomoduladores pueden afectar a uno o más o a todos las aspectos de la respuesta inmune de un sujeto. Los aspectos de la respuesta inmune incluyen, pero sin limitación, la respuesta inflamatoria, la cascada del complemento, la diferenciación, la proliferación y/o la función efectora de leucocitos y linfocitos, los recuentos de monocitos y/o basófilos, y la comunicación celular entre las células del sistema inmune. En ciertas realizaciones de la invención, un agente inmunomodulador modula un aspecto de la respuesta inmune. En otras realizaciones, un agente inmunomodulador modula más de un aspecto de la respuesta inmune. En una realización preferida de la invención, la administración de un agente inmunomodulador a un sujeto inhibe o reduce uno
o más aspectos de las capacidades de la respuesta inmune del sujeto. En una realización alternativa de la invención, el agente inmunomodulador potencia uno o más aspectos de la respuesta inmune del sujeto. En ciertas realizaciones, un agente inmunomodulador no es un agente anti-inflamatorio. En una realización específica, un agente inmunomodulador es un agente distinto de un agente quimioterapéutico.
Ejemplos de agentes inmunomoduladores incluyen, pero sin limitación, agentes proteínicos, tales como citoquinas, miméticos de péptidos, y anticuerpos (por ejemplo, humanos, humanizados, quiméricos, monoclonales, policlonales, los fragmentos Fvs, ScFvs, Fab o F(ab)2 o fragmentos de unión a epítopos), moléculas de ácidos nucleicos (por ejemplo, moléculas de ácidos nucleicos antisentido y hélices triples), moléculas pequeñas, compuestos orgánicos, y compuestos inorgánicos. En particular, los agentes inmunomoduladores incluyen, pero sin limitación, metotrexato, leflunomida, ciclofosfamida, citoxano, lmmuran, ciclosporina A, minociclina, azatioprina, antibióticos (por ejemplo, FK506 (tacrolimus)), metilprednisolona (MP), corticosteroides, esteroides, micofenolato mofetil, rapamicina (sirolimus), mizoribina, desoxiespergualina, brequinar, malononitriloamidas (por ejemplo, leflunamida), moduladores de receptores de los linfocitos T y moduladores de receptores de citoquinas.
Ejemplos de moduladores de los receptores de los linfocitos T incluyen, pero sin limitación, anticuerpos para los receptores de los linfocitos anti-T (por ejemplo, anticuerpos anti-CD4 (por ejemplo, cM-T412 (Boehringer), IDEC-CE9.1® (IDEC y SKB), mAB 4162W94, Orthoclone y OKTcdr4a (Janssen-Cilag)), anticuerpos anti-CD3 (por ejemplo, Nuvion (Product Design Labs), OKT3 (Johnson & Johnson), o Rituxan (IDEC)), anticuerpos anti-CD5 (por ejemplo, un inmunoconjugado unido a ricina antiCD5), anticuerpos anti-CD7 (por ejemplo, CHH-380 (Novartis)), anticuerpos anti-CD8, anticuerpos monoclonales para el ligando anti-CD40 (por ejemplo, IDEC-131 (IDEC)), anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, CAMPATH 1H (Ilex)), anticuerpos anti-CD2 (por ejemplo, MEDI-507 (Medlmmune, Inc., publicaciones de solicitudes de patentes internacionales Nº WO 02/098370 y WO 02/069904), anticuerpos anti-CD11a (por ejemplo, Xanelim (Genentecb)), y anticuerpos anti-B7 (por ejemplo, IDEC-114) (IDEC))), CTLA4-inmunoglobulina, y LFA-3TIP (Biogen, publicación de solicitud de patente internacional Nº WO 93/08656 y patente de EE.UU, Nº 6.162.432).
Ejemplos de moduladores de los receptores de citoquinas incluyen, pero sin limitación, receptores de citoquinas solubles (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor de TNF-� o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, el dominio extracelular de un receptor de IL-� o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, y el dominio extracelular de un receptor de IL-6 o uno de sus fragmentos que se une a antígenos), citoquinas o sus fragmentos (por ejemplo, interleuquina IL-2, IL-3, IL-4, IL5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-23, TNF-�, TNF-�, interferón (IFN)-�, IFN-�, IFN-�, y GM-CSF), anticuerpos para los receptores de anti-citoquinas (por ejemplo, anticuerpos para los receptores de anti-IFN, anticuerpos para los receptores de anti-IL-2 (por ejemplo, Zenapax (Proteína Design Labs)), anticuerpos para los receptores de anti-IL-3, anticuerpos para los receptores de anti-IL-4, anticuerpos para los receptores de anti-IL-6, anticuerpos para los receptores de anti-IL-9, anticuerpos para los receptores de anti-IL-10, anticuerpos para los receptores de anti-IL-12, anticuerpos para los receptores de anti-IL-13, anticuerpos para los receptores de anti-IL15, y anticuerpos para los receptores de anti-IL-23), anticuerpos anti-citoquinas (por ejemplo, anticuerpos anti-IFN, anticuerpos anti-TNF-�, anticuerpos anti-IL-�, anticuerpos anti-IL-3, anticuerpos anti-IL-6, anticuerpos anti-IL-8 (por ejemplo, ABX-IL-8 (Abgenix)), anticuerpos anti-IL-9, anticuerpos anti-IL-12, anticuerpos anti-IL-13, anticuerpos anti-IL-15 y anticuerpos anti-IL-23).
En una realización específica, un modulador de los receptores de citoquinas es IFN, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-12 o uno de sus fragmentos que se une a antígenos. En otra realización, un modulador de los receptores de citoquinas es un anticuerpo anti-IL-�, anticuerpo anti-IL-6, anticuerpo anti-IL-9, anticuerpo para los receptores de anti-IL-12 o anticuerpo anti-TNF-�. En otra realización, un modulador de los receptores de citoquinas es el dominio extracelular de un receptor de TNF-� o uno de sus fragmentos que se une a antígenos.
Un agente inmunomodulador se puede seleccionar para interferir con las interacciones entre los subconjuntos de linfocitos T adyuvantes (TH1 o TH2) y linfocitos B para inhibir la formación de anticuerpos neutralizantes. Los anticuerpos que interfieren con, o bloquean, las interacciones necesarias para la activación de linfocitos B por linfocitos T adyuvantes (abreviadamente TH por la expresión inglesa T Helper), y por tanto bloquean la producción de anticuerpos neutralizantes, son útiles como agentes inmunomoduladores en los métodos de la invención. Por ejemplo, la activación de linfocitos B por linfocitos T requiere que ocurran ciertas interacciones (Durie et al., Immunol, Today, 15(9):406-410 (1994)), tal como la unión del ligando CD40 del linfocito T adyuvante al antígeno CD40 en el linfocito B, y la unión de los ligandos CD28 y/o CTLA4 del linfocito T al antígeno B7 de linfocito B. Sin ambas interacciones, el linfocito B no puede ser activado para inducir la producción del anticuerpo neutralizante.
La interacción CD40-ligando (CD40L)-CD40 es un punto de bloqueo deseable para bloquear la respuesta inmune debido a su amplia actividad tanto en la activación como en la función de los linfocitos T adyuvantes, así como la ausencia de redundancia en su vía de señalización. Por tanto, en una realización específica de la invención, la interacción de CD40L con CD40 es bloqueada transitoriamente en el momento de la administración de uno o más de los agentes inmunomoduladores. Esto se puede conseguir tratando con un agente que bloquea el ligando CD40 en el linfocito TH e interfiere con la unión normal del ligando CD40 en el linfocito T adyuvante con el antígeno CD40 en el linfocito B. Se puede seleccionar y usar como un agente inmunomodulador de acuerdo con los métodos de la invención un anticuerpo para el ligando CD40 (antiCD40L) (disponible en Bristol-Myers Squibb Co; véase, por ejemplo, la solicitud de patente europea 555880, publicada el 18 de agosto de 1993) o una molécula de CD40 soluble.
Un agente inmunomodulador se puede seleccionar para inhibir la interacción entre linfocitos TH1 y linfocitos T citotóxicos (abreviadamente en lo sucesivo CTL por la expresión inglesa cytotoxic T lymphocytes) para reducir que se produzca la muerte mediada por los CTL. Se puede seleccionar un agente inmunomodulador para alterar (por ejemplo, inhibir o suprimir) la proliferación, diferenciación, actividad y/o la función de los linfocitos T CD4+, y/o CD8+. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos específicos para los linfocitos T como agentes inmunomoduladores para agotar o alterar la proliferación, diferenciación, actividad y/o función de los linfocitos T CD4+ y/o CD8+.
En una realización, un agente inmunomodulador que reduce o inhibe una o más actividades biológicas (por ejemplo, la diferenciación, proliferación y/o las funciones efectoras) de los subconjuntos TH0, TH1, y/o TH2 de los linfocitos T adyuvantes CD4+ se administra a un sujeto con infección por el RSV de acuerdo con los métodos de la invención. Un ejemplo de dicho agente inmunomodulador es IL-4. La IL-4 potencia la actividad específica del antígeno de los linfocitos TH2 a expensas de la función de los linfocitos TH1 (véase, por ejemplo, Yokota et al, 1986 Proc, Natl, Acad, Sci., USA, 83:5894-5898; y la patente de EE.UU, Nº 5.017.691), Otros ejemplos de agentes inmunomoduladores que afectan a la actividad biológica (por ejemplo, proliferación, diferenciación, y/o funciones efectoras) de los linfocitos T adyuvantes (en particular, los linfocitos TH1 y/o TH2) incluyen, pero sin limitación, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-l0, IL12, IL-13, IL-15, IL-23 e interferón (IFN)-�.
En otra realización, un agente inmunomodulador administrado a un sujeto con infección por el RSV de acuerdo con los métodos de la invención es una citoquina que impide la presentación del antígeno. En una realización específica, un agente inmunomodulador usado en los métodos de la invención es IL-10. La IL-10 también reduce
o inhibe la acción de los macrófagos que implica eliminación bacteriana.
De acuerdo con la invención, se administran uno o más agentes inmunomoduladores a un sujeto con infección por el RSV antes de, subsiguiente a, o concomitantemente con, una formulación líquida de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos. Preferiblemente, se administran uno o más agentes inmunomoduladores en combinación con una formulación líquida de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos a un sujeto con infección por el RSV para reducir o inhibir uno o más aspectos de la respuesta inmune según sea considerado necesario por un experto en la técnica. Se puede usar cualquier método bien conocido por un experto en la técnica para medir uno o más aspectos de la respuesta inmune en un sujeto particular, y con ello determinar cuándo es necesario administrar un agente inmunomodulador a dicho sujeto. En una realización preferida, se mantiene en un sujeto un recuento de linfocitos medio absoluto de aproximadamente 500 células/mm3, preferiblemente 600 células/mm3, 650 células/mm3, 700 células/mm3, 750 células/mm3, 800 células/mm3 , 900 células/mm3, 1000 células/mm3 , 1100 células/mm3 o 1200 células/mm3. En otra realización preferida, a un sujeto con infección por el RSV no se le administra un agente inmunomodulador si su recuento absoluto de linfocitos es 500 células/mm3 o menos, 550 células/mm3 o menos, 600 células/mm3 o menos, 650 células/mm3 o menos, 700 células/mm3 o menos, 750 células/mm3 o menos, o 800 células/mm3 o menos.
En una realización específica, se administran uno o más agentes inmunomoduladores en combinación con una formulación líquida de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos a un sujeto con infección por el RSV de modo que se reduzca o inhiba transitoriamente uno o más aspectos de la respuesta inmune. Dicha inhibición o reducción transitoria de uno o más aspectos del sistema inmune puede durar horas, días, semanas o meses. Preferiblemente, la inhibición o reducción transitoria de uno o más aspectos de la respuesta inmune dura unas cuantas horas (por ejemplo, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas o 48 horas), unos cuantos días (por ejemplo, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días o 14 días), o unas cuantas semanas (por ejemplo, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o 6 semanas). La reducción o inhibición transitoria de uno o más aspectos de la respuesta inmune potencia el(los) efecto(s) profiláctico(s) y/o terapéutico(s) de una formulación líquida de SYNAGIS5 o uno de sus fragmentos que se une a antígenos.
En una realización preferida, las proteínas, polipéptidos o péptidos (incluyendo anticuerpos) que se utilizan como agentes inmunomoduladores se derivan de la misma especie que la que recibe las proteínas, polipéptidos o péptidos de modo que se reduce la probabilidad de una respuesta inmune a estas proteínas, polipéptidos o péptidos. En otra realización preferida, cuando el sujeto es un ser humano, las proteínas, polipéptidos o péptidos que se utilizan son agentes inmunomoduladores humanos
o humanizados.
Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas, polipéptidos, o péptidos con actividad inmunomoduladora o las proteínas, polipéptidos o péptidos con actividad inmunomoduladora se pueden administrar a un sujeto con infección por el RSV de acuerdo con los métodos de la invención. Además, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican derivados, análogos o fragmentos de proteínas, polipéptidos, o péptidos con actividad inmunomoduladora, o derivados, análogos, o fragmentos de proteínas, polipéptidos, o péptidos con actividad inmunomoduladora se pueden administrar a un sujeto con una infección por el RSV de acuerdo con los métodos de la invención. Preferiblemente, dichos derivados, análogos y fragmentos retienen la actividad inmunomoduladora de la proteína, polipéptido o péptido de tipo natural de longitud completa.
Preferiblemente, los agentes que están comercialmente disponibles y que se sabe que funcionan como agentes inmunomoduladores se usan en los métodos de la invención. La actividad inmunomoduladora de un agente se puede determinar in vitro y/o in vivo por cualesquiera métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ensayos CTL, ensayos de proliferación e inmunoensayos (por ejemplo, diversos tipos de ELISA) para la expresión de proteínas particulares, tales como moléculas co-estimuladoras y citoquinas.
5.6.2 Agentes anti-inflamatorios.
De acuerdo con métodos de la invención se puede usar cualquier agente antiinflamatorio, incluyendo agentes útiles en terapias para trastornos inflamatorios, bien conocidos por los expertos en la técnica para impedir, tratar, gestionar o mejorar una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. Ejemplos no limitativos de agentes anti-inflamatorio incluyen fármacos anti-inflamatorios no esteroides (NSAID), fármacos anti-inflamatorios esteroides, anticolinérgicos (por ejemplo, sulfato de atropina, metilnitrato de atropina y bromuro de ipratropio (ATROVENTTM), agonistas beta 2 (por ejemplo, abuterol (VENTOLINTM y PROVENTILTM), bitolterol (TORNALATETM), levalbuterol (XOPONEXTM), metaproterenol (ALUPENTTM), pirbuterol (MAXAIRTM), terbutlaina (BRETHAIRETM y BRETHINETM), albuterol (PROVENTILTM , REPETABSTM , y VOLMAXTM), formoterol (FORADIL AEROLIZERrM), y salmeterol (SEREVENTTM y SEREVENT DISKUSTM)), y metilxantinas (por ejemplo, teofilina (UNIPHYLTM, THEO-DURTM , SLO-BIDTM, y TEHO-42TM)). Ejemplos de NSAID incluyen, pero sin limitación, aspirina, ibuprofeno, celecoxib (CELEBREX'TM), diclofenaco (VOLTARENTM), etodolaco (LODINETM), fenoprofeno (NALFONTM), indometacina (INDOCINTM), ketoralaco (TORADOLTM), oxaprozina (DAYPROTM), nabumentona (RELAFENTM), sulindaco (CLINORIL TM), tolmentina (TOLECTINTM), rofecoxib (VIOXXTM), naproxeno (ALEVETM, NAPROSYNTM), ketoprofeno (ACTRONTM) y nabumetona (RELAFENTTM). Dichos NSAID funcionan inhibiendo una enzima ciclooxigenasa (por ejemplo, COX-1 y/o COX-2). Ejemplos de fármacos anti-inflamatorios esteroides incluyen, pero sin limitación, glucocorticoides, dexametasona (DECADRONTM), corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona (MEDROLTM)), cortisona, hidrocortisona, prednisona (PREDNISONETM y DELTASONETM), prednisolona (PRELONETM y PEDIAPREDTM), triamcinolona, azulfidina e inhibidores de eicosanoides (por ejemplo, prostaglandinas, tromboxanos, y leucotrienos (véase la Tabla 2, más adelante, para ejemplos no limitativos de leucotrienos y las dosis típicas de dichos agentes)).
5.6.3 Agentes anti-virales
De acuerdo con los métodos de la invención se puede usar cualquier agente anti-viral bien conocido por los expertos en la técnica (en particular, uno útil para el tratamiento, prevención, gestión o mejora de una infección por el RSV) para prevenir, tratar, gestionar o mejorar una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. Ejemplos no limitativos de agentes anti-virales incluyen proteínas, polipéptidos, péptidos, anticuerpos de proteínas fusión, moléculas de ácidos nucleicos, moléculas orgánicas, moléculas inorgánicas y moléculas pequeñas que inhiben y/o reducen la unión de un virus a su receptor, la internalización de un virus en una célula, la replicación de un virus o la liberación de un virus desde una célula. En particular, los agentes antivirales incluyen, pero sin limitación, análogos de nucleósidos (por ejemplo, zidovudina, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina y ribavirina), foscarnet, amantadina, rimantadina, saquinavir, indinavir, ritonavir, interferones alfa y otros interferones, y AZT.
En realizaciones específicas, el agente anti-viral es un anticuerpo distinto de SYNAGIS® que es inmunoespecífico para un antígeno viral. Como se usa en la presente memoria, la expresión "antígeno viral " incluye, pero sin limitación, cualquier péptido, polipéptido y proteína del RSV (por ejemplo, la glicoproteína F del RSV y la glicoproteína G del RSV) que es capaz de producir una respuesta inmune.
En realizaciones preferidas, la infección viral es por el RSV y el antígeno antiviral es un anticuerpo distinto de SYNAGIS® que se une inmunoespecíficamente a un antígeno del RSV. En ciertas realizaciones, el anticuerpo para el antígeno anti-RSV se une inmunoespecíficamente a un antígeno del RSV del grupo A del RSV. En otras realizaciones, el anticuerpo para el antígeno anti-RSV se une inmunoespecíficamente a un antígeno del RSV del grupo B del RSV. En otras realizaciones, el anticuerpo para el antígeno anti-RSV se une inmunoespecíficamente a un antígeno del RSV de un grupo y reacciona de forma cruzada con un antígeno análogo del otro grupo. En realizaciones particulares, el anticuerpo para el antígeno anti-RSV se une inmunoespecíficamente a una nucleoproteína del RSV, fosfoproteína del RSV, proteína de la matriz del RSV, proteína hidrófoba pequeña del RSV, RNA-polimerasa dependiente de RNA del RSV, proteína F del RSV, y/o proteína G del RSV. En realizaciones específicas adicionales, el anticuerpo para el antígeno anti-RSV se une a variantes alélicas de una nucleoproteína del RSV, una proteína de la cápsida del RSV, una fosfoproteína del RSV, una proteína de la matriz del RSV, una glicoproteína de unión al RSV, una glicoproteína de fusión del RSV, una proteína de la nucleocápsida del RSV, una proteína de la matriz del RSV, una proteína hidrófoba pequeña del RSV, una RNA-polimerasa dependiente de RNA del RSV, una proteína F del RSV, una proteína L del RSV, una proteína P del RSV, y/o una proteína G del RSV.
Las terapias anti-virales y sus dosis, vías de administración y uso recomendado son conocidos en la técnica y han sido descritos en literatura científica como el Physician's Desk Reference (57th ed., 2003). Una información adicional sobre las infecciones virales respiratorias está disponible en el Cecil Textbook of Medicine (18th ed., 1988).
5.7 Métodos de administrar las formulaciones de SYNAGIS®.
La invención proporciona métodos de tratamiento, profilaxis y mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas por administración a un sujeto de una cantidad eficaz de formulaciones líquidas de la invención. El sujeto es preferiblemente un mamífero tal como uno no primate (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, ratas etc) y un primate (por ejemplo, monos tales como monos cinomolgos y un ser humano). En una realización preferida, el sujeto es un ser humano. En otra realización preferida, el sujeto es un bebé o un bebé nacido prematuramente.
Se conocen y se pueden usar diversos sistemas para administrar una formulación líquida de la presente invención. Los métodos de administrar las formulaciones líquidas de SYNAGIS® de la presente invención incluyen, pero sin limitación, administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), administración epidural, administración tópica, administración pulmonar, y administración por las mucosas (por ejemplo, vías intranasal y oral). En una realización específica, las formulaciones líquidas de la presente invención se administran intramuscularmente, intravenosamente o subcutáneamente y, de modo preferible, intramuscularmente. Las formulaciones se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección de bolo, por absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador.
La invención también proporciona que una formulación líquida de la presente invención esté envasada en un recipiente herméticamente cerrado, tal como una ampolla o saquito que indique la cantidad de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos. Preferiblemente, las formulaciones líquidas de la presente invención están en un recipiente herméticamente cerrado que indica la cantidad y concentración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, la formulación líquida de la presente invención se suministra en un recipiente herméticamente cerrado que contiene al menos 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml o 300 mg/ml y, más preferiblemente, 105 mg/ml, en una cantidad de 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml o 20 ml y, más preferiblemente, 1,2 ml.
La cantidad de las formulaciones líquidas de la presente invención que será eficaz en la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas se puede determinar por técnicas clínicas estándares. Por ejemplo, la dosificación de la composición que será eficaz en el tratamiento, prevención o mejora de los síntomas asociados con la infección por el RSV se puede determinar administrando la formulación a una rata del algodón, midiendo el título del RSV después de la prueba de virulencia en la rata del algodón con 105 UFP de RSV y comparando el título del RSV con el obtenido en una rata algodón a la que no se ha administrado la formulación. Por consiguiente, una dosificación que de cómo resultado una disminución de 2 log o una reducción del 99% en el título del RSV en la rata del algodón inoculada con 105 UPF del RSV con respecto a la rata del algodón inoculada con 105 UFP del RSV, pero a la que no se administra la formulación, es la dosificación de la formulación que puede ser administrada a un ser humano para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. La dosificación de la formulación que será eficaz en la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas se puede determinar administrando la formulación a un modelo animal (por ejemplo, una rata del algodón o un mono) y midiendo el título del suero de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos. Por consiguiente, una dosificación de la formulación que dé como resultado un título de suero de al menos 1 µg/ml, preferiblemente 2 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml, 20 µg/ml, 25 µg/ml, al menos 35 µg/ml, al menos 40 µg/ml, al menos 50 µg/ml, al menos 75 µg/ml, al menos 100 µg/ml, al menos 125 µg/ml, al menos 150 µg/ml, al menos 200 µg/ml, al menos 250 µg/ml, al menos 300 µg/ml, al menos 350 µg/ml, al menos 400 µg/ml, o al menos 450 µg/ml se puede administrar a un ser humano para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimas.
La dosis precisa que ha de emplearse en la formulación también dependerá de la vía de administración, y la gravedad de la infección por el RSV, y debe ser decidida de acuerdo con el criterio del facultativo y las circunstancias del paciente. Las dosis eficaces pueden ser extrapoladas a partir de las curvas dosis-respuesta derivadas de sistemas de ensayo con un modelo in vitro o animal (por ejemplo, la rata del algodón o monos cinomolgos).
Para los anticuerpos (por ejemplo, SYNAGIS®), proteínas, polipéptidos, péptidos y proteínas de fusión, la dosificación administrada a un paciente es típicamente alrededor de aproximadamente 1 mg/kg a 30 mg/kg de peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosificación administrada a un paciente es entre 10 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del paciente, más preferiblemente 15 mg/kg del peso corporal del paciente. Generalmente, los anticuerpos humanos tienen una semivida más larga dentro del cuerpo humano que los anticuerpos procedentes de otras especies debido a la respuesta inmune a los polipéptidos extraños. Por tanto, frecuentemente son posibles dosificaciones inferiores de anticuerpos humanos y menos administración. Además, la dosificación, el volumen y la frecuencia de administración de las formulaciones líquidas de la presente invención pueden ser reducidos aumentando la concentración de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos en las formulaciones, aumentando la afinidad y/o avidez de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, y/o aumentando la semivida de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos.
Dosis ilustrativas de una molécula pequeña incluyen cantidades de miligramos o microgramos de la molécula pequeña por kilogramo de sujeto o muestra de peso (por ejemplo, aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 500 miligramos por kilogramo, aproximadamente 100 microgramos por kilogramo a aproximadamente 5 miligramos por kilogramo o aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 50 microgramos por kilogramo).
En una realización específica, se administra a un mamífero, preferiblemente un ser humano, una formulación líquida estable de la presente invención para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas en una cantidad eficaz para disminuir los títulos del RSV. De acuerdo con esta realización, una cantidad eficaz de las formulaciones líquidas de la presente invención reduce los títulos del RSV en los pulmones según se mide, por ejemplo, por la concentración del RSV en muestras de esputos o un líquido de lavado de los pulmones de un mamífero. En otra realización, se administra a un mamífero, preferiblemente un ser humano, una formulación líquida de la presente para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune en el mamífero.
En otra realización, se administra a un mamífero, preferiblemente un ser humano, una primera dosis de una formulación líquida de la presente invención que comprende 30 mg/kg o menos, 15 mg/kg o menos, 10 mg/kg o menos, 5 mg/kg o menos, 3 mg/kg o menos, 1 mg/kg o menos o 0,5 mg/kg o menos de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas en una cantidad eficaz para inducir un título de suero de al menos 1 µg/ml, preferiblemente al menos 2 µg/ml, al menos 5 µg/ml, al menos 10 µg/ml, al menos 15 µg/ml, al menos 20 µg/ml, al menos 25 µg/ml, al menos 30 µg/ml, al menos 35 µg/ml, al menos 40 µg/ml 20 días (preferiblemente 25, 30, 35, 40 días) después de la administración de la primera dosis y antes de la administración de una dosis posterior. En una realización específica, una formulación líquida de la presente invención comprende SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos y se administra a un sujeto una primera dosis de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg para inducir un título del suero de aproximadamente 40 µg/ml o superior 30 días después de la administración de la primera dosis y antes de la administración de una dosis posterior. Preferiblemente, el título del suero de dicho SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos es menos de 50 µg/ml 30 días después de la administración de la primera dosis y antes de la administración de una dosis posterior.
En otra realización, se administra a un mamífero, preferiblemente un ser humano, una primera dosis de una formulación líquida de la presente invención que comprenden 30 mg/kg o menos, 15 mg/kg o menos, 10 mg/kg o menos, 5 mg/kg o menos, 3 mg/kg o menos, 1 mg/kg o menos o 0,5 mg/kg o menos de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas en una cantidad eficaz para inducir un título del suero de al menos 1 µg/ml, preferiblemente al menos 2 µg/ml, al menos 5 µg/ml, al menos 10 µg/ml, al menos 15 µg/ml, al menos 20 µg/ml, o al menos 25 µg/ml 20 días (preferiblemente 25, 30, 35, 40 días) después de la administración de la primera dosis y antes de la administración de una dosis posterior. Preferiblemente, el título del suero de dicho SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos es menos de 30 µg/ml 30 días después de la administración de la primera dosis y antes de la administración de una dosis posterior.
En otra realización, se administra a un mamífero, preferiblemente un ser humano, una primera dosis de una formulación líquida de la presente invención que comprende 30 mg/kg o menos, 15 mg/kg o menos, 5 mg/kg o menos, 3 mg/kg o menos, 1 mg/kg o menos o 0,5 mg/kg o menos de una forma modificada de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas que tiene una semivida in vivo aumentada en una cantidad eficaz para inducir un título del suero de al menos 1 µg/ml, preferiblemente al menos 2 µg/ml, al menos 5 µg/ml, al menos 10 µg/ml, al menos 15 µg/ml, al menos 20 µg/ml, o al menos 25 µg/ml 25 días (preferiblemente 30, 35 o 40 días) después de la administración de la primera dosis y antes de la administración de una dosis posterior. Preferiblemente, el título del suero de dicho SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos es menos de 30 µg/ml 30 días después de la administración de la primera dosis y antes de la administración de una dosis posterior.
En otra realización, se administra a un mamífero, preferiblemente un ser humano, una primera dosis de una formulación líquida de la presente invención que comprende 30 mg/kg o menos, 15 mg/kg o menos, 5 mg/kg o menos, 3 mg/kg o menos, 1 mg/kg o menos o 0,5 mg/kg o menos de un SYNAGIS® modificado o uno de sus fragmentos que se une a antígenos para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas que tiene una semivida in vivo aumentada en una cantidad eficaz para inducir un título del suero de al menos 1 µg/ml, preferiblemente al menos 2 µg/ml, al menos 5 µg/ml, al menos 10 µg/ml, al menos 15 µg/ml, al menos 20 µg/ml, o al menos 25 µg/ml 25 días (preferiblemente 30, 35, o 40 días) después de la administración de la primera dosis y antes de la administración de una dosis posterior. Preferiblemente, el título del suero de dicho SYNAGIS®
o uno de sus fragmentos que se une a antígenos es menos de 30 µg/ml 30 días después de la administración de la primera dosis y antes de la administración de una dosis posterior.
En otra realización, se administra a un mamífero, preferiblemente un ser humano, una primera dosis de una formulación líquida que comprende aproximadamente 30 mg/kg o menos, 15 mg/kg o menos (preferiblemente 10 mg/kg o menos, 5 mg/kg o menos, 3 mg/kg o menos, 1 mg/kg o menos o 0,5 mg/kg o menos) de una forma modifica de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos que tiene una semivida in vivo aumentada para la prevención, tratamiento, gestión o mejorada de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas en una cantidad eficaz para inducir un título del suero de al menos 30 µg/ml, preferiblemente al menos 35 µg/ml, al menos 40 µg/ml, o al menos 50 µg/ml 25 días (preferiblemente 30, 35, o 40 días) después de la administración de la primera dosis y antes de la administración de una dosis posterior.
En una realización, se administra a un mamífero, preferiblemente un ser humano, una primera dosis de una formulación líquida de la presente invención por administración pulmonar que comprenden 30 mg/kg o menos, 15 mg/kg o menos, 5 mg/kg o menos, 3 mg/kg o menos, 1 mg/kg o menos, 0,5 mg/kg o menos o 0,01 mg/kg
o menos de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas en una cantidad eficaz para inducir un título de al menos 20 ng per mg de proteína pulmonar (preferiblemente al menos 40 ng/mg, al menos 60 ng/mg, al menos 80 ng/mg, al menos 50 ng/mg, al menos 75 ng/mg, al menos 100 ng/mg, o al menos 150 ng/mg) en una muestra de intubación o líquido para lavado de los pulmones de dicho mamífero 20 días (preferiblemente 25, 30, 35, o 40 días) después de la administración de la primera dosis y antes de la administración de dosis posterior. Preferiblemente, el título del suero de dicho SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos es menos de 100 ng/ml de proteína 30 días después de la administración de la primera dosis y antes de la administración de una dosis posterior.
En otra realización, se administra a un mamífero, preferiblemente un ser humano, una primera dosis de una formulación líquida de la presente invención que contiene 10 mg/kg o menos, 5 mg/kg o menos, 3 mg/kg o menos, 1 mg/kg o menos o 0,5 mg/kg o menos de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas en una cantidad eficaz para inducir un título del suero de al menos 35 µg/ml, al menos 40 µg/ml, al menos 50 µg/ml, al menos 80 µg/ml, al menos 100 µg/ml, al menos 120 µg/ml, al menos 150 µg/ml, al menos 200 µg/ml, al menos 250 µg/ml o al menos 300 µg/ml 20 días (preferiblemente 25, 30, 35 o 40 días) después de la administración de la primera dosis. En otra realización, se administra a un mamífero, preferiblemente un ser humano, una primera dosis de una formulación líquida de la presente invención que comprende aproximadamente 15 mg/kg de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos para la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas en una cantidad eficaz para inducir un título del suero de al menos 100 µg/ml, al menos 125 µg/ml, al menos 150 µg/ml, al menos 200 µg/ml, al menos 250 µg/ml, al menos 300 µg/ml, al menos 350 µg/ml, al menos 400 µg/ml, o al menos 450 µg/ml 20 días (preferiblemente 25, 30, 35 o 40 días) después de la administración de la primera dosis. La expresión "aproximadamente 15 mg/kg" como se usa en la presente memoria se refiere a un intervalo entre de entre 14 mg/kg y 16 mg/kg.
En otra realización, se administra a un mamífero, preferiblemente un ser humano, un dosis de una formulación líquida de la presente invención que comprende SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos para la prevención de una infección por el RSV o uno de sus síntomas en una cantidad eficaz para inducir un título profilácticamente eficaz del suero de menos de 10 µg/ml, menos de 8 µg/ml, menos de 5 µg/ml, menos de 3 µg/ml, menos de 1 µg/ml o menos de 0,5 µg/ml 30 días después de la administración de la dosis, en donde dicho título profilácticamente eficaz del suero es el título del suero que reduce la incidencia de una infección por el RSV en el ser humano o el título del suero en una rata del algodón que da como resultado un título del RSV 5 días después de la inoculación con 105 UFP que es 99% menor que el título del RSV en la rata del algodón 5 días después de la inoculación con 105 UFP del RSV en una rata del algodón a la que no se ha administrado la dosis antes de la inoculación. Preferiblemente, la dosis de la composición terapéutica o farmacéutica comprende 10 mg/kg o menos, 5 mg/kg o menos, 3 mg/kg o menos, 1 mg/kg o menos o 0,5 mg/kg o menos de SYNAGIS ® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos.
En incluso otra realización, se administra a un mamífero, preferiblemente un ser humano, una dosis de una formulación líquida de la presente invención que comprende SYNAGIS ® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos para el tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas en una cantidad eficaz para inducir un título terapéuticamente eficaz del suero de menos de 10 µg/ml, menos de 8 µg/ml, menos de 5 µg/ml, menos de 3 µg/ml, menos de 1 µg/ml
o menos de 0,5 µg/ml 30 días después de la administración de la dosis, en donde dicho un título terapéuticamente eficaz del suero es el título del suero que reduce la gravedad o duración de una infección por el RSV o es el título del suero en una rata del algodón que da como resultado un título del RSV en la rata 5 días después de la inoculación con 105 UFP del RSV que es 99% inferior al del título del RSV 5 días después de la inoculación con 105 UFP del RSV en una rata del algodón a la que no se le ha administrado la dosis antes de la inoculación. Preferiblemente, la dosis de la formulación líquida de la presente invención comprende 12 mg/kg o menos, 10 mg/kg o menos, 5 mg/kg o menos, 3 mg/kg o menos, 1 mg/kg o menos o 0,5 5 mg/kg o menos de un anticuerpo o uno de sus fragmentos que se une a antígenos.
En una realización especifica, las formulaciones de la presente invención se administran una vez al mes justo antes de, o durante, la estación del RSV. En otra realización, las formulaciones se administran cada dos meses justo antes de, o durante, la estación del RSV. En incluso otra realización, las formulaciones estables de la presente invención se administran una vez justo a antes de, o durante, la estación del RSV. La expresión "estación del RSV" se refiere a la época del año en la que es más probable que ocurra una infección por el RSV. Típicamente, la estación del RSV en el hemisferio norte comienza en noviembre y dura hasta abril.
En una realización, se administra una formulación líquida que comprende aproximadamente 5 mg/kg o menos (preferiblemente 1,5 mg/kg o menos) de SYNAGIS ® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos 5 veces, 3 veces o 1 a 2 veces durante una estación del RSV a un mamífero, preferiblemente un ser humano. En otra realización, se administra aproximadamente 1,5 mg/kg de SYNAGIS ® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, en las formulaciones líquidas de la presente invención mensualmente cinco veces durante la estación del RSV a un mamífero, preferiblemente un ser humano, intramuscularmente. En otra realización, se administra 3 mg/kg de SYNAGIS ® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos en la formulación líquida de la invención mensualmente tres veces durante la estación del RSV a un mamífero, preferiblemente un ser humano, intramuscularmente. En incluso otra realización, se administra 5 mg/kg de un SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos en una formulación líquida de la invención mensualmente una o dos veces durante la estación del RSV a un mamífero, preferiblemente un ser humano, intramuscularmente.
En una realización específica, se administra 15 mg/kg de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos en la formulación líquida de la presente invención a un mamífero, preferiblemente un ser humano, intramuscularmente mensualmente cinco veces durante la estación del RSV, en donde dicho SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos que tiene una semivida in vivo aumentada. En otra realización, se administra aproximadamente 5 mg/kg o menos (preferiblemente 1,5 mg/kg o menos) de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos en la formulación líquida de la presente invención cinco veces, 3 veces o 1 a 2 veces durante la estación del RSV a un mamífero, preferiblemente un ser humano. En otra realización, se administra 3 mg/kg de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, que tiene una semivida in vivo aumentada, en la formulación líquida de la presente invención mensualmente tres veces durante la estación del RSV a un mamífero, preferiblemente un ser humano, intramuscularmente. En otra realización, se administra 5 mg/kg de SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos, que tiene una semivida in vivo aumentada, en la formulación líquida de la presente invención a un mamífero, preferiblemente un ser humano, intramuscularmente dos veces durante la estación del RSV.
5.8 Ensayos biológicos. 5.8.1 Inmunoespecificidad de los anticuerpos de la invención.
Los anticuerpos de la presente invención o sus fragmentos se pueden caracterizar por una variedad de modos bien conocidos por los expertos en la técnica. En particular, los anticuerpos de la invención o sus fragmentos que se unen a antígenos en una formulación líquida de la presente invención pueden ser analizados por la capacidad de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo de un virus sincitial respiratoria. Dichos ensayos pueden realizarse en solución (por ejemplo, Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412-421), en perlas (Lam, 1991, Nature 354:82-84), en chips (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), en bacterias (Patente de EE.UU, Nº 5.223.409), en esporas (Patentes de EE.UU, Nº 5.571.698; 5.403.484; y 5.223.409), en plásmidos (Cull et al., 1992, Proc, Natl, Acad, Sci, USA 89:1865-1869) o en fagos (Scott y Smith, 1990, Science 249:386-390; Cwirla et al., 1990, Proc, Natl, Acad, Sci, USA 87:63786382; y Felici, 1991, J, Mol, Biol, 222:301-310). El SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos en una formulación líquida de la presente invención puede ser determinado por su especificidad y afinidad.
El SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos de la presente invención puede ser determinado por unión inmunoespecífica a un antígeno del RSV reactividad cruzada con otros antígenos por cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que se pueden usar para analizar la unión inmunoespecífica y la reactividad cruzada incluyen, pero sin limitación, sistemas de ensayos competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como transferencia Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo con inmunosorbente unido a enzima), inmunoensayos "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina con difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunoradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos con proteína A por nombrar unos cuantos. Dichos ensayos son habituales y bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol, 1, John Wiley & Sons, Inc., New York).
5.8.2 Ensayos in vitro e in vivo.
Una formulación líquida o una terapia de combinación de la presente invención se puede ensayar en cuanto a su actividad in vitro y/o in vivo en diversos sistemas de ensayo o modelos animales adecuados.
Una formulación líquida de la presente invención para tratar, gestionar, prevenir o mejorar una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas se puede ensayar en cuanto a su capacidad para inhibir la replicación viral o reducir la carga viral en ensayos in vitro. Por ejemplo, la replicación viral puede analizarse por un ensayo en placa como se ha descrito, por ejemplo, por Johnson et al., 1997, Journal of Infectious Diseases 176:1215-1224 176:1215-1224. Una formulación líquida de la invención administrada de acuerdo con los métodos de la invención también puede ser analizada en cuanto a su capacidad para inhibir o sub-regular la expresión de polipéptidos vira-les. Se pueden usar métodos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, análisis por transferencia Western, análisis por transferencia Northern, y RT-PCR para medir la expresión de polipéptidos virales y/o títulos virales.
Se puede ensayar una formulación líquida de la invención en sistemas de modelos de animales adecuados antes del uso en seres humanos. Dichos sistemas de modelos de animales incluyen, pero sin limitación, ratas, ratones, pollos, vacas, monos, cerdos, perros, conejos, etc. Puede usarse cualquier sistema animal bien conocido en la técnica. Algunos aspectos del método pueden variar; incluyendo dichos aspectos, pero sin limitación, el régimen temporal de administrar las terapias (por ejemplo, agentes profilácticos y/o terapéuticos) tanto si dichas terapias se administran separadamente o como una mezcla, y la frecuencia de administración de las terapias.
Los modelos animales se pueden usar para determinar la eficacia de los métodos de la invención para tratar, gestionar, prevenir o mejorar una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. Los modelos animales para la infección por el RSV incluyen, pero sin limitación, los descritos, por ejemplo, por Piedimonte et al., Am, J, Physiol, 1999, 277:L831-L840; McArthur-Vaughan et al., J, Med, Primatol, 2002, 31(2):61-73; y Byrd et al., Clin, lnfect, Dis, 1997, 25(6):1363-8. En una realización específica, se administra a ratas del algodón una formulación líquida que comprenden SYNAGIS® de acuerdo con los métodos de la invención, inoculada con 105 UFP del RSV, y cuatro o más días más tarde, se sacrifican las ratas y se determina el título en suero del RSV y SYNAGIS®. Por consiguiente, una dosificación que dé como resultado una disminución de 2 log o una reducción de 99% en el título del RSV en la rata del algodón inoculada con 105 UFP del RSV con respecto a la rata del algodón inoculada con 105 UFP del RSV pero a la que no se le ha administrado la formulación es la dosificación de la formulación que se puede administrar a un ser humano para el tratamiento, prevención o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. Además, en esta realización, los tejidos (por ejemplo, los tejidos pulmonares) de las ratas sacrificadas se pueden examinar en lo que respecta a cambios histológicos.
La administración de una formulación líquida de la invención de acuerdo con los métodos de la presente invención puede ser analizada en cuanto a su capacidad de disminuir el tiempo de infección por el RSV en al menos 25%, preferiblemente al menos 50%, al menos 60%, al menos 75%, al menos 85%, al menos 95% o al menos 99%. Una formulación líquida de la invención también puede ser analizada en cuanto a su capacidad para aumentar el periodo de supervivencia de seres humanos que sufren una infección por el RSV en al menos 25%, preferiblemente al menos 50%, al menos 60%, al menos 75%, al menos 85%, al menos 95% o al menos 99%. Además, una formulación líquida de la invención se puede analizar en cuanto a su capacidad para reducir el periodo de hospitalización de un ser humano que sufre una infección por el RSV en al menos 60%, preferiblemente al menos 75%, al menos 85%, al menos 95%, o al menos 99%. Se pueden usar métodos conocidos por los expertos en la técnica para analizar in vivo la función de una formulación líquida de la invención.
Además, se pueden usar cualesquiera ensayos in vitro o in vivo conocidos por los expertos en la técnica para evaluar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de una formulación líquida de la invención descrita en la presente memoria para una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas.
5.8.3 Ensayos de toxicidad.
La toxicidad y/o eficacia de los protocolos profilácticos y/o terapéuticos de la presente invención se pueden determinar por métodos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, determinando la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50/DE50. Las terapias que muestran índices terapéuticos grandes son las preferidas. Aunque se pueden usar terapias que muestran efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado en diseñar un sistema de administración que dirija dichos agentes al sito del tejido afectado para minimizar el daño potencial a células no infectadas y, por tanto, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de los ensayos en cultivos de células y estudios en animales se pueden usar en formular un intervalo de dosificación de los agentes profilácticos y/o terapéuticos para uso en seres humanos. La dosificación de dichos agentes cae preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier terapia usada en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos en cultivos de células. Se puede formular una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración en plasma circulante que incluye una CI50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que consigue la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) según se determina en cultivos de células. Dicha información se puede usar para determinar con más precisión las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía de alta resolución.
5.9 Kits
La invención proporciona un envase o kit farmacéutico que comprenden uno o más recipientes llenos con una formulación líquida de la invención para la prevención tratamiento, gestión o mejora de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas. En una realización específica, las formulaciones líquidas de la invención comprenden SYNAGIS® o uno de sus fragmentos que se une a antígenos fusionado recombinantemente o conjugado químicamente a otros restos, incluyendo pero sin limitación, una proteína heteróloga, un polipéptido heterólogo, un péptido heterólogo, una molécula grande, una molécula pequeña, una secuencia marcadora, un agente de diagnóstico o detectable, un resto terapéutico, un resto de fármaco, un ion de metal radioactivo, un segundo anticuerpo y un soporte sólido.
La presente invención proporciona kits que se pueden usar en los métodos anteriores. En una realización, un kit comprende una formulación líquida de la invención, en uno o más recipientes. En otra realización, un kit comprende una formulación líquida de la invención, en uno o más recipientes y uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para la prevención, gestión o tratamiento de una infección por el RSV o uno o más de sus síntomas, en uno o más recipientes. Preferiblemente, el kit comprende además instrucciones para prevenir, tratar, gestionar o mejorar una infección por el RSV (por ejemplo, usando las formulaciones líquidas de la invención solas o en combinación con otro agente profiláctico o terapéutico), así como sus efectos secundarios e información de la dosificación de administración. Opcionalmente asociado con dicho(s) recipiente(s) puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, el cual aviso refleja la aprobación por dicha agencia de la fabricación uso o venta para la administración a seres humanos.
6. EJEMPLOS
6.1 Ejemplo 1 (Estudio de estabilidad).
Se preparó una formulación de anticuerpo de la presente invención que comprendía, en un vehículo acuoso, histidina 25 mM, glicina 1,6 mM, y SYNAGIS® a pH 6 de acuerdo con el siguiente protocolo:
Para un 1 kg de solución tampón: En 800 g de agua se disolvieron 3,875 g de histidina (base libre) y 0,12 g de glicina. El pH se ajustó con HCl 6N 6,0 ± 0,2. Se añadió la cantidad suficiente de agua para llevar la masa total hasta 1,0 kg.
Para la diafiltración: Después de las etapas de cromatografía en el proceso de purificación, el SYNAGIS® se concentró a la concentración deseada de 150 g/L. El producto concentrado se sometió a diafiltración. El producto formulado se diluyó a la concentración de fabricación deseada de 103 ± 3 g/L.
Para un estudio de estabilidad, se prepararon dos formulaciones: una que contenía 105 mg/ml de SYNAGIS® y otra que contenía 160 mg/ml de SYNAGIS®. La estabilidad de cada formulación se midió usando HPSEC en términos de grados de formación de agregados y fragmentación durante la conservación a 2-8ºC durante has
5 ta o 15 meses y a 38-42ºC durante hasta 1 año. Para el análisis por HPSEC, se usó típicamente, una columna TosoHaas G3000WXL con una fase móvil que contenía fosfato sódico 0,1 M y sulfato sódico 0,1 M, de pH 6.8, se usó un caudal de 0,8 ml/min. Se inyectó en la columna una muestra que contenía 250 mg de proteína en un volumen apropiado y se detectaron los picos de proteínas por UV a 280 nm y/o fluorescencia
10 (excitación a 280 nm y emisión a 340 nm). Los datos mostraron que no fue detectable un aumento en la agregación cuando cada formulación de SYNAGIS ® se conservó a 2-8ºC durante 15 meses como se muestra en la Tabla 3. Tabla 3. Agregados porcentuales durante la conservación a 2-8ºC.
Mes
% de agregados
105 mg/ml
160 mg/ml
0
0,3 0,4
5
0,3 0,3
8
0,4 -
12
0,4 -
15
0,4 0,5
Error ± 0,1%
15 Cuando estas formulaciones se conservaron a 38-42ºC durante aproximadamente 60 días se observó un aumento de 1,5% en los agregados con la formulación que contenía 105 mg/ml de SYNAG1S® y se observó un aumento de 2,0% con la formulación que contenía 160 mg/ml de SYNAGIS®.
20 6.2 Ejemplo 2 (Estudio clínico). La formulación líquida de la presente invención que comprendía 100 mg/ml de SYNAGIS® en una solución acuosa que contenía histidina 25 mM y glicina 1,6 mM a pH 6 se analizó en un estudio de seguridad y tolerabilidad en un estudio aleatorio, doble ciego, en grupos paralelos, en fase 1, en dos sitios. Los fármacos del estudio eran
25 una formulación líquida (Liq) de SYNAGIS ® y la formulación liofilizada (Lio) actualmente sometida al régimen de licencias de SYNAGIS ®. Un total de 48 voluntarios se distribuyeron al azar en uno los cuatro grupos de tratamiento siguientes:
GRUPO 1:
N=12 3 mg/kg de SYNAGIS® (Liq) en los días 0 y 30 del estudio (IM)
GRUPO 2:
N=12 3 mg/kg de SYNAGIS® (Lio) en los días 0 y 30 del estudio (IM)
GRUPO 3:
N=12 15 mg/kg de SYNAGIS® (Liq) en el día 0 del estudio (IV)
GRUPO 3:
N=12 15 mg/kg de SYNAGIS® (Lio) en el día 0 del estudio (IV)
Los signos vitales se obtuvieron antes y 30 minutos después de cada dosis del fármaco en estudio.
5 Los eventos adversos se monitorizaron durante 30 días después de la última dosis del fármaco en estudio y los eventos adversos graves se monitorizaron durante los 60 días del estudio.
A todos los voluntarios se les extrajo sangre el día 0 del estudio para establecer la concentración en suero de SYNAGIS® antes de la dosificación, al final de la de 10 infusión (solamente a los grupos de dosis con IV), y a las 0,25, 0,5, 1, 4, 8, y 12 horas después de la inyección IM o al final de la infusión. Subsiguientemente, se recogieron diariamente muestras de sangre para la determinación de los niveles de SYNAGIS® durante el día 5 del estudio y en los días 7, 14, 21, 30, 37 (solamente a los grupos de dosis con IM) y 60 del estudio. Se recogieron muestras de suero para analizar los anti15 cuerpos anti-SYNAGIS® en los días 0, 7, 14, 21, 30, 37 (solamente a los grupos con dosis IM) y 60 del estudio. Se recogieron muestras para analizar la química del suero y el recuento completo de células de la sangre (abreviadamente en lo sucesivo CBC por la expresión inglesa Complete Blood Count), recuento diferencial y recuento de plaquetas, y se recogieron muestras de orina para análisis de orina el día 0 del estudio,
20 así como 7 días después de cada dosis de SYNAGIS® (día 7 del estudio para los grupos con IV y días 7 y 37 del estudio para los grupos con IM). Los análisis de �HCG en orina se realizaron el día de la dosificación antes de cada dosis de SYNAGIS® (día 0 del estudio para los grupos con IV y días 0 y 30 del estudio para los grupos con IM). Un diagrama de flujo del estudio se representa en la Fig. 2.
25 6.2.1 Métodos del estudio.
A. Selección de los voluntarios.
Los voluntarios en este estudio serán adultos hombres o mujeres. Los voluntarios estarán aconsejados por un investigador (médico) a quien se les dirigirán las preguntas y preocupaciones de cada voluntario y asegurarán el consentimiento infor
30 mado por escrito para la participación el estudio. El consentimiento informado por escrito se obtendrá antes de realizar los métodos del estudio o la administración del fármaco de ensayo.
a. Criterios de inclusión
Los voluntarios deben satisfacer todos los siguientes criterios:
1.
1. Hombre o mujer.
2.
2. Edad 18 a 49 años en el momento de la primera dosis del fármaco en estudio.
3.
3.Peso <50kg.
4.
4. Consentimiento informado por escrito obtenido del voluntario.
5.
5. Las mujeres deben ser sexualmente activas, a no ser que sean quirúrgica-mente estériles, deben haber usado un método eficaz de evitar el embarazo (incluyendo anticonceptivos por vía oral o implantados, DIU, condón femenino, diafragma con espermicida, caperuza cervical, abstinencia, uso de un condón por el compañero sexual o compañero sexual estéril) durante 14 días antes de la primera dosis del fármaco en estudio, deben estar de acuerdo en continuar usando estas precauciones durante 30 días después de la dosis final del fármaco en estudio, y deben pasar una prueba negativa en suero 2 días antes de la primera dosis del fármaco en estudio.
6.
6. Encontrarse sanos por historial médico y examen físico.
7.
7. Ser capaces de completar un periodo de seguimiento de 60 días como es requerido por el protocolo.
b. Criterios de exclusión.
Los voluntarios no deben tener ninguno de los siguientes:
1.
1. Enfermedad aguda a comienzo del estudio.
2.
2. Fiebre > de 37,5ºC al comienzo del estudio.
3.
3. Terapia con fármacos en los 7 días antes del día 0 del estudio (excepto anticonceptivos).
4.
4. Donación de sangre en una cantidad superior a 400 mL en los 6 meses antes del comienzo del estudio.
5.
5. Haber recibido inmunoglobulina o productos sanguíneos en los 60 días antes de comenzar el estudio.
6.
6. Haber recibido una terapia con fármacos en investigación o una vacuna estándar dentro de los 120 días antes de la primera dosis del fármaco en estudio en este protocolo durante 60 días después de la dosis final del fármaco en estudio.
7.
7. Historial de inmunodeficiencia.
8.
8. Historial de enfermedad alérgica o reacciones que probablemente se han de exacerbar por cualquier componente del fármaco en estudio.
9.
9. Historial médico previo o evidencia de una enfermedad intercurrente puede comprometer la seguridad del voluntario en el estudio.
10.
10. Evidencia de infección con el virus de la hepatitis A, B o C o el VIH-1.
11.
11. Tener en una analítica (realizada dentro de los 21 días anteriores a la entrada en el estudio) cualquiera de los siguientes: CBC: Hgb < 12,0 gm/dl; recuento de glóbulos blancos (abreviadamente WBC por la expresión inglesa White Blood Count)< 4.000/mm3; recuento de plaquetas < 120.000/mm3 (o los valores normales del laboratorio); aspartato-aminotransferasa (abreviadamente en lo sucesivo AST por la expresión inglesa ASpartate aminoTransferase), alanina-aminotransferasa (abreviadamente en lo sucesivo ALT por la expresión inglesa ALanine aminoTransferase), nitrógeno de urea en sangre abreviadamente BUN por la expresión inglesa Blood Urea Nitrogen), creatinina > límite superior al normal; otros valores anormales de laboratorio en el panel de la analítica que en la opinión del investigador principal sean considerados clínicamente significativos; otros valores anormales de laboratorio en el panel de la analítica que en la opinión del investigador principal sean considerados que potencialmente confunden el análisis de los resultados del estudio.
12.
12. Tener madre enfermera.
13.
13. Historial abuso de alcohol o drogas durante los 2 años anteriores.
14.
14. Pruebas de cualquier enfermedad sistémica por examen físico.
B. Aleatorización.
a. Métodos de aleatorización de los voluntarios y asignación de los tratamientos.
En la visita de selección, los voluntarios serán evaluados por el investigador principal para determinar la elegibilidad para entrar en el estudio. Se mantendrá un registro principal para todos los voluntarios seleccionados. Los voluntarios que firmen un consentimiento informado y que satisfagan los criterios de elegibilidad entrarán en el estudio. Cuando un voluntario llegue al estudio para la aleatorización (día 0 del estudio), el investigador confirmará que el voluntario satisface todos los criterios de inclusión y exclusión. El investigador asignará al paciente un número de identificación (abreviadamente PID por la expresión inglesa patient identification number). Los números de identificación de los pacientes serán asignados secuencialmente dentro de cada uno de los dos sitios en los que se realiza el estudio, empezando por el nº 101 en el sitio 1 y por el nº 201 en el sitio 2. Se considerará que los voluntarios han entrado en el estudio cuando se le haya asignado el PID. Una lista de aleatorización proporcionada al farmacéutico del estudio, en cada sitio del estudio, contendrá las asignaciones a cada uno de los cuatro grupos de tratamiento para los voluntarios de ese sitio. El investigador notificará a Medlmmune por transmisión facsímil (fax) al nº 301-527-4217 de EE.UU, que un voluntario ha sido aleatorizado. Los voluntarios a los que les ha sido asignado un PID y no reciben ninguno de los fármacos del estudio, los que reciben una infusión incompleta del fármaco del estudio, los que no reciben ambas inyecciones IM del fármaco en estudio o los que no completan al menos 50% de las visitas del estudio pueden ser reemplazados a discreción por el patrocinador. Los voluntarios que se retiran debido a un efecto adverso o cuyo estatus no puede ser determinado no serán reemplazados. Los voluntarios que retiren el consentimiento por razones distintas de un efecto adverso pueden ser reemplazados. A los voluntarios del reemplazo se les asignará un nuevo PID. Los voluntarios que son remplazados confirmarán que continuarán el seguimiento por seguridad de acuerdo con el protocolo.
a. Ceguera del estudio.
Este es un estudio doble ciego. El carácter ciego se mantendrá por asignación de los voluntarios a la formulación liofilizada o líquida dentro de los grupos IM o
IV. Para mantener el carácter ciego del ensayo durante la administración de las dos formulaciones de SYNAGIS®, el farmacéutico del estudio en cada sitio preparará el fármaco en estudio en un lugar separado físicamente de la estación de tratamiento y protegido de la observación por el investigador principal o cualquier personal del estudio implicado directamente en la realización del estudio. Para la inyección IM, el farmacéutico preparará jeringas de 5 mL que parezcan idénticas que contengan el volumen calculado de SYNAGIS® liquido o liofilizado reconstituido. Para la infusión IV, el farmacéutico preparará bolsas de infusión de 200 mL que parezcan idénticas que contengan el volumen calculado de SYNAGIS® liquido o liofilizado reconstituido. Las etiquetas no identificarán si la jeringa/bolsa contiene SYNAGIS® liquido o liofilizado re-constituido. Un monitor independiente que revisará el registro de farmacia solamente, el director de estadística y suministro de MedImmune y el farmacéutico del estudio son las únicas personas que tendrán acceso a la lista de aleatorización que identifica la asignación del tratamiento del estudio a los voluntarios. Estas personas no deben revelar la información de aleatorización a nadie. En el caso de que el tratamiento del estudio para un voluntario llegue a ser conocido por el investigador, éste lo debe notificar inmediatamente a Medlmmune. En todos los caso la falta de ceguera será documentada en el informe del estudio.
C. Estudio de fármacos.
a. Suministro y responsabilidad de los fármacos del estudio.
El patrocinador proporcionará al investigador cantidades adecuadas SYNAGIS® líquido, SYNAGIS®, liofilizado y diluyente (agua estéril para inyección). El fármaco del estudio debe ser conservado a 2ºC a 8ºC (36ºF a 46ºF) y no debe ser congelado.
5 El SYNAGIS® líquido se proporcionará en viales de 3 mL que contengan 100 mg de producto líquido estéril en un volumen de 1 mL (histidina 25 mM, glicina 1,6 a pH 6,0).
El SYNAGIS ® liofilizado se proporcionará en viales de 5 mL que contengan 100 mg de producto liofilizado estéril que cuando se formuló (antes de la liofilización) 10 contenía histidina 25 mM, glicina 1,6 mM, y manitol al 3% (p/v) a pH 6,0.
Al farmacéutico del estudio se le requiere que mantenga precisos los registros de contabilidad del fármaco. Al finalizar el estudio serán devueltos al patrocinador, todos los registros del fármaco sobrante. También serán devueltos al patrocinador todo el fármaco del estudio que no se haya utilizado.
15 c. Regímenes de tratamiento.
En el estudio se emplearan los regímenes siguientes:
GRUPO 1:
N=12 3 mg/kg de SYNAGIS® (Liq) en los días 0 y 30 del estudio (IM)
GRUPO 2:
N=12 3 mg/kg de SYNAGIS® (Lyo) en los días 0 y 30 del estudio (IM)
GRUPO 3:
N=12 15 mg/kg de SYNAGIS® (Liq) en el día 0 del estudio (IV)
GRUPO 4:
N=12 15 mg/kg de SYNAGIS ® (Lyo) en el día 0 del estudio (IV)
e. Petición y preparación del fármaco del estudio.
La dosis del fármaco del estudio para la administración debe ser preparada
20 por el farmacéutico del estudio. El formulario de la prescripción del fármaco del estudio que indica el PID y el peso corporal del voluntario será enviado al farmacéutico por el investigador (o persona designada por éste). El farmacéutico del estudio usará esta información para preparar el fármaco del estudio. Para preparar el SYNAGIS® líquido o liofilizado para la administración, el far
25 macéutico eliminará la porción de lengüeta de la cápsula del vial y limpiará el tapón de caucho con etanol al 70% o equivalente. El vial debe estar ventilado. Las dosis para cada voluntario se calculará como se describe más adelante basándose en el peso de voluntario (con una aproximación de 0,1 kilogramo) el día que se administra el SYNAGIS®. La dosis debe ser redondeada lo más próximo a 0,1 mL. Todas las preparacio
30 nes del fármaco del estudio deben ser administradas dentro de 6 horas después la introducción del vial de SYNAGIS®. Si no se administra dentro de las 6 horas se debe usar un nuevo vial o viales.
Preparación de SYNAGIS® líquido.
1.
(1) Para inyecciones IM: El volumen requerido de SYNAGIS® líquido (100 mg/mL) se obtendrá reuniendo el contenido de tantos viales como sean necesarios con una jeringa de 5 mL.
2.
Dosis (mL) = [peso del voluntario (kg) x nivel de dosis (3 mg/kg)] / Concentración de fármaco (100 mg/mL)
3.
Ejemplo: Un voluntario que pesa 75,6 kg recibe 2,3 mL de SYNAGIS®.
4. (75,6 kg x 3 mg/kg)/100 mg/mL = 2,268 mL (redondeada a 2,3 mL)
5.
(2) Para infusiones IV: El volumen requerido de SYNAGIS® líquido (100 mg/mL) se obtendrá reuniendo el contenido de tantos viales como sean necesarios con una jeringa de 20 mL (o mayor).
6.
Dosis (mL) = [Peso del voluntario (kg) x Nivel de dosis (15 mg/kg)] / Concentración de fármaco (100 mg/mL).
7.
Este volumen de SYNAGIS® líquido será inyectado en una bolsa de infusión vacía de 200 mL y diluido 1:4 con diluyente añadiendo a la bolsa cuatro volúmenes de diluyente para una concentración final de 20 mg/mL de SYNAGIS®.
8.
Ejemplo: Un voluntario que pesa 71,4 kg recibe 10,7 mL de SYNAGIS®.
9.
[(71,4 kg x 15 mg/kg) / 100 mg/mL = 10,71 mL (redondeada a 10,7 mL)]
10.
y 42,8 mL de diluyente (4 x 10,7) para un volumen total de infusión de 53,5 mL.
Preparación de SYNAGIS® liofilizado
1. (1) Para inyecciones IM: Se debe añadir un (1) ml de diluyente lentamente al vial de SYNAGIS® liofilizado para una concentración final de 100 mg/mL de SYNAGIS®. El vial debe ser agitado suavemente durante 30 segundos para evitar la formación de espuma. El SYNAGIS® reconstituido debe reposar a temperatura ambiente durante un mínimo de 20 minutos hasta que el SYNAGIS® se clarifique. El volumen requerido de SYNAGIS® liofilizado reconstituido (100 mg/mL) se obtendrá reuniendo los contenidos de tantos viales como sea necesario con una jeringa de 5 mL.
2.
Dosis (mL) = [Peso del voluntario (kg) x Nivel de dosis (3 mg/kg)] / Concentración de fármaco (100 mg/mL)
3.
Ejemplo: Un voluntario que pesa 75,6 kg recibe 2,3 mL de SYNAGIS®.
4. (75,6 kg x 3 mg/kg)/ 100 mg/mL = 2,268 mL (redondeada 2,3 mL)
5.
(2) Para infusiones IV: Se deben añadir (5) ml de diluyente lentamente al vial de SYNAGIS® liofilizado para una concentración final de 20 mg/mL de SYNAGIS®. El vial debe ser removido suavemente durante 30 segundos para evitar la formación de espuma. El SYNAGIS reconstituido debe reposar a temperatura ambiente durante un mínimo de 20 minutos hasta que el SYNAGIS® se clarifique. El volumen requerido de SYNAGIS® liofilizado reconstituido (20 mg/mL) se obtendrá reuniendo los contenidos de tantos viales como sea necesario con una jeringa de 20 mL (o más grande) e inyectando este volumen en una bolsa de infusión vacía de 200 mL.
6.
Dosis (mL) = [Peso del voluntario (kg) x Nivel de dosis (15 mg/kg)] / Concentración de fármaco (20 mg/mL)].
7.
Ejemplo: Un voluntario que pesa 71,4 kg recibe 53,6 mL de SYNAGIS
8.
(71,4 kg x 15 mg/kg) / 20 mg/ml = 53,55 mL (redondeada to 53,6 mL).
d. Administración del fármaco del estudio,
El fármaco del estudio para los grupos de tratamiento IM y IV será dispensado por la farmacia en jeringas de 5 mL aparentemente idénticas y bolsas de infusión de 200 mL aparentemente idénticas, respectivamente.
Inyección IM
El fármaco del estudio se administrará por inyección IM en el músculo deltoide (después de confirmar que la aguja no está en un vaso sanguíneo) usando una técnica aséptica estándar. Los voluntarios permanecerán en observación en el sitio del estudio durante al menos 30 minutos después de la inyección.
Infusión IV
Antes de la administración del fármaco, se colocará un catéter IV en una vena accesible usando técnicas de inserción estándares. La persistencia del catéter IV se mantendrá mediante una infusión IV continua de dextrosa al 5% para inyección USP a un caudal de 10 a 25 mL/h. La infusión de dextrosa se interrumpirá, y se infundirá SYNAGIS® a través de un filtro de 0,22 µm de baja unión a proteína a un caudal de aproximadamente 1-2 mL/minuto. Después de que se haya administrado el SYNAGIS®, el tubo de debe ser lavado por arrastre y mantenido abierto con dextrosa al 5% para inyección USP a 10 a 25 mL/h hasta que se retira el catéter para la IV.
e. Medicaciones concomitantes
Se registrarán todas las medicaciones concomitantes usadas por el voluntario desde el día del estudio 0 hasta el día 60 en el formulario del informe del caso. Los voluntarios no deben recibir lo siguiente:
1.
Medicación inmunosupresora (se permiten corticosteroides inhalados y por vía tópica).
2.
Agentes en curso de investigación desde 120 días antes de la entrada en el estudio hasta el día 60 del estudio.
El patrocinador debe ser notificado si un voluntario recibe medicaciones concomitantes prohibidas. Los voluntarios pueden recibir medicaciones para tratar eventos adversos si es considerado necesario por el investigador o por el médico del voluntario.
D. Programa de evaluaciones de los voluntarios.
Todos los voluntarios que tienen asignado un PID y reciben un fármaco del estudio serán seguidos de acuerdo con el protocolo independientemente del número de dosis recibidas del fármaco del estudio, a menos que se ha haya retirado el consentimiento para el seguimiento. El patrocinador debe ser notificado de todas las desviaciones de las visitas protocolarias o evaluaciones y estas evaluaciones, si es aplicable, deben ser reprogramadas o realizadas en el momento más pronto posible respecto al programa original.
Los voluntarios serán informados de que pueden llamar al personal del estudio para comunicarles cualquier anormalidad durante los intervalos entre las visitas del estudio y desplazarse al sitio del estudio si necesitan evaluación médica y la urgencia de la situación lo permite. Para las visitas de emergencia y otras no programadas a una instalación médica distinta del sitio del estudio se obtendrán registros médicos por el investigador. En la Tabla 4 se presenta un programa de selección de selección y visitas en el estudio seguido por una descripción detallada de cada visita.
Análisis
Día del estudio
0
1 2 3 4 5 7 14 21 30 37 60
Consentimiento informado por escrito
x
Verificación de los criterios de elegibilidad
x x
Historial médico
x
Examen físico
x
Altura y peso corporalg
x x xd
Análisis de orina
x x x xd
Hepatitis A, B, C.
x
�HCGb en suero
x
�HCGb en orina
x xd
Química del sueroc
x x x xd
CBC con recuento diferencial y de plaquetas
x x x xd
Nivel en suero de SYNAGIS®
xa x x x x x x x x x xd x
Anticuerpo anti-SYNAGIS®
x x x x x xd x
Signos vitalese
x xd
Aleatorización/Asignación de PID
x
Inyección del fármaco del estudio (Grupos IM)
x xd
Infusión de fármacos del estudio (Grupos IV)
x
Determinación de efectosf
x x x x x x x x x x xd x
a. Se tomaran muestras de la sangre para determinar la concentración de SYNAGIS® en suero antes de la dosificación y al final de la infusión (solamente los grupos de dosis IV) y a las 0,25, 0,5, 1, 4, 8 y 12 horas del final de la inyección/infusión. b. Solo hembras. c. ALT, AST, BUN, creatinina. d. Solamente los grupos de dosis IM. e. Signos vitales obtenidos antes y 30 minutos después de cada dosis. f. Eventos adversos durante los 30 días después de cada dosis. Eventos adversos graves en el día 60 del estudio. g. Peso corporal solamente en el día 30 del estudio

das 21 días antes de la entrada en el estudio (día 0 del estudio). Las evaluaciones de
a. Análisis
Nota: Todas la determinaciones del laboratorio de análisis deben ser realiza
loa análisis deben llevarse a cabo en más de una visita.
1.
Consentimiento escrito informado.
2.
Verificación de los criterios de elegibilidad,
3.
Análisis de los historiales médicos.
4.
Examen físico de los análisis.
5.
Altura y peso corporal.
6.
Análisis de orina.
o Recogida de sangre para el análisis.
o Suero para anticuerpo de la hepatitis A, antígeno de superficie de la hepatitis B, anticuerpo de la hepatitis C.
o �HCG en suero (sólo las mujeres voluntarias).
o Panel de química (AST, ALT, BUN, creatinina)
o CBC con recuento diferencial y de plaquetas Día 0 del estudio: Dosis 1 Visita 1
1.
Verificación de los criterios de elegibilidad,
2.
Altura y peso corporal.
3.
Análisis de orina.
4.
�HCG en orina (solo las mujeres voluntarias).
5.
Recogida de sangre en la línea base.
o Panel de química (AST, ALT, BUN, creatinina).
o CBC con recuento diferencial y de plaquetas.
o Suero para nivel de SYNAGIS®.
o Suero para anticuerpo anti-SYNAGIS®.
6. Aleatorización y asignación de los PID.
7. Signos vitales antes de la administración del fármaco del estudio (temperatura, presión sanguínea, frecuencia del pulso, frecuencia respiratoria). Nota: Todos los parámetros anteriores deben ser completados antes de la administración del fármaco del estudio.
1.
Administración del fármaco del estudio.
2.
Monitorización de signos vitales 30 minutos después de la inyección o al final de la infusión.
3.
Monitorización de efectos adversos y efectos adversos graves.
4.
Recogida de sangre después de la dosis,
o Suero para los niveles de SYNAGIS® inmediatamente después de completarse la infusión (solamente para grupos con dosis IV) y a las 0,25, 0,5, 1, 4, 8, y 12 horas de la inyección/final de la infusión.
Día 1 del estudio: Muestreo farmacocinético de la dosis 1 Visita 2
1. Recogida de sangre después de la dosis para determinar el nivel de SYNAGIS® en suero a las 24 horas.
2. Monitorización de los eventos adversos y los eventos adversos graves. Día 2 del estudio 2: Muestreo farmacocinético de la dosis 1 Visita 3
1. Recogida de sangre después de la dosis para determinar el nivel de SYNAGIS® en suero a las 48 horas.
2. Monitorización de los eventos adversos y los eventos adversos graves Día 3 del estudio: Muestreo farmacocinético de la dosis 1 Visita 4
1.
Recogida de sangre después de la dosis para determinar el nivel de SYNAGIS® en suero a las 72 horas.
2.
Monitorización de los eventos adversos y los eventos adversos graves.
Día 4 del estudio: Muestreo farmacocinético de la dosis 1 Visita 5
1. Recogida de sangre después de la dosis para determinar el nivel de SYNAGIS® en suero a las 96 horas.
2. Monitorización de los eventos adversos y los eventos adversos graves. Día 5 del estudio: Muestreo farmacocinético de la dosis 1 Visita 6
1. Recogida de sangre después de la dosis para determinar el nivel de SYNAGIS® en suero a las 120 horas.
3. Monitorización de los eventos adversos y los eventos adversos graves Día 7 del estudio: Visita 7
1.
Análisis de orina.
2.
Recogida de sangre.
o Panel de química (AST, ALT, BUN, creatinina).
o CBC con recuento diferencial y de plaquetas.
o Suero para determinar el nivel de SYNAGIS®.
o Suero para determinar el anticuerpo anti-SYNAGIS®.
3. Monitorización de eventos adversos y eventos adversos graves. Día 14±1 del estudio: Visita 8
o Recogida de sangre
o Suero para determinar el nivel de SYNAGIS®.
o Suero para determinar el anticuerpo anti-SYNAGIS®.
o Monitorización de eventos adversos y eventos adversos graves. Día 21±1 del estudio: Visita 9
o Recogida de sangre
o Suero para determinar el nivel de SYNAGIS®.
o Suero para determinar el anticuerpo anti-SYNAGIS®.
o Monitorización de eventos adversos y eventos adversos graves. Visita 10 Todos los voluntarios.
o Recogida de sangre.
o Suero determinar el para nivel de SYNAGIS®.
o Suero para determinar el anticuerpo anti SYNAGIS®.
o Monitorización de eventos adversos y eventos adversos graves. Solamente los voluntarios de los grupos IM.
3.
Peso corporal.
4.
�HCG en orina.
5.
Signos vitales antes de la administración del fármaco del estudio,
6.
Administración del fármaco del estudio,
7.
Monitorización de los signos vitales 30 minutos después de la inyección.
Día 37±1 del estudio: Visita 11
Solamente los voluntarios de los grupos con IM.
1.
Análisis de orina.
2.
Recogida de sangre. Panel de química (AST, ALT, BUN, creatinina)
o CBC con recuento diferencial y de plaquetas
o Suero para determinar el nivel de SYNAGIS®.
o Suero para determinar el anticuerpo anti-SYNAGIS®
3. Monitorización de eventos adversos y eventos adversos graves. Día 60±2 del estudio: Visita 12
1. Recogida de sangre.
o Suero para determinar el nivel de SYNAGIS®.
o Suero para determinar el anticuerpo de SYNAGIS®.
2. Monitorización para eventos adversos graves.
E. Métodos de evaluación de los voluntarios.
a. Evaluaciones habituales de laboratorio.
Se realizarán los ensayos habituales de laboratorio durante los análisis y durante el estudio en cada uno de los laboratorios clínicos locales de los sitios del estudio. Las pruebas de embarazo en orina durante el estudio se realizaran en el sitio del estudio usando una prueba bajo régimen de licencia. Los resultados anormales de laboratorio deben repetirse tan pronto como sea posible (preferiblemente dentro de 2448 horas).
b. Evaluaciones farmacocinéticas e inmunológicas.
La concentración en suero de SYNAGIS® y anticuerpos anti-SYNAGIS® serán medidas por Medlmmune, Inc, mediante ELISA.
F. Finalización del estudio y abandono del seguimiento.
Se considerará que los voluntarios han completado el estudio si continuaron en el estudio hasta el día 60 del estudio. En el formulario del informe del caso debe especificarse si el voluntario completó o no el seguimiento del estudio hasta el día 60 del estudio. Se considerará que los voluntarios abandonaron el seguimiento solamente si no se hubiera establecido contacto en el momento que se ha completado el estudio de tal modo que haya una información insuficiente para determinar el estatus del voluntario el día 60 del estudio. El investigador debe documentar los intentos de re-establecer el contacto con los voluntarios que faltan durante el periodo de estudio. Si se re-establece el contacto con un voluntario que falta, se reanuda el seguimiento de acuerdo con el protocolo. Se realizarán evaluaciones farmacocinéticas e inmunológicas basándose en la concentración en suero de SYNAGIS® y anticuerpos anti-SYNAGIS® medidas por ELISA.
Equivalentes
Los expertos en la técnica reconocerán o serán capaces de determinar usando una o más de experimentación habitual, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descrita en la presente memoria. Se pretende que dichos equivalentes estén abarcados por las reivindicaciones anexas.
La cita o estudio de una referencia en la presente memoria no ha de ser considerada como una admisión de que constituye técnica anterior de la presente invención.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> Medlmmune, Inc,
<120> FORMULACIONES DE ANTICUERPO ANTI-RSV ESTABILIZADAS
<130> 10271-026-228
<140>
<141>
<150> 60/388.921
<151> 14-06-2002
<160> 6
<170> Versión Patentln 3.1
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Thr Ser Gly Met Ser Val Gly
15
<210> 2 <211>16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 510 15 <210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val
15 10 <210>4
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Lys Cys Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met His
15 10 <210>5
<211> 7
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 5
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
15
<210> 6 <211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
15

Claims (45)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una formulación de palivizumab acuosa y estable que comprende, en un vehículo acuoso: (a) al menos 65 mg/ml de palivizumab o uno de sus fragmentos de unión a sus antígenos; (b) histidina 10 mM a 50 mM; y (c) menos de glicina 3 mM, en donde dicho palivizumab o fragmento que se une a antígenos de palivizumab de la formulación es estable 38ºC-42ºC, durante al menos 60 días, según se determina por cromatografía de exclusión por tamaños de alta resolución (HPSEC).
  2. 2.
    La formulación de la reivindicación 1, en donde dicho palivizumab o fragmento que se une a antígenos de palivizumab está una concentración de al menos 70 mg/ml, al menos 75 mg/ml, al menos 80 mg/ml, al menos 85 mg/ml o al menos 90 mg/ml.
  3. 3.
    La formulación de la reivindicación 1, en donde dicho palivizumab o fragmento que se une a antígenos de palivizumab, está a una concentración de al menos 80 mg/ml.
  4. 4.
    La formulación de la reivindicación 2, en donde dicho palivizumab o fragmento que se une a antígenos de palivizumab está a una concentración de al menos 80 mg/ml.
  5. 5.
    La formulación de cualquier reivindicación precedente, sustancialmente exenta de tensioactivos y sales inorgánicas.
  6. 6.
    La formulación de cualquier reivindicación precedente, en donde dicha formulación está sustancialmente exenta de otros excipientes.
  7. 7.
    La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha formulación comprende además un excipiente distinto de un tensioactivo.
  8. 8.
    La formulación de la reivindicación 1, en donde la glicina está a una concentración de menos de 2 mM.
  9. 9.
    La formulación de cualquier reivindicación precedente, en donde la formulación no comprende manitol.
  10. 10.
    La formulación de cualquier reivindicación precedente, en donde la histidina está a una concentración de aproximadamente 25 mM y la glicina está a una concentración de 1,6 mM.
  11. 11.
    La formulación de la reivindicación 7, en donde el excipiente es un sacárido.
  12. 12. La formulación de la reivindicación 11, en donde el sacárido es sacarosa.
  13. 13.
    La formulación de la reivindicación 7, en donde el excipiente es un poliol distinto del manitol.
  14. 14. La formulación de la reivindicación 13, en donde el poliol es polisorbato.
  15. 15.
    La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha formulación tiene un pH de entre aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,0.
  16. 16.
    La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde dicha formulación tiene un pH de entre aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5.
  17. 17.
    La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde la formulación tiene un pH de aproximadamente 6,0.
  18. 18.
    La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho palivizumab o fragmento que se une a antígenos de palivizumab está a una concentración de al menos 100 mg/ml.
  19. 19.
    La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde dicho palivizumab o fragmento que se une a antígenos de palivizumab está a una concentración de al menos 125 mg/ml o al menos 150 mg/ml.
  20. 20.
    La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho palivizumab o fragmento que se une a antígenos de palivizumab es estable a aproximadamente la temperatura ambiente durante al menos 1 año según se determina por HPSEC.
  21. 21.
    La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho palivizumab o fragmento que se une a antígenos de palivizumab es estable a 4ºC durante al menos 3 años según se determina por HPSEC.
  22. 22.
    La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde menos de 2% de dicho palivizumab o fragmento que se une a antígenos de palivizumab forma un agregado según se mide por HPSEC.
  23. 23.
    La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el vehículo acuoso es agua destilada.
  24. 24.
    La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formulación es estéril.
  25. 25.
    La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones, en donde la formulación es homogénea.
  26. 26.
    La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones, en donde dicho palivizumab o fragmento que se une a antígenos de palivizumab está conjugado con un resto terapéutico.
  27. 27.
    La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-25, en donde dicho palivizumab o fragmento que se une a antígenos de palivizumab está conjugado con un agente detectable.
  28. 28.
    Una forma farmacéutica de dosificación unitaria que comprende la formulación de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, la cual forma farmacéutica es adecuada para administración a un ser humano y está en un recipiente adecuado.
  29. 29.
    La forma farmacéutica de dosificación unitaria de la reivindicación 28, en donde la formulación es adecuada para administración parenteral a un ser humano.
  30. 30.
    La forma farmacéutica de dosificación unitaria de la reivindicación 28, en donde la formulación es adecuada para administración subcutánea, intravenosa, intramuscular o intranasal.
  31. 31.
    La forma farmacéutica de dosificación unitaria de la reivindicación 28, en donde la formulación es adecuada para administración por aerosol a un ser humano y está en un recipiente adecuado.
  32. 32.
    Un recipiente herméticamente cerrado que comprende la formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-27.
  33. 33.
    La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-26, para uso en la prevención de una infección por el virus sincitial respiratorio (RSV) o uno de sus síntomas en un sujeto.
  34. 34.
    La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-26 para uso en el tratamiento de una infección por el RSV o uno de sus síntomas en un sujeto.
  35. 35.
    La formulación de la reivindicación 27, para uso en el diagnóstico de una infección por el RSV.
  36. 36.
    La formulación de la reivindicación 27, para uso en el diagnóstico de una infección por el RSV en un sujeto.
  37. 37.
    La formulación de la reivindicación 33, 34 o 36, en donde el sujeto es un ser humano.
  38. 38.
    Uso de la formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-26, en la fabricación de un medicamento para uso en la prevención de una infección por el RSV o uno de sus síntomas en un sujeto.
  39. 39.
    Uso de la formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-26, en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de una infección por el RSV o uno de sus síntomas en un sujeto.
  40. 40.
    Uso de la formulación de la reivindicación 27, en la fabricación de un medicamento para uso en el diagnóstico de una infección por el RSV.
  41. 41.
    Uso de la formulación de la reivindicación 27, en la fabricación de un medicamento para uso en el diagnóstico de una infección por el RSV en un sujeto,
  42. 42.
    El uso de la formulación de la reivindicación 33, 39 o 41, en donde el sujeto es un ser humano.
    5 43. La formulación de la reivindicación 33 o 34, en donde el sujeto es un niño, un niño nacido prematuramente, un anciano, un ser humano con fibrosis quística, displasia broncopulmonar, enfermedad cardiaca congénita, inmunodeficiencia congénita
    o adquirida o un ser humano que ha tenido una trasplante de médula ósea.
  43. 44. Uso de la formulación de la reivindicación 38 o 39, en donde en donde el
    10 sujeto es un bebé, un bebé nacido prematuramente, un anciano, un ser humano con fibrosis quística, displasia broncopulmonar, enfermedad cardiaca congénita, inmunodeficiencia congénita o adquirida o un ser humano que ha tenido una trasplante de médula ósea.
  44. 45. La formulación de la reivindicación 33, para uso en la prevención de una 15 infección por el RSV o uno de sus síntomas antes de, o durante, la estación del RSV.
  45. 46. La formulación de la reivindicación 34, para uso en el tratamiento de una infección por el RSV o un de sus síntomas antes de, o durante, la estación del RSV.
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