JPS6169730A - 可溶性蛋白質ｆｂｐ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明は可溶性蛋白質ＦＢＰ及びその製造方法に関する
。

ＦＢＰはシイタケ子実体より抽出される可溶性蛋白質で
あり、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）感染阻害作用
を有することから抗植物ウィルス唐桑としての用途が期
待されるのみならず、動物細胞に対してもＪＴＣ−１９
＃Ｉ胞のＤＮＡ合成能を高める働き、犬リンパ球を活性
化（＃若化）する働き等を有する有ｍな物質である。

Ｌ従来の技術］ シイタケ子実体から有用物質を取得する試みがかなり以
前上り竹なわれており、１９７０年にＣｈｉｈａｒａら
が分子量約１００万の抗腫よう性多糖（レンチナン）を
５ン離し、１９７９年に１土、５ｕｚｕ−ｋｉらにより
、ウィスキー蒸留残置中で培養した、シイタケ菌子培１
！戒中から号子ｆｆ１ｆ１＋０．０００〜９５．０００
の抗腫よう性糖蛋白質（ＫＳ−２）が分離されている。

また、シイタケ子実体の抽出液がＴ　Ｍ　Ｖ　Ｉ：対し
て感染阻害活性を有するとの報告もある［植物防疫、旦
、　１７（１９７５）７゜Ｃ発明が解決しようとする問
題７−χノしかしながら、上記の報告では、抽出液中の
有効成分の分離確認、及びその用途等について何等検討
がなされていない、他方、植物ウィルスに対［る感染阻
害作用を有する物質については多くの研究報告があるが
、農薬として実用化されているものは極めで少ないとい
う実情にある。

［発明の構成１ 本発明者らは、抗植物ウィルス剤の内光を目的として、
シイタケ子実体に含まれるＩＡ染阻害物質の分離、精製
を種々試みた結果、号子盟約２３゜０００の単純蛋白′
質でＴＭＶに対し非常に高い感染阻害を示す新規物質Ｆ
ＢＰの分離に成功し、本発明を完成するに至った。

本発明により得られるＭ規物質ＦＢＰは以下に示す如き
性状を有する可溶性蛋白質である。

■　分子量 トヨパールＨＷ−６０によるゲルろ過法（０゜０１Ｍト
リス−塩ｆｉ！緩衝液、９８８．０．０．２ＭＫＣｌ含
有）により測定した分子量は、約２３．０（）０であっ
た。

ｃｐ　　　糖含イ１力ｔ Ｂｉａｌらのオルシ／−ルー塩酸法［Ｄｅｎｔ、　Ｍｅ
ｄ。

Ｗｏｃｌ＋、、２８，２５３（１９０２）；２９．４７
７（１ｑｏ３）Ｉにより求めたＦｌｌＰ中の糖含イＩ鼠
は０゜１％以下であった。

■　１１素含量 勝又によるミクロケグ−ルーヒポクロライド比色法［千
葉医学会誌、　、２９．８６（１９５３）Ｉにより求め
た窒素含量は１７．８％であった。

■　等電１ｇ。

Ｖｅｓｌｅｒｂｅｒｇ−８ｖｅｎｓｅｅｎの等電点分画
法［ＡｃＬａＣｌ＋ｅａ　　５ｃａｎｄ、　＋２０−１
８２０（１９６６）］により求めた等電点は≧８．０で
あった。

■　紫外部吸収スペクトル ＦＢＰの紫外部における吸収スペクトルパターンは２７
７ｎ−に極大吸収を、２５４ｎ−に極小吸収を有し、０
Ｄ２６０ｎ＋１１０Ｄ２８０ｎ−比は、０．６５であっ
た。

■　アミノ酸組成 ＦＢＰのアミノ酸組成を測定した結果を第１表に示す。

第１４　１・’　１３１′ノア　ミ／Ｉｕｔｌ＆アミノ
酸の種Ｍ　　ＦＢＰ１００ｇ中に占めるアミアスパラギ
ン酸　　１５．２ グルタミン９　　　１１．６ グリシノ　　　　　４．８ ７ラニン　　　　　５．９ バリン　　　　　４．７ ０イシン　　　　　７．６ インロイシン　　　５．３ セリン　　　　　６．２ スレオニン　　　　７．２ ンスチン　　　　　　− メチオニン　　　　０．３ プロリン　　　　　　３．０ フェニルアラニン　７．２ チロシン　　　　　３．５ トリプトファン　　　− ヒスチノン　　　　１．４ リンン　　　　　　４．３ アルギニン　　　　９．７ ７ミドーＮＨ２−０，１ 計　　　　　　　　９７．９ 第１表のとおり１・’　ｕ　ｔ’はアスパラギン酸、グ
ルタミン酸及びアルギニンを多量に含み、次いでロイシ
ン、スレオニン及びフェニルアラニンを多く含んでいる
。また、ＦＢＰは構ｔ７ミノ酸の比率が９７％以上あり
、前記の紫外部吸収スペクトル及び糖含量の結果より、
ＦＢＰは、単純蛋白質であると考えられる。

■　ｐＨ安定性 ＦＢＰをそれぞれのｐＨに２４時間放置した後、ただち
にもとの状態にらどし、その植物ウィルス感染阻害活性
を測定することによりｐＨ安定性を求めた。その結果Ｆ
ＢＰはｐＨ４〜９で安定であった。

■　熱安定性 ＦＢＰをそれぞれの温度に１０分間放置した後、温度を
出来るだけ早くもとの状態にもどし、その植物ウィルス
感染阻害活性を測定することにより熱安定性求めた。そ
の結果ＦＢＰは６０℃以下で安定であった。

上記の如き性状を有するＦＢＰは、後記実施例に小；如
く、シイタケ子実体の磨叶物から（）、ＯＩＭ）リスー
塩酸級ｌｌＩ液により抽出し、ＤＥＡＥセルロースバッ
チ法、セフＴデフクスＧ−７５ゲルろ過、ＣＭ−トヨパ
ールカラムクロマトグツフィー及び等電点分画により分
離精製することにより製造される。

【実施例Ｊ 以ト″に、ＦＤＰの製造方法を実施例で示し、本発明を
更に詳細に説明する。

実施例１（ＦＢＰの製造方法） （ａ）　　シイタケ子実体よりＦＢＰの抽出新鮮なシイ
タケ子実体ＩＫｇを純水で水洗いした後、０゜０１Ｍト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）約３リツトル中で、ミ
キサーを使用し、０℃で磨砕した１次いで、この磨砕液
を磨砕撮［商品名、ヒスコトロン、日本Ｍ″ｅｅ工業）
製１で更に１０分間磨砕し、０℃、７．３００ＸＧ、１
５分間遠心分離した。この上清液に、トリス−塩酸緩Ｉ
ｉ液で１１衡化したＤＥＡＥセルロース約１リットルを
入れ、攪はん後１５分ｌｌ１１静置し、ＤＥＡＥセルロ
ース吸着１１号をろ過して除ν・た、このＩ）　Ｌ：　
Ａ　Ｉじセルロー人処理液を減圧ドに約１５倍に濃縮後
、１１０．０ＯＯＸＧ、５℃で３０分間超遠心し、その
上清液を粗ＦＢＰｔｌ液とした。

（ｂ）　　セフ７デツクスＧ−７５カラムクロマトグラ
フイー ＠ＦＢＰＩａ約２００ｍｌを３回にわけ、トリス−塩酸
緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−７５カラＡ（４
，６５Ｘ９５，０ｅｓ）にノセ、同一緩衝液で１５２ｍ
ｌ／ｈｒの流速で上昇法により展開した。溶出液は、２
０−１ずつ分■し、各ｔ）　ｉｉｌ　Ｉｌｌの蛋白質濃
度及びＴＭＶ感染阻害活性を測定した。

その結果、３つの蛋白質１１１９が得られ、このうち２
番目の一分（７ラクシーンＮｏ、４Ｏ−５０）に、強い
ＴＭＶ感染阻害活性が認められた。

この２番目の画分を集め（３回分）減圧下に約７０ｍ１
まで濃縮した。

（Ｃ）　　セフ７デツクスＧ−７５カラム再クロマトグ
フフイー 上記（ｂ）で得ｒ−濃縮！７０ｍ１を再度セフＴデツク
スＧ−７５カフムで、（１１）と同じ条件で展開した。

その結果、蛋白質の溶出パターンとＴＭＶ感染ｔ’ｕ　
’Ｊ／活性の１１１１に、相聞性があることが確！！さ
れた。

（、ｊ）　　ＣＭ−トヨバールカラムクロマトグラフィ
上記（ｃ）で得られた、ＴＭＶ感染阻害活性を持−）画
分（７フクシヨンＮｏ、４（１−５０）を集め、凍結乾
ｅさせた後、純水約１０羨１に溶解させ、セファデック
スＧ−２５ゲルろ過性により脱塩した。

次いで、この試料溶液を０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐｉ
ｆ　７　、０　）で１１衝化したＣＭ−）ヨバールカラ
ム（２，２Ｘ２７．Ｏｅ＋＊）に流速３６ｍ１／ｌ＋ｒ
で吸着させた後、同１１ｔｌツ１液を食塩により塩濃度
０〜０゜３Ｍまでｆｉ線的に変化させ、ＦＢＰを溶出さ
せた。

１９出液は１０１ずっ分画し、セフＴデ・ンクスＧ−２
５ゲルろ過性に上り脱塩した名画分のＴＭＶ恐染阻−１
活性を検定した。その結果、食塩濃度０゜１Ｍ付近で溶
出される蛋白質画分に、強いＴＭＶ感染阻；Ｉｆ丁活が
認められた。この両分は、５ＤＳ−Ｄｉｓｋ電気泳電気
泳動−な標品として得られたので、この−号の蛋白質を
ＦＢＰとした。

尚、このＦＢＰは、シイタケ子実体ＩＫｇより約ｌ鴫ｇ
の収率で分離された。

［発明の効果１ 次ぎに、ＦＢＰの有用性を確認するために行なった試験
について説明する。

試験例Ｉ ＴＭＶ感染阻害活性の測定（生葉法）　　・（ａ）　　
方法 検定植物アカザの葉、左生葉に、０．ＯＩＭ）リスー塩
ｍ５ｔｔｉ浪（ｐＨ８，０＞に溶解させた阻害物質１ｍ
ｌ（ｉｇｌ＆は実験ごとに示した）と、等量の精製ＴＭ
ＶＷｊ痕２０μビ／−１との混合液を接種液とし、その
中に適量の４００メツシエ、カーボラングムを混ぜて脱
脂綿で軽くこすりながら接種した。

また、右生葉には、コントロールとして、同上緩衝液と
、精製ＴＭＶＩ液との等量混合液を接種液として、同様
に接種した。

接種後、７−１０日後に各生葉の病斑数を数え、以上の
、１　ｔ？、式を用いてｌ”　Ｍ　Ｖ感染阻害率を求め
た。

感染阻害＋（％）＝ （ｂ）　　結果 ＦＢＰは、２０ｐρ−で９６％の感染阻害率を示した。

また、ＦＢＰ並びにＴＭＶ感染阻害活性を持つ、ポリリ
ジン（Ｐ＋＋１ｙ−Ｌ　　Ｌｙｓ）、ポリオルニチン（
Ｐｏｌｙ−Ｌ−（）ｒｎ）、ポリアルギニン（Ｐｏｌｙ
　　Ｌ−Ａｒｇ）及びチトクロームＣの各濃度におけろ
ＴＭ■感染阻杏活性を測定し、この結果より、５０％Ｔ
ＭＶ感染阻害活性を示す濃度を求めたところ、ＦＢＰは
６．３μｇ／−１、ポリリジンは１４．１μｇ　／　ｍ
　ｌ、ポリオルニチンは３１．６μｇ／論１、ポリアル
ギニンは４４．７μｇ／閤１、及びチトクロームＣは１
００μｇ／鶴１であった。

試験例２ ＪＴＣ−１９細胞のチミノン取り込みへ及ぼすＦＢＰの
影響 （、）　　測定り法 ＪＴＣ−１９細胞をＭＥＭ培地で、６Ｘ１０’個／■１
に１１４μシ、０．１鴎１づつマイクロプレートにまい
た０次ぎに各濃度に調整したＦＢＰ液０゜１１づつを加
え、３７℃、７２時間、ＣＯ２インキエベーター中で培
養した０次ぎに、０．２μＣｉ／　２０　ｎｍｏｌ／　
２０μｍの’Ｈ−チミノン２０１を加え、同一条件で１
６時間インキュベートした後、取り込まれた３Ｈ−チミ
ジンの量を液体シンチレーシタンカウンターで測定した
。

（ｂ）　　結果 結果をｔＡ２表に示す。

第２表 ０　　　　　　　　　４９８４±６４８５　　　　　　
　　　９５１３±３４１１０　　　　　　　　　９５０
９±６４８これより、１・′１３ＰはＪＴＣ−１９細胞
へ収り込まれるチミジンの量を増加させることが確認さ
れ、このことより、ＦＢＰはＪＴＣ−１９細胞のＤＮＡ
合成能力を高める働きを持つことが、示唆された。

試験例３ Ｆ　Ｂ　Ｐの犬リンパ球へ及ぼすレクチン（＊−１）補
作用 紅全ビーグル種成犬より、常法通り、大リンパ球を１１
ｔ＃ｌシ、［・’　＋３１’の大リンパ球へ及ば［レク
チ／補作用を以ドの方法で測定した。

（ｕ）　　測定Ｊｊ法 単離したリンパ球をＲＰＭ　Ｉ培地で１０’個／１に調
整し、これを０．１１づつマイクロプレートにまいた。

更にＣａｎ１ｎｅ　　５ｅｒｕ＋＊０　、０５　ｍｌを
加え、ＲＰＭＩ培地に溶解した各濃度のＦＢＰ［０゜１
１を加えた。これを３７℃、７２時間、ＣＯｔインキュ
ベーター中で培養した後、コＨ−チミジン（１μＣｉ／
２０ｎ＋＋ｏ１１０．１ｍ１）０．１＋＊ｌを加え、同
一条件下で２４時間培培養、取り込まれた３Ｈ−チミジ
ンのｌｉｔを液体シンチレーシａンカウ／ターで測定し
た。尚、Ｐｏ５ｉｔｉｖｅコントロールとしては、５μ
Ｈ／　＋ｓ　Ｉ　（最終濃度）のフンカナバリンＡ（Ｃ
ｏｎ　　Ａ）を使用した。

）［−１レクチン二種々の糖あるいは糖がｆｌ！ｌ！表
面に分布する血球、リンパ球などを認識して凝集させる
性質を持った物質の総称をレクチンという。

レクチンは以上の作用の他、リンパ球有糸核分裂促進作
用を持つ。

（ｂ）　　結果 結果は１８３表の通りである。

第３表 ５　　　　　　　　　　　　２１６４±４０１０　　　
　　　　　　　　１１２９５±２３６２０　　　　　　
　　　　　　７０１０±２６Ｃｏｎ−八　５μ　−１３
２５７±３６これより、大リンパ球は、ＦＢＰにより強
く活性化（幼若化）され、その割合はＣｏ＋＋　　Ａ以
上であることが確、ｉ！すれた。このことよりＦＢＰは
、大リンパ球において、γ型インターフェロンをｙｉ導
した可能性が極めて高いことが示唆された。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記性状を有する可溶性蛋白質ＦＢＰ（イ）分子
   量：約２３，０００（ゲルろ過法）（ロ）糖含量：＜０
   ．１％ （ハ）窒素含量：１７．８％ （ニ）等電点（ｐＩ）：≧８．０ （ホ）紫外部吸収：極大　２７７ｎｍ 極小　２５４ｎｍ
2. （２）シイタケ子実体を溶媒で抽出して可溶性蛋白質Ｆ
   ＢＰを採取することを特徴とする可溶性蛋白質ＦＢＰの
   製造方法。