JPH054929A - 抗ウイルス活性物質の分画精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 砂糖黍バカスおよび米ぬかを含有する培地に
椎茸菌を培養した培養物から抗ウイルス活性物質を効率
よく分画精製する。 【構成】 上記の水抽出液を限外ろ過するかまたは限外
ろ過したのち疎水クロマトグラフィーにより分画精製す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は砂糖黍バガスに由来する
抗ウイルス剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】砂糖黍バガスを原料とする固形培地に椎
茸菌を生育させた後、これを熱水抽出することにより得
られる粗抽出液は抗腫瘍活性，免疫賦活活性など種々の
生理活性を有することが知られている（特公昭５３−２
３３９２，特公昭６２−３７６０９，特願昭５８−７９
１４５，特願昭６１−１１５７１０）。本粗抽出液の製
造方法は特公昭５３−１０１１７号公報に記載されてい
る。粗抽出液は、「ＬＥＭ」の通称で呼ばれており健康
食品，飲料の材料として利用されている。

【０００３】近年、上記の粗抽出液の有する多様な生理
活性の中で抗ウイルス活性が注目され、研究が進められ
ている。植物ウイルスの一つ、タバコモザイクウイルス
に対する抑制効果から粗抽出液は農薬として登録されて
いる。さらに人体においては、粗抽出液の熱風乾燥物が
活動型Ｂ型肝炎に対する治療効果を有することが報告さ
れている（原田ら（肝胆膵１４ ３２７ １９８７），
菅野ら（ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔｅｒｓ １７ １０９−
１１５ １９８２），鈴木ら（医学のあゆみ１３８−４
４１ １９８６））。試験管内の試験では、抗エイズウ
イルス（ＨＩＶ）活性が鈴木ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｉｓｉｃ．ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎ．１６
０ ３６７−３７３ １９８９），栃倉ら（Ｍｅｄ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７ ２３５−
２４４ １９８８）により報告されている。それらの研
究で粗抽出液に由来する画分がＨＩＶの細胞への吸着、
ウイルス感染に起因する細胞融合を阻害することが示さ
れた。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に対しても、粗
抽出液およびＪＬＳ−１８と呼ばれるその分画がウイル
スの吸着や増殖を阻害することが本発明者らにより発見
されている（特願平２−３８１８）。神経節に潜伏感染
したＨＳＶの再活性化を利用した動物実験系において、
ＪＬＳ−１８は、腹腔投与のみならず経口投与でも抑制
効果を示すことが確認されている（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅ
ｅ等 第８回国際ウイルス学会、ベルリン、ｐ３４−５
７、要旨集３２４頁 １９９０）。これらの結果は、粗
抽出液に含まれる生理活性物質の治療薬への応用の可能
性を強く示唆している。

【０００４】これら多様な生理活性を有する成分を粗抽
出液より単離，同定する試みも報告されている。鈴木等
（前出）はマクロファージの糖代謝能を亢進する生物活
性を指標として、エタノール沈澱法，フェニルセファロ
ースを用いたクロマトグラフィー法およびゲルろ過法の
組み合わせからなる方法で活性の集中する画分の調製を
試みている。

【０００５】本発明者らは、粗抽出液の有するＨＳＶ吸
着阻害活性を発見し（特願平１−３２０５８）、これを
指標として独自に簡素化した分画方法を開発し活性の集
中する画分を得た。続いて、さらに改良した方法を発明
し、得られた分画（ＪＬＳ−１８）が吸着阻害活性のほ
かに増殖阻害活性，潜伏感染ウイルスの再発の阻害活性
を有すること、きわめて有力な抗ヘルペスウイルス剤の
構成成分たりうることを発見した（特願平２−３８１
８）。

【０００６】その画分（ＪＬＳ−１８）は、疏水性が強
く、リグニンを主成分として、１０−３０％の糖，微量
のたん白の複合体を含んでいた。この画分の分析値は鈴
木等の報告したものと近似しており、この結果は粗抽出
液中に含まれる活性成分による多様な生理活性が本物質
に帰属することを示唆している。

【０００７】

【発明の解決しようとする課題】粗抽出液をそのまま熱
風乾燥した粉末（ＬＥＭ）は、３−９ｇ／日の量が人体
に経口で投与されている。しかしながら粗抽出液中には
溶質分が乾燥重量として１，０００ｍｌあたり約７ｇ含
まれており、本抽出物をそのまま薬剤として供給しよう
とすると、きわめて大量の抽出液を処理しなければなら
ない。

【０００８】したがって、粗抽出液を精製濃縮すること
が要求されるが、粗抽出液あるいはその熱風乾燥物は活
性に関係のない灰分や低分子成分をきわめて大量に含ん
でいるので、クロマトグラフィーにより分画精製する
際、これらが非特異的に樹脂に吸着し、樹脂の再生，再
使用を困難にする。エタノール沈澱法による脱塩濃縮
は、生物活性を有する画分を沈澱させるためには５０％
以上のエタノール濃度が必要であることから、大量のエ
タノールを使用しなければならず、経済性，安全性上困
難である。また、エタノール沈澱画分を疏水クロマトグ
ラフィーにより分画すると、他の成分が強く樹脂に吸着
し、樹脂の再生，再使用を困難にするため本工程がきわ
めて高価なものとなる。さらに、本工程で主活性成分の
溶出に用いられる高濃度のエチレングリコール水溶液
（特公平２−２３７９３４）は、高粘度でカラムの流速
がきわめて遅くなるうえ、樹脂の容量変化が大きく作業
性がきわめて悪い。また、溶出液からエチレングリコー
ルを除去する工程が必要となり、大量処理上、困難が大
きい。また、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いた分子
量分画による精製も経口薬の製法としては工業的とはい
えない。

【０００９】

【課題を解決するための手段】以上の問題を解決する手
段として、本発明者らは種々のタイプの限外ろ過膜を使
用して分画精製法，濃縮法を検討したところ、回収率，
作業性において、ホローファイバーあるいはタンジェン
シャルフロー型機能膜を用いて限外ろ過を行うことによ
り、きわめて簡便に活性物質が濃縮，精製されることを
見いだした。本検討にあたって、生物活性の測定は、単
純ヘルペスウイルスの吸着阻害活性を指標とした。この
方法は特願平１−３２０５８に記載されている通りであ
る。続いて本工程を実施する際、前処理としてポアサイ
ズの大きい限外ろ過膜を通過させることにより、濃縮処
理の作業性を著しく向上することができた上、引き続き
通過液を適当なポアサイズの限外ろ過膜を用いて濃縮操
作を行うことにより、得られた精製物の乾燥重量あたり
の生物活性（比活性）は粗抽出液の１０−２０倍に上昇
した。さらに、本精製品を原料として疏水クロマトグラ
フィーにより精製を行うと２−１０倍の比活性の向上が
認められた。この場合樹脂への非特異的吸着物がきわめ
て少なく、しかも樹脂の再生がきわめて容易であった。
粗抽出液あるいはアルコール沈澱したＪＬＳ−１８分画
を疏水性の樹脂に吸着したのち活性成分を溶出する際、
従来は高濃度のエチレングリコール水溶液が使用されて
いたが、本発明になる限外ろ過処理したＪＬＳ−１８分
画を疏水性樹脂に吸着させた場合驚くべきことに、蒸留
水を使用して効率よく有効成分を溶出することが可能と
なることが見いだされた。このことにより、溶出物の後
処理が不要になった上、作業性がきわめて向上した。ま
た、樹脂の容量変化をなくすことが可能であった。疏水
クロマトグラフィーに利用する疏水基，樹脂に関して作
業効率，経済性等を念頭に置き検討をすすめたところ、
フェニル−セファロース^R ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア）
は、強度，流速，再生再利用上大量精製には適さなかっ
た。フェニル−トヨパール^R （トーソー）も流速，吸着
力の点で適さなかった。しかしながら、まったく予期せ
ぬことにオクチルセルロファイン^R （生化学工業）が、
吸着力，再生の容易さ，強度，流速等どの点においても
良好な結果を示し、有力な担体であることが明らかにな
った。フェニル−セルロファイン^R （生化学工業）も再
生上問題が残るものの使用が可能であった。

【００１０】本発明はこれらの知見に基づくもので、砂
糖黍バガスおよび米ぬかを含有する培地に椎茸菌を培養
して得られた培養物の水性抽出物を限外ろ過し、濾液を
採取することを特徴とする抗ウイルス活性物質の分画精
製法、および上記の濾液を疏水クロマトグラフィーに付
し抗ウイルス活性を示すフラクションを採取することを
特徴とする抗ウイルス活性物質の分画精製法である。

【００１１】砂糖黍バガスおよび米ぬかを含有する培地
に椎茸菌を培養して得られた培養物を水で抽出して得ら
れるウイルス活性の粗抽出液はすでに知られており、た
とえば特公昭５３−１０１１７号公報の記載に従って得
ることができる。

【００１２】限外ろ過は分子量カット１００００〜３０
０００ダルトンのフィルターを用いて行うのがよく、好
ましくは珪藻土や孔径０．１〜０．４５μｍのフィルタ
ーを用いて予備ろ過することにより限外ろ過の作業性を
著しく向上させることができる。

【００１３】限外ろ過のフィルターとしては、ホローフ
ァイバーもしくはタンジェンシャルフロー型の機能膜を
用いることができる。

【００１４】この限外ろ過により、濾液のウイルスに対
する活性は乾燥重量あたり粗抽出液の１０〜２０倍に上
昇する。

【００１５】かくして得られた濾液を疏水クロマトグラ
フィーに付してさらに精製分画することができる。

【００１６】疏水クロマトグラフィーの担体としては、
たとえばフェニルセルロファイン^R （生化学工業製、フ
ェニル基をセルロース系樹脂セルロファイン^R に付加し
たもの），オクチルセルロファイン^R （生化学工業製、
オクチル基をセルロース系樹脂に付加したもの）が好ま
しい。

【００１７】溶出液としては水やエチレングリコール水
溶液を用いることができ、特に水を用いれば溶出液から
水以外の溶媒を除去する操作が不要となる利点がある。

【００１８】溶出される各分画の抗ウイルス活性をプラ
ーク法で測定して活性を示す分画を採取する。プラーク
法のかわりに２８０ｎｍの吸収を指標にしてもよい。

【００１９】かくして、効率よく抗ウイルス活性物質を
精製，分画することができる。

【００２０】以下に実験例および実施例により本発明を
さらに説明する。

【００２１】〔実験例１〕砂糖黍バガス９，米ぬか１の
組成比からなる固形培地に椎茸菌子を植え込み５カ月室
温で培養した。これを６０度の熱純水で抽出し、０．７
％（７ｇ／Ｌ）の溶質を含む原液を得た。これを珪藻土
および０．４５μｍの膜で予備ろ過して、粗抽出液とし
た。本抽出液の５０Ｌづつを種々の限外ろ過膜で１Ｌま
で濃縮した。これに蒸留水を４Ｌ加えたのち、１Ｌまで
濃縮した。この操作を５回くりかえした。抗ウイルス活
性は後記の方法で測定した。本実験の結果を表１に示し
た。回収率においてタンジェンシャルフロー型が優れて
いた。比活性の上昇率（精製効率）は中空糸型限外ろ過
膜も、タンジェンシャルフロー型と同等の性能を示し
た。作業性（処理に要する時間）の観点からは、よりポ
アサイズの大きい膜が優れていたが、ポアサイズが大き
くなるにつれて収率が低下した。これらの実験から、Ｊ
ＬＳ−１８の分画精製，濃縮において、限外ろ過膜がき
わめて有効な手段であることが明らかになった。

【００２２】〔実験例２〕タンジェンシャルフロー型Ｐ
ＴＴＫ膜により分画精製した濃縮液に硫安を加え塩濃度
を１Ｍに調整した後、３ｍｌづつを、フェニル−セファ
ロース（ファルマシア），フェニル−トヨパール（トー
ソー），フェニル−セルロファインおよびオクチル−セ
ルロファインを充填したカラム（容量１ｍｌ）に負荷し
た。１０ｍｌの１Ｍ硫安を通してカラムを洗った後、５
ｍｌの０．１Ｍ硫安で一次溶出した。次に二次溶出とし
て、５ｍｌの蒸留水をカラムに通した。５ｍｌの０．２
Ｎ苛性ソーダ溶液を通過してカラムを再生した後、５ｍ
ｌの１Ｍ硫安を通過してカラムを再生した。この操作を
１００回繰り返し、活性の回収，カラムの容量変化，流
速について検討した。表２に示した結果から、ＪＬＳ−
１８の工業的生産上、オクチル−セルロファインの優位
性が明らかになった。

【００２３】〔実施例１〕粗抽出液１，０００Ｌを旭化
成製中空糸型限外ろ過膜“マイクローザＰＳＶ１０３”
（ポアサイズ０．１μｍ、旭化成）を通過させた。通過
液をミリポア社製タンジェンシャルフロー型限外ろ過膜
“ＰＴＴＫ”（分子量３００００カット、ミリポア）を
使用して５Ｌまで濃縮した。４５Ｌの蒸留水を加えて１
０倍希釈したのち、５Ｌまで濃縮した。この操作を５回
繰り返して、灰分その他の低分子成分を除去した。５Ｌ
の濃縮液に５Ｌの１Ｍ硫安を加えて混和したのち、これ
をあらかじめ５Ｍ硫安溶液で平衡化しておいた５Ｌのオ
クチル−セルロファインカラムに負荷した、続いて５０
Ｌの０．５Ｍ硫安溶液を通過させたのち、２５Ｌの０．
１Ｍ硫安溶液で一次溶出したのち、２５Ｌの蒸留水で二
次溶出した。溶出終了後、２５Ｌの０．１Ｎ苛性ソーダ
を通過させたのち、約２００Ｌの蒸留水を通過させて、
カラムを再生した。さらに２５Ｌの０．５Ｍの硫安溶液
を通過させることにより平衡化した。本操作を繰り返し
実施して、一次および二次溶出の際、２８０ｎｍの吸収
しが０．１以上認められる範囲をプールした。一次溶出
液として８Ｌ、二次溶出液として３Ｌが得られた。本実
施例の結果を表３に示した。本方法で精製したＪＬＳ−
１８画分（二次溶出液）は１６００単位／ｍｇであり、
生物活性の回収率は５１％に達した。本実験の結果、本
発明による精製法はきわめて優れた方法であることが明
らかになった。得られた抗ウイルス活性分画の分析値の
比較を表４に示した。対照に従来法により精製した分画
精製物の分析値を示した。これは、培養物の水抽出液に
１Ｍになるように硫安を添加し、フェニルトヨパール
（トーソー）カラムに負荷し、通過液の塩濃度を暫時低
下させて（硫安１Ｍ〜リン酸１０ｍＭ、ｐＨ７．４）不
純物を溶離した後、リン酸１０ｍＭ以下の塩濃度で溶出
して得た活性分画である。

【００２４】〔抗ウイルス活性測定法〕ウイルスの吸着
阻害の強さを次のようにして測定した。猿腎由来Ｖｅｒ
ｏ細胞をヌンク製２４穴組織培養用プレートに生育させ
た。単純ヘルペスウイルス１型（アラバマ大学ウイルス
学教室、ホイットリイ教授より分与）Ｆ株を０．１ｍｌ
中に５０ないし１００プラーク形成単位含むように、１
％の血清（大日本製薬）を含むイーグルＭＥＭ（日水製
薬）からなる培地で希釈した。ＬＥＭあるいはその分画
を段階希釈したものおよび比較したい薬剤を段階希釈し
たものをウイルス希釈液と等量混合し３７℃で１ないし
２時間反応させた。ダルベッコー処方のリン酸緩衝生理
食塩水（ＰＢＳ，日水製薬）で、プレート中の細胞を洗
った後、反応液０．１ｍｌずつを各穴に加え、１時間細
胞と接触させた。細胞をＰＢＳで洗った後、０．２％の
寒天を含む前述した培地を重層し固化した上で、２日間
炭酸ガス孵卵器中で培養した。次いで、各穴の細胞を、
１ｍｌずつの１０％ホルマリン（和光純薬）で固定し、
０．５ｍｌずつの０．０３％メチレンブルー（シグマ）
で染色し、プラークを計数して活性値を算出した。

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【００２５】

【発明の効果】本発明によれば、砂糖黍バガスと米ぬか
を含有する培地に椎茸菌を培養した培養物の水抽出液か
ら、きわめて効率よく抗ウイルス活性物質を分画精製す
ることができる。

【表１】 表１ 限外ろ過膜の種類とろ過特性 ────────────────────────────────── 生物活性¹⁾の回収（単位） 乾燥重量（ｇ） ろ過内液 ろ過外液 （内液） ────────────────────────────────── 粗抽出液 (2.0×10⁷ ) (350) タンジェンシャルフロー型²⁾ (10 ⁴ ダルトン) ³⁾ 1.9×10⁷ ＮＤ 43.5 (3×10⁴ ダルトン） 1.4×10⁷ 0.4×10⁷ 18.0 (10 ⁵ ダルトン) 0.7×10⁷ 1.1×10⁷ 8.5 (3×10⁵ ダルトン） 0.5×10⁷ 1.3×10⁷ 6.3 中空糸型⁴⁾ (10 ⁴ ダルトン) 0.4×10⁷ 1.5×10⁷ 6.2 (3×10⁴ ダルトン） 1.1×10⁷ 0.8×10⁷ 12.8 (10 ⁵ ダルトン) 1.1×10⁷ 0.7×10⁷ 24.2 ────────────────────────────────── 表 １ （続） ────────────────────────────────── 精製効率 作業時間（ｈ） （内液） ────────────────────────────────── 粗抽出液 1 タンジェンシャルフロー型²⁾ (10 ⁴ ダルトン) ³⁾ 7.6 3.3 (3×10⁴ ダルトン） 13.6 3.0 (10 ⁵ ダルトン) 14.4 2.4 (3×10⁵ ダルトン） 13.8 2.2 中空糸型⁴⁾ (10 ⁴ ダルトン) 11.3 3.4 (3×10⁴ ダルトン） 15.0 6.1 (10 ⁵ ダルトン) 7.9 20 ────────────────────────────────── 1)生物活性 ウイルス吸着阻害活性をさす。５０％の吸
着阻害を示す希釈濃度を１単位として、それぞれの試料
が５０％阻害を示す希釈倍率を単位数として表示した。 2)タンジェンシャルフロー型としてミリポア製ＰＴＧ
Ｃ，ＰＴＴＫ，ＰＴＨＫ，ＰＴＭＫの４種類のポアサイ
ズを用いた。 3)各機能膜の分子量カットオフ値。 4)中空糸膜型としてＰＳＶ１０３，ＡＨＰ１０１０，Ａ
ＣＰ１０５０の３種類のポアサイズを用いた。

【表２】 表２ 疏水性樹脂の比較 ────────────────────────────────── オクチルセルロ フェニルセルロ ファイン ファイン ────────────────────────────────── 第１回目 流速 大（加圧可能） 大（加圧可能） 収率（％） 51 53 比活性（単位／mg） 1620 1600 容積変化¹⁾ なし なし 再生後の着色²⁾ なし なし 第３回目 流速 大（加圧可能） 大（加圧可能） 収率 53 50 比活性 1600 1640 容積変化¹⁾ なし なし 再生後の着色²⁾ なし なし 第３０回目 流速 大（加圧可能） 大（加圧可能） 収率 52 47 比活性 1610 1580 容積変化¹⁾ なし 小 第１００回目 流速 大（加圧可能） 大（加圧可能） 収率 50 42 比活性 1590 1590 容積変化¹⁾ なし 小 ────────────────────────────────── 表 ２ （続） ────────────────────────────────── フェニルトヨパール フェニルセファロース ────────────────────────────────── 第１回目 流速 中 小 収率（％） 50 53 比活性（単位／mg） 1650 1620 容積変化¹⁾ 小 大 再生後の着色²⁾ 若干 顕著 第３回目 流速 中 小 収率 46 39 比活性 1610 1590 容積変化¹⁾ 小 大 再生後の着色²⁾ 若干 顕著 第３０回目 流速 中 小 収率 40 11 比活性 1570 1600 容積変化¹⁾ 小 顕著 第１００回目 流速 中 使用不能 収率 33 比活性 1560 容積変化¹⁾ 小 ────────────────────────────────── 1)クロマトグラフィー実施前に対する実施後の樹脂の容
積変化 2)クロマトグラフィー実施後に再生処理した樹脂の着色

【表３】 表３ ＪＬＳ−１８の大量精製例（実施例） ────────────────────────────────── 容 量 生物活性¹⁾ 回収率 （Ｌ） （×10³ 単位／ml） （％） ────────────────────────────────── 粗抽出液 1000 380 100 中空糸型膜ろ過液 1030 315 85 タンジェンシャル フロー型膜濃縮液 5 64,600 85 カラムチャージ液 10 ＮＴ ＮＴ カラムチャージ漏れ 35 1,080 0.1 一次溶出液 8 14,100 30 二次溶出液 3 64,200 51 ────────────────────────────────── ──────────────────────────── 総乾燥重量 比 活 性 （ｇ） （単位／ｍｇ） ──────────────────────────── 粗抽出液 7000 54 中空糸型膜ろ過液 6130 53 タンジェンシャル フロー型膜濃縮液 448 721 カラムチャージ液 ＮＴ ＮＴ カラムチャージ漏れ ＮＴ ＮＴ 一次溶出液 241 468 二次溶出液 120 1,605 ──────────────────────────── 1)ウイルス吸着阻害活性

【表４】 表４ ＪＬＳ−１８活性画分の分析値 ────────────────────────────────── 限外ろ過／オクチル法 従 来 法 ────────────────────────────────── 組成比（％） 蛋白質 2 2 糖 24 23 リグニン 74 75 ────────────────────────────────── アミノ酸組成（％） Asx 15.5 Met 0.5 Asx 15.6 Met 0.4 Thr 6.8 Ile 4.2 Thr 6.9 Ile 4.1 Ser 6.9 Leu 5.3 Ser 6.8 Leu 5.2 Glx 16.2 Tyr 1.3 Glx 16.1 Tyr 1.2 Pro 7.3 Phe 3.9 Pro 7.2 Phe 4.1 Gly 10.5 Lys 4.1 Gly 10.4 Lys 4.2 Ala 8.1 His 2.5 Ala 8.3 His 2.4 Val 6.1 Arg 0.8 Val 6.1 Arg 1.0 ────────────────────────────────── 糖組成（％） Glucose 33 32 Xylose 42 50 Galactose 6 3 Alabinose 16 15 Mannose 3 0 ──────────────────────────────────

【表１】

【表１】

【表２】

【表２】

フロントページの続き (72)発明者 山本 佳希 大阪府東大阪市荒川２丁目19番１号 (72)発明者 松尾 昭夫 兵庫県神戸市須磨区東落合３丁目29番30号

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 砂糖黍バガスおよび米糠を含有する培地
   に椎茸菌を培養して得られた培養物の水性抽出物を限外
   ろ過し、ろ液を採取することを特徴とする抗ウイルス活
   性物質の分画精製法。
2. 【請求項２】 水性抽出物が孔径０．１〜０．４５μｍ
   の限外ろ過膜で予備ろ過される請求項１記載の分画精製
   法。
3. 【請求項３】 限外ろ過をタンジェンシャルフロー型装
   置もしくは中空糸型膜を用いた装置で行う請求項１また
   は２記載の分画精製法。
4. 【請求項４】 請求項１の方法により採取したろ液を疏
   水クロマトグラフィーに付し、抗ウイルス活性を示す分
   画を採取することを特徴とする抗ウイルス活性物質の分
   画精製法。
5. 【請求項５】 疏水クロマトグラフィーの担体としてオ
   クチル基もしくはフェニル基を官能基として付加したセ
   ルロース系の樹脂を用いる請求項４記載の分画精製法。