ES2342449T3 - Profilacticos/medicamentos para la infeccion, agentes anti-endotoxinas, adyuvantes de vacunas y estimuladores del crecimiento. - Google Patents

Abstract

Uso de un extracto derivado de caña de azúcar para la preparación de un agente para el tratamiento de una enfermedad o afección ocasionada por una infección bacteriana en humanos o animales, en el que el extracto derivado de caña de azúcar es una fracción obtenida al hacer pasar un material de partida seleccionado del grupo que comprende jugo de caña de azúcar, un extracto líquido a partir de caña de azúcar y melazas derivadas de caña de azúcar, a través de una columna empacada con un adsorbente sintético como portador fijo y fluir las sustancias adsorbidas en el adsorbente sintético con un disolvente seleccionado del grupo que comprende agua, metanol, etanol y mezclas de los mismos o una fracción que absorbe luz a una longitud de onda de 420 nm obtenible mediante tratamiento en una columna cromatográfica que utiliza diferencias de afinidad para una resina de intercambio iónico empacada en una columna como portador fijo.

Description

Profilácticos/medicamentos para la infección, agentes anti-endotoxinas, adyuvantes de vacunas y estimuladores del crecimiento.

Antecedentes de la invención Sector de la invención

La presente invención se refiere al uso de un extracto derivado de caña de azúcar para preparar un agente para el tratamiento de una enfermedad o afección ocasionada por una infección bacteriana en humanos o animales.

La presente invención se refiere al uso de un extracto derivado de caña de azúcar para preparar un agente para el tratamiento de una enfermedad o afección ocasionada por endotoxina en humanos o animales.

La presente invención se refiere al uso de un extracto derivado de caña de azúcar para preparar un agente para el tratamiento de una enfermedad o afección ocasionada por infección fúngica, de micoplasma, rickettsia o clamidia en humanos y animales.

La presente invención se refiere al uso de un extracto derivado de caña de azúcar para preparar un agente para el tratamiento de una enfermedad o afección ocasionada por una infección viral en humanos o animales.

La presente invención se refiere al uso de un extracto derivado de caña de azúcar para preparar un agente para estimular el crecimiento.

La presente invención se refiere al uso de un extracto derivado de caña de azúcar como adyuvante en la preparación de una composición de vacuna.

La presente invención se refiere a una composición de vacuna que comprende un antígeno y un extracto derivado de caña de azúcar.

Descripción de la técnica anterior

Se ha considerado recientemente, que varias enfermedades o numerosas enfermedades infecciosas del hombre y los animales están ocasionadas por funciones inmunológicas debilitadas, o una insuficiencia de las funciones inmunológicas. En el hombre, por ejemplo, las funciones inmunológicas se debilitan o se hacen insuficientes por el asma bronquial, enfermedad alérgica, reumatismo articular, enfermedad autoinmune, lesión nutricional, operaciones quirúrgicas, envejecimiento, cáncer, transplante de órganos o concepción, lo que resulta en la concurrencia de enfermedades infecciosas tales como enfermedades infecciosas de los órganos respiratorios, septicemia y enfermedades infecciosas de los tractos urinarios. Para tratar estas enfermedades y enfermedades infecciosas se administran muchos tipos de antibióticos. Sin embargo, cuando el antibiótico se administra de forma continuada, su eficacia se vuelve más débil debido al desarrollo de bacterias resistentes, lo que lleva a un problema, divulgado recientemente, de infección hospitalaria. Por tanto, se desea no depender sólo de antibióticos, sino desarrollar medicamentos o alimentos que hagan cumplir las funciones inmunológicas por sí mismas para, de esta manera, prevenir o tratar la infección y disminuir la dosificación de los antibióticos.

En la industria ganadera y pesquera, se lleva a cabo la cría a gran escala o por superpoblación para producir animales domésticos, aves de corral o peces de cultivo de manera eficiente. Este ambiente de producción ocasiona estrés en los animales, así como insuficiencia inmune en la edad temprana de los animales, lo que lleva con frecuencia a varios tipos de enfermedades infecciosas. Como contramedida de esta situación, se administran elevadas dosis de antibióticos a los animales para tratar o prevenir enfermedades. Sin embargo, dichas altas dosis de antibióticos requieren, por otra parte, administrar más tipos u otros tipos de antibióticos con el fin de hacer frente a problemas de antibióticos residuales, incremento de bacterias resistentes y enfermedades ocasionadas por bacterias resistentes.

De forma general, los medicamentos profilácticos o terapéuticos conocidos comprenden un componente único o una pluralidad de componentes que poseen estructuras similares como ingrediente activo, que se prepara o preparan mediante la extracción, condensación o síntesis de los componentes. Por consiguiente, se considera que una dosis de larga duración o una dosis elevada del medicamento profiláctico o terapéutico ocasiona efectos secundarios.

Se han encontrado sustancias que activan la inmunidad para prevenir de ese modo infecciones, tales como algunas de Bacillus subtilis, Lactobacillus bifidus y Clostridium. Se ha dado a conocer el efecto de activación de la inmunidad, o el efecto profiláctico de infecciones de las siguientes sustancias: albúmina de huevo (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H3-251573), una mezcla de dos o más seleccionadas entre albúmina de huevo, bacteria y ajo (Publicación Nacional de la Traducción de la Solicitud de Patente Internacional No. H8-509211), una o más seleccionadas entre Rosa roxburghii, altamisa y col y una mezcla de éstas (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H6-116158), y componente de Glycyrrhiza (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H9-143-85).

Se conoce que el bagazo se puede usar como medio de cultivo para hongos tales como setas shiitake, Fomes japonicus, setas de paja, almez y setas. Se ha dado a conocer asimismo un agente antiviral cuyo ingrediente activo es un extracto de basidiomicetos (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H2-286623, Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H4-66536) y una sustancia antiviral obtenida por fraccionamiento y purificación de un extracto acuoso a partir de sustancias cultivadas obtenidas al cultivar la seta shiitake en un medio que contiene bagazo y salvado de arroz (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública
No. H5-4929).

La solicitud de patente internacional WO 98/02041 da a conocer composiciones terapéuticas derivadas de la caña de azúcar y menciona que estas composiciones son útiles para tratar una variedad de afecciones patológicas, incluyendo aquellas ocasionadas por inflamación; infección bacteriana, viral o fúngica; toxinas; traumas tales como quemaduras; y otras causas.

Se conoce un agente antiviral que comprende como ingrediente activo polisacáridos y citoquininas generadas por basidiomicetos cultivados sobre bagazo como medio (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S55-157517). Sin embargo, el mismo inventor presentó después otra solicitud de patente sobre un agente antiviral de animales que comprendía en esencia tanto polisacáridos como lignina soluble en agua como ingredientes activos, que se preparan sometiendo el bagazo a actividad enzimática o hirviendo el bagazo, seguido por extracción (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S57-106624). Sin embargo, los datos sobre un agente que comprende, como ingrediente activo, polisacáridos con un peso molecular de 10.000 a 50.000 y lignina soluble en agua con un peso molecular de 50.000 a 100.000 preparada sometiendo al bagazo a actividad enzimática y extrayéndola, son los mismos que los datos descritos en la mencionada Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S55-157517. No se han dado a conocer datos de ninguna prueba antiviral sobre los componentes extraídos por hervir y extraer el bagazo. (Debe notarse que la descripción en el resumen sobre el hervor y la extracción fue suprimida más adelante en un procedimiento de invalidación por recurso). Por lo tanto, los contenidos de la Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S57-106624 son sustancialmente los mismos y nada más que los de la Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S55-157517. Como se resumió anteriormente, se conoce que los hongos que contienen basidiomicetos como las setas shiitake y Fomes japonicus son fisiológicamente activos y se usan generalmente en alimentos saludables. Se conoce que algunos de los extractos de este bagazo cultivado con hongos poseen efectos antivirales. Para extraerlos, son necesarios los micelios de basidiomicetos, hongos, o enzimas producidos de esta manera.

Como ya se describió anteriormente, cuando tienen lugar enfermedades infecciosas, especialmente aquellas ocasionadas por bacterias, generalmente se administran antibióticos. En estos casos, especialmente en los que se administran los antibióticos cuando las bacterias causales han proliferado por encima de determinado nivel, todas las bacterias mueren al mismo tiempo, y las endotoxinas presentes en las bacterias se mueven hacia un huésped, lo cual puede ocasionar un choque de endotoxinas en el huésped. Además de este movimiento repentino de la endotoxina en la sangre ocasionado por los antibióticos, las bacterias o la endotoxina de éstas pueden circular en la sangre para ocasionar septicemia o choque de septicemia.

Para prevenir o tratar estas enfermedades ocasionadas por endotoxinas, se han dado a conocer algunos agentes anti-endotoxinas: un método de uso de un anticuerpo como agente anti-endotoxina para remediar enfermedades ocasionadas por endotoxina (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S61-500355, Publicación Nacional de la Traducción de la Solicitud de Patente Internacional No. H4-506447, Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H2-104534, Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H2-134329, Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H6-62844, y la Publicación Nacional de la Traducción de la Solicitud de Patente Internacional No. H6-501931), un método de uso de hirudina, que es un inhibidor de la trombina (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública, No. H6-165691), un método de uso de proteína C reactiva desnaturalizada (Publicación Nacional de la Traducción de la Solicitud de Patente Internacional No. H7-501545), un método de uso de derivados de 1,4-tiazina (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S63-301876), un método de uso de derivados heterocíclicos (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H3-240779), un método de uso de un agente anti-endotoxina que comprende taurina como ingrediente activo (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H10-158158), un método de uso de un compuesto novedoso (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública
No. H5-194470).

Recientemente, los adyuvantes de vacunas han atraído la atención como aditivos para las vacunas, ya que se considera que juegan un papel importante para mejorar la antigenicidad de la vacuna. En particular, el adyuvante de vacuna es indispensable para una vacuna inactivada, ya que la expresión del efecto de la vacuna es inestable.

Actualmente, los adyuvantes usados clínicamente para el hombre y los animales son aquellos usados de forma tópica junto con vacunas, por ejemplo, aceites de plantas tales como el aceite de sésamo y el aceite de colza, aceites minerales tales como el adyuvante completo de Freund y el adyuvante incompleto de Freund, hidróxido de aluminio y sulfato de aluminio.

Se han realizado estudios sobre adyuvantes de vacunas. Usualmente, un adyuvante se mezcla con la vacuna y se inyecta o se administra de forma oral. En busca de un efecto adyuvante más natural y seguro, se han dado a conocer estudios sobre adyuvantes de administración oral derivados de productos naturales. Se han dado a conocer como adyuvantes orales un adyuvante para la vacuna del virus de influenza que contiene Shouseiryutou como ingrediente efectivo (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H7-173069), se dieron a conocer un adyuvante aviar oral que contiene el ingrediente efectivo NaF (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H10-59869) y un adyuvante oral que contiene como ingrediente efectivo un mutante de enterotoxina (Publicación Nacional de la Traducción de la Solicitud de Patente Internacional No. H10-505059). Como adyuvantes derivados de plantas, se han dado a conocer los siguientes: un tipo específico de emulsión lipídica de un adyuvante que contiene un aceite graso que se origina de una planta, un adyuvante de vacuna de polisacárido que comprende endotoxina purificada y detoxificada y dimicolato de trehalosa (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S63-22029), una composición de adyuvante que contiene un lipopolisacárido sintético hidrofóbico y un componente surfactante que se origina de una planta (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H5-255117), una vacuna que contiene acemanano extraído de aloe como adyuvante (Publicación Nacional de la Traducción de la Solicitud de Patente Internacional No. H7-506565).

Además, se estudia el uso de toxinas detoxificadas tales como la toxina del cólera mutada y la toxina lábil al calor mutada y la citoquina IL-12 (Experimental Medicine (Jikken Igaku), 17, 199 (1999)).

En las industrias ganadera y pesquera se desea crecer los animales domésticos, peces y mariscos más rápido para embarcarlos, o aumentar la productividad por el crecimiento de animales domésticos, peces y mariscos débiles, que usualmente se consideran demasiado pequeños y demasiado débiles ya crecidos como para ser embarcados. Se han realizado muchos estudios con el propósito de crecer animales más rápido incrementando la eficiencia de alimentación, o cambiando el gusto y sabor de la alimentación para hacer el alimento más barato y menos preferido más efectivo, o para crecer animales domésticos, peces y mariscos que usualmente se consideran demasiado débiles ya crecidos como para ser embarcados.

Se ha dado a conocer lo siguiente como un medio para incrementar el peso de un animal doméstico: un aditivo para alimentación animal que contiene soja, veneno de sapo, aralia y vesícula biliar de animal (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H7-313070), un método de uso de una mezcla de levadura cervecera y etanol (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S48-61266), un método de uso de un antibiótico, multimicina (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S52-54013), un método de uso de un complejo de titanio (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S58-76050), un método de uso de una sustancia que contiene globulina (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S61-132143) y un método de uso de un carbazato (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S61-145156).

Se han dado a conocer los siguientes métodos para estimular el crecimiento animal: un método de uso de \beta-fenetanolamina (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S59-155343), un método de uso de un factor de crecimiento de célula epitelial (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S62-240625), un método de uso de un derivado de morforina (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H1-6262) y un método de uso de forscolina (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H1-320956).

Como método para disminuir la tasa de consumo de alimento y por tanto incrementar la eficiencia de aumento de peso de los animales domésticos, se han dado a conocer los siguientes: un método de uso de un vinagre de origen de frutas (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S48-103364), un método de uso de una prolactina porcina (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H1-230531) y un método de uso de un producto de una enzima bacteriolítica y una proteasa (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H2-207756).

Se ha dado a conocer un método de uso de hexanol o hexanal como método de cambiar la preferencia por el alimento animal para de esta forma incrementar el peso (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H7-313067).

Se han dado a conocer los siguientes métodos para disminuir las enfermedades tales como la diarrea para estimular el crecimiento y el incremento en peso: un método de uso de un fructooligosacárido (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S60-34134), un método de uso de un inulo-oligosacárido (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. S61-40754), un método de uso de un galactosil disacárido (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H4-360652), un método de uso de un polisacárido específico con \beta-1,3-glucano como cadena principal (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H7-50999), un agente para incrementar el peso y mejorar la inmunidad que comprende, como ingrediente activo, células bacterianas desprovistas de cápsulas (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H2-11519) y un método para mejorar la inmunidad e incrementar el peso usando un alimento que contiene verdolaga común (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública No. H6-141784).

El efecto profiláctico o terapéutico, el efecto anti-endotoxina y el efecto de adyuvante de vacuna están todos relacionados con la inmunidad. Sin embargo, sus mecanismos funcionales son diferentes uno de otro, y en consecuencia, todos los agentes profilácticos o terapéuticos no pueden trabajar como agentes anti-endotoxina o de adyuvante de vacuna. El efecto profiláctico o terapéutico es aquel contra virus o bacterias que ocasionan enfermedades infecciosas y es diferente del efecto de las endotoxinas producidas por bacterias. Algunos que poseen un mayor efecto profiláctico o terapéutico para la infección, producen un título de anticuerpos de vacuna, pero otros pueden cancelar el efecto de una vacuna por el ataque a una vacuna atenuada cuando éstos coexisten junto con la vacuna. El efecto anti-endotoxina y el efecto de adyuvante de vacuna son diferentes uno de otro tanto en un individuo afectado, como en los mecanismos funcionales. Como consecuencia, no ha sido dado a conocer un material natural que posea todos estos efectos.

Los remedios naturales profilácticos y los agentes anti-endotoxina dados a conocer previamente tienen usos limitados, ya que tienen que ser administrados oralmente en una gran cantidad con el fin de poder expresar efectos, o poseen un gusto, olor o sabor tan fuerte, que, al añadirse al alimento o pienso en sus cantidades efectivas, éstos afectan el sabor u olor del alimento o pienso, o incrementan los costos. Por lo tanto, se desea un material que posea un sabor u olor tal, que permita su adición a una amplia gama de alimentos o pienso, exprese un efecto profiláctico o terapéutico en una pequeña dosis contra enfermedades infecciosas, y sea barato y un producto de origen natural. La mayoría de los agentes naturales profilácticos y terapéuticos y agentes anti-endotoxina dados a conocer previamente comprenden un ingrediente específico como ingrediente activo y se entiende que su uso a largo plazo o a dosis elevadas ocasiona efectos secundarios. Por lo tanto, entre los materiales naturales que muestran un efecto profiláctico o terapéutico para las enfermedades infecciosas en bajas dosis, se desea particularmente uno que comprende una pluralidad de ingredientes activos y es más natural.

Los adyuvantes de vacunas dados a conocer anteriormente incluyen compuestos adyuvantes, adyuvantes inorgánicos y adyuvantes biológicos. Estos son compuestos purificados, materiales inorgánicos o detoxificados o enterotoxinas o endotoxinas producidas por bacterias. Estos adyuvantes usados convencionalmente no expresan de forma estable los efectos y a veces ocasionan un efecto secundario de producir IgE. Recientemente, se desea un adyuvante natural y más seguro, particularmente uno que expresa los efectos mediante una administración oral.

Los estimulantes del crecimiento dados a conocer anteriormente incluyen compuestos químicos, plantas o extractos de éstas, microorganismos tales como levaduras, materiales de desecho tales como frijoles de soja desaceitados y sustancias biológicamente activas contenidas en enzimas, proteínas o células. Sin embargo, existía sólo una pequeña parte de estimulantes del crecimiento baratos y fácilmente preparados a partir de una fuente natural.

Un objeto de la presente invención consiste en dar a conocer un agente profiláctico o terapéutico para una infección, un agente profiláctico o terapéutico para choque de endotoxinas (un agente anti-endotoxina), un adyuvante de vacuna y un estimulante del crecimiento, que son seguros y eficaces para el hombre y los animales.

Otro objeto de la presente invención es dar a conocer un alimento o pienso para animales que comprende el agente profiláctico o terapéutico para infecciones, el agente anti- endotoxina, el adyuvante de vacuna o el estimulante del crecimiento.

Características de la invención

Para conseguir los objetos anteriormente descritos, los inventores han hecho estudios en alimentos seguros para el hombre o los animales, dichos alimentos pueden ser producidos a bajos costes y poseen efectos profilácticos o terapéuticos para la infección, un efecto anti-endotoxina, un efecto de adyuvante de vacuna, o un efecto de estimulación del crecimiento. Como resultado, los inventores han encontrado que un extracto obtenido al tratar la caña de azúcar, que ha sido usada como alimento desde tiempos antiguos, posee efecto profiláctico o terapéutico contra la infección ocasionada por bacterias o virus, efecto anti-endotoxina, efecto de adyuvante de vacuna y efecto de estimulación del crecimiento para hacer la presente invención.

Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso de un extracto derivado de caña de azúcar para preparar un agente para el tratamiento de una enfermedad o afección ocasionada por una infección bacteriana en humanos o animales, en el que el extracto derivado de caña de azúcar es una fracción obtenida al hacer pasar una materia prima seleccionada del grupo que comprende jugo de caña de azúcar, un extracto líquido de la caña de azúcar y melazas derivadas de la caña de azúcar, a través de una columna empacada con un adsorbente sintético como portador fijo y eluir las sustancias adsorbidas sobre el adsorbente sintético con un disolvente seleccionado del grupo que comprende agua, metanol, etanol y mezcla de éstos, o una fracción que absorbe luz a una longitud de onda de 420 nm y que se obtiene por tratamiento cromatográfico en columna utilizando diferencias en afinidad para una resina de intercambio iónico empacada en una columna como portador fijo.

Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso de un extracto derivado de caña de azúcar para preparar un agente para el tratamiento de una enfermedad o afección ocasionada por endotoxinas en humanos o animales, en el que el extracto derivado de caña de azúcar es una fracción obtenida al hacer pasar una materia prima seleccionada del grupo que comprende jugo de caña de azúcar, un extracto líquido de la caña de azúcar, y melazas derivadas de la caña de azúcar, a través de una columna empacada con un adsorbente sintético como portador fijo, y eluir las sustancias adsorbidas sobre el adsorbente sintético con un disolvente seleccionado del grupo que comprende agua, metanol, etanol y mezcla de éstos, o una fracción que absorbe luz a una longitud de onda de 420 nm y que se obtiene por tratamiento cromatográfico en columna utilizando diferencias en afinidad para una resina de intercambio iónico empacada en una columna como portador fijo.

Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso de un extracto derivado de caña de azúcar para preparar un agente para el tratamiento de una enfermedad o afección ocasionada por infección fúngica, de micoplasma, rickettsia o clamidia en humanos o animales, en el que el extracto derivado de caña de azúcar es una fracción obtenida al hacer pasar una materia prima seleccionada del grupo que comprende jugo de caña de azúcar, un extracto líquido de caña de azúcar y melazas derivadas de la caña de azúcar, a través de una columna empacada con un adsorbente sintético como portador fijo, y eluir las sustancias adsorbidas sobre el adsorbente sintético con un disolvente seleccionado del grupo que comprende agua, metanol, etanol y mezclas de éstos, o una fracción que absorbe luz a una longitud de onda de 420 nm y que se obtiene por tratamiento cromatográfico en columna utilizando diferencias en afinidad para una resina de intercambio iónico empacada en una columna como portador fijo.

Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso de un extracto derivado de caña de azúcar para preparar un agente para el tratamiento de una enfermedad o afección ocasionada por una infección viral en humanos o animales, en el que el extracto derivado de caña de azúcar comprende un componente con un peso molecular menor de 1.000 como ingrediente activo y el extracto derivado de caña de azúcar es una fracción obtenida al hacer pasar una materia prima seleccionada del grupo que comprende jugo de caña de azúcar, un extracto líquido de caña de azúcar y melazas derivadas de la caña de azúcar, a través de una columna empacada con un adsorbente sintético como portador fijo, y eluir las sustancias adsorbidas sobre el adsorbente sintético con un disolvente seleccionado del grupo que comprende agua, metanol, etanol y mezclas de éstos, o una fracción que absorbe luz a una longitud de onda de 420 nm y que se obtiene por tratamiento cromatográfico en columna utilizando diferencias en afinidad para una resina de intercambio iónico empacada en una columna como portador fijo.

Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso de un extracto derivado de caña de azúcar para preparar un agente para la estimulación del crecimiento, en el que el extracto derivado de caña de azúcar comprende un componente con un peso molecular menor de 1.000 como ingrediente activo y el extracto derivado de caña de azúcar es una fracción obtenida al hacer pasar una materia prima seleccionada del grupo que comprende jugo de caña de azúcar, un extracto líquido de caña de azúcar y melazas derivadas de la caña de azúcar, a través de una columna empacada con un adsorbente sintético como portador fijo, y eluir las sustancias adsorbidas sobre el adsorbente sintético con un disolvente seleccionado del grupo que comprende agua, metanol, etanol y mezclas de éstos, o una fracción que absorbe luz a una longitud de onda de 420 nm y que se obtiene por tratamiento cromatográfico en columna utilizando diferencias en afinidad para una resina de intercambio iónico empacada en una columna como portador fijo.

Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso de un extracto derivado de caña de azúcar para preparar una composición de vacuna, en el que el extracto derivado de caña de azúcar comprende un componente con un peso molecular menor de 1.000 como ingrediente activo y el extracto derivado de caña de azúcar es una fracción obtenida al hacer pasar una materia prima seleccionada del grupo que comprende jugo de caña de azúcar, un extracto líquido de caña de azúcar y melazas derivadas de la caña de azúcar, a través de una columna empacada con un adsorbente sintético como portador fijo, y eluir las sustancias adsorbidas sobre el adsorbente sintético con un disolvente seleccionado del grupo que comprende agua, metanol, etanol y mezclas de éstos, o una fracción que absorbe luz a una longitud de onda de 420 nm y que se obtiene por tratamiento cromatográfico en columna utilizando diferencias en afinidad para una resina de intercambio iónico empacada en una columna como portador fijo.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a una composición de vacuna que comprende un antígeno y un extracto derivado de caña de azúcar como adyuvante para potenciar el efecto estimulante de la inmunidad de la composición, en el que el extracto derivado de caña de azúcar es una fracción obtenida al hacer pasar una materia prima seleccionada del grupo que comprende jugo de caña de azúcar, un extracto líquido de caña de azúcar y melazas derivadas de la caña de azúcar, a través de una columna empacada con un adsorbente sintético como portador fijo y eluir las sustancias adsorbidas sobre el adsorbente sintético con un disolvente seleccionado del grupo que comprende agua, metanol, etanol y mezclas de éstos, o una fracción que absorbe luz a una longitud de onda de 420 nm y que se obtiene por tratamiento cromatográfico en columna utilizando diferencias en afinidad para una resina de intercambio iónico empacada en una columna como portador fijo.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un patrón de elución obtenido en la columna cromatográfica realizada en el Ejemplo de Preparación 1.

La figura 2 muestra un patrón de elución obtenido en la columna cromatográfica realizada en el Ejemplo de Preparación 2.

La figura 3 muestra la absorbancia, conductividad eléctrica y composición de azúcares de las fracciones obtenidas por separación con una resina de intercambio iónico realizada en el Ejemplo de Preparación 6.

La figura 4 muestra un patrón de elución obtenido en la cromatografía de permeación en gel del extracto del Ejemplo de Preparación 3, realizado en el Ejemplo de Prueba 4.

La figura 5 muestra un patrón de elución obtenido en la cromatografía de permeación en gel del extracto del Ejemplo de Preparación 5, realizado en el Ejemplo de Prueba 4.

La figura 6 muestra un patrón de elución obtenido en la cromatografía de permeación en gel de marcadores de peso molecular, realizado en el Ejemplo de Prueba 4.

Descripción de las realizaciones preferentes

En el presente documento, los términos "un agente profiláctico o terapéutico para la infección" significa un agente que tiene un efecto de prevenir o curar la infección con bacterias o virus. Dicho efecto incluye un efecto profiláctico o terapéutico mediante el control de los sistemas inmunológicos y mediante otros mecanismos.

En el presente documento, "un efecto anti-endotoxina" incluye un efecto profiláctico o terapéutico para enfermedades ocasionadas por endotoxinas, tales como la disminución de la muerte por choque de endotoxinas o septicemia e incluso un efecto para las enfermedades orales por bacterias periodontales. Además, es de esperar un efecto como bloqueador de radicales y un efecto de supresión de las citoquinas inflamatorias.

En el presente documento, "una función de adyuvante de vacuna" o "un efecto de adyuvante de vacuna" es un efecto de mejorar las funciones de un antígeno, o sea, un efecto de estimulación de la inmunidad para mejorar una respuesta inmune. Se trata, específicamente, del efecto de incrementar el título de anticuerpos para de esta forma incrementar el efecto de la vacunación al administrar el adyuvante en un periodo de tiempo específico antes o después de la vacunación.

En el presente documento, "un efecto de estimulación del crecimiento" incluye un efecto de estimular el crecimiento del hombre o animales infantiles y un efecto sobre el incremento del peso corporal de hombres o animales delgados. En el presente documento, el efecto de estimulación del crecimiento no se distingue del efecto de estimulación del peso.

En el presente documento, el término "animales" significa vertebrados diferentes del hombre, que incluye mamíferos, aves y peces, por ejemplo, animales domésticos tales como vacas, cerdos y caballos, aves de corral tales como gallinas y codornices, peces tales como cola amarilla (Seriola lalandi) jóvenes, besugos, platijas, peces globo, medregales, ayus, anguilas, truchas, carpas y carpas doradas, y animales de compañía tales como perros y gatos.

En el presente documento, un extracto derivado de caña de azúcar es un extracto obtenido de la caña de azúcar como materia prima.

En una realización de la presente invención, el extracto derivado de caña de azúcar es una fracción obtenida al tratar una materia prima seleccionada del grupo que comprende jugo de caña de azúcar, líquido extraído de caña de azúcar y melazas derivadas de caña de azúcar (pueden ser referidas simplemente como materia prima en adelante) en cromatografía de columna con un portador fijo. Más preferentemente, el extracto derivado de caña de azúcar es una fracción obtenida haciendo pasar la materia prima a través de una columna empacada con un adsorbente sintético como el portador fijado y eluir las sustancias adsorbidas sobre el adsorbente sintético con un disolvente seleccionado del grupo que comprende agua, metanol, etanol y mezcla de éstos, o una fracción que absorbe luz a una longitud de onda de 420 nm de las fracciones que se obtienen por tratamiento de la materia prima en cromatografía de columna utilizando diferencias en afinidad hacia una resina de intercambio iónico empacada en una columna como portador fijo. Es preferente someter la fracción que absorbe la luz de 420 nm a electrodiálisis para así disminuir, o, más preferentemente, eliminar las sales en la fracción.

Los valores de color de las materias primas derivadas de caña de azúcar, intermediarios y productos se evaluaron previamente por absorbancia a 420 nm. La absorbancia a 420 nm está afectada ligeramente por el pH de la muestra, de forma tal que el pH de la muestra se ajusta a pH cerca de la neutralidad antes de la medición de absorbancia. En la presente invención, la absorbancia se mide después de ajustar el pH de las muestras a un intervalo de 6 a 8. Como se describirá en los Ejemplos, cuando se disuelven 0,25 g del polvo liofilizado de la fracción obtenida en tampón fosfato 0,5 mM (pH 7,5) hasta un volumen total de 100 mL y su absorbancia se mide a 420 nm en una celda con una longitud de paso de luz de 1 cm, las fracciones que poseen una absorbancia a 420 nm de 0,8 o superior, poseen un mayor efecto de la presente invención. Sin embargo, la absorbancia a 420 nm es una medida del contenido de color derivado de caña de azúcar y se desconoce si la absorbancia a 420 nm es atribuible a los ingredientes activos presentes y, además, el contenido del color en la caña de azúcar puede variar en dependencia de sus sitios de producción y las especies, por lo que es posible que no haya necesariamente una relación proporcional entre los presentes efectos y la absorbancia a 420 nm entre varios extractos de cañas de azúcar de diferentes sitios de producción y especies. Por lo tanto, se miden las absorbancias a 420 nm de una pluralidad de fracciones obtenidas de una materia prima y aquellas fracciones con una absorbancia relativamente superior son las fracciones de la presente invención.

Cuando se lleva a cabo la cromatografía en columna con un adsorbente sintético empacado en una columna, los ingredientes activos se adsorben al adsorbente sintético al hacer pasar la materia prima a través de la columna, ya que éstos poseen una afinidad muy fuerte hacia el adsorbente. A continuación, los ingredientes adsorbidos se desadsorben y eluyen con un disolvente.

Cuando se usa una resina de intercambio iónico como portador fijo, la afinidad de los presentes ingredientes activos hacia la resina no es tan fuerte como en la adsorción. Sin embargo, existe una diferencia de afinidad hacia la resina de intercambio iónico entre los ingredientes activos y los otros ingredientes. En base a la diferencia en la velocidad de elución, los ingredientes activos se pueden separar de los demás ingredientes alimentando la materia prima hacia la columna y luego pasando agua como eluyente.

En otra realización de la presente invención, un extracto derivado de caña de azúcar es un extracto obtenido por extracción de un bagazo derivado de caña de azúcar con un líquido seleccionado entre agua, disolventes hidrofílicos y una mezcla de éstos, más preferentemente, un extracto obtenido por extracción de bagazo, que es un residuo después de la molienda de la caña de azúcar para obtener jugo de molienda con un líquido seleccionado entre agua, disolventes hidrofílicos y una mezcla de éstos.

En la presente invención, el jugo de caña de azúcar incluye jugo de molino obtenido por molienda de la caña de azúcar, jugo extraído al extraer la caña de azúcar con agua, jugo clarificado obtenido por tratamiento con cal en un ingenio azucarero, y jugo concentrado.

En la presente invención, un extracto líquido de la caña de azúcar incluye una solución acuosa obtenida al extraer la caña de azúcar con un disolvente orgánico de amplio uso, concentrar, secar y redisolver en agua. Ejemplos de disolvente orgánico incluyen alcoholes tales como metanol, etanol y una combinación de éstos. Se puede emplear una mezcla de alcohol con agua.

En la presente invención, las melazas derivadas de caña de azúcar incluyen melazas obtenidas al centrifugar una mezcla de cristales de azúcar y un licor madre obtenido en un proceso de cristalización y separar las melazas de los cristales de azúcar, tales como las melazas primarias, melazas secundarias, melazas finales en un ingenio azucarero, y sirope de afinación, primera a séptima melaza y melazas finales de refinería en una refinería de azúcar. También se hace uso del residuo libre de sacáridos tales como un licor aislado obtenido en la fermentación alcohólica de estas melazas como materia prima.

En la presente invención, el bagazo típicamente significa bagazo en la fabricación de azúcar en un ingenio azucarero. En el presente documento, el bagazo agotado en un proceso de fabricación de azúcar en un ingenio azucarero incluye no sólo un bagazo final de la prensa final, sino también la caña de azúcar finamente molida que se desmenuza entre las prensas, o entre la primera y última prensa. Se usa preferentemente el bagazo agotado después de la molienda para el jugo de molino en el proceso de molienda en la planta de azúcar crudo. El bagazo de desecho del proceso molienda varía en cuanto a contenido de humedad, contenido de azúcar y composición, en dependencia de la especie de caña de azúcar y el tiempo de cosecha. Sin embargo, en la presente invención se puede usar cualquier bagazo. De manera similar se puede usar el bagazo agotado que queda luego de la molienda de la caña de azúcar en un ingenio de azúcar moreno (KOKUTOU). En una escala pequeña de práctica a nivel de laboratorio, se puede utilizar el bagazo remanente después de exprimir la caña de azúcar para obtener jugo de prensa.

Más específicamente, el extracto derivado de caña de azúcar se puede preparar como sigue.

Primeramente, será explicado el presente método de tratamiento de columna cromatográfica.

El jugo de caña de azúcar, extracto líquido de caña de azúcar obtenido por extracción con un disolvente, o melazas derivadas de caña de azúcar (en adelante referidos como materia prima) se hacen pasar a través de una columna empacada con un portador fijo. La materia prima mencionada anteriormente puede ser usada como tal, o luego de su dilución con agua, a una concentración deseada. Se prefiere filtrar la materia prima antes del tratamiento con la columna para eliminar cualquier sustancia extraña. Los medios de filtración no están limitados a uno en particular y preferentemente, se puede hacer uso de varios medios ampliamente usados en la industria alimentaria tales como la filtración de pantalla, filtración con tierra diatomeacea, filtración de precisión y ultrafiltración.

Se prefiere un adsorbente sintético o una resina de intercambio iónico como portador fijo.

Primeramente, se ilustrará una realización preferente, en la que se usa el adsorbente sintético como portador fijo. Como adsorbente sintético, se pueden usar preferentemente resinas orgánicas tales como resinas aromáticas, resinas de ácido acrílico del tipo metacrílico y resinas alifáticas de acrilonitrilo. Más preferentes son las resinas aromáticas, particularmente las resinas aromáticas no sustituidas. Como adsorbente sintético se pueden usar resinas aromáticas, por ejemplo resina de estireno-divinilbenceno. Como resina aromática se pueden usar resinas porosas, por ejemplo, resinas aromáticas que tienen sustituyentes hidrofóbicos, resinas aromáticas no sustituidas y resinas porosas tales como resinas aromáticas obtenidas al someter las resinas aromáticas no sustituidas a un tratamiento especial. Más preferentemente, se puede hacer uso de resinas aromáticas obtenidas al someter las resinas de tipo aromático no sustituidas a un tratamiento especial.

Estos adsorbentes sintéticos están disponibles comercialmente, como ejemplo, las series Diaion®, tales como HP-10, HP-20, HP-21, HP-30, HP-40 y HP-50 (nombres comerciales, ex-Mitsubishi Chemicals Inc.: éstas son resinas aromáticas no sustituidas), SP-825, SP-800, SP-850 y SP-875, SP-70 y SP-700 (nombres comerciales, ex-Mitsubishi Chemicals Inc.: éstas son resinas aromáticas obtenidas al someter las resinas de tipo no sustituido a un tratamiento especial); SP-900 (nombre comercial, ex-Mitsubishi Chemicals Inc.: resina aromática), las series Amberlight® tales como XAD-2, XAD-4, XAD-16 y XAD-2000 (nombres comerciales, ex-Organo Inc.: éstas son resinas aromáticas); series Diaion® SP-205, SP-206 y SP-207 (nombres comerciales, ex-Mitsubishi Chemicals Inc.: éstas son resinas aromáticas que tienen sustituyentes hidrofóbicos), HP-2MG y EX-0021 (nombres comerciales, ex-Mitsubishi Chemicals Inc.: éstas son resinas aromáticas con sustituyentes hidrofóbicos), las series Amberlight® XAD-7 y XAD-8 (nombres comerciales, ex-Organo Inc.: éstas son resinas de ésteres acrílicos), las series Diaion® HP1MG y HP2MG (nombres comerciales, ex-Mitsubishi Chemicals Inc.: éstas son resinas metacrílicas del tipo ácido acrílico), la serie Sephadex® LH20 y LH60 (nombre comercial, ex-Pharmacia Biotech Inc.: éstas son derivados de dextrana reticulada) y similares. Entre éstas, SP-850 es particularmente preferente.

La cantidad de portador fijo varía en dependencia del tamaño de la columna, el tipo de disolvente y el tipo de portador fijo. Una cantidad preferente es de 0,01 a 5 veces, como volumen húmedo, tan grande como sea el tamaño del contenido de sólidos de la materia prima.

Al pasar la materia prima a través de dicha columna, los ingredientes con el efecto de la presente invención en la materia prima se adsorben al portador, y la mayor parte de la sacarosa, glucosa fructosa y sales inorgánicas pasan a través de la columna.

Los ingredientes adsorbidos al portador fijo eluyen con un disolvente. Con el fin de eluir eficientemente los ingredientes con el efecto de la presente invención, es preferente lavar la columna de forma suficiente con agua para eliminar sacarosa, glucosa, fructosa y sales inorgánicas remanentes de la columna antes de la elución, mediante lo cual los ingredientes adsorbidos con los efectos pretendidos se recuperan de forma eficiente. El disolvente de elución se selecciona entre agua, metanol, etanol y una mezcla de éstos. Se le da preferencia a un disolvente mezclado de agua con etanol, particularmente una mezcla de etanol-agua. Una mezcla de etanol y agua en una relación volumétrica de 50/50 a 60/40 es más preferente, porque los ingredientes con los efectos pretendidos se eluyen eficientemente a temperatura ambiente. Al elevar la temperatura de la columna, se pueden eluir los ingredientes pretendidos, con el efecto de la presente invención con una relación más baja de etanol en la mezcla etanol-agua que puede salir. Aquí, la presión en la columna es la presión atmosférica o superior. Los ingredientes con el efecto de la presente invención están presentes en las fracciones eluidas con el disolvente descrito. La velocidad de elución varía en dependencia del tamaño de la columna, el tipo de disolvente y el tipo de portador fijo y no está restringida a una velocidad específica. Sin embargo, la SV está preferentemente en el intervalo de 0,1 a 10 h^{-1}, donde SV es la velocidad espacial que representa cuántas veces por hora pasa un volumen de líquido igual al volumen de la resina.

Los ingredientes con el efecto de la presente invención pueden ser obtenidos preferentemente en la siguiente manera, pero no está limitado a ella. O sea, la materia prima se hace pasar a través de una columna empacada una resina aromática no sustituida que tiene un volumen húmedo de 0,01 a 5 veces del contenido de sólidos de la materia prima a una temperatura de columna de 60 a 97ºC. Después de lavar la resina en la columna con agua, los ingredientes adsorbidos a la resina se eluyen a una temperatura de columna de 20 a 40ºC con una mezcla de etanol y agua en una relación de volumen de 50/50 a 60/40 y las fracciones se colectan hasta que el volumen del eluyente colectado desde el principio de la elución represente 4 veces el volumen húmedo de la resina mencionada.

Mientras tanto, una realización preferente con una resina de intercambio iónico como portador fijo será descrita más adelante. Las resinas de intercambio iónico se clasifican en resina de intercambio catiónico y resina de intercambio aniónico desde el punto de vista de la propiedad de intercambio de iones. En la presente invención, se usa preferentemente una resina de intercambio catiónico. Más preferentemente, se usan resinas de tipo acídica fuerte, en forma de iones sodio o en forma de iones potasio de las resinas de intercambio catiónico. Las resinas de intercambio iónico se clasifican también, desde el punto de vista morfológico, en resinas de tipo de gel y resinas de tipo poroso tales como de tipo poroso, de tipo macroporoso y de tipo altamente poroso. En la presente invención se emplea una resina de intercambio iónico de tipo gel. Más preferentemente, se usa una resina de intercambio catiónico de tipo gel tipo acídico fuerte en forma de iones sodio o en forma de iones potasio. Tales resinas de intercambio iónico están disponibles comercialmente, por ejemplo, incluyen las series de Diaion® SK1B, SK104, SK110, SK112, SK116 (todos nombres comerciales, ex-Mitsubishi Chemicals Co.), UBK530, UBK550 (grados cromatográficos, nombres comerciales, ex-Mitsubishi Chemicals Co.), las series Amberlite®: Amberlite IR120B, IR120BN, IR124, XT1006, IR118, Amberlist 31, Amberlite de grado cromatográfico CG120, CG6000 (nombres comerciales, ex-Organo Co.), series Dowex® tales como HCR-S, HCR-W2, HGR-W2, Monosphere 650C, Marason C600, 50Wx2, 50Wx4, 50Wx8 (todos nombres comerciales, ex-Dox Chemical Japan Co.), Muromac 50WX (nombre comercial, ex-Muromachi Chemical Industry Co.), y las series Purolite C-100E, C-100, C-100x10, C-120E, PCR433, PCR563K, PCR822, PCR833, PCR866, PCR883, PCR892, PCR945 (todos nombres comerciales, ex-AMP Ionex Co.). Entre éstas, las series UBK son particularmente preferentes.

La cantidad de portador fijo varía en dependencia del tamaño de la columna y del tipo de portador fijo. La cantidad es, como volumen húmedo, preferentemente, de 2 a 10.000 veces, más preferentemente de 5 a 500 veces, tan grande como el contenido de sólidos de la materia prima.

La materia prima se hace pasar a través de dicha columna y luego es sometida a un tratamiento cromatográfico con agua como eluyente. De las muchas fracciones obtenidas, aquellas que absorben luz a 420 nm se colectan para obtener el extracto deseado.

En adelante, este método de tratamiento será referido como separación cromatográfica iónica.

Las condiciones de separación varían en dependencia de la composición de la materia prima y el tipo de portador fijo. En una simple separación de columna por lote usando agua desgasificada como eluyente, las condiciones preferentes son las siguientes: un caudal, como SV, de 0,3 a 1,0 h^{-1}, una cantidad de carga de la materia prima entre 1 y 20% del volumen de la resina de intercambio iónico y una temperatura desde 40 a 70ºC. Para cada una de las fracciones obtenidas por este método de separación, se determinan la absorbancia a una longitud de onda de 420 nm, la conductividad eléctrica, que es una medida del contenido de sales, el contenido de sacarosa, glucosa y fructosa. Cuando estos datos se grafican contra el tiempo, se encuentran picos en la absorbancia a 420 nm, en la conductividad eléctrica, en el contenido de sacarosa y en el contenido de azúcares reductores, en esta secuencia.

En la figura 3, las fracciones de la 3ra a la 14ta se colectan como fracciones que absorben luz a una longitud de onda de 420 nm. En particular, son preferentes las fracciones de la 3ra a la 8va. Las fracciones enteras sin azúcar, que consisten en las fracciones 1ra a 9na, incluyendo a las fracciones 3ra a 8va, y las fracciones 18va a 30ma, pueden ser usadas como el presente extracto, aunque la concentración del ingrediente activo es más baja. Para un método de separación continua de cama en pseudomovimiento, las condiciones generales de separación no se pueden presentar aquí, ya que la velocidad de carga de la materia prima, el caudal del eluyente y el caudal de extracción se fijan de acuerdo con la composición de la materia prima, el tipo de portador fijo y la cantidad de resina de intercambio
iónico.

Las presentes fracciones obtenidas por una separación continua de cama en pseudomovimiento, con el uso de la 2da melaza a partir de un molino de azúcar crudo como materia prima comprende, como mínimo, el 6% de sacarosa y, como mínimo, el 90% de componente no azúcar, en base al contenido sólido y tiene una pureza aparente del 10%, aunque la composición varía en dependencia del tipo de materia prima y de la capacidad de separación de la resina de intercambio iónico. La pureza aparente es un porcentaje de la polarización por contenido de sólidos (Brix:Bx), donde la polarización es el ángulo de rotación medido con un sacarímetro, en relación con un patrón de sacarosa pura de una concentración especificada.

Las presentes fracciones, obtenidas por un método de separación simple de columnas por lotes, usando la 2da melaza como materia prima, contiene aproximadamente el 5% de polifenoles, el 44,7% de sales eléctricamente conductivas y el 5% de azúcar, en base al contenido de sólidos liofilizados.

Es evidente que los presentes ingredientes activos están contenidos más en las fracciones correspondientes al pico de absorbancia a una longitud de onda de 420 nm, pero aún no queda claro si los ingredientes activos por sí mismos absorben luz a 420 nm.

Las fracciones mencionadas anteriormente que absorben luz a 420 nm o las fracciones con menos azúcar pueden ser tratadas a continuación por electrodiálisis para disminuir o eliminar las sales contenidas en las fracciones. Las fracciones obtenidas por cromatografía de columna con una resina de intercambio iónico contienen sales en una cantidad de hasta un 40% de ceniza de sulfato, en base a los sólidos secos. Por consiguiente, el sabor de las fracciones resulta muy salado y afecta el sabor de los alimentos. Para permitir que el hombre pueda tomar las fracciones, el contenido de sal debe disminuirse, ya que el consumo de demasiadas sales es perjudicial para la salud. Esto se aplica también a los animales y existe una cantidad máxima de consumo de sal. Especialmente para los animales domésticos, se regula la cantidad de cada tipo de sal a ser suministrada, por lo que se ajusta el contenido de sal en una fórmula de pienso.

Por lo tanto, para la aplicación en alimentos para animales domésticos, el extracto derivado de caña de azúcar contiene preferentemente una cantidad más baja de sales. Por consiguiente, es preferente disminuir el contenido de sales de las fracciones obtenidas.

En la desalinización por electrodiálisis, cationes tales como iones sodio, iones potasio, iones calcio e iones magnesio, se eliminan de forma casi igual independientemente de la especie iónica. En cuanto a los aniones, se conoce que los iones cloruro se eliminan de forma selectiva, mejor que el ion sulfato, que no se elimina tan bien. Los cationes y aniones se eliminan en proporciones equivalentes.

A continuación se explicará un método para preparar el extracto derivado de caña de azúcar por extracción del bagazo. El extracto de bagazo se prepara extrayendo el bagazo con un disolvente seleccionado del grupo que comprende agua, disolventes hidrofílicos y una mezcla de éstos. Los ejemplos de disolventes hidrofílicos incluyen alcoholes inferiores tales como metanol y etanol, cetonas tales como acetona y acetatos tales como acetato de metilo y acetato de etilo. El etanol es el disolvente hidrofílico preferente. Un disolvente preferente para la extracción es una mezcla de etanol y agua en una relación volumétrica de, como mínimo, 60/40, más preferentemente, como mínimo, 50/50. Para la extracción eficiente, es preferente una temperatura de extracción entre 50 y 100ºC. El tiempo de extracción es usualmente de 1 a 3 horas, aunque esto varía en dependencia del origen del bagazo, su tipo y estado. Cualquier método de extracción usado comúnmente puede ser usado, tal como la extracción en un recipiente, donde el bagazo y el disolvente de extracción se colocan juntos, la extracción por circulación del disolvente de extracción, la extracción continua usando, por ejemplo un extractor Desmet y un extractor Lurgi. El extracto del bagazo contiene muchos sacáridos, por lo que puede ser sometido a un tratamiento cromatográfico similar al del método mencionado anteriormente para eliminar los sacáridos.

Los presentes ingredientes activos se pueden obtener por condensación del extracto de caña de azúcar preparado por cualquiera de los métodos descritos anteriormente, en un método convencional tal como evaporación del disolvente al vacío y liofilización. Los ingredientes activos así obtenidos se pueden almacenar en forma de un líquido condensado con, como mínimo, 20% de contenido de sólidos o en polvo. Preferentemente, se almacena en un refrigerador, particularmente cuando es líquido.

Como se mostrará más adelante en el Ejemplo de Prueba 4, el presente extracto derivado de caña de azúcar no comprende un solo ingrediente activo, sino una pluralidad de ingredientes, y presenta diferentes composiciones condensadas de los ingredientes activos en dependencia del método de preparación.

Los agentes profilácticos o terapéuticos de infecciones conocidos hasta ahora comprenden generalmente un componente activo único o una pluralidad de componentes activos similares, de manera que se teme que una dosis de larga duración o elevada ocasionarían efectos secundarios. En contraste, el presente extracto derivado de caña de azúcar comprende muchos componentes de un amplio intervalo de pesos moleculares y es más natural.

El presente extracto derivado de caña de azúcar muestra efectos profiláctico o terapéutico contra infección por bacterias y virus en un experimento animal, donde el extracto derivado de caña de azúcar fue administrado oralmente a ratones (ver Ejemplos 1 a 4). Se cree que el presente extracto derivado de caña de azúcar controla el sistema inmunológico para prevenir o remediar la infección de este modo.

Por lo tanto, la presente invención puede ser aplicada para prevenir o remediar enfermedades ocasionadas por la debilidad o deficiencia de la función inmunológica mediante el control de la función inmunológica del hombre o los animales. La presente invención puede ser aplicada también para prevenir o curar varios tipos de enfermedades infecciosas.

Tales enfermedades no están limitadas a unas en particular. En el caso del hombre, los ejemplos incluyen reumatismo articular, glomerulonefritis, anemia hemolítica, asma bronquial, enfermedad de Behçet, Enfermedad de Hashimoto, poliomiositis, lupus eritematoso sistémico, enfermedades autoinmunes tales como esclerosis sistémica progresiva y algunos tipos de tumores, enfermedades infecciosas de todo el cuerpo, del sistema respiratorio, tractos urinarios, intestinos, intrabdomen, membranas mucosas, u órganos circulatorios, varios tipos de enfermedades infecciosas de niños con trastornos nutricionales, personas ancianas, o aquellos que se encuentran bajo administración de agentes anticancerígenos o de invasiones operacionales. En el caso de animales, los ejemplos incluyen diarreas, neumonía epidémica y gastroenteritis infecciosa del cerdo, neumonía aviar y enfermedad de Marek, diarrea bovina, neumonía y mastitis, y síndrome de inmunodeficiencia felina y leucemia. Además, las enfermedades infecciosas de los peces de cultivo no están limitadas a unas en particular, y entre los ejemplos se incluyen infecciones bacterianas tales como estreptococosis, pasteurelosis e infrecicón viral.

Entre los ejemplos de infección bacteriana se incluyen la salmonelosis humana (Salmonella enteritidis, S. dublin) Vibrio parahemoliticus, fiebre tifoidea (Salmonella typhi), enfermedad infecciosa de E. coli infecciosa (Escherichia coli), tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis), disentería de bacilo (Shigella dysenteriae, S. flexneri), pertussis (Bordetella pertussis), difteria (Corynebacterium diphteriae), enfermedad de Hansen (Mycobacterium leprae), peste (Yersinia pestis), mastitis bovina (Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Actinomyces pyogenes), brucelosis (Brucella abortus), campilobacteriosis (Campylobacter fetus), ántrax (Bacillus antracis), enfermedad de Johne (Mycobacterium avium), queratoconjuntivitis infecciosa bovina (Moraxella bovis), pasteurelosis (Pasteurella multocida y Pasteurella haemolytica), trichophytia interdigitalis (Fusobacterium necrophorum), muermo (Bordetella mallei), metritis infecciosa equina (Taylorella equinogenitalis), fiebre recurrente (Borrelia theileri), rinitis atrófica porcina (Bordetella bronchiseptica), erisipela porcina (Erysipelothrix rhusiopathiae), enfermedad de Glasser (Haemophilus parasuis), diarrea blanca bacilar (Salmonella pullorum), cólera aviar doméstica (Pasteurella multocida), rinitis infecciosa (Haemophilus paragallinarum), enfermedad micobacteriana atípica (Mycobacterium avium), leptospirosis ocular canina (Leptospira canicola), tétanos (Clostridium tetani), infección por enterococo íctico (Enterococcus seriolicida), pasteurelosis (Pasteurella piscicida), enfermedades de Vibrio (Vibrio anguillarum), infección por Edwardsiella (Edwardsiella tarda), enfermedad del agua fría (Flavobacterium psychrophilus), enfermedad de la boca roja (Yersinia ruckeri), infección por Aeromonas (Aeromonas hydrophila), nocardiosis (Nocardia asteroides, Nocardia seriolae).

Entre los ejemplos de enfermedades virales se incluyen la influenza humana (virus de influenza humana), herpes humano (virus de herpes humano 3), síndrome de inmunodeficiencia humana (virus del síndrome de inmunodeficiencia), poliomielitis (virus de la polio), rubéola (virus de la rubéola), sarampión (virus del sarampión), encefalitis japonesa (virus de la encefalitis japonesa), parotiditis epidémica (virus de la papera), fiebre hemorrágica de Ebola (virus Ebola), fiebre de dengue (virus de dengue), enfermedad de Marburg (virus de Marburg), coriomeningitis linfocítica (virus de coriomeningitis linfocítica), leucemia de linfocitos T humanos (virus de linfocitos T humanos), fiebre amarilla (virus de fiebre amarilla), rinotraqueítis bovina infecciosa (virus de herpes bovino 1), fiebre aftosa (virus de fiebre aftosa), fiebre efímera bovina (virus de la fiebre efímera bovina), viruela bovina (virus de la viruela bovina), enfermedad de Akabane (virus de Akabane), enfermedad de Ibaraki (virus de Ibaraki), Lengua azul (virus de Lengua azul), fiebre de embarque (virus de la parainfluenza bovina), fiebre de Rift Valley (virus de Rift Valley), anemia infecciosa equina (virus de la anemia infecciosa equina), arteritis equina (virus de la arteritis equina), enfermedad de Borna (virus de Borna), rinoneumonitis equina (virus de herpes 4 équido), encefalitis equina del este (virus de la encefalitis equina del este), gastroenteritis porcina trasmisible (virus de la gastroenteritis porcina trasmisible), síndrome reproductivo y respiratorio porcino (virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino), enfermedad de Aujeszky (virus de Pseudorabia), cólera de cerdo (virus de cólera de cerdo), enfermedad vesicular porcina (virus de la enfermedad vesicular porcina), rinitis porcina por cuerpos de inclusión (Herpesvirus Suido 2), enfermedad bursal infecciosa aviar (virus de la enfermedad bursal infecciosa), enfermedad de Newcastle (virus de la enfermedad de Newcastle), viruela aviar (virus de la viruela aviar), enfermedad de Marek (virus de la enfermedad de Marek), laringotraqueítis infecciosa (virus de la laringotraqueítis infecciosa), bronquitis infecciosa aviar (virus de la bronquitis infecciosa aviar), rabia canina (virus de la rabia), moquillo canino (virus del moquillo canino), hepatitis infecciosa (adenovirus canino 1), infección por parvovirus canino (parvovirus canino), leucemia felina (virus de leucemia felina), síndrome de inmunodeficiencia felina (virus del síndrome de inmunodeficiencia felina), peritonitis infecciosa felina (virus de la peritonitis infecciosa felina), panleucopenia felina (virus de la panleucopenia felina), infección por iridovirus íctico (virus Flounder), necrosis hematopoiética infecciosa (virus de la necrosis hematopoiética infecciosa), necrosis pancreática infecciosa (virus de la necrosis pancreática infecciosa), estomatitis (no identificado).

Entre los ejemplos de enfermedades fúngicas se incluyen la coccidioidomicosis humana (Coccidioides immitis), histoplasmosis (Histoplasma capsulatum), mastitis bovina (Candida tropicalis), aborto espontáneo (Aspergillus fumigatus), dermatomicosis (Trychophyton verrucosum), mucormycosis (Mucor rasemosus), micosis de las bolsas guturales equina (Aspergillus nidulans), linfadenosis infecciosa (Histoplasma farciminosum), tricofitosis equina (Trichophyton equinum), ingluviitis aviar (Candida albicans), neumonía por Apergillus (Aspergillus fumigatus), blastomicosis canina (Blastomyces dermatitidis), dermatomicosis (Microsporum canis), linfadenosis (Histoplasma capsulatum), Malasseziasis (Malassezia pachydermatis), infección de Saprolegnia íctica (Saprolegnia parasitica), micosis visceral (Saprolegnia diclina), granuloma micetogénico (Aphanomyces piscicida), infección por Pythium (Pythium gracile), enfermedad del tímpano (Candida sake).

Entre los ejemplos de enfermedades infecciosas por micoplasma se incluyen neumonía por micoplasma bovino (Mycoplasms mycoides), mastitis por micoplasma (Mycoplasma bovis), agalactia infecciosa ovina (Mycoplasma agalactiae), neumonía epidémica de cerdo (Mycoplasma hyopneumoniae), inflamación crónica del paso de aire superior aviar (Mycoplasma gallisepticum).

Entre los ejemplos de enfermedades infecciosas por rickettsia se incluyen el tifus humano (Rickettsia prowazekii), la fiebre Q (Coxiella burnetii), enfermedad por arañazo de gato (Bartonella henselae), fiebre hemorrágica bovina (Ehrlichia ondiri), fiebre equina del Potomac (Ehrlichia risticii), infección canina de Ehrlichia (Ehrlichia canis).

Entre los ejemplos de enfermedades por clamidia se incluyen la psitacosis humana (Chlamidia psittaci), aborto epidémico bovino (Chlamidia psittaci), encefalomielitis esporádica bovina (Chlamidia pecorum), hidrohimenitis epidémica ovina (Chlamidia pecorum), neumonía por clamidia felina (Chlamidia psittaci).

El presente extracto derivado de caña de azúcar mostró un incremento significativo en la tasa de supervivencia en un modelo de endotoxina, donde el extracto derivado de caña de azúcar fue administrado de forma oral a animales de experimento un día antes y 6 horas después de una administración intravenosa de endotoxina. Esto indica que el extracto derivado de caña de azúcar por sí mismo o sus metabolitos actúan sobre la endotoxina presente en la sangre para descomponer, aglomerar u ocasionar cualquier cambio en el estado de la endotoxina para neutralizarla, para suprimir la excesiva activación del complemento por la endotoxina, sirve como un bloqueador de radicales, suprime las citoquinas inflamatorias, o disminuye la eficiencia de la endotoxina mediante cualquier mecanismo, para tener así efectos anti-endotoxina.

Por tanto, el presente extracto de caña de azúcar puede ser usado para prevenir o remediar enfermedades ocasionadas pro endotoxinas. Tales enfermedades no están limitadas a unas en particular, e incluyen la sepsis que ocasiona síntomas generales severos tales como fiebre, escalofríos, vómitos y alteración de la conciencia, choque por endotoxinas, y enfermedades orales por endotoxinas tales como bacterias periodontales. Entre los ejemplos de bacterias que tienen tales endotoxinas se incluyen bacterias Gram negativas tales como Escherichia coli (E. coli), pneumobacilos, proteus, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter.

El presente extracto derivado de caña de azúcar actúa también como adyuvante de vacuna y como estimulador del crecimiento, como será demostrado en los Ejemplos.

La dosificación de la administración del presente agente profiláctico o terapéutico para la infección, agente anti-endotoxina, o estimulador del crecimiento no está limitada. La dosificación de la administración del presente adyuvante de vacuna no está limitada y se puede administrar antes, el mismo día de la administración de la vacuna o después. Generalmente, se administra durante y/o después de la vacunación. Al administrarlo antes de la vacunación, se pueden esperar efectos más confiables. Como mínimo, una administración es suficiente y se prefiere la administración continua o intermitente por un período de un día a una semana antes de la vacunación y de una semana a dos semanas después de la vacunación. La administración posterior continuada durante 1 a 6 meses puede ser realizada sin problemas.

La dosis del presente agente profiláctico o terapéutico para la infección, agente anti-endotoxina, adyuvante de vacuna o estimulador de crecimiento no está limitada y puede ser decidida en dependencia de la pureza y la forma del extracto derivado de caña de azúcar, el tipo, estado de salud o etapa de crecimiento del animal objetivo. Por ejemplo, una dosis de polvo del extracto derivado de caña de azúcar preparada en los Ejemplos de Preparación 1 a 7, descritos más adelante en el presente documento, es de 1 a 1000 mg, preferentemente de 50 a 1000 mg por kg de peso corporal.

El presente extracto derivado de caña de azúcar puede ser administrado en cualquier forma tales como administración oral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intracutánea, intrabdominal, intra-rectal e hipoglosa, endermismo, instilación para ejercer un efecto profiláctico o terapéutico, efecto de anti-endotoxina, efecto de adyuvante de vacuna, o efecto de estimulación del crecimiento.

El presente extracto se puede administrar en cualquier forma. El extracto en forma de líquido o polvo se puede administrar como tal, o se puede preparar en forma de una preparación sólida o líquida con un portador para la preparación por un método conocido. De forma alternativa, el presente extracto, ya sea en una preparación o no, puede ser mezclado en un alimento, un pienso o en agua potable.

Se puede hacer una preparación sólida para administración oral por adición de bases diluyentes, aglutinantes, agentes adhesivos, desintegrantes, lubricantes y abrillantadores, colorantes, controladores de sabor y olor, antioxidantes y ayudas de disolución para el presente extracto y para preparar la mezcla en forma de granos ("pellets"), granos revestidos, gránulos, polvo o medicamentos encapsulados.

Entre los ejemplos de las bases diluyentes se incluyen almidón, almidón de maíz, dextrina, harina, harina de maíz, salvado, salvado de arroz, torta de aceite de salvado de arroz, torta de soja, polvo de soja, torta de aceite de soja, harina de soja, glucosa, lactosa, azúcar blanca, maltosa, aceite de plantas, aceite animal, aceite solidificado, ácidos grasos superiores saturados, otros tipos de ácidos grasos, levadura, manitol, celulosa cristalina, dióxido de silicio, anhídrido silícico, silicato de calcio, ácido silícico, hidrogenofosfato de calcio, fosfato de calcio y dihidrogenofosfato de calcio.

Entre los ejemplos de aglutinantes se incluyen polivinilpirrolidona, etilcelulosa, metilcelulosa, goma arábiga, goma tragacanto, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, caseína de sodio, carboximetilcelulosa de sodio, propilenglicol, y poli(acrilato de sodio).

Entre los ejemplos de lubricantes y abrillantadores se incluyen estearato de magnesio, talco y ácido esteárico.

Se puede usar como colorante y saborizante o esencia cualquier agente permitido en medicamentos, alimentos o piensos.

Entre los ejemplos de antioxidantes se incluyen ácido ascórbico, \alpha-tocoferol, ethoxiquina, dibutilhidroxitolueno, butilhidroxianisol y todos aquellos permitidos en medicamentos, alimentos o piensos. Las tabletas o gránulos se pueden cubrir como se desee.

Un medicamento de inyección se puede preparar por adición de agentes de ajuste de pH, tampones, agentes de suspensión, ayudas de disolución, estabilizadores, agentes isotónicos, antioxidantes, preservantes y procesándolos por un método conocido. Aquí, el medicamento puede ser un medicamento liofilizado. La inyección se puede hacer de forma intravenosa, subcutánea o intramuscular.

Entre los ejemplos de los agentes de suspensión se incluyen metilcelulosa, polisolvato 80, hidroxietilcelulosa, goma arábiga, goma tragacanto en polvo, carboximetilcelulosa de sodio y polioxietilensorbitan-monolaureato.

Entre los ejemplos de las ayudas de disolución se incluyen aceite de ricino endurecido con polioxietileno, polisolvato 80, amida nicotínica y polioxietilensorbitan-monolaureato.

Entre los ejemplos de preservantes se incluyen paraoxibenzoato de metilo, paraoxibenzoato de etilo y ácido sórbico.

La presente invención se refiere además al uso de un extracto derivado de caña de azúcar, de acuerdo con la invención, en el que el extracto derivado de caña de azúcar se administra en forma de un alimento o un pienso para animales.

Los ejemplos de los alimentos incluyen confitería, refrescos, condimentos funcionales, y alimentos para la salud. Los ejemplos de pienso para animales incluyen alimento para mascotas tales como alimentos para perros o alimentos para gatos, piensos para animales domésticos y piensos para peces y mariscos de cultivo.

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Ejemplos

La presente invención será explicada más específicamente. La descripción de una dosis tal como "10 mg/kg" ó "10 mg/kg de peso", significa una dosis de 10 mg por kg de peso corporal.

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Ejemplo de Preparación 1

Se calentaron seiscientos cincuenta litros de un jugo de molino (contenido de sólidos de 18,8%), obtenidos en un proceso de preparación de azúcar en un ingenio azucarero hasta 80ºC con un calentador de jugos y a continuación se filtraron a través de una membrana de ultrafiltración de tipo tubular (Daicel Chemical Industries Ltd., tipo MH-25, área efectiva de membrana de 2 m^{2} x 3 tubos, peso molecular de exclusión de 100.000) para obtener aproximadamente 600 litros de jugo tratado.

Se empacaron quince litros de un adsorbente sintético (SP-850, nombre comercial, ex-Mitsubishi Chemical Co.) en una columna provista con camisa de agua (tamaño de columna: diámetro interno de 17,0 cm y altura de 100 cm). El jugo tratado antes mencionado se pasó a través de la columna a un caudal de 30 litros/hora (Velocidad espacial = 2 horas^{-1}). Durante el pase del jugo de caña de azúcar filtrado, siempre circuló por la camisa agua a 65ºC. A continuación, la columna se lavó haciendo pasar 45 litros de agua tratada por intercambio iónico a través de la columna a un caudal de 30 litros/hora (SV = 2 horas^{-1}). Después de lavar con agua tratada por intercambio iónico, se confirmó que el Brix del efluente era aproximadamente cero, medido por un medidor Handref Brix (ex-Atago Company, tipo N-1E). A continuación, se pasó a través de la columna una solución acuosa de etanol al 55% (etanol/agua = 55/45 en relación volumétrica) como disolvente de elución a un caudal de 30 litros/hora (SV = 2,0 hora^{-1}) para eluir los ingredientes adsorbidos al adsorbente sintético. Durante el paso del disolvente de elución, se circuló siempre agua a 25ºC a través de la camisa de agua. El efluente de la columna se colectó en cada porción de 5 litros. El patrón de elución se muestra en la figura 1, donde -1- indica el punto de comienzo del paso del jugo de caña de azúcar filtrado; -2-, el punto de comienzo del lavado con agua tratada por intercambio iónico; y -3-, el punto de comienzo de la elución con la solución acuosa de etanol al 55%. En la figura, los círculos rellenos muestran la absorbancia a 420 nm y los cuadrados vacíos muestran los Brix de cada fracción. La fracción eluida con la solución acuosa de etanol al 55% (correspondiente a la parte "A" en la figura 1), se condensó al vacío aproximadamente 20 veces con un concentrador. Después de liofilizar el concentrado
durante toda la noche, se obtuvieron 460 g de polvo marrón, o sea, de extracto derivado de caña de azúcar.

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Ejemplo de Preparación 2

Se trataron seiscientos litros de un jugo clarificado (contenido de sólidos de 11,7%) obtenidos en un proceso de preparación de azúcar en un ingenio azucarero de la misma manera que en el Ejemplo de Preparación 1, excepto que el jugo no fue tratado por ultrafiltración. El patrón de elución es como se muestra en la figura 2, donde -1- indica el punto de partida del paso del jugo clarificado; -2-, el punto de partida del lavado con agua tratada por intercambio iónico; -3-, el punto de partida de la elución con la solución acuosa de etanol al 55%. La fracción "B" en la figura 2, se colectó y se condensó al vacío. Después de liofilizar el concentrado durante la noche, se obtuvieron 225 g de polvo marrón, o sea, de extracto derivado de caña de azúcar.

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Ejemplo de Preparación 3

Se puso un kilogramo de bagazo seco obtenido en el ingenio azucarero se puso en una bolsa formada por una red de nylon y la bolsa que contenía el bagazo en un tanque, al que se adicionaron 25 L de agua a 80ºC, y la extracción se llevó a cabo con agitación. Después de una hora de extracción, el extracto líquido obtenido se filtró con un filtro de algodón para eliminar sustancias extrañas. El filtrado se concentró al vacío con un concentrador centrífugo de capa fina. Después de liofilizar el concentrado durante toda la noche, se obtuvieron 26,31 g de polvo marrón, o sea de extracto derivado de caña de azúcar.

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Ejemplo de Preparación 4

Se colocaron trescientos cincuenta gramos de bagazo seco obtenido en un ingenio azucarero en una bolsa formada por una red de nylon y se colocó en un tanque, al que se adicionaron 5.250 mL de etanol/agua, en una relación volumétrica de 50/50, y la extracción se llevó a cabo con agitación. Después de dos horas de extracción, el líquido obtenido se filtró con un papel de filtro No. 2, ex-Advantec Toyo Co., para eliminar sustancias extrañas. El filtrado se concentró al vacío con un evaporador. Después de liofilizar el concentrado durante toda la noche, se obtuvieron 6,72 g de polvo marrón, o sea de extracto derivado de caña de azúcar.

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Ejemplo de Preparación 5

Separación por una cromatografía de columna con lecho en pseudomovimiento con el uso de una resina de intercambio iónico

Una segunda melaza se sometió a una separación en columna de intercambio iónico usando un lecho en pseudomovimiento de una resina de intercambio catiónico, dichas melazas se habían obtenido por colección doble de los cristales de sacarosa en una marmita de un ingenio azucarero y por centrifugación del sirope remanente para eliminar los cristales.

Los procesos, desde la preparación de la materia prima hasta la separación en columna cromatográfica de intercambio iónico, se realizaron de manera continua, y el contenido de sólidos y la composición mostrada más adelante son aquellas medidas en una operación continua, aunque varían un poco con el tiempo.

Las segundas melazas tenían un Brix de aproximadamente 85. Esta concentración era demasiado elevada para ser tratada por cromatografía de columna, de manera que las melazas se diluyeron hasta un Brix de aproximadamente 50. A ésta se añadieron cal apagada y carbonato de calcio para aglomerar las impurezas y luego se filtró a través de tierra diatomeacea. El filtrado obtenido tenía un Brix de 47,3, una polarización de 23,6, una pureza de 49,9 y un contenido de azúcares reductores de 2,5%. Este filtrado se sometió a cromatografía de intercambio iónico.

La cromatografía de intercambio iónico se llevó a cabo por un método de separación continua con lecho de pseudomovimiento con uso de una resina de intercambio catiónico UBK530, ex-Mitsubishi Chemical Co. La columna de separación empacada con la resina tenía 8 secciones, cada una de las cuales contenía 6,5 m^{3} de la resina. La alimentación líquida y el agua como eluyente se suministraron de forma continua a distintas secciones cada cierto intervalo de tiempo predeterminado y una fracción que contenía sacarosa y una que contenía menos sacarosa se tomaron de distintas secciones a cada intervalo de tiempo predeterminado. Las condiciones de operación en estado estacionario fueron las siguientes: el caudal de la corriente de alimentación fue de 3 m^{3}/h; el caudal de agua eluyente fue de 13,5 m^{3}/h; el caudal de retirada de la fracción con menos sacarosa fue de 12,35 m^{3}/h; el caudal de retirada de la fracción que contenía sacarosa fue de 4,37 m^{3}/h; y el intervalo de cambio fue de 267 segundos. Por este tratamiento cromatográfico, la fracción que contenía sacarosa y la fracción con menos sacarosa se separaron una de la otra. La primera corresponde a las fracciones 10 a 17 en la figura 3, y la última a las fracciones 1 a 9 y fracciones 18 a 30. La fracción que contiene sacarosa tiene un contenido de sacarosa, determinado por HPLC, de aproximadamente 87% por peso de sólido, y un Brix de aproximadamente 35. Esta fracción se combinó con el jugo clarificado y se recicló al proceso principal para recuperar sacarosa de nuevo. La fracción con menos sacarosa tenía un contenido de sacarosa, determinado por HPLC, de aproximadamente 0,3% y un Brix de aproximadamente 8. Esta fracción se condensó en una marmita al vacío hasta un Brix de 40,0, polarización de 2,3, pureza de 5,8 y contenido de azúcares reductores de 5,4%. Esta fracción se liofilizó durante toda la noche para ser usada en pruebas posteriores. Se disolvieron cero coma veinticinco gramos del polvo liofilizado obtenido en tampón fosfato 0,5 mM a pH 7,5 en un volumen total de 100 mL, al cual se le determinó una absorbancia de 1,1 a 420 nm.

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Ejemplo de Preparación 6

Fraccionamiento de una segunda melaza mediante una separación por lotes en columna única utilizando una resina de intercambio iónico

Se sometió un líquido preparado mediante tratamiento de una segunda melaza obtenida en un ingenio azucarero a separación cromatográfica iónica por lotes en una columna única.

El líquido se preparó diluyendo una segunda melaza y lavando con carbonato sódico y filtrando a través de tierra diatomeacea. Este material de partida líquido tenía un Brix de 47,4, polarización de 23,2, pureza de 48,9 y un contenido de azúcar reductor de 3,2%.

Este material de partida líquido se sometió a fraccionamiento mediante separación cromatográfica iónica por lotes en una columna única utilizando el sistema FPLC (Pharmacia Co.). La columna se empacó con 500 mL de una resina en forma de gel de intercambio catiónico fuertemente acídica en forma sódica, UBK 530, ex-Mitsubishi Chemical Co. La columna tenía un diámetro interno de 26 mm y una altura de 1000 mm, equipada con un adaptador de caudal. Se pasó agua destilada desgasificada como eluyente a un caudal de SV = 0,5 h^{-1} (4,17 mL/min) a 60ºC.

Se alimentaron a la columna aproximadamente 25 mL del material de partida. La colecta del efluente se comenzó aproximadamente 30 minutos después de alimentar el material de partida. El efluente se colectó durante 3,6 min por cada tubo de ensayo (aproximadamente 15 mL por tubo) y se recuperó el efluente de 30 tubos en total.

Cada una de las 30 fracciones se analizó por absorbancia a 420 nm, conductividad eléctrica y contenido de azúcar. Los resultados son tal como se muestra en la figura 3. Para mediar la absorbancia a 420 nm, se diluyeron 0,1 mL de cada fracción con 2 mL de tampón fosfato 0,5 mM a pH 7,5. Para medir la conductividad eléctrica, se diluyó cada fracción con agua destilada hasta el 0,5%. El contenido de sacarosa se midió mediante HPLC.

Para examinar la relación de la actividad antiviral de cada uno de los picos cromatográficos, se agruparon las fracciones correspondientes al pico de la absorbancia a 420 nm en 4 muestras; aquellas que corresponden al pico de sacarosa en 3 muestras y aquellas que corresponden al efluente después del pico de sacarosa en 1 muestra. Es decir, las fracciones 3 y 4 se unieron como la muestra 1; las fracciones 5 y 6 como la muestra 2; las fracciones 7 y 8 como la muestra 3, las fracciones 9 y 10 como la muestra 4, las fracciones 11 y 12 como la muestra 5; las fracciones 13 y 14 como la muestra 6, las fracciones 15 y 16 como la muestra 7 y las fracciones 17 a 30 como la muestra 8. Las fracciones 1 y 2 se desecharon ya que no se eluyó prácticamente nada. Cada muestra se liofilizó durante toda la noche hasta convertirla en polvo. Se disolvieron 0,25 g del polvo liofilizado obtenido en tampón fosfato 0,5 mM a pH 7,5 hasta un volumen total de 100 mL a los que se les determinó absorbancia a 420 nm. Los resultados se muestran en la tabla 1. La muestra 8 tuvo una absorbancia relativamente grande de 0,86, debido a que era una colecta de la cola del pico. Mientras que las muestras diferentes a la muestra 8 eran cada una mezclas de dos fracciones, la muestra 8 era una mezcla de 14 fracciones. Por lo tanto, la muestra 8 tiene una absorbancia mayor, pero no es eficiente para el propósito de la presente invención colectar solamente estas fracciones. En la tabla 1, el contenido de ceniza con conductividad eléctrica se calculó a partir de un factor determinado de una correlación de conductividades eléctricas con contenidos de ceniza de sulfato conocidos.

Los resultados analíticos se muestran en la tabla 1. En la tabla, una relación de distribución de un contenido de sólido liofilizado significa una relación de peso de un contenido de sólidos de cada muestra con respecto al contenido de sólidos total de todas las muestras. El contenido de ceniza con conductividad eléctrica y el contenido de cada sacárido son relaciones de éstos con respecto al contenido de sólidos de cada muestra.

Considerando cada uno de los contenidos de sacáridos, se observa que las muestras 1 a 3 corresponden con una fracción con menos azúcares y las muestras 4 a 8 a una fracción que contiene azúcares.

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TABLA 1 Datos analíticos de las muestras de la segunda melaza fraccionadas con una resina de intercambio iónico

1

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Ejemplo de Preparación 7

Desalinización del extracto obtenido mediante separación cromatográfica iónica

Utilizando un baño de electrodiálisis, CH-0, ex-Asahi Glass Co., provisto de una membrana de intercambio catiónico, Selemion CMV y una membrana de intercambio aniónico, Selemion AMV, ambas ex-Asahi Glass Co., el extracto derivado de caña de azúcar (extracto líquido condensado) preparado en el Ejemplo de preparación 5 se desalinizó mediante electrodiálisis.

Se utilizaron diez litros de una solución de cloruro sódico a 100 g/L como solución de condensación y 4,0 litros de una solución de sulfato sódico a 50 g/L como solución de electrodo. Como material de partida se utilizaron 10,7 litros del efluente de la cromatografía iónica.

Las condiciones de funcionamiento fueron las siguientes. Se mantuvo constante el voltaje eléctrico a 3,0 V. Inicialmente, la corriente eléctrica fue de 8,15 A, que se disminuyó gradualmente mientras avanzaba la desalinización. Cuando transcurrieron 5 horas, la corriente eléctrica fue de 1,6 A, se extrajeron 8 litros del líquido de condensación y se añadieron 8 litros de agua para dilución. Posteriormente, se reanudó la operación y se continuó durante 7 horas en total. La corriente eléctrica final fue de 0,6 A. El avance de la desalinización se monitorizó mediante la medición de las concentraciones del ión cloruro y del ión sulfato en el líquido desalinizado en el tiempo. En la desalinización por electrodiálisis, se eliminan cantidades equivalentes de aniones y cationes. Se eliminan cationes tales como ión potasio, ión sodio, ión calcio e ión magnesio de forma casi igual independientemente de la especie de ión, pero los aniones tales como ión cloruro e ión sulfato se eliminan en una proporción diferente. En este Ejemplo, las concentraciones de ión cloruro e ión sulfato por sólido seco, como aniones típicos, se determinaron mediante HPLC y se calcularon sus proporciones de eliminación. Al comienzo de la desalinización, el contenido de ión cloruro por sólido seco del extracto a ser desalinizado fue de 5,45% en peso, el de ión sulfato fue de 7,41% en peso y el de las sales de sulfato fue de 43,0% en peso. Después de terminar la desalinización, el contenido de ión cloruro por sólido seco fue de 0,03% en peso (proporción de eliminación de 99,4%), el de ión sulfato fue de 6,61% en peso (proporción de eliminación de 10,8%) y el de las sales de sulfato fue de 34,7% en peso (proporción de eliminación de 19,3%).

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Mediante electrodiálisis, solamente se eliminó una pequeña cantidad de iones sulfato, pero se eliminó la mayoría de los iones cloruro. El extracto obtenido se liofilizó durante toda la noche hasta convertirlo en un polvo. Se disolvieron 0,25 gramos del polvo obtenido en tampón fosfato 50 mM a pH 7,5 hasta un volumen total de 100 mL, al que se le midió absorbancia a 420 nm. La absorbancia fue de 1,26.

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Ejemplo de Prueba 1

Ensayo de toxicidad aguda del extracto derivado de caña de azúcar

Utilizando el polvo de extracto preparado en el Ejemplo de Preparación 1, se llevó a cabo un ensayo de toxicidad mediante administración oral única utilizando ratas. Se pusieron en cuarentena 16 ratas hembras y 16 ratas machos Sprague-Dawley línea SPF (Crj:CD(SD)) de 5 semanas de edad y se alimentaron durante aproximadamente una semana. Se seleccionaron las ratas saludables y se sometieron al ensayo con 6 semanas de edad. En el momento de la administración, las ratas machos pesaban entre 157 y 171 gramos y las ratas hembras entre 123 y 133 gramos.

Las ratas se alimentaron en una habitación iluminada para animales durante 12 horas a una temperatura de 23 +/- 3ºC, una humedad relativa de 50 +/- 2% y a una frecuencia de ventilación de 10 a 15 veces por hora, en las que las ratas se dejaron que consumieran libremente el alimento sólido CRF-1, marca comercial, ex-Oriental Yeast Co. y agua potable. A las ratas se les dejó en ayunas durante toda la noche (durante 16 horas) antes del día de la administración, se les administró oralmente de forma forzada polvo de extracto derivado de caña de azúcar a una concentración predeterminada una vez a 10 mL/kg de peso corporal. Al grupo de control solamente se les administró agua destilada esterilizada de una manera similar. La alimentación se reanudó 6 horas después de la administración.

Además del grupo de control, hubo dos grupos con diferentes dosis de 200 mg/kg y 1000 mg/kg. De esta manera, se ensayaron 3 grupos en total. Cada grupo consistió en 5 machos y 5 hembras. Los resultados se muestran en la tabla 2.

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TABLA 2 Ensayo de toxicidad mediante administración oral única

2

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Se estimó que la dosis letal era mayor que 1000 mg/kg, debido a que ninguna de las ratas hembras ni machos murieron 14 días después de la administración de la dosis máxima de 1000 mg/kg.

Durante la alimentación de las ratas, no se observó ninguna anormalidad en ninguna de las ratas. Además, los grupos a los que se les administró una dosis mostraron un cambio en el peso corporal casi idéntico que el grupo de control y su aumento de peso corporal durante el periodo de observación fue casi el mismo que los del grupo de control. En un examen anatómico, en ninguna rata se observaron anormalidades en órganos y tejidos en la superficie del cuerpo, cabeza, pecho y región abdominal.

A juzgar a partir de los resultados antes mencionados, la toxicidad del polvo de extracto obtenido en el Ejemplo de Preparación 1 es extremadamente baja, cuando el polvo se administra vía oral a una rata una vez.

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Ejemplo de Prueba 2

Actividad antibacteriana del extracto derivado de caña de azúcar contra E. coli

Utilizando cada uno de los polvos de extractos preparados en los Ejemplos de preparación 1 a 4, se determinaron las concentraciones inhibidoras de crecimiento mínimas (MIC, \mug/mL) para 6 cepas de Escherichia coli (E. coli) según el método especificado por la Asociación Japonesa de Quimioterapia. El extracto se disolvió y se diluyó con agua destilada esterilizada hasta cinco niveles de concentración de 100 \mug/mL, 300 \mug/mL, 1000 \mug/mL, 3000 \mug/mL y 10000 \mug/mL y se determinó MIC. Se encontró que MIC era de 10000 \mug/mL para todas las 6 cepas de E. coli, de manera que no se observó actividad antibacteriana fuerte. Los resultados se muestran en la tabla 3 a continuación.

TABLA 3 Concentración de inhibición del crecimiento mínima para cada una de las bacterias

3

Se llevaron a cabo experimentos similares para varias cepas de otras bacterias, levaduras y hongos. Los MIC para bacterias (Pseudomonas aureofaciens), levaduras (Saccharomyces cerevisiae, Hansenula anomala, etc.) y hongos (Chaetomium globsum) fueron de 1000 \mug/mL, lo que indica una actividad antibacteriana más fuerte que contra E. coli.

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Ejemplo de Prueba 3

Propiedad de inhibición de la proliferación del extracto derivado de caña de azúcar

Utilizando cada uno de los polvos de extractos preparados en los Ejemplos de Preparación 1 y 2, se examinó la propiedad de inhibición de la proliferación contra el virus Coxsackie tipo B6 cepa Schmitt y el virus de Herpes simple tipo 1 cepa HF.

Al inicio, se examinó la citotoxicidad del extracto para células derivadas de pulmón de embriones humanos (célula HEL-R66). El extracto derivado de caña de azúcar se disolvió y se diluyó con agua destilada esterilizada hasta una concentración de 125 hasta 2000 \mug/mL y se aplicó a cultivos celulares. Después de cultivar durante 4 días, se observó existencia de desnaturalización en las células con un microscopio. Tal como se muestra en la tabla 4, no se observó toxicidad hacia las células hasta una concentración de 1000 \mug/mL.

A continuación, se inocularon en las células 100 PPU de virus. Después que los virus fueron absorbidos por las células, se eliminó el exceso de virus. Se añadió el extracto derivado de caña de azúcar al medio de mantenimiento para las células, en una cantidad tal que la concentración final del extracto estaba en el intervalo de 125 a 1000 \mug/mL. Las células con los virus adsorbidos en las mismas se cultivaron durante 4 días. Después de cultivarlas, se observó la proliferación de las células con un microscopio. Tal como se muestra en las tablas 5 y 6, se encontró que el extracto derivado de caña de azúcar no tuvo ningún efecto de inhibición de la proliferación contra el virus Coxsackie, mientras que tuvo
un efecto de inhibición de la proliferación contra el virus del Herpes a una concentración desde 500 a 1000 \mug/mL.

TABLA 4 Citotoxicidad

4

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TABLA 5 Propiedad de inhibición de la proliferación contra virus Coxsackie tipo B6 cepa Schmitt

5

TABLA 6 Propiedad de inhibición de la proliferación contra virus tipo Herpes simple cepa 1HF

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Ejemplo 1

Se utilizaron ratones machos S1c:ICR de 5 semanas de edad (aproximadamente 30 g de peso corporal) en 10 ratones por grupo. Cada uno de los extractos preparados en los Ejemplos de Preparación 1 a 4 mencionados anteriormente se disolvieron o suspendieron en agua destilada esterilizada. La solución o suspensión de extracto se les administró por vía oral a los ratones en una cantidad de 100 mg/kg ó 500 mg/kg el día antes de la inoculación de E. coli. Al grupo de control de los ratones, se les administró por vía oral el mismo volumen de agua destilada esterilizada. Se les inoculó a los ratones una suspensión de E. coli de origen humano por vía subcutánea en una cantidad de 0,2 mL, que se corresponde con 1 dosis letal mínima MLD, (4,0 x 10^{7} CFU/ratón). La proporción de supervivencia de cuatro días se determinó cuatro días después de la inoculación. Los resultados se evaluaron mediante la prueba \chi^{2}, tal como se muestra en la tabla 7.

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TABLA 7 Ensayo de prevención de la infección contra E. coli

7

8

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Los grupos que fueron inoculados con E. coli después de la administración del extracto derivado de caña de azúcar mostraron claramente proporciones de supervivencia mayores, cuya proporción aumentó con el aumento de la cantidad administrada. Es decir, fue reconocido un efecto de prevención de la infección en el extracto derivado de caña de azúcar.

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Ejemplo 2 1) Extractos ensayados

Además de los extractos derivados de caña de azúcar preparados en los Ejemplos de Preparación 1 a 4, también se prepararon los siguientes extractos. De esta manera, el primer extracto preparado en el Ejemplos de Preparación 2 se resuspendió en agua destilada esterilizada y se dializó contra agua esterilizada en un tubo de diálisis hecho de éster de celulosa con un peso molecular de fraccionamiento de 1000 (Spectra/Por. nombre comercial, membrana de éster de celulosa MWCO: 1000, ex-Spectrum Co.). El líquido resultante en el interior de la membrana de diálisis, que es referido como la fracción con un peso molecular de 1000 o más, y el líquido en el exterior de la membrana, que es referido como la fracción con un peso molecular menor de 1000, se condensaron hasta secar y se utilizaron para los ensayos.

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2) Ensayo antiviral

Se utilizaron ratones machos S1c:ICR de 5 semanas de edad (aproximadamente 30 g de peso corporal) en 10 ratones por grupo. Cada uno de los extractos preparados en los Ejemplos de Preparación 1 a 4, la fracción con un peso molecular de 1000 o más y la fracción con un peso molecular menor de 1000 del Ejemplo de Preparación 2 se disolvieron o suspendieron en agua destilada esterilizada. La solución o suspensión de extracto se le administró por vía oral o intramuscular a los ratones en una cantidad mostrada en la tabla 7. La administración se realizó 3 veces en total, es decir, inmediatamente después, un día después y dos días después de la inoculación del virus, ó 9 veces en total, es decir, tres veces al día x 3 días consecutivos. Al grupo de referencia de los ratones, se le administró por vía oral el mismo volumen de agua destilada esterilizada. Una suspensión de virus de Pseudorabia de origen porcino se les inoculó por vía subcutánea a los ratones en una cantidad de 0,2 mL, que se corresponde con 1 MLD (133 PFU/ratón). Se determinó la proporción de supervivencia a los 7 días. Los resultados se evaluaron mediante la prueba \chi^{2}, tal como se muestra en la tabla 8.

TABLA 8 Ensayo de prevención de la infección contra virus

9

Los grupos administrados con el extracto derivado de caña de azúcar mostraron claramente proporciones de supervivencia mayores que aumentaron con el incremento de la cantidad de administración. Es decir, se reconoció un efecto preventivo de infección en el extracto derivado de caña de azúcar. En el extracto procesado a partir del Ejemplo de Preparación 2, la fracción con un peso molecular menor de 1000 tuvo un efecto superior que la fracción con un peso molecular de 1000 o más. Se obtuvo una proporción de supervivencia significativa mediante la administración por vía intramuscular. De esta manera, se encontró que el extracto derivado de caña de azúcar de la presente invención es también eficaz cuando se administra por vía intramuscular en base a esto.

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Ejemplo 3 Efecto de prevención de infección contra E. coli mediante el consumo de la fracción con menos sacarosa 1) Extracto ensayado

Se ensayaron el polvo de extracto preparado mediante separación cromatográfica por iones en el Ejemplo de Preparación 5 y el polvo de extracto desalinizado preparado mediante separación cromatográfica en el Ejemplo de Preparación 7.

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2) Ensayo de efecto preventivo contra infección por E. coli

Se utilizaron ratones machos S1c:ICR de 5 semanas de edad (aproximadamente 30 g de peso corporal) en 10 ratones por grupo. Cada uno de los extractos mencionados anteriormente se disolvieron o suspendieron en agua destilada esterilizada se les administró a los ratones por vía oral en una cantidad mostrada en la tabla 9 el día antes de la inoculación con E. coli. Al grupo de control de los ratones, se les administró por vía oral el mismo volumen de agua destilada esterilizada. Se les inoculó por vía subcutánea una suspensión de E. coli de origen humano a los ratones en una cantidad de 0,2 mL que se corresponde con 1 MLD (4,0 x 10^{7} CFU/ratón). Se determinó la proporción de supervivencia a los cuatro días. Los resultados evaluados por la prueba de \chi^{2} se muestran en la tabla 9.

Los grupos a los que se les administró el extracto derivado de caña de azúcar mostraron claramente proporciones de supervivencias mayores, que aumentaron con el incremento de la cantidad de administración. No se observó efecto de la desalinización.

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TABLA 9 Ensayo de prevención de infección contra E. coli

11

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Ejemplo 4 Efecto antiviral del consumo de la fracción con menos azúcares 1) Extractos ensayados

Se ensayaron un total de 10 extractos: el polvo del extracto preparado en el Ejemplo de Preparación 5, los polvos de las muestras 1 a 8 preparadas en el Ejemplo de Preparación 6 y el polvo de extracto desalinizado preparado mediante separación cromatográfica en el Ejemplo de Preparación 7.

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2) Ensayo antiviral

Se utilizaron ratones machos S1c:ICR de 5 semanas de edad (aproximadamente 30 g de peso corporal) en 10 ratones por grupo.

Cada uno de los extractos mencionados anteriormente se disolvieron o suspendieron en agua destilada esterilizada y se les administró de forma forzada a los ratones por vía oral en una cantidad mostrada en la tabla 10. La administración se realizó 3 veces en total, es decir, inmediatamente después, un día después y dos días después de la inoculación del virus. Al grupo de control de los ratones, se les administró por vía oral de forma forzada el mismo volumen de agua destilada esterilizada. Se les inoculó por vía subcutánea una suspensión de virus de Pseudorabia de origen porcino a los ratones en una cantidad de 0,2 mL que se corresponde con 1 MLD (133 PFU/ratón). Se determinó la proporción de supervivencia a los siete días. Los resultados se evaluaron por la prueba de \chi^{2}, tal como se muestran en la tabla 10.

Los grupos a los que se les administró el extracto derivado de caña de azúcar mostraron claramente proporciones de supervivencias mayores, que aumentaron con el incremento de la cantidad de administración.

Los extractos que tienen un contenido mayor de no azúcares, es decir, el extracto del Ejemplo de Preparación 5, los extractos de las muestras 1 a 3 del Ejemplo de Preparación 6 y el extracto del Ejemplo de Preparación 7 mostraron proporciones de supervivencia particularmente altas. Por lo tanto, no se considera que sea el azúcar el ingrediente activo en la presente invención.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 10 Ensayo de prevención de la infección contra virus

12

Ejemplo de Prueba 4

Fracciones separadas con Sephadex G-25, sobre la base del peso molecular, del extracto líquido separado mediante cromatografía iónica y extracto de bagazo y efecto antiviral de los mismos

Se llevó a cabo una cromatografía de permeación en gel al extracto preparado en el Ejemplo de Preparación 3 (extracción del bagazo con agua caliente) y al extracto preparado en el Ejemplo de Preparación 5 (extracto líquido preparado por cromatografía iónica) para fraccionamiento sobre la base del peso molecular.

Los extractos mencionados anteriormente se trataron previamente para evitar la obstrucción provocada por los precipitados posiblemente presentes en el extracto. El extracto del Ejemplo de Preparación 3 se diluyó hasta un Brix de 17,5 a 17,8 con agua destilada y se centrifugó a 600 x g durante 15 minutos para eliminar materiales insolubles. El sobrenadante se filtró por succión a través de un filtro de papel No. 2, ex-Advantec Toyo Co., o un papel de filtro de fibra de vidrio GA55, ex-Advantec Toyo Co. El filtrado se sometió a cromatografía de permeación en gel. El extracto del Ejemplo de Preparación 5 se diluyó hasta un Brix de 18,7 a 22,2 con agua destilada y se filtró a través de un papel de filtro de fibra de vidrio GA55, ex-Advantec Toyo Co. El filtrado se sometió a cromatografía de permeación en gel.

Se empacó una columna que tenía un diámetro interior de 26 mm y una altura de 630 mm, con 315 mL de Sephadex G-25 Superfine, nombre comercial de Amersham Pharmacia Biotech Co. Se utilizó el sistema FPLC, ex-Pharmacia Co, para la cromatografía.

Se utilizó como eluyente una solución desgasificada de etanol/agua = 35/65 por volumen, que se hizo pasar a través de la columna a un caudal de SV=0,25 h^{-1} (1,32 mL/min) a temperatura ambiente. Para el extracto del Ejemplo de Preparación 3, la cantidad de muestra alimentada fue de 6 mL cuando se filtró con el papel de filtro No. 2 y 17 mL cuando se filtró con el papel de filtro de fibra de vidrio. Para el extracto del Ejemplo de Preparación 5, se alimentaron 6 mL. La cromatografía se repitió, como mínimo, 5 veces en las mismas condiciones para confirmar la reproducibilidad del cromatograma. Aproximadamente a los 80 minutos después que se inició la alimentación de la muestra, se comenzó la colecta. Se colectaron un total de 20 fracciones para cada uno de los extractos de los Ejemplos de Preparación 3 y 5. El cromatograma es tal como se muestra en las figuras 4 y 5. La figura 6 muestra un cromatograma de un marcador de peso molecular en las mismas condiciones.

Las 20 fracciones se combinaron en tres muestras: la muestra 1, que consiste en las fracciones 1 a 4, que contiene las sustancias con peso molecular de 10000 o más, las muestra 2, que consiste en las fracciones 5 a 11 hasta la parte frontal del pico de conductividad eléctrica y la muestra 3, que consiste en las fracciones 12 a 20, que contiene muchas sales.

Estas muestras 1 a 3 se liofilizaron hasta convertirlas en polvo. Los resultados de los análisis son tal como se muestran en la tabla 11. En este caso, las definiciones de proporción de distribución de contenidos de sólido liofilizado y sacáridos son las mismas que para la tabla 1. Utilizando cada uno de los polvos, se realizó un ensayo antiviral de la misma manera que en el Ejemplo 4. Los resultados son tal como se muestran en la tabla 12.

No se observaron diferencias significativas entre las muestras 1 a 3. A partir de esto, se observa que existen varias sustancias activas antivirales tanto en el extracto obtenido por separación cromatográfica iónica como en el extracto de bagazo con agua caliente, cuyas sustancias tienen un intervalo amplio de pesos moleculares.

TABLA 11

13

TABLA 12 Ensayo de prevención de la infección contra virus

14

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Ejemplo 5 Evaluación de los efectos de los adyuvantes de vacunas 1) Extractos ensayados

Se ensayaron los siguientes extractos: el polvo del extracto preparado por columna cromatográfica en el Ejemplo de Preparación 1, el polvo del extracto preparado a partir de bagazo en el Ejemplo de Preparación 3, el polvo del extracto preparado mediante cromatografía iónica en el Ejemplo de Preparación 5 y el polvo del extracto preparado por desalinización del extracto obtenido por cromatografía iónica en el Ejemplo de Preparación 7.

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2) Evaluación de los efectos de adyuvante de vacuna

Se utilizaron ratones machos S1c:ICR de 5 semanas de edad (aproximadamente 30 g de peso corporal) en 10 ratones por grupo.

Se ensayaron los efectos de adyuvante de vacuna en la administración de varios extractos derivados de caña de azúcar a los ratones.

Para los grupos a los que se les administró extractos de los Ejemplos de Preparación 1, 3, 5 y 7, se diluyó la vacuna contra el virus de Pseudorabia de origen porcino disponible comercialmente (AWV) con solución salina fisiológica aproximadamente 20 veces y se les administró a los ratones por vía intramuscular 0,2 mL de la suspensión. Se disolvió cada polvo de extracto en una cantidad de 500 mg menos contenido de azúcares/kg en 0,5 mL de agua destilada. La solución de extracto se administró por vía oral a los ratones una vez al día durante 6 días, comenzando el día de la vacunación. Catorce días después de la vacunación, se les inoculó a los ratones por vía subcutánea 0,2 mL de una suspensión de virus de Pseudorabia de origen porcino diluido con una solución salina fisiológica, que corresponde con 1 MLD y se determinó la proporción de supervivencia a los 7 días.

Tal como para el extracto del Ejemplo de Preparación 3, se utilizó un grupo adicional de ratones a los que se les administró una mezcla de la vacuna y una solución preparada disolviendo la extracción en una cantidad de 100 mg de menos contenido de azúcares/kg en 0,5 mL de agua esterilizada.

Al grupo sin vacunación, se les administró 0,2 mL de una solución salina fisiológica en vez de la vacuna y 0,5 mL de agua esterilizada en vez del extracto. Al grupo sin administración del extracto, se les administró 0,5 mL de agua esterilizada en vez del extracto.

Se evaluaron los efectos del adyuvante mediante la prueba \chi^{2} contra la proporción de supervivencia del grupo sin administración del extracto (se les administró solamente con vacuna). Los resultados se muestran en la tabla 13.

No se observaron diferencias significativas entre el grupo sin administración de vacuna y el grupo sin administración de extracto. El grupo al que se le administró por vía intramuscular la mezcla de extracto y la vacuna no mostró diferencia significativa en la proporción de supervivencia. Por el contrario, en los grupos en los que se administraron por vía oral los extractos derivados de caña de azúcar se observaron aumentos significativos de las proporciones de supervivencia, lo que indica que el presente extracto es efectivo como adyuvante de vacunas.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 13 Evaluación de efectos de adyuvantes de vacunas

15

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Ejemplo 6 1) Extractos ensayados

Se ensayaron los siguientes extractos: el polvo del extracto preparado en los Ejemplos de Preparación 1 a 4 y los polvos de extracto del Ejemplo de Preparación 2 procesado de la misma manera que en el Ejemplo 2, es decir, la fracción con un peso molecular de 1000 o menor y la fracción con un peso molecular mayor de 1000.

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2) Efecto anti-endotoxina

Se utilizaron ratones machos S1c:ICR de 5 semanas de edad (aproximadamente 30 g de peso corporal) en 10 ratones por grupo.

Los extractos de los Ejemplos de Preparación 1 a 4 y el extracto procesado del Ejemplo de Preparación 2 se disolvieron cada uno o se suspendieron en agua destilada esterilizada y se administró por vía oral a los ratones en una cantidad de 100 mg/kg dos veces, un día antes y 6 horas después de la inyección de endotoxina, lipopolisacárido, en adelante referido como LPS. Al grupo de control de los ratones, se les administró por vía oral el mismo volumen de agua destilada esterilizada. Se inyectó LPS de origen de E. coli a la vena caudal de los ratones en una cantidad de 0,2 mL que se corresponde con la dosis letal mínima por ataque de endotoxina. Se determinó la proporción de supervivencia a los cuatro días y se evaluó mediante la prueba \chi^{2}. Los resultados se muestran en la tabla 14.

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TABLA 14 Evaluación de efecto de choque anti-endotoxina

16

El grupo al que se le administró el extracto derivado de caña de azúcar mostró proporciones de supervivencia significativamente mayores, lo que indica que el presente extracto presenta un efecto anti-endotoxina. Para los extractos procesados del Ejemplo de Preparación 2, la fracción de menor peso molecular tuvo un efecto superior al de la fracción de mayor peso molecular.

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Ejemplo 7 Efecto anti-endotoxina 1) Extractos ensayados

Se ensayaron el polvo del extracto preparado por separación cromatográfica iónica en el Ejemplo de Preparación 5 y el polvo de extracto desalinizado por separación cromatográfica iónica en el Ejemplo de Preparación 7.

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2) Efecto anti-endotoxina

Se utilizaron ratones machos S1c:ICR de 5 semanas de edad (aproximadamente 30 g de peso corporal) en 10 ratones por grupo.

Cada uno de los extractos se disolvió o se suspendió en agua destilada esterilizada y se administró por vía oral a los ratones en una cantidad de 100 mg/kg dos veces, un día antes y 6 horas después de la inyección de endotoxina (LPS). Al grupo de control de los ratones, se les administró por vía oral el mismo volumen de agua destilada esterilizada. Se inyectó LPS de origen de E. coli a la vena caudal de los ratones en una cantidad de 0,2 mL que se corresponde con la dosis letal mínima por ataque de endotoxina. Se determinó la proporción de supervivencia a los cuatro días y se evaluó mediante la prueba \chi^{2}. Los resultados se muestran en la tabla 15.

TABLA 15 Evaluación de efecto de choque anti-endotoxina

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Ejemplo 8

Se utilizaron ratones machos S1c:ICR de 3 semanas de edad (aproximadamente 12 g de peso corporal) en 5 ratones por grupo. El grupo 1 de control se alimentó con un alimento MF estándar y los grupos 2 a 5 se alimentaron con MF estándar añadido con 0,1% de uno de los Ejemplos de Preparación 1 a 4. Al final de los 28 días de alimentación, se midió el peso corporal. Además, se colectó sangre y plasma y se sometieron a análisis bioquímico. Los resultados del aumento de peso se muestran en la tabla 16 y de los análisis bioquímicas se muestran en la tabla 17.

En la tabla 16, "aumento de peso" significa el peso ganado en el periodo de ensayo; "proporción de aumento de peso" significa una proporción del aumento de peso con respecto al peso (g) al comienzo del ensayo; y "proporción de la proporción de aumento de peso" es el porcentaje de la proporción del aumento de peso con respecto a la proporción del aumento de peso del grupo de control.

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TABLA 16 Efecto de estimulación del crecimiento del extracto

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Los grupos en los que se alimentó el extracto derivado de caña de azúcar mostraron un aumento de peso significativo, lo que indica un efecto de estimulación del crecimiento del presente extracto. No se detectó ninguna anormalidad en los análisis bioquímicos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

19

Ejemplo 9 Efecto estimulador del crecimiento de los extractos de los Ejemplos de Preparación 3, 5 y 7

Ratones machos S1c:ICR de 3 semanas de edad (aproximadamente 12 g de peso corporal) se utilizaron en 5 ratones por grupo. Se mantuvo constante la dosis de la parte no azúcar, ya que el azúcar no se considera que es el ingrediente activo. Un grupo de control se alimentó con un alimento MF estándar y los grupos de ensayo se les dio libremente alimento MF estándar añadido con 0,1% (como contenido de no azúcar) de uno de los extractos del Ejemplo de Preparación 3 (extracto de bagazo), Ejemplo 5 (extracto separado por cromatografía iónica), y Ejemplo 7 (extracto separado por cromatografía iónica y desalinizado). Al final de los 28 días de alimentación, se midió el peso corporal. Además, se colectó sangre y plasma y se sometieron a análisis bioquímico. Los resultados del aumento de peso se muestran en la tabla 18 y de los análisis bioquímicos se muestran en la tabla 19.

En la tabla 18, "aumento de peso" significa el peso ganado en el periodo de ensayo; "proporción de aumento de peso" significa una proporción del aumento de peso con respecto al peso (g) al comienzo del ensayo; y "proporción de la proporción de aumento de peso" es el porcentaje de la proporción del aumento de peso con respecto a la proporción del aumento de peso del grupo de control.

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TABLA 18 Efecto de estimulación del crecimiento del extracto

20

21

Aplicación industrial

Administrando el extracto derivado de caña de azúcar de la presente invención al hombre o a animales por vía oral, se puede prevenir o remediar la infección por bacterias y virus. Además, se pueden prevenir o remediar las enfermedades ocasionadas por endotoxina.

El extracto derivado de caña de azúcar de la presente invención funciona como un adyuvante de vacuna y también estimula el crecimiento cuando se administra por vía oral, por ejemplo, al hombre o a animales. El extracto derivado de caña de azúcar es de origen vegetal un producto natural que ha sido tomado por el hombre desde tiempos remotos como azúcar no centrifugada tal como azúcar moreno (KOKUTOU) y, por consiguiente, es seguro para la salud humana o animal. Además, el extracto se puede producir a un coste bajo. El extracto de la presente invención es un producto natural, pero posee un alto efecto preventivo o profiláctico, efecto anti-endotoxina, efecto adyuvante de vacunas y un efecto estimulador del crecimiento incluso en dosis pequeñas.

Claims (15)

1. Uso de un extracto derivado de caña de azúcar para la preparación de un agente para el tratamiento de una enfermedad o afección ocasionada por una infección bacteriana en humanos o animales, en el que el extracto derivado de caña de azúcar es una fracción obtenida al hacer pasar un material de partida seleccionado del grupo que comprende jugo de caña de azúcar, un extracto líquido a partir de caña de azúcar y melazas derivadas de caña de azúcar, a través de una columna empacada con un adsorbente sintético como portador fijo y fluir las sustancias adsorbidas en el adsorbente sintético con un disolvente seleccionado del grupo que comprende agua, metanol, etanol y mezclas de los mismos o una fracción que absorbe luz a una longitud de onda de 420 nm obtenible mediante tratamiento en una columna cromatográfica que utiliza diferencias de afinidad para una resina de intercambio iónico empacada en una columna como portador fijo.

2. Uso de un extracto derivado de caña de azúcar para la preparación de un agente para el tratamiento de una enfermedad o afección ocasionada por endotoxina en humanos o animales, en el que el extracto derivado de caña de azúcar es una fracción obtenida al hacer pasar un material de partida seleccionado del grupo que comprende jugo de caña de azúcar, un extracto líquido a partir de caña de azúcar y melazas derivadas de caña de azúcar, a través de una columna empacada con un adsorbente sintético como portador fijo y fluir las sustancias adsorbidas en el adsorbente sintético con un disolvente seleccionado del grupo que comprende agua, metanol, etanol y mezclas de los mismos o una fracción que absorbe luz a una longitud de onda de 420 nm obtenible mediante tratamiento en una columna cromatográfica que utiliza diferencias de afinidad para una resina de intercambio iónico empacada en una columna como portador fijo.

3. Uso de un extracto derivado de caña de azúcar para la preparación de un agente para el tratamiento de una enfermedad o afección ocasionada por un hongo, micoplasma, rickettsia o clamidia en humanos o animales, en el que el extracto derivado de caña de azúcar es una fracción obtenida al hacer pasar un material de partida seleccionado del grupo que comprende jugo de caña de azúcar, un extracto líquido a partir de caña de azúcar y melazas derivadas de caña de azúcar, a través de una columna empacada con un adsorbente sintético como portador fijo y fluir las sustancias adsorbidas en el adsorbente sintético con un disolvente seleccionado del grupo que comprende agua, metanol, etanol y mezclas de los mismos o una fracción que absorbe luz a una longitud de onda de 420 nm obtenible mediante tratamiento en una columna cromatográfica que utiliza diferencias de afinidad para una resina de intercambio iónico empacada en una columna como portador fijo.

4. Uso de un extracto derivado de caña de azúcar para la preparación de un agente para el tratamiento de una enfermedad o afección ocasionada por una infección viral en humanos o animales, en el que el extracto derivado de caña de azúcar es una fracción obtenida al hacer pasar un material de partida seleccionado del grupo que comprende jugo de caña de azúcar, un extracto líquido a partir de caña de azúcar y melazas derivadas de caña de azúcar, a través de una columna empacada con un adsorbente sintético como portador fijo y fluir las sustancias adsorbidas en el adsorbente sintético con un disolvente seleccionado del grupo que comprende agua, metanol, etanol y mezclas de los mismos o una fracción que absorbe luz a una longitud de onda de 420 nm obtenible mediante tratamiento en una columna cromatográfica que utiliza diferencias de afinidad para una resina de intercambio iónico empacada en una columna como portador fijo.

5. Uso de un extracto derivado de caña de azúcar para la preparación de un agente para la estimulación del crecimiento, en el que el extracto derivado de caña de azúcar es una fracción obtenida al hacer pasar un material de partida seleccionado del grupo que comprende jugo de caña de azúcar, un extracto líquido a partir de caña de azúcar y melazas derivadas de caña de azúcar, a través de una columna empacada con un adsorbente sintético como portador fijo y fluir las sustancias adsorbidas en el adsorbente sintético con un disolvente seleccionado del grupo que comprende agua, metanol, etanol y mezclas de los mismos o una fracción que absorbe luz a una longitud de onda de 420 nm obtenible mediante tratamiento en una columna cromatográfica que utiliza diferencias de afinidad para una resina de intercambio iónico empacada en una columna como portador fijo.

6. Uso de un extracto derivado de caña de azúcar como adyuvante en la preparación de una composición de vacuna, en el que el extracto derivado de caña de azúcar es una fracción obtenida al hacer pasar un material de partida seleccionado del grupo que comprende jugo de caña de azúcar, un extracto líquido a partir de caña de azúcar y melazas derivadas de caña de azúcar, a través de una columna empacada con un adsorbente sintético como portador fijo y fluir las sustancias adsorbidas en el adsorbente sintético con un disolvente seleccionado del grupo que comprende agua, metanol, etanol y mezclas de los mismos o una fracción que absorbe luz a una longitud de onda de 420 nm obtenible mediante tratamiento en una columna cromatográfica que utiliza diferencias de afinidad para una resina de intercambio iónico empacada en una columna como portador fijo.

7. Uso de un extracto derivado de caña de azúcar, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el extracto derivado de caña de azúcar se administra en forma de alimento.

8. Uso de un extracto derivado de caña de azúcar, según la reivindicación 7, en el que el alimento es un alimento animal.

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9. Uso de un extracto derivado de caña de azúcar, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la resina de intercambio iónico es una resina de intercambio catiónico.

10. Uso de un extracto derivado de caña de azúcar, según la reivindicación 9, en el que la resina de intercambio catiónico es una resina de intercambio catiónico fuertemente acídica.

11. Uso de un extracto derivado de caña de azúcar, según la reivindicación 10, en el que la resina de intercambio catiónico fuertemente ácida está en forma de ión sódico o en forma de ión potásico.

12. Uso de un extracto derivado de caña de azúcar, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 9 a 11, en el que la resina de intercambio iónico es una resina en forma de gel.

13. Uso de un extracto derivado de caña de azúcar, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 9 a 12, en el que el tratamiento cromatográfico de intercambio iónico se lleva a cabo en un método de separación continuo de lecho en pseudomovimiento.

14. Uso de un extracto derivado de caña de azúcar, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 9 a 13, en el que la fracción que absorbe luz de una longitud de onda de 420 nm se trata además mediante electrodiálisis para disminuir de esta manera la cantidad de sales.

15. Composición de vacuna que comprende un antígeno y un extracto derivado de caña de azúcar como adyuvante para mejorar el efecto estimulador del sistema inmune de la composición, en la que el extracto derivado de caña de azúcar es una fracción obtenida al hacer pasar un material de partida seleccionado del grupo que comprende jugo de caña de azúcar, un extracto líquido a partir de caña de azúcar y melazas derivadas de caña de azúcar, a través de una columna empacada con un adsorbente sintético como portador fijo y fluir las sustancias adsorbidas en el adsorbente sintético con un disolvente seleccionado del grupo que comprende agua, metanol, etanol y mezclas de los mismos o una fracción que absorbe luz a una longitud de onda de 420 nm obtenible mediante tratamiento en una columna cromatográfica que utiliza diferencias de afinidad para una resina de intercambio iónico empacada en una columna como portador fijo.