JP6077899B2 - アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤 - Google Patents

Description

本発明は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤に関する。

グルコシルグリセロールは、グリセロールにグルコースが結合した構造であり、保水性が強く化粧品原料として利用が検討されている（非特許文献２，４）。グルコシルグリセロールは日本酒に含まれていることが知られている（非特許文献１〜３）。グルコシルグリセロールは日本酒の製造工程において、糖源であるマルトースと酵母が産生するグリセロールから麹由来のα−グルコシダーゼの作用により生成すると考えられている。

Ｔａｋｅｎａｋａ Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０００，６４（２），３７８−８５． Ｔａｋｅｎａｋａ Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０００，６４（９），１８２１−６． Ｔａｋｅｎａｋａ Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００１，６５（７），１４５８−６３． Ｓｃｈｗａｒｚ Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ． ２００９，１０３（５），８６５−７２．

本発明は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤を提供することを目的とする。

グルコシルグリセロールが、日本酒に含まれていることはすでに知られていたが、保水性以外の性質はよく知られていなかった。本発明者らは、鋭意研究を行った結果、グルコシルグリセロールがアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）に対する阻害活性を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、グルコシルグリセロールを有効成分として含有するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤を提供する。

本発明は、グルコシルグリセロールを有効成分として含有する抗酒薬を提供する。

本発明は、グルコシルグリセロールを有効成分として含有するアルコール依存症の治療薬を提供する。

摂取されたアルコールはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）によってアセトアルデヒドへ分解され、アセトアルデヒドはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）によって酢酸に分解される。アセトアルデヒドは非常に毒性が強く、フラッシング反応（顔が赤くなる、吐き気がする、動悸がする、眠くなる等の症状）を起こし、二日酔いの原因とも考えられている。したがって、グルコシルグリセロールを対象に投与することによって、対象の体内におけるアセトアルデヒドの蓄積が促され、抗酒薬及びアルコール依存症の治療薬としての効果が奏される。

本発明は、哺乳動物にグルコシルグリセロールを有効量投与することを含む、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを阻害する方法を提供する。

本発明は、哺乳動物にグルコシルグリセロールを有効量投与することを含む、アルコール依存症を治療する方法を提供する。

上記哺乳動物は、ヒトであってもよい。

本発明は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの阻害に使用する、グルコシルグリセロールを提供する。

本発明は、アルコール依存症の治療に使用する、グルコシルグリセロールを提供する。

本発明は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤の製造における、グルコシルグリセロールの使用を提供する。

本発明は、抗酒薬の製造における、グルコシルグリセロールの使用を提供する。

本発明は、アルコール依存症の治療薬の製造における、グルコシルグリセロールの使用を提供する。

本発明によれば、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤を提供することが可能になる。

日本酒に含まれる成分のＡＬＤＨ阻害活性を示すグラフである。 日本酒に含まれる成分のＡＬＤＨ阻害活性を示すグラフである。 日本酒に含まれる成分のＡＬＤＨ阻害活性を示すグラフである。 日本酒からＡＬＤＨ阻害物質を同定するための手順を示す図である。 日本酒に含まれる成分のＡＬＤＨ阻害活性を示すグラフである。 日本酒に含まれる成分のＡＬＤＨ阻害活性を示すグラフである。 日本酒に含まれる成分の分子量を示すグラフである。 合成したα−グルコシルグリセロールのＡＬＤＨ阻害活性を示すグラフである。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

本実施形態に係るアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤（以下、ＡＬＤＨ阻害剤という場合がある）は、グルコシルグリセロールを有効成分として含有する。

上記ＡＬＤＨとしては、特に制限はないが、例えばＡＬＤＨ２等が挙げられる。ＡＬＤＨ２には遺伝子多型が存在し、日本人を含むモンゴロイドはアセトアルデヒド分解活性の低いタイプが約４０％程度存在すると言われている。アルコール分解における律速反応は、ＡＬＤＨ２によるアセトアルデヒドの分解であり、ＡＬＤＨ２の活性を抑制することによって、対象の体内におけるアセトアルデヒドの蓄積が促され、抗酒薬及びアルコール依存症の治療薬としての効果が奏される。

グルコシルグリセロールは、α−グルコシルグリセロールでも、β−グルコシルグリセロールでもよい。グルコシルグリセロールは、公知の方法によって入手が可能である。α−グルコシルグリセロールは、例えば、日本酒等の酒類から溶媒抽出して単離精製してもよいし、マルトースとグリセロールとから、α−グルコシダーゼによる糖転移反応によって合成してもよい。また、市販品を入手してもよい。β−グルコシルグリセロールは、例えば、非特許文献４に記載の方法で合成することが可能である。

本実施形態に係るＡＬＤＨ阻害剤は、有効成分としてグルコシルグリセロール以外のアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを阻害する物質（ＡＬＤＨ阻害物質）を含んでもよい。ＡＬＤＨ阻害物質としては、ジスルフィラム、シアナミド等が挙げられる。

本実施形態に係るＡＬＤＨ阻害剤は、固体（例えば、凍結乾燥させて得られる粉末）、液体（水溶性又は脂溶性の溶液又は懸濁液）、ペースト等のいずれの形状であってもよく、また、散剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤等のいずれの剤形であってもよい。

上述の各種製剤は、有効成分であるグルコシルグリセロールからなるものであってもよい。上述の各種製剤はまた、有効成分であるα−グルコシルグリセロールと、薬学的に許容される添加剤（賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤等）とを混和し、成形することによって調製することもできる。この場合の上記有効成分の含有量は、製剤全量を基準として、例えば、０．１〜２０質量％であることが好ましい。

例えば、賦形剤としては、ラクトース、スクロース、デンプン、デキストリン等が挙げられる。結合剤としては、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等が挙げられる。崩壊剤としては、結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリン等が挙げられる。乳化剤又は界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８０、モノステアリン酸グリセリン等が挙げられる。基剤としては、セトステアリルアルコール、ラノリン、ポリエチレングリコール、米糠油、魚油（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ８０等が挙げられる。懸濁化剤としては、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８０、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。

本実施形態に係るＡＬＤＨ阻害剤は、ヒトに投与しても、非ヒト哺乳動物に投与してもよい。投与量及び投与方法は、投与される個体の状態、年齢等に応じて適宜決定することができる。好適な投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。投与量及び投与方法の一例として、ＡＬＤＨ阻害剤を有効成分量が５０ｍｇ〜１０ｇとなる量を１日１回経口でヒトに投与する方法を挙げることができる。

本実施形態に係るＡＬＤＨ阻害剤は、医薬品成分、飲食品成分、飲食品添加物、飼料成分、飼料添加物等として使用することができる。

例えば、本実施形態に係るＡＬＤＨ阻害剤は、水、清涼飲料水、果汁飲料、乳飲料、アルコール飲料、パン類、麺類、米類、豆腐、乳製品、醗酵食品、発酵乳、醤油、味噌、菓子類等の飲食品への添加物として使用することができる。これらの飲食品は、当分野で通常使用される他の添加物を更に含有してもよく、そのような添加物としては、例えば、苦味料、香料、リンゴファイバー、大豆ファイバー、肉エキス、黒酢エキス、ゼラチン、コーンスターチ、蜂蜜、動植物油脂；グルコース、フルクトース等の単糖類；スクロース等の二糖類；デキストロース、デンプン等の多糖類；エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール等の糖アルコール類；ビタミンＣ等のビタミン類、が挙げられる。本実施形態に係るＡＬＤＨ阻害剤はまた、特定保健用食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、病者用食品等の成分として使用することもできる。

本実施形態に係るグルコシルグリセロールは、ＡＬＤＨ阻害活性を有しているため、抗酒薬の有効成分としても用いられうる。すなわち、グルコシルグリセロールを有効成分として含有する抗酒薬であってもよい。

本実施形態に係るグルコシルグリセロールは、ＡＬＤＨ阻害活性を有しているため、アルコール依存症の治療薬の有効成分としても用いられうる。すなわち、グルコシルグリセロールを有効成分として含有するアルコール依存症の治療薬であってもよい。

摂取されたアルコールはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）によってアセトアルデヒドへ分解され、アセトアルデヒドはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）によって酢酸に分解される。アセトアルデヒドは非常に毒性が強く、フラッシング反応（顔が赤くなる、吐き気がする、動悸がする、眠くなる等の症状）を起こし、二日酔いの原因とも考えられている。したがって、グルコシルグリセロールを対象に投与することによって、対象の体内におけるアセトアルデヒドの蓄積が促され、抗酒薬及びアルコール依存症の治療薬としての効果が奏される。なお、抗酒薬は、禁酒薬、嫌酒薬という場合がある。

以下、本発明について、実施例を挙げて更に詳細に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実験方法
ＡＬＤＨ活性の測定
Ｃ５７／ＢＬ６マウスから肝臓を摘出し、肝臓重量の４倍量の緩衝液（０．２５Ｍ ｓｕｃｒｏｓｅ−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ ７．４０，０．１ｍＭＤＴＴ）を加えてホモジナイズした。得られたホモジネートを８００ｇにて１５分間遠心して、核及びデブリス（細胞片）を取り除いた。その後、得られた上清を１２０００ｇにて１５分間遠心し、ミトコンドリア画分を沈殿させ回収した。残った上清を再度遠心し、残存するミトコンドリアを回収した。ミトコンドリア画分を上記緩衝液に再浮遊させ、遠心して再沈殿させた後、組織重量の１容量の緩衝液に浮遊させ、０℃において１０秒間、３回超音波粉砕した。超音波粉砕することによって得られたサンプルのタンパク質の定量はＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いて行った。得られたミトコンドリア画分（サンプル）は使用するまで−８０℃で保存した。

７０ｍＭ ピロリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１ｍＭ ピラゾール、０．１ｍＭ ＮＡＤ＋、及び酵素源であるミトコンドリア画分（約１００ｍｇのタンパク質を含む）及び基質（１０ｍＭ ２−エチルヘキサナール）を混合することによって反応を開始させた（３７℃）。反応液量は２００μｌとし、サンプルは１０質量％となるように添加した。３４０ｎｍにおける吸光度の増加を５分間記録し、その増加速度からＡＬＤＨ活性を評価した。

α−グルコシダーゼによるα−グルコシルグリセロールの合成
酵素は、トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」（天野エンザイム株式会社製、商品名）を、マルトースの量に対して０．１％使用した。マルトース５０ｇ（１０％），グリセロール１２５ｇ（２５％）を酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）５００ｍｌに溶解し、上記酵素の存在下、４０℃にて一晩反応させた。反応終了後、９５℃にて１０分間加熱することによって上記酵素を失活させた。得られた反応液を配位子カラムＳＰＣ８１０（昭和電工社製、商品名Ｓｈｏｄｅｘ）によって分離し、α−グルコシルグリセロールをフラクションコレクターにて分取した。

日本酒からのＡＬＤＨ阻害物質の分離及び精製
エバポレーターによって、日本酒からアルコール分を除去し、サンプル（日本酒サンプル）を得た。この日本酒サンプルに含まれるＡＬＤＨ阻害物質の分子量を推定する目的で、分子量７０００カットの透析チューブを用いて上記透析チューブを透過した成分が含まれる低分子画分と、上記透析チューブを透過しなかった成分が含まれる高分子画分とに分画した。得られた低分子画分及び高分子画分のＡＬＤＨ阻害活性を測定した。その結果、低分子画分に阻害活性が認められた（図１）。次に吸着樹脂ＸＡＤ２（オルガノ社製、商品名：アンバーライトＸＡＤ２）による分画を行った。上記日本酒サンプルをＸＡＤ２に通液後、２０％メタノール水溶液、５０％メタノール水溶液、１００％メタノールを順次通液し、それぞれの溶出画分を得た。得られた画分のうち、ＸＡＤ２非吸着画分にＡＬＤＨ阻害活性が認められた（図２）。日本酒に含まれるＡＬＤＨ阻害物質はＸＡＤ２への吸着性を示さず、親水性の高い物質であることが予想されたことから、ＸＡＤ２非吸着画分を弱塩基性陰イオン交換樹脂（オルガノ株式会社製、商品名Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＥ５８３）又は弱酸性陽イオン交換樹脂（オルガノ株式会社製、商品名Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＣ３５００）に通液し、ＡＬＤＨ阻害活性を評価した。その結果、弱塩基性陰イオン交換樹脂への通液によってＡＬＤＨ阻害活性が消失し、弱酸性陽イオン交換樹脂への通液ではＡＬＤＨ阻害活性の消失は認められなかった（図３）。ここまでの日本酒の分画のスキームを図４にまとめる。

ＸＡＤ２に非吸着であって、陽イオン交換樹脂ＦＰＣ３５００にも非吸着である上記日本酒サンプルの画分についてＨＰＬＣによって更に分離を行った。上記画分をＯＤＳカラム（Ｗａｔｅｒｓ社製、商品名：Ａｔｌａｎｔｉｓ）によって分離し、フラクションコレクターを用いて３０秒間隔にてフラクション（画分）を得た（分離条件：０−４分 ０％ＣＨ_３ＣＮ，４−９分 ０％−１００％ＣＨ_３ＣＮ，９−１０分 １００％ＣＨ_３ＣＮ、カラム温度：４０℃、流量：１ｍｌ／分）。図５（ｂ）にクロマトグラムを示す。２６０ｎｍの紫外吸収を示した画分２〜５についてＡＬＤＨ阻害活性を測定した結果、画分２にＡＬＤＨ阻害活性が認められた（図５（ａ））。画分２をさらに親水性化合物分離用ＮＨ２カラム（ＴＯＳＯＨ社製、商品名：ＴＳＫ−ｇｅｌ ＮＨ２）にて分離し、フラクションコレクターを用いて３０秒間隔にてフラクション（画分）を得た（分離条件：０−１５分 ８０％−２０％ ＣＨ_３ＣＮ，１５−１６分 ２０％−０％ ＣＨ_３ＣＮ、カラム温度：４０℃、流量：１ｍｌ／分）。図６（ｂ）にクロマトグラムを示す。取得した２２フラクションのうち、溶出時間６．５〜７．０分のフラクション１０にＡＬＤＨ阻害活性が認められた（図６（ａ））。ＡＬＤＨ阻害率は測定終了時におけるコントロールと試験サンプルとの３４０ｎｍの吸光度の比から算出した。

日本酒に含まれるＡＬＤＨ阻害物質の同定
ＴＳＫ−ｇｅｌ ＮＨ２カラムによる分離にて得られたフラクション１０について、ＬＣ／ＴＯＦ−ＭＳによって精密質量を測定した。Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２カラムを用いた分離でＥＳＩによる検出では３つのピークが得られた（図７（ａ））。それぞれのピークの精密質量と推定分子式はピーク１：１８１．０７０９ｍ／ｚ，Ｃ_６Ｈ_１４Ｏ_６（図７（ｂ））、ピーク２：２５３．０９２９ｍ／ｚ，Ｃ_９Ｈ_１８Ｏ_８（図７（ｃ））、ピーク３：１７９．０５６１ｍ／ｚ，Ｃ_６Ｈ_１２Ｏ_６（図７（ｄ））であった。それぞれのピークについて化合物データベースによる検索と、日本酒に含まれるＡＬＤＨ阻害物質の紫外吸収が弱いといった情報から、ピーク１がマンニトール又はソルビトールであり、ピーク２がα−グルコシルグリセロール（α−ＧＧ）であり、ピーク３がグルコース又はガラクトースであると推察された。これらの化合物のうち、標品が市販されているグルコース及びガラクトース（ピーク３）、並びにマンニトール及びソルビトール（ピーク１）については１０ｍｇ／ｍｌの濃度でもＡＬＤＨ活性の阻害は認められなかった。α−グルコシルグリセロール（ピーク２）については標品が市販されていないため、酵素を用いて合成することにした。

α−グルコシダーゼによるα−グルコシルグリセロールの合成
α−グルコシルグリセロールは、マルトースとグリセロールとからα−グルコシダーゼによる糖転移反応によって合成できることが知られている。そこで、同様の方法でα−グルコシルグリセロールを合成した後、分離及び精製することによってα−グルコシルグリセロールの標品を調製した。非特許文献２に記載の方法によりマルトースとグリセロールからα−グルコシダーゼの反応により、α−グルコシルグリセロールを合成した。酵素による合成後の反応液には目的産物であるα−グルコシルグリセロール以外に基質であるマルトース、グリセロール及び糖転移反応によって生成するグルコースが含まれている。配位子カラムＳｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＰＯ８１０（昭和電工社製、商品名Ｓｈｏｄｅｘ）により分離し、α−グルコシルグリセロールを精製した（移動相：Ｈ_２Ｏ、カラム温度：８０℃、流量：０．８ｍｌ／分）。フラクションコレクターを用いて酵素反応液からα−グルコシルグリセロールのみを分取した。分取によって得られた画分はほぼα−グルコシルグリセロールであり（図８（ａ））、１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＡＬＤＨ阻害活性が認められた（図８（ｂ））。これら一連の分離及び同定の作業によって日本酒に含まれるα−グルコシルグリセロールがＡＬＤＨを阻害する物質であることが明らかとなった。

Claims (3)

1. グルコシルグリセロールを有効成分として含有するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤。
2. グルコシルグリセロールを有効成分として含有する抗酒薬。
3. グルコシルグリセロールを有効成分として含有するアルコール依存症の治療薬。