JP2023530476A - 非ヒト動物の治療において有用なヘスペラロエから調製した抽出物を含むサポニン - Google Patents

Abstract

ヘスペラロエ属の非木本植物から水溶性抽出物を除去するための方法を開示しており、抽出物は少なくとも一つのサポニンを含む。本方法は、ヘスペラロエバイオマスを提供すること、このバイオマスを粉砕し、溶媒で洗浄して粗抽出物を得ること、ならびに、場合により、この粗抽出物をさらに精製及び/又は濃縮することを含む。ヘスペラロエバイオマスから抽出されたサポニンは、25(27)-デヒドロフクレアスタチン、5(6)，25(27)-ジスデヒドロユッカロイシドC、5(6)-ジスデヒドロユッカロイシドC、フルクレアスタチン、及びユッカロイシドを含み得る。本出願の一実施形態は、ヘスペラロエ抽出物を含むサポニンの投与を含む、非ヒト動物における抗原への免疫応答を増強する方法を提供する。別の実施形態は、非ヒト動物における一つ又は複数の状態の予防、治療、及び制御のための、一つ又は複数のサポニンを含むヘスペラロエ由来免疫調節剤の投与を提供する。好ましくは、一つ又は複数のサポニンを含むヘスペラロエ抽出物は、コクシジウム症の予防及び治療のために、家禽に経口投与されてもよい。【選択図】図１Ａ、図１Ｂ

Description

植物は、多種多様な種別の有機化合物を産生し、その大多数が、それらの成長及び発生に直接関与していないように見える。これらの物質は、従来、二次代謝物又は植物天然産物と呼ばれ、しばしば、植物界内の限定された分類群の間に分布する。二次代謝産物の機能は、大部分が未知であるが、多くの化合物が、花粉媒介者及び種子分散動物のための誘引物質として、ならびに植物種間の競争に影響を与える化合物（アレロケミカル）として、植物に有用な特質、例えば、草食動物に対する保護及び微生物感染に対する保護に関連付けられてきた。植物天然産物における関心は高まっている。なぜなら、これらの産物は、しばしば、製薬業界、化粧品業界、食品業界、洗剤業界など、様々な種類の産業において幅広い用途を有するからである。

目的の植物二次代謝物の特定の群は、サポニンである。サポニンは、トリテルペノイド、ステロイド、又はステロイド系グリコアルカロイドのいずれかとして分類されるグリコシル化化合物である。サポニンは、アグリコンに結合される一つ又は二つの糖部分（それぞれモノ及びビスデスモシド）からなる。サポニンは、酸加水分解又は酵素方法により、サポゲニン及び糖部分に加水分解することができる。サポニンは一般的に、６００～２，０００ダルトン超の範囲の分子量を伴う水溶性高分子量化合物である。

それらの疎水性（アグリコン）部分及び親水性（糖）部分の非対称分布は、これらの化合物に両親媒性の特徴を付与し、それらは、主にそれらの界面活性剤様の特性に関与する。表面張力を下げる能力によって、サポニンは、化粧品業界における及び洗剤業界における使用のために潜在的に十分に適する。

サポニンはまた、コレステロールを伴う不溶性複合体を形成する能力を有しており、それによって、それらの一部が、コレステロール低下剤として製薬業界における使用のために適切となる。他のサポニンは、ワクチン戦略において有用である免疫刺激複合体の形成に関連付けられる。

現在、サポニンの広範な活用に対する主要な制限は、商業的に入手可能なサポニンが比較的高価であるという事実である。この費用は、大部分が、相当量のサポニンを有する、限られた数の植物抽出物に起因する。現在、サポニンを含む、商業的に入手可能な植物抽出物は、サポナリア・オフィシナリス、キラヤの樹皮及び茎、カスタネア・サティバの種子、ならびに様々なユッカ種の抽出物を含む。

サポニンを含む植物抽出物は、このように、幅広い異なる業界内で一般の関心となっている。従って、サポニン抽出物の代替的な供給源についての、当技術分野における必要性は増しており、これらの植物供給源は、好ましくは、安価で、得ることが簡単であり、好ましくは、サポニン含量は比較的高いはずである。

本発明は、植物由来免疫調節剤の投与のための組成物、方法、及びキットに関する。組成物は、非ヒト対象の自然及び適応免疫系を感作させるために有用であり得るが、このように、感染を治療するために、又は免疫化におけるアジュバントとして使用することができる。好ましくは、本発明の植物由来免疫調節剤は、サポニンを含む植物抽出物である。対象へのこれらの免疫調節剤の投与によって、細胞媒介性免疫系が有意に増強され、対象における抗体産生が有意に増強される。

したがって、一実施形態では、本発明は、感染を治療するのに十分な量で、植物由来免疫調節剤を動物に投与することにより、感染を有する、又は感染のリスクがある非ヒト動物を治療する方法を提供する。特に好ましい実施形態では、免疫調節剤は、ヘスペラロエ属の非木本植物から抽出された少なくとも一つのサポニンを含む。

他の実施形態では、本発明は、非ヒト動物に、植物由来免疫調節剤を投与する方法を提供し、ここで、植物由来免疫調節剤は、宿主の適応免疫系を増強し、非ヒト動物を、感染病原体により起こされる疾患から保護する。好ましくは、ヘスペラロエ属の非木本植物から調製される、一つ又は複数のサポニンを含む植物由来免疫調節剤の対象への投与は、治療される対象におけるＣＤ４ Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、特にＴｈ１細胞及びＴｈ１７細胞において食作用活性を増加させ得る。

さらに他の実施形態では、本発明は、非ヒト動物、特に鳥類、より具体的には家禽における一つ又は複数の状態の予防、治療、及び制御のために、好ましくはヘスペラロエ属の非木本植物から調製される、一つ又は複数のサポニンを含む植物由来免疫調節剤の投与を提供する。例えば、ヘスペラロエから由来するサポニン含有組成物は、非ヒト動物に投与されて、環境のアンモニア及び臭気を低減し、低コレステロール血症効果を提供し、炎症を低減し、体重増加を促進し、及び飼料変換効率を改善し得る。特に好ましい実施形態では、一つ又は複数のサポニンを含むヘスペラロエ抽出物は、コクシジウム症の予防及び治療のために、家禽に経口投与されてもよい。

さらに他の実施形態では、本発明は、非ヒト動物の免疫応答を増強するのに十分な量での、ヘスペラロエ抽出物を含むサポニンの非ヒト動物への投与を含む、非ヒト動物における抗原への免疫応答を増強する方法を提供する。特に好ましい実施形態では、ヘスペラロエ抽出物を含むサポニンは、家禽に投与され、ＣＤ４ Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、特にＴｈ１細胞及びＴｈ１７細胞での食作用活性における増加をもたらし、エイメリア感染に対する保護を提供する。

他の実施形態では、本発明は、抗原の免疫原性有効量及びヘスペラロエ属の非木本植物から抽出されたサポニン組成物を含む、非ヒト動物において抗原に対する抗体の産生を誘導するために有用な免疫学的組成物を提供し、ここで、抽出物中のサポニンの量は、抗原に対する非ヒト動物の免疫応答を増強するのに充分な量で存在する。特に好ましい実施形態では、本発明の抽出物を含むサポニンは、免疫応答を増加させ、病変スコアを低下させ、コクシジウム症から生じるオーシスト脱落を低減させるために、それを必要とする家禽にエイメリアワクチンで投与される。

図１Ａ及び図１Ｂは、それぞれトリテルペノイドサポニン及びステロイド系サポニンを図示する。 同上。 図２Ａ～Ｃは、２５（２７）－デヒドロフクレアスタチン（図２Ａ）、５（６），２５（２７）－ジスデヒドロユッカロイシドＣ（図２Ｂ）、及び５（６）－ジスデヒドロユッカロイシドＣ（図２Ｃ）を含む、本発明に従ってヘスペラロエ属の非木本植物から抽出された様々な新規サポニンを図示する。 同上。 同上。 図３は、処置群１から６の各々のメンバーの盲腸扁桃の胚中心についてのカウントをプロットしたグラフである。 図４は、処置群１から６の各々についての腸関連リンパ組織についてのスコアをプロットしたグラフである。 図５は、処置群１から６の各々のメンバーの粘膜固有体における偽好酸球の数をプロットしたグラフである。 図６は、ニワトリ血清の分析のための商業的なＥＬＩＳＡ（ＦｌｏｃｋＣｈｅｋ（登録商標）Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ、ＩＤＥＸＸ）を使用して測定された、処置群１から６の各々のメンバーのＥＬＩＳＡ力価をプロットしたグラフである。

定義
本明細書中で使用するように、用語「バイオマス」は、一般的に、ヘスペラロエ属、例えばＨ．フニフェラ、Ｈ．パルビフロラ、Ｈ．ノクターナ、Ｈ．チアンギイ、Ｈ．テヌイフォリア、Ｈ．エンゲルマンニ、及びＨ．マラコフィラなどの植物全体及び植物器官（即ち、葉、茎、花、根など）を指す。特に好ましい例では、本発明の組成物を含むサポニンは、植物の地上部分、より具体的には、植物のクラウン上の部分、さらにより好ましくは、植物の葉から本質的になるバイオマスから調製されてもよい。

本明細書中で使用するように、用語「バガス」は、一般的に、抽出過程、例えば、連続的な溶媒抽出又は粉砕などに供されたバイオマスを指し、その結果として得られるバイオマスの固体は、それが由来するバイオマスよりも少ない水溶性固体を有する。特定の実施形態では、バガスは、バイオマスを高圧に供することにより調製され、それは、バイオマスを、一つ又は複数の対の対向ロール、機械的プレス、スクリュープレスに通過させることにより、ならびに直接水圧及びバイオマスに圧力を適用して、そこから細胞間液及び細胞内液を除去するための他の過程により達成され得る。

本明細書中で使用するように、用語「粉砕」は、一般的に、バイオマスからの細胞間液及び細胞内液を押すのに十分な圧力の適用を指す。

本明細書中で使用するように、用語「サッカライド」は、その定義が糖化学の当業者に周知である、用語「ポリサッカライド」、「オリゴサッカライド」、及び「糖」と互換的に使用される。サッカライドは、モノ、オリゴ、及び／又はポリサッカライドの形態であり得ることに留意すべきである。好ましくは、サッカライドは水溶性であり、他の化合物、例えばトリテルペノイドに結合してサポニンを形成するグリコシド（アラビノース、グルコース、ガラクトース、キシロース、及びグルクロン酸）などに結合されたセルロース、ヘミセルロースあるいはモノ、オリゴ、及び／又はポリサッカライドを含まない。

本明細書中で使用するように、用語「サポニン」は、一般的に、グリカンとして言及される糖成分及びアグリコンとして言及される非糖成分を含むグリコシドを指す。アグリコンの構造に依存して、サポニンは、図１Ａに図示されているトリテルペノイドサポニンとして、又は図１Ｂに図示されているステロイド系サポニンに分類され得る。サポニンのアグリコン部分は、五環式トリテルペノイド又は四環式トリテルペノイドのいずれかであり得るが、それらの両方が３０の炭素原子を含む。ステロイド系又はトリテルペノイドを問わず、サポニンはモノ、ビ、又はトリデスモディックであり得る。モノデスモディックサポニンは、単一のサッカライドを有し、通常はＣ－３に付着されている。ビデスモディックサポニンは、二つのサッカライドを有し、しばしば、一つがＣＣ－３でエーテル結合を通じて付着され、他は、ＣＣ－２８でエステル結合を通じて、又はＣ－２０でエーテル結合を通じて（それぞれ五環式及び四環式トリテルペンサポニン）、あるいはＣ－２６でエーテル結合を通じて（フロスタンサポニン）付着されている。特定の例では、ヘスペラロエバイオマスは、バイオマスの絶乾重量に基づいて、少なくとも約５ｗｔ％の総サポニン、例えば約５～約１５ｗｔ％など、例えば約８～約１２ｗｔ％などを含み得る。総サポニンは、下のテスト方法のセクションにおいて記載されるように決定され得る。

本明細書中で使用するように、用語「水溶性固体」は、一般的に、抽出物が遠心分離され、濾過され、全ての水が蒸発された後に残る乾燥物質を指す。本発明のバイオマス抽出物の水溶性固体を測定するための手順が、下のテスト方法のセクションにおいて詳細に記載されている。水溶性固体は、絶乾バイオマスの質量に対するパーセンテージベースで表現され得る。

本明細書中で使用するように、用語「不水溶性固体」は、一般的に、下のテスト方法のセクションにおいて記載されるように、水溶性固体を測定する経過中に遠心分離及び濾過により除去される抽出物の画分を指す。

本明細書中で使用するように、「免疫応答を増強する」は、処置される前の同じ対象と比較して、本明細書中に記載するように、ヘスペラロエから由来するサポニン含有組成物で処置されている対象における、ＣＤ４ Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、特にＴｈ１及びＴｈ１７細胞での食作用活性における増加を指す。

本明細書中で使用するように、「医薬組成物」は、非ヒト動物における疾患の治療又は予防のための治療レジメンの一部として、医薬品の製造及び販売を規制する政府機関の要件を満たす様式において、ヘスペラロエから抽出された少なくとも一つのサポニンを含み、一つ又は複数の医薬グレードの賦形剤で製剤化された組成物を指す。医薬組成物は、例えば、単位投薬形態（例、錠剤、カプセル、カプレット、ゲルキャップ、又はシロップ）での経口投与のために；局所投与（例、クリーム、ゲル、ローション、又は軟膏として）のために；静脈内投与（例、微粒子塞栓を含まない滅菌溶液として、及び静脈内使用のために適切な溶媒系中で）のために；又は本明細書中に記載する任意の他の製剤用に製剤化することができる。

本明細書中で使用するように、用語「対象」及び「非ヒト動物」は、限定しないが、ウシ、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ウズラ、ガチョウ、ブタ、及びヒツジを含む任意の脊椎動物を指す。

本発明は、例えば、Ｈ．フニフェラ、Ｈ．パルビフロラ、Ｈ．ノクターナ、Ｈ．チアンギイ、Ｈ．テヌイフォリア、Ｈ．エンゲルマンニ、及びＨ．マラコフィラを含むヘスペラロエ属の非木本植物から由来する抽出物、画分、活性化合物、及び植物化学物質又はそれらの混合物から選択される少なくとも一つの成分を含み、場合により、医薬的に及び栄養学的に許容可能な植物化学的な活性物質、希釈剤、賦形剤、担体、及び活性物質又はそれらの混合物の一つ又は複数を含む、新規の医薬品、栄養補助食品、及び食品成分組成物に関する。特に好ましい実施形態では、本発明は、一つ又は複数のサポニンを含むヘスペラロエ由来免疫調節剤を非ヒト動物に投与することにより、非ヒト動物において、ＣＤ４ Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、特にＴｈ１及びＴｈ１７細胞における食作用活性を増加させる方法を提供する。

本発明の組成物は、例えば、ウシ、家禽、ブタ、ヒツジ、及びウマ種を含む非ヒト動物の治療のために特に十分に適切である。例として、本発明の方法及び組成物は、ウシ、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ウズラ、ガチョウ、ブタ、及びヒツジの治療のために使用することができる。特に好ましい実施形態では、本発明の方法及び組成物は、家禽の治療のために、より具体的には、コクシジウム症及び／又は壊死性腸炎の予防及び治療のために使用することができる。

本発明のヘスペラロエ由来免疫調節剤は、下のテスト方法のセクションにおいて示す総サポニンアッセイにより測定されるように、組成物の絶乾重量に基づいて、少なくとも５ｗｔ％のサポニンを含んでもよい。特定の実施形態では、本発明に従って使用されるサポニン含有組成物は、１０ｗｔ％のサポニン、より好ましくは少なくとも約１０ｗｔ％のサポニン、さらにより好ましくは、例えば約１５～約２５ｗｔ％のサポニン、例えば約５～約３０ｗｔ％など、少なくとも約１５ｗｔ％のサポニンなどを含む。組成物の効果は、存在するサポニンの総量に関連すると考えられる。このように、当業者は、特定の量のサポニンが望ましい場合、それは、投与される特定の濃度の組成物の体積を変動させること、特定の体積の組成物の濃度を変動させること、又はその両方を通じて達成することができることを理解するであろう。

本発明において有用なサポニンはまた、ヘスペラロエ属の非木本植物から抽出されてもよい。ヘスペラロエ由来サポニンは、一般的に、ステロイド系サポニンを有する。ヘスペラロエから由来するサポニンは、以下のアグリコン又はゲニンの少なくとも一つを有し得る：カンモゲニン、マノゲニン、ゲントロゲニン、ヘコゲニン、チゴゲニン、サルサポゲニン、クロロゲニン、及びジトゲニン又はそれらの対応する異性体あるいは以下のグリコシド部分の少なくとも一つを伴う（酸又は塩の形態において）酸化形態又は還元形態：グルコース、キシロース、ラムノース、アラビノース、又はガラクトース。他の実施形態では、ステロイド系サポニンは、アガメノシド、アガベシド、アガボシド、マグエイシド、アガバサポニ、カンタラサポニン、シサルサポニン、ガブリトノシド、ドングノシドもしくはアモロニン、又は他のステロイド系サポニンを含み得る。

抽出物は、バイオマス、特に葉、より具体的には植物のクラウン上の葉を抽出することにより、ヘスペラロエ属の非木本植物から回収されてもよく、少なくとも一つの溶媒は、水、メタノール、エタノール、ブタノール、及びイソプロパノールならびにそれらの混合物からなる群から選択される。例えば、一実施形態では、この過程は、バイオマスを、水を含む抽出溶液と接触させ、水溶性画分を不溶性バイオマス画分から分離することを含む。他の実施形態では、抽出物溶液は、水に加えて、界面活性剤、溶媒、場合により、抽出物担持ジュースを含んでもよい。抽出物担持ジュースは、例えば、より早期の抽出工程又はより早期の粉砕工程から得ることができる。

ヘスペラロエバイオマスの単純な水抽出は、サッカライド、ポリサッカライド、無機塩、サポニン、及びサポゲンを含む粗水抽出物をもたらし得る。粗抽出物はまた、メタノールを溶媒として使用して、又はメタノールと水の混合物を使用して産生されて、バイオマスを抽出してもよく、これは以前に、脂質及び色素を除去するためにアセトン又はジエチルエーテルで抽出されているであろう。他の例では、バイオマスは、４：１のエタノール－水溶媒で抽出してもよく、その後に非極性溶媒、例えばヘキサンなどでの抽出物の脱脂が続く。特定の例では、脱脂抽出物をさらなる処理に供して、特定の水溶性成分、例えばサポニンなどを単離してもよく、これは、ブタノールと混合してブタノール相を分離することにより脱脂抽出物から精製されて、タンパク質ならびに遊離サッカライド及びポリサッカライドを実質的に含まないサポニンの混合物を得てもよい。

熱水抽出物も使用することができる。例えば、一実施形態では、水溶性固体は、熱水エタノール又はイソプロパノール（７５～９５重量％アルコール）でバイオマスを抽出することにより、ヘスペラロエバイオマス、特に葉から抽出されてもよい。水性アルコール抽出液を次に濾過及び濃縮してもよく、脂溶性物質を、抽出液を非極性溶媒、例えばヘキサンなどと混合することにより除去してもよい。実質的に純粋なサポニン組成物を次に、脱脂抽出物を極性溶媒、例えばブタノールなどでさらに抽出することにより調製してもよい。

本発明の組成物を調製する目的のために、及び本方法における使用のために、単純な水性抽出物が好まれ得るが、他の抽出方法が本発明の範囲内である。特に好ましい実施形態では、ヘスペラロエバイオマスは、等しく切断され、プレスされ、水溶性抽出物、例えば無機塩、サッカライド、ポリサッカライド、有機酸、及びサポニンなどを除去するために、水性溶媒で抽出されてもよい。水溶性抽出物を収集して、当技術分野において周知の技術、例えば、蒸発、噴霧乾燥、ドラム乾燥などにより濃縮してもよい。抽出物は、それが約２０～約１００重量％の固形分、例えば約２０～約９５重量％の固形分など、例えば約２０～約８０重量％の固形分などを有するまで濃縮してもよい。

特に好ましい実施形態では、水溶性抽出物を、抽出溶液を噴霧装置に供給することにより、噴霧乾燥により濃縮する。適切な噴霧装置は、回転ホイール噴霧器、圧力ノズル噴霧器、及び二相流体ノズル噴霧器を含むが、これらに限定しない。回転ホイール噴霧器、圧力ノズル噴霧器、及び二相流体ノズル噴霧器は、当業者に公知であり、様々な供給源、例えばＧＥＡ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇなどから商業的に入手可能なスプレー乾燥機における噴霧器を含む。

下でより詳細に記載するように、バイオマスを粉砕して、ロール、スクリュー、及び他の形態のプレスを使用してバガス及び水溶性固体を分離してもよい。特定の好ましい実施形態では、バイオマスを、対向逆回転ロールの一つ又は複数のニップの間に通過させて、ジュースの機械的除去を最大化する。バガスを次に、下でより完全に記載するように、その後の粉砕工程においてジュースと接触させることができる。特定の例では、バイオマスを粉砕前に等しく切断して、浄化してもよい。切断及び浄化は、当技術分野で周知の方法を使用して行ってもよい。特に好ましい実施形態では、バイオマスを、水又は他の溶媒を使用することなく、細片、例えば埃などを除去するように浄化する。抽出前にバイオマスを等しく切断することが好ましいことがある一方で、特定の実施形態では、バイオマスを、それが粉砕される前に砕く、パルプにする、シュレッダにかける、又は浸軟しないことが有用である。そのような物理的処理工程は、より多くのバイオマス表面を抽出物溶液に曝露するという点で有利であり得る一方で、それらは、植物細胞壁を破壊し、繊維長を過度に短縮させ、過度な量の微粒子を作り得る。抽出段階の間にこの様式においてバガスに負の影響を及ぼすことを避けることが一般的に望ましい。この様式では、本発明の抽出方法は、典型的には、例えばパルプ化などにより、さらに処理され得るバガス繊維をもたらし、紙製品の製造のために適したパルプ繊維をもたらす。

他の実施形態では、水溶性固体は、拡散によりバイオマスから回収され得る。拡散では、バイオマスを液体と接触させて液体成分を抽出した。通常、バイオマスは、繊維への損傷を最小限にし、過度な量の微粒子の発生を避けるために、最初に切断し、剪断又は粉砕はしないことにより調製される。調製されたバイオマスを次に、通常は溶媒を使用して繰り返し洗浄し、バイオマス中に含まれる液体を抽出する。溶媒は、前述の溶媒のいずれかであることができる。例示的な処理溶媒は、水、特に熱水、例えば約４０～約９０℃の温度まで加熱された水などである。溶媒を循環させて、再利用することができ、第一の抽出のために使用された溶媒が、その後の調製されたバイオマスを抽出するための溶媒として再利用されるようにする。

様々な型の拡散器が当技術分野において公知であり、本明細書中に記載するバイオマスでの使用のために適合させることができる。適切な拡散器は、リング拡散器、タワー拡散器、又はドラム拡散器を含む。例示的な拡散系は、例えば、米国特許第４，１８２，６３２号、第４，７５１，０６０号、第５，８８５，５３９号、及び第６，１９３，８０５号において考察されており、その内容は本開示と一致する様式において本明細書により組み入れられる。多数の他の拡散方法及び拡散方法のためのデバイスが公知であり、本明細書中に記載する方法における使用のために適合させることができる。一つのそのような拡散器は、Ｃｒｏｗｎ Ｉｒｏｎ Ｗｏｒｋｓ（ミネソタ州ブレイン）から商業的に入手可能な連続ループ、対向流、浅床のＣｒｏｗｎ Ｍｏｄｅｌ ＩＩＩ Ｐｅｒｃｏｌａｔｉｏｎ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒである。

バイオマスは、切断又は非切断で、上で考察したように、任意の適切な抽出方法により抽出されてもよい。特に好ましい実施形態では、抽出のために使用される溶媒は水を含む。当業者は、抽出溶媒とバイオマスの比率が、溶媒、抽出されるバイオマスの量、及び抽出手順に基づいて変動するであろうことを認識するであろう。特定の好ましい実施形態では、抽出溶媒は水であり、抽出溶媒とバイオマスの比率は、抽出溶媒のリットルに対する絶乾バイオマスのキログラムに基づいて、約１：５～約１：１００、例えば約１：５～約１：５０、より好ましくは約１：５～約１：２０などである。

抽出溶媒のｐＨは、約ｐＨ５．０～８．０の間、例えば、約ｐＨ６．０～約ｐＨ８．０の間及び約ｐＨ６．５～約ｐＨ７．５の間などとすることができる。特定の実施形態では、抽出溶媒は、約ｐＨ６．５～約ｐＨ７．５の間のｐＨを有する水である。抽出が粗製ジュースでの含浸を含む実施形態では、含浸液は約４．０～約５．０のｐＨを有してもよい。

抽出は、約２５～約９０℃の間、例えば、約３０～約８０℃の間、約３５～約７５℃の間、約４０～約７０℃の間、約４５～約６５℃の間、又は約５０～約６０℃の間などの温度で行ってもよい。

抽出方法がバッチ抽出方法である実施形態では、抽出時間は、約０．２５～約２４時間、例えば、約０．５～約２時間、約１～約８時間、又は約１～約６時間などの範囲であり得る。

抽出方法が連続方法である実施形態では、抽出時間は、約０．２５～約５時間、例えば、約０．５～約３時間などの範囲であり得る。

抽出後、不水溶性バイオマス材料は、濾過により水溶性固体から分離されて、無機塩、サッカライド、ポリサッカライド、有機酸、及びサポニン（本明細書中では「第一の濾液」として言及される）を含む濾液が提供され得る。分離は、限定しないが、重力濾過、プレート・フレームフィルタープレス、クロスフローフィルター、スクリーンフィルター、Ｎｕｔｓｃｈｅフィルター、ベルトフィルター、セラミックフィルター、膜フィルター、マイクロフィルター、ナノフィルター、限外フィルター、又は遠心分離を含む任意の適切な手段により達成することができる。場合により、様々な濾過補助剤、例えば珪藻土、ベントナイト、ゼオライトなどもこの方法において使用してもよい。

分離後、第一の濾液のｐＨを調整して、追加の不純物を除去してもよい。一実施形態では、第一の濾液のｐＨは、ゆっくりした撹拌を伴う、塩基、例えば、酸化カルシウム又は水酸化カルシウム（濾液の体積から約１．０％）などを用いた処理により約８．５～約１０．０の間に調整することができる。

特に好ましい実施形態では、水溶性固体は、場合により含浸及び／又は脱ピスを伴う、一連のミル、例えばタンデムに配置された二、三、四、五、六、又は七つのミルなどによるパルプ化の前に、バイオマス、特にヘスペラロエの葉から除去される。一般的に、本発明によるバイオマスの処理によって、少なくとも約２５％の水溶性固体、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％、例えば約２５～約９８％など、例えば約５０～約９０％など、例えば約７５～約９０％などがバイオマスから除去される。

バイオマスから回収された水溶性固体の量は、抽出効率に依存して変動し得るが、しかし、特定の例では、約１００～約４００グラムの水溶性固体、例えば約１２０～約３５０グラム／キログラムなど、例えば約１５０～約３００グラム／キログラムなどが、絶乾バイオマスの１キログラム当たりで抽出されてもよい。抽出された水溶性固体のうち、総サポニンは、水溶性固体の絶乾重量に基づいて、約５～約４０ｗｔ％、例えば約１０～約３０ｗｔ％などを含み得る。特定の例では、バイオマスから抽出され得る総サポニンの量は、約１０～約４００グラム／バイオマスの絶乾キログラム、例えば約２０～約３００グラムなど、例えば約２５～約２００グラムなど、例えば約１０～約１００グラムなどの範囲であり得る。特定の例では、抽出過程の間にバイオマスから除去された材料の量（１キログラムの絶乾バイオマス当たりの絶乾グラム）は、下の表１に示す範囲であり得る。

サポニンに加えて、水溶性固体は、サッカライド、タンパク質、脂質、及び無機塩を含み得る。例えば、特定の例では、水溶性固体は、水溶性固体の絶乾重量に基づいて、少なくとも約１ｗｔ％のサッカライド、例えば約１～約１５ｗｔ％など、例えば約２～約１０ｗｔ％などを含み得る。サッカライドはモノサッカライド及びオリゴサッカライドを含んでもよい。他の例では、水溶性固体は、水溶性固体の絶乾重量に基づいて、少なくとも約１５ｗｔ％の無機塩、例えば約１５～約３０ｗｔ％などを含み得る。

一般的に、粉砕は、約５～約９、例えば約６～約７～約８などの範囲のｐＨを有する水性溶媒、例えば水などの添加により行う。水溶性固体は、一般的に、粗抽出物として粉砕過程から回収され、特定の化合物、例えばサッカライド、ポリサッカライド、有機酸、及びサポニンなどを回収するためにさらなる処理に供してもよい。

浮遊固体は、本明細書中で不水溶性画分としても言及され、場合により、例えば、清澄、濾過、遠心分離、又はそれらの組み合わせを含む周知の過程により粗抽出物から除去してもよい。抽出物中の不水溶性固体の量（１キログラムの絶乾バイオマス当たりの絶乾グラム）は、約１．０～約３０グラムの範囲であってもよく、疎水性物質、例えばワックスなどを含んでもよい。

浮遊固体の除去後、清澄化されたジュースを直接的に使用する、濃縮する、又はさらなる処理に供して、一つ又は複数の水溶性固体、例えばサッカライド、ポリサッカライド、有機酸、サポニン、及びサポノニンなどを単離してもよい。他の例では、清澄化されたジュースをさらに精製して、サッカライド、ポリサッカライド、及び有機酸を除去し、サポニンを含む組成物を得てもよい。

前述の抽出方法から結果として得られるジュースを、さらなる抽出に供して、粗サポニン抽出物の形態で、又は約３０～約９０重量％の濃度でサポニンを含むその実質的に精製された形態でサポニンを得ることができる。抽出方法は、ヘスペラロエ属の非木本植物から抽出されたジュースを、水不混和性極性溶媒と混合することを含み得る。適切な水不混和性極性溶媒は、例えば、４～６個の炭素原子を有するアルコール、例えばブチル、アミル、ヘキシル、及びシクロヘキシルアルコールなどを含む。水不混和性極性溶媒を用いたジュースの抽出によって、一般的に、水相中に残る不純物、例えばタンパク質、糖、及び有機酸などが除去されて、サポニンが溶媒相に移される。

サポニンを含む溶媒相は、アルコール相からサポニンを分離するためのさらなる処理に供してもよい。これは、様々な方法において、例えば、冷却により、溶媒抽出物を脱水することにより、又はアルコール溶媒と混和性であるが、しかし、サポニンが不溶性である有機溶媒を加えることにより達成することができる。適切な沈殿溶媒は、例えば、ジエチルエーテル、石油エーテル、アセトン、及びクロロホルムを含む。

特に好ましい実施形態では、サポニンは、フラッシュ蒸発によりアルコールから分離される。フラッシュ蒸発は、液体混合物からの揮発性成分の迅速な除去のための分取化学において公知の技術である。揮発性液体は、しばしば、周囲温度を上回るが、しかし、大気圧での溶液の沸点を下回る、溶液の温度の増加を伴う減圧下で、大きな表面積にわたり溶液の薄いフィルムを作ることにより、蒸気相への迅速な変換により溶液から除去される。フィルムの実際の厚さ及びそれが適用される領域は、最適な蒸発及び使いやすさを提供するように選ばれるが、しかし、蒸発は実質的に瞬間的であり得る（それ故に、名称は「フラッシュ」蒸発）。フラッシュ蒸発では、意図される産物を分解し得る、高い温度の長期使用が回避され、アルコール成分のほとんど全てを除去する能力を有する（それによって、次の工程において用いられる噴霧乾燥の好ましい実施のために、残りの溶液が適切となる）。アルコールは、この工程から回収されて、この抽出方法において再利用されてもよい。

アルコール抽出物のサポニン含量は、サポニン組成物に対する有意な変化又はその損失を伴うことなく、限外濾過膜上の通過によりさらに増加させることができる。サポニン含量が８５～９０％の範囲中にあるこの濃縮サポニン画分は、次に、液体状態でさらに精製する、又は乾燥状態まで低減することができる。個々のサポニンは、逆相固相抽出及び分取逆相ＨＰＬＣの組み合わせにより回収され得る。あるいは、サポニンを含むアルコール抽出物は、逆相固相抽出及び分取逆相ＨＰＬＣの組み合わせにより直接的に分画することができる。

さらに他の実施形態では、サポニンは、本発明に従って調製されたジュースから精製してもよく、ジュースを塩及び溶媒と混合して第一の溶液を形成する工程を含む。溶媒は、酢酸、アセトン、アセトニトリル、ベンゼン、１－ブタノール、２－ブタノール、２－ブタノン、ｔ－ブチルアルコール、四塩化炭素、クロロベンゼン、クロロホルム、シクロヘキサン、１，２－ジクロロエタン、ジエチレングリコール、ジエチルエーテル、ジグリム、１，２－ジメトキシエタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、１，４－ジオキサン、エタノール、酢酸エチル、エチレングリコール、グリセリン、ヘプタン、ヘキサメチルホスホルアミド、ヘキサメチルリン酸トリアミド、ヘキサン、メタノール、メチル－ｔ－ブチルエーテル、塩化メチレン、Ｎ－メチル－２－ピロリジノン、ペンタン、パークロロエチレン、石油エーテル、１－プロパノール、２－プロパノール、ピリジン、テトラヒドロフラン、トルエン、トリエチルアミン、トリフルオロトルエン、水、キシレン、又は前述の任意の組み合わせから選択される一つ又は複数の溶媒を含み得る。一部の実施形態では、溶媒は水である。塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類塩、遷移金属塩、アンモニウム塩、又は前述の組み合せから選択され得る。特定の好ましい実施形態では、溶液を形成するために植物抽出物に加えられる塩は、アルカリ土類金属塩である。特に好ましい実施形態では、塩は、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、又はそれらの混合物である。

第一の溶液のｐＨは、一般的に、約６．０～約９．０、例えば約６．０～約８．０など、例えば約６．０～約７．０などのｐＨに調整される。少なくとも一つのリン酸を次に、第一の溶液に加えて、イオン－ポリサッカライド複合体沈殿物を形成してもよい。有用なリン酸は、例えば、リン酸水素ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４）、リン酸ナトリウム（Ｎａ_３ＰＯ_４）、又はビスリン酸水素ナトリウム（Ｎａ_２Ｈ_２ＰＯ_７）を含む。

沈殿したイオン－ポリサッカライド複合体を濾過により除去して、第二の溶液を得てもよく、これを、精製サポニンの抽出物を産生するためにさらに浄化してもよい。場合により、抽出物を、先行技術において公知の任意の濾過技術により濃縮することができる。好ましくは、精製サポニンの抽出物の濃縮を、ナノ濾過、限外濾過、及び透析濾過、又はこれらの技術の任意の組み合わせにより行う。一部の実施形態では、サポニン抽出物は、タンパク質を実質的に含まない。一部の実施形態では、サポニン抽出物は、ポリサッカライドを実質的に含まない。一部の実施形態では、サポニン抽出物は、フェノール化合物を実質的に含まない。

本発明によるヘスペラロエバイオマスから抽出され得るサポニンの総量は、絶乾バイオマス１キログラム当たり約１０～約１００グラム、例えば約２０～約８０グラムなど、例えば約２５～約７５グラムなどの範囲であり得る。サポニンは、粗製ジュースの一部として、乾燥水溶性固体組成物の一部として、部分的に精製された組成物として、又はサポニンの混合物を含む実質的に純粋な組成物として提供されてもよい。

特定の実施形態では、ヘスペラロエバイオマスから抽出されたサポニンは、２５（２７）－デヒドロフクレアスタチン（図２Ａ）、５（６），２５（２７）－ジスデヒドロユッカロイシド（図２Ｂ）、５（６）－ジスデヒドロユッカロイシド（図２Ｃ）、フルクレアスタチン、及びユッカロイシドを含む。

本発明において有用な組成物は、ヘスペラロエバイオマスからの水性抽出物を、グリセロール、プロピレングリコール、ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールなど、ならびにポリグリセロールを含む、一つ又は複数のポリヒドロキシアルコールと混合することにより調製され得る。好ましいポリヒドロキシアルコールは、約８個未満の炭素原子を有する。グリセロール及びプロピレングリコールは、特に好ましいポリヒドロキシアルコールである。

組成物はまた、サッカライドを含み得るが、それは、水性抽出物中に存在し得る、又は製剤化の間に抽出後に加えられ得る。本発明の組成物において有用なサッカライドは、モノサッカライド、例えばグルコースなど、ジサッカライド、例えばスクロースなど、及びポリサッカライド、例えばデンプンなどを含む。

さらに他の実施形態では、本発明の実施形態による組成物は、非ヒト動物の維持及び福祉のために利益を有するように、当技術分野において公知の様々な他の添加剤を含むことができる。例として、組成物は、成分、例えばビタミンＥ、プロピオン酸ビタミンＡ、パルミチン酸ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、Ｄ－活性化動物ステロール（ビタミンＤ３の供給源）、酵母成分、乾燥卵固体、乾燥カゼイン、及び乾燥ホエイなどを含むことができる。

本発明のサポニン含有組成物は、液体形態又は乾燥形態であってもよい。一例として、ヘスペラロエ抽出物を含むサポニンを粉末形態に乾燥させてもよい。この形態では、サポニン含有組成物は、ピルもしくはボーラスとして動物に投与されてもよく、又は他の成分、例えば給餌食などと混合されてもよい。例えば、サポニン含有組成物の乾燥粉末製剤は、マイクロ成分機械を介して給餌食に加えてもよく、又は給餌混合トラックに加えて、徹底的に混合されて、給餌における均等な分布を保証してもよい。ヘスペラロエ抽出物を含むサポニンはまた、担体液体、例えば水などの量を伴う液体形態であってもよい。この形態では、サポニン含有組成物は、液体水薬として動物に投与されてもよい。

本発明のサポニン含有組成物は、それを必要とする非ヒト動物に、給餌レジメンの一部として、単回投与として、複数回投与として投与されてもよい。例えば、非ヒト動物は、初期用量を受けて、次に、より少ない量でその後の維持用量を受けてもよい。非ヒト動物は、１日において複数用量のサポニン含有組成物を受けてもよく、又は複数日にわたり複数用量を受けてもよい。

特定の実施形態では、本発明の組成物は、免疫調節剤又はアジュバントとして有用であり得る。特定の実施形態では、ヘスペラロエから由来する組成物を含むサポニンは、適応免疫応答を誘発するために、それを必要とする非ヒト動物に投与されてもよい。特に好ましい実施形態では、本発明の抽出物を含むサポニンの投与は、対象において、ＣＤ４ Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、特にＴｈ１細胞及びＴｈ１７細胞における食作用活性における増加を起こす。この様式では、本発明の抽出物は、対象の免疫応答を増強するための抗原の添加を伴うことなく、医薬組成物として投与されてもよい。

他の実施形態では、本発明のヘスペラロエ抽出物は、対象の免疫応答を増強するための抗原と、非ヒト動物に投与されてもよい。適切な抗原は、微生物病原体、細菌、ウイルス、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド、グリコペプチド、リポペプチド、トキソイド、糖、及び腫瘍特異的抗原を含む。二つ以上の抗原の混合物を用いてもよい。特定の好ましい実施形態では、本発明の組成物を、非ヒト動物、特に家禽におけるコクシジウム症の予防のために意図されるワクチンで投与してもよく、コクシディアは、エイメリア、イソスポラ、トキソプラズマ、ベスノイティア、及びネオスポラからなる群から選択されることを特徴とする。このように、本発明は、ワクチン及び他の免疫刺激組成物を作製及び使用して疾患を治療又は予防する際に、例えば非ヒト動物において抗原に対する活性免疫を誘導する際に特に有利であるアジュバントシステムを提供する。

特に好ましい実施形態では、サポニン含有抽出物を、免疫応答を増加させ、病変スコアを下げて、コクシジウム症に起因するオーシスト脱落を低減させるために、それを必要とする家禽にエイメリアワクチンと投与してもよい。本発明の免疫原性組成物を、約５０μｇ未満の用量レベル、例えば約４０μｇ未満など、例えば約３０μｇ未満など、例えば約１～約５０μｇなど、例えば約５～約３０μｇなどの、免疫応答を増加させるために適切な用量体積で経口又は皮下に送達してもよい。

本発明の組成物は、広い範囲の投与量及び投与される抗原に対する広い範囲の比率にわたり投与される場合に、アジュバント効果を示す。一実施形態では、サポニンは、サポニンの重量に基づいて、３．０又はそれ以下、好ましくは１．０又はそれ以下の抗原（ｗ／ｗ）に対するアジュバントの比率で投与される。

本発明によるヘスペラロエ属の非木本植物から抽出されたサポニンは、粗製形態又は精製形態のアジュバントとして使用されてもよく、抗原に対する免疫応答の増強を達成するために他の非サポニンアジュバントと混合されてもよい。本発明で有用なそのような非サポニンアジュバントは、オイルアジュバント（例えば、Ｆｒｅｕｎｄ完全及び非完全）、リポソーム、ミネラル塩（例えば、ＡｌＫ（ＳＯ_４）_２、ＡｌＮａ（ＳＯ_４）_２、ＡｌＮＨ_４（ＳＯ_４）、シリカ、アルム、Ａｌ（ＯＨ）_３、Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２、カオリン、及び炭素）、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣ酸及びポリＡＵ酸）、特定の天然物質（例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシスからのワックスＤ、ならびにコリネバクテリウム・パルフム、ボルデテラ・パータシス、及びブルーセラ属のメンバーにおいて見出される物質）である。

テスト方法
水溶性固体
総バイオマス水溶性固体は、Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＡＳＥ）、例えばＤｉｏｎｅｘ（商標）ＡＳＥ（商標）３５０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）などを使用して決定してもよい。約１０グラムの回収されたバイオマスを、オーブン中で、典型的には１２５℃で４時間、一定重量に乾燥させる。乾燥後、１．５～２．０グラムの絶乾バイオマスを正確に秤量し、重量（Ｗ_ｂ）を０．００１グラム単位まで記録した。水を溶媒として使用して、バイオマスを、下の表中に示す条件を使用して抽出する。バイオマス対溶媒の比率は一般的に２１：１であり、５回の連続水抽出サイクルが実施される。各々の抽出サイクルの終了時に、液相を収集し、約４０℃で真空下で乾燥させ、乾燥材料（Ｗ_ｉ）の重量を０．００１ｇ単位まで記録する。水溶性固体の総重量（Ｗ_ｅ）を、各々の抽出サイクル（Ｗ_ｉ）から回収された固体の重量を合計することにより算出する。絶乾バイオマスのパーセンテージとしての総水溶性固体を次に、以下の等式を使用して決定する：水溶性固体（ｗｔ％）＝Ｗ_ｅ／Ｗ_ｂ＊１００。

バイオマス抽出物中の総水溶性固体は、適したアリコート、典型的には約１０～５０ｍｌを取り出し、清潔な、乾燥した遠心分離管に移すことにより決定され得る。チューブを７０００ｒｐｍで２０分間にわたり遠心分離する。抽出物の重量（Ｗ_１）を算出する。上清のアリコートを次に、清潔な、予め秤量されたビーカー（Ｄ_０）に移し、秤量する。。ビーカー及びサンプルを次に、０．００１ｇ単位まで秤量し、重量（Ｄ_２）を記録する。サンプルを含むビーカーを次に、一晩乾燥するために熱風オーブン中で、１４０℃に置く。ビーカーをオーブンから取り出し、乾燥させ、室温まで冷却し、次に０．００１グラム（Ｄ_１）単位まで秤量する。可溶性固体の重量パーセンテージを、抽出物の重量に基づいて、以下の式を使用して決定する。
Ｄ_１＝空ビーカー＋乾燥可溶性固体の質量、Ｄ_０＝空ビーカーの質量、Ｄ_２＝バイオマス抽出物及び空ビーカーの質量。

総サポニン
総サポニンを、一般的に、Ｍａｋｋａｒ，Ｈａｒｉｎｄｅｒ Ｐ．Ｓ．，Ｓｉｄｈｕｒａｊｕ，Ｐ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｋｌａｕｓ（２００７）Ｐｌａｎｔ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，ｃｈａｐｔｅｒ １７，ｐｐ９３－１００において記載されるように測定した。標準的なサポニン溶液を、１０ｍｇのジオスゲニン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ＞９３％）を秤量し、１６ｍＬのメタノール中に溶解し、４ｍＬの蒸留水を加えることにより調製した。溶液を徹底的に混合し、８０％メタノール溶媒中の０．５ｍｇ／ｍＬのジオスゲニン溶液を得た。標準を使用して、様々な量の標準（０、１０、２０、４０、６０、８０、及び１００μＬ）を１３ｍｍガラス試験管中に移すことにより検量線を作成した。８０％水性メタノールの溶液を総体積１００μＬまで加えた。

テストの前に、バイオマス抽出物のサンプルを、水での希釈により、約０．５ｗｔ％の総固形分に調整して、吸光度の結果が、サポニン標準検量線の範囲に沿っていることを確実にした。希釈された抽出物（２０μＬ）のサンプルを、１３ｍｍのガラス試験管中にピペットで分注し、体積を８０μＬのメタノールで１００μＬまで上げた。各々のサンプルを三通りにテストした。

各々のサンプルに、１００μＬのバニリン試薬（８００ｍｇのバニリンを１０ｍＬの９９．５％エタノール（分析グレード）中に溶解することにより調製）、次に、１．０ｍＬの７２％（ｖ／ｖ）硫酸（７２ｍＬの硫酸（分析グレード、９５％、ｗ／ｗ）を２８ｍＬの蒸留水に加えることにより調製された７２％（ｖ／ｖ）硫酸）を加えた。溶液をよく混合し、６０℃で１０分間にわたり加熱した。サンプルを次に氷浴中で冷却し、１ｍＬの溶液をそれぞれのキュベット中に移し、５４４ｎｍでの吸光度を読み取った。サンプル中のサポニンの総質量を、以下のように、標準吸光度曲線に基づいて算出してもよい：
サポニン（μｇ）＝［スロープ］×測定吸光度－［インターセプト］

総サポニン
総サポニンを、一般的に、Ｍａｋｋａｒ，Ｈａｒｉｎｄｅｒ Ｐ．Ｓ．，Ｓｉｄｈｕｒａｊｕ，Ｐ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｋｌａｕｓ（２００７）Ｐｌａｎｔ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，ｃｈａｐｔｅｒ １７，ｐｐ９３－１００において記載されるように測定した。標準的なサポニン溶液を、１０ｍｇのジオスゲニン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ＞９３％）を秤量し、１６ｍＬのメタノール中に溶解し、４ｍＬの蒸留水を加えることにより調製した。溶液を徹底的に混合し、８０％メタノール溶媒中の０．５ｍｇ／ｍＬのジオスゲニン溶液を得た。標準を使用して、様々な量の標準（０、１０、２０、４０、６０、８０、及び１００μＬ）を１３ｍｍガラス試験管中に移すことにより検量線を作成した。８０％水性メタノールの溶液を総体積１００μＬまで加えた。

テストの前に、バイオマス抽出物のサンプルを、水での希釈により、約０．５ｗｔ％の総固形分に調整して、吸光度の結果が、サポニン標準検量線の範囲に沿っていることを確実にした。希釈された抽出物（２０μＬ）のサンプルを、１３ｍｍのガラス試験管中にピペットで分注し、体積を８０μＬのメタノールで１００μＬまで上げた。各々のサンプルを三通りにテストした。

各々のサンプルに、１００μＬのバニリン試薬（８００ｍｇのバニリンを１０ｍＬの９９．５％エタノール（分析グレード）中に溶解することにより調製）、次に、１．０ｍＬの７２％（ｖ／ｖ）硫酸（７２ｍＬの硫酸（分析グレード、９５％、ｗ／ｗ）を２８ｍＬの蒸留水に加えることにより調製された７２％（ｖ／ｖ）硫酸）を加えた。溶液をよく混合し、６０℃で１０分間にわたり加熱した。サンプルを次に氷浴中で冷却し、１ｍＬの溶液をそれぞれのキュベット中に移し、５４４ｎｍでの吸光度を読み取った。サンプル中のサポニンの総質量を、以下のように、標準吸光度曲線に基づいて算出してもよい：
サポニン（μｇ）＝［スロープ］×測定吸光度－［インターセプト］

実施例１
合計で１５０匹の１日齢のブロイラー雛を、２８日間のケージ試験において六つの実験群に無作為に分配した。生コクシディアを、トリに、それらの生後１４日目に手作業で導入した。処置コードは、表３中に列挙するように、コクシジウムチャレンジを伴う（対照＋）及び伴わない（対照）基礎食を使用した二つの対照コードを含んだ。残りの処置コードは全て、二つの異なる投与量での本発明の組成物で濃縮された基礎食、又は商品名ＦＯＡＭＡＴＩＯＮ（商標名）（Ｉｎｇｒｅｄｉｏｎから商業的に入手可能、イリノイ州ウェストチェスター）の下で市販されているユッカ抽出物を使用し、コクシジウムでチャレンジした。ＦＯＡＭＡＴＩＯＮ（商標）は、組成物の５０重量％の水溶性固体を含んだが、そのうちサポニンが１０ｗｔ％を構成した。各々のペンについての鳥の体重増加（ＢＷ）及び飼料消費量を毎週測定した。飼料換算率（ＦＣＲ）は、消費された飼料のキログラムと体重増加のキログラムの間の比率である。より低いＦＣＲ値は、より良い飼料を示す。

本発明の抽出物は、クラウン上の成熟したヘスペラロエ・フニフェラの葉を回収し、葉を約０．５０～約８．０ｃｍの範囲の切片に切断し、切断バイオマスを、タンデムプレスを使用してプレスすることにより調製した。バイオマスを３回プレスし、粗製ジュースを収集し、２５ｍｍフィルターを通過させ、加熱して抽出物を２９％固体に濃縮した。水溶性固体は、水溶性固体の絶乾重量に基づいて、２１ｗｔ％の総サポニンを含んだ。

２８日間の治験の終了時に、チャレンジされた対照（対照＋）群は、チャレンジを伴わない対照と比較して、飼料消費量が約１４０ｇ／鳥だけ減少し、体重増加が約１６０ｇ／鳥だけ低減した。これらの減少は、しかし、下の表４中に図示するように、本発明の組成物を含む飼料を投与されたニワトリでは観察されなかった。

実施例２
合計５１２羽の１日齢のブロイラー雛を８つの実験群に無作為に分配し、２１日間の試験において各々の群について８つのケージ及びケージ当たり８羽の鳥であった。生きたコクシジウムを、生後１４日齢で若い鳥に手作業で導入した。鳥の体重増加（ＷＧ）、飼料変換率（ＦＣＲ）、病変スコア、及びオーシスト数を測定した。処置コードは、表５中に列挙するように、コクシジウムチャレンジを伴わない（対照）及びチャレンジを伴う（対照＋）基礎食を含んだ。残りの処置コードは、Ｃｏｂａｎ（Ｅｌａｎｃｏ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、インディアナ州グリーンフィールドから商業的に入手可能）、Ｍｉｃｒｏ－Ａｉｄ（ＤＰＩ Ｇｌｏｂａｌ，カリフォルニア州ポータービルから商業的に入手可能）、及び二つの異なる投与量での二つの異なる本発明のサンプルを伴う基礎食を使用したコクシジウムチャレンジドコードであった。基礎食は、家禽についての国家研究会議の最低要件を満たした。

本発明のサンプル１を、クラウン上の成熟したヘスペラロエ・フニフェラの葉を回収し、葉を約０．５０～約８．０ｃｍの範囲の断片に切断し、切断バイオマスをタンデムプレスを使用してプレスすることにより調製した。バイオマスを３回プレスし、粗製ジュースを収集し、２５ｍｍフィルターを通過させ、加熱して抽出物を２９％固体に濃縮した。本発明のサンプル２を、クラウン上の成熟したヘスペラロエ・フニフェラの葉を回収し、葉を約０．５０～約８．０ｃｍの範囲の断片に切断し、切断バイオマスをタンデムプレスを使用して１回プレスすることにより調製し、その後、収集されたジュースを加熱し、１４％固体を有する抽出物を得た。全ての処理材料を、各々の添加剤を、ミキサー中の指定されたローディングレベルで基礎飼料に混合することにより作製した。

本発明の組成物を給餌されたニワトリは、下の表６中に要約するように、体重増加、改善された飼料転換率、減少した病変スコア、及びより低いオーシストを示した。多くの例では、改善は、Ｃｏｂａｎ又はＭｉｃｒｏ－Ａｉｄ Ｇｒｅｅｎを給餌されたニワトリで観察された改善と同等、又はより良好であった。サポニンの比較的低用量でさえ、本発明の組成物は効果的である。

本発明の組成物は、コクシジウム症を低減又は予防する際に特に有用である。病変スコアは、０～４の間のスコア（０は正常な腸の外観を示す一方で、４は重度の損傷した腸を示す）で、ニワトリの腸損傷を通じたコクシジウム症の発生を評価する手段である。本発明の組成物を３週間にわたり給餌されたニワトリは、チャレンジされていない対照と比較して、改善した病変スコア（２３～２７％）を示した。感染の例を低減し、ニワトリの消化器系を保護することにより、ニワトリはより良く消化し、栄養素を吸収し、より速い速度で成長することができた。

実施例３
孵化から合計２１０日のＲｏｓｓ ｘ Ｒｏｓｓ雄ブロイラー雛を、Ａｖｉａｇｅｎ Ｈａｔｃｈｅｒｙ、ジョージア州ブレアズビルから得た。出生時、鳥は定期予防接種（ＨＶＴＳＢ１）を受けた。鳥を、２８日間のケージ試験において六つの実験群に無作為に分配した。処置群は、表７中に列挙するように、無ワクチン又はヘスペラロエ抽出物を受けた最初の群、ヘスペラロエ抽出物単独を受けた群、ニューカッスル病ウイルス（Ｌａｓｏｔａ株）及びヘスペラロエ抽出物を受けた群、ならびに不活化ニューカッスル病ウイルス（Ｌａｓｏｔａ株）を受けた群を含んだ。

ニューカッスル病ウイルスで処置された鳥は、０日目に、首の後部で０．１０ｍｌのＳ．Ｑ．で投与された油型エマルジョンニューカッスル病ウイルス（ラソタ株）ワクチンを受けた。ヘスペラロエ抽出物を、切断バイオマスをタンデムプレスを使用して１回プレスすることにより、実施例２に記載するように実質的に調製し、その後、収集したジュースを加熱して、１４％固体を有する抽出物を得た。

３５匹のブロイラー雛の各々の群を、１３．４’×１５．７’の部屋に収容した。分離室環境は、独立したＨＥＰＡ濾過システム及びヒートポンプユニットにより制御され、１つのヒートランプによって、介卵の間に補足的な熱が提供される。鳥を周囲湿度下で飼育し、主要なブリーダ推奨事項に従って照明プログラムを提供した。配置時に、各々のペンは、約４インチの新鮮な松の削り屑を含んだ。リターは試験コースの間に交換しなかった。各々の区画はチューブ給餌器及びベル給水器を含み、３５羽／給餌器と給水器の比率をもたらした。

全ての食餌が、１１３．５ｇ／トンのアンプロリウムを含み、コクシジウム症を予防したが、他の併用薬物治療は試験の間に使用されなかった。スターター食料を秤量し、ＤＯＴ ０からＤＯＴ ２８に給餌した。飼料製剤は、ＮＲＣ基準を満たす又はそれを上回るように分析により算出された、局所製剤を代表する一般的に使用される米国飼料を配合させた非投薬の商業用ブロイラースターター及び生産者用食餌からなった。抗生物質はいずれの飼料にも加えなかった。

ＤＯＴ ２８では、処置当たり１０羽の鳥を安楽死させ、臓器標本（十二指腸における大きなパイエル板、盲腸扁桃、ファブリキウス嚢の半分、空腸の０．５ｃｍ切片）を収集し、個々の瓶に入れた。組織サンプルを１０％緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンワックス中に包埋した。パラフィン包埋組織の切片（約５ミクロン）を、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。

リンパ濾胞領域及びリンパ濾胞皮質を、Ｍｕｎｉｚ，ｅｔ ａｌ，Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ｊ Ｐｏｕｌｔ Ｓｃｉ ８，２１７－２２０，２００６に記載されるように測定した。解剖学的特徴の完全な提示を伴う五つの濾胞を、嚢ごとに測定した。測定を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア１．３７、Ｊａｖａベースの画像処理ソフトウェアにおける無償ハンドツール及びラインツーエリア機能を用いて行ったが、このソフトウェアは、米国国立衛生研究所で開発され、インターネット上で無償で利用可能である。ピクセルからマイクロメートルを、ＡｍＳｃｏｐｅ ＭＲ４００較正スライドを使用して較正した。

盲腸扁桃及びパイエル板の面積をリンパ濾胞面積の測定と同様に測定し、胚中心を手作業で計数した。処置群１から６の各々についての盲腸扁桃の生殖中心カウントを図３中に図示する。

腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）増殖（過形成）を、０～５のスケールでスコア化した：０（明らかではない）、１（最小の存在）、２（軽度）、３（中等度）、４（顕著）、及び５（重度）。ＧＡＬＴ増殖は、限局的で、局所的に広範で、びまん性に生じたが、正常限度内であり、しかし、過形成の程度は変動した。処置群１から６の各々についてのＧＡＬＴスコアを図４中に図示する。

腸ヘテロフィルが、固有層中のヘテロフィルのクラスターとして出現した。クラスターの総数を計数し、各々の空腸切片について記録した。処置群１から６の各々についての固有層中のクラスターの総数を図５中に図示する。

ＤＯＴ ２８に、処置当たり１０羽の鳥を採血し、血清サンプルを収集し、商業的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）ニューカッスル病抗体テスト（ＦｌｏｃｋＣｈｅｋ（登録商標）、ＩＤＥＸＸ、米国メイン州から商業的に入手可能）を使用して評価した。群の各々についての結果として得られたＥＬＩＳＡ力価を図６中に示す（グラフ中の左から右に示す処置群１から６）。

Claims (27)

1. 非ヒト動物に、少なくとも一つのサポニンを含むヘスペラロエ属の非木本植物からの抽出物の免疫原性有効量を投与する工程を含む、非ヒト動物において免疫応答を増強する方法。
2. 前記抽出物が、サッカライド、タンパク質、及び脂質をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記抽出物が、サッカライド、タンパク質、及び脂質を実質的に含まない、請求項１に記載の方法。
4. 前記の少なくとも一つのサポニンが、カンモゲニン、マノゲニン、ゲントロゲニン、ヘコゲニン、チゴゲニン、サルサポゲニン、クロロゲニン又はジトゲニン、ならびにグルコース、キシロース、ラムノース、アラビノース、及びガラクトースから選択される少なくとも一つのグリコシド部分を含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記少なくとも一つのサポニンが、２５（２７）－デヒドロフクレアスタチン、５（６），２５（２７）－ジスデヒドロユッカロイシド、５（６）－ジスデヒドロユッカロイシド、フルクレアスタチン、又はユッカロイシドである、請求項１に記載の方法。
6. 前記抽出物が、２５（２７）－デヒドロフクレアスタチン、５（６），２５（２７）－ジスデヒドロユッカロイシド、５（６）－ジスデヒドロユッカロイシド、フルクレアスタチン、及びユッカロイシドの混合物を含む、請求項１に記載の方法。
7. ヘスペラロエ属の前記非木本植物が、ヘスペラロエ・フニフェラ、ヘスペラロエ・ノクターナ、ヘスペラロエ・パルビフロラ、又はヘスペラロエ・チアンギイである、請求項１に記載の方法。
8. 前記抽出物中のサポニンの量が、前記抽出物の約１０～約２５重量％の範囲である、請求項１に記載の方法。
9. ヘスペラロエ属の非木本植物から抽出された少なくとも一つのサポニンを含む組成物をそれに投与することを含む、家禽においてコクシジウム症及び／又は壊死性腸炎を治療する方法。
10. 前記抽出物が、サッカライド、タンパク質、及び脂質をさらに含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記抽出物が、サッカライド、タンパク質、及び脂質を実質的に含まない、請求項９に記載の方法。
12. 前記少なくとも一つのサポニンが、カンモゲニン、マノゲニン、ゲントロゲニン、ヘコゲニン、チゴゲニン、サルサポゲニン、クロロゲニン、又はジトゲニン、ならびにグルコース、キシロース、ラムノース、アラビノース、及びガラクトースから選択される少なくとも一つのグリコシド部分を含む、請求項９に記載の方法。
13. 前記少なくとも一つのサポニンが、２５（２７）－デヒドロフクレアスタチン、５（６），２５（２７）－ジスデヒドロユッカロイシド、５（６）－ジスデヒドロユッカロイシド、フルクレアスタチン、又はユッカロイシドである、請求項９に記載の方法。
14. 前記抽出物が、２５（２７）－デヒドロフクレアスタチン、５（６），２５（２７）－ジスデヒドロユッカロイシド、５（６）－ジスデヒドロユッカロイシド、フルクレアスタチン、及びユッカロイシドの混合物を含む、請求項９に記載の方法。
15. ヘスペラロエ属の前記非木本植物が、ヘスペラロエ・フニフェラ、ヘスペラロエ・ノクターナ、ヘスペラロエ・パルビフロラ、又はヘスペラロエ・チアンギイである、請求項９に記載の方法。
16. 前記抽出物中のサポニンの量が、前記抽出物の約１０～約２５重量％の範囲である、請求項９に記載の方法。
17. 免疫原性有効量の抗原を投与することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
18. 非ヒト動物において少なくとも一つの適応免疫防御機構の活性を増加させるのに有効なヘスペラロエ由来免疫調節剤の量を前記非ヒト動物に投与することを含み、前記ヘスペラロエ由来免疫調節剤が少なくとも一つのサポニンを含む、前記非ヒト動物において適応免疫応答を増強するための方法。
19. 前記ヘスペラロエ由来免疫調節剤が二つ以上のサポニンの混合物を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記少なくとも一つのサポニンが、カンモゲニン、マノゲニン、ゲントロゲニン、ヘコゲニン、チゴゲニン、サルサポゲニン、クロロゲニン、又はジトゲニン、ならびにグルコース、キシロース、ラムノース、アラビノース、及びガラクトースから選択される少なくとも一つのグリコシド部分を含む、請求項１８に記載の方法。
21. 前記ヘスペラロエ由来免疫調節剤が、２５（２７）－デヒドロフクレアスタチン、５（６），２５（２７）－ジスデヒドロユッカロイシド、５（６）－ジスデヒドロユッカロイシド、フルクレアスタチン、及びユッカロイシドから選択される二つ以上のサポニンを含む、請求項１８に記載の方法。
22. 前記ヘスペラロエ由来免疫調節剤が、２５（２７）－デヒドロフクレアスタチン、５（６），２５（２７）－ジスデヒドロユッカロイシド、５（６）－ジスデヒドロユッカロイシド、フルクレアスタチン、及びユッカロイシドの混合物を含む、請求項１８に記載の方法。
23. 少なくとも一つの寄生虫、微生物、抗原、免疫原、エピトープ、又はワクチン、及びヘスペラロエから抽出された１～約５０μｇの総サポニンを含むアジュバントを含む、ニワトリにおけるコクシジウム症、感染性気管支炎、伝染性ファブリキウス嚢病、喉頭気管炎、マレック病、又はニューカッスル病に対する免疫原性又はワクチン組成物。
24. 前記組成物が医薬的に有効な担体をさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
25. 少なくとも一つの寄生虫、微生物、抗原、免疫原、エピトープ、又はワクチンがコクシジウム症ワクチンである、請求項２３に記載の組成物。
26. 前記コクシジウム症ワクチンが、Ｅ．アセルブリナ、Ｅ．マキシマ、Ｅ．ミティス、又はＥ．テネラの一つ又は複数の株を含む、請求項２５に記載の組成物。
27. 前記少なくとも一つの寄生虫、微生物、抗原、免疫原、エピトープ、又はワクチンが、感染性気管支炎ワクチン、伝染性ファブリキウス嚢病ワクチン、喉頭気管炎ワクチン、マレック病ワクチン、及びニューカッスル病ワクチンを含む群から選択される、請求項２３に記載の組成物。