ES2332616T3

ES2332616T3 - Peptidos de quimiocinas, variantes, derivados y analogos, su utilizacion en metodos para inhibir o aumentar una respuesta inflamatoria.

Info

Publication number: ES2332616T3
Application number: ES98946057T
Authority: ES
Inventors: David J. Grainger; Lauren Marie Tatalick; Suzanne T. Kanaly
Original assignee: Cambridge Enterprise Ltd
Current assignee: Cambridge Enterprise Ltd
Priority date: 1997-09-11
Filing date: 1998-09-11
Publication date: 2010-02-09
Anticipated expiration: 2018-09-11
Also published as: EP1012187B1; US6989435B2; CA2303422A1; AU9315398A; US20060073114A1; WO1999012968A3; EP1012187A2; WO1999012968A2; JP4523151B2; JP2001515918A; US7700087B2; DE69841105D1; ATE440863T1; US20010006640A1

Abstract

Un péptido aislado y purificado que comprende no más de 30 residuos de aminoácidos y que comprende una variante peptídica del péptido de quimiocina MCP-1, donde la variante peptídica comprende cualquiera de las SEQ ID Nos. 1, 7 a 11, 13 y 14, o una versión de secuencia D inversa cíclica (CRD) de dicha variante peptídica, o donde dicha variante peptídica es Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Ile-Gln, y donde el péptido inhibe la actividad de al menos una quimiocina nativa.

Description

Péptidos de quimiocinas, variantes, derivados y análogos, su utilización en métodos para inhibir o aumentar una repuesta inflamatoria.

El reclutamiento de macrófagos/monocitos cumple un papel en la morbilidad y mortalidad de un amplio espectro de enfermedades, que incluyen enfermedades autoinmunes, enfermedades granulomatosas, enfermedades alérgicas, enfermedades infecciosas, osteoporosis y enfermedad arterial coronaria. Por ejemplo, en la aterosclerosis durante la formación temprana de la lesión lipídica, los monocitos circulantes se adhieren al endotelio activado que recubre la placa incipiente. En condiciones apropiadas, los monocitos migran posteriormente a la íntima en desarrollo. En la íntima, los macrófagos acumulan lipoproteínas y excretan un exceso de proteasas respecto de los inhibidores de proteasas. Si las lipoproteínas se oxidan, estas son tóxicas para los macrófagos, lo que produce la muerte de macrófagos y un incremento de la reserva de lípidos extracelulares, necróticos e inestables. Un exceso de proteasas produce pérdida de matriz extracelular y desestabilización de la placa fibrosa. La inestabilidad de la placa es la causa aguda del infarto de miocardio.

Se han identificado muchas moléculas que son necesarias para el reclutamiento de monocitos y otros tipos de células inflamatorias. Estas moléculas representan blancos para la inhibición del reclutamiento de monocitos. Una clase de tales moléculas es la de las moléculas de adhesión, por ejemplo receptores para monocitos. Otra clase de moléculas incluyen mediadores inflamatorios, tales como TNF-\alpha y moléculas relacionadas, las interleuquinas, por ejemplo IL-1\beta y las quimiocinas, por ejemplo la proteína de quimioatracción de monocitos-1 (MCP-1).

Como resultado, los agentes que modulan la actividad de las quimiocinas probablemente son útiles para prevenir y tratar una amplia gama de enfermedades. Por ejemplo, Rollins et al. (Patente Estadounidense No. 5.459.128) describen en general análogos de MCP-1 que inhiben la actividad quimioatrayente de monocitos de la MCP-1 endógena. Se describen análogos que son efectivos para inhibir la MCP-1 endógena como análogos que están modificados en la tirosina 28, arginina 24, aspartato 3 y/o en aminoácidos entre los residuos 2-8 de MCP-1. En particular, Rollins et al. afirman que la "inhibición exitosa de la actividad se encuentra donde MCP-1 está modificada en una o más de las siguientes maneras: a) la tirosina 28 está sustituida por aspartato, b) la arginina 24 está sustituida por fenilalanina, c) el aspartato 3 está sustituido por alanina y/o d) la secuencia de aminoácidos 2-8 está suprimida" (col. 1, líneas 49-54). La supresión de los aminoácidos 2-8 de MCP-1 ("MCP-1(\Delta2-8)") produce un polipéptido que es inactivo, es decir MCP-1(\Delta2-8) no es quimioatrayente (col. 5, líneas 22-23). El único inhibidor efectivo de MCP-1 descrito en Rollins et al. es MCP-1(\Delta2-8).

Estudios recientes sugieren que MCP-1(\Delta2-8) exhibe un efecto negativo dominante, es decir, forma heterodímeros con MCP-1 de tipo salvaje que no pueden producir un efecto biológico (Zhang et al., J. Biol. Chem., 269 15918 (1994); Zhang et al., Mat. Cell. Biol., 15, 4851 (1995)). En consecuencia, MCP-1(\Delta2-8) no exhibe propiedades de un antagonista de receptor clásico. Más aún, es poco probable que MCP-1(\Delta2-8) sea muy útil para la inhibición de la actividad de MCP-1 in vivo, ya que MCP-1(\Delta2-8) es un polipéptido grande con propiedades farmacodinámicas no deseables. Además, no se sabe si MCP-1(\Delta2-8) es activa como inhibidor negativo dominante de otras quimiocinas asociadas con la inflamación.

En consecuencia, es necesario identificar agentes que inhiban o aumenten el reclutamiento de macrófagos y/o monocitos inducidos por quimiocina y que tengan propiedades farmacodinámicas deseables. Más aún, es necesario identificar agentes que inhiban o aumenten las actividades inducidas por quimiocinas de otros tipos celulares, tales como linfocitos. Además, se necesita identificar agentes que sean inhibidores pan-selectivos de quimiocinas.

La Patente Estadounidense 5.079.228 describe péptidos cuya secuencia de aminoácidos deriva de la parte N-terminal y C-terminal del factor activador de neutrófilos nativo (NAF o IL-8). Estos péptidos son antagonistas de la NAF nativa. Uno de tales fragmentos es NAF (44-72). Otros de tales fragmentos es el tripéptido WVQ.

Síntesis de la invención

La invención proporciona una variante peptídica de quimiocina aislada y purificada. Un agente terapéutico de la invención inhibe la actividad de al menos una quimiocina.

El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.

Una realización preferida de la invención es un péptido 3 de quimiocina CC purificado, por ejemplo un péptido derivado de MCP-1 que corresponda a aproximadamente el tramo que va desde el resto 46 a aproximadamente el resto 67 de MCP-1 madura ("péptido 3[MCP-1]"), una variante, un análogo o uno de sus derivados. Se contempla que el péptido 3 de quimiocina, una variante, un análogo o uno de sus derivados es un antagonista de receptores de quimiocinas, si bien estos agente terapéuticos pueden ejercer su efecto por un mecanismo diferente, por ejemplo por inhibición de la vía de ácido araquidónico (por ejemplo, inhibición de síntesis o estabilidad de leucotrienos, tromboxanos o prostaglandinas) o por elevación de los niveles de TGF-beta o por más de un mecanismo.

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Un péptido 3 preferido de la invención es un compuesto de fórmula (I):

[[(X^{2})(X^{3})-C-(X)-(X^{7})-P]_{a}-[(X^{4})-(Z-)-(X^{5})-W-(X^{1})-(X^{6})_{b}]_{c}

donde X^{2} es E, Q, D, N, L, P, I o M, donde X^{3} es I, V, M, A, P, norleucina o L, donde X es A, L, V, M, P, norleucina o I, donde X^{4} es K, S, R, R, Q, N o T, donde Z es Q, K, E, N, R, I, V, M, A, P, norleucina o L, donde X^{7} es D o P, donde X^{5} es K, E, R, S, Q, D, T, H o N, donde X^{1} es V, L, M, P, A, norleucina o I, donde X^{6} es Q, N, K o R, donde a es 0-6, donde b es 0-6, y donde c es 1-6, con la salvedad de que a y b no pueden ser O. Las letras de las fórmulas (I)-(II) que no son X, Y o Z representan residuos peptidilo como se muestra en la Figura 13. Un péptido 3 más preferido de la invención es un compuesto de fórmula (I):

[[(X^{2})-(X^{3})-C-(X)-D-P]_{a}[(X^{4})-(Z)-(X^{5})-W-(X^{7})-(X^{6})_{b}]_{c}

donde X^{2} es E, Q o M, donde X^{3} es I, V o L, donde X es A, L o I, donde X^{4} es K, S o T, donde Z es Q, K, E o L, donde X^{5} es K, E, R, S o T, donde X^{1} es V o I, donde X^{6} es Q o R, donde a es 0-6, donde b es 0-6, y donde c es 1-6, con la salvedad de que a y b no pueden ser ambos 0.

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Inclusive otro péptido 3 preferido de la invención es un compuesto de fórmula (II):

[[(X^{4})-(Z)-(X^{5})]_{a}-[W-(X^{1})-(X^{6})_{b}]_{c}

donde X^{4} es K, S o T, donde Z es Q, K, E o L, donde X^{5} es K, E, R, S o T, donde X^{1} es V o I, donde X^{6} es Q o R, donde a es 0-6, donde b es 0-6, y donde c es 1-6, con la salvedad de que a y b no pueden ser ambos 0.

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Otro péptido 3 preferido de la invención es un compuesto de fórmula (II);

[[(X^{4})-(Z)-(X^{5})]_{a}-[W-(X^{1})-(X^{6})_{b}]_{c}

donde X^{4} es K, S, R, R, Q, N o T, donde Z es Q, K, E, N, R, I, V, M, A, P, norleucina o L, donde X^{5} es K, E, R, S, Q, D, T, H o N, donde X^{1} es V, L, M, P, A, norleucina o I, donde X^{6} es Q, N, K o R, donde a es 0-6, donde b es 0-6, y donde c es 1-6, con la salvedad de que a y b no pueden ser ambos 0.

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Un péptido 3 más preferido de la invención es un compuesto de fórmula (X):

(X^{8})-(X)-D-(X^{2})-(X^{4})-(Z)-(X^{5})-W-(X^{1})-Q-(X^{7})

donde X es A, L, V o I, donde X^{2} es P, G o L, donde X^{4} es K, T, R o N,

donde Z es Q, K, A o L, donde X^{5} es K, E, R, Q o P, donde X^{1} es V, L, A, M, F o 1, y donde X^{8} y X^{7} son independientemente C o están ausentes.

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Una realización preferida de la invención es un péptido 3 de quimiocina CC aislado y purificado, por ejemplo un péptido derivado de MCP-1 que corresponde a la SEQ ID NO:1 ("péptido 3(1-12)[MCP-1]") o SEQ ID NO:7 ("péptido 3(3-12) [MCP-1]"), un fragmento, una variante, un análogo, o uno de sus derivados. Como se describe en la presente a continuación, el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) y el péptido 3(3-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:7) son inhibidores de pan-quimiocinas, biodisponible y tienen una farmacocinética ventajosa. Otro péptido 3 de quimiocina CC preferido de la invención es el péptido 3[MIP1\alpha], y con más preferencia el péptido 3(1-12)[MIP1\alpha], que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la SEQ ID NO:42, una variante, un análogo, un fragmento o uno de sus derivados.

Otras realizaciones preferidas de la invención son un péptido 3 de quimiocina CC tal como el péptido 3(1-12)[MCP-4] (por ejemplo, SEQ ID NO:65), el péptido 3(1-12)[MCP-3](por ejemplo, SEQ ID NO;66), el péptido 3(1-12)[MCP-2] (por ejemplo, SEQ ID NO:67), el péptido 3(1-12)[eotaxina] (por ejemplo, SEQ ID NO:68), el péptido 3(1-12)[MIP1\alpha] (por ejemplo, SEQ ID NO:42), el péptido 3(1-12)[MIP1\beta] (por ejemplo, SEQ ID NO;43), el péptido 3(1-12)[RANTES] (por ejemplo, SEQ ID NO:44), o uno de sus fragmentos.

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Otra realización preferida de la invención incluye un péptido 3 de quimiocina CXC, una variante, un análogo o uno de sus derivados. Un péptido 3 de CXC preferido de la invención es un compuesto de fórmula (III):

[[(X^{2})-(X^{3})-C-L-(X)-(X^{7})]_{a}-[(X^{4})-(Z)-(X^{5})-(X^{8})-(X^{1})-(X^{6})_{b}]_{c}

donde X^{2} es E o K, donde X^{3} es I, A, R o L, donde X es D o N, donde X^{7} es Q, P o L, donde X^{4} es E, K, D, A o Q, donde Z es A, R, S o E, donde X^{5} es P, N o K, donde X^{8} es F, W, R, I, M, L o A, donde X^{1} es L, V, Y o I, donde X^{6} es K o Q, donde a es 0-6, donde b es 0-6, y donde c es 1-6, con la salvedad de que a y b no pueden ser ambos 0.

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Otras realizaciones preferidas de la invención son un péptido 3 de quimiocina CXC tal como el péptido 3(1-12)[IL-8) (por ejemplo, SEQ ID NO:40), el péptido 3(1-12)[SDF-1] (por ejemplo, SEQ ID NO:38), el péptido 3(1-12)[ENA-78) (por ejemplo, SEQ ID NO:41), el péptido 3(1-12)[GRO\alpha] (por ejemplo, SEQ ID NO:72), el péptido 3(1-12)[GRO\beta] (por ejemplo, SEQ ID NO:73), el péptido 3(1-12)(GRO\gamma] (por ejemplo, SEQ ID NO:74), o fragmentos de los mismos.

Inclusive otras realizaciones preferidas de la invención son un péptido 3 de quimiocina CX_{2}C, CX_{3}C o C, una variante, un análogo o uno de sus derivados.

Preferiblemente, un péptido 3 de quimiocina, sus variantes, análogos o derivados, inhiben la vía del ácido araquidónico, por ejemplo inhibe la síntesis o estabilidad o unión de tromboxanos, prostaglandinas, leucotrienos o cualquiera de sus combinaciones.

Otros compuestos de la invención incluyen los compuestos de fórmula (VIII):

1

en la que

R es alquilo (C_{1}-C_{6}), alcanoílo (C_{1}-C_{6}), arilo, heteroarilo, alcoxi (C_{1}-C_{6})carbonilo, o benciloxicarbonilo, donde arilo, heteroarilo y el anillo fenilo del benciloxicarbonilo opcionalmente pueden estar sustituidos con uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) halo, hidroxi, ciano, nitro, trifluorometilo, trifiuorometoxi, alquilo (C_{1}-C_{5}), alcoxi (C_{1}-C_{5}), alcanoílo (C_{1}-C_{6}), alcanoiloxi (C_{2}-C_{5}) o alcoxi (C_{1}-C_{6})carbonilo;

R' es alcoxi (C_{1}-C_{6}), ariloxi o NR_{a}R_{b}, donde R_{a} y R_{b} son independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{6}), arilo, bencilo o fenetilo; o R_{a} y R_{b} junto con el nitrógeno al cual están unidos son un anillo heterocíclico de 5-6 miembros (por ejemplo pirrolidino, piperidino o morfolino); y

cada R'' es independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{6}), fenilo, bencilo o fenetilo;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. Preferiblemente, R es benciloxicarbonilo y R' es dimetilamino o dietilamino, o R es benciloxicarbonilo; y R' es benciloxi.

Otros compuestos de la invención incluyen los compuestos de fórmula (IX):

2

en la que

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R es alquilo (C_{1}-C_{6}), alcanoílo (C_{1}-C_{5}), arilo, heteroarilo, alcoxi (C_{1}-C_{6})carbonilo, o benciloxicarbonilo, donde arilo, heteroarilo y el anillo fenilo del benciloxicarbonil opcionalmente puede estar sustituidos con uno o más (por ejemplo 1, 2, 3, o 4) halo, hidroxi, ciano, nitro, trifluorometilo, trifluorometoxi, alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{6}), alcanoílo (C_{1}-C_{6}), alcanoiloxi (C_{2}-C_{6}) o alcoxi (C_{1}-C_{6})carbonilo;

cada R'' es independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{5}), fenilo, bencilo o fenetilo;

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Otra realización preferida de la invención incluye un péptido 3 de quimiocina que es al menos un tripéptido, una de sus variantes o uno de sus derivados. Una realización preferida de la invención es el tripéptido de MCP-1 KOK (es decir, el péptido 3(9-12) [MCP-1], que inhibe específicamente la actividad inducida por la quimiocina MCP-1, pero no MIP1\alpha, IL8 ni SDF1\alpha. Otras realizaciones preferidas de la invención incluyen tripéptidos de quimiocina aislados y purificados que inhibe específicamente a IL8, MIP1\alpha, SDF1, MCP-1 murina, MCP-2, MCP-3 y MIP1\beta3, por ejemplo, KEN, SEE, KLK, KKE, KER, TQK y SES, respectivamente. Otra realización preferida de la invención es un tripéptido del péptido 3 de quimiocina que inhibe la actividad de más de una quimiocina, por ejemplo WVQ o WIQ. Preferiblemente, un tripéptido de la invención no es RFK.

Inclusive otra realización de la invención es un péptido que incluye la secuencia de aminoácidos KXK, donde X es un aminoácido, preferiblemente uno de los veinte aminoácidos naturales, péptido que es un antagonista de quimiocinas, activa TGF-beta (TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3 o una de sus combinaciones), o una de sus combinaciones. Preferiblemente, el péptido aumenta la activación de TGF-beta 1. Se prefiere que un péptido que incluye la secuencia de aminoácidos KXK tenga menos de aproximadamente 15, preferiblemente aproximadamente 10, y con más preferencia aproximadamente 8 residuos de aminoácidos de longitud. Preferiblemente, el péptido no es KKFK o RKPK. Otra realización de la invención es un péptido que incluye un resto de aminoácido básico seguido por fenilalanina seguido por otro resto básico, donde el péptido no es RFK, no es KRFK o no contiene RFK ni KRFK.

Otro péptido preferido de la invención es un compuesto de fórmula (VII):

(X^{1})-(Y)-(K)-(X^{2})-K-(X^{3})

donde X^{2} es V, A, D, E, P, R, C, H, M, F, K, L, N, Q, Y o I; donde Y está ausente o es un aminoácido que no es R o K; y donde X^{1} y X^{3} son independientemente 0-20 residuos de aminoácidos o están ausentes. Preferiblemente, X^{2} es F, K, L, N, Q, Y o I. Más preferiblemente, X^{2} es F, K, L, N, Q, Y o I, e Y, X^{1} y X^{3} están ausentes.

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Para identificar un péptido de la invención útil en los métodos de la invención, se realiza una comparación de secuencias de quimiocinas de diferentes especies. Luego se evalúa la reactividad cruzada de una quimiocina no humana para el receptor humano.

Una quimiocina preferida es una proveniente de una especie que tiene la menor homología de secuencia con la quimiocina humana correspondiente, pero que no obstante reacciona en forma cruzada uniéndose al receptor humano. Las regiones que tienen un alto grado de semejanza o identidad de secuencias se emplean para preparar un péptido de la invención. Por ejemplo, para identificar péptidos de TGF-beta que tienen propiedades antagonistas, agonistas o neutras, la secuencia de aminoácidos de la TGF-beta humana se comparó con la de Xenopus. Los péptidos identificado por este método incluyen LYIDFRQDLGWKW ("T1"; SEQ ID NO: 111); HEPKGYHANFC ("T2"; SEQ ID NO:112); VYYVGRK ("T3", SEQ ID NO:113) y KVEQLSNMWKSC ("T4"; SEQ ID NO:114). T1 biotinilado se unió al receptor de TGF-beta de células THP-1 con una DE_{50} de 18 \muM y es un agente neutro para el receptor (es decir, ni agonista ni antagonista). T2 biotinilado se unió al receptor de TGF-beta de células THP-1 con una DE_{50} de 30 \muM y es un antagonista del receptor débil.

Otra realización preferida de la invención es un péptido 2 de quimiocina CC aislado y purificado, tal como un péptido correspondiente a la SEQ ID NO:3 ("péptido 2(1-15)[MCP-1)"), SEQ ID NO:5 ("péptido 2(1-14)[MIP1\alpha]"), un fragmento, una variante, un análogo, o uno de sus derivados. Se contempla que el péptido 2 de quimiocina, una variante, un análogo o uno de sus derivados es un agonista del receptor de quimiocina, aunque estos agentes terapéuticos pueden ejercer su efecto por un mecanismo diferente, o por más de un mecanismo. También se prevé que el péptido 2 de quimiocina, una variante, un análogo o uno de sus derivados es un antagonista de receptores de quimiocinas. Preferiblemente, una variante, un análogo o a derivado del péptido 2 ha reducido la unión al antígeno de Duffy, y también preferiblemente, mejoró las propiedades de unión al receptor, con respecto al correspondiente péptido 2 que tiene una secuencia de aminoácidos nativa o de tipo salvaje.

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Otros péptidos 2 de quimiocinas CC preferidos incluyen el péptido 2(1-14)[MIP1\beta] (por ejemplo, SEQ ID NO:60), el péptido 2 (1-15)[RANTES] (por ejemplo, SEQ ID NO:61), el péptido 2(1-15)[MCP-2) (por ejemplo, SEQ ID NO:62), el péptido 2(1-15)[MCP-3) (por ejemplo, SEQ ID NO:63), el péptido 2(1-15)[MCP-4] (por ejemplo, SEQ ID NO:64), el péptido 2(1-15)[eotaxina] (por ejemplo, SEQ ID NO: 75), o un fragmento de los mismos.

Otra realización preferida de la invención incluye un péptido 2 de quimiocina CXC, una variante, un análogo o uno de sus derivados. El péptido 2 de quimiocina CC preferido incluye el péptido 2(1-15)[IL8] (por ejemplo, SEQ ID NO:6), el péptido 2 (1-15)[SDF1 (por ejemplo, SEQ ID NO:4), el péptido 2(1-15)[ENA78] (por ejemplo, SEQ ID NO:59), el péptido 2(1-15)[GRO\alpha] (por ejemplo, SEQ ID NO:69), el péptido 2(1-15)[GRO\beta] (por ejemplo, SEQ ID NO:70), el péptido 2(1-15)(GRO\gamma] (por ejemplo, SEQ ID NO:71), o un fragmento de los mismos.

Inclusive otra realización preferida de la invención es un péptido 2 de quimiocina CX_{2}C, CX_{3}C o C, una variante, un análogo o uno de sus derivados.

Otros péptidos 2 preferidos incluyen TSSKC (péptido 2(1-5)[M1P-1); SEQ ID NO:102); DYFETSSQC (péptido 2 (1-9)[ MIP1\alpha]; SEQ ID NO:103); CSKPGV (péptido 2(9-14)[MIP1\alpha]; SEQ ID NO:104); HLKILNTPNCALQIV (péptido 2 (1-5)[MIP1\alpha]; SEQ ID NO:105); SYRRITSSK (péptido 2(1-5)[MCP-1); SEQ ID NO:106); CPKEAV (péptido 2(10-15) [MCP-1]; SEQ ID NO:107); SYRR! (péptido 2(1-5)[MCP-1]; SEQ ID NO:108); y CSYRRITSSKSPKEAVC (SEQ ID NO:110); así como un péptido que tiene los isómeros D de la secuencia VGPKSCOSSTEFYD (correspondiente a los restos 1-14 del péptido 2(1-14)[MIP1\alpha], las letras minúsculas se usan en la presente para indicar los isómeros D así como la letra "D" en CRD y LRD); un péptido que corresponde a vaekpcksstirry; y una variante del péptido 2 de vgpkscqsstefyd (péptido LRD 2(1-14)[MIP1\alpha] que incluye el isómero D de la serina en la posición 10, y el isómero D de la cisteína en los extremos amino y carboxilo terminales del péptido (denominado péptido LRD-Cys_{0}Ser_{10}Cys_{16} 2(1-15)[MCP-1], donde L = lineal, F = delantero, D= isómero D).

Un péptido 2 más preferido de la invención es un compuesto de fórmula (XII):

C-(X)-Y-(X^{2})-(X^{4})-(Z)-T-(X^{5})-(X^{6})-(X^{1})-C-(X^{8})-(X^{7})-(X^{9})-(X^{10})-V-C

en la que X es S o D, donde X^{2} es R, K, F o Y, donde X^{4} es R, E o F, donde Z es T o un enlace peptídico, donde X^{5} es S o N, donde X^{6} es S o I, donde X^{1} es K, R, Q o L, donde X^{8} es P o S, donde X^{7} es K, R o Q, donde X^{9} es E o P, y donde X^{10} es A o G.

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También se proporciona una variante de péptido de quimiocina aislada y purificada, o uno de sus derivados. Una variante de péptido de quimiocina tiene al menos aproximadamente 50%, preferiblemente al menos aproximadamente 80%, y con más preferencia al menos aproximadamente 90% pero menos de 100%, de homología o identidad de secuencia de aminoácidos contigua a la secuencia de aminoácidos de la correspondiente quimiocina nativa, por ejemplo, péptido Ser_{7} 3(1-12) [MCP1] (SEQ ID NO:11) tiene menos de 100% de homología contigua con la correspondiente secuencia de aminoácidos de MCP-1, es decir, un péptido que tiene la SEQ ID NO:1. Una variante preferida de péptido 3 es péptido Leu_{4}Ile11 3(3-12)[MCP-1].

La invención también proporciona derivados de péptidos de quimiocina y variantes de péptidos. Un derivado preferido es un derivado cíclico con isómeros D (CRD) de la secuencia reversa de un péptido de quimiocina, una variante o uno de sus análogos de la invención.

Por ejemplo, los derivados LRD del péptido 2, CRD-Cys_{0}Ser_{10}Cys_{16} péptido 2[MCP-1] y CRD-Cys_{l3}Leu_{4}Ile11 péptido 3(3-12)[MCP-1] son compuestos de la invención que son particularmente útiles en la práctica de los métodos de la invención, como se describe a continuación en la presente.

También se proporcionan ciertos análogos de quimiocinas. En particular, se contemplan los análogos del péptido 2 de quimiocina, péptido 3 de quimiocina, o sus variantes. Un análogo preferido del péptido 3 de quimiocina es un análogo de WIQ. En consecuencia, un análogo preferido de quimiocina de la invención incluye un compuesto de fórmula (IV):

3

donde R^{1} es arilo, heteroarilo, arilalquilo (C_{1}-C_{3}), heteroarilalquilo (C_{1}-C_{3}), cumarilo, cumarilalquilo (C_{1}-C_{3}), cromanilo o cromanilalquilo (C_{1}-C_{3}); donde cualquier grupo arilo o heteroarilo, o el anillo benzo de cualquier grupo cumarilo o cromanilo opcionalmente puede estar sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo, nitro, ciano, hidroxi, alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{6}), alcanoílo (C_{1}-C_{6}), alcanoiloxi (C_{2}-C_{6}), -C(=O)alcoxi (C_{1}-C_{6}), C(=O)NR^{g}R^{h}, NR^{i}R^{j}; donde R^{2} es alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{10}), cicloalquil (C_{3}-C_{6}) alcoxi (C_{1}-C_{6}) o N(R^{a})(R^{b});

donde R^{3} es alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{10}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alcoxi (C_{1}-C_{6}) o N(R^{c})(R^{d});

donde Y es oxo o tioxo;

donde Z es alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{10}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alcoxi (C_{1}-C_{6}) o N(R^{e})(R^{f}); y

donde R^{a}-R^{j} son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), alcanoílo (C_{1}-C_{10}), fenilo, bencilo o fenetilo; o R^{a} y R^{b}, R^{c} y R^{d}, R^{e} y R^{f}, R^{g} y R^{h}, o R^{i} y R^{j} junto con el nitrógeno al cual están unidos forman un anillo seleccionado de pirrolidino, piperidino o morfolino; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

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Una realización preferida de un compuesto de fórmula (IV) incluye un compuesto de fórmula (IV) donde R^{1} es arilo, heteroarilo, cumarilo o cromanilo. Preferiblemente arilo es fenilo; y heteroarilo es indolilo o piridinilo. Otra realización preferida de un compuesto de fórmula (IV) incluye un compuesto de fórmula (IV)

donde R^{2} es N(R^{a})(R^{b}); y R^{3} es R^{c})(R^{d}). Inclusive otra realización preferida de un compuesto de fórmula (IV) incluye un compuesto de fórmula (IV) donde Z es alquilo (C_{1}-C_{10}).

Otro compuesto preferido es un compuesto de fórmula (IV) donde R^{1} es indolilo; R^{2} es N(R^{a})(R^{b}); R^{3} es N(R^{c}) (R^{d}); Y es S; Z es hidrógeno; y R^{a}, R^{b}, R^{d}, y R^{d} son metilo.

Otro análogo preferido del péptido 3 de quimiocina es un análogo de KXK.

En consecuencia, la invención incluye un compuesto de fórmula (V):

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4

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en la que

R^{4} es NR_{k}R_{l};

R^{5} es NR_{m}R_{n};

R^{6} es NR_{o}R_{p}.

R^{7} es la cadena lateral de un aminoácido natural o no natural o es -(CH_{2})_{2}C(=O)NR_{q}R_{r};

R^{8} es hidrógeno, hidroxi, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{10}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alcoxi (C_{1}-C_{6}), NR_{s}R_{t}, el extremo amino terminal de un aminoácido o el residuo N-terminal de un péptido de 2 a aproximadamente 25 residuos de aminoácidos;

R_{k}, R_{l}, R_{o} y R_{p} son independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), alcanoílo (C_{1}-C_{10}), fenilo, bencilo o fenetilo;

R_{m} y R_{n} son independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{10}), alcanoílo (C_{1}-C_{10}), alcoxi (C_{1}-C_{10})carbonilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo, fenilo, bencilo, fenetilo, el resto C-terminal de un aminoácido o un péptido de 2 a aproximadamente 25 residuos de aminoácidos;

R_{q} y R_{r} son independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), fenilo, bencilo o fenetilo;

donde R_{s} y R_{t} son independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), fenilo, bencilo o fenetilo; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

\newpage

Preferiblemente R_{k}, R_{l}, R_{o} y R_{p} son hidrógeno; R_{m} y R_{n} son independientemente hidrógeno, acetilo, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), propoxi, butoxi, terc-butoxicarbonilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo o el residuo C-terminal de un aminoácido o un péptido de 2 a aproximadamente 25 residuos de aminoácidos; y R_{q} y R_{r} son independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}) o cicloalquilo (C_{3}-C_{6}).

Preferiblemente, R^{7} es -(CH_{2})_{2}C(=O)NR_{q}R_{r}.

Preferiblemente, R^{7} es metilo, 3-guanidinopropilo, aminocarbonilmetilo, carboximetilo, mercaptometilo, (2-carboxi-2-aminoetil)ditiometilo, 2-carboxietilo, 2-(aminocarbonil)etilo, hidrógeno, 5-imadazoilmetilo, 4-amino-3-hidroxipropilo, 2-butilo, 2-metilprop-1-ilo, 4-aminobutilo, 2-(metiltio)etilo, bencilo, hidroximetilo, 1-hidroxietilo, 3-indolilmetilo, 4-hidroxibencilo o isopropilo.

Con más preferencia, R^{7} es hidrógeno, bencilo, 4-hidroxibencilo, metilo, 2-hidroximetilo, o mercaptometilo.

Un compuesto de fórmula (V) preferido incluye un análogo de KGK, KFK, KYK, KAK, KSK, KCK o KOK. Por ejemplo, un análogo de KQK incluye un compuesto de fórmula (V):

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5

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donde R^{4} es NR_{k}R_{l};

donde R^{5} es NR_{m}R_{n};

donde R^{6} es NR_{o}R_{p};

donde R^{7} es NR_{q}R_{r};

donde R^{8} es hidrógeno, hidroxi, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{10}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alcoxi (C_{1}-C_{6}), NR_{s}R_{t}, el extremo amino terminal de un aminoácido o el residuo N-terminal de un péptido de aproximadamente 2 a 25 residuos de aminoácidos;

donde R_{k}, R_{l}, R_{o} y R_{p}, son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), alcanoílo (C_{1}-C_{10}), fenilo, bencilo o fenetilo;

donde R_{m} y R_{n} son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{10}), alcanoílo (C_{1}-C_{10}), alcoxi (C_{1}-C_{10})-carbonilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo, fenilo, bencilo, fenetilo, el residuo C-terminal de un aminoácido o un péptido de 2 a aproximadamente 25 residuos de aminoácidos;

donde R_{q} y R_{r} son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), fenilo, bencilo o fenetilo;

donde R_{s} y R_{t} son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), fenilo, bencilo o fenetilo; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

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Preferiblemente R_{k}, R_{l}, R_{o}, y R_{p} son cada uno hidrógeno; R_{m} y R_{n} son independientemente hidrógeno, acetilo, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), propoxi, butoxi, terc-butoxicarbonilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo o el residuo C-terminal de un aminoácido o un péptido de 2 a aproximadamente 25 residuos de aminoácidos; y R_{q} y R_{r} son independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}) o cicloalquilo (C_{3}-C_{6}).

\newpage

Otro análogo preferido del péptido 3 de quimiocina es un análogo de WVQ (véase la Figura 8). En consecuencia, la invención proporciona un compuesto de fórmula (VI):

6

donde

R^{10} es NR^{i}R^{j};

R^{11} es arilo, heteroarilo, arilalquilo (C_{1}-C_{3}), heteroarilalquilo (C_{1}-C_{3}), cumarilo, cumarilalquilo (C_{1}-C_{3}), cromanilo o cromanilalquilo (C_{1}-C_{3}); donde cualquier grupo arilo o heteroarilo, o el anillo benzo de cualquier grupo cumarilo o cromanilo, opcionalmente puede estar sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo, nitro, ciano, hidroxi, alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{6}), alcanoílo (C_{1}-C_{6}), alcanoiloxi (C_{2}-C_{6}), -C(=O)alcoxi (C_{1}-C_{6}), C(=O)NR^{g}R^{h}, NR^{e}R^{f};

R^{12} es alquilo (C_{1}-C_{6});

R^{13} es alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{10}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alcoxi (C_{1}-C_{6}), hidroxi o N(R^{a})(R^{b});

R^{14} es (alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{10}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alcoxi (C_{1}-C_{6}) o N(R^{c})(R^{d});

Y es oxo o tioxo;

donde R^{a}-R^{j} son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), alcanoílo (C_{1}-C_{10}), fenilo, bencilo o fenetilo; o R^{a} y R^{b}, R^{c} y R^{d}, R^{e} y R^{f}, R^{g} y R^{h} o R^{i} y R^{j} junto con el nitrógeno al cual están unidos forman un anillo seleccionado de pirrolidino, piperidino, o morfolino; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

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Preferiblemente, R^{10} es amino; R^{11} es 2-benzimidazolilo; R^{12} es alquilo (C_{1}-C_{6}); R^{13} es hidroxi; y R^{14} es amino.

Se prevé que los agente terapéuticos de la invención incluyen compuestos que tienen un centro quiral que se puede aislar en formas ópticamente activas y formas racémicas.

También se proporcionan moléculas de ácido nucleico aislado y purificado, por ejemplo moléculas de ADN, que comprenden un segmento de ácido nucleico preseleccionado que codifica una porción de una quimiocina, es decir, ellos codifican un péptido de quimiocina o una de sus variantes como se describe en la presente, por ejemplo, un péptido 3 de quimiocina, una de sus variantes o derivados o un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes o derivados. Por ejemplo, la invención proporciona un casete de expresión que comprende un segmento de ADN preseleccionado que codifica para una molécula de ARN que es sustancialmente idéntica (homosentido) al total o una porción de un ARN mensajero (ARNm "blanco"), es decir, un ARNm de quimiocina endógena o "nativa". El segmento de ADN preseleccionado del casete de expresión está unido operativamente a un promotor. Como se usa en la presente, "sustancialmente idéntico" de secuencia significa que dos secuencias de ácidos nucleicos tienen al menos aproximadamente 65%, preferiblemente aproximadamente 70%, con más preferencia aproximadamente 90%, y aún con más preferencia aproximadamente 98%, de identidad de secuencias de nucleótidos contiguos entre sí. Preferiblemente, el segmento de ADN preseleccionado se hibridiza en condiciones de hibridación, preferiblemente en condiciones de hibridación rigurosas, a una molécula de ácido nucleico que codifica la correspondiente quimiocina nativa.

La presente invención también proporciona moléculas de ADN aislado y purificado que proporciona transcriptos de ARN "antisentido" de los segmentos de ADN que codifican una quimiocina que, cuando se expresan a partir de un casete de expresión en una célula huésped, pueden alterar la expresión de la quimiocina. Como se usa en la presente, el término "antisentido" significa una secuencia de ácidos nucleicos que es el complemento inverso de al menos una porción de una molécula de ARN que codifica una quimiocina. Preferiblemente, las secuencias antisentido de la invención son sustancialmente complementarias con un segmento de ADN que codifica un péptido o variante de péptido de la invención. Como se usa en la presente, "sustancialmente complementario" significa que dos secuencias de ácidos nucleicos tienen al menos aproximadamente 65%, preferiblemente aproximadamente 70%, con más preferencia aproximadamente 90%, y aún con más preferencia aproximadamente 98%, de complementariedad de secuencia de nucleótidos contiguos entre sí. Una molécula de ARN sustancialmente complementaria es una que tiene suficiente complementariedad de secuencia con el ARNm que codifica una quimiocina de modo que produce una reducción o inhibición de la traducción del ARNm. Se prevé que la doble hebra formada por la secuencia antisentido y el ARNm inhibe la traducción del ARNm, así como promueve la degradación del ARNm, si bien las secuencias antisentido pueden ejercer su efecto por otros mecanismos, o por combinación de mecanismos. Preferiblemente, el segmento de ADN antisentido preseleccionado se hibridiza en condiciones de hibridación, preferiblemente en condiciones de hibridación rigurosas, a una molécula de ácido nucleico que comprende el correspondiente gen de quimiocina.

La introducción del ácido nucleico homosentido o antisentido de la quimiocina en una célula ex vivo o in vivo puede originar una terapia basada en genética molecular dirigida a controlar la expresión de la quimiocina. En consecuencia, el ácido nucleico introducido puede ser útil para corregir o suplementar la expresión del gen en pacientes con una indicación asociada a quimiocinas. Por ejemplo, la administración de un vector de expresión que codifica un péptido de la invención que es un agonista del receptor de una quimiocina puede aumentar la señalización de la quimiocina y en consecuencia es eficaz para las enfermedades que se caracterizan por niveles disminuidos de la quimiocina. Asimismo, la administración de un vector de expresión que comprende secuencias de quimiocina antisentido puede ser útil para prevenir o tratar un trastorno asociado con el aumento de expresión de una quimiocina. Por ejemplo, un vector de expresión que contiene un péptido 3(1-12)[MCP-1] antisentido que se introduce a los pulmones puede ser eficaz para prevenir o tratar el asma.

También se proporcionan composiciones farmacéuticas, sistemas de administración y kits que comprenden los agentes terapéuticos de la invención.

La invención además proporciona métodos para tratar indicaciones asociadas con quimiocinas. Por ejemplo, la invención proporciona un método para prevenir o inhibir una indicación asociada con la actividad inducida por quimiocinas. El método comprende administrar a un mamífero afectado con o en riesgo de la indicación, una cantidad de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, uno de sus fragmentos, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones, efectiva para prevenir o inhibir dicha actividad. Preferiblemente, el péptido no es un péptido de IL-8, un péptido de NAP-2 ni un péptido de PF4. Preferiblemente, la administración es efectiva para inhibir la actividad de más de una quimiocina (es decir, el péptido es un inhibidor pan-selectivo). Los inhibidores pan-quimiocina son WVQ, WIQ, Leu_{4}Ile_{11} péptido 3(3-12)[MCP-1], Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(1-12)[MCP-1] y CRD-Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(3-12). Estos agentes con útiles para tratar indicaciones tales como esclerosis múltiple, asma, psoriasis, alergia, artritis reumatoide, rechazo al trasplante de órganos y trastornos autoinmunes. Los péptidos de quimiocina preferidos útiles para tratar o inhibir estas indicaciones incluyen péptido 2 y/o péptido 3 de MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, RANTES, MIP1\alpha, ENA78, MIG, GRO\beta, eotaxina, IP10, MIP\beta y SDF-1

La invención también proporciona un método para tratar a un mamífero afectado con, o en riesgo de, una indicación asociada con la actividad inducida por quimiocinas, que comprende:

administrar al mamífero una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula (IV):

7

donde R^{1} es arilo, heteroarilo, cumarilo o cromanilo; donde R^{2} es N(R^{a})(R^{b});

donde R^{3} es N(R^{c})(R^{d}); donde Y es oxo o tioxo; donde Z es alquilo (C_{1}-C_{10});

donde R^{a}-R^{d} son independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), alcanoílo (C_{1}-C_{10}), fenilo, bencilo o fenetilo; o donde R^{a} y R^{b}, o R^{c} y R^{d}, junto con el nitrógeno al cual están unidos forman un anillo pirrolidino, piperidino o morfolino; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

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Además se proporciona un método de tratar a un mamífero afectado con, o en riesgo de, una indicación asociada con la actividad inducida por quimiocinas, que comprende:

administrar al mamífero una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula (V):

8

donde R^{4} es N R^{k}R^{l}; R^{5} es NR^{m}R^{n}; R^{6} es NR^{o}R^{p}; R^{7} es la cadena lateral de un aminoácido natural o no natural o es -(CH_{2})_{2}C(=O)NR^{q}R^{r}; R^{8} es hidrógeno, hidroxi, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{10}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alcoxi (C_{1}-C_{6}), NR^{s}R^{t}, el extremo amino terminal de un aminoácido o el residuo N-terminal de un péptido de 2 a aproximadamente 25 residuos de aminoácidos; R^{k}, R^{l}, R^{o} y R^{p} son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}- C_{6}), cicloalquil (C_{3}- C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), alcanoílo (C_{1}-C_{10}), fenilo, bencilo o fenetilo; R^{m} y R^{n} son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}- C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{10}), alcanoílo (C_{1}-C_{10}), alcoxi (C_{1}-C_{10})carbonilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo, fenilo, bencilo, fenetilo, el residuo C-terminal de un aminoácido o un péptido de 2 a aproximadamente 25 residuos de aminoácidos; R^{q} y R^{r} son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), fenilo, bencilo o fenetilo; donde R^{s} y R^{t} son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{10}), fenilo, bencilo o fenetilo; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

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También se proporciona un método para tratar a un mamífero afectado con, o en riesgo de, una indicación asociada con la actividad inducida por quimiocinas, que comprende:

administrar al mamífero una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula (VI):

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9

en la que

R^{10} es NR^{i}R^{j};

R^{11} es arilo, heteroarilo, arilalquilo (C_{1}-C_{3}), heteroarilalquilo (C_{1}-C_{3}), cumarilo, cumarilalquilo (C_{1}-C_{3}), cromanilo o cromanilalquilo (C_{1}-C_{3}); donde cualquier grupo arilo o heteroarilo, o el anillo benzo de cualquier grupo cumarilo o cromanilo, opcionalmente puede estar sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo, nitro, ciano, hidroxi, alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{6}), alcanoílo (C_{1}-C_{6}), alcanoiloxi (C_{2}-C_{6}), -C(=(O)alcoxi (C_{1}-C_{6}), C(=O)NR^{g}R^{h}, NR^{e}R^{f};

R^{12} es alquilo (C_{1}-C_{6});

R^{14} es alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{10}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alcoxi (C_{1}-C_{6}) o N(R^{c})(R^{d});

Y es oxo o tioxo;

donde R^{a}-R^{i} son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), alcanoílo (C_{1}-C_{10}), fenilo, bencilo o fenetilo; o R^{a} y R^{b}, R^{c} y R^{d}, R^{e} y R^{f}, R^{g} y R^{h}, o R^{i} y R^{j} junto con el nitrógeno al cual están unidos forman un anillo seleccionado de pirrolidino, piperidino o morfolino; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

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La invención también proporciona un método para incrementar, aumentar o mejorar una respuesta inflamatoria asociada a quimiocinas en un mamífero, que comprende:

administrar al mamífero una cantidad de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones, efectivo para incrementar, aumentar o mejorar dicha respuesta. Más aún, como el péptido 3, sus variantes y derivados pueden reducir las respuestas de Th2 y aumentan las respuestas de Th1, estos compuestos pueden ser particularmente útiles para tratar o prevenir enfermedades específicas en las que se indica una reducción de la respuesta de Th2 y un aumento de la respuesta de Th1. Se prefiere que el agente empleado para incrementar, aumentar o mejorar la respuesta inflamatoria asociada a quimiocinas no sea YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK. Estos agentes terapéuticos son útiles para aumentar una respuesta inflamatoria a, por ejemplo, agentes patógenos o parásitos intracelulares, que frecuentemente están asociados con una mala respuesta inmune. En consecuencia, estos agentes pueden ser útiles para tratar o prevenir tuberculosis y malaria. Por lo tanto, la invención también proporciona un método terapéutico para prevenir o tratar una infección parasitaria.

La invención también proporciona un método para prevenir o inhibir una indicación asociada con la liberación de histamina de los basófilos o mastocitos. El método comprende administrar a un mamífero en riesgo de, o afectado con, la indicación, una cantidad efectiva de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones.

También se proporciona un método para prevenir o inhibir una indicación asociada con el reclutamiento de monocitos, macrófagos, neutrófilos, células B, células T o eosinófilos, o la activación o proliferación de células B o T. El método comprende administrar una cantidad efectiva de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones. Por ejemplo, un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, o uno de sus derivados puede ser útil para prevenir o tratar indicaciones autoinmunes o granulomatosas.

También se proporciona un método terapéutico para prevenir o tratar indicaciones vasculares, que comprende: administrar a un mamífero que necesita dicha terapia una cantidad efectiva de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones, donde la indicación es enfermedad arterial coronaria, infarto de miocardio, angina de pecho inestable, aterosclerosis o vasculitis. Los péptidos de quimiocina preferidos para esta realización de la invención incluyen péptidos de quimiocina de MCP-1, RANTES, GRO\alpha, MIP1\alpha, IP10, MCP-4 y MIP1\beta.

La invención también proporciona un método para prevenir o tratar un trastorno autoinmune. El método comprende administrar a un mamífero que necesita dicha terapia, una cantidad efectiva de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones. Una variante preferida del péptido 3 útil para prevenir o tratar trastornos autoinmunes es Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:14) o péptido 3 que tiene WVQ. Un péptido 3 de quimiocina preferido para usar en la prevención o el tratamiento de la esclerosis múltiple incluye SEE y el péptido 3(1-14)[MIP1\alpha] (SEQ ID NO:42). Otros péptidos preferidos son péptidos de quimiocina de RANTES.

También se proporciona un método para modular la actividad inducida por quimiocinas de macrófagos, células B, células T u otras células hematopoyéticas, por ejemplo neutrófilos, eosinófilos o mastocitos, en un sitio fisiológico preseleccionado. El método comprende administrar una forma de dosificación que comprende una cantidad efectiva de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones, donde la forma de dosificación se une, tanto en forma covalente como no covalente, a un resto localizador. El resto localizador se une a un componente celular en el sitio fisiológico preseleccionado.

Más aún, también se prevé que un agente de la invención puede ser un resto localizador, ya que algunos de los agentes son inhibidores selectivos de quimiocinas, más que inhibidores pan-quimiocina. Por ejemplo, un agente de la invención, por ejemplo el péptido 2, puede ser útil en la administración dirigida de un isótopo u otra molécula citotóxica a los eritrocitos para el tratamiento de trastornos tales como la leucemia eritroide, mielosis eritroide, policitemia vera u otras displasias eritroides. De modo similar, un agente de la invención que se dirige específicamente a un tipo celular particular puede ser útil para el diagnóstico. En consecuencia, estos agentes se pueden marcar radiactivamente (Chianelli et al. Nucl. Med. Comm., 18, 437 (1997)), o marcar con cualquier otra señal detectable, tales como las que resultan útiles en la obtención de imágenes para diagnóstico (por ejemplo, MRI y CAT) para visualizar sitios de inflamación en trastornos tales como artritis reumatoide y diabetes mellitus (tipo I).

También se proporciona un método terapéutico para aumentar una respuesta inmune. El método comprende administrar a un mamífero un resto inmunogénico y una cantidad de un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones, donde la cantidad es efectiva para aumentar la respuesta inmune del mamífero al resto inmunogénico. En consecuencia, la invención también proporciona una vacuna que comprende un resto inmunogénico y una cantidad de un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes o uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII) o una de sus combinaciones. Como se usa en la presente, un "resto inmunogénico" significa una composición o compuesto aislado o purificado (por ejemplo, una preparación de virus purificado o un antígeno viral o bacteriano nativo o recombinante) que, cuando se introduce en un animal, preferiblemente un mamífero, origina una respuesta inmune humoral y/o celular del animal a la composición o compuesto. También se proporcionan vacunas modificadas, donde el resto inmunogénico se acopla al péptido 2, una de sus variantes o derivados. El péptido 2 incrementa la unión de la vacuna modificada al conjunto de eritrocitos y bloquea la unión de Duffy de quimiocinas y de este modo prolonga el tiempo de permanencia en circulación y disminuye la actividad inducida por quimiocinas, cualquiera de las cuales produce una respuesta de anticuerpos aumentada. Se prevé que la vacuna modificada se administre por las mismas vías usadas para el inmunógeno no modificado (por ejemplo, vía intravenosa, intramuscular u oral).

La invención también proporciona un método terapéutico para prevenir o inhibir el asma. El método comprende administrar a un mamífero que necesita dicha terapia una cantidad efectiva de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones. Como se describe a continuación en la presente en el Ejemplo 12, un péptido de la invención inhibió la inflamación celular y las respuestas de IgE en pulmón de ratón expuesto a ovoalbúmina. Preferiblemente, en esta realización de la invención, un agente terapéutico se administra en el tracto respiratorio superior y/o inferior. Los péptidos
preferidos útiles en esta realización de la invención son los péptidos de quimiocina de RANTES, MCP-1 y MIP1\alpha.

También se proporciona un método terapéutico para prevenir o inhibir la infección o replicación viral, por ejemplo de poxvirus, herpesvirus (por ejemplo, Herpesvirus samiri), citomegalovirus (CMV) o lentivirus. El método comprende administrar a un mamífero que necesita dicha terapia una cantidad efectiva de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), o un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VITI), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones. Preferiblemente, los agentes terapéuticos se emplean para prevenir o tratar el VIH. Con más preferencia, el agente se administra antes, durante o después de la administración del agente antiviral, por ejemplo, para VIH, AZT, un inhibidor no nucleosídico de transcriptasa inversa, un inhibidor de proteasas o una de sus combinaciones. También se prevé que una combinación de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), o un compuesto de fórmula (XI I) puede ser útil en los métodos y composiciones antivirales de la invención. Los péptidos de quimiocina preferidos útiles para prevenir o inhibir la infección viral son los de IP10, MIP1\alpha, MIP1\beta, SDF-1, IL-8, GRO\alpha, RANTES y MCP-1.

También se proporciona un método terapéutico para prevenir o tratar la densidad mineral ósea baja. El método comprende administrar a un mamífero que necesita dicha terapia una cantidad efectiva de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones. Un derivado preferido de una variante del péptido 3 para prevenir o tratar la densidad mineral ósea baja es CRD-Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(3-12)[MCP-1]. Un fragmento preferido de la SEQ ID NO:1 útil para la prevención o el tratamiento de la densidad mineral ósea baja es KQK.

También se proporciona un método para suprimir el crecimiento tumoral en un animal vertebrado que comprende administrar a dicho vertebrado una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones. Preferiblemente, el método aumenta o refuerza la actividad de los macrófagos, de las células B, las células T u otras células inmunes asociadas en un sitio tumoral. Un péptido preferido para usar en esta realización de la invención es un péptido de MCP-1.

También se proporciona un método para la prevención o el tratamiento de la artritis reumatoide en un mamífero, que comprende: administrar al mamífero una cantidad efectiva de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones. Para esta realización de la invención, un péptido preferido es un péptido de MCP-1, MIP1\alpha, M1P1\beta, GROG\alpha y ENA78.

También se proporciona un método para prevenir o tratar el rechazo al trasplante de órganos. El método comprende administrar una cantidad efectiva de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones.

También se proporciona un método para la prevención o el tratamiento de la psoriasis en un mamífero, que comprende: administrar al mamífero una cantidad efectiva de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones. Los péptidos preferidos para prevenir o tratar la psoriasis son los péptidos de MCP-1, RANTES, MIP1\alpha, MIG, IP10, GRO\beta, GRO\alpha o MCP-3. Un derivado preferido para prevenir o tratar la psoriasis es un derivado CRD del péptido 3.

También se proporciona un método para mejorar la curación de heridas. El método comprende administrar una cantidad efectiva de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), a compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones.

También se proporciona un método para la prevención o el tratamiento de una alergia en un mamífero, que comprende: administrar al mamífero una cantidad efectiva de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones. Los péptidos preferidos para prevenir o tratar alergias incluyen los péptidos de RANTES, MIP1\alpha, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, eotaxina o MIP1\beta.

Inclusive otra realización de la invención es un método para prevenir o inhibir una indicación asociada con el TNF-\alpha elevado. El método comprende administrar una cantidad efectiva de un péptido 3 de quimiocina, un péptido 2 de quimiocina, una de sus variantes, uno de sus derivados, un compuesto de fórmula (IV), un compuesto de fórmula (V), un compuesto de fórmula (VI), un compuesto de fórmula (VII), un compuesto de fórmula (VIII), un compuesto de fórmula (IX), un compuesto de fórmula (X), un compuesto de fórmula (XI), un compuesto de fórmula (XII), o una de sus combinaciones.

La invención también proporciona métodos en los que se administran moléculas de ácido nucleico de la invención a un mamífero afectado con, o en riesgo de, una indicación asociada con la actividad inducida por quimiocinas.

La invención también proporciona métodos con los cuales se puede modular la farmacocinética de agentes farmacéuticos ventajosos. En particular, los agentes que normalmente se eliminan rápidamente de la circulación se pueden retener más tiempo por adición de un péptido de la invención que tiene afinidad por el antígeno Duffy de los eritrocitos. Esta metodología se puede adecuar particularmente para modificar la farmacocinética de otros péptidos biológicamente activos, farmacéuticamente útiles, así como polipéptidos o proteínas más grandes. Por ejemplo, un péptido de unión a Duffy (tal como el péptido 2[MCP-1] se puede acoplar o unir, en forma covalente o no covalente, a una molécula tal como la hormona de crecimiento humana (HGH) recombinante o insulina, y administrarse por medio de una inyección en depósito. Al repartirse la HGH modificada en los eritrocitos, la HGH puede tener una farmacocinética más adecuada, con semividas más largas y cambios menos rápidos de las concentraciones plasmáticas. En otro ejemplo, la insulina acoplada a un péptido de la invención puede ser particularmente útil como tratamiento para diabéticos tipo II altamente resistentes a insulina, cuya enfermedad ha avanzado en forma significativa. También se prevé que otras moléculas pequeñas se pueden acoplar a moléculas de unión a Duffy de una manera que conserve la función deseada de la molécula activa y de la molécula de unión a Duffy. Para acoplarse a las proteínas y péptidos recombinantes, se prefieren los péptidos de unión a Duffy. Para acoplarse a fármacos de molécula pequeña, se prefieren análogos (por ejemplo, isósteros) de los péptidos de unión a Duffy.

Breve descripción de las Figuras

La Figura 1 es un esquema del ensayo de migración trans-pocillo. En la mayoría de los experimentos, el péptido (línea ondulada) se añade al pocillo superior con aproximadamente 50.000 células (\circ). Los pocillos superior e inferior están separados por una membrana libre de PVP de un tamaño de poro de 5 \mum u 8 \mum (- - - -). La quimiocina (\bullet) se añade al pocillo inferior. Después de 4 horas, se mide la cantidad de células que han migrado a través de la membrana (\circ en el pocillo inferior).

La Figura 2 muestra una curva de dosis-respuesta para la inhibición por el péptido 3 (SEQ ID NO: 1) de la migración de células THP-1 inducida por MCP-1.

La Figura 3 muestra la actividad de transcriptasa inversa presente en el medio de cultivo en el día 21 después de la infección de células Jurkat con un VIH T-trófico. Los péptidos se añadieron el día 0, una hora antes de la infección de las células con aislado de VIH. Se usó quimiocina de SDF-1 de longitud completa como control positivo.

La Figura 4 muestra al estructura del CRD-Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11} péptido 3[MCP-1](3-12)[MCP-1], que se cicla por medio de enlaces disulfuro. Los carbonos \alpha de la cadena principal se representan mediante C_{D}, lo que indica que está presente la forma D del aminoácido.

La Figura 5 representa un esquema de la inhibición de la migración celular por medio de la unión de un agente terapéutico de la invención a un receptor de quimiocinas. C^{R}C= un agente terapéutico de la invención. Los receptores de quimiocinas se muestran como rectángulos negros.

La Figura 6 representa un esquema de la inhibición de la entrada del VIH mediante un agente de la invención.

La Figura 7 muestra la inhibición dependiente de la dosis de la inflamación (A) y la endotoxemia (B) en modelos animales por el péptido 3 (CRD-Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11} péptido 3(3-12) [MCP-1] = NRS8-3.14.3).

La Figura 8 muestra un análogo preferido del péptido WVQ.

La Figura 9 muestra un gráfico del número de macrófagos en el sitio de administración de LPS en una rata en presencia o ausencia de un péptido de la invención.

La Figura 10 muestra un gráfico del número de células B en el sitio de administración de LPS en una rata en presencia o ausencia de un péptido de la invención.

La Figura 11 muestra un gráfico de la fracción de células THP-1 infectadas con VIH en presencia del péptido 2 o péptido 3 usando un ensayo cuantitativo de inmunofluorescencia (QIF).

La Figura 12 representa codones para varios aminoácidos.

La Figura 13 representa ejemplos de sustituciones de aminoácidos.

La Figura 14 muestra ejemplos de agentes terapéuticos de la invención.

La Figura 15 muestra la afinidad de unión a Duffy y la inhibición de la migración de THP-1 para compuestos seleccionados del péptido 2. LFL = isómero L delantero lineal; LRD = isómero D inverso lineal; CRD = isómero D inverso cíclico; CFL = isómero L delantero cíclico.

La Figura 16 resume los datos de unión y DE_{50} para los péptidos seleccionados de la invención.

La Figura 17 muestra un ejemplo de protocolo para ensayar agentes en un modelo de inflamación dérmica en rata (CRD-Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11} péptido 3(3-12) [MCP-1] = NR58-3.14.3).

Descripción detallada de la invención Definiciones

"Quimiocinas" se refiere a una familia de moléculas de señalización proinflamatorias que actúan sobre macrófagos, células B, células T, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos, células del músculo liso, por ejemplo células del músculo liso vascular y similares (por ejemplo, afectando su migración, proliferación o desgranulación, o la inmunomodulación del desarrollo de las células T a los subtipos Th1 y Th2). Las quimiocinas preferidas son de origen de primate, por ejemplo humano, si bien la invención incluye otras quimiocinas de mamíferos, tales como las de origen bovino, ovino, equino, canino, felino o de roedor, así como quimiocinas codificadas por virus. Las quimiocinas incluyen, pero sin limitación, MCP-1 (SEQ ID NO:16), MCP-2 (SEQ ID NO:17), MCP-3 (SEQ ID NO:18), MIG (SEQ ID NO:45), MIP1\alpha (SEQ ID NO:19), MP1\beta (SEQ ID NO:20), RANTES (SEQ ID NO:21), PF4 (SEQ ID NO:46), I-309 (SEQ ID NO:47), HCC-1 (SEQ ID NO:48), eotaxina (SEQ ID NO:25), C10 (SEQ ID NO:49), CCR-2 (SEQ ID NO;50), ENA-78 (SEQ ID NO:52), GRO\alpha (SEQ ID NO:24), GRO\beta (SEQ ID NO:53), IL-8 (SEQ ID NO:23), IP-10 (SEQ ID NO:54), SDF1\alpha (SEQ ID NO:22), SDF1\beta (SEQ ID N0:56), GRO\alpha (SEQ ID NO:57), MIP3\alpha, TCA-3, CTAPIII, MARC/FYK, \beta-tromboglobulina, GCP-2, PBP, HC14, MDC, TECK, PARC, 6Ccina, fractalina, DC-CK1, LIX, TARC, LARC, MIG, Ck\beta8, CCF18/MRP-2, CCIII, CK\alpha2, H1305, Dvic-1, MGSA, Ck\beta4, DGWCC, TCA4, dendrocina (véase WO 97/29192), CC2/HCC1, CC3 y MIP1\tau, así como quimiocinas codificadas por virus tales como vMiP-I, vMIP-II y vMIPIII (véase Kledal et al., Science, 277, 1656 (1997)). Las quimiocinas "CXC" o "\alpha" incluyen, pero sin limitación, IL-8, PF4, IP10, NAP-2, GRO\alpha, GRO\beta3, GRO\gamma, SDF1, MIP2, MGSA, \gammaIP, CTAPIII, \beta-tromboglobulina, MIG, PBP, NAP-2 y ENA78. Las quimiocinas "CC" o "\beta" quimiocinas incluyen, pero sin limitación, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, RANTES, eotaxina, LARC, TARC, C10, MIP1\alpha, MIP1\beta, I309, HCC-1, CK\beta8, CCF18/MRP-2, MIP1\tau. Un tercer tipo de quimiocinas son las quimiocinas "C", por ejemplo linfotactina. Un cuarto tipo de quimiocinas son las quimiocinas "CX_{3}C" tales como fractalina o neurotactina (Rollins et al., Blood, 90, 404 (1997)). Un quinto tipo de quimiocinas, las quimiocinas CX_{2}C, incluyen CCIII.

El "péptido 3" se refiere a un péptido derivado de una quimiocina, cuando se localiza generalmente en la mitad carboxilo-terminal de la quimiocina, y que inhibe la actividad de al menos la quimiocina nativa correspondiente, según se determina por métodos bien conocidos en la técnica. El péptido 3 comprende no más de 30, preferiblemente aproximadamente 3 a aproximadamente 25, con más preferencia aproximadamente 3 a aproximadamente 15, y aún con más preferencia aproximadamente 3 a aproximadamente 11, residuos peptidilo que tienen 100% de homología o identidad de secuencia de aminoácidos contiguos a la secuencia de aminoácidos de la quimiocina nativa correspondiente, preferiblemente una quimiocina de mamífero, por ejemplo una quimiocina de primate tal como una quimiocina humana, o una quimiocina codificada por virus. Por ejemplo, un péptido 3 preferido de MCP-1 que inhibe al menos la actividad de MCP-1 es el péptido 3(1-12)[MCP-1], por ejemplo un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la SEQ ID NO:1, o uno de sus fragmentos o derivados. Otra realización preferida de la invención es el péptido 3(3-12)[MCP-1], por ejemplo un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la SEQ ID NO:7, o uno de sus fragmentos o derivados. Preferiblemente, un péptido 3 de quimiocina de la invención no incluye un péptido de IL-8, PF-4 o NAP-2.

Un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de quimiocinas, tal como el alineamiento representado en la Tabla 1, proporciona un método general para identificar la ubicación de las secuencias del péptido 3 en las quimiocinas. Generalmente, el péptido 3 de quimiocinas distintas de MCP-1 corresponde al tramo desde aproximadamente el residuo 46 a aproximadamente el residuo 67 de la MCP-1 humana madura. Más aún, se prevé que el péptido 3 puede comprender restos diferentes de la secuencia de aminoácidos que inhibe la actividad de quimiocinas, por ejemplo residuos de aminoácidos no presentes en la quimiocina nativa (es decir, una proteína de fusión), moléculas de ácido nucleico o restos de localización tales como anticuerpos o sus fragmentos o biotina, siempre que estos restos no reduzcan sustancialmente la actividad biológica del péptido 3. Una reducción sustancial de la actividad significa una reducción de actividad superior a aproximadamente 99%.

"Péptido 2" se refiere a un péptido derivado de una quimiocina, que generalmente se ubica en los dos tercios amino-terminales de la quimiocina, y que no incluye los residuos de aminoácidos amino-terminales aproximadamente 20 a aproximadamente 24 de la quimiocina madura nativa. Generalmente, el péptido 2 es un agonista de quimiocinas, pero el péptido 2 también puede no tener actividades agonistas ni antagonistas (es decir, es "neutro"), o puede ser un antagonista de quimiocinas, siempre que el péptido se una específicamente a al menos un receptor de quimiocinas. El péptido 2 comprende no más de 30, preferiblemente aproximadamente 3 a aproximadamente 25, con más preferencia aproximadamente 10 a aproximadamente 25, y aún con más preferencia aproximadamente 10 a aproximadamente 18, restos peptidilo que tienen 100% de homología o identidad de secuencia de aminoácidos contiguos a la secuencia de aminoácidos de la quimiocina nativa correspondiente. Por ejemplo, un péptido 2 preferido de MCP-1 es el péptido 2(1-15)[MCP-1], por ejemplo un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la SEQ ID NO:3, o uno de sus fragmentos o derivados. Un péptido 2 más preferido es un péptido 2 que comprende al menos un isómero D. Preferiblemente, un péptido 2 de quimiocina de la invención no es el péptido 2[PF4], ni el péptido 2 [IL-8] ni el péptido 2 [NAP-2] ni YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK.

Un alineamiento de secuencias de aminoácidos de quimiocina, tal como el alineamiento representado en la Tabla 1, proporciona un método general para identificar la ubicación de las secuencias del péptido 2 en otras quimiocinas. En general, el péptido 2 en las quimiocinas distintas de MCP-1 corresponde a aproximadamente el residuo 27 a aproximadamente el residuo 45 de la MCP-1 madura humana. También se prevé que el péptido 2 puede comprender restos diferentes de la secuencia de aminoácidos que imita, mejora o no afecta (es decir, neutra) la actividad de quimiocina, por ejemplo los residuos de aminoácidos no presentes en la quimiocina nativa, moléculas de ácido nucleico o restos de localización tales como los descritos anteriormente para el péptido 3, siempre que estos restos no alteren sustancialmente la actividad biológica del péptido 2. Una alteración sustancial de la actividad significa una alteración mayor de aproximadamente 99%.

Asimismo preferiblemente, un péptido, variante, análogo o derivado de la invención, tiene aumento de afinidad por al menos un receptor de quimiocinas, por ejemplo aproximadamente 1 \muM a aproximadamente 1 nM, con más preferencia aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1 pM, y también preferiblemente tiene reducción de unión a Duffy, respecto al péptido correspondiente que tiene la secuencia nativa ("de tipo salvaje") o respecto de la quimiocina nativa correspondiente. Sin embargo, ciertas poblaciones tienen individuos que son Duffy, por ejemplo, un determinado porcentaje de afroamericanos son Duffy. En consecuencia, agentes útiles para tratar estas poblaciones pueden tener afinidad de unión que es igual o mayor a la de la quimiocina nativa correspondiente.

Como se usa en la presente, los términos "aislado y/o purificado" se refieren a la preparación, el aislamiento y/o la purificación in vitro de un agente terapéutico de la invención, de modo que no está asociado con sustancias in vivo. En consecuencia, con respecto a una "molécula de ácido nucleico aislado", que incluye un polinucleótido de origen genómico, ADNc o sintético o alguna de sus combinaciones, la "molécula de ácido nucleico aislada" (1) no está asociada con el total o una porción de un polinucleótido en el que la "molécula de ácido nucleico aislada" se encuentra en la naturaleza, (2) está unido operativamente a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza o (3) no se presenta en la naturaleza como parte de una secuencia mayor. Una molécula de ácido nucleico aislada significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas monocatenarias y bicatenarias de ADN. El término "oligonucleótido" mencionado en la presente incluye nucleótidos naturales y nucleótidos modificados unidos entre sí por enlaces de oligonucleótidos naturales y no naturales. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos con 200 bases o menos de longitud. Preferiblemente, los oligonucleótidos tienen 10 a 60 bases de longitud y con máxima preferencia 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son usualmente monocatenarios, por ejemplo, para sondas; si bien los oligonucleótidos pueden ser bicatenarios, por ejemplo, para utilizar en la construcción de una variante. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos homosentido o antisentido. El término "nucleótidos naturales" mencionado en la presente incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" mencionado en la presente incluye nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces de oligonucleótidos" mencionado en la presente incluye enlaces de oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato y similares. Un oligonucleótido puede incluir un marcador de detección, si se desea.

El término "polipéptido aislado" significa un polipéptido codificado por ADNc o ARN recombinante, o es de origen sintético o alguna de sus combinaciones, polipéptido aislado que (1) no está asociado con proteínas que se hallan en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo libre de las proteínas humanas, (3) es expresado por una célula de especie diferentes o (4) no se presenta en la naturaleza.

El término "homología de secuencias" significa la proporción de coincidencias de bases entre dos secuencias de ácidos nucleicos o la proporción de coincidencias de aminoácidos entre dos secuencias de aminoácidos. Cuando la homología de secuencias se expresa como porcentaje, por ejemplo 50%, el porcentaje indica la proporción de coincidencias respecto de la longitud de secuencia de una quimiocina que se compara con alguna otra secuencia. Las brechas (en cualquiera de las dos secuencias) están permitidas para maximizar las coincidencias; usualmente se usan longitudes de brecha de 15 bases o menos, se prefieren 6 bases o menos, con más preferencia 2 bases o menos. Cuando se usan oligonucleótidos como sondas o tratamientos, la homología de secuencias entre el ácido nucleico blanco y la secuencia de oligonucleótidos generalmente no es menor de 17 coincidencias de bases blanco de los 20 pares posibles de coincidencias de bases de oligonucleótidos (85%); preferiblemente no menor de 9 coincidencias de 10 pares posibles de coincidencias de bases (90%), y con más preferencia no menor de 19 coincidencias de 20 pares posibles de coincidencias de bases (95%).

El término "hibridiza selectivamente" significa unirse en forma detectable y específica. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de la invención hibridizan selectivamente las cadenas de ácido nucleico en condiciones de hibridación y lavado que minimizan cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden usar condiciones de rigurosidad alta para obtener condiciones de hibridación selectivas conocidas en la técnica y descritas en la presente. En general, la homología de secuencias de ácidos nucleicos entre los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de la invención y una secuencia de ácidos nucleicos de interés es de al menos 65%, y más típicamente preferiblemente homologías crecientes de al menos aproximadamente 70%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 98% y 100%.

Dos secuencias de aminoácidos son homólogas si existe una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, 85% de homología significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando se alinean dos secuencias para el máximo apareamiento. Las brechas (en cualquiera de las dos secuencias apareadas) están permitidas para maximizar el apareamiento; se prefieren longitudes de brecha de 5 o menos, con más preferencia 2 o menos. En forma alternativa y preferiblemente, dos secuencias de proteínas (o secuencias de polipéptidos derivadas de ellas de al menos 30 aminoácidos de longitud) son homólogas, tal como se usa este término en la presente, si estas tienen un puntaje de alineamiento de más de 5 (en unidades de desvío estándar) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalización de brecha de 6 o más. Véase Dayhoff, M. O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, 1972, volumen 5, National Biomedical Research Foundation, pp. 101-110, y Suplemento 2 de este volumen, pp. 1-10. Las dos secuencias o partes de ellas con más preferencia son homólogas si sus aminoácidos son más que o igual a 50% idénticos cuando se alinean óptimamente mediante el programa ALIGN.

El término "corresponde a" se usa en la presente para significar que una secuencia de polinucleótidos es homóloga (es decir, es idéntica, no relacionada estrictamente con la evolución) al total o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia, o que una secuencia de polipéptidos es idéntica a una secuencia de polipéptidos de referencia. En cambio, el término "complementaria con" se usa en la presente para significar que la secuencia complementaria es homóloga al total o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a la secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria con una secuencia de referencia "GTATA".

Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencias", "porcentaje de identidad de secuencias", e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como base para comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo como un segmento de ADNc de longitud completa o secuencia génica dada en un listado de secuencias, o puede comprender un ADNc o secuencia génica completa. Generalmente, una secuencia de referencia tiene al menos 20 nucleótidos de longitud, con frecuencia al menos 25 nucleótidos de longitud y a menudo al menos 50 nucleótidos de longitud. Debido a que dos polinucleótidos pueden (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia de polinucleótidos completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) además puede comprender una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan normalmente por comparación de las secuencias de dos polinucleótidos respecto de una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de semejanza de secuencias.

Una "ventana de comparación", como se usa en la presente, se refiere a un segmento conceptual de al menos 20 nucleótidos contiguos y donde la porción de la secuencia de polinucleótidos de la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, brechas) de 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede realizar por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mal. Biol. 48: 443, por la búsqueda del método de semejanza de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444, por implementaciones computadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) o por inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (es decir, el que da como resultado el mayor porcentaje de homología respecto de la ventana de comparación) generado por los diversos métodos.

El término "identidad de secuencias" significa que las dos secuencias de polinucleótidos son idénticas (es decir, comparando nucleótido por nucleótido) respecto de la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencias" significa que dos secuencias de polinucleótidos son idénticas (es decir, comparando nucleótido por nucleótido) respecto de la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencias" se calcula comparando dos secuencias alineadas óptimamente respecto de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que aparecen las bases de ácidos nucleicos idénticas (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) en ambas secuencias para dar el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de ventana) y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencias. Los términos "identidad sustancial" como se usan en la presente indican una característica de una secuencia de polinucleótidos, donde el polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos 85 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, más usualmente al menos 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia re referencia respecto de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótidos, con frecuencia respecto de una ventana de al menos 20-50 nucleótidos, donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia de polinucleótidos que puede incluir supresiones o adiciones con un total de 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia respecto de la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de una MCP-1 humana.

Cuando se aplica a polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias de péptidos, cuando se alinean en forma óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT mediante pesos de brecha predeterminados, comparten al menos aproximadamente 80 por ciento de identidad de secuencias, preferiblemente al menos aproximadamente 90 por ciento de identidad de secuencias, con más preferencia al menos aproximadamente 95 por ciento de identidad de secuencias, y con máxima preferencia al menos aproximadamente 99 por ciento de identidad de secuencias.

Como se usa en la presente, los términos "marcador" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, por incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de restos biotinilo que se pueden detectar con avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que se puede detectar con métodos ópticos o colorimétricos). Se conocen varios métodos de marcación de polipéptidos en la técnica y pueden ser utilizados. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero sin limitación, los siguientes: radioisótopos (por ejemplo, ^{3}H, ^{14}C ^{35}S ^{125}O, ^{131}I), marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, lantánido, fosforados), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano, \beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epitopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias del par de cierre de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión metálica, colas de epitopos). En algunas realizaciones, los marcadores se unen con ramas espaciadoras de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.

Como se usa en la presente, "sustancialmente puro" significa que una especie objeto es la especie presente predominante (es decir, en términos molares es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y preferiblemente una fracción sustancialmente purificada es una composición donde la especie objeto comprende al menos aproximadamente 50 por ciento (en términos molares) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes de la composición, con más preferencia más de aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, y aproximadamente 99%. Con máxima preferencia, la especie objeto está purificada a homogeneidad esencial (no se pueden detectar especies contaminantes en la composición por métodos de detección convencionales) donde la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.

Una "variante de péptido de quimiocina" aislada del péptido 3 o péptido 2 es un péptido que comprende no más de 30, preferiblemente aproximadamente 3 a aproximadamente 25, y con más preferencia aproximadamente 3 a aproximadamente 18, y aún con más preferencia aproximadamente 3 a aproximadamente 11, restos peptidilo que tienen al menos 50%, preferiblemente al menos aproximadamente 80%, y con más preferencia al menos aproximadamente 90% pero menos de 100%, de identidad u homología de secuencia de aminoácidos contiguos con la secuencia de aminoácidos de la quimiocina nativa correspondiente, por ejemplo Ser7 péptido 3(1-12)[MCP1] (SEQ ID No:11) tiene menos de 100% de homología con la correspondiente secuencia de aminoácidos de MCP-1, es decir, el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID No:1). Una variante de la invención puede incluir residuos de aminoácidos no presentes en la quimiocina nativa correspondiente, y supresiones internas respecto de la quimiocina nativa correspondiente. Las variantes del péptido de quimiocina incluyen los péptidos que tienen al menos un D-aminoácido.

Los péptidos de quimiocina o las variantes de péptidos que se someten a modificaciones químicas, tales como esterificación, amidación, reducción, protección y similares, se denominan "derivados" de quimiocina. Por ejemplo, una modificación que se sabe mejora la estabilidad y biodisponibilidad de los péptidos in vivo es la ciclación del péptido, por ejemplo a través de uno o más enlaces disulfuro. Una modificación preferida es la síntesis de un derivado de secuencia inversa cíclica (CRD) de un péptido de la invención. Un péptido lineal se sintetiza con todas las formas D de los aminoácidos usando la secuencia inversa (es decir, de C-terminal a N-terminal) del péptido. Si es necesario, se añaden residuos de cisteína a los extremos N- y C-terminales (si la secuencia de péptidos ya no tiene los residuos N- y C-terminales), de este modo se permite la ciclación oxidativa. Sin embargo, el término "CRD" incluye la ciclación por otros mecanismos, por ejemplo por medio de un enlace peptidilo y similares. Un derivado preferido de la invención es CRD-Cys_{0}Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11}péptido 3[MCP-1] o CRD-Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11} péptido 3(3-12)[MCP-1].

También se incluyen dentro del alcance del término "derivado" los derivados D inverso lineal (LRD) y L delantero ciclado (CFL). Los derivados LRD tienen la secuencia inversa (es decir, C-terminal a N-terminal) del péptido con aminoácidos todos de formas D, pero no ciclados. Los derivados CFL tienen la secuencia delantera (es decir; N-terminal a C-terminal) del péptido con aminoácidos todos de formas L, pero con residuos de cys N- y C-terminales adicionales (si la secuencia peptídica no tiene ya residuos cys en alguna de las posiciones N- o C-terminales), seguido de ciclación oxidativa o ciclación por un método alternativo. Otros "derivados" de la invención incluyen péptidos ramificados, circulares, péptidos ramificados y circulares ramificados.

Un "análogo de quimiocina" significa un resto que simula o inhibe una actividad inducida por quimiocina, o se une en o cerca de un receptor de quimiocina pero no simula o inhibe la actividad de quimiocina (neutro), donde la porción del resto que simula o inhibe la actividad inducida por quimiocina, o se une en o cerca de un receptor pero es neutro, no es un péptido, y donde la porción activa del análogo no es una molécula de ácido nucleico. Como se usa en la presente, el término "simula" significa que el resto induce una actividad que está inducida por una quimiocina nativa, pero que la inducción con el análogo no es necesariamente de la misma magnitud que la inducción de la actividad por la quimiocina nativa.

También se prevé que los péptidos de quimiocina, sus variantes, análogos y derivados, de la invención pueden comprender restos diferentes de la porción que inhibe o simula la actividad de quimiocina, o se une o acerca a un receptor de quimiocina sin estimular o inhibir la señalización, por ejemplo moléculas de péptido o polipéptido, tales como anticuerpos o sus fragmentos o proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, azúcares, lípidos, grasas, una molécula señal detectable tal como un radioisótopo, por ejemplo emisores gamma, moléculas paramagnéticas o emisores de ondas de sonido, agentes químicos pequeños, metales, sales, polímeros sintéticos, por ejemplo polilactida y poliglicolida, tensioactivos y glicosaminoglicanos, que preferiblemente se unen o ligan de modo covalente a la porción del péptido, variante, análogo o derivado que simula o inhibe la actividad inducida por quimiocina, en la medida que los otros restos no alteren la actividad biológica del péptido, variante, análogo o derivado. También se prevé un péptido de quimiocina, variante, análogo o derivado que está asociado en forma no covalente con los restos descriptos anteriormente.

Un análogo preferido de quimiocina de la invención es un compuesto de fórmula (IV):

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donde R^{1} es arilo, heteroarilo, arilalquilo (C_{1}-C_{3}), heteroarilalquilo (C_{1}-C_{3}), cumarilo, cumarilalquilo (C_{1}-C_{3}), cromanilo o cromanilalquilo (C_{1}-C_{3}); donde cualquier grupo arilo o heteroarilo, o el anillo benzo de cualquier grupo cumarilo o cromanilo opcionalmente puede estar sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo, nitro, ciano, hidroxi, alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{6}), alcanoílo (C_{1}-C_{6}), alcanoiloxi (C_{2}-C_{6}), -C(=O)alcoxi (C_{1}-C_{6}), C(O)NR^{g}R^{h}, NR^{i}R^{j};

donde R^{2} es alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{10}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alcoxi (C_{1}-C_{6}) o N(R^{a})(R^{b});

donde R^{3} es alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{10}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alcoxi (C_{1}-C_{6}) o N(R^{c})(R^{d});.

donde Y es oxo o tioxo;

donde R^{a}-R^{j} son independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), alcanoílo (C_{1}-C_{10}), fenilo, bencilo o fenetilo; o R^{a} y R^{b}, R^{c} y R^{d}, R^{e} y R^{f}, R^{g} y R^{h}, o R^{i} y R^{j} junto con el nitrógeno al cual están unidos forman un anillo seleccionado de pirrolidino, piperidino o morfolino; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

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Una realización preferida de un compuesto de fórmula (IV) incluye un compuesto de fórmula (IV) donde R^{1} es arilo, heteroarilo, cumarilo, o cromanilo. Preferiblemente arilo es fenilo; y heteroarilo es indolilo o piridinilo. Otra realización preferida de un compuesto de fórmula (IV) incluye un compuesto de fórmula (IV) donde R^{2} es N(R^{a})(R^{b}); y R^{3} es N(R^{c})(R^{d}). Inclusive otra realización preferida de un compuesto de fórmula (IV) incluye un compuesto de fórmula (IV) donde Z es alquilo (C_{1}-C_{10}).

Otro compuesto preferido es un compuesto de fórmula (IV) donde R^{1} es indolilo; R^{2} es N(R^{a})(R^{b}); R^{3} es N(R^{c}) (R^{d}); Y es S; Z es hidrógeno; y R^{a}, R^{b}, R^{c} y R^{d} son cada uno metilo.

Inclusive otro compuesto preferido de fórmula (IV) incluye un compuesto donde R^{1} es 2-benzimidazolilo; para R^{2} es N(R^{a})(R^{b}); R^{3} es N(R^{c})(R^{d}); Y es oxo; y Z es N(R^{e})(R^{f}) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. Otro compuesto preferido de fórmula (IV) es un compuesto donde R^{1} es 2-benzimidazolilo; R^{2} es N(Me)_{2}; R^{3} es N(Me)_{2}; Y es oxo; y Z es N(Me)_{2}; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Otro análogo preferido de quimiocina de la invención es un compuesto de fórmula (V):

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donde R^{4} es NR_{k}R_{l}; donde R^{5} es NR_{m}R_{n}; donde R^{6} es NR_{o}R_{p}; donde R^{7} es Nr_{g}R_{r}; donde R^{8} es hidrógeno, hidroxi, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{5}), alcoxi (C_{1}-C_{10}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alcoxi (C_{1}-C_{6}), NR_{s}R_{t}, el extremo amino terminal de un aminoácido o el residuo N-terminal de un péptido de 2 a aproximadamente 25 residuos de aminoácidos; donde R_{k}, R_{l}, R_{o} y R_{p} son independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), alcanoílo (C_{1}-C_{10}), fenilo, bencilo o fenetilo; donde R_{m} y R_{n} son independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{10}), alcanoílo (C_{1}-C_{10}), alcoxi (C_{1}-C_{10})carbonilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo, fenilo, bencilo, fenetilo, el resto C-terminal de un aminoácido o un péptido de 2 a aproximadamente 25 residuos de aminoácidos; donde R_{q} y R_{r} son independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), fenilo, bencilo o fenetilo; donde R_{s} y R_{t} son independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), cicloalquil (C_{3}-C_{6})-alquilo (C_{1}-C_{6}), fenilo, bencilo o fenetilo; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

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Preferiblemente R_{k}, R_{l}, R_{o} y R_{p} son cada uno hidrógeno; R_{m} y R_{n} son cada uno independientemente hidrógeno, acetilo, alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), propoxi, butoxi, terc-butoxicarbonilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo, el resto C-terminal de un aminoácido o un péptido de 2 a aproximadamente 25 residuos de aminoácidos; y R_{q} y R_{r} son independientemente hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{10}), o cicloalquilo (C_{3}-C_{6}).

Otro análogo preferido de quimiocina de la invención es un compuesto de fórmula (VI)

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Como se usa en la presente, halo es fluoro, cloro, bromo o yodo. Los términos alquilo y alcoxi indican grupos lineales y ramificados, pero la referencia a un radical individual tal como "propilo" abarca sólo al radical de cadena lineal, denominándose específicamente un isómero de cadena ramificada tal como "isopropilo". El arilo indica un radical fenilo o un radical carbocíclico bicíclico condensado en posición orto que tiene aproximadamente nueve a diez átomos anulares en los que al menos un anillo es aromático. Heteroarilo abarca un radical unido por medio de un carbono del anillo de un anillo aromático monocíclico que contiene cinco o seis átomos anulares que consisten en carbono y uno a cuatro heteroátomos, cada uno seleccionado del grupo que consiste en oxígeno no peróxido, azufre y N(R^{4}), donde R^{4} está ausente o es hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{4}), fenilo o bencilo, así como un radical de un heterociclo bicíclico condensado en posición orto de aproximadamente ocho a diez átomos anulares derivados de los mismos, en particular un derivado benzo o un derivado obtenido por condensación con el mismo de un dirradical propileno, trimetileno o tetrametileno.

Será apreciado por los expertos en la técnica que los compuestos de fórmula (IV), (V) o (VI) que incluyen los compuestos de la invención que son péptidos que tienen centros quirales, pueden existir y ser aislados en formas óptimamente activas y racémicas. Por ejemplo, los compuestos de la invención comprenden residuos de aminoácidos \alpha en forma D o L o sus mezclas. Algunos compuestos pueden exhibir polimorfismo. Se considera que la presente invención abarca cualquiera de las formas racémicas, ópticamente activas, polimórficas o estereoisómeras o sus mezclas, de un compuesto de la invención, que posee las propiedades útiles descritas en la presente. Es bien sabido en la técnica cómo preparar las formas ópticamente activas (por ejemplo, por resolución de la forma racémica mediante técnicas de recristalización, por síntesis partir de materiales de partida ópticamente activos, por síntesis quiral o por separación cromatográfica usando una fase estacionaria quiral). También es bien conocido en la técnica cómo determinar la capacidad de los compuestos para inhibir o mejorar la actividad inducida por quimiocinas usando las pruebas estándares descritas en la presente, o usando otras pruebas bien conocidas en la técnica.

Los valores específicos y preferidos enumerados en la presente para radicales, sustituyentes e intervalos son sólo a modo de ilustración y no excluyen otros valores definidos u otros valores dentro de rangos definidos para los radicales y sustituyentes. Específicamente, alquilo (C_{1}-C_{10}) puede ser metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, pentilo, 3-pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo o decilo; alquilo (C_{1}-C_{6}) puede ser metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, pentilo, 3-pentilo o hexilo; alquilo (C_{1}-C_{3}) puede ser metilo, etilo o propilo; cicloalquilo (C_{3}-C_{6}) puede ser ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo; alcoxi (C_{1}-C_{10}) puede ser metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, iso-butoxi, sec-butoxi, pentoxi, 3-pentoxi, hexiloxi, heptiloxi, octiloxi, noniloxi, o deciloxi; alcoxi (C_{1}-C_{6}) puede ser metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, iso-butoxi, sec-butoxi, pentoxi, 3-pentoxi o hexoxi; alcanoílo (C_{1}-C_{10}) puede ser formilo, acetilo, propanoílo, butanoílo, pentanoílo, hexanoílo, heptanoílo, octanoílo, nonanoílo o decanoílo; alcanoílo (C_{1}-C_{6}) puede ser formilo, acetilo, propanoílo, butanoílo, pentanoílo o hexanoílo; alcanoiloxi (C_{2}-C_{6}) puede ser acetoxi, propanoiloxi, butanoiloxi, pentanoiloxi o hexanoiloxi; arilo puede ser fenilo, indenilo o naftilo; y heteroarilo puede ser furilo, imidazolilo, tetrazolilo, piridilo, (o su N-óxido), tienilo, bencimidazolilo (o su N-óxido), pirimidinilo (o su N-óxido), indolilo o quinolilo (o su N-óxido).

Preferiblemente, los agentes terapéuticos de la invención son biológicamente activos. La actividad biológica de un péptido de quimiocina, sus variantes, análogos o derivados de péptidos, se puede medir por métodos conocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen a continuación en la presente. Por ejemplo, las variantes del péptido 3[MCP-1] biológicamente activas que se incluyen dentro del alcance de la invención tienen al menos aproximadamente 1%, preferiblemente al menos aproximadamente 10%, con más preferencia al menos aproximadamente 50%, y aún con más preferencia al menos aproximadamente 90%, de la actividad de la correspondiente secuencia peptídica nativa, por ejemplo el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) o la quimiocina nativa, por ejemplo MCP-1 (SEQ ID NO:16). En consecuencia, una variante del péptido 3, por ejemplo, Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(1-1 2)[MCP-1], que se incluye dentro del alcance de la invención, tiene una DE_{50} para la inhibición que es al menos aproximadamente 1%, preferiblemente al menos aproximadamente 10%, con más preferencia al menos aproximadamente 50%, y aún con más preferencia al menos aproximadamente 90%, la actividad máxima del péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO;1) a 100 \muM.

De modo similar, por ejemplo, el péptido 2[MCP-1], variantes, análogos o derivados que se incluyen dentro del alcance de la invención, tienen una DE_{50} para una actividad tipo quimiocina que es al menos aproximadamente 1%, preferiblemente al menos aproximadamente 10%, con más preferencia al menos aproximadamente 50%, y aún con más preferencia al menos aproximadamente 90%, de la máxima actividad de la SEQ ID NO:3 a 100 \muM. En forma alternativa, el péptido 2, variantes, análogos o derivados que se incluyen dentro del alcance de la invención, se unen a células que tienen al menos un receptor de quimiocina con una constante de asociación que es al menos aproximadamente 1%, preferiblemente al menos aproximadamente 10%, con más preferencia al menos aproximadamente 50%, y aún con más preferencia al menos aproximadamente 90%, de la afinidad del péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO:3) por el mismo receptor.

Como se usa en la presente, "una actividad inducida por quimiocina" incluye, pero sin limitación, una actividad que se estimula mediante la unión de una quimiocina, un agente terapéutico de la invención u otro resto, por ejemplo una proteína viral, a un receptor de quimiocina, o la unión de un agente terapéutico u otro resto en proximidad física cercana al receptor de modo que se altere la actividad. Los receptores de quimiocinas incluyen, pero sin limitación, CCR1, CCR2a, CCR2b, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, IL8R1, IL8R2, CC-CKR1, CC-CKR2, CC-CKR3, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CX3CR1 y CXCR4. Los receptores de quimiocinas cumplen un papel en la migración celular, activación celular, entrada del virus o parásitos, liberación de compuestos proinflamatorios y similares.

Como se usa en la presente, las "indicaciones asociadas con la actividad inducida por quimiocinas" incluyen, pero sin limitación, aterosclerosis y otras formas de vasculitis local o sistémica, enfermedades tales como infarto de miocardio, accidente cerebrovascular e isquemia aguda que son secundarias a la aterosclerosis; hipertensión; lesión por reperfusión (Kumar et al., Circulation, 95, 693 (1997)); aneurismas aórticos; hiperplasia de injerto venoso; angiogénesis; hipercolesterolemia; insuficiencia cardíaca congestiva; enfermedad en pacientes sometidos a angioplastía; densidad mineral ósea patológicamente baja, tal como osteoporosis (Posner et al., Bone, 21, 321 (1997)); colitis ulcerosa; enfermedad pulmonar obstructiva crónica; infección por virus de inmunodeficiencia humana (VIH), otros lentivirus o retrovirus con mecanismos similares de entrada a la célula por medio de un receptor(es) de quimiocinas, o infección con otros virus, por ejemplo citomegalovirus (Sozzani et al., J. Leukoc. Biol., 62, 30 (1997)), o infección viral que produce meningitis viral; trasplante de órganos, tal como rechazo agudo al trasplante, rechazo alogénico y enfermedad injerto versus huésped; vasculopatía por trasplante, malaria y otras consecuencias de la infección por parásitos relacionados con el plasmodio; asma; enfermedades alérgicas, tales como atopía (componentes mediados por IgE), rinitis alérgica, dermatitis atópica, anafilaxis, aspergilosis bronquiopulomar alérgica (mediada por IgE), y neumonitis hipersensible (alta IgG y células T reactivas) (enfermedad del criador de palomas, enfermedad pulmonar del granjero, enfermedad pulmonar del humidificador, enfermedad pulmonar de los trabajadores de la malta); alergias, que incluyen dermatitis por alergia a las pulgas en mamíferos tales como animales domésticos, por ejemplo perros y gatos, alergenos por contacto que incluyen mordeduras de mosquito u otras alergias por picaduras de insectos, hiedra venenosa, roble venenoso, zumaque venenoso u otros alergenos cutáneos; urticaria; eczema; fibrosis pulmonar tal como fibrosis pulmonar idiopática; fibrosis quística; síndrome urémico hemolítico (Van Settee et al., Pediatr. Res., 43, 759 (1998)); trastornos autoinmunes, que incluyen, pero sin limitación, diabetes tipo I, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, artritis, artritis reumatoide (Ogata et al., J. Pathol., 182, 106 (1997); Gong et al., J. Exp. Med., 186, 131 (1997)), lupus eritematoso sistémico, tiroiditis autoinmune (de Hasimoto), enfermedades hepáticas autoinmunes tales como hepatitis y cirrosis biliar primaria, hipertiroidismo (enfermedad de Graves; tirotoxicosis), diabetes insulinorresistente, insuficiencia adrenal autoinmune (enfermedad de Addison), ooforitis autoinmune, orquitis autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, hemoglobinuria paroxística al frío, enfermedad de Behcet, trombocitopenia autoinmune, neutropenia autoinmune, anemia perniciosa, anemia eritrocitaria pura, coagulopatías autoinmunes, miastenia gravis, polineuritis autoinmune, encefalomielitis alérgica experimental, pénfigo y otras enfermedades ampollares, carditis reumática, síndrome de Goodpasture, síndrome pos-cardiotomía, síndrome de Sjogren, polimiositis, dermatomiositis y escleroderma; enfermedades oculares tales como uveítis o queratitis de estroma con ceguera por Herpes; enfermedad hepática; ehrliquiosis o enfermedad de Lyme que incluye artritis de Lyme; hematopoyesis aberrante; nefritis debida a, por ejemplo, enfermedad renal poliquística dominante autosómica, neuropatía diabética, neuropatía por IgA, fibrosis intersticial o lupus; así como otros estados de enfermedad provenientes de inflamación inapropiada, tanto local como sistémica, por ejemplo síndrome de colon irritable o inflamatorio (Mazzuchelli et al, J. Pathol., 178, 201 (1996)), psoriasis (Gillitzer et al., Arch. Dermatol. Res., 284, 26 (1992); Yu et al., Lab Investig., 71, 226 (1994)), hipersensibilidad de tipo retardada, enfermedad de Alzheimer, inflamación crónica pulmonar, por ejemplo alveolitis pulmonar y granuloma pulmonar, inflamación gingival u otra enfermedad periodontal e inflamación ósea asociada con lesiones de origen endodóntico (Volejnikova et al., Am. J. Pathol., 150, 1711 (1997)), enfermedades pulmonares por hipersensibilidad tales como neumonitis por hipersensibilidad (Sugiyama et al., Eur. Respir. J., 8, 1084 (1995)) e inflamación relacionada con la liberación de histamina de los basófilos (Dvorak et al., J. Allergy Clin, Immunol, 98, 355 (1996)), tales como fiebre de heno, liberación de histamina de los mastocitos (Gatti et al., Ciba Foundation Symposium, 147, 53(1989)), o tumores de mastocitos, tipos de reacciones de hipersensibilidad de tipo 1 (anafilaxis, alergia cutánea, urticaria, rinitis alérgica y gastroenteritis alérgica); glomerulonefritis (Gesualdo et al., Kidney International, 51, 155 (1997)); inflamación asociada con diálisis peritoneal (Sach et al., Nephrol, Dial. Transplant, 12, 315 (1997)) y pancreatitis.

Otras indicaciones que se incluyen dentro del alcance de la invención incluyen, pero sin limitación, neoplasia, por ejemplo histiocitoma, glioma, sarcoma, osteosarcoma, osteoma (Zheng et al., J. Cell Biochem., 70, 121 (1998)), melanoma, sarcoma de Kaposi, cáncer pulmonar de células pequeñas y carcinoma ovárico así como mielosupresión y mucositis asociada con quimioterapia; trauma cerebral o de la médula espinal, tal como después de la cirugía de disco (Ghimikar et al., J. Neurosci. Res., 46, 727 (1996); Berman et al., J. Immunol., 156, 3017 (1996)); gota; enfermedad pulmonar, por ejemplo, debido a infección con virus sincicial respiratorio de seres humanos, ganado vacuno, cerdos y similares, o lesión pulmonar (Lukacs et al., Adv. Immunol., 62, 257 (1996)); accidentes cerebrovasculares; síndrome de Loeffler; neumonía eosinofílica crónica; fibrosis pulmonar; curación de heridas; infección bacteriana, por ejemplo peritonitis o meningitis bacteriana; enfermedades granulomatosas tales como micobacteriosis, pneumocistosis, histoplasmosis, blastomicosis, coccidiomicosis, criptococosis, aspergilosis, enteritis granulomatosa, candidiasis, granulomas de cuerpo extraño y peritonitis, granulomatosis pulmonar, granulomatosis de Wegener (Del Papa et al., Arthritis Rheum., 39, 758 (1996)), lepra, sífilis, enfermedad por arañazo de gato, esquistosomiasis (Jacobs et al., Am. J. Pathol., 150, 2033 (1997)), silicosis, sarcoidosis (lida et al., Thorax, 52, 431 (1997); Car et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 149, 655 (1994)) y beriliosis; endotoxemia letal (Zisman et al., J. Clin. Invest, 99, 2832 (1997)); e indicaciones asociadas con una respuesta inflamatoria débil, por ejemplo, que se presentan en la infección parasitaria, por ejemplo Leishmaniasis (Moll, Biol. Abs., 104, 21765 (1997)), tripanosoma, infección con Mycobacterium leprae o Mycobacterium tuberculosis, infecciones helmínticas, tales como nematodos (gusanos redondos); (Trichuriasis, Enterobiasis, Ascariasis, gusanos ganchudos, estrongiloidiasis, triquinosis, filariasis); trematodos (fluxes) (esquistosomiasis, clonorquiasis), cestodos (tenias) (equinococosis, Taeniasis saginata, cisticercosis; acción visceral, larva migrans visceral (por ejemplo, Toxocara), gastroenteritis eosinofílica (por ejemplo, Anisaki spp., Phocanema ssp.), larva migrans cutánea (Ancylostoma braziliense, Ancylostoma caninum), o infección fúngica.

Además, para prevenir o tratar indicaciones asociadas con una respuesta inflamatoria débil, los agentes de la invención, es decir, el péptido 2, sus variantes, análogos y derivados, se pueden emplear como adyuvantes de vacunas.

Los péptidos de la invención también pueden ser útiles como anticonceptivos o para inducir el aborto, en el síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, y las enfermedades en las que se usan esteroides de rutina (por ejemplo, colitis de Brees recurrente y asma).

También se incluyen dentro del alcance de la invención indicaciones asociadas con el factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha), por ejemplo artritis reumatoide o endotoxemia, o indicaciones asociadas con niveles elevadas de TNF-\alpha. Estas indicaciones incluyen, pero sin limitación, shock endotóxico; enfermedad de Crohn; fiebre y síntomas similares de gripe; neumonitis intersticial aguda; choque séptico y no séptico; síndrome de insuficiencia respiratoria aguda; afecciones tromboembólicas; resorción ósea; artritis; enfermedad injerto versus huésped aguda; malaria cerebral; caquexia por tuberculosis o cáncer; lesión pulmonar y fibrosis idiopática.

I. Identificación de Agentes Terapéuticos que se incluyen dentro del Alcance de la Invención

Los agentes útiles en la práctica de la invención incluyen los agentes que inhiben o reducen (por ejemplo, antagonista de receptores de quimiocinas), o incrementan, aumentan o mejoran (por ejemplo, agonistas de receptores de quimiocinas), actividad inducida por quimiocinas, por ejemplo reclutamiento de monocitos o macrófagos. Estos agentes pueden ser identificados mediante ensayos in vitro e in vivo, tales como los ensayos que se describen en la presente a continuación. Se reconoce que no todos los agentes que se incluyen dentro del alcance de la invención pueden inhibir o mejorar la actividad inducida por quimiocinas in vitro e in vivo. Los agentes terapéuticos de la invención pueden ser agonistas y/o antagonistas directos de unión al receptor, o pueden actuar por un mecanismo diferente, por ejemplo formación de moléculas bicatenarias de ácido nucleico antisentido con ARNm de quimiocina, o por más de un mecanismo, de modo de producir la alteración de la actividad inducida por quimiocinas.

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A. Péptidos, variantes, derivados y análogos 1. Quimiotaxis in vitro

Para determinar si un agente inhibe una actividad inducida por quimiocinas, tal como el reclutamiento de macrófagos, se mezclan cantidades variables del agente con las células en presencia de un quimioatrayente conocido. Por ejemplo, una variedad de concentraciones conocidas de un agente, por ejemplo, un péptido de quimiocina, se incuba con una cantidad definida (por ejemplo, 10^{4}-10^{6}) de células monocíticas de THP-1 humana en pocillos individuales del compartimiento superior de una placa trans-pocillo. La quimiocina (tal como MCP-1, MIP1\alpha, IL8 o SDF-1\alpha), a una concentración conocida para producir una migración significativa de las células THP-1 en el ensayo de migración trans-pocillo, se coloca en el compartimiento inferior (Figura 1). Las células luego se incuban a 37ºC durante un período suficiente para permitir la migración, por ejemplo 4 horas. Después de la incubación, las células se extraen suavemente de la parte superior del filtro con una pipeta, se añaden 20 \mul de EDTA 20 mM en PBS simple en cada pocillo superior, y se incuba durante 20 minutos a 4ºC. El filtro se lava cuidadosamente con medio usando un flujo suave y se retira. Se prepara una curva estándar que consiste en una serie de diluciones a la mitad de células THP-1 (en 29 \mul) para cuantificar con precisión la cantidad de células que han migrado. Las células migradas se colorean con 3 \mul de solución patrón de colorante que se añade directamente en cada pocillo (5 mg/ml en RPMI-1640 sin rojo fenol, Sigma Chemical Co.) y se incuba a 37ºC durante 4 horas. El medio se aspira con cuidado de cada pocillo, y el colorante convertido se solubiliza con 20 \mul de DMSO. Se mide la absorbancia del colorante convertido a una longitud de onda de 595 nm usando un lector de placas de ELISA. Luego se determina la cantidad de células migradas en cada pocillo por interpolación en la curva estándar (véase también Imai et al., J. Biol. Chem., 272, 15036 (1997)).

Se puede utilizar cualquier método adecuado para contar células, por ejemplo recuento con un hemocitómetro, incubación de las células con MTT (véase anteriormente) o análisis FACS. También se realiza un ensayo de control negativo, usando TGF-\beta u otro quimioatrayente distinto de quimiocinas (por ejemplo, IL1-\beta o TNF-\alpha). Para evaluar si el agente es citotóxico, se incuban las mismas concentraciones del agente con las células THP-1. Los agentes que 1) no son citotóxicos a niveles que inhiben la migración, 2) no son eficaces para inhibir la migración inducida por el control negativo y 3) reducen o inhiben la migración de THP-1 inducida por quimiocinas son agentes que se incluyen dentro del alcance de la invención.

Los agentes también se pueden identificar en un ensayo quimiotáctico que emplea neutrófilos, eosinófilos, mastocitos, basófilos, plaquetas, linfocitos o monocitos humanos. Para los monocitos, 9 ml de sangre fresca se transfieren a un tubo que contiene 1 ml de citrato de sodio 3,8%, y se dejan a temperatura ambiente durante 15 minutos. Cinco ml de esta sangre anticoagulada se colocan cuidadosamente sobre 3,5 ml de Polymorphprep® (Nycomed Pharma, Oslo), y se centrifugan a 500 g durante 35 minutos según las instrucciones del fabricante. La banda superior de la interfaz muestra/medio contiene monocitos. Los monocitos se extraen con cuidado con una pipeta de vidrio, y se reconstituyen al volumen original (5 ml). Las células se lavan con PBS más 10% de suero fetal de ternero y se centrifugan a 400 g durante 10 minutos. La etapa de lavado se repite tres veces antes de contar las células. Las células se resuspenden a razón de 1 x 10^{7} células/ml en RPKII-1640 + 10% de suero fetal de ternero (FCS). Los monocitos se cultivan durante dos días a 37ºC en una atmósfera humidificada de 5% de CO_{2}.

En el día 2, las células se cuentan, centrifugan y reconstituyen a razón de 1 x 10^{7} células/ml en solución salina equilibrada de Gey + 1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA). La quimiotaxis se induce en cámara de quimiotaxis de 48 o 96 pocillos desechables equipada con un filtro de policarbonato de 5-8 \mum para monocitos, neutrófilos o eosinófilos, o un filtro de 3 \mum para linfocitos (Uguccioni et al, Eur. J. Immunol., 25, 64 (1995); Loetscher et al., J. Exp. Med., 184, 569 (1996); Weber et al., J. Immunol., 4166 (1995)) (libre de PVP, ChemoTX, Neuroprobe Inc., Cabin John, MD). Se añaden veinticinco \mul de quimioatrayente o control al compartimiento inferior de cada pocillo. El filtro enmarcado se alinea con los orificios en la esquina del marco del filtro y se coloca sobre los pocillos. Se añaden dos y medio x 10^{5} monocitos en 25 \mul de la solución salina equilibrada de Gey + 1 mg/ml BSA al compartimiento superior. El agente se disuelve en agua Milli Q y posteriormente se diluye en forma seriada en la solución salina equilibrada de Gey. En la mayoría de los casos, el agente diluido en forma seriada se añade al compartimiento superior de la cámara de quimiotaxis. La cámara se incuba a 37ºC en una atmósfera humidificada de 5% de CO_{2} durante 1,5 horas.

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2. Liberación de la enzima

Se puede emplear la liberación de N-acetil-[3-D-glucosaminidasa de los monocitos para determinar si un agente terapéutico inhibe una actividad asociada a citoquinas. Muestras de 1,2 x 10^{6} monocitos en 0,3 ml de medio precalentado (136 mM de NaCl, 4,8 mM de KCI, 1,2 mM de KH_{2}PO_{4}, 1 mM de CaCl_{2}, 20 mM de Hepes, pH 7,4, 5 mM de D-glucosa, y 1 mg/ml de BSA libre de ácidos grasos) se pretratan durante 2 minutos con citochalasina B (2,7 mg/ml) y luego se estimulan con una quimiocina en presencia o ausencia del agente terapéutico. La reacción se detiene después de 3 minutos por enfriamiento en hielo y centrifugación, y se determina la actividad enzimática en el sobrenadante (Uguccioni et al., Eur. J. Immunol., 25, 64 (1995)).

La liberación de elastasa de los neutrófilos también se puede emplear para determinar si un agente terapéutico inhibe una actividad asociada con citoquinas (Pereri et al., J. Exp. Med., 1547 (1988); Clark-Lewis et al., J. Biol. Chem., 269, 16075 (1994)).

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3. Cambios de concentración de Ca^{2+} libre ([Ca^{2+}]_{l}) citosólico

Los monocitos, eosinófilos, neutrófilos y linfocitos cargados con Fura-2 (0,1 nmol/10^{5} células) se estimulan con una quimiocina en presencia o ausencia del agente terapéutico, y se registran los cambios de fluorescencia relacionados con [Ca^{2+}]_{l} (Von Tschanner et al., Nature, 324, 369 (1986)). Por ejemplo, para determinar las concentraciones citosólicas de Ca^{2+} en los monocitos, los monocitos se incuban con Fura-2/AM 0,5 \muM durante 30 minutos a 37ºC en solución salina amortiguada con HEPES (145 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl_{2}, 10 mM de HEPES, y 10 mM de glucosa), pH 7,4, a 37ºC, suplementado con 1% de albúmina (p/v) y 1 mM de CaCl_{2}. Después de cargar con Fura-2, las células se centrifugan durante 5 minutos a 300 x g y posteriormente se resuspenden en buffer que no contiene albúmina añadida, a una densidad celular de 1,5 x 10^{5} células/ml, y se mantienen a temperatura ambiente hasta el uso. Este protocolo da como resultado una concentración citosólica de Fura-2 de aproximadamente 100 \muM. Las diluciones seriadas de las quimiocinas en PBS más 0,1% de albúmina (p/v) (filtrada en forma estéril) se añaden a alícuotas (0,7 ml) de suspensión celular. Se mide la fluorescencia de Fura-2 de la suspensión de monocitos a 37ºC en una única longitud de onda de excitación y única de emisión (500 nm) en un fluorómetro Perkin-Elmer LS5. Se calcula
el [Ca^{2+}]_{l} a partir de los cambios de fluorescencia medidos a una única longitud de onda de excitación de 340 nm.

Las mediciones de [Ca^{2+}]_{I} en células que están transformadas establemente con un receptor de quimiocina clonado molecularmente que no se expresa en las correspondientes células no transformadas se realizan esencialmente como se describió anteriormente. Después de cargar con Fura-21AM, las células (1 x 10^{6}/ml) se mantienen en un medio frío en hielo (118 mM de NaCl, 4,6 mM de KCl, 25 mM de NaHCO_{3}, 1 mM de KH_{2}PO_{4}, 11 mM de glucosa, 50 mM de HEPES, 1 mM de MgCl_{2}, 1 mM de CaCl_{2}, 0,1% de gelatina (pH 7,4). Las alícuotas (2 ml) de la suspensión celular se precalientan a 37ºC durante 5 minutos en cubetas plásticas de 3 ml, y se mide la fluorescencia en un fluorómetro (Johnson Foundation Biomedical Group) con agitación magnética y temperatura controlada a 37ºC. La excitación se ajusta a 340 nm, y la emisión se ajusta a 510 nm. El [Ca^{2+}]_{I} se calcula como se describió anteriormente.

En los estudios de monocitos sobre desensibilización cruzada de las respuestas al calcio, se añaden las quimiocinas en forma sucesiva con un intervalo de 2 minutos, y se registran las [Ca^{2+}]_{I} transitorias. Las concentraciones usadas en estos tipos de estudios varían para cada quimiocina y se ajustan a niveles conocidos por inducir la máxima respuesta para la movilización de [Ca^{2+}]_{I} (véase, Forssmann et al., FEBS Lett., 408, 211 (1997); Sozzani et al., J. Leukoc. Biol., 57, 788 (1995); Berkhout et al., J. Biol. Chem., 272, 16404 (1997)).

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4. Unión a quimiocinas y desplazamiento de la unión

En general, la unión específica se calcula como la cantidad de agente marcado unido en ausencia de competidor frío menos la cantidad de agente marcado unido en presencia de competidor frío. La cantidad de unión específica en presencia de cantidades variables de competidor frío se puede usar para determinar la constante de asociación para el agente, así como el número de sitios de unión en la célula para el agente, usando, por ejemplo, el análisis de Scatchard. El agente se puede marcar por radiomarcado (por ejemplo, yodación) o con un marcador bioquímico adecuado (por ejemplo, biotina) o por adición de un grupo de entrecruzamiento fotoactivable. Los agentes con una constante de asociación menor de 100 \muM (es decir, que se unen más fuertemente que un agente con una constante de asociación de 100 \muM) y que tienen al menos aproximadamente 2.500, preferiblemente al menos aproximadamente 10.000, y con más preferencia más de 25.000, sitios de unión por célula -para al menos un tipo celular que expresa un receptor de quimiocina- se incluyen en el alcance de esta invención. Las células THP-1 tienen al menos aproximadamente 5.000 receptores de MCP-1/célula.

Por ejemplo, se suspenden monocitos en medio RPMI 1640 sin bicarbonato que contiene 0,2% de albúmina sérica bovina y 0,1% de azida. El péptido de quimiocina radiomarcado se incuba con 1-2 x 10^{6} células, por ejemplo células THP-1, en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de quimiocina no marcada (MCP-1, MCP-3, MCP-4, RANTES o MP-1\alpha) durante 15 minutos a 37ºC en una placa de 96 pocillos en un volumen final de 0,2 ml (por ejemplo, PBS + 0,5% de FCS). Después de la incubación, se añaden 0,5 ml de buffer de lavado frío en hielo (20 mM de Tris, 0,5 M de NaCl, pH 7,4), y las células se recolectan sobre un filtro tratado con polietilenimina Whatman GF/C usando un recolector de células Brandall. Los filtros se lavan con 4 ml de buffer de lavado frío, y se mide la radiactividad unida a los filtros en un contador \gamma.

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Para los estudios de competencia, la CI_{50} se calcula con un programa de ajuste de curva (Grant, Erithacus Software, London), usando una logística de cuatro parámetros, cpm_{unida} = cpm_{máx}/1 + ([L]/IC_{50})^{s}) + cpm_{ns}, donde cpm_{máx} representa la unión sin competidor, [L] es la concentración del competidor, cpm_{ns} es la unión no específica y s el factor de la pendiente. La cpm_{unida} se corrige para los controles "sin células". Para obtener la K_{d} y los datos de capacidad de unión específica, los datos de unión de los experimentos de desplazamiento homólogo se ajustan en una ecuación de unión al ligando de sitio único usando el programa de mejor ajuste GraFit.

La unión de quimiocinas a células transformadas establemente con un receptor de quimiocina clonado molecularmente se realiza esencialmente como se describió anteriormente excepto que el agente radiomarcado se diluye con quimiocina no marcada. Las células se incuban con agente radiomarcado más o menos quimiocinas no marcadas durante 30 minutos a 37ºC (véase también, Imai et al., supra; Sozzani et al. (1995), supra; Berkhout et al., supra; WO 97122698).

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5. Unión al Receptor de Antígeno Duffy para Quimiocinas (DARC)

La afinidad del agente terapéutico por DARC se puede determinar por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo la capacidad del agente de inhibir la unión de MCP-1 radioyodada a eritrocitos (véase el Ejemplo 3). Los agentes que se unen a DARC con una menor constante de asociación (es decir, unión más fuerte) que los que se unen a los receptores de quimiocinas (es decir, una relación de selectividad de DARC < 1), y que se unen al DARC con una constante de asociación menor de 100 \muM, preferiblemente menor de 10 \muM y con más preferencia menor de 1 \muM, son útiles en las realizaciones particulares de los métodos de la invención. En contraste, los agentes que no se unen a DARC, o no unen a DARC con una afinidad que es mayor que su afinidad por los receptores de quimiocina (es decir, una relación de selectividad > 1), son útiles en la práctica de otras realizaciones de los métodos de la invención.

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6. Inhibición de la actividad co-mitogénica de las quimiocinas

Muchas quimiocinas son comitogénicas con las concentraciones bajas de FCS, por ejemplo 50 ng/ml de MCP-1 + 0,5% de FCS es un mitógeno para células de músculo liso. Ensayos bien conocidos en la técnica para la determinación de la síntesis de ADN inducida por cualquier quimiocina conocida más una concentración baja (< 5%) de FCS en las células adecuadas (por ejemplo, células de músculo liso) en presencia y ausencia del agente se pueden emplear para identificar agentes para dicha actividad inhibidora. Véase Porreca et al., J. Véase. Res., 34, 5B (1997), cuya descripción se incorpora en la presente por referencia.

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7. Actividad anti-lentiviral

Para preparar líneas celulares que son sensibles a la infección lentiviral como resultado de la expresión de un receptor particular de quimiocina, un receptor de quimiocina clonado molecularmente se introduce en una línea celular que no expresa de otro modo el receptor de quimiocina, por ejemplo células HeLa-MAGI (Kimpton y Emerman, J. Virol., 66(5), 3026 (1992)) o U373-MAGI (Harrington y Geballe, J. Virol., 67, 5939 (1993)), por la infección con un vector retroviral. La expresión del receptor de quimiocina en la superficie celular se demuestra por la inmunotinción de las células vivas usando un anticuerpo. La expresión del ARN que codifica el receptor se demuestra por análisis de RT-PCR. HeLa-MAG1 y U373-MAGI expresan \beta-galactosidasa después de la infección lentiviral. La incubación de las células infectadas con X-gaI produce el depósito de una coloración azul en estas células.

Se lleva a cabo la infección de las líneas celulares transformadas establemente con el receptor de quimiocina con VIH en presencia o ausencia del agente en placas de 12 pocillos con diluciones seriadas 1:10 de 300 \mul de virus en presencia de 30 \mug/ml de DEAE-dextrano como se describe (Kimpton y Emerman, supra). Los patrones virales se normalizan por ELISA o p24^{gag} (Coulter Immunology) o p27^{gag} (Coulter Immunology) para VIH-1 y VIH-2/SIV, respectivamente, usando estándares provistos por el fabricante.

Dos días después de la infección, las células se fijan y tiñen para determinar la actividad de \beta-galactosidasa con X-gaI. Las células se tiñen durante 50-120 minutos a 37ºC. El título infeccioso es la cantidad de células azules por pocillo multiplicada por la dilución del virus y normalizada a 1 ml.

Para otros métodos útiles para determinar si un agente inhibe la infección y/o replicación lentiviral, véase también Cacchi et al, Science, 270, 1811 (1995), y W097/22698.

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8. Agonistas

Para determinar si un agente de la invención es un agonista de receptores de quimiocinas, se mezclan cantidades variables de una forma marcada del agente, por ejemplo biotinilados, con las células que expresan el receptor, por ejemplo, células THP-1 que expresan receptores para MCP-1, MIP1\alpha, SDF-1\alpha e IL-8, mientras que las células Jurkat expresan receptores funcionales para SDF-1. Posteriormente se determina la afinidad del agente marcado por las células. Los agentes que se unen a los receptores con afinidad razonable e interactúan con el receptor induciendo la señalización, están dentro del alcance de la invención. Si bien no están abarcados por los términos "agonista" o "antagonista", los agentes que se unen o acercan al receptor pero no inducen respuesta también están dentro del alcance de la invención, y se denominan agentes "neutros".

Los agentes con actividad agonista también se pueden identificar usando el ensayo de migración trans-pocillo, donde las células se colocan en el compartimiento superior (véase la Figura 1) en ausencia del agente, y el agente, por ejemplo, el péptido 2[MCP-1], se coloca en concentraciones variables en el compartimiento inferior en lugar de la quimiocina. Si el(los) agente(s) tiene(n) actividad agonista, se hallan más células en el compartimiento inferior al final del ensayo en los pocillos que contienen el/los agente(s) que en los pocillos que contienen el control inactivo, es decir, agente o medio solo. Preferiblemente, los agentes que tienen actividad agonista también estimulan la migración de las células humanas primarias, por ejemplo monocitos, en un ensayo de migración trans-pocillo.

Más aún, los agonistas débiles o agonistas neutros (agentes que se unen al receptor pero no inhiben la unión de la quimiocina nativa y su señalización posterior ni inducen la señalización por sí mismos) se pueden identificar seleccionando agentes por su capacidad de desplazar la unión de gp 120 del VIH, en forma específica el bucle V3 de gp120, a la superficie de las células THP-1 o células Jurkat. Las células se incuban con proteína gp 120 recombinante marcada (por ejemplo, radioyodada) en una cantidad efectiva para unirse al receptor del virus, en presencia y ausencia de concentraciones variables de los agentes. Los agentes que reducen o anulan la unión de gp120 son agonistas o agonistas neutros dentro del alcance la invención.

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9.In vivo

Un método rápido para determinar si un agente de la invención inhibe o aumenta una respuesta inflamatoria es inyectar una quimiocina seleccionada en la piel de un animal en presencia o ausencia de un agente de la invención. En algún punto posterior en el tiempo, los animales se sacrifican y se compara la cantidad de células inflamatorias de los animales expuestos a la quimiocina y el agente con la cantidad de células inflamatorias en los animales expuestos a quimiocina sola, por ejemplo por inmunofluorescencia cuantitativa, con respecto a los animales control.

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B. Moléculas de ácido nucleico de la invención 1. Fuentes de las Moléculas de Ácido Nucleico de la Invención

Las fuentes de secuencias de nucleótidos de las que provienen las moléculas de ácido nucleico presentes que codifican un péptido de quimiocina, una de sus variantes o su complemento del ácido nucleico, incluyen ARN total o poliA+ de cualquier fuente celular eucariota, preferiblemente de mamífero, de la que pueden derivar los ADNc por métodos conocidos en la técnica. Otras fuentes de moléculas de ADN de la invención incluyen bibliotecas genómicas derivadas de cualquier fuente celular eucariota. Además, las presentes moléculas de ADN se pueden preparar in vitro, por ejemplo, por síntesis de un oligonucleótido de aproximadamente 100, con preferencia aproximadamente 75, con más preferencia aproximadamente 50, y aún con más preferencia aproximadamente 40, nucleótidos de longitud, o por subclonación de una porción de un segmento de ADN que codifica una quimiocina particular.

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2. Aislamiento de un gen que codifica una quimiocina

Una molécula de ácido nucleico que codifica una quimiocina se puede identificar y aislar usando métodos estándares, según se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989). Por ejemplo, se puede emplear PCR por transcriptasa inversa (RT-PCR) para aislar y clonar los ADNc de quimiocina. Se pueden emplear un oligo-dT como cebador en la reacción de la transcriptasa inversa para preparar los ADNc de una primera cadena, provenientes del ARN aislado que contiene las secuencias de ARN de interés, por ejemplo el ARN total aislado de tejido humano. El ARN se puede aislar por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo usando el reactivo TRIZOL^{TM} (GIBCO-BRL/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Los ADNc resultantes de la primera cadena posteriormente se amplifican en reacciones de PCR.

La "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento o técnica en la que cantidades de un fragmento de ácido nucleico preseleccionado, ARN y/o ADN, se amplifican como se describe en la Patente Estadounidense No. 4.683.195. Generalmente, la información de secuencia de los extremos de la región de interés o más allá se emplea para diseñar cebadores de oligonucleótidos que comprenden al menos 7-8 nucleótidos. Estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a las cadenas opuestas del molde amplificado. La PCR se puede usar para amplificar secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas del ADN genómico total y el ADNc transcripto del ARN celular total, secuencias de bacteriófagos o plásmidos y similares. Véase, en general, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., es 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). En consecuencia, las estrategias de clonación basadas en PCR dependen de las secuencias conservadas deducidas de los alineamientos de las secuencias del gen o polipéptidos relacionados.

Los cebadores se hacen corresponder a regiones altamente conservadas de secuencias de polipéptidos o nucleótidos que se identifican o comparan para generar los cebadores, por ejemplo por comparación de secuencias de otras quimiocinas de eucariotas. Se prepara un cebador previsto para aparearse a la cadena antisentido y se prepara otro cebador previsto para aparearse a la cadena homosentido, de una molécula de ADN que codifica una quimiocina.

Los productos de cada reacción de PCR se separan por medio de un gel de agarosa y todos los productos amplificados en forma consistente se purifican por gel y se clonan directamente en un vector adecuado, tal como un vector de plásmido conocido. Los plásmidos resultantes se someten a endonucleasas de restricción y secuenciación didesoxi de los ADN plásmidos bicatenarios

Otra estrategia para identificar, aislar y clonar los ADNc que codifican una quimiocina es seleccionar una biblioteca de ADNc. La selección de fragmentos de ADN que codifican el total o una porción de un ADNc que codifica una quimiocina se puede lograr investigando la biblioteca con una sonda que tiene secuencias que son altamente conservadas entre los genes que se consideran relacionados con la quimiocina, por ejemplo el homólogo de una quimiocina particular de una especie diferente, o por selección de placas que se unen a los anticuerpos que reconocen específicamente la quimiocina. Los fragmentos de ADN que se unen a una sonda que tienen secuencias que están relacionadas con la quimiocina, o que son inmunorreactivos con los anticuerpos para la quimiocina, se pueden subclonar en un vector adecuado y se secuencian y/o se usan como sondas para identificar otros ADNc que codifican la totalidad de o una porción de la quimiocina.

Como se usa en la presente, los términos "aislado y/o purificado" se refieren al aislamiento in vitro de un ADN o molécula de polipéptido proveniente de un ambiente celular, y de la asociación con otros componentes de la célula, tales como ácido nucleico o polipéptido, de modo que se puede secuenciar, replicar y/o expresar. Por ejemplo, "ácido nucleico de quimiocina aislado" es ARN o ADN que contiene más de 9, preferiblemente 36, y con más preferencia 45 o más, bases nucleotídicas secuenciales que codifican al menos una porción de una quimiocina, o una de sus variantes, o un ARN o ADN complementario a este, que es complementario o hibridiza, respectivamente, al ARN o ADN que codifica la quimiocina y permanece unido establemente en condiciones rigurosas, definido por los métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, en Sambrook et al., supra. En consecuencia, el ARN o ADN se "aísla" de modo que es libre a partir de al menos un ácido nucleico contaminante con el que está normalmente asociado en la fuente natural del ARN o ADN y preferiblemente está sustancialmente libre de cualquier otro ARN o ADN de mamífero. La frase "libre de al menos un ácido nucleico de fuente contaminante con la que se asocia normalmente" incluye el caso en el que el ácido nucleico se reintroduce en la fuente o célula natural pero está en una ubicación cromosómica diferente o está flanqueado de otro modo por secuencias de ácidos nucleicos que no se hallan normalmente en la célula fuente. Un ejemplo del ácido nucleico de quimiocina aislado es ARN o ADN que codifica la MCP-1 humana y comparte al menos aproximadamente 80%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%, y con más preferencia al menos aproximadamente 95%, de identidad de secuencia con el polipéptido de MCP-1 que tiene la SEQ ID NO:16.

Como se usa en la presente, el término "ácido nucleico recombinante" o "ácido nucleico preseleccionado", por ejemplo "secuencia o segmento de ADN recombinante" o "secuencia o segmento de ADN preseleccionado" se refiere a un ácido nucleico, por ejemplo a un ADN, que se ha obtenido o aislado de cualquier fuente de tejido apropiado, que posteriormente se puede alterar en químicamente in vitro, de modo que su secuencia no es natural o corresponde a secuencias naturales que no se ubican como deberían ubicarse en un genoma que no ha sido transformado con el ADN exógeno. Un ejemplo de ADN preseleccionado "derivado" de una fuente, sería una secuencia de ADN que se identifica como un fragmento útil dentro de un organismo dado, y que posteriormente se sintetiza químicamente en forma esencialmente pura. Un ejemplo de dicho ADN "aislado" de una fuente sería una secuencia de ADN útil que se escinde o elimina de dicha fuente por medios químicos, por ejemplo utilizando endonucleasas de restricción, de modo que pueda ser manipulado adicionalmente, por ejemplo amplificado, para usar en la invención, por la metodología de ingeniería genética.

En consecuencia, la recuperación o el aislamiento de un fragmento dado de ADN de un digesto de restricción puede emplear la separación del digesto sobre gel de poliacrilamida o agarosa por electroforesis, identificación del fragmento de interés por comparación de su movilidad versus la del marcador de ADN de peso molecular conocido, extracción de la sección de gel que contiene el fragmento deseado y separación del gel del ADN. Véase Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9, 6103 (1981), y Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980). En consecuencia, "ADN preseleccionado" incluye secuencias de ADN completamente sintéticas, secuencias de ADN semi-sintéticas, secuencias de ADN aisladas de fuentes biológicas y secuencias de ADN derivadas de ARN, así como sus mezclas.

Como se usa en la presente, el término "derivado" con respecto a una molécula de ARN significa que la molécula de ARN tiene identidad de secuencia complementaria con una molécula de ADN particular.

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3. Variantes de las Moléculas de Ácido Nucleico de la Invención

Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes de secuencias de aminoácidos de un péptido de quimiocina se preparan por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de las variantes de secuencias de aminoácidos naturales) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis por casete de una variante preparada con anterioridad o una versión no variante del péptido de quimiocina.

La mutagénesis mediada por oligonucleótidos es un método preferido para preparar las variantes por sustitución de aminoácido de un péptido de quimiocina. Esta técnica es bien conocida en la materia como se describe en Adelman et al., DNA, 2, 183 (1983). En pocas palabras, el ADN de quimiocina se modifica por hibridación de un oligonucleótido que codifica la mutación deseada a un ADN molde, donde el molde es una forma monocatenaria de un plásmido o bacteriófago que contiene la secuencia de ADN no alterada o nativa de la quimiocina. Después de la hibridación, se usa ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena complementaria completa del molde que en consecuencia incorporará el cebador del oligonucleótido y codificará la modificación seleccionada en el ADN de la quimiocina.

En general, se usan oligonucleótidos de al menos 25 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo tendrá 12 a 15 nucleótidos que son totalmente complementarios con el molde en cualquier lado del(de los) nucleótido(s) que codifican la mutación. Esto asegura que el oligonucleótido se hibridizará apropiadamente con la molécula del ADN molde monocatenario. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente usado técnicas conocidas en la materia tales como los que se describen en Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sol. U.S.A., 75, 5765 (1978).

El ADN molde puede ser generado por los vectores que derivan de los vectores del bacteriófago M13 (son adecuados los vectores M13mp18 y M13mp19 disponibles en el comercio), o los vectores que contienen el origen de replicación del fago monocatenario descritos por Viera et al, Meth. Enzymol., 153, 3 (1987). En consecuencia, el ADN que se va a mutar se puede insertar en uno de estos vectores para generar el molde monocatenario. La producción del molde monocatenario se describe en las secciones 4.21-4.41 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. 1989).

En forma alternativa, el ADN molde monocatenario se puede generar por desnaturalización del ADN plásmido bicatenario (u otro) usando técnicas estándares.

Para la modificación de la secuencia de ADN nativa (para generar variantes de secuencias de aminoácidos, por ejemplo), el oligonucleótido se hibridiza al ADN molde monocatenario en condiciones de hibridación adecuadas. Una enzima de polimerización de ADN, usualmente el fragmento Klenow de ADN polimerasa I, se añade posteriormente para sintetizar la cadena complementaria del molde usando el oligonucleótido como cebador para la síntesis. Se forma en consecuencia una molécula hetero-bicatenaria de modo tal que una cadena del ADN codifica la forma mutada de la quimiocina y la otra cadena (el molde original) codifica la secuencia no alterada nativa de la quimiocina. Esta molécula hetero-bicatenaria posteriormente se transforma en un célula huésped adecuada, usualmente un procariota tal como E. coli JM101. Después de cultivar las células, estas se incuban en placas de agarosa y se analizan usando el cebador oligonucleotídico radiomarcado con fosfato 32 para identificar las colonias bacterianas que contienen el ADN mutado. La región mutada posteriormente se extrae y coloca en el vector apropiado para la producción del péptido o polipéptido, en general un vector de expresión del tipo normalmente empleado para la transformación de un huésped apropiado.

El método descrito inmediatamente antes se puede modificar de modo que se cree una molécula homo-bicatenaria donde ambas cadenas del plásmido contienen la(s) mutación(es). Las modificaciones son las siguientes: el oligonucleótido monocatenario se aparea al ADN molde monocatenario como se describió anteriormente. Una mezcla de tres desoxirribonucleótidos, desoxirriboadenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP) y desoxirribotimidina (dTTP), se combina con una tiodesoxirribocitosina modificada llamada dCTP-(\alphaS) (que se pueden obtener de la Amersham Corporation). Esta mezcla se añade al complejo molde-oligonucleótido. Después de la adición de ADN polimerasa a esta mezcla, se genera una cadena de ADN idéntica al molde excepto por las bases mutadas. Además, esta nueva cadena de ADN contendrá dCTP-(\alphaS) en vez de dCTP, que sirve para protegerlo de la digestión con endonucleasa de restricción.

Después de cortar la hebra del molde del heterodúplex bicatenario con una enzima de restricción apropiada, la cadena del molde se puede digerir con una nucleasa ExoIII u otra nucleasa apropiada a través de la región que contiene
el(los) sitio(s) por mutagenizar. La reacción posteriormente se detiene para dejar una molécula que sea sólo parcialmente monocatenaria. Posteriormente se forma un homodúplex de ADN bicatenario usando ADN polimerasa en presencia de los cuatro trifosfatos de desoxirribonucleótido, ATP y ADN ligasa. Esta molécula homodúplex posteriormente se puede transformar en una célula huésped adecuada tal como E. coli JM101.

Por ejemplo, una realización preferida de la invención es una molécula de ADN aislada y purificada que comprende un segmento de ADN preseleccionado que codifica el péptido 3 (1-12)[MCP-1] que tiene la SEQ ID NO:1, donde el segmento de ADN comprende la SEQ ID NO:76, o variantes de la SEQ ID NO:76 que tiene sustituciones de nucleótidos que son "silentes" (véase la Figura 12). Es decir, cuando las sustituciones de nucleótidos silentes están presentes en un codón, el mismo aminoácido está codificado por el codón con la sustitución de nucleótidos como es codificada por el codón sin la sustitución. Por ejemplo, la valina es codificada por el codón GTT, GTC, GTA y GTG. Una variante de la SEQ ID NO:79 en el décimo codón del polipéptido maduro (GTC en la SEQ ID NO:79) incluye la sustitución de GTT, GTA o GTG en lugar de GTC. Otras sustituciones de nucleótidos "silentes" en la SEQ ID NO: 76 que pueden codificar el péptido 3 (1.12)[MCP-1) que tiene la SEQ ID NO: se pueden establecer por referencia a la Figura 12 y la página D1 del Apéndice D de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989). Las sustituciones de nucleótidos se pueden introducir en los segmentos de ADN por métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra. Asimismo, las moléculas de ácido nucleico que codifican otras quimiocinas de mamífero, preferiblemente ser humano, se pueden modificar de una manera similar. En consecuencia, las moléculas de ácido nucleico que codifican al menos una porción, por ejemplo, de MCP-2 (SEQ ID NO:80), MCP-3 (SEQ ID NO:81), MCP-4 (SEQ ID NO:100), MIP1\alpha, (SEQ ID NO:82), MIP1\beta (SEQ ID NO:83), RANTES (SEQ ID NO: 84), SIDF1\alpha (SEQ ID NO:85), IL8 (SEQ ID NO:86), GRO\alpha (SEQ ID NO:87), eotaxina (SEQ ID NO:88), MIG (SEQ ID NO: 89), PF-4 (SEQ ID NO:90), 1309 (SEQ ID NO:91), HCC-1 (SEQ ID NO:92), C_{10} (SEQ ID NO:93), CCR-2 (SEQ ID NO: 94), ENA-78 (SEQ ID NO:95), GRO\beta (SEQ ID NO:96), IP10 (SEQ ID NO:97), SDF1 \beta (SEQ ID NO:98), GRO\alpha (SEQ ID NO:99), MIP3a, TCA-3, CTAPIII, MARC/FYK, \beta-tromboglobulina, GCP-2, PBP, HC_{1}4, MDC, TECK, PARC, 6Ckina, fractalina, DC-CK1, LIX, TARC, LARC, MIG, Ck\beta8, CCF18/MRP-2, CCIII, CK\alpha2, H1305, Dvic-1, DGWCC, TCA4, dendrocina, CC2/HCC1, CC3 y MIP1\tau, así como quimiocinas codificadas por virus tales como vMIP-1, vMIP-II y vMIP-III o el complemento de éstos, se pueden modificar de modo de producir moléculas de ácido nucleico de la invención que tienen sustituciones de nucleótidos silentes, o para producir moléculas de ácido nucleico que tienen sustituciones de nucleótidos que originan sustituciones de aminoácidos (véanse variantes de péptidos a continuación).

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C. Estudios in vivo

Para determinar adicionalmente si un agente particular es útil en la práctica de los métodos de la invención, se identifica un modelo animal para una enfermedad humana. También se pueden emplear modelos de animales transgénicos para enfermedad humada para identificar agentes útiles en los métodos de la invención. Por ejemplo, los modelos de reclutamiento de macrófagos inducido por quimiocina asociados con la aterosclerosis humana incluyen, pero sin limitación, ratones con supresión homocigota del gen de apolipoproteína E (apoE), ratones que sobreexpresan la apoB humana y conejos con hiperlipidemia hereditaria de Watanabe. Los modelos para enfermedades autoinmunes incluyen artritis inducida por colágeno en ratones DBA/1 y encefalomielitis autoinmune experimental inducida por proteína básica de mielina. Los modelos para osteoporosis incluyen ratas hembra ovariectomizadas, ratones, monos, ratas tratadas con heparina o con glucocorticoides así como osteoporosis inducida por suspensión en ratas. Los modelos para la infección con VIH incluyen la infección de monos con SIV, cepas de SIV, VIH o cepas de VIH, ratones SCID-Hu con VIH o cepas de VIH, o conejos con VIH o cepas de VIH. Otros modelos animales para la infección lentiviral incluyen gatos infectados con FIV, caballos con EIAV y cabras infectadas con CAEV (que también es un modelo animal para artritis).

La eficacia de un agente de la invención se puede evaluar midiendo el grado de inflamación o el grado de infiltración de macrófagos de los tejidos afectados. La infiltración de macrófagos se puede detectar por tinción de secciones de tejidos con anticuerpos que específicamente detectan macrófagos (por ejemplo, antisuero mac-1). La inflamación u otros síntomas de la enfermedad se pueden detectar por medición de parámetros clínicos apropiados, usando técnicas que son bien conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, se tratan ratones deficientes en apoE con un agente, tal como CRD-Leu_{4}Ile_{11}péptido 3, por ejemplo, por inyección intraperitoneal, durante un período de doce semanas, mientras que las compañeros de jaula control reciben un péptido control adecuado sin actividad biológica conocida. Al final de las doce semanas, los animales se sacrifican y el efecto del agente se evalúa por medición de la reducción del reclutamiento de macrófagos en la pared del recipiente por inmunohistoquímica cuantitativa usando antisuero mac-1 y por medición de la reducción del grado de formación de lesión lipídica vascular por histoquímica usando tinción con rojo oleoso O de acuerdo con Paigen, Arteriosclerosis, 10, 316 (1990).

Los ratones transgénicos Apo(a) desarrollan lesiones cuando se alimentan con una dieta rica en lípidos. Estas lesiones no contienen ningún macrófago. En contraste, los ratones C57B16 endogámicos desarrollan lesiones lipídicas de tamaño y gravedad similar a los ratones transgénicos apo(a), pero estas lesiones son ricas en macrófagos de infiltración. Las lesiones de los ratones apo(a), C57B16 y otras 6 cepas de ratones que desarrollan lesiones lipídicas ricas con macrófagos, se analizaron mediante inmunofluorescencia cuantitativa para determinar niveles de mediadores proinflamatorios, por ejemplo TNF-\alpha, MCP-1, MIP-1\alpha, IL1\beta, ICAM-1, VCAM-1 y P-selectina. TNF-\alpha, MIP-1\alpha, IL1\beta, ICAM-1, VCAM-1 y P-selectina se expresaron en niveles idénticos en las lesiones del ratón apo(a) y las lesiones de C57B16. En consecuencia, si bien estos mediadores proinflamatorios pueden ser necesarios para la infiltración, no son suficientes solos. En marcado contraste, MCP-1 estuvo completamente ausente en las lesiones de ratones apo(a), pero se expresó a niveles altos en las lesiones de todos las otras líneas de ratón que tenían lesiones ricas en macrófagos.

El análisis microscópico confocal de las secciones de la pared de los vasos sanguíneos con lesiones triples teñidas con anticuerpos específicos para actina SM-\alpha (células de músculo liso; anticuerpo IA4), macrófagos (anticuerpos Mac-1) y MCP-1, mostró que la MCP-1 no es exclusivamente expresada por los macrófagos. Es decir, las células de músculo liso y los macrófagos expresaron MCP-1. En consecuencia, MCP-1 puede ser el "mediador inflamatorio" faltante en el modelo de ratón apo(a) de la aterosclerosis. Estos resultados sugieren que la carencia de MCP-1 en lesiones de ratones apo(a) puede no ser una consecuencia de la ausencia de macrófagos, sino en cambio contribuir a la causa de la carencia de infiltración de monocitos. Además, estos resultados proporcionan evidencia de que la quimiocina MCP-1 cumple un papel en la inflamación vascular aterosclerótica. En consecuencia, MCP-1 puede proporcionar la base para los análogos que bloquean la actividad de reclutamiento de esta quimiocina.

Las quimiocinas diferentes de la MCP-1 también pueden participar en el reclutamiento de macrófagos, inflamación y patogénesis de la aterosclerosis, y en otras enfermedades asociadas con la proliferación inapropiada. Por ejemplo, MIP1\alpha ha sido implicada en la inflamación inapropiada en la esclerosis múltiple. En consecuencia, las secuencias análogas al péptido 2 y 3 de MIP1\alpha pueden ser particularmente útiles para tratar o prevenir la esclerosis múltiple. En consecuencia, cuando una quimiocina particular está implicada en una enfermedad particular, las secuencias de la quimiocina particular pueden ser especialmente útiles para tratar o prevenir esta enfermedad. Los agentes preferidos que se incluyen dentro del alcance de la invención son inhibidores de la señalización de más de una quimiocina, y preferiblemente de todas las quimiocinas. En consecuencia, puede ser preferible preparar los análogos del péptido de quimiocina que tienen secuencias de una quimiocina diferente de una asociada con un proceso de enfermedad particular. La selección de un agente particular para tratar una enfermedad particular se puede basar en la biodisponibilidad, toxicidad, unión a DARC u otros criterios similares.

Otros modelos incluyen, pero sin limitación, los informados por Lukacs (Adv. Immunol., pp. 257-304, Academic Press (1996)) para lesión pulmonar; Lloyd et al. (J. Leuko. Biol., 185, 1371 (1997)) y Tam et al. (Kid. Int., 49, 715 (1996)) para nefritis; Volejnikova (Am. J. Pathol., 150, 1711 (1997) para hueso; Ghinikar et al. (J. Neurosci. Res., 46, 727 (1996)) y Ransohoif et al. (J. Leuko. Biol., 62, 645 (1997)) para el cerebro; Kalil et al. (Am. J. Trop. Med. Hyg., 58, 240 (1995)) para malaria; Ajeubar et al. (J. Leuko. Biol., 63, 108 (1998)) para peritonitis; Furukawa et al. (Lupus, 6, 193 (1997)) para lupus sistémico; Suzuki et al (J. Heart & Lung Transpl., 16, 1141 (1967)), Abbott et al (Arch. Surg., 89, 645 (1964)), Cony et al. (Transpl., 16, 343 (1973)), Dworkin et al. (J. Heart Lung Transpl., 10, 591 (1991)), Laden et al. (Arch. Path., 93, 240 (1972)) y Mitchell et al. (Transpl., 49, 835 (1990)) para trasplantes; la Patente Estadounidense No. 5.661.132 para la curación de heridas; Burhardt et al. (R^{h}eum. Int., 17, 91 (1997)) para autoinmunidad; Elson et al Gastroenter., 09,1344(1998)) para enfermedad intestinal inflamatoria; Hayes et al. (Arteries. Thromb. Vase. Biol., 18, 397 (1998)) y Wang et al. (Arterio. Thromb., 11, 1166 (1991)), para las enfermedades cardiovasculares; Wegner et al. (Science, 247, 456 (1990) para la infiltración eosinofílica en el pulmón; Brahn (Ciinorth y Rel. Res., 265, 42 (1991)), Wooley (Curr. Op. R^{h}eum., 3, 407 (1991)) y Gay et al. (Curr. Op. R^{h}eum., 7, 199 (1995), modelo de implante sinovial humano SCID)) para artritis reumatoide); Reamer et al. (Blood, 86, 3220 (1998)), Nakaguma (Int. J. Exp. Path., 76, 65 (1998)), Nanney et al. (J. Invest. Dennat., 106, 1169 (1996)), Nickoff et al. (AJP, 146, 580 (1995)), Sundberg et al. (Pathobiol., 65, 271 (1997)) y Wolf et al. (Int. J. Dermal., 30, 448 (1998)) para psoriasis; y Centl et al. (Blood, 89, 4120 (1997)), Gonzalo et al (JCL, 98, 2332 (1996)), Telyeira et al. (JCI, 100, 1657 (1997)), Geri et al. (Allergy, 52, 739 (1997)), Freed (Eur. Res. J., 8, 1770 (1998)), Griffiths-Johnson et al. (Meth. Enzy., 288, 241 (1991)), Herz et al (New Horizons in Allergy immunoth., 25-32 Plenum Press, 1996) y Kane (Eur. Resp. J., 7, 555 (1991)) para alergia.

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II. Preparación de Agentes que se Incluyen Dentro del Alcance de la Invención A. Moléculas de ácido nucleico 1. Casetes de Expresión Quiméricos

Para preparar casetes de expresión para la transformación de la presente, la secuencia o segmento de ADN recombinante o preseleccionado puede ser circular o lineal, bicatenaria o monocatenaria. Una secuencia de ADN preseleccionado que codifica una secuencia de ARN que es sustancialmente complementaria con una secuencia de ARN que codifica una quimiocina es normalmente una secuencia de ADN "homosentido" clonada en un casete en la orientación opuesta (es decir, 3' a 5' en lugar de 5' a 3'). En general, la secuencia o segmento de ADN preseleccionado está en forma de ADN quimérico, tal como el ADN plásmido, que también puede contener regiones codificadoras flanqueadas por secuencias control que promueven la expresión del ADN preseleccionado presente en la línea celular resultante.

Como se usa en la presente, "quimérico" significa que un vector comprende ADN de al menos dos especies diferentes, o comprende ADN de la misma especie, que se une o asocia de una manera que no se presenta en el tipo "nativo" o salvaje de la especie.

Aparte de las secuencias de ADN preseleccionado que actúan como unidades de transcripción para una quimiocina, o porciones de esta, una porción del ADN preseleccionado puede transcribirse, y cumplir una función reguladora o estructural. Por ejemplo, el ADN preseleccionado puede de por sí comprender un promotor que es activo en células de mamífero, o puede utilizar un promotor ya presente en el genoma que es el blanco de transformación. Dichos promotores incluyen el promotor de CMV, así como el promotor tardío de SV40 y los LTR retrovirales (elementos de repetición terminal largos), aunque muchos otros elementos promotores bien conocidos en la técnica se pueden emplear en la práctica de la invención.

Otros elementos funcionales en las células hospedantes, tales como intrones, potenciadores, secuencias de poliadenilación y similares, también pueden ser parte del ADN preseleccionado. Dichos elementos pueden ser necesarios o no para la función del ADN, pero pueden proporcionar mejor expresión del ADN al afectar la transcripción, estabilidad del ARNm, o similares. Dichos elementos se pueden incluir en el ADN, según corresponda para obtener el rendimiento óptimo de la transformación del ADN de la célula.

"Secuencias control" se define para significar las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora unida operativamente en un organismo hospedante particular. Las secuencias control que son adecuadas para las células procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor y, opcionalmente, una secuencia operadora y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

"Unido operativamente" significa que los ácidos nucleicos se colocan en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretora está unido operativamente al ADN para un péptido o polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del péptido o polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificadora si esta se ubica para facilitar la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN unidas son contiguas y, en el caso de una líder secretora, contigua y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no necesitan ser contiguos. La unión se logra por el ligamiento en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se usan los adaptadores o ligadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

El ADN preseleccionado que se introducirá en las células en general también contendrá un gen del marcador seleccionable o un gen indicador o ambos para facilitar la identificación y selección de las células trasformadas de la población de las células que se busca transformar. En forma alternativa, el marcador seleccionable se puede llevar en un trozo separado de ADN y usarse en un procedimiento de cotransformación. Tanto los marcadores seleccionables como los genes indicadores pueden estar flanqueados con secuencias reguladoras apropiadas para permitir la expresión en las células hospedantes. Los marcadores seleccionables útiles son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a los antibióticos y herbicidas, tales como neo, hpt, dhtr, bar, aroA, dapA y similares. Véanse también, los genes enumerados en la Tabla I de Lundquist et al. (Patente Estadounidense No. 5.848.956).

Los genes indicadores se usan para identificar células potencialmente transformadas y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. Los genes indicadores que codifican para las proteínas fácilmente analizables son bien conocidos en la técnica. En general, un gen indicador es un gen que no está presente ni es expresado por el organismo o tejido receptor y que codifica una proteína cuya expresión se manifiesta con alguna propiedad fácilmente detectable, por ejemplo una actividad enzimática. Los genes preferidos incluyen el gen de cloranfenicol acetil transferasa (cat) de Tn9 de E. coli, el gen de beta-glucuronidasa (gas) del locus uidA de E. coli, y el gen de luciferasa de la luciérnaga Photinus piralis. La expresión del gen indicador se ensaya en un tiempo adecuado después de introducir el ADN en las células receptoras.

Los métodos generales para construir ADN recombinante que pueden transformar las células blanco son bien conocidos por los expertos en la técnica, y se pueden utilizar las mismas composiciones y métodos de construcción para producir el ADN útil en la presente. Por ejemplo, J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2d ed., 1989), proporciona métodos de construcción adecuados.

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2. Transformación en Células Hospedantes

El ADN recombinante se puede introducir fácilmente en células hospedantes, por ejemplo, células de mamífero, bacterianas, levaduras o de insectos, por transfección con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una quimiocina o su complemento, por cualquier procedimiento útil para la introducción en una célula particular, por ejemplo métodos físicos o biológicos, para producir una célula transformada que tiene el ADN recombinante integrado establemente en su genoma, de modo que las moléculas, secuencias o segmentos de ADN de la presente invención son expresados por la célula hospedante.

Los métodos físicos para introducir un ADN preseleccionado en una célula hospedante incluyen precipitación con fosfato de calcio, lipofección, bombardeo con partículas, microinyección, electroporación y similares. Los métodos biológicos para introducir el ADN de interés en una célula hospedante incluyen el uso de vectores virales de ADN y ARN. La principal ventaja de los métodos físicos es que no están asociados con los procesos patológicos u oncogénicos de los virus. Sin embargo, ellos son menos precisos, a menudo originan inserciones de copias múltiples, integración aleatoria, disrupción de secuencias génicas extrañas y endógenas y la expresión no predecible. Para la terapia génica de mamíferos, es conveniente usar un medio eficiente de inserción con precisión de un gen de copia única en el genoma del huésped. Los vectores virales, y en especial los vectores retrovirales, se han convertido en el método más ampliamente usado para insertar genes en mamíferos, por ejemplo en células humanas. Otros vectores virales pueden derivar de poxvirus, virus de herpes simplex I, adenovirus y virus adenoasociados, y similares.

Como se usa en la presente, los términos "línea celular" o "célula hospedante" se refieren a poblaciones bien caracterizadas de células biológicamente puras y homogéneas. Estas células pueden ser células eucariotas que son neoplásicas o que han sido "inmortalizadas" in vitro por métodos conocidos en la técnica, así como también células primarias o células procariotas. La línea celular o célula hospedante es preferiblemente de origen mamífero, pero se pueden emplear líneas celulares o células hospedantes de origen no mamífero, que incluyen fuentes vegetales, de insectos, levaduras, fúngicas o bacterianas. En general, la secuencia de ADN preseleccionado se refiere a una secuencia de ADN que reside en el genoma de la célula huésped pero no está expresada, o no está altamente expresada o, en forma alternativa, está sobreexpresada.

"Transfectada" o "transformada" se usa en la presente para incluir cualquier célula hospedante o línea celular, cuyo genoma ha sido alterado o aumentado por la presencia de al menos una secuencia de ADN preseleccionado, ADN que también se denomina en la técnica de la ingeniería genética "ADN heterólogo", "ADN recombinante", "ADN exógeno", "ADN manipulado genéticamente", "ADN no nativo" o "ADN extraño", donde dicho ADN fue aislado e introducido en el genoma de la célula hospedante o línea celular por el proceso de la ingeniería genética. Las células hospedantes de la presente invención normalmente se producen por transfección con una secuencia de ADN en un vector de expresión del plásmido, un vector de expresión viral o como una secuencia de ADN lineal aislada. Preferiblemente, el ADN transfectado es una secuencia de ADN recombinante integrado en el cromosoma, que comprende un gen que codifica la quimiocina o su complemento, célula hospedante que puede expresar o no niveles significativos de quimiocina autóloga o "nativa".

Para confirmar la presencia de la secuencia de ADN preseleccionado en la célula hospedante, se puede realizar una variedad de ensayos. Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos "biológicos moleculares" bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como transferencia Southern y Northern, RT-PCR y PCR; ensayos "bioquímicos", tales como detectar la presencia o ausencia de una quimiocina particular, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISA y transferencia Western) o por ensayos descritos anteriormente en la presente para identificar los agentes que se incluyen dentro del alcance de la invención.

Para detectar y cuantificar ARN producido a partir de segmentos de ADN preseleccionados introducidos, se puede emplear RT-PCR. En esta aplicación de la PCR, primero es necesario transcribir en forma inversa ARN en ADN, usando enzimas tales como transcriptasa inversa, y posteriormente mediante el uso de técnicas de PCR convencionales para amplificar el ADN. En la mayoría de los casos, las técnicas de PCR, aunque útiles, no demostrarán la integridad del ARN producto. Se puede obtener información adicional acerca de la naturaleza del ARN producto por transferencia Northern. Esta técnica demuestra la presencia de una especie de ARN y brinda información acerca de la integridad de este ARN. La presencia o ausencia de una especie de ARN también se puede determinar usando hibridaciones por transferencia Northern en ranura o mancha. Estas técnicas son modificaciones de la transferencia Northern y sólo demuestran la presencia o ausencia de una especie de ARN.

Si bien la transferencia Southern y la PCR se pueden usar para detectar el segmento de ADN preseleccionado en cuestión, estas no proveen información respecto de si se está expresando el segmento de ADN preseleccionado. La expresión se puede evaluar específicamente identificando los productos peptídicos de las secuencias de ADN preseleccionado introducido o evaluando los cambios fenotípicos producidos por la expresión del segmento de ADN preseleccionado introducido en la célula hospedante.

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B. Péptidos, variantes de péptidos, y sus derivados

Los presentes péptidos de quimiocina, variante de péptidos o su derivados aislados y purificados, se pueden sintetizar in vitro, por ejemplo, por el método de síntesis de péptidos en fase sólida o por estrategias de ADN recombinante (véase más arriba). El método de síntesis de péptidos en fase sólida es un método establecido y ampliamente usado, que se describe en las siguientes referencias: Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85 2149 (1963); Meienhofer in "Hormonal Proteins and Peptides", ed.; C.H. Li, Val. 2 (Academic Press, 1973), pp. 48-267; Bavaay y Merrifield, "The Peptides", eds. E. Gross y F. Meienhofer, Vol. 2 (Academic Press, 1980) pp. 3-285; y Clark-Lewis et al., Meth. Enzymol., 287, 233 (1997). Estos péptidos se pueden purificar adicionalmente por fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC en fase reversa; cromatografía en sílice o una resina de intercambio aniónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; o cromatografía por afinidad de ligando.

Una vez aislados y caracterizados, los derivados, por ejemplo derivados extraídos químicamente, de un péptido de quimiocina dado se pueden preparar fácilmente. Por ejemplo, las amidas del péptido de quimiocina o las variantes del péptido de quimiocina de la presente invención también se pueden preparar por técnicas bien conocidas en la materia para convertir un grupo ácido carboxílico o precursor a una amida. Un método preferido para la formación de amida en el grupo carboxilo C-terminal es escindir el péptido de un soporte sólido con una amina apropiada, o escindir en presencia de un alcohol, lo que produce un éster, seguido por aminólisis con la amina deseada.

Las sales de los grupos carboxilo de un péptido o variante de péptido de la invención se pueden preparar de la manera usual poniendo en contacto el péptido con uno o más equivalentes de una base deseada tal como, por ejemplo, un hidróxido metálico básico, por ejemplo hidróxido de sodio; una base de tipo carbonato o bicarbonato metálico tal como, por ejemplo, carbonato de sodio o bicarbonato de sodio; o una amina básica tal como, por ejemplo, trietilamina, trietanolamina y similares.

Los N-acil derivados de un grupo amino del péptido o variante de quimiocinas de péptido se pueden preparar utilizando un aminoácido protegido con N-acilo para la condensación final, o por acilación de un péptido protegido o no protegido. Los O-acil derivados se pueden preparar, por ejemplo, por acilación de un hidroxi-péptido libre o de una resina peptídica. La acilación se puede llevar a cabo usando reactivos de acilación estándares tales como haluros de acilo, anhídridos, acil imidazoles y similares. Si se desea, la N- y O-acilación se pueden llevar a cabo juntas.

La formil-metionina, piroglutamina y trimetil-alanina pueden estar sustituidas en el residuo N-terminal del péptido o variante del péptido. Otras modificaciones amino-terminales incluyen las modificaciones con aminooxipentano (véase Simmons et al., Science, 276, 276 (1997)).

Además, se puede modificar la secuencia de aminoácidos de un péptido de quimiocina de modo de producir una variante del péptido de quimiocina. La modificación incluye la sustitución de al menos un residuo de aminoácido en el péptido por otro residuo de aminoácido, que incluye las sustituciones que utilizan la forma D en lugar de la L, así como también otros análogos de aminoácidos bien conocidos, por ejemplo aminoácidos no naturales tales como aminoácidos \alpha,\alpha-disustituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico y similares. Estos análogos incluyen fosfoserina, fosfotreonina, fosfotirosina, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato; ácido hipúrico, ácido octahidroindol-2-carboxílico, estatina, ácido 1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, penicilamina, ornitina, citrulina, \alpha-metil-alanina, para-benzoil-fenilalanina, fenilglicina, propargilglicina, sarcosina, \varepsilon-N,N,N-trimetillisina, \varepsilon-N-acetillisina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, \omega-N-metilarginina y otros aminoácidos similares e iminoácidos y terc-butilglicina.

Uno o más de los residuos del péptido se pueden modificar, siempre que la variante de péptido sea biológicamente activa. Por ejemplo, para las variantes del péptido 3[MCP-1], por ejemplo, Ser_{7}péptido 3(1-12)[MCP-1], se prefiere que la variante tenga al menos aproximadamente 10% de la actividad biológica del correspondiente péptido no variante, por ejemplo un péptido que tiene SEQ ID NO:1. Se prefieren las sustituciones conservadoras de aminoácidos, por ejemplo aspártico-glutámico como aminoácidos ácidos; lisina/arginina/histidina como aminoácidos básicos; leucina/isoleucina, metionina/valina, alanina/valina como aminoácidos hidrófobos; serina/glicina/alanina/treonina como aminoácidos hidrófilos. La sustitución conservadora de aminoácidos también incluye agrupamientos basados en las cadenas laterales. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadena lateral alifática es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales hidroxil-alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptofano; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Por ejemplo, es razonable esperar que el reemplazo de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tenga un mayor efecto sobre las propiedades de la variante del polipéptido resultante. Si un cambio de aminoácido produce un péptido funcional se puede determinar fácilmente
al analizar la actividad específica de la variante de péptido. Los ensayos se describen con detalle en la presente.

Las sustituciones conservadoras se muestran en la Figura 13 bajo el título de ejemplos de sustituciones. Las sustituciones más preferidas están bajo el título de sustituciones preferidas. Después de introducir las sustituciones, las variantes se analizan para determinar la actividad biológica.

Las sustituciones de aminoácidos que se incluyen dentro del alcance de la invención, en general, se obtienen por selección de sustituciones que no difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto peptídico en el área de la sustitución, (b) la carga o carácter hidrófobo de la molécula en el sitio blanco o (c) la masa de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos basados en propiedades de cadena comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6) aromáticos; trp, tyr, phe.

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La invención también prevé variantes de péptidos con sustituciones no conservadoras. Las sustituciones no conservadoras suponen el intercambio de un miembro de una las clases descritas anteriormente por otro.

Las sales de adición de ácidos del péptido o variante de péptido o de residuos amino del péptido o variante de péptido se pueden preparar poniendo en contacto el péptido o amina con uno o más equivalentes del ácido inorgánico u orgánico deseado, tal como, por ejemplo, ácido clorhídrico. Los ésteres de los grupos carboxilo de los péptidos también se pueden preparar por cualquiera de los métodos usuales métodos conocidos en la técnica.

Además, también se prevé que los agentes de la invención, por ejemplo, los péptidos de quimiocina, se modifiquen de una manera que incremente su estabilidad in vivo, por ejemplo su vida media o biodisponibilidad. Estos agentes modificados se denominan "derivados". Los métodos para preparar dichos derivados son bien conocidos en la técnica. Un método para estabilizar péptidos es preparar derivados que son péptidos ciclados (véase EPA 471.453 (enlaces amida), tales como los que existen entre las cadenas laterales de lisina y ácido aspártico; EPA 467.701 (enlaces disulfuro); EPA 467,699 (enlaces tioéter). Otras modificaciones que pueden aumentar la estabilidad in vivo se describen en Jameson et al. (Nature, 368.744 (1994)); Patente Estadounidense No. 4.992.463; Patente Estadounidense No. 5.596.078 y Patente Estadounidense No. 5.091.396. Una realización preferida de la invención es un péptido o variante de quimiocina que ha sido ciclado por adición de uno o más residuos de cisteína a los extremos N y/o C-terminales del péptido, así como también péptidos que se construyen a partir de la secuencia inversa (es decir, lectura desde el extremo C-terminal al N-terminal) de aminoácidos en forma D. Una realización más preferida de esta invención es un péptido que está ciclado y construido con la secuencia inversa de los aminoácidos en forma D, es decir un derivado de CRD.

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C. Análogos de quimiocinas

Los análogos de quimiocinas tienen propiedades análogas a las del péptido correspondiente. Estos análogos se pueden denominar "miméticos del péptido" o "peptidomiméticos" (Fauchere, J. (1986) Adv. Dru Res., 15:29; Veber y Freidinger (1985) TINS p. 392; y Evans et al. (1987) J. Med. Chem, 30:1229, que se incorporan en la presente por referencia) y se pueden desarrollar con ayuda de un modelo molecular computarizado. Estos análogos incluyen estructuras que tienen una o más uniones peptídicas opcionalmente reemplazadas con una unión seleccionada del grupo que consiste en:

-CH_{2}NH-, -CH_{2}S-, -CH_{2}-CH_{2}-, -CH=CH-(cis y trans), -CH=CF-(trans), -COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2}-, y -CH_{2}SO-, por métodos conocidos en la técnica y descritos adicionalmente en las siguientes referencias: Spatola, A. F. en "Chemistry and Biochemistry of Aminoacids, Peptides and Proteins", B. Weinstein, eds. Marcel Dekker, New York, P. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Val. 1, Issue 3, "Peptide Backbone Modifications" (revisión general); Morley, J. S., Trends Pharm. Sci. (1980) pp. 463-468 (revisión general); Hudson, D. et al., Int. J. Pept. Prot. Res. (1979) 14:177-185 (-CH_{2}NH-, CH_{2}CH_{2}-); Spatola, A. F. et al., Life Sci. (1986) 38: 1243-1249 (-CH_{2}-S); Hann, M. M., J. Chem. Soc. Perkin Trans I (1982) 307-314 (-CH-CH-, cis y trans); Almquist, R. G. et al., J. Med. Chem. (1980) 23:1392-1398 (-COCH_{2}-); Jennings-White, C. et al., Tetrahedron Lett. (1982) 23:2533 (-COCH_{2}-); Szelke, M. et al. European Appln. EP 45665 (1982) CA; 97:39405 (1982) (-CH(OH)CH_{2}-); Holladay, M. W. et al., Tetrahedron Lett. (1983) 24:4401-4404 (-C(OH)CH_{2}-); y Hruby, V. J., Life Sci. (1982) 31: 189-199 (-CH_{2}S-); cada uno los cuales se incorpora en la presente por referencia. Una unión no peptídica particularmente preferida es -CH_{2}NH-. Tales análogos pueden tener mayor estabilidad química, mejores propiedades farmacológicas (vida media, absorción, potencia, eficacia, etc.), especificidad alterada (por ejemplo, un amplio espectro de actividades biológicas), antigenicidad reducida y ser de preparación económica. La marcación de análogos usualmente incluye la unión covalente de uno o más marcadores, en forma directa o a través de un espaciador (por ejemplo, un grupo amida), a posiciones no interferentes en el análogo que son predichas por los datos de actividad estructural cuantitativa y/o modelado molecular. Tales posiciones no interferentes en general son posiciones que no forman contactos directos con las macromoléculas a las que se une el análogo para producir el efecto terapéutico. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) también se pueden usar para generar péptidos más estables.

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1. Isósteros de tripéptidos de quimiocinas (un compuesto de fórmula (IV))

Un compuesto de fórmula (IV), donde Z=CH_{3}; R=indolilo; Y=O; y X-CH_{3}, se puede preparar a partir de N-tBOC-NinBOC-L-triptofano-OH y ciclohexenona. Por ejemplo, se puede hacer reaccionar 2-ciclohexen-1-ona (Aldrich C10,281-4) con dimetilcuprato de litio en presencia de cloruro de trimetilsililo (Aldrich 38,652-9) (Reacción 1) para atrapar el enolato intermediario. Se prepara dimetilcuprato de litio a partir de metillitio y una sal de cobre (I) con una estequiometría 2:1, antes de usar en la reacción, por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, House et al, J. Ors. Chem., 40, 1460 (1975)). Se describe la adición de cetonas \alpha,\beta-insaturadas con organocupratos, por ejemplo, en House et al., J. Org. Chem., 31, 3128 (1966). De modo similar, la captura del enolato con cloruro de trimetilsililo se describe en House et al., J. Org. Chem., 36, 2361 (1971). El enolato atrapado posteriormente se resuelve al \alpha-yododerivado, por ejemplo, por adición de yodo molecular en presencia de acetoxi-plata y fluoruro de tetrabutilamonio, de acuerdo con el método de Rubottom (J. Ore. Chem., 44, 1731 (1979)) para dar la ciclohexanona trans-disustituida de fórmula (VI),

13

La conversión del yoduro de fórmula (VI), a un alcohol secundario, y la formación de un éster, por ejemplo, con anhídrido acético produce un compuesto de fórmula (VIIb).

14

Un compuesto de fórmula (VIIb) se puede preparar en forma alternativa por conversión del anterior enolato del éter trimetilsilílico a la \alpha-hidroxicetona seguido por formación del éster, usando procedimientos que son bien conocidos en la técnica.

Un compuesto de fórmula (VIIb) se puede alquilar, por ejemplo, con bromuro de vinil magnesio en condiciones estándares, y deshidratarse (por ejemplo, en presencia de yodo molecular y calor) para dar un dieno de fórmula (VIII):

15

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La reacción de Diels-Alder entre el dieno de fórmula a (VIII) y acrilato de etilo (Aldrich E970-6) proporciona un producto estereoespecífico y regioespecífico de fórmula IX. Por ejemplo, se puede realizar la reacción de ciclación mezclando el compuesto de fórmula (VIII) y acrilato de etilo en un tubo sellado y calentando, esencialmente como se describe en Green et al. (Adv, Pest Control Res., 3, 129 (1960)).

16

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La ruptura oxidativa del doble enlace en un compuesto de fórmula (IX) proporciona un diácido de fórmula (X). Tal ruptura oxidativa se puede llevar a cabo apropiadamente por ozonólisis o por oxidación con un cromato ácido. Por ejemplo, usando CrO_{3} en ácido, se puede preparar el compuesto de fórmula (X), esencialmente como se describe en Eschenmoser & Winter, Science, 196, 1410 (1977).

17

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La activación del diácido con POCl_{5} y la posterior reacción con dietilamina da una diamida de fórmula (XI).

18

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La hidrólisis del grupo acetoxi de un compuesto de fórmula (XI) seguida de formación del mesilato (u otro grupo saliente) y la adición de yoduro de sodio en THF produce un compuesto de fórmula (XIb).

19

La reacción de un compuesto de fórmula (XI) y un compuesto de fórmula (XII) en presencia de carbonato de potasio anhidro en DMF seco, esencialmente como se describe en Lygo y Rudd (Tetrahedron Lett, 36, 3577 (1995)) seguida de eliminación de la sulfona, por ejemplo, usando Sml_{2}, proporciona un compuesto de fórmula (XII) que se puede desproteger y acilar para dar un compuesto de fórmula (IV) donde R^{2} y R^{3} son NMe_{2}.

20

Un intermediario de fórmula (XII) se puede preparar apropiadamente a partir de un triptofano protegido (por ejemplo, N-\alpha-tBOC-N_{in}tBOC-L-triptofano-OH; Novabiochem 04-12-0201) por reacción con el dianión derivado de la fenilmetilsulfona.

21

Ar= N-tBOC-indolilo.

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Una síntesis preferida para un compuesto de fórmula (IV) es:

22

Los derivados de tiocetona (Y=S) se pueden sintetizar por inserción de una reacción adicional, en la que el derivado de \beta-cetosulfona del triptofano protegido se convierte al derivado de tiocetona. Por ejemplo, la reacción con un ditiol, tal como 1,2-etanoditiol, forma un tioacetal que se puede hidrolizar en presencia de H_{2}S en condiciones anhidras, para producir la tiocetona. La conversión también se puede llevar a cabo usando [2,4-bis(4-metoxi-fenilo)-1,3-ditia-2,4-difosfetano-2,4-disulfuro] (reactivo de Lawesson). La reacción del derivado de tiocetona con el compuesto de fórmula (XI) proporciona un compuesto de fórmula (I) donde Y=S.

23

Los sustituyentes arilo diferentes de indolilo requieren la preparación de derivados de \beta-cetosulfona adecuadamente protegidos del aminoácido apropiado. Cuando el aminoácido está fácilmente disponible, la reacción se puede realizar usando el aminoácido apropiado protegido con tBOC o Fmoc (fenilalanina y tirosina, respectivamente), por ejemplo, de Novabiochem. Cuando el aminoácido no está disponible con facilidad (por ejemplo, R=cumarilo), el aminoácido adecuadamente protegido primero se debe preparar por métodos bien establecidos en la técnica para la síntesis de aminoácidos no estándares (por ejemplo, véase Yuan y Hruby, Tetrahedron Lett., 38, 3853 (1997)).

Como se ilustra a continuación, un compuesto de fórmula (V) se puede preparar apropiadamente a partir de un éster de fórmula 13. La desprotonación con diisopropilamiduro de litio seguida de alquilación con el bromuro 14 proporciona un compuesto de fórmula 15. La reducción selectiva del éster, por ejemplo con hidruro de diisobutilamonio, proporciona un aldehído de fórmula 16, que se puede convertir al difluoroalqueno 17 por una reacción de Wittig con PPh_{3}=CF_{2} (Hayashi et al., Chemistry Letters, 1980, páginas 935-938)

El aldehído 18 se puede convertir al bromuro 19 usando un procedimiento similar al que se describe en Visweswariah et al., Synthesis, 1982, páginas 309-310, por tratamiento con tribromuro de feniltrimetilamonio, seguido de formación del acetal en condiciones estándares. La conversión del bromuro al correspondiente alquillitio por tratamiento con n-butillitio, seguido de reacción con el difluoruro 17, produce un compuesto de fórmula 20 (Chemistry Letters, 1980, páginas 935-940). La desprotección en condiciones ácidas proporciona el aldehído 21, que se puede hacer reaccionar con PPh_{3}=CF_{2} para dar el trifluoruro 22. El posterior tratamiento de 22 con el alquillitio derivado del bromuro 23 produce un compuesto de fórmula (V). Será entendido por los expertos en la técnica que se puede utilizar una variedad de otros grupos protectores conocidos en los procedimientos anteriores y que se pueden preferir ciertos grupos protectores respecto de otros que dependen de la estructura de los grupos R_{4}-R_{8}.

24

Se pueden identificar otros análogos de quimiocinas útiles por los métodos que se describieron anteriormente en la presente. En particular, los análogos de quimiocinas que son biodisponibles por vía oral, y se prefieren inhibidores estables y potentes de la actividad de quimiocinas.

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D. Direccionamiento del agente terapéutico

Los péptidos de quimiocina, sus variantes, análogos o derivados se pueden dirigir a un sitio terapéutico específico por la unión del agente terapéutico a un resto que en forma específica se une a un componente celular, por ejemplo anticuerpos o sus fragmentos, lectinas, transferrina (para dirigir al hígado) y fármacos de moléculas pequeñas, de modo de formar un conjugado terapéutico. El direccionamiento de los agentes terapéuticos de la invención puede producir un aumento de concentración del agente terapéutico en una ubicación anatómica específica. Más aún, la unión de un agente terapéutico de la invención a un resto de unión puede incrementar la estabilidad del agente terapéutico in vivo. Por ejemplo, un mimético anti-CD4 que se une al receptor CD4 se puede unir a un agente terapéutico de la invención de modo de producir un conjugado terapéutico, una porción del cual se une al correceptor del VIH. Esto puede mejorar la capacidad de dirigir el agente terapéutico a un tipo de célula particular y en consecuencia bloquear la infección del VIH de ese tipo celular.

Para neoplasia, pueden ser útiles anticuerpos anti-tumorales tales como NR-LU-10 (anti-carcinoma), NR-ML-5 (anti-melanoma), o anti-CD45 (anti-linfoma) para localizar el agente terapéutico a un tipo particular de tumor. Para una enfermedad infecciosa, se pueden emplear anticuerpos que reconocen un epitopo específico del patógeno, tal como mAb 17.41 (Cryptosporidium parvum). Para dirigir a las articulaciones para el tratamiento de la artritis reumatoide, los anticuerpos anti-membrana sinovial o sulfato de condroitina (por ejemplo, Catálogo No. C8035, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) se pueden unir a un agente terapéutico de la invención. Para tratar o prevenir el asma o la neumonía, pueden ser útiles anticuerpos para el epitelio bronquial para preparar inmunoconjugados para usar en los métodos de la invención.

Otros anticuerpos útiles para dirigir un agente terapéutico de la invención a un sitio específico o tipo celular específico incluyen anticuerpos específicos para los vasos sanguíneos o linfáticos (por ejemplo, Ulex europaeus-I lectina, No. de Catálogo 114754, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), coágulos o plaquetas de la sangre (por ejemplo, Nos. de Catálogo F9902, F4639, F2506, F8512, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), células T (por ejemplo, Nos. de Catálogo C7048 (CD3); C1805 (CD4); C7173 (CD5); y C7298 (CD7), Sigma Chemical Co., St, Louis, MO), cerebro (por ejemplo, Nos. de Catálogo S2644 y S2407, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), tumores (por ejemplo, No. de Catálogo C2331, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), células epiteliales (por ejemplo, Nos. de Catálogo E6011 y 01041, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), fibroblastos (por ejemplo, Nos. de Catálogo F4771 y V4630, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), macrófagos (por ejemplo, No. de Catálogo M1919, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), lumen estomacal (por ejemplo, No. de Catálogo M5293, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), neutrófilos (por ejemplo, Nos. de Catálogo N1890 y N1765, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), tendones (por ejemplo, No. de Catálogo E4013, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), piel (por ejemplo, No. de Catálogo K4252, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) tejido o epitelio mamario (por ejemplo, No. de Catálogo C8930, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y músculo esquelético (por ejemplo, Nos. de Catálogo D8281 y D1033, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

Para preparar inmunoconjugados útiles para dirigirse a células malignas o infectadas por virus, un anticuerpo o su fragmento que tiene una especificidad para un antígeno de superficie en células malignas o infectadas por virus malignos se une a un agente terapéutico de la invención. Preferiblemente, un péptido de quimiocina o su variante se une por medio de enlaces peptídicos a las regiones carboxilo-terminales, por ejemplo, CH3, de las cadenas pesadas del anticuerpo. Los inmunoconjugados se pueden preparar por técnicas de manipulación genética, es decir, por formación de una construcción de ácido nucleico que codifica el inmunoconjugado quimérico. Preferiblemente, la construcción génica que codifica el inmunoconjugado incluye, en orientación 5' a 3', un segmento de ADN que codifica una región variable de cadena pesada, a un segmento de ADN que codifica la región constante de cadena pesada, y un segmento de ADN que codifica el péptido de quimiocina, variante de péptido, o sus repeticiones. El gen fusionado se inserta en un vector de expresión para la transfección de las células receptoras apropiadas donde se expresa. La cadena híbrida se puede combinar con una contraparte de cadena liviana (o pesada) para formar inmunoconjugados monovalentes y divalentes.

Se puede seleccionar la región constante de cadena pesada para los conjugados de alguno de los cinco isotipos: alfa, delta, épsilon, gamma o mu. Se pueden usar las cadenas pesadas o varias subclases (tales como las subclases de IgG 1-4). Las cadenas livianas pueden ser una cadena constante kappa o lambda. Las secuencias de ADN para estas regiones de la inmunoglobulina son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Gillies et al., J. Immunol. Meth., 125, 1.91 (1989)).

En realizaciones preferidas, la región variable deriva de un anticuerpo específico para el antígeno blanco (un antígeno asociado con una célula enferma tal como una célula cancerosa o célula infectada con un virus), y la región constante incluye los dominios CH1, CH2 y CH3. El gen que codifica el péptido o variante de quimiocina se une, por ejemplo, con ligadores apropiados, por ejemplo, por el ADN que codifica (Gly_{4}-Ser)_{3} en marco al extremo 3' del gen codificador de la región constante (por ejemplo, exón de CH3), sea en forma directa o a través de una región intergénica. En ciertas realizaciones, la región intergénica puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de ruptura proteolítica. Este sitio, interpuesto entre la inmunoglobulina y el péptido o variante de quimiocina, se puede diseñar para proporcionar la liberación proteolítica del péptido o variante de quimiocina en el sitio blanco. Por ejemplo, es bien conocido que la plasmina y la tripsina escinden después de los residuos de lisina y arginina en los sitios que son accesibles a las proteasas. Son bien conocidas muchas otras endoproteasas específicas de sitio y las secuencias de aminoácidos que ellas atacan.

La construcción de ácido nucleico puede incluir promotor y potenciador endógeno para el gen codificador de la región variable para regular la expresión de la cadena de inmunoglobulina quimérica. Por ejemplo, se pueden obtener genes que codifican la región variable como fragmentos de ADN que comprenden el péptido líder, el gen VJ (regiones variables reorganizadas funcionalmente (V) con segmento de unión (J)) para la cadena liviana o el gen VDJ para la cadena pesada, y el promotor y potenciador endógeno para estos genes. En forma alternativa, el gen codificador para la región variable se puede obtener en forma separada de los elementos reguladores endógenos y se usa en un vector de expresión que proporciona estos elementos.

Los genes de la región variable se pueden obtener por procedimientos de clonación de ADN estándares de las células que producen el anticuerpo deseado. La identificación de la biblioteca genómica para una región variable reorganizada funcionalmente específica se puede lograr con el uso de las sondas de ADN apropiadas tales como segmentos de ADN que contienen la secuencia de ADN de la región J y las secuencias corriente abajo. La identificación y la confirmación de los clones correctos se logran por secuenciación de ADN de los genes clonados y la comparación de la secuencia con la secuencia correspondiente del ARNm de longitud completa, apropiadamente empalmado.

Los genes que codifican regiones variables apropiadas se pueden obtener generalmente a partir de células linfoides productoras de Ig. Por ejemplo, se pueden producir líneas celulares del hibridoma que producen Ig específicas para los antígenos asociados con el tumor o antígenos virales por técnicas estándares de hibridación de células somáticas. Estas líneas celulares productoras de IgG proporcionan la fuente de genes de la región variable en forma reorganizada funcional. Los genes de la región variable son normalmente de origen murino porque el sistema se presta para la producción de una amplia variedad de Igs de especificidad deseada.

El fragmento de ADN que contiene el gen de la región variable reorganizada funcionalmente se une a un fragmento de ADN que contiene el gen que codifica la región constante deseada (o una de sus porciones). Las regiones constantes de Ig (cadena pesada y liviana) se pueden obtener a partir de células productoras de anticuerpos por técnicas de clonación génicas estándares. Los genes para las dos clases de cadenas livianas humanas y las cinco clases de cadenas pesadas humanas se han clonado y, en consecuencia, las regiones constantes de origen humano están disponibles con facilidad a partir de estos clones.

El gen fusionado que codifica la cadena de IgH híbrida se ensambla o inserta en vectores de expresión para la incorporación en una célula receptora. La introducción de la construcción génica en vectores plásmidos se puede lograr por procedimientos de empalme génico estándar.

La cadena de IgH quimérica se coexpresa en la misma célula con una correspondiente cadena L de modo de expresar y ensamblar simultáneamente una inmunoglobulina completa. Para este fin, las construcciones de cadena pesada y liviana se pueden colocar en vectores iguales o separados.

Las líneas celulares receptoras son generalmente células linfoides. La célula receptora preferida es un mieloma (o hibridoma). Los mielomas pueden sintetizar, ensamblar y secretar inmunoglobulinas codificadas por genes transfectados y pueden glicosilar el polipéptido. Una célula receptora particularmente preferida es el mieloma Sp20 que normalmente no produce inmunoglobulina endógena. Cuando se transfecta, la célula producirá solo Ig codificada por las construcciones génicas transfectadas. Los mielomas transfectados se pueden cultivar en cultivo o en el peritoneo de ratones, en donde se puede recuperar el inmunoconjugado secretado del fluido ascítico. Otras células linfoides tales como los linfocitos B se pueden usar como células receptoras.

Existen varios métodos para transfectar células linfoides con vectores que contienen las construcciones de ácidos nucleicos que codifican la cadena de Ig quimérica. Una manera preferida de introducir un vector en células linfoides es por fusión de esferoblastos (véase Gilles et al, Biotechnol., 7, 798-804 (1989)). Los métodos alternativos incluyen electroporación o precipitación con fosfato de calcio.

Otros métodos útiles para producir los inmunoconjugados incluyen la preparación de una secuencia de ARN que codifica la construcción y su traducción en un sistema in vivo o in vitro apropiado.

Los métodos para purificar inmunoglobulinas recombinantes son bien conocidos. Por ejemplo, un método bien conocido para purificar anticuerpos incluye la purificación de proteína A debido a la propensión de la proteína A para unir la región Fc de los anticuerpos. La actividad de unión al antígeno de los inmunoconjugados purificados posteriormente se pueden medir por métodos bien conocidos en la técnica, tales como los descritos en Gillies et al. (J. Immune]. Methol., 125, 191 (1989)). Por ejemplo, se puede determinar la actividad del inmunoconjugado usando placas recubiertas con antígeno con una unión directa o formato de ensayo de competencia.

En particular, se prefiere preparar los anticuerpos humanizados y posteriormente analizar su capacidad para unirse al antígeno. Los métodos para determinar la capacidad de los anticuerpos humanizados para unirse al antígeno se pueden lograr por alguno de los numerosos métodos conocidos para ensayar la afinidad antígeno-anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo murino NR-LU-13 se une a una glicoproteína de aproximadamente 40 kilodalton que se expresa en numerosos carcinomas. Este antígeno se ha caracterizado en Varki et al., Cancer Res., 44, 681 (1984); Okabe et al., Cancer Res., 44, 5273 (1989). En consecuencia, es de rutina analizar la capacidad de los anticuerpos humanizados para unirse al antígeno NR-LU-13. Más aún, los métodos para evaluar la capacidad de los anticuerpos para unirse a los epitopos de este antígeno son conocidos.

Los anticuerpos humanizados (o sus fragmentos) son herramientas útiles en los métodos con fines terapéuticos. Cuando se determinan los criterios para emplear anticuerpos humanizados o conjugados de anticuerpos para la administración in vivo con fines terapéuticos, es deseable que la relación de direccionamiento obtenible sea alta y que la dosis absoluta del agente terapéutico aplicada al tumor sea suficiente para inducir una respuesta tumoral significativa. Los métodos para utilizar los anticuerpos humanizados se pueden hallar, por ejemplo, en las patentes Estadounidenses Nos. 4.877.868, 5.175.343, 5.213.787, 5.120.526, y 5.202.169.

Para dirigirse a las células del músculo liso vascular (VSMC), se pueden emplear proteínas de unión a VSMC, por ejemplo polipéptidos o carbohidratos, proteoglicanos y similares, que están asociados con las membranas celulares de las células del músculo liso vascular para preparar conjugados terapéuticos. En una realización preferida, el resto de unión se ejemplifica con proteoglicanos de tipo sulfato de condroitina (CSPG) sintetizados por las células del músculo liso vascular y pericitos, y se prefiere especialmente una porción diferenciada (denominada epitopo en la presente) de la molécula de CSPG que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 250 kD. El blanco de 250 kD es una glicoproteína unida por N que es un componente de un complejo de proteoglicanos más grande de 400 kD. En una realización actualmente preferida de la invención, se proporciona una proteína de unión al tejido muscular liso vascular con un anticuerpo monoclonal NR-AN-01 (un subcultivo de NR-ML-05) que se une a un epitopo de una molécula blanco CSPG del músculo liso vascular monoclonal denominada NR-ML-05, que según se ha informado se une a una CSPG de 250 kD sintetizada por las células del melanoma (Morgan et al, Pat. Estadounidense No. 4.897.255), también se ha informado que las células de músculo liso y los pericitos sintetizan una CSPG de 250 kD así como también otras CSPG. Se ha descrito la unión de NR-ML-05 a células de músculo liso (Fritzberg et al., Pat. Estadounidense No. 4.879.225). El subcultivo de NR-ML-05 No. 85-41-4I-A2, congelado # A2106, se ha depositado en la American Type Culture Collection, Rockville, MD y admitido con el No. de Acceso HB-9350. NR-ML-05 es el progenitor de, y estructural y funcionalmente equivalente al, subclon NR-AN-01, que se describe en la presente. Se reconocerá que NR-AN-01 es sólo un ejemplo de proteína de unión al músculo liso vascular que específicamente se asocia con el blanco de CSPG de 400 kD y que otras proteínas de unión que se asocian con este blanco y otros epitopos en este blanco también son de utilidad en los conjugados y métodos terapéuticos de la invención.

Se reconocerá que los inventores también contemplan la utilidad de los anticuerpos monoclonales humanos o anticuerpos murinos "humanizados" como una proteína de unión al músculo liso vascular en los conjugados terapéuticos de esta invención. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal murino se puede "quimerizar" por recombinación genética de la secuencia de nucleótidos que codifica la región de Fv murina (es decir, que contiene los sitios de unión al antígeno) con la secuencia de nucleótidos que codifica una región del domino constante humano y una región Fc, por ejemplo, de una manera similar a la que se describe en la solicitud de patente europea No. 0.411.893 A2. Se reconocerá que los compañeros de unión al músculo liso vascular humanizados tienen la ventaja de reducir la inmunorreactividad del anticuerpo o polipéptido del receptor huésped, que por ende puede ser de utilidad para aumentar la semivida in vivo y reducir la posibilidad de reacciones inmunes adversas. Véase también, N. Lonberg et al. (Patentes Estadounidenses Nos. 5.625.126; 5.545.806; y 5.569.825); y Surani et al. (Patente Estadounidense No. 5.545.807).

Los péptidos de unión útiles para las realizaciones de tratamiento del cáncer de la presente invención incluyen los asociados con la membrana celular y los epitopos citoplasmáticos de las células cancerosas y similares. Estos péptidos de unión localizan la membrana superficial de las células intactas y los epitopos internos de las células alteradas, respectivamente, y liberan el agente terapéutico para la asimilación en las células blanco. Los péptidos mínimos, los compuestos orgánicos miméticos y los anticuerpos humanos o humanizados que localizan los tipos de células tumorales requeridos también son útiles como péptidos de unión de la presente invención. Tales péptidos de unión se pueden identificar y construir o aislar de acuerdo con técnicas conocidas. Los péptidos de unión preferidos de estas realizaciones de la presente invención se unen a un epitopo blanco con una constante de asociación de al menos aproximadamente 10^{-6} M.

Son bien conocidos en la técnica métodos útiles para preparar conjugados anticuerpo-péptido. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5.650.150, cuya descripción se incorpora en la presente por referencia. Los métodos de "acoplamiento" para unir el agente terapéutico mediante enlaces covalentes o no covalentes al resto dirigido incluyen compuestos químicos de entrecruzamiento y de entrecruzamiento heterobifuncionales (es decir, "ligadores") que reaccionan para formar un enlace entre los grupos reactivos (tales como grupos hidroxilo, amino, amida, o sulfhidrilo) en un agente terapéutico y otros grupos reactivos (de naturaleza similar) en la porción blanco. Este enlace puede ser, por ejemplo, un enlace peptídico, enlace disulfuro, enlace tioéster, enlace amida, enlace tioéter y similares. En un ejemplo ilustrativo, los conjugados de anticuerpos monoclonales con fármacos han sido resumidos por Morgan y Foon (Monoclonal Antibody Therapy to Cancer: Preclinical Models and Investigations, Basic and Clinical Tumor immunology, Vol. 2, Kluwer Academic Publishers, Hingham, MA) y por Uhr, J. of Immunol 133:i-vii, 1984). En otro ejemplo ilustrativo donde el conjugado contiene un agente radionúclido citostático, Patente Estadounidense No. 4.897.255, Fritzberg et al., que se incorpora en la presente por referencia, es instructivo de los métodos de acoplamiento que pueden ser de utilidad. En una realización, el conjugado terapéutico contiene una proteína de unión al músculo liso vascular acoplada en forma covalente a un péptido o variante de quimiocina. En este caso, el enlace covalente de la unión se puede formar entre uno o más grupos amino, sulfhidrilo o carboxilo de la proteína de unión al músculo liso vascular y el péptido o variante de quimiocina.

En una realización preferida de la invención, se usa un conjugado de anticuerpo en métodos de pre-direccionamiento. Esencialmente, tales métodos de pre-direccionamiento se caracterizan por una mejor relación de direccionamiento o aumento de la dosis absoluta a los sitios de la célula blanco en el diagnóstico o terapia del cáncer convencional. Una descripción general de métodos de pre-direccionamiento se puede hallar en las Patentes Estadounidenses Nos. 4.863.713, 5.578.287 y 5.630.996. Los abordajes de pre-direccionamiento típicos se resumen a continuación.

Los métodos de pre-direccionamiento son de dos tipos generales: métodos de pre-direccionamiento de tres etapas y métodos de pre-direccionamiento de dos etapas. Un protocolo de pre-direccionamiento de tres etapas incluye la administración de un conjugado resto-ligando de direccionamiento, al que se le permite localizar el sitio blanco y diluirse en la circulación. Esto es seguido por la administración de un anti-ligando que se une al conjugado resto-ligando de direccionamiento y elimina el conjugado resto-ligando de direccionamiento no unido de la sangre, así como también se une al conjugado resto-ligando de direccionamiento en el sitio blanco. En consecuencia, el anti-ligando cumple una función dual al eliminar el conjugado resto-ligando de direccionamiento no unido al sitio blanco así como también se une al sitio blanco para formar un complejo resto-ligando de direccionamiento: anti-ligando. Finalmente, se administra un conjugado agente terapéutico-ligando que exhibe rápida depuración corporal total.

Cuando el conjugado agente terapéutico-ligando en circulación entra en proximidad estrecha con el complejo resto-ligando de direccionamiento:anti-ligando unido al sitio blanco, la porción anti-ligando del complejo se une a la porción de ligando del conjugado agente terapéutico-ligando circulante, produciendo así un "sándwich" resto de direccionamiento-ligando: anti-ligando : ligando-agente terapéutico en el sitio blanco. Además, debido a que el agente terapéutico no unido se fija a un ligando de depuración rápida (más que a un resto de direccionamiento de depuración lenta, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo), está técnica proporciona disminución de la exposición no-blanco al agente activo.

En forma alternativa, los métodos de pre-direccionamiento de dos etapas eliminan la etapa de administración del anti-ligando mencionada. Estos procedimientos de "dos etapas" se caracterizan por la administración de un resto de direccionamiento-ligando o resto de direccionamiento-anti-ligando, seguida de la administración de un agente terapéutico que se conjuga con el miembro opuesto del par ligando-anti-ligando.

Como etapa opcional del método de pre-direccionamiento en dos etapas, se administra ligando o anti-ligando, diseñado en forma específica para proporcionar una función de depuración, para facilitar la depuración del resto de direccionamiento-ligando o resto de direccionamiento-anti-ligando circulantes. En consecuencia, en el abordaje de pre-direccionamiento de dos etapas, el agente de depuración no se une a la población de células blanco, sea en forma directa o a través del conjugado previamente administrado de resto de direccionamiento-anti-ligando o resto de direccionamiento-ligando unido a células blanco.

Un resto de direccionamiento en un método de pre-direccionamiento se une a una población definida de células blanco, tales como células tumorales. Los restos de direccionamiento preferidos de utilidad en este aspecto son anticuerpos (policlonales o monoclonales), tales como anticuerpos monoclonales humanos, o anticuerpos murinos "humanizados" o quiméricos. Algunos de los anticuerpos humanizados incluyen los que se producen en CHO, se producen en huéspedes tales como plantas (por ejemplo maíz, soja, tabaco y similares), insectos, mamíferos, levaduras y bacterias. Los anticuerpos humanizados pueden ser los que se unen al antígeno unido por el anticuerpo NRLU-13. Preferiblemente, el anticuerpo humanizado puede no tener glicosilación ligada a N o se ha modificado su glicosilación ligada a N después de la expresión para reducir la inmunogenicidad o toxicidad.

Los pares ligando/anti-ligando adecuados para usar en los protocolos de direccionamiento usan biotina/avidina o estreptavidina, haptenos y epitopos/anticuerpo, sus fragmentos o análogos, que incluyen los miméticos, lectinas/
carbohidratos, proteínas dedos de zinc/fragmentos de ADNsd, inhibidores de enzimas/enzimas; y sus análogos y derivados. Los ligandos y anti-ligandos preferidos se unen entre sí con una afinidad de al menos aproximadamente K_{A} \geq 10^{9}M^{-1} o K_{D} \leq10^{-9}M. Biotina/avidina o estreptavidina es un par ligando-anti-ligando preferido.

En general, dichos métodos de pre-direccionamiento preferiblemente incluyen la administración de un anti-ligando que proporciona una función de depuración. La depuración probablemente se puede atribuir al entrecruzamiento y/o agregación de conjugados que están circulando en la sangre, lo que lleva a la depuración del complejo/agregado por el RES (sistema retículo-endotelial) del receptor. La depuración anti-ligando de este tipo se logra preferiblemente con una molécula multivalente. Sin embargo, también se puede emplear una molécula univalente de tamaño suficiente para ser eliminada por el RES por sí misma.

En forma alternativa, los mecanismos de depuración basados en receptores, por ejemplo, el receptor de Ashwell u otros receptores, se pueden aprovechar por adición de residuos de hexosa, tales como residuos de galactosa o manosa, para proporcionar la depuración del anti-ligando, conjugado de anti-ligando o anticuerpo humanizado a través del hígado. Tales mecanismos de depuración son menos dependientes de la valencia del agente de depuración que los mecanismos de depuración del complejo de RES/agregado descrito anteriormente.

Por ejemplo, si el resto de direccionamiento-ligando o resto de direccionamiento-anti-ligando se ha derivatizado para proporcionar la depuración (es decir, adición de un residuo de hexosa) no debería ser necesario un agente de depuración. Los agentes de depuración preferidos se describen en las Patentes Estadounidenses Nos. 5.624.896 y 5.616.690; así como también en la publicación de solicitud de patente PCT Número WO 95/15978.

Los expertos en la técnica, en base a las enseñanzas de la presente y las aplicaciones mencionadas en la presente, pueden determinar con facilidad un protocolo efectivo de dosis terapéuticas y tratamiento. Esto dependerá de factores tales como el agente terapéutico particular seleccionado, vía de administración, el tipo de sitio(s) blanco, la afinidad del resto de direccionamiento por el sitio blanco de interés, cualquier reactividad cruzada del resto de direccionamiento con tejido normal, el estado del paciente, si el tratamiento se efectúa solo o en combinación con otros tratamientos, entre otros factores.

Por ejemplo, en el caso de los conjugados anticuerpo humanizado-avidina o estreptavidina en las estrategias de pre-direccionamiento, una dosis adecuada oscila entre aproximadamente 10 a aproximadamente 2500 mg, con más preferencia entre aproximadamente 50 a 1500 mg, y con máxima preferencia entre aproximadamente 100 a 800 mg. La dosis del conjugado ligando-agente terapéutico, generalmente varía de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 10 mg y con más preferencia de aproximadamente 0,1 a 2 mg.

En general, tales métodos de pre-direccionamiento incluyen la administración de un agente de depuración. La dosis del agente de depuración es una cantidad que es suficiente para depurar sustancialmente el conjugado previamente administrado de la circulación, es decir, al menos aproximadamente 50%, con más preferencia al menos aproximadamente 90%, y con máxima preferencia aproximadamente o 100%. En general, el agente de depuración se administra varios días después de la administración del conjugado anticuerpo humanizado-estreptavidina, con preferencia aproximadamente 1 a 5 días después, con más preferencia al menos aproximadamente 1 a 2 días después. Generalmente, la determinación de cuándo administrar el agente de depuración depende de la captación del blanco y de la depuración endógena del conjugado del resto de direccionamiento. Los agentes de depuración particularmente preferidos son los que proporcionan la depuración mediada por el receptor de Ashwell, tales como proteínas galactosiladas, por ejemplo albúmina sérica bovina biotinilada galactosilada (HSA) y agentes de depuración de molécula pequeña que contienen galactosa y biotina. En el caso de agentes de depuración basados en HSA, una dosis típica del agente de depuración variará de aproximadamente 100 a 1000 mg, y con más preferencia aproximadamente 200-500 mg. Si se administra un agente de depuración, el conjugado ligando-agente terapéutico preferiblemente se administra aproximadamente 2 a 12 horas después.

Los conjugados se pueden administrar por métodos conocidos de administración. Los métodos conocidos de administración incluyen, a modo de ejemplo, inyección intraperitoneal, inyección intravenosa, inyección intramuscular, administración intranasal, entre otros. En general se prefiere la administración intravenosa.

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III. Indicaciones que se Prestan para el Tratamiento con los Agentes de la Invención

Los agentes de la invención son útiles para tratar un mamífero afectado con, para inhibir en un mamífero el riesgo de o para aumentar en un mamífero el riesgo de, una indicación asociada con la actividad inducida por quimiocinas, tales como procesos inflamatorios aberrantes o patológicos. Las quimiocinas participan en una amplia variedad de procesos inflamatorios, tanto fisiológicos como patológicos. En consecuencia, la amplia especificidad de los inhibidores de quimiocinas puede ser útil para tratar o prevenir una amplia variedad de enfermedades inflamatorias. Más aún, el uso de inhibidores de quimiocinas diseñados en forma racional, es decir, inhibidores con especificidad relativa para varias quimiocinas, puede reducir o inhibir los efectos secundarios asociados con terapias crónicas de los inhibidores de quimiocinas de amplio espectro. En consecuencia, estos inhibidores se pueden diseñar para tratar enfermedades particulares, minimizando de este modo los efectos secundarios resultantes de la alteración de procesos fisiológicos no relacionados.

Aterosclerosis. El desarrollo de la aterosclerosis es un proceso complejo que involucra células de músculo liso, células endoteliales y células inflamatorias y, en particular, macrófagos tisulares derivados de monocitos, células B o T. Una vez que se activan las células endoteliales, expresan moléculas de adhesión importantes para la extravasación de las células inflamatorias. Por ejemplo, en el ratón carente de TGF\beta1 (-/-), la ausencia de esta citoquina produjo activación de células endoteliales. Las células endoteliales activadas expresan, entre otras moléculas de adhesión, E-selectina, P-selectina, e ICAM-1, que a su vez participan en la extravasación de leucocitos. También se expresaron potentes citoquinas proinflamatorias en los sitios de las lesiones vasculares incipientes. Se han detectado TNF-\alpha, IL-1, así como también varias quimiocinas que incluyen IL-8 y MCP-1, en niveles altos en las lesiones ateroscleróticas. Los resultados descritos anteriormente en la presente muestran que la quimiocina MCP-1 en particular cumple un papel en la inflamación vascular aterosclerótica.

En la actualidad es bien aceptado que la estabilidad aguda de las lesiones vasculares es un determinante más importante del riesgo a corto plazo, por ejemplo menos de varios años, de infarto de miocardio que la carga de placa total. El grado de infiltración de macrófagos es probablemente el determinante principal de la estabilidad relativa de la placa. Al menos dos factores contribuyen a la estabilidad de la placa: los macrófagos secretan un exceso de enzimas que degradan la matriz (tales como las metaloproteinasas de matriz) respecto de sus inhibidores, lo que produce la pérdida de matriz extracelular (ECM) en las regiones del hombro ricas en macrófagos y terminales fibrosas, una característica común de las placas inestables o rotas; y las células espumosas derivadas de macrófagos se tornan necróticas, posiblemente en respuesta a metabolitos oxidativos tóxicos de los lípidos, lo que produce una mezcla extracelular rellena de lípidos que además desestabiliza la arquitectura de pared de los vasos sanguíneos locales.

Los inhibidores de la acción de las quimiocinas, y en particular los inhibidores de MCP-1, pueden mejorar la estabilidad de la placa y, en consecuencia, reducir rápidamente el riesgo de infarto de miocardio, sin reducir necesariamente la carga de placa aterosclerótica total. En particular, los agentes de la invención pueden reducir la formación de lesión por lípidos y/o avance de la lesión por lípidos así como también incrementar la estabilidad de la placa (Boring et al., Nature, 394, 894 (1998)). En consecuencia, los agentes de la invención, por ejemplo el péptido 3(1-12) [MCP-1] (SEQ ID NO:1), KQK, el péptido 3[7-12] (SEQ ID NO:9), así como también sus variantes, por ejemplo Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:14) o derivados, pueden ser útiles para tratar y/o prevenir la angina de pecho inestable, la aterosclerosis, así como otras enfermedades caracterizadas por vasculitis local o sistémica, así como los síntomas y enfermedades que se producen en forma secundaria a la inflamación de la pared del vaso tal como infarto de miocardio.

Además, los agentes de la invención también son útiles en combinación con agentes hipolipemiantes, tales como las estatinas, o agentes que elevan la TGF-beta (véase, por ejemplo, WO 96/40098, cuya descripción se incorpora en la presente por referencia).

Osteoporosis. La densidad mineral ósea baja, a menudo categorizada como osteoporosis, proviene de un desequilibrio entre el depósito de matriz ósea por los osteoblastos y su subsiguiente resorción por los osteoclastos. El equilibrio entre estos dos procesos dinámicos determina la densidad ósea. Una estrategia para aumentar la densidad ósea ha sido el uso de análogos de tamoxifeno, tales como raloxifeno, que simulan los efectos de los estrógenos en el hueso y, en consecuencia, promueven la diferenciación osteoblástica (aumento del depósito de matriz ósea) e inhiben el reclutamiento de osteoclastos (disminución de la resorción). Una estrategia alternativa es reducir la resorción de matriz al inhibir directamente el mecanismo por el que los osteoclastos se reclutan en el hueso. La medición de los productos de degradación de la matriz ósea (tales como los telopéptidos N-terminales y C-terminales del colágeno así como entrecruzamientos de piridinio) en plasma y orina confirman que la resorción ósea está aumentada en la osteoporosis, y en consecuencia la inhibición de la actividad osteoclástica probablemente demuestre ser una estrategia terapéutica efectiva.

A diferencia de los osteoblastos, que se derivan localmente, los osteoclastos se reclutan continuamente en el hueso como células precursoras que circulan en la fracción de monocitos, y que pueden ser idénticos a los monocitos. Una vez reclutados, los precursores se diferencian en osteoclastos que posteriormente resorben matriz hasta que mueren por apoptosis. En consecuencia, se puede regular rápidamente la cantidad de osteoclastos en el tejido óseo (y en consecuencia la actividad osteoclástica) modulando el proceso de reclutamiento de osteoclastos.

En la actualidad diversas líneas de evidencia sugieren que el reclutamiento de monocitos en el hueso es un paralelo molecular del reclutamiento de monocitos patológico en la pared de los vasos sanguíneos que ocurre durante la aterogénesis. En particular, la quimiocina MCP-1 está implicada en ambos procesos. De este modo, los inhibidores de MCP-1 pueden actuar para reducir el reclutamiento y en consecuencia reducir el reclutamiento de osteoclastos y/o disminuir la cantidad de células que se diferencian en osteoclastos, lo que podría originar un aumento rápido de la densidad ósea, por ejemplo, durante un período de semanas más que años. La capacidad de los presentes agentes terapéuticos para aumentar la densidad ósea contrasta con los fármacos existentes que previenen una reducción adicional de la densidad ósea pero no aumentan la densidad ósea. En consecuencia, el péptido 3, por ejemplo el péptido 3(7-12)[MCP-1], y sus variantes (por ejemplo, Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(1-12)[MCP-1]) y derivados (por ejemplo, CRD-Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(3-12)[MCP-1]) pueden ser útiles para inhibir o prevenir la densidad ósea baja. En particular, los derivados con especificidad por las quimiocinas CC, tales como CRD-Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(3-12)[MCP-1], son agentes preferidos para el tratamiento de la osteoporosis.

Infección por VIH y SIDA. Además del receptor de CD4, se requieren moléculas de superficies celulares adicionales (denominadas correceptores) para la infección productiva de una célula por aislados de VIH. Los aislados de VIH se pueden dividir en dos subtipos, que dependen de si pueden infectar los monocitos/macrófagos (cepas con tropismo M) o linfocitos T auxiliares (cepas con tropismo T). Los experimentos con ligandos de quimiocinas sugieren que los receptores de quimiocinas actúan como correceptores del VIH: MIP1\alpha y RANTES inhibieron la infección de los monocitos con cepas con tropismo M (pero sin infección de las células T por cepas con tropismo T), mientras que SDF-1 inhibió la infección de las células T (pero no la infección de los monocitos). Otros análisis moleculares confirmaron que el receptor CCR-5 de MIP1\alpha/RANTES es el correceptor de VIH en los monocitos mientras que el receptor CXCR-4 de SDF-1 (también denominado LESTR y fusina) es el correceptor de las células T. En la infección temprana, predomina el virus con tropismo M, un virus que no es formador de sincicio, menos virulento y no elimina células T. En un tiempo posterior, la selección favorece la conversión a la cepa con tropismo T formadora de sincicio, más virulenta, una cepa que elimina las células T ayudantes y lleva a la inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Es posible que los viriones puedan usar otros receptores de quimiocinas, aunque con menor eficiencia. En consecuencia, para proporcionar un agente efectivo para inhibir el VIH, el agente preferiblemente inhibe la unión del virus a más de un receptor, es decir, un agente debería tener una amplia especificidad por los receptores de quimiocinas.

Los estudios genéticos han identificado una mutación de CCR5 que vuelve a los individuos esencialmente inmunes a la infección con VIH. Esta mutación, denominada CCR5\Delta32, produce un ARNm truncado para CCR-5. La expresión de la CCR-5 truncada no produce ninguna proteína CCR-5 detectable en la superficie de la célula. Se ha informado que los individuos homocigotos para esta deficiencia son completamente resistentes a la infección con VIH, aun bajo la exposición a un estímulo viral extremadamente alto, si bien existe actualmente un único informe de un individuo mutante homocigoto seropositivo para la infección por VIH. En consecuencia, estas observaciones demuestran que el bloqueo efectivo del receptor de CCR-5 puede prevenir efectivamente la infección. Además, la señalización de quimiocinas mediada por CCR-5 no tiene un papel crucial en la fisiología normal, ya que los homocigotos de CCR-5\Delta32 no tienen un fenotipo detectable diferente de la resistencia al VIH.

En consecuencia, los inhibidores de los receptores de quimiocinas, tales como el péptido 3, sus variantes, análogos o derivados, pueden inhibir la infección por VIH ya que estos agentes tienen especificidad amplia. Como se describe más adelante en la presente (Ejemplo 5), el péptido 3[MCP-1] inhibió la unión del VIH y la infección de las células Jurkat y macrófagos. Un agente preferido para prevenir o inhibir la infección y/o replicación del VIH es el CRD-Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(3-12)[MCP-1]. En particular, el péptido 3, sus variantes, análogos o derivados, por ejemplo CRD-Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11} péptido 3(3-12)[MCP-1], puede ser especialmente útil para inhibir la infección de las cepas con tropismo M del VIH.

El péptido 2, sus variantes, análogos o derivados, también son útiles para prevenir o inhibir la infección y/o replicación del VIH, ya que el péptido 2 inhibió la replicación del VIH en células T y macrófagos. Los agentes terapéuticos preferidos tiene unión a Duffy reducida y afinidad por el correceptor aumentada (en al menos aproximadamente el intervalo de nM) (véase el Ejemplo 5) respecto de la correspondiente quimiocina o péptido que tiene la secuencia nativa o de tipo silvestre. Preferiblemente, el péptido 2, sus variantes, análogos o derivados, por ejemplo los derivados LRD, son útiles para inhibir las cepas con tropismo T del VIH.

En consecuencia, una combinación del péptido 3, sus variantes, análogos o derivados, y el péptido 2, sus variantes, análogos o derivados, puede ser particularmente útil para prevenir o tratar la infección por VIH.

En consecuencia, estos agentes son útiles para el tratamiento, así como la prevención, de los pacientes seropositivos para VIH y del avance de los pacientes seropositivos al SIDA, cuando se usan, sean solos o combinados, o combinados con otras terapias antivirales. Cuando se usan combinados, se prefiere que un individuo infectado sea pretratado con inhibidores virales (tales como un cóctel de transcriptasa inversa e inhibidores de proteasa viral) y posteriormente se administran dosis de un inhibidor de quimiocina general, preferiblemente el péptido 3, el péptido 2, sus variantes o derivados, con más preferencia el péptido 2[MIP1\alpha], sus análogos o derivados. Además, debido a que la resistencia a otras terapias (tales como los inhibidores de proteasa o inhibidores de transcriptasa inversa) surge a partir de la replicación viral, los agentes que reducen la efectividad del virus pueden aumentar drásticamente el éxito de estas terapias existentes. Específicamente, a diferencia de los blancos terapéuticos explotados actualmente tales como la transcriptasa inversa o la proteasa viral, los agonistas y/o antagonistas de quimiocinas se dirigen a la célula sensible más que al virus mismo. Si bien el virus puede mutar rápidamente para generar cepas resistentes a los agentes dirigidos al virus, las células mutan menos fácilmente y están bajo menos o ninguna presión selectiva para mutar. La medida en que se deben producir las mutaciones del virus de VIH para sortear el uso de un correceptor de quimiocina es probablemente mucho mayor que las mutaciones necesarias para convertir una transcriptasa inversa en resistente a un inhibidor de transcriptasa inversa. En consecuencia, es probable que la administración de los análogos de quimiocina demuestre ser efectiva ya sea solos o combinados con terapias dirigidas al virus. Además, los inhibidores de quimiocinas pueden tener efectos secundarios limitados in vivo, es decir, impacto fisiológico limitado, y en consecuencia tener un buen índice terapéutico cuando se usan in vivo.

Malaria. La malaria es causada por parásitos intracelulares del grupo plasmodio. El principal blanco celular del parásito es el eritrocito, y el mecanismo de infección involucra la interacción de una proteína de superficie del plasmodio y el Receptor del Antígeno Duffy para las Quimiocinas (DARC) para al menos una especie de plasmodio común, P. vivax. Los estudios han indicado que la presentación en superficie normal de DARC sobre la superficie de los eritrocitos es necesaria para la entrada del plasmodio. En consecuencia, los inhibidores de la función de DARC pueden ser agentes antimaláricos útiles. En consecuencia, el péptido 3, o preferiblemente un derivado que muestre mayor afinidad de unión al DARC tal como Ser_{7}Glu_{8}Glu_{9}péptido 3(1-12)[MCP-1] o, con más preferencia, un péptido que muestre unión a DARC de alta afinidad y no inhiba la actividad de quimiocinas tal como el péptido 2[MCP-1], péptido 2[MGSA] o péptido 2[IL-8] son ejemplos de los agentes que se incluyen en el alcance de esta invención que son útiles para la prevención y tratamiento de la malaria. El péptido 2, las variantes y derivados del péptido 2 son agentes proinflamatorios. En consecuencia, estos agentes son útiles para aumentar las respuestas inflamatorias, en particular las respuestas inflamatorias débiles que a menudo se asocian con infecciones persistentes tales como la infección parasitaria, por ejemplo los parásitos intracelulares.

Psoriasis. La psoriasis es un trastorno inflamatorio que se asocia con MCP-1 y el reclutamiento de monocitos. La aplicación tópica de un agente terapéutico de la invención, por ejemplo el péptido 3, se prefiere para prevenir o tratar la psoriasis ya que este método de administración reduce los problemas de biodisponibilidad. Los derivados de los agentes terapéuticos de la invención, por ejemplo los péptidos de CRD, que se administran por vía tópica pueden exhibir aumento de biodisponibilidad respecto de sus contrapartidas no derivatizadas.

Enfermedades autoinmunes. Las enfermedades autoinmunes, tales como la esclerosis múltiple, la enfermedad de Crohn, la artritis reumatoide y el lupus eritematoso sistémico, se caracterizan por la activación inapropiada del sistema inmune, orquestada por los leucocitos autorreactivos. Si bien aún no está claro qué factores llevan al reconocimiento inapropiado inicial de los autoantígenos, numerosas citoquinas proinflamatorias han sido implicadas en la inflamación continua que subyace a la destrucción del tejido que, a su vez, lleva a la morbilidad y mortalidad asociada con estas enfermedades. De estas citoquinas inflamatorias, se ha implicado al TNF-\alpha y a las quimiocinas (en particular MP-1\alpha).

Por ejemplo, se ha detectado una expresión elevada de MP-1\alpha en la encefalomielitis autoinmune experimental, un modelo de enfermedad autoinmune mediada por células T con algunas características comunes a la esclerosis múltiple humana. También se detectó una actividad elevada de MP-1\alpha en el líquido cefalorraquídeo de los pacientes con esclerosis múltiple. La terapia de anticuerpos para reducir los niveles de quimiocinas ha demostrado ser efectiva en modelos animales de enfermedades autoinmunes, pero este método sólo reduce los niveles de quimiocinas durante un período corto, y es poco probable que sea útil en la terapia humana. En contraste, un antagonista general de la señalización de quimiocinas es probable que suprima indefinidamente la inflamación inapropiada. En consecuencia, el péptido 3, sus derivados y variantes, pueden ser útiles para prevenir y/o tratar trastornos autoinmunes que incluyen, pero sin limitación, la diabetes tipo 1, esclerosis múltiple, artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico.

Más aún, diferentes patrones de expresión de quimiocinas pueden estar asociados con diferentes trastornos autoinmunes y en consecuencia cada enfermedad autoinmune puede requerir un derivado o variante diferente del péptido 3. Por ejemplo, MIP1\alpha puede cumplir un papel central en la esclerosis múltiple. MIP1\alpha es una quimiocina CC. En consecuencia, la administración de un agente selectivo de CC de la invención se puede usar para tratar la esclerosis múltiple (por ejemplo, Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(1-12)[MCP-1] o Ser_{7}Glu_{8}Glu_{9}péptido 3(1-12)[MCP-1]).

Curación de heridas. Después de producirse una herida, existe un proceso complejo de curación de la herida que involucra el reclutamiento y proliferación de diferentes tipos celulares, elaboración de la matriz, y aumento de la vigilancia inmune. En el feto (donde no se requiere aumento de la vigilancia inmune) este proceso de curación de heridas lleva a una restauración completa de la arquitectura del tejido normal (por ejemplo, la arquitectura dérmica normal se restaura después de una herida por incisión). En marcado contraste, en el adulto, una herida por incisión produce un proceso de curación de herida que no restaura la arquitectura dérmica normal. La matriz se elabora con cantidades en exceso y en una organización espacial inapropiada. El resultado es una cicatriz. En algunos casos, tales como en los niños después de heridas graves tales como quemaduras, las cicatrices son hipertróficas con gran exceso de depósito de matriz y en particular producen desfiguración importante.

En adultos, el riesgo de infección después de producida una herida es alto. Los leucocitos, en particular los neutrófilos, se reclutan rápidamente en el sitio de la herida, mientras que los monocitos/macrófagos aparecen varios días después de la herida, lo que produce una formación rápida de tejido granulomatoso. Estudios con anticuerpos han sugerido que las quimiocinas CXC tales como IL-8 cumplen un papel importante en la atracción de neutrófilos al sitio de la herida; y que la inhibición de la producción de IL-8 reduce la acumulación de neutrófilos y la ulterior formación de cicatrices. Los experimentos de bloqueo de quimiocinas CC han mostrado de modo similar que estas cumplen un papel en la atracción de macrófagos al sitio de la herida, y estas células también pueden promover la curación rápida a expensas de la calidad de la herida. En consecuencia, la inhibición de las quimiocinas CXC o CC, o ambas, puede producir una reducción de la reacción inflamatoria inducida por la herida, y a su vez promover un equilibrio entre la curación rápida y la buena restauración de la arquitectura dérmica.

Para prevenir o reducir la formación de cicatrices y/o mejorar la curación de heridas, una realización preferida de la invención es la aplicación tópica de un agente terapéutico de la invención que inhibe la acción de quimiocinas en el sitio de la herida. En consecuencia, se puede administrar un inhibidor de quimiocinas de amplio espectro, tal como el péptido 3(1-12)[MCP-1], Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(1-12)[MCP-1], CRDLeu_{4}-Ile_{11}péptido 3[MCP-1] o WVQ, o sus combinaciones. En forma alternativa, se puede administrar un inhibidor selectivo de IL-8, tal como KEN, o un inhibidor selectivo de MCP-1, tal como KQK, así como sus combinaciones. Además, se puede administrar una combinación de un inhibidor de amplio espectro y un inhibidor selectivo. De este modo, se pueden controlar los diversos componentes del proceso inflamatorio inducido por la herida, según corresponda, y se puede dejar que la herida se cure más lentamente (en condiciones en las que esté protegida de infecciones, por ejemplo utilizando simultáneamente antibióticos) pero con mejor recuperación de la arquitectura dérmica. Véase la Patente Estadounidense No. 5.202.118 por los métodos para determinar la eficacia de un agente para tratar o mejorar la curación de heridas.

Hipertensión. La hipertensión es un factor de riesgo para la aterosclerosis. Para determinar si un agente de la invención es útil para inhibir o tratar la hipertensión, se emplea un modelo de conejo. Los conejos blancos New Zealand se alimentan con una dieta aterogénica durante tres semanas para inducir la formación de placa. A una mitad de cada grupo de conejos se administra un agente de la invención. La coartación aórtica se crea en un grupo de conejos al enrollar una banda de Dacron alrededor de la porción media de la aorta torácica descendente (grupo estenosis). Otro grupo de conejos se somete a la técnica de banda sin constricción aórtica. Además otro grupo de conejos sirve como controles no operados. La unión de monocitos a la superficie endotelial aórtica se determina con microscopía de epifluorescencia en segmentos aórticos estándares proximales y distales a la banda. Se realiza la inmunohistoquímica usando los siguientes anticuerpos: VCAM-1, RAM11, CD11b y factor VIII. En los conejos que no recibieron el agente, las regiones hipertensivas de la aorta proximal a la estenosis, la adhesión de monocitos y la expresión de VCAM-1 endotelial están aumentadas, con espesamiento de la íntima y acumulación de macrófagos. En los conejos tratados con el agente, la adhesión de monocitos y la expresión de VCAM-1 endotelial, espesamiento de la íntima y acumulación de macrófagos están disminuidos respecto de los conejos no tratados con agente.

Tuberculosis. La infección con Mycobacterium tuberculosis es un ejemplo de una enfermedad en la que el monocito/macrófago es responsable de intentar eliminar el patógeno del tejido huésped (en este caso el pulmón) pero donde la respuesta inmune es a menudo insuficiente. Como consecuencia, aun cuando se usan antibióticos, la infección con M. tuberculosis puede persistir, en forma clínica o subclínica, en la medida que el cuerpo no puede eliminar la carga de patógeno completa.

En consecuencia, enfermedades tales como la tuberculosis son pasibles de terapia con los agentes que aumentan la reacción inmune para reclutar los monocitos adicionales al tejido blanco. Los agentes que estimulan una inflamación sistémica son menos útiles porque la inflamación sistémica tiene efectos secundarios (por ejemplo, náuseas, temperatura alta, letargo, etc.). En consecuencia, los agentes que se unen a DARC con afinidad alta, pueden ser útiles ya que estos agentes pueden aumentar una reacción inflamatoria existente pero no producen inflamación sistémica. Debido a que DARC actúa normalmente para limitar el grado de reacción inflamatoria local al secuestrar quimiocinas producidas en forma local, los agentes que reducen o bloquean la capacidad de DARC para secuestrar las quimiocinas pueden aumentar la respuesta deseada. En consecuencia, una realización de la invención es la administración de un agente de unión a DARC, por ejemplo el péptido 2[MCP-1], ya sea en forma local en los pulmones o en forma sistémica, para reducir o inhibir el secuestro de DARC de las quimiocinas. El aumento de los niveles locales de quimiocinas puede incrementar el reclutamiento de monocitos y el aumento resultante de la cantidad de macrófagos del tejido puede ayudar a la eliminación del M. tuberculosis y reducir o prevenir la infección crónica.

El agente de la invención se puede administrar solo o con más preferencia, combinado con antibióticos u otros fármacos que han demostrado inhibir el crecimiento de M. tuberculosis, pero que cuando se usan solos pueden no prevenir ni eliminar la infección crónica.

Los agentes tales como el péptido 2[MCP-1] que aumentan las reacciones inmunes existentes también pueden ser útiles para la reducción o eliminación de otras infecciones crónicas o parasitarias, por ejemplo leishmania, tripanosomas, lepra y similares.

Enfermedades mediadas por basófilos. El asma es una enfermedad caracterizada por vías respiratorias hiperreactivas e inflamación crónica resultante de un influjo de muchos tipos celulares y mediadores inflamatorios. La interacción y los efectos causales de todos los mediadores inflamatorios en el asma no están completamente comprendidos. MCP-1 puede cumplir una función en el asma a través de varias funciones efectoras diferentes tales como: reclutamiento de monocitos, reclutamiento de basófilos, reclutamiento de linfocitos, activación de monocitos o al desencadenar la liberación de histamina de los basófilos o mastocitos residentes (Bischoff et al., J. Exp. Med., 175(5), 1271 (1992)). La inhibición de estos procesos probablemente reduzca la gravedad de la enfermedad. Las enfermedades alérgicas, como el asma, se manifiestan a través de una interacción compleja de mediadores inflamatorios que incluyen monocitos/macrófagos, linfocitos y la liberación de histamina de los mastocitos y basófilos.

Un modo preferido para la administración de un agente terapéutico de la invención para tratar o inhibir los síntomas asociados con el asma es por inhalación. Ya que los eritrocitos no están normalmente presentes en el aparato respiratorio, la especificidad por DARC del agente terapéutico es menos importante para la administración al aparato respiratorio que para otros modos de administración.

Endotoxemia. La endotoxemia es una enfermedad sistémica aguda a menudo mediada por LPS, un componente principal de la pared celular de las bacterias gram-negativas. El LPS estimula la liberación de citoquinas proinflamatorias. MCP-1 y MCP-2 se expresan en la endotoxemia y ejercen sus efectos por el reclutamiento de leucocitos a los órganos blanco. La administración intraperitoneal de MCP-1 murino recombinante a ratones estimulados con MCP-1 los protegió de la letalidad endotóxica (Zisman et al., J. Clin. Invest., 99, 2832 (1997)). En consecuencia, los péptidos preferidos para usar en esta realización de la invención son los péptidos de MCP-1 y MCP-2.

Infarto de Miocardio/Isquemia Aguda. El infarto de miocardio es el resultado del cierre agudo de un vaso coronario usualmente debido a la trombosis secundaria a la ruptura de la placa aterosclerótica. El daño al miocardio adyacente y la insuficiencia cardíaca resultante son secundarios al período de isquemia y el daño causado durante el período de reperfusión. Las lesiones por reperfusión se asocian con aumento de radicales libres de oxígeno y mediadores inflamatorios. MCP-1 se regula por aumento durante el período de reperfusión y es un mediador inflamatorio clave (Kumar et al., Circulation, 90, 1427 (1994); Kumar et al., Circulation, 95, 693 (1997)). La inhibición de MCP-1 y el aporte inflamatorio resultante pueden disminuir el daño al miocardio durante la recuperación y reducir la incidencia de la insuficiencia cardíaca.

Artritis reumatoide. La artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria multisistémica que involucra principalmente las articulaciones pero también la piel, vasos sanguíneos, corazón, pulmón y músculo. La patología característica de la artritis reumatoide involucra la acumulación de infiltrado celular inflamatorio no supurativo que consiste en macrófagos y linfocitos dentro de la articulación. MCP-1 es producida tanto por las células sinoviales como por los monocitos/macrófagos de infiltración en la artritis reumatoide y se considera que contribuyen a la acumulación de las células inflamatorias dentro de la articulación. Se ha evaluado la capacidad del MCP-1 nativo y un antagonista de MCP (residuos 9-76 de la MCP-1 nativa) en el modelo MRL-Ipr de artritis crónica. El tratamiento con la antagonista MCP-1 (9-76) pero no con la MCP-1 nativa produjo una reducción de los síntomas e histopatología de la artritis crónica en este modelo (Gong et al., J. Exp. Med., 186, 131 (1997); Platerc-Zyberk et al., Immunot. Lett., 57, 117 (1997); Wilder, Clin. Rheumat., 10, 259 (1996)). En consecuencia, el péptido 3, sus variantes, análogos y derivados pueden ser especialmente útiles para tratar o prevenir la artritis reumatoide.

Anticoncepción. Los ratones carentes del receptor de quimiocinas CXCR4 exhiben letalidad embrionaria. Se ha identificado que los agentes de la invención bloquean al receptor CXCR4 (véase el Ejemplo 5) y otros receptores de quimiocinas. En consecuencia, los agentes de la invención puede ser útiles para inducir aborto o proporcionar anticoncepción. El bloqueo del receptor CXCR4 podría proveer una alternativa a los anticonceptivos tradicionales y se podrían usar después del coito.

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IV. Dosis. Formulaciones y Vías de Administración de los Agentes de la Invención

Los agentes terapéuticos de la invención, que incluyen un compuesto de fórmula (I)-(V), que incluyen sus sales, preferiblemente se administran de modo de alcanzar niveles séricos de aproximadamente 0,01 pM a aproximadamente 100 nM, con más preferencia a dosis de aproximadamente 0,01 pM a aproximadamente 5 nM, y aún con más preferencia a dosis de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 2 nM, del agente terapéutico. Para obtener estos niveles, el agente se puede administrar en dosis de al menos aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg, con más preferencia aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/kg, y aún con más preferencia aproximadamente 0,1 a aproximadamente 30 mg/kg, de peso corporal, si bien otras dosis pueden proporcionar resultados beneficiosos. La cantidad administrada variará de acuerdo con varios factores que incluyen, pero sin limitación, el agente elegido, la enfer-
medad, si se obtiene prevención o tratamiento y si el agente se modifica para la biodisponibilidad y estabilidad in vivo.

La administración de una molécula de ácido nucleico homosentido o antisentido se puede obtener mediante la introducción de células transformadas con un casete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico (véase, por ejemplo, WO 93/02556) o la administración de la molécula de ácido nucleico (véase, por ejemplo, Feigner et al., Patente Estadounidense No. 5,580,659, Pardoll et al., Immunity, 3,165 (1995); Stevenson et al., Immunol. Rev., 145; 211 (1995); Molling, J. Mel. Med., 75, 242 (1997); Donnelly et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 772, 40 (1995); Yang et al., Mal. Med. Today, 2, 476 (1996); Abdallah et al., Biol. Cell, 85, 1 (1995)). Las formulaciones farmacéuticas, dosis y vías de administración para los ácidos nucleicos se describen en términos generales, por ejemplo, en Feigner et al., supra.

La cantidad administrada de agente terapéutico se selecciona para tratar una indicación particular. Por ejemplo, para tratar la malaria, se pueden administrar dosis mayores del péptido 2, sus variantes o derivados, mientras que dosis más pequeñas del péptido 2, sus variantes o derivados, son útiles para prevenir o inhibir la infección por VIH. Los agentes terapéuticos de la invención también son pasibles de uso crónico con fines profilácticos, preferiblemente por administración sistémica.

La administración de los agentes terapéuticos de acuerdo con la presente invención puede ser continua o intermitente, por ejemplo, de acuerdo con el estado fisiológico del receptor, si el propósito de la administración es terapéutico o profiláctico, y otros factores conocidos por los profesionales expertos. La administración de los agentes de la invención puede ser esencialmente continua durante un período de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis espaciadas. Están contempladas tanto la administración local como sistémica.

Una o más formas de unidades de dosificación adecuadas que comprenden los agentes terapéuticos de la invención que, como se describe a continuación, opcionalmente se pueden formular para la liberación sostenida, se pueden administrar por una variedad de vías que incluyen oral o parenteral, que incluyen por vía rectal, bucal, vaginal y sublingual, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratorácica, intrapulmonar e intranasal. Las formulaciones, según corresponda, se pueden presentar en forma apropiada en formas de dosificación unitarias discretas y se pueden preparar por cualquiera de los métodos bien conocidos en la farmacia. Tales métodos pueden incluir la etapa de asociar el agente terapéutico con vehículos líquidos, matrices sólidas, vehículos semisólidos, vehículos sólidos finamente divididos o sus combinaciones y, posteriormente, si es necesario, introducir o dar forma al producto para el sistema de administración deseado.

Cuando los agentes terapéuticos de la invención se preparan para la administración oral, preferiblemente se combinan con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable para formar una formulación farmacéutica, o forma de dosificación unitaria. Los ingredientes activos totales en tales formulaciones comprenden de 0,1 a 99,9% en peso de la formulación. Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende que el vehículo, diluyente, excipiente y/o sal debe ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudicial para su receptor. El ingrediente activo para la administración oral puede estar presente como polvo o como gránulos; en forma de solución, suspensión o emulsión; o en una base asequible tal una resina sintética para la ingestión de los ingredientes activos a partir de una goma masticable. El ingrediente activo también se puede presentar en forma de bolo, electuario o pasta.

Las formulaciones adecuadas para la administración vaginal se pueden presentar como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, duchas, lubricantes, espumas o sprays que contienen, además del ingrediente activo, vehículos tales como los conocidos en la técnica, según sea apropiado. Las formulaciones adecuadas para la administración rectal se pueden presentar como supositorios.

Las formulaciones farmacéuticas que contienen los agentes terapéuticos de la invención se pueden preparar por procedimientos conocidos en la técnica usando ingredientes bien conocidos y fácilmente disponibles. Por ejemplo, el agente se puede formular con excipientes, diluyentes o vehículos comunes, y transformarse en comprimidos, cápsulas, suspensiones, polvos y similares. Los ejemplos de excipientes, diluyentes o vehículos que son adecuados para tales formulaciones incluyes los siguientes rellenos y expansores tales como almidón, azúcares, manitol y derivados silícicos; agentes aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, HPMC y otros derivados de celulosa, alginatos, gelatina y polivinil-pirrolidona; agentes humectantes tales como glicerol; agentes desintegrantes tales como carbonato de calcio y bicarbonato de sodio; agentes para retardar la disolución tales como parafina; aceleradores de resorción tales como compuestos de amonio cuaternario; agentes tensioactivos tales como alcohol cetílico, monoestearato de glicerilo; vehículos adsortivos tales como caolín y bentonita; y lubricantes tales como talco, estearato de calcio y magnesio y polietilenglicoles sólidos.

Por ejemplo, los comprimidos o comprimidos oblongos que contienen los agentes de la invención pueden incluir agentes amortiguadores tales como carbonato de calcio, óxido de magnesio y carbonato de magnesio. Los comprimidos oblongos y comprimidos también pueden incluir ingredientes inactivos tales como celulosa; almidón pregelatinizado, dióxido de silicio, hidroxipropilmetilcelulosa, estearato de magnesio, celulosa microcristalina, almidón, talco, dióxido de titanio, ácido benzoico, ácido cítrico, almidón de maíz, aceite mineral, polipropilenglicol, fosfato de sodio y estearato de zinc, y similares. Las cápsulas de gelatina duras o blandas que contienen un agente de la invención pueden comprender ingrediente inactivos tales como gelatina, celulosa microcristalina, lauril sulfato de sodio, almidón, talco y dióxido de titanio y similares, así como vehículos líquidos tales como polietilenglicoles (PEG) y aceite vegetal. Además, los comprimidos oblongos o comprimidos con cubierta entérica de un agente de la invención están diseñados para resistir la desintegración en el estómago y disolverse en el ambiente más neutro a alcalino del
duodeno.

Los agentes terapéuticos de la invención también se pueden formular en forma de elixires o soluciones para la administración oral apropiada o como soluciones apropiadas para la administración parenteral, por ejemplo por vías intramuscular, subcutánea o intravenosa.

Las formulaciones farmacéuticas de los agentes terapéuticos de la invención también pueden adoptar la forma de una solución o dispersión acuosa o anhidra, o en forma alternativa la forma de una emulsión o suspensión.

En consecuencia, el agente terapéutico se puede formular para la administración parenteral (por ejemplo, por inyección, por ejemplo inyección en bolo o infusión continua) y se puede presentar en una forma de dosificación unitaria en ampollas, jeringas precargadas, recipientes de infusión de volumen pequeño o en recipientes de dosis múltiples con un conservante agregado. Los ingredientes activos pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. En forma alternativa, los ingredientes activos pueden estar en forma de polvo, obtenidos por el aislamiento aséptico de sólido estéril o por la liofilización de una solución, para la reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril libre de pirógenos, antes de usar.

Estas formulaciones pueden contener vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables que son bien conocidos en la técnica previa. Es posible, por ejemplo, preparar soluciones usando uno o más disolventes orgánicos que son aceptables desde el punto de vista fisiológico, que se eligen, además del agua, de disolventes tales como acetona, etanol, alcohol isopropílico, éteres glicólicos tales como los productos comercializados con el nombre "Dowanol", poliglicoles y polietilenglicoles, ésteres de alquilo C_{1}-C_{4} de ácidos de cadena corta, preferiblemente lactato de etilo o isopropilo, triglicéridos de ácidos grasos tales como los productos comercializados con el nombre "Miglyol", miristato de isopropilo, aceites animales, minerales y vegetales y polisiloxanos.

Las composiciones de acuerdo con la invención también pueden contener agentes espesantes tales como celulosa y/o derivados de celulosa. También pueden contener gomas tales como goma xántica, de guar o carbo o goma arábiga o, en forma alternativa, polietilenglicoles, bentonas y montmorilonitas, y similares.

Es posible añadir, si es necesario, un adyuvante elegido de antioxidantes, tensioactivos, otros conservantes, formadores de película, agentes queratolíticos o comedolíticos, perfumes y colorantes. Asimismo, se pueden añadir otros ingredientes activos, sea para las enfermedades descritas o alguna otra afección.

Por ejemplo, entre los antioxidantes, se pueden mencionar t-butilhidroquinona, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado y \alpha-tocoferol y sus derivados. Las formas galénicas acondicionadas principalmente para la aplicación tópica adoptan la forma de cremas, leches, geles, dispersiones o microemulsiones, lociones espesadas en mayor o menor grado, almohadillas impregnadas, ungüentos o barras, o en forma alternativa en forma de formulaciones en aerosol en forma de spray o espuma o alternativamente en forma de torta o jabón.

Además, los agentes se adaptan bien a la formulación como formas de dosificación de liberación sostenida y similares. Las formulaciones pueden estar constituidas de modo que liberen el ingrediente activo solo o preferiblemente en una parte particular del aparato intestinal o respiratorio, en lo posible durante un período de tiempo. Los recubrimientos, envolturas y matrices protectores se pueden preparar, por ejemplo, a partir de sustancias poliméricas, tales como polilactida-glicolatos, liposomas, microemulsiones, micropartículas, nanopartículas o ceras. Estos recubrimientos, envolturas y matrices protectores son útiles para recubrir dispositivos permanentes, por ejemplo stents, catéteres, tubos de diálisis peritoneal y similares.

Los agentes terapéuticos de la invención se pueden administrar por medio de parches para la administración transdérmica. Véase la Patente Estadounidense No. 5.560.922 para ejemplos de parches adecuados para administración transdérmica de un agente terapéutico. Los parches de administración pueden comprender una capa soporte y una matriz polimérica que tiene disperso o disuelto un agente terapéutico, junto con uno o más potenciadores de la difusión cutánea. La capa soporte se puede preparar con cualquier material adecuado que sea impermeable al agente terapéutico. La capa soporte sirve como cubierta protectora para la capa matriz y también proporciona una función de refuerzo. El soporte se puede conformar de modo que la capa sea esencialmente de igual tamaño que la matriz polimérica o puede ser de mayor dimensión de modo que se pueda extender más allá del lado de la matriz polimérica o sobre el lado o lados de la matriz polimérica y posteriormente puede extenderse hacia afuera de manera que la superficie de la extensión de la capa soporte pueda ser la base para un medio adhesivo. En forma alternativa, la matriz polimérica puede contener, o formularse con, un polímero adhesivo, tal como copolímero de poliacrilato o acrilato/acetato de vinilo. Para aplicaciones a largo plazo, puede ser conveniente usar laminados de soporte microporoso y/o que dejen pasar el aire, de modo que se pueda minimizar la hidratación o maceración de la piel.

Los ejemplos de materiales adecuados para obtener la capa soporte son películas de soporte de polietileno de alta y baja densidad, polipropileno, poliuretano, cloruro de polivinilo, poliésteres tales como poli(ftalato de etileno), folios metálicos, laminados de folios metálicos de tales películas poliméricas, y similares. Preferiblemente, los materiales usados para la capa soporte son laminados de estas películas poliméricas con un folio metálico tal como papel de aluminio. En estos laminados, una película polimérica del laminado usualmente estará en contacto con la matriz polimérica adhesiva.

La capa soporte puede ser de cualquier espesor apropiado que proporcione las funciones protectoras y de soporte apropiadas. Un espesor adecuado será de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 micrómetros.

En general, los polímeros usados para formar la capa polimérica adhesiva biológicamente aceptable son los que pueden formar cuerpos configurados, paredes delgadas o cubiertas a través de las cuales los agentes terapéuticos pueden pasar a una velocidad controlada. Los polímeros adecuados son biológica y farmacéuticamente compatibles, no alergénicos e insolubles y compatibles con los fluidos o tejidos corporales con los que se pone en contacto el dispositivo. Se debe evitar el uso de polímeros solubles ya que la disolución o erosión de la matriz por la humedad cutánea puede afectar la velocidad de liberación de los agentes terapéuticos así como la capacidad de la unidad de dosificación de permanecer en el lugar para conveniencia de eliminación.

Los ejemplos de materiales para fabricar la capa de polímero adhesivo incluyen polietileno, polipropileno, poliuretano, copolímeros de etileno/propileno, copolímeros de etileno/acrilato de etilo, copolímeros de etileno/acetato de vinilo, elastómeros de silicona, especialmente los polidimetilsiloxanos de calidad medicinal, caucho de neopreno, poliisobutileno, poliacrilatos, polietileno clorado, cloruro de polivinilo, copolímeros de cloruro de vinilo-acetato de vinilo, polímeros de polimetacrilato entrecruzado (hidrogel), cloruro de polivinilideno, poli(tereftalato de etileno), caucho butilo, cauchos de epiclorohidrina, copolímeros de etileno-alcohol vinílico, copolímeros de etileno-viniloxietanol; copolímeros de silicona, por ejemplo copolímeros de polisiloxano-policarbonato, copolímeros de polisiloxano-óxido de polietileno, copolímeros de polisiloxano-polimetacrilato, copolímeros de polisiloxano-alquileno (por ejemplo, copolímeros de polisiloxano-etileno), copolímeros de polisiloxano-alquilensilano (por ejemplo, copolímeros de polisiloxano-etilensilano), y similares; polímeros de celulosa, por ejemplo metil- o etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y ésteres de celulosa; policarbonatos; politetrafluoroetileno y similares.

Preferiblemente, un polímero adhesivo biológicamente aceptable se debe seleccionar de los polímeros con temperaturas de transición vítrea por debajo de la temperatura ambiente. El polímero puede, pero no necesita obligatoriamente, tener un grado de cristalinidad a temperatura ambiente. Se pueden incorporar unidades o sitios monoméricos entrecruzados en estos polímeros. Por ejemplo, se pueden incorporar monómeros entrecruzados en polímeros de poliacrilato, que proporciona sitios para entrecruzar la matriz después de dispersar el agente terapéutico en el polímero. Los monómeros entrecruzados conocidos para los polímeros de poliacrilato incluyen ésteres de poliol polimetacrílico tales como diacrilato y dimetacrilato de butileno, trimetacrilato de trimetilolpropano y similares. Otros monómeros que proporcionan estos sitios incluyen acrilato de alilo, matacrilato de alilo, maleato de dialilo y similares.

Preferiblemente, un agente plastificante y/o humectante se dispersa en la matriz polimérica adhesiva. Los polioles hidrosolubles son generalmente adecuados para este fin. La incorporación de un humectante en la formulación permite que la unidad de dosificación absorba humedad en la superficie de la piel que a su vez ayuda a reducir la irritación cutánea y evitar que falle la capa polimérica adhesiva del sistema de administración.

Los agentes terapéuticos liberados de un sistema de administración transdérmica deben poder penetrar cada capa de la piel. A fin de incrementar la velocidad de difusión de un agente terapéutico, un sistema de administración transdérmica del fármaco en particular debe poder aumentar la permeabilidad de la capa exterior de la piel, la capa córnea, que proporciona la máxima resistencia a la penetración de las moléculas. La fabricación de parches transdérmicos de los agente terapéuticos es bien conocida en la técnica.

Para la administración al tracto respiratorio superior (nasal) o inferior por inhalación, los agentes terapéuticos de la invención se administran en forma apropiada a partir de un insuflador, nebulizador o un envase presurizado u otro medio conveniente de administrar un spray en aerosol. Los envases presurizados pueden comprender un propelente adecuado tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, se puede determinar la unidad de dosificación proveyendo una válvula para aplicar una cantidad medida.

En forma alternativa, para la administración por inhalación o insuflación, la composición puede adoptar la forma de polvo seco, por ejemplo una mezcla de polvo del agente terapéutico y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón. La composición de polvo se puede presentar en forma de dosis unitarias, por ejemplo cápsulas o cartuchos, o, por ejemplo, gelatina o envases blíster de los cuales se puede administrar el polvo con ayuda de un inhalador, insuflador o un inhalador de dosis medida.

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Para la administración intranasal, el agente terapéutico se puede administrar por medio de gotas nasales, un spray líquido, tal como por medio de un atomizador de frasco de plástico o inhalador de dosis medida. Los atomizadores típicos son Mistometer (Wintrop) y el Medihaler (Riker).

La administración local de los agentes terapéuticos de la invención también puede ser por una variedad de técnicas que administran el agente en o cerca del sitio de la enfermedad. Los ejemplos de técnicas de administración local específica o dirigida al sitio no están destinados a limitar sino a ilustrar las técnicas disponibles. Los ejemplos incluyen catéteres de administración local, tal como un catéter de infusión o permanente, por ejemplo un catéter de infusión con aguja, derivaciones y stents u otros dispositivos implantables, portadores específicos de sitios, inyección directa o aplicaciones directas.

Para la administración tópica, los agentes terapéuticos se pueden formular como es conocido en la técnica para la aplicación directa en un área blanco. Las formas convencionales para este fin incluyen vendajes de heridas, vendas recubiertas u otras coberturas de polímeros, ungüentos, cremas, lociones, pastas, jaleas, spray y aerosoles, así como en forma de pasta dentífrica y enjuagues bucales o con otras formas adecuadas, por ejemplo por medio de un condón recubierto. Los ungüentos y cremas, por ejemplo, se pueden formular con una base acuosa u oleosa con adición de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Las lociones se pueden formular con una base acuosa u oleosa y en general también contendrán uno o más agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes espesantes o agentes colorantes. Los ingredientes activos también se pueden administrar por medio de iontoforesis, por ejemplo, como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 4.140.122; 4.383.529 o 4.051.842. El porcentaje en peso de un agente terapéutico de la invención presente en una formulación tópica dependerá de varios
factores, pero generalmente será de 0,01% a 95% del peso total de la formulación, y normalmente 0,1-25% en peso.

Cuando se desea, las formulaciones descritas anteriormente se pueden adaptar para dar la liberación sostenida del ingrediente activo empleado, por ejemplo, por combinación con ciertas matrices poliméricas hidrófilas, por ejemplo, que comprende geles naturales, geles poliméricos sintéticos o sus mezclas.

Las gotas, tales como gotas oculares o gotas nasales, se pueden formular con una base acuosa o no acuosa que comprende uno o más agentes dispersantes, agentes solubilizantes o agentes de suspensión. Los sprays líquidos se administran apropiadamente a partir de envases presurizados. Las gotas se pueden administrar por medio de un simple frasco con tapa gotera para uso ocular o por medio de un frasco de plástico adaptado para administrar contenidos líquidos por goteo, por medio de un cierre de forma especial.

El agente terapéutico además se puede formular para la administración tópica en la boca o garganta. Por ejemplo, los ingredientes activos se pueden formular como una pastilla que comprende también una base saborizada, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden la composición en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia; enjuagues bucales que comprenden la composición de la presente invención en un vehículo líquido adecuado; y pastas y geles, por ejemplo, pastas dentífricas o geles, que comprenden la composición de la invención.

Las formulaciones y composiciones descritas en la presente también pueden contener otros ingredientes tales como agentes antimicrobianos o conservantes. Además, los ingredientes activos también se usan en combinación con otros agentes terapéuticos, por ejemplo anticonceptivos orales, broncodilatadores, agentes antivirales, esteroides y similares.

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Formas de Dosificación de Liberación Sostenida

Las formas de dosificación de liberación sostenida de la invención pueden comprender micropartículas y/o nanopartículas que tienen un agente terapéutico disperso en las mismas. Las formas de dosificación terapéuticas de este aspecto de la presente invención pueden ser de cualquier configuración adecuada para la liberación sostenida. Las formas de dosificación terapéuticas de liberación sostenida preferidas exhiben una o más de las siguientes características:

- micropartículas (por ejemplo, de aproximadamente 0,5 micrómetros a aproximadamente 100 micrómetros de diámetro, prefiriéndose de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2 micrómetros; o de aproximadamente 0,01 micrómetros a aproximadamente 200 micrómetros de diámetro, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 micrómetros, y con más preferencia de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 micrómetros) o nanopartículas (por ejemplo, de aproximadamente 1,0 nanómetro a aproximadamente 1000 nanómetros de diámetro, con máxima preferencia aproximadamente 50 a aproximadamente 250 nanómetros; o de aproximadamente 0,01 nanómetro a aproximadamente 1000 nanómetros de diámetro, preferiblemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 nanómetros), estructura de polvo de libre fluencia;

- estructura biodegradable diseñada para biodegradarse durante un período de tiempo preferiblemente entre aproximadamente 0,5 a aproximadamente 180 días, preferiblemente de aproximadamente 1-3 a aproximadamente 150 días, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 180 días, con más preferencia de aproximadamente 10 a aproximadamente 21 días; o estructura no biodegradable para permitir que se produzca la difusión del agente terapéutico durante un período de tiempo de entre aproximadamente 0,5 a aproximadamente 180 días, con más preferencia de aproximadamente 30 a aproximadamente 120 días; o de aproximadamente 3 a aproximadamente 180 días, preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 21 días;

- biocompatible con el tejido blanco y el ambiente fisiológico local en el que se administra la forma de dosificación, que incluye generar productos de biodegradación biocompatibles;

- facilitar una dispersión estable y reproducible del agente terapéutico, preferiblemente para formar una matriz agente terapéutico-polímero, ocurriendo la liberación del agente terapéutico activo por una o ambas de las siguientes vías: (1) difusión del agente terapéutico a través de la forma de dosificación (cuando el agente terapéutico es soluble en el polímero formado o la mezcla de polímeros que define las dimensiones de la forma de dosificación); o (2) liberación del agente terapéutico a medida que la forma de dosificación se biodegrada; y/o

- para formas de dosis dirigidas, capacidad para tener, preferiblemente, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10.000 enlaces entre proteína/péptido de unión y la forma de dosificación y con más preferencia, un máximo de aproximadamente 1 enlace entre el péptido de unión y la forma de dosificación por cada 150 ángstroms cuadrados de área superficial de partícula. La cantidad total de enlaces entre proteína/péptido de unión y forma de dosificación depende del tamaño de partícula usado. Las proteínas o péptidos de unión son capaces de acoplarse a las partículas de la forma de dosificación terapéutica a través de modalidades sándwich de ligando covalentes o no covalentes como se expone en la presente.

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Las formas de dosificación terapéuticas de liberación sostenida en nanopartículas preferiblemente son biodegradables y, opcionalmente, se unen a las células del músculo liso vascular y entran en las células, principalmente por endocitosis. La biodegradación de las nanopartículas ocurre en el tiempo (por ejemplo, 30 a 120 días; o 10 a 21 días) en vesículas prelisosómicas y lisosomas. Las formas preferidas de dosificación terapéuticas en micropartículas más grandes de la presente invención liberan los agentes terapéuticos para la posterior captación de las células blanco, ingresando sólo unas pocas de las micropartículas más pequeñas que la célula por fagocitosis. Un profesional de la técnica apreciará que el mecanismo preciso por el cual una célula blanco asimila y metaboliza una forma de dosificación de la presente invención depende de la morfología, fisiología y los procesos metabólicos de estas células. El tamaño de partícula de las formas de dosificación terapéuticas de liberación sostenida también es importante con respecto al modo de asimilación celular. Por ejemplo, las nanopartículas más pequeñas pueden fluir con el fluido intersticial entre las células y penetrar al tejido infundido. Las micropartículas más grandes tienden a ser atrapadas más fácilmente en forma intersticial en el tejido primario infundido y en consecuencia son útiles para los agentes terapéuticos.

Las formas preferidas de dosificación de liberación sostenida de la presente invención comprenden micropartículas o nanopartículas biodegradables. Con más preferencia, las micropartículas o nanopartículas biodegradables están formadas por una matriz que contiene polímero que se biodegrada por ruptura hidrolítica, no enzimática y aleatoria para liberar el agente terapéutico, formándose de este modo poros dentro de la estructura particulada.

Los polímeros derivados de la condensación de ácidos alfa hidroxicarboxílicos y lactonas relacionadas son preferidos para su uso en la presente invención. Un resto particularmente preferido se forma a partir de una mezcla de poliésteres termoplásticos (por ejemplo, polilactida o poliglicolida) o un copolímero de componentes lactida y glicolida, tales como poli(lactida-co-glicolida). Un ejemplo de estructura, una poli(DL-lactida-co-glicolida) aleatoria, se muestra a continuación, pudiendo los valores de x e y ser manipulados por un profesional de la materia para obtener propiedades de micropartícula o nanopartícula convenientes.

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Otros agentes adecuados para obtener formas de dosificación particuladas de la presente invención incluyen poliortoésteres y poliacetales (Polymer Letters, 18:293 (1980)) y poliortocarbonatos (Patente Estadounidense No. 4.093.709) y similares.

Las partículas preferidas de matriz que contienen polímero de ácido láctico/ácido glicólico de la presente invención se preparan por procesos basados en la emulsión, que constituyen procesos de extracción con disolventes modificados; véanse, por ejemplo, los procesos descritos por Cowsar et al., "Poli(Lactide-Co-Glycolide) Microcapsules for Controlled Release of Steroids" Methods Enzymology, 112:101-116, 1985 (atrapamiento de esteroides en micropartículas); Eldridge et al., "Biodegradable and Biocompatible Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres as an Adjuvant for Staphilococcal Enterotoxin B Toxoid Which Enhances the Level of Toxin-Neutralizing Antibodies", Infection and immunity, 59:2978-2986, 1991 (atrapamiento de toxoides); Cohen et al., "Controlled Delivery Systems for Proteins Based on Poly(Lactic/Glycolic Acid) Microspheres", Pharmaceutical Research, 8 (6):713-720, 1991 (atrapamiento de enzimas); y Sanders et al., "Controlled Release of a Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Analogue from Poly(D,L-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres", J. Pharmaceutical Science, 73(9):1294-1297, 1984 (atrapamiento de péptidos).

En general, el procedimiento para obtener las formas de dosificación en partículas de la presente invención incluye disolver el polímero en un disolvente hidrocarbonado halogenado, dispersar una solución del agente terapéutico (preferiblemente acuosa) y añadir un agente adicional que actúe como disolvente para el disolvente hidrocarbonado halogenado pero no para el polímero. El polímero precipita de la solución del polímero en el disolvente hidrocarbonado halogenado sobre microgotas de la solución que contiene el agente terapéutico y atrapa al agente terapéutico. Preferiblemente el agente terapéutico está disperso en forma sustancialmente uniforme dentro de la forma de dosificación de liberación sostenida de la presente invención. Después de la formación de las partículas, estas se lavan y endurecen con un disolvente orgánico. Continúan etapas de lavado con agua y lavado con tensioactivo no iónico acuoso, antes de secar a temperatura ambiente al vacío.

A los efectos de lograr biocompatibilidad, las formas de dosis particuladas, caracterizadas por un agente terapéutico disperso en la matriz de las partículas, se esterilizan antes del envasado, almacenamiento o administración. La esterilización se puede realizar de cualquier manera conveniente. Por ejemplo, las partículas se pueden irradiar con radiación gamma, con la condición de que la exposición a esta radiación no influya adversamente sobre la estructura o función del agente terapéutico disperso en el agente terapéutico-matriz polimérica o la proteína/péptido de unión unida a esta. Si el agente terapéutico o proteína/péptido de unión se ven influidos adversamente, las formas de dosificación en partículas se pueden producir en condiciones estériles.

La liberación del agente terapéutico de las formas de dosificación en partículas de la presente invención puede ocurrir como resultado de la difusión y erosión de la matriz de partículas. La velocidad de biodegradación afecta directamente la cinética de liberación del agente terapéutico. La velocidad de biodegradación se puede regular por modificación de la composición o estructura de la forma de dosificación de liberación sostenida. Por ejemplo, la modificación de la relación lactida/glicolida en las formas de dosificación preferidas de la presente invención se puede realizar como se describe en Tice et al., "Biodegradable Controlled-Release Parenteral Systems" Pharmaceutical Technology, pp. 26-35, 1984; por inclusión de agentes que alteran la velocidad de hidrólisis del polímero, tales como ácido cítrico y carbonato de sodio, como se describe en Kent et al., "Microencapsulation of Water Soluble Active Polypeptides", Patente Estadounidense No. 4.675.189; por alteración de la carga del agente terapéutico en el polímero de lactida/glicolida, siendo la velocidad de degradación inversamente proporcional a la cantidad de agente terapéutico contenida en esta, por selección acertada de un análogo apropiado de una familia común de agentes terapéuticos que exhiben diferentes potencias para alterar dichas cargas del núcleo; y por variación del tamaño de partícula, como se describe en Beck et al., "Poly(DL-Lactide-Co-Glicolide)/Norethisterone Microcapsules: An Injectable Biodegradable Contraceptive", Biol. Reprod., 28:186-195, 1983, o similares. Todos los métodos anteriormente mencionados para regular la velocidad de biodegradación influyen sobre la viscosidad intrínseca de la matriz que contiene el polímero, alterando de este modo la velocidad de hidratación de la misma.

La estructura de lactida/glicolida preferida es biocompatible con el ambiente fisiológico de los mamíferos. Asimismo, estas formas preferidas de dosificación de liberación sostenida tienen la ventaja de que su biodegradación forma ácido láctico y ácido glicólico, ambos productos metabólicos normales de los mamíferos.

Los grupos funcionales necesarios para la unión de la proteína/péptido de la forma de dosificación en partículas opcionalmente se incluyen en o sobre la matriz de partículas y se fijan a las unidades poliméricas no degradables o biodegradables. Los grupos funcionales que son útiles para este fin incluyen los que son reactivos con los péptidos, por ejemplo grupos carboxilo, grupos amina, grupos sulfhidrilo y similares. Los restos preferidos para mejorar la unión incluyen los grupos carboxilo terminales de la matriz que contiene el polímero (lactida-glicolida) o similares.

Para emplear los agentes terapéuticos de la invención para aumentar la respuesta inmunológica de un inmunógeno particular, por ejemplo el polisacárido capsular tipo b de Haemophilis influenza (Hib) (fosfato de polirribosilribitol, PRP), los agentes se pueden conjugar al inmunógeno. En consecuencia, por ejemplo, el péptido 2(1-15)[MCP-1] se puede unir en forma covalente a PRP a través de una molécula espaciadora de 6 carbonos derivada de la dihidrazida del ácido adípico (véase Gordon, Patente 8314939, República de Sudáfrica, 1984), y se administra de una manera similar a la que se describe en Eskola et al., Lancet, 1, 1184 (1985). El uso de moléculas de ácido nucleico para preparar vacunas se describe en, por ejemplo, Feigner et al., supra y Stevenson et al., supra.

Una vacuna de la invención también puede comprender células o virus que tienen un ácido nucleico que codifica el inmunógeno y un péptido o variante de péptido de la invención o su complemento, opcionalmente como proteína de fusión.

Para una descripción general de principios y práctica de vacunas, véase Ada, En: Fundamental Immunology, 2nd ed., Raven Press Ltd., N.Y., pp. 985-1030 (1989).

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V. Detección de los Péptidos de la Invención en Líquido Fisiológico

El análisis del péptido 3 en sangre y orina se realizó sobre una columna de HPLC de superficie semipermeable (SPS) (medio de acceso restringido). El suero u otras muestras que contienen proteína se pueden inyectar directamente en la columna SPS (por ejemplo, SPS-C18 con un tamaño de columna de 4,6 mm x 250 mm; usando una fase móvil: A: 0,1% de TFA en agua, B: 0,1% de TFA en acetonitrilo: 0-5 min-5% de B, 5-30 min-60% de B, 30-40 min-5% de B; detector a 215 nm). La fase exterior de la columna forma una superficie semipermeable que impide que las moléculas alcancen la fase interna. Las moléculas pequeñas penetran la superficie semipermeable e interactúan con la fase inversa interna.

Se inyectaron estándares del péptido 3 (intervalo de 1,5 \mug/ml a 1000 \mug/ml) en PBS y se creó una curva estándar. Se inyectaron 20 \mul de suero y orina y se obtuvieron los picos del péptido 3. La concentración posteriormente se calculó a partir de la curva estándar. Este método puede detectar al menos aproximadamente 20 \mug/ml de un péptido en muestras de líquidos fisiológicos.

La invención será descrita adicionalmente, pero sin limitación, por los siguientes ejemplos.

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Ejemplo 1 Identificación y Caracterización de Inhibidores de Péptidos de Pan-Quimiocinas

Sobre la base de un alineamiento de las secuencias de MCP-1 de especies diferentes, se identificaron tres regiones de MCP-1 que estaban conservadas entre todas las especies examinadas. Se prepararon tres péptidos purificados (>95% de pureza) (oligómeros de 12-15 unidades) que tenían la mayor homología de secuencia entre las secuencias de MCP-1 humanas y de ratón (Tabla 1). Estos péptidos se analizaron en cuanto a su capacidad de inhibir la migración de THP-1 inducida por hMCP-1. De modo similar, se compararon las secuencias de TGF-beta 1 y TGF-beta3 de Xenopus laevis y TGF-beta 1 y TGF-beta 3 humanas y se identificaron 3 regiones (cada una de 10 unidades monoméricas) de homología perfecta. Estos péptidos se denominaron "betátidos".

Para este ensayo, se mantuvieron células THP-1 a una densidad de 4 x 10^{5} células por ml en RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal de ternero + 2-mercaptoetanol 20 \muM. La quimiotaxis se indujo en una cámara de quimiotaxis desechable de 96 pocillos equipada con un filtro de policarbonato de 5 \muM (libre de PVP, ChemoTX, Neuroprobe Inc., Cabin John). Se añadieron veinticinco \mul de sustancia quimioatrayente (quimiocina recombinante humana; 50 ng/ml, es decir, 5,9 nM) o control (100 ng/ml de TGF\beta al compartimiento inferior de cada pocillo. El filtro recuadrado se alineó con los orificios en la esquina del marco del filtro y se colocó sobre los pocillos. Se añadieron cinco x 10^{4} células THP-1 en 25 \mul de medio de cultivo RPMI-1640 al compartimiento superior. Los péptidos se disolvieron en agua Milli Q y posteriormente se diluyeron en forma seriada en medio de cultivo. En la mayoría de los casos, los péptidos diluidos en forma seriada se añadieron al compartimiento superior de la cámara de quimiotaxis. La cámara se incubó a 37ºC en una atmósfera humidificada de 5% de CO_{2} durante 4 horas.

Después de la incubación, las células se retiraron suavemente de la parte superior del filtro con una pipeta, se añadieron 20 \mul de EDTA 20 mM en PBS en cada pocillo superior, y la mezcla se incubó durante 20 minutos a 4ºC. El filtro posteriormente se lavó cuidadosamente con medio usando un flujo suave, y se retiró. Se preparó una curva estándar para cuantificar con precisión la cantidad de células THP-1 que habían migrado. La curva se basó en una serie de diluciones a la mitad de las células THP-1 (100000 células estándares de la parte superior en 29 \mul). Las células que habían migrado, y en pocillos separados las células de los estándares, se tiñeron con 3 \mul de solución patrón de MTT que se añadió directamente en cada pocillo (5 mg/ml de RPMI 1640 sin rojo fenol, Sigma Chemical Co.) y se incubó a 37ºC durante 4 horas. El medio se aspiró cuidadosamente de cada pocillo, y el colorante convertido se solubilizó con 20 \mul de DMSO. Se midió la absorbancia del colorante convertido a una longitud de onda de 595 nM usando un lector de placas de ELISA. Se determinó la cantidad de células que habían migrado en cada pocillo por interpolación de la curva estándar.

El péptido 1[MCP-1] (véase la Tabla 1; SEQ ID NO:2), es decir, el péptido N-terminal de la MCP-1 humana, fue sólo débilmente activo en el ensayo de migración (DE_{50}> 100 \muM; 10% de inhibición a 100 \muM, p=0,27). El péptido 2[MCP-1] (Tabla 1; SEQ ID NO:3) también fue un inhibidor débil de migración inducida por quimiocinas (DE_{50} > 100 \muM,; 19% de inhibición a 100 \muM, p=0,09). En consecuencia, en presencia de un agonista fuerte, es decir, MCP-1, el péptido 2[MCP-1] que tiene la SEQ ID NO:3, un agonista débil, desplaza a MCP-1 de su receptor. Sin embargo, en ausencia de un agonista fuerte, es decir, MCP-1, el péptido 2[MCP-1] exhibió propiedades de agonista débil, es decir, el péptido 2[MCP-1] estimuló la quimiotaxis. De modo sorprendente, el péptido 2(1-15)[SDF1\alpha] presentó potentes propiedades de antagonista de pan-quimiocinas.

En contraste, el péptido 3(1-12)[MCP-1] (Tabla 1; SEQ ID NO:1) fue un inhibidor muy efectivo de la migración de THP-1 inducida por MCP-1 con una dosis que da 50% de inhibición (DE_{50}) de 8 \pm 1 \muM (n=4). Se muestra una curva de dosis respuesta típica en la Figura 2. A concentraciones por encima de 50 \muM, el péptido 3(1-12)[MCP-1] que tiene la SEQ ID NO:1 anuló toda la migración de THP-1 inducida por MCP-1.

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Para determinar si los péptidos eran antagonistas del receptor de MCP-1, los péptidos se introdujeron con la quimiocina en el compartimiento inferior (a diferencia de las células del compartimiento superior en los experimentos descritos anteriormente) en el ensayo de migración de THP-1 trans-pocillo. En estas condiciones, el péptido 1 [MCP-1] que tiene la SEQ ID NO:2 fue un inhibidor más eficiente de la migración de quimiocina inducida por MCP-1 que había sido incubado con las células, inhibiendo el 48% de la migración inducida por MCP-1 a 100 \muM, en comparación con el 10% de inhibición cuando se incubó el péptido 1 [MCP-1] (SEQ ID NO:2) con las células. Este resultado es coherente con los informes publicados que muestran que el péptido 1 [MCP-1] (SEQ ID N0:2) y sus derivados actúan desarticulando el dímero de MCP-1, formando monómeros inactivos. El péptido 1 [MCP-1) (SEQ ID NO:2), en consecuencia, no es un antagonista a nivel de receptor clásico de la función de MCP-1. En marcado contraste, el péptido 3 (1-12)[MCP-1], que tiene la SEQ ID NO:1, fue mucho menos efectivo cuando se incubó con la quimiocina que con las células (17% de inhibición a 100 \muM en comparación con >99% de inhibición), lo que sugiere que un péptido que tiene la SEQ ID NO:1 inhibe la migración inducida por MCP-1 por antagonismo del receptor directo. Para confirmar esta observación, se determinó la afinidad de unión de un derivado biotinilado N-terminal del péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1). Este derivado se unió a la superficie de las células THP-1 con una ka de aproximadamente 10 \muM.

El péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) también inhibió otras funciones de la MCP-1, que pueden estar mediadas por diferentes combinaciones de receptores. Se ha informado que MCP-1 es un comitógeno débil con 0,5% de suero fetal de ternero para células de músculo liso cultivadas. Se halló que el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) a la concentración 100 \muM anuló completamente el efecto comitogénico de MCP-1 para las células de músculo liso cultivadas, también coherente con la hipótesis de que el péptido 3 (1-12)(MCP-1) (SEQ ID NO:1) es un antagonista del receptor de MCP-1. La observación de que el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) inhibe completamente las diferentes respuestas a MCP-1 en tipos celulares diferentes sugiere que el péptido 3 puede ser un antagonista general de todos los receptores de quimiocinas capaces de unir y señalizar en respuesta a MCP-1.

Para investigar la especificidad del receptor para la inhibición del péptido 3, se determinó la DE_{50} para la inhibición con el péptido 3(1-12) [MCP-1] (SEQ ID NO:1) de la migración de THP-1 inducida por quimiocinas que señalizan mediante receptores diferentes de los receptores de MCP-1. Las quimiocinas representativas incluyen una beta-quimiocina ("CC"), MIP-1\alpha y dos alfa-quimiocinas ("CXC"), IL-8 y SDF-1\alpha. Además, para determinar la especificidad del péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) para los receptores de quimiocinas, se seleccionó TGF-beta como agente inductor de la migración no relacionado con la familia de las quimiocinas, y como agente que estimula una actividad biológica por señalización a través de receptores identificados no relacionados.

El péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) inhibió la respuesta inducida por la migración de THP-1 a las cuatro quimiocinas seleccionadas, con el orden de potencia: MIP-1\alpha \geq MCP-1 > SDF1 \geq IL-8 (véase la Tabla 2). En contraste, el péptido 1 [MCP-1] (SEQ ID NO:2) o el péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO:3) no inhibieron la migración en respuesta a ninguna de estas quimiocinas en más de 20%, inclusive a 100 \muM (Tabla 2).

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TABLA 2

(a) DE_{50} para la inhibición de la migración de THP-1

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Además, el péptido 3(1-12)[MCP-1] que tiene la SEQ ID NO:1 (así como el péptido 1[MCP-1] (SEQ ID NO:2) y el péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO:3)) no inhibieron significativamente la migración de THP-1 inducida por TGF-beta inclusive a 100 \muM. Tomados en conjunto, estos resultados demostraron que el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) es un inhibidor general y específico de la señalización de quimiocinas. Si bien el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) muestra selectividad débil por las quimiocinas CC respecto de las quimiocinas CXC, no obstante, a 100 \muM, el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) inhibe >99% de la migración inducida por cualquiera de las quimiocinas de la familia de las quimiocinas analizada (Tabla 2). En consecuencia, si bien MCP-1 señaliza a través de múltiples receptores relacionados, el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) bloquea todos los receptores que participan en las vías de señalización quimiotáctica y mitogénica estimuladas por MCP-1.

Para excluir la posibilidad de que el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) fuera más efectivo en las células THP-1 que los monocitos primarios humanos, se analizó el efecto del péptido 3(1,12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) sobre la migración inducida por quimiocina de monocitos de sangre periférica recién preparados de 3 dadores. De modo similar a los resultados para las células THP-1, 100 \muM del péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1), pero no el péptido 1[MCP-1] (SEQ ID NO:2) o el péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO:3), inhibieron el total o casi la totalidad (>95%) de la migración inducida con cada una de las cuatro quimiocinas, pero no afectó la migración inducida por TGF-beta. En consecuencia, el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) es un inhibidor de una amplia variedad de quimiocinas proinflamatorias que actúan sobre una amplia variedad de células blanco (células de músculo liso, THP-1, línea celular T Jurkat y monocitos primarios humanos). Cabe destacar que en contraste con las células THP-1, la inhibición del péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO:3) de la migración inducida por MCP-1 de monocitos primarios humanos (20%) fue estadísticamente significativa (Tabla 2).

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Ejemplo 2 Caracterización de Fragmentos y Variantes del Péptido 3(1-12)[MCP-1] y del Péptido 2 [MCP-1]

Para determinar si un fragmento del péptido 3 tiene actividad biológica y selectividad, se analizaron dos "medios péptidos" hexámeros (Tabla 3): EICADP (SEQ ID NO:8), correspondiente al péptido 3(1-6)[MCP-1], y KQKWVQ (SEQ ID NO:9), correspondiente al péptido 3(7-12)(MCP-1]. El péptido 3(7-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:8) fue tan potente como inhibidor de la señalización de quimiocinas CC como el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1), pero fue marcadamente más potente como inhibidor de quimiocinas CXC (Tabla 4). En contraste, el péptido 3(1-6)[MCP-1] (SEQ ID NO:8) fue mucho menos potente como inhibidor del péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1).

TABLA 3

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TABLA 4 Efecto de Derivados Mutantes de Secuencia del Péptido 3 sobre la Migración de THP-1

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El péptido 3(7-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:9) no mostró esencialmente ninguna selectividad para la inhibición de la migración con todas las quimiocinas analizadas con una DE_{50} en el intervalo de 7-9 \muM. El péptido 3(1-6)[MCP-1] (SEQ ID NO:8) fue mucho menos eficiente para inhibir las quimiocinas CC (DE_{50} de aproximadamente 30 \muM) pero sólo ligeramente menos eficiente para inhibir las quimiocinas CXC (18 \muM) en comparación con el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1). La relación de selectividad se define como el promedio de la DE_{50} para MCP-1 y MIP1\alpha dividido por el promedio de DE_{50} para IL-8 y SDF1\alpha. Relaciones de selectividad mayores que 1 indican mayor inhibición de las quimiocinas CC con respecto a las quimiocinas CXC; las relaciones de selectividad menores que 1 indican mayor inhibición de las quimiocinas CXC con respecto a las quimiocinas CC; y una relación de selectividad de valor 1 indica que ambas familias de citocinas están inhibidas en igual grado. En consecuencia, si bien es principalmente un inhibidor marcadamente débil de la señalización de quimiocinas, el péptido 3(1-6)[MCP-1] (SEQ ID NO:8) mostró una selectividad 2 veces mayor para las quimiocinas CXC. En consecuencia, el péptido 3(1-6)[MCP-1] (SEQ ID NO:8) es un inhibidor preferido de las quimiocinas CXC, con una relación de selectividad de 0,7, mientras que el péptido 3(7-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:9) es un inhibidor preferido de ambas clases de quimiocinas, con una relación de selectividad de 1,1. La relación de selectividad para el péptido 3(1-12)[MCP1] (SEQ ID NO:1) es 1,5.

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El péptido 3(3-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:7) presentó propiedades muy similares al péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO: 1). Este resultado sugirió que los residuos de glutamato (E) e isoleucina (I) en las posiciones 1 y 2 de la secuencia del péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1), que no están conservados en secuencias de quimiocina diferentes de MCP-1, no son importantes para la unión al receptor. El alineamiento de todas las secuencias de quimiocinas humanas de la región del péptido 3 indica un motivo conservado común presente en casi todas las quimiocinas, ya sean de la subfamilia alfa o beta (Tabla 3). Este motivo es: Cx_{1}DPx_{2}x_{3}x_{4}Wx_{5}Q.

Además, existe un patrón de aminoácidos en las posiciones variables x_{1} a x_{5} que sugiere que la naturaleza del aminoácido en estas posiciones puede cumplir un papel en la determinación de la selectividad de la unión al receptor. Por ejemplo, en la familia de quimiocinas CC, la posición x_{1} está usualmente ocupada por alanina (A), mientras que esta posición es comúnmente leucina (L) en las quimiocinas CXC, excepto en SDF1 (isoleucina (I) en SDF-1). Para probar esta hipótesis, la selectividad del Leu_{4}péptido 3(1,12)[MCP-1] (SEQ ID NO:10) se comparó con la del péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1). Si bien Leu_{4}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:10) mostró un aumento de aproximadamente 4 veces de potencia como inhibidor de las quimiocinas CXC en comparación con el péptido 3(1-12)[MCP-1) (SEQ ID NO:1) que contiene ala, no hubo disminución de la potencia de inhibición de las quimiocinas CC (Tabla 4). En consecuencia, Leu_{4}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:10) mostró alguna selectividad por CXC (una relación de selectividad de 0,37) y fue el más selectivo para CXC de todos los derivados analizados diferentes de los tripéptidos (véase a continuación).

Como se indicó para la posición x_{1} anterior, sólo tres aminoácidos diferentes aparecen en la posición x_{5} (Tabla 1). La mayoría de las quimiocinas tienen valina (V) en la posición x_{5} como las quimiocinas CXC IL-8 y MIP. En contraste, SDF-1 y IP10 tienen isoleucina (I) en esta posición, mientras que ENA78 es la única quimiocina con leucina (L) en esta posición. Los resultados mostraron que Ile_{11}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:13) mostró alguna selectividad por CXC, aunque no tan marcada como Leu_{4}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:10) (una relación de selectividad de 0,9), pero de modo sorprendente mostró la mayor selectividad para IL-8 (que tiene valina en esta posición), no para SDF-1. Este análogo fue el inhibidor más selectivo de la señalización de IL-8 diferente de los tripéptidos, es decir, el análogo tuvo una selectividad para IL-8 respecto de otras quimiocinas aproximadamente 3 veces mayor.

Un análogo que tiene las sustituciones Leu_{4} y Ile_{11} no mostró una mayor especificidad como inhibidor de las quimiocinas CXC que cualquier mutante simple Leu_{4}péptido 3(1-12)[MCP-1](SEQ ID NO:10) o Ile_{11}péptido 3(1,12)
[MCP-1] (SEQ ID NO:13) (Tabla 6). Sin embargo, Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:14) fue aproximadamente 5 veces más potente como inhibidor de las quimiocinas CC que el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1), o las mutantes únicas Leu_{4}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:10) o Ile_{11}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:13). En consecuencia, Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(1-12)[MCP-1l (SEQ ID NO:14) fue un inhibidor general de quimiocinas más potente, con una DE_{50} promedio de 2,3 \muM en comparación con 10 \muM para el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1). Además, Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:14) inesperadamente conservó la modesta selectividad por CC del péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO: 1) con una relación de selectividad de 2,0. De modo sorprendente, en consecuencia, Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(1-1 2)[MCP-1] (SEQ ID NO: 1) fue aproximadamente 5 veces más potente como inhibidor de la señalización de MCP-1 que el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO: 1), a pesar del hecho de que el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO: 1) contiene la secuencia afín de la MCP-1 humana. Además, se halló que Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(3-12)[MCP-1], al igual que Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO: 14), fue un análogo peptídico de mayor afinidad del péptido 3(1-12)[MCP-1](SEQ ID NO:1).

Para las posiciones x_{2} a x_{4}, todas las quimiocinas descritas hasta la fecha tienen al menos un aminoácido cargado en esta región del tripéptido (Tabla 1). Muchas quimiocinas tienen dos residuos básicos que ocupan x_{2} y x_{4} (por ejemplo, KQK en MCP-1, KER en MCP-2 y KLK en SDF-1) mientras que otras tienen dos residuos ácidos (por ejemplo, SEE en MIP1\alpha, SES en M1P1\beta, y SES en RANTES). Un estudio reciente (Nature Med., 3, 367 (1997)) sugirió que la carga de los bucles extracelulares de los receptores de quimiocinas pueden ser un determinante importante de la especificidad del ligando, por ejemplo CXCR4, que se une a SDF-1, está cargado negativamente, mientras que CCR5, que se une a MIP1\alpha, MIP1\beta y RANTES está cargado positivamente. En consecuencia, los residuos x_{2}-x_{4} pueden cumplir un papel importante en la especificidad del receptor.

Para probar esta hipótesis, se prepararon algunas variantes: Ser_{7}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:11) sustituye el residuo K con carga positiva presente en MCP-1, MCP-2, eotaxina, IL-8 y SDF-1 con el residuo hidroxilado S presente en MIP1\alpha, MIP1\beta y RANTES. Sin embargo, esta alteración no alteró marcadamente la selectividad. En particular, esta alteración no redujo la potencia de inhibición de la señalización de MCP-1, ni aumentó la potencia de inhibición de la señalización de MIP1\alpha (Tabla 4). El único cambio detectable fue un modesto cambio de la moderada selectividad por CC del péptido 3(1-12) [MCP-1] (SEQ ID NO:1) a una moderada selectividad por CXC de la variante Ser_{7}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:11) (una relación de selectividad de 0,5). Otra variante, Ser_{7}Glu_{8}Glu_{9}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:12), que convierte al péptido de ser afín a la secuencia de MCP-1 a ser afín a la secuencia de MIP1\alpha, produjo un inhibidor de MIP1\alpha más selectivo, aunque la relación de selectividad por MIP1\alpha versus las otras quimiocinas fue sólo aproximadamente 3 veces mayor.

Ninguna de las variantes del péptido 3(1-12)[MCP-1] presentó actividad detectable como inhibidor de la migración de células THP-1 inducida por TGF-beta, incluso a 100 \muM (Tabla 4). En consecuencia, todas estas variantes fueron inhibidores altamente selectivos de la señalización inducida por quimiocinas. No existieron sustituciones que alteraran un residuo de aminoácido del péptido 3(1-12)[MCP-1] a ninguna otra región de aminoácidos hallada en las secuencias de quimiocinas descritas anteriormente que redujeran marcadamente la potencia de la inhibición general de quimiocinas observada. Sin embargo, ciertas alteraciones produjeron un cambio marcado de la selectividad. Por ejemplo, la selectividad por CC del péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) se puede convertir a selectividad por CXC al mutar A a L en la posición 4 (x_{1}) o al mutar V a I en la posición 11 (x_{5}). En particular, dos variantes tuvieron una selectividad 3 veces mayor para una quimiocina respecto de la DE_{50} promedio para las otras, es decir, el Ile_{11}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:13) presentó selectividad total para la inhibición de IL8 y Ser_{7}Glu_{8}Glu_{9}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:12) tuvo una selectividad global débil para MIP1\alpha.

En síntesis, si bien las variantes del péptido 3(1-12)[MCP-1] variaron en pequeña medida en sus DE_{50} y sus especificidades para la familia \alpha o \beta de quimiocinas, no obstante, estas fueron similares para el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1). Los resultados de la Tabla 6 mostraron que las variantes del péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) y el péptido 3(1-12)[MCP-1] inhibieron la migración inducida por las quimiocinas MCP-1, MIP1\alpha, IL8 y SDF1\alpha en similar medida. Si bien algunos péptidos o variantes de péptidos mostraron leve preferencia por las quimiocinas CC, otros mostraron leve preferencia por las quimiocinas CXC pero en ningún caso de la especificidad por CC excedió el factor dos. El péptido 3(1-12)[MCP-1) (SEQ ID NO:1), el péptido 3(1-6)[MCP-1] (SEQ ID NO:6) y el péptido 3(7-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:9) tampoco mostraron selectividad significativa por CC o CXC.

Ejemplo 3 Identificación y Caracterización de Secuencias de Quimiocinas que son Agonistas Funcionales

Los resultados descritos anteriormente, de que el péptido 2(1-15)[MCP-1) (SEQ ID NO:3) no inhibió la actividad de MCP-1 en el ensayo de migración de THP-1, no excluyeron la posibilidad de que el péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO:3) se asocie con el receptor de MCP-1 y fracase en la inhibición de la unión y señalización de MCP-1, o actúe como agonista, impidiendo la unión de MCP-1 pero transduciendo una señal del tipo MCP-1. Para determinar si el péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO:3) se une al receptor de quimiocinas, se mezclaron células THP-1 con un derivado biotinilado del péptido. Se halló que el péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO:3) se une a las células THP-1 con una afinidad razonable (kD = 1,9 \muM), lo que sugiere que el péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO:3) fue capaz de interactuar con los receptores de quimiocinas sin inhibir la señalización de quimiocinas (un agente de unión neutro).

A diferencia del péptido 3, que representa una región que está relativamente conservada entre las quimiocinas, existe una semejanza de secuencias menos marcada en la región del péptido 2 de las quimiocinas. En consecuencia, el péptido 2, sus derivados o variantes, pueden poseer efectos más específicos de las quimiocinas. Para probar esta hipótesis, se comparó la unión del péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO:3) biotinilado a dos tipos de células diferentes, es decir, células THP-1 y células Jurkat. Las células THP-1 expresan los receptores para MCP-1, MIP1\alpha, SDF-1\alpha y IL-8 mientras que las células Jurkat expresan receptores funcionales sólo para SDF-1. El péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO:3) se unió a las células Jurkat con una kD similar (3 \muM) a las células THP-1 (1,9 \muM). Esta observación sugiere que, de modo sorprendente, el péptido 2(1-15)[MCP-1] fue capaz de unirse a numerosos receptores de quimiocinas diferentes, aunque la secuencia del péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO;3) muestra poca homología con la región equivalente de SDF-1.

Las propiedades de agonista funcional del péptido 2(1-15)[MCP-1 (SEQ ID NO:3) se caracterizaron incubando las células THP-1 con concentraciones variables del péptido 2(1-15)(MCP-1] (SEQ ID NO:3) en un ensayo de migración. El péptido 2(1-15) [MCP-1] (SEQ ID NO:3) presentó actividad agonista débil (promoviendo la migración con una DE_{50} de aproximadamente 10 \muM) con migración máxima a 100 \muM, que fue aproximadamente 10% de la inducida por MCP-1. En consecuencia, a concentraciones altas (>20 \muM) el péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO:3), sus variantes o derivados, pueden ser útiles para las aplicaciones que requieren actividad agonista débil de MCP-1 (por ejemplo, para la terapia de infecciones parasitarias donde es deseable el aumento de la actividad de los macrófagos). Más aún, a concentraciones menores (> 1 \muM pero < 20 \muM), el péptido 2, las variantes o los derivados del péptido 2 pueden ser útiles como agentes de unión neutros que pueden afectar la unión de las proteínas distintas de MCP-1 a los receptores de quimiocinas. Por ejemplo, el péptido 2, sus derivados o variantes, pueden ser útiles para prevenir o inhibir la unión del VIH a los receptores de quimiocinas sin inhibir la señalización de quimiocinas conveniente.

Ejemplo 4 Identificación, Preparación y Caracterización de Agentes Terapéuticos de la Invención para su Uso In Vivo A. Derivados

Los péptidos generalmente son sensibles a la hidrólisis química o enzimática. En particular, los péptidos no son normalmente biodisponibles por vía oral ya que no son estables en el ambiente ácido y proteolítico del estómago. En consecuencia, la hidrólisis química o enzimática genera una semivida muy corta para los péptidos. Para extender la semivida de los agentes susceptible a la hidrólisis, los agentes activos in vitro se modifican de manera que producen un derivado que pueda ser biodisponible en forma oral, tenga una mejor farmacocinética y cuya administración pueda lograr concentraciones en sangre que inhiban la actividad de quimiocinas. Por ejemplo, se pueden preparar péptidos D inversos cíclicos (CRD). Los péptidos CRD se preparan por síntesis de la secuencia inversa del péptido (desde el extremo C-terminal al N-terminal) usando el estereoisómero opuesto (D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos). El péptido resultante posteriormente se cicla por medio de residuos de cisteína N- y C-terminales. Estos derivados retienen un ordenamiento estérico de los átomos muy similar al péptido no CRD, pero no están sujetos a hidrólisis enzimática. Otros derivados que pueden exhibir una semivida extendida in vivo incluyen los derivados de tienilo o piridilo (por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4.992.463; Patente Estadounidense No. 5.091.396).

Por ejemplo, para preparar un derivado del péptido 3, el péptido 3(3-12)[MCP-1] se modificó de acuerdo con Jameson et al. (Nature, 368, 744 (1994)), que produjo el CRD-Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(3-12)[MCP-1] (Figura 4). Se encontró que CRD-Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(3-12)[MCP-1], que presentaba propiedades muy similares al péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) en los ensayos in vitro descritos anteriormente en la presente, era estable frente a la hidrólisis ácida (<10% de degradación a pH 2,0 durante 2 horas a 37ºC) y la destrucción enzimática (5 unidades de tripsina durante 2 horas a 37ºC). El CRD-Cys_{l3}Leu_{4}Ile_{11}péptido 3 (3-12)[MCP-1] también fue resistente a la hidrólisis in vivo y permitió obtener concentraciones plasmáticas terapéuticamente útiles (> 10 \muM 24 horas después de una dosis intraperitoneal única de 1 mg de CRD-Cys_{l3}Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(3-12)[MCP-1] en 250 \mul de solución salina).

Se prepararon los derivados D inverso cíclico (CRD), D inverso lineal (LRD), L delantero cíclico (CFL) y L delantero lineal (LFL) (es decir, la forma estándar de los péptidos) de Leu_{4}Ile_{11}péptido 3 y se determinaron sus actividades inhibidoras de MCP-1 en el ensayo trans-pocillo de THP-1. Los resultados fueron:

LFL-Leu_{4}Ile_{11}péptido 3: 1-5 \muM

LRD-Leu_{4}Ile_{11}péptido 3: 200-400 nM

CFL-Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11}péptido 3: 500-700 nM

CRD-Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11}péptido 3: 50-100 nM

Estos resultados demuestran, de modo algo sorprendente, que tanto la ciclación como la derivatización inversa D mejoran de modo independiente la actividad. Esta mejora es por lo tanto aditiva en el derivado CRD. En consecuencia, la ciclación aumenta la afinidad por constricción de las conformaciones del péptido. Sin embargo, no se esperaba que la derivatización inversa D fuera tan beneficiosa, posiblemente por el aumento de la estabilidad de la molécula.

Se halló que CRD-Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(3-12)[MCP-1] es un inhibidor muy potente de la migración de THP-1 inducida por MCP-1 (DE_{50} de aproximadamente 1 nM). Esta potencia aumentada en comparación con el Leu_{4}Ile_{11}
péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:14) original puede reflejar el aumento de estabilidad, incluso in vitro, o puede reflejar el aumento de estabilidad conformacional del péptido. Más aún, este compuesto se une al receptor de señalización con la misma afinidad que la MCP-1 nativa de longitud completa pero no señaliza.

Para determinar si CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] inhibía o aumentaba la proliferación de las células T o B a conconavalina A o al toxoide del tétanos en cultivo, se evaluó la proliferación de las células T y B CD4 por marcación de células CFSE-FITC. 50 ng de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12) [MCP-1] inhibieron la proliferación de ConA de las células T CD4 al 50% y 5 ng de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12) [MCP-1] redujeron la proliferación de ConA de las células T CD4 en < 3%. El CRDLeu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1) no tuvo efecto sobre la proliferación de las células B al toxoide tetánico.

Se empleó modelado por ordenador para determinar si los reemplazos específicos de aminoácidos afectaban la conformación del derivado peptídico CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1]. La secuencia peptídica se ingresó en HyperChem 5,0 (HyperCube). Se buscó una conformación de energía mínima usando los parámetros Amber Force Field y el algoritmo Polak-Ribiere. El modelo inicial se manipuló con simulaciones dinámicas moleculares (300ºK, 2 nseg) y rotaciones de cadena lateral manuales, seguido de optimización de la geometría, hasta alcanzar una conformación de energía mínima global aparente. El criterio de convergencia fue <0,01 Kcal/mol \ring{A}. Se obtuvo una conformación usando este procedimiento con una energía de aproximadamente 213,4 kcal/mol.

Para ensayar la sensibilidad del péptido del modelo a las perturbaciones, cada uno de los residuos, excepto las cisteínas terminales que forman el enlace disulfuro, se mutaron individualmente de D a L, y se reoptimizó la geometría, comenzando con la conformación mínima de todo los péptidos D. Para estas perturbaciones, cada mutante se corrió primero a través de una rutina de optimización de geometría general, posteriormente una simulación de dinámica molecular, posteriormente otra optimización de geometría. Los péptidos mutantes resultantes se compararon con todas las formas D por superposición del enlace disulfuro y un átomo adyacente, y la evaluación visual de la diferencia entre los esqueletos peptídicos. La conformación global fue insensible al cambio de quiralidad de las posiciones 2, 3, 4, 8, 9 y 10, pero fue sensible al cambio de quiralidad de las posiciones 5, 6 y 7. En general, los cambios de posición de la cadena lateral fueron menores excepto cuando la conformación del esqueleto cambió de modo significativo. Las energías para las mutantes variaron de -187,9 a -226,1 Kcal/mol, pero el cambio de energía (de -213,4 para la conformación inicial) no se correlacionó con el cambio conformacional.

Además, se evaluó el efecto de modificar el residuo aspartato de la posición 9 convirtiendo su grupo carboxilo de cadena lateral en la D-alanil amida. Se buscó una conformación de energía mínima del péptido modificado usando la misma rutina que para las mutantes quirales, a partir de la misma conformación de energía mínima. La condensación de D-alanina al residuo 9 del carboxilo de la cadena lateral causó un cambio importante en la conformación del péptido. Esto es coherente con los datos de migración de monocitos in vitro que demostraron una pérdida significativa de actividad biológica del péptido D-ala con respecto al CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1].

El modelado molecular indicó que L-Leu-CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1], que es CRD-Leu_{4}Ile_{11} Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] con el D-Leu reemplazado por L-Leu, debería producir muy poco cambio en la conformación del esqueleto del péptido. Los estudios de migración in vitro con el derivado L-Leu mostraron que también retenía actividad funcional. En consecuencia, para seleccionar las sustituciones de aminoácidos particulares que retienen la conformación de una molécula biológicamente activa de la invención, se puede emplear el modelado molecular.

Los siguientes cambios de D-aminoácido a L-aminoácido no tuvieron un impacto significativo sobre la estructura del esqueleto del péptido evaluado por el modelado.

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Los siguientes cambios de D-aminoácido a L-aminoácido tuvieron un impacto significativo sobre la estructura del esqueleto del péptido evaluado por esta técnica.

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B. Unión de DARC

Una consideración adicional para la biodisponibilidad es la unión no específica del agente terapéutico. Los eritrocitos tienen un receptor de quimiocinas o proteína de unión deficiente en la señalización, denominado Receptor del Antígeno Duffy para Quimiocinas (DARC). Si bien no señaliza, este receptor tiene una alta afinidad por las quimiocinas (10 nM) y puede cumplir una función en la eliminación de ellas de la circulación. Lamentablemente, cualquier antagonista de receptores de quimiocinas que tenga alta afinidad por DARC puede ser secuestrado por la enorme mezcla de sitios de unión en los eritrocitos, y en consecuencia no están disponibles para inhibir la señalización productiva de quimiocinas en otros tejidos. De modo similar, los agonistas que se unen a DARC con alta afinidad no están disponibles para señalizar en forma no productiva mediante los receptores de quimiocinas específicos. Para el uso in vivo, un agente de la invención preferiblemente tiene alguna afinidad por DARC, ya que los péptidos que no se unen a DARC se eliminan rápidamente en el primer paso por filtración glomerular. En consecuencia, los agentes preferidos tienen unión a DARC (constante de afinidad) en el intervalo de 100 nM a 1 mM, con más preferencia en el intervalo 1 \muM a 100 \muM y aún con más preferencia en el intervalo de 10 a 100 \muM.

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Si bien la interacción de las quimiocinas con DARC es de alta afinidad (5-10 nM de constante de asociación), cinéticamente la interacción se caracteriza por velocidades de asociación y disociación extremadamente rápidas. En consecuencia, la incubación con quimiocina marcada lleva a la saturación de los sitios de unión de DARC, pero la mayor parte del marcador unido se pierde minutos después de la eliminación del marcador no unido (>90% de pérdida dentro de los 3 minutos). Como resultado, es difícil determinar directamente la unión de péptidos a DARC por el ensayo directo del péptido biotinilado, ya que las velocidades de disociación rápida tornan imposible o imprecisa la determinación de la cantidad de marcador unido.

Para superar esta dificultad, la ka para la asociación de DARC con el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) y el péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NC:3) se estimó por incubación de eritrocitos que expresan DARC con MCP-1 marcada con ^{125}I en presencia de concentraciones variables del péptido. Después que la unión alcanzó el equilibrio (30 minutos a 37ºC), las células se separan del marcador no unido por centrifugación durante 5 minutos a través de un gradiente de sacarosa. Las cuentas asociadas con las células se determinan posteriormente por centelleo de cuentas gamma. En ausencia de todos los péptidos, la constante de asociación para MCP-1 marcada con ^{125}I en los eritrocitos humanos fue 5,45 nM, un valor que está de acuerdo con un informe previo. Por otra parte, el análisis de Scatchard confirma la presencia de un sitio de alta afinidad única con 500-1000 copias por célula, coherente con las propiedades conocidas de DARC. En consecuencia, la determinación de unión a ^{125}I-MCP-1 a eritrocitos en este ensayo en presencia de varias concentraciones de los péptidos permite estimar con precisión la constante de asociación del péptido para DARC.

También se determina la relación de especificidad por DARC. La relación de especificidad por DARC se define como la ka estimada para la asociación con DARC dividida por la DE_{50} para la actividad biológica. Una relación de especificidad por DARC mayor que 1 indica que un péptido se asocia escasamente con DARC y está biodisponible para modular la señalización de quimiocinas, sea como antagonista o agonista. Una relación de especificidad de DARC de aproximadamente 1 indica que el péptido se une a DARC y los receptores de señalización de THP-1 con similar afinidad. En consecuencia, puede ser difícil obtener concentraciones biológicamente activas (como inhibidor de quimiocinas) de estos péptidos in vivo sin otras modificaciones del péptido. Una relación de especificidad por DARC menor que 1 indica afinidad por DARC mucho mayor que para los receptores de señalización de quimiocinas.

El péptido 1[MCP-1] (SEQ ID NO:2)(que no se une a los receptores de quimiocinas pero actúa de un modo negativo dominante) no mostró unión a DARC (ka estimada > 100 \muM). En marcado contraste, el débil péptido agonista 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO:3) mostró unión de alta afinidad por DARC. La constante de asociación para el péptido 2(1-15) [MCP1] (SEQ ID NO:3) para los receptores de quimiocinas sobre las células THP-1 se estimó en 2 \muM usando ensayos de unión por competencia. Sin embargo, este péptido presentó una afinidad por DARC menor que 500 nM, también evaluada por el análisis de unión por competencia, usando eritrocitos. En consecuencia, el péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO:3) se une a los receptores de quimiocinas de las células THP-1, aunque no inhibe la señalización a través de los receptores, y se une a DARC aún más fuertemente (relación de selectividad de DARC = 0,1-0,2). En consecuencia, el péptido 2 es un agente terapéutico preferido para el tratamiento o prevención de la malaria (una acción que requiere la inhibición de DARC, pero no la modulación de la señalización de quimiocinas).

Los péptidos tales como péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO:3), que tienen muy alta afinidad por el receptor de DARC, pueden tener fuerte actividad biológica agonista in vivo (aunque sólo son agonistas débiles o agonistas neutros in vitro). Además, el péptido 2, sus variantes y derivados pueden ser fuertemente proinflamatorios in vivo, o exacerbar fuertemente la inflamación existente al impedir que DARC realice la función de unión a quimiocinas. Si DARC actúa como sumidero para eliminar quimiocinas de la circulación, posteriormente la concentración de quimiocinas puede aumentar marcadamente por la presencia del péptido 2. En condiciones en que las quimiocinas se liberan a la circulación (por ejemplo, durante la inflamación), el péptido 2 puede exacerbar la inflamación, permitir que la inflamación persista más tiempo que en ausencia del péptido o cambia de otro modo la naturaleza cualitativa de la reacción inflamatoria. Por estas razones, los péptidos con una relación de especificidad por DARC baja son útiles para el tratamiento de enfermedades que requieren mejor función inmune, o enfermedades que se caracterizan por una respuesta inflamatoria patológicamente inadecuada.

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MIP1-\alpha ha demostrado previamente ser la única quimiocina que no se une con afinidad significativa a DARC. El péptido 2(1-9)[MCP-1] tiene una afinidad por Duffy de aproximadamente 50 \muM mientras que el péptido 2(1-15)[MIP1-\alpha] (SEQ ID NO:5) fue un agente de unión potente para el receptor de MIP1-\alpha y tuvo excelente especificidad sobre DARC. Es decir, el péptido 2(1-15) [MIP1\alpha] (SEQ ID NO:5) no se unió a DARC (constante de asociación > 50 \muM) pero se unió fuertemente a los receptores de quimiocinas en las células THP-1 (constante de asociación = 100-900 nM; el número de sitios de unión es aproximadamente 150.000 por célula). Más aún, este agente no inhibió la migración de las células THP-1 inducida por MCP-1, MIP1\alpha, IL-8 o SDF1\alpha. En consecuencia, este último agente puede ser particularmente útil como agente de unión a receptores de quimiocinas neutros in vivo, altamente selectivo sobre DARC.

El péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) también se une a DARC, aunque se une a DARC con sólo una afinidad similar a la que se une a los receptores de quimiocinas (intervalo de concentración \muM bajo). Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:14) esencialmente no tuvo capacidad de unión a DARC, a la vez que inhibió la migración inducida por MCP1 a concentraciones de aproximadamente 1 \muM. En consecuencia, los derivados del péptido 3, tal como Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:14), pueden lograr propiedades antagonistas in vivo.

Los fragmentos más cortos del péptido 3[MCP-1] (por ejemplo, el péptido 3(7-12)[MCP-1] (SEQ ID N0:9)) mostraron relaciones de especificidad por DARC progresivamente mayores (aproximadamente 3,0 para el péptido 3(7-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:9) versus 1,0 para el péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1)), lo que indica que cuando se desea la especificidad del receptor para la señalización de quimiocinas, en general se prefieren los fragmentos de péptidos más cortos que retienen actividad completa de antagonista o agonista de quimiocinas por sobre los péptidos de longitud completa.

El péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) (relación de especificidad por DARC = 1,00) es poco probable que sea útil como inhibidor de pan-quimiocinas in vivo, mientras que Leu_{4}Ile_{11} péptido 3[MCP-1] (SEQ ID NO:14) (relación de especificidad por DARC = 37,83), o sus derivados tales como CRD-Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(3-12)[MCP-1], que sólo se unen débilmente a DARC (constante de asociación = 90 \muM) pero se unen muy fuertemente a los receptores de quimiocinas en las células THP-1 (constante de asociación = 100-500 nM; el número de sitios es aproximadamente 150.000 por célula), son una realización preferida para el tratamiento o la prevención de la aterosclerosis, osteoporosis y enfermedades autoinmunes, y la infección por VIH (funciones de unión a receptores de señalización de quimiocinas). Más aún, CRD-Cys_{13}Leu_{4}Ile_{11}péptido 3(3-12)[MCP-1] inhibió la migración de las células THP-1 inducida por MCP-1, MIP1\alpha, IL-8, y SDF1, con DE_{50} muy similares.

CRD-péptido 2(1-15)[MCP-1] tiene una potencia más funcional, menos actividad de unión a Duffy en comparación con el derivado LFL. El LRD péptido 2(1-15)[MCP-1] tuvo una reducción de la unión a Duffy de aproximadamente 100 veces (25 \muM versus 100 \muM para LFL).

Un abordaje alternativo para preparar agentes que sean biodisponibles es la preparación de análogos no peptídicos de las quimiocinas. Un análogo no peptídico preferido de la invención incluye un isóstero de WIQ, por ejemplo un compuesto de fórmula (IV), donde Z=CH_{3}; Y=O; X=CH_{3}; y Ar = indolilo. Este compuesto no se unió a DARC (constante de asociación = > 30 \muM) pero se unió muy fuertemente a los receptores de quimiocinas a células THP-1 (constante de asociación = 100 nM-1 \muM; el número de sitios es aproximadamente 150.000 por célula). Este agente inhibió la migración de las células THP-1 inducida por MCP-1, MIP1\alpha, IL-8 y SDF1\alpha con DE_{50} muy similares.

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TABLA 5

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Ejemplo 5 Actividad Anti-VIH de los Agentes de la Invención

Para demostrar que los agentes de la invención inhiben la unión del VIH y la infección de las células, se incubaron células Jurkat derivadas de células T humanas con una cepa de VIH con tropismo T infecciosa en presencia de (i) ningún inhibidor, (ii) péptido C (Tabla 5) como péptido control inactivo, (iii) 100 \muM de péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1) o (iv) 100 ng/ml de SDF-1, que debería unirse a y bloquear todos los receptores CXCR-4. Después de 3 semanas de cultivo, se evaluó la replicación viral por un ensayo de transcriptasa inversa del medio de cultivo. Se halló que el péptido 3(1-12)[MCP-1) (SEQ ID NO:1) es un inhibidor efectivo de la infección de las células Jurkat con VIH (Figura 3).

Dado que el péptido 2(1-15)[MCP1] (SEQ ID NO:3) se une a los receptores de quimiocinas en la superficie de las células Jurkat y células THP-1, pero no inhibe la señalización productiva por las quimiocinas, es posible que el péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO:3) se una e inhiba un epitopo usado por el VIH para ingresar a la célula pero no por MCP-1 para la señalización. Para probar esta hipótesis, se empleó el mismo ensayo de infección con VIH descrito anteriormente para examinar si el péptido 2(1-15)[MCP-1] (SEQ ID NO:3) inhibe la infección con VIH de las células Jurkat. A 100 \muM, el péptido 2(1-155)[MCP-1] ](SEQ ID NO:3) fue más efectivo que el péptido 3(1,12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1), y tan efectivo como SDF1\alpha, para impedir la entrada del virus.

Los derivados del péptido 2 (Figura 10) son mejores inhibidores de las células T Jurkat de la infección con VIH (un evento mediado por CXCR4) que los derivados del péptido 3, mientras que en forma sorprendente el péptido 3 es un mejor inhibidor de la infección de las células THP-1 (un evento mediado por CCR-5). En consecuencia, las combinaciones del péptido 2 y el péptido 3 pueden ser particularmente útiles para la terapia anti-VIH, por ejemplo, para inhibir las infecciones productivas por cepas tanto de tropismo M como tropismo T.

Además, dado que el LRD péptido 2(1-15)[MCP-1] tenía una constante de afinidad de 100 nM o menor para CCR5/CXCR4 y una disminución de 100 veces en la unión de Duffy respecto del LFL péptido 2[MCP-1], los derivados LRD pueden ser más eficaces que sus equivalentes LFL (25 \muM versus 100 \muM para LFL).

Las terapias actuales para la inhibición del VIH se centran en el virus, por ejemplo inhibidores de transcriptasa inversa o inhibidores de proteasa viral. Estas terapias sólo son efectivas durante un período limitado. En cada caso, la eficacia se reduce porque el virus está experimentando una replicación rápida, y existe una selección a favor de los mutantes que son resistentes a los inhibidores. Si bien las terapias combinadas son más efectivas, es poco probable que causen la eliminación del virus de un individuo afectado. Finalmente, se originará el virus mutante que sortea el cóctel de fármacos y se producirá la progresión nuevamente en el individuo ahora resistente a los fármacos. En consecuencia, las estrategias que se basan en la inhibición del correceptor dirigido a una proteína del hospedante, más que a una proteína viral, pueden tener mayor eficacia ya que se pueden necesitar mutaciones más extensas del virus para sortear un correceptor inhibido. En efecto, la resistencia a la infección de los homocigotas CCR-5\Delta32 sugiere que el virus no puede adaptarse fácilmente al uso de un correceptor alternativo, al menos mientras la población del virus sea pequeña.

Preferiblemente, se emplea una variante Ser10 del péptido 2(1-15)[MCP-1] (SYRRITSSKSPKEAV), o su derivado LRD Cys_{0}Ser_{10}Cys_{15} (cvaekpsksstirrysc) o derivado de CRD. La unión a DARC de SYRRITSSKSPKEAV está en el intervalo 20 \muM a 100 \muM y la actividad, en el intervalo 1-100 nM como agente anti-VIH.

Ejemplo 6 Método de Análisis Rápido para Infectividad

Los ensayos actuales para infección por VIH in vitro llevan mucho tiempo y carecen de reproducibilidad. Por ejemplo, la infección a menudo se controla con la producción de actividad de la transcriptasa inversa (RT) viral usando un sustrato de RT radiomarcado. Lamentablemente, la producción de RT es baja, aun cuando se use una cepa de VIH adaptada al laboratorio para infectar una línea permisiva alta tal como la línea de células T Jurkat humanas. Como resultado, es necesario que las células infectadas se cultiven durante dos o más semanas para permitir producir la suficiente infección para que la producción de RT sea medible. Además de llevar mucho tiempo, este ensayo tiene muchas otras desventajas: la de mayor importancia, que este ensayo depende de múltiples rondas de infección secundaria para aumentar suficientemente el título viral para que la actividad de RT sea detectable. Como resultado, las pequeñas diferencias en la infección primaria se magnifican, y debido a que la infección primaria con frecuencia es baja, las diferencias estocásticas entre los pocillos tratados idénticamente se vuelven significativas. Por ende, el ensayo requiere muchos pocillos replicados para cada análisis, se usan de rutina hasta 24 replicados. Por ejemplo, en un ensayo típico en placas de 96 pocillos, se infectan grupos de 24 pocillos de células Jurkat con alícuotas replicadas del patrón del virus VIH, con un grupo que recibe el tratamiento con el péptido 2 como inhibidor del correceptor de quimiocinas, otro grupo que recibe SDF-1\alpha (el ligando de CXCR-4 natural) y un tercer grupo no se trata. Después de tres semanas, las células se recolectaron y se midió la actividad de RT. El coeficiente de variación en los pocillos no tratados fue 37%. Como resultado, si bien el péptido 2 inhibió la actividad de RT en un 75%, esto sólo fue significativo con p=0,02 a causa de la alta variabilidad de pocillo a pocillo. Esto necesita el uso de muchos replicados, lo que hace al ensayo engorroso a los fines analíticos.

Un método alternativo es usar la visualización directa de las proteínas de VIH, por ejemplo por microscopia de inmunofluorescencia. Lamentablemente, aun las proteínas de VIH más altamente expresadas (tales como p24gag) están presentes en niveles relativamente bajos en las células. En consecuencia, la detección directa en las etapas más tempranas ha sido difícil y propensa a error. En consecuencia, se empleó el siguiente método para aumentar la sensibilidad de la inmunofluorescencia, lo que permite determinar con precisión la cantidad de células infectadas con VIH entre 24 horas y 72 horas después de la infección. Por otra parte, la relación señal a ruido de esta técnica permite el recuento automatizado de las células infectadas usando un programa de computación de análisis de imagen.

Para las células THP-1, las células se adhieren a portaobjetos multi-pocillo de vidrio (por ejemplo, portaobjetos en cámara de 16 pocillos; Nunc) usando PMA e hidrocortisona. Las células posteriormente se exponen al virus en el portaobjeto de la cámara en presencia de varios agentes de ensayo. Para células no adherentes tales como las células Jurkat, las infecciones se llevan a cabo colocándolas en, por ejemplo, placas de cultivo de 96 pocillos como en los ensayos de RT, pero antes del análisis las células se fijan a portaobjetos de vidrio usando un aparato cyrospin de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células infectadas se fijan sobre los portaobjetos de vidrio entre 24 horas y 72 horas después de la infección, por ejemplo, por inmersión de los portaobjetos en acetona fría en hielo durante 90 segundos. También se pueden usar otros métodos de fijación compatibles con la inmunofluorescencia cuantitativa (véase J. Histochem. Cytochem., 44,1043 (1997) para una descripción de procedimientos de inmunofluorescencia cuantitativa). Después de la fijación, se bloquea la unión no específica de las proteínas a las células, por ejemplo, por incubación en albúmina sérica bovina 3% p/v libre de ácidos grasos en solución salina amortiguada con fosfato (3% de FAF-BSA en PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente. En forma alternativa, se pueden usar otras soluciones de bloqueo (por ejemplo, 5% de sacarosa, 5% de Tween-20 en PBS). Las secciones bloqueadas posteriormente se tiñen para determinar la proteína de VIH, por ejemplo, usando un antisuero específico para p24gag. Los portaobjetos se incuban con el antisuero en una concentración adecuada (usualmente en el intervalo 1-100 \mug/ml de la IgG específica) en 3% de FAF-BSA en PBS. Se pueden usar anticuerpos para otros antígenos HIV, si bien se prefieren los antígenos con expresión relativamente alta tales como p24gag.

Esta incubación se debe dejar en marcha durante al menos 16 horas. Los procedimientos de inmunofluorescencia tradicional usan períodos de incubación de anticuerpo primario de normalmente 1-2 horas de duración, pero una incubación más larga aumenta la señal sin aumentar el fondo (J. Histochem. Cytochem., 44, 1043 (1997)). La incubación se puede dejar hasta 36 horas sin efectos perjudiciales sobre la relación señal a ruido. El anticuerpo no unido posteriormente se lava. Típicamente, esto involucra lavados de 3 x 3 minutos en PBS, aunque se pueden usar otros regímenes de lavado (véase J. Histochem. Cytochem., 44, 1043 (1997)) para una comparación de métodos de lavado). Normalmente, se usa un segundo anticuerpo marcado con un fluoróforo apropiado para detectar el anticuerpo primario no unido. Sin embargo, para evitar que el anticuerpo primario se escape del antígeno, el anticuerpo primario se pos-fija a la sección. Esto se puede obtener, por ejemplo, incubando el portaobjeto en paraformaldehído 4% recién preparado en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de tres lavados adicionales, por ejemplo 3 x 3 minutos en PBS, los portaobjetos se exponen a un anticuerpo secundario específico para la especie del anticuerpo primario acoplado a un fluoróforo apropiado (por ejemplo, conjugado de IgG anti-conejo FITC a razón de 1-100 g/ml). Se debe incluir un colorante nuclear no específico en esta incubación. Por ejemplo, se podría usar Hoechst 33342 a 1-100 ng/ml, o yoduro de propidio a 1-100 ng/ml. Esta incubación es durante un mínimo de aproximadamente 4 horas, preferiblemente al menos 8 horas y se puede dejar hasta 24 horas sin efectos perjudiciales en la relación señal a ruido. Los portaobjetos posteriormente se lavan, por ejemplo 3 x 3 minutos en PBS, para eliminar el anticuerpo secundario no unido y se montan en un medio de montaje adecuado tal como Citifluor AF1. Los portaobjetos se dejan al menos aproximadamente 18 horas después del montaje pero menos de aproximadamente 72 horas en una caja oscura después del montaje antes del análisis.

El análisis se puede realizar manualmente usando cualquier microscopio adecuado con capacidad de visualizar epifluorescencia y conjuntos de filtros apropiados para permitir el examen de la fluorescencia del fluoróforo del anticuerpo secundario seleccionado (por ejemplo, FITC) y el seleccionado con tinción nuclear inespecífica (por ejemplo, Hoechst 33342) por separado. La cantidad de células en cada campo visual se determina por el recuento de los núcleos mediante filtros para visualizar la tinción nuclear no específica. La cantidad de células infectadas por VIH en el mismo campo visual posteriormente se determina por el cambio del conjunto de filtros para visualizar el fluoróforo acoplado al anticuerpo secundario. En cada caso, la cantidad de células se puede determinar por recuento manual. En forma alternativa, se puede usar un programa de análisis de imágenes (por ejemplo, programa de computación OpenLab: Improvision, R.U.) para aplicar un umbral constante a cada imagen y contar la cantidad de objetos separados por enzima de este umbral. Los algoritmos de desaglomeración, estándares en el campo del análisis de imágenes, se pueden aplicar, según se necesite de acuerdo con la densidad de las células en los portaobjetos. Con la condición de que se use el conjunto de condiciones de iluminación constantes durante la obtención de imágenes y que se aplique un umbral constante, la fracción de células con VIH teñidas se puede determinar en forma rápida y precisa sin referencia a consideraciones subjetivas.

La Figura 11 muestra los resultados de la inhibición de la infección por VIH con el péptido 2(1-15)[MCP-1] y el péptido 3(1-12) [MCP-1]. El coeficiente de variación para la técnica es menor del 5% con reproducibilidad excelente. Aproximadamente 6% de las células THP-1 se infectaron con VIH en ausencia de los inhibidores peptídicos de los receptores de quimiocinas. En presencia de 100 \muM de péptido 2, esto se redujo al 25% \pm 3%. Puede observarse una reducción estadísticamente significativa de la infección viral a partir de una sola determinación, usando múltiples campos visuales dentro del pocillo único para establecer diferencias significativas. Los resultados positivos se pueden confirmar por análisis de pocillos replicados y se pueden construir curvas de dosis-respuesta.

Cuando la expresión del antígeno de VIH seleccionado es baja, o cuando la detección es muy prematura después de la infección (de aproximadamente 14 horas después de la infección), se puede mejorar adicionalmente la sensibilidad de esta técnica. Después de la incubación con el anticuerpo secundario, se aplica una etapa de pos-fijación adicional (por ejemplo, 10 minutos a temperatura ambiente en paraformaldehído 4% en PBS) y los portaobjetos se incuban con una fracción de inmunoglobulina no inmune de la misma especie como anticuerpo primario (es decir, suero de conejo no inmune). Esta incubación puede ser durante 1-2 horas a temperatura ambiente. De aquí en adelante, se realiza posteriormente una segunda incubación con el mismo anticuerpo primario que se usó previamente. En este caso, la tinción nuclear no específica (por ejemplo, Hoechst 33342) se añade a la segunda incubación sólo con anticuerpo secundario. Todas las incubaciones deben estar separadas por un régimen de lavado apropiado (por ejemplo, 3 x 3 minutos en PBS a temperatura ambiente). Estos cambios llevan a un incremento adicional de cinco veces en la sensibilidad para la detección del antígeno de VIH para permitir la detección más temprana de la infección.

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Ejemplo 7 Preparación y Caracterización de Agentes Terapéuticos Tripeptídicos de la Invención

Para determinar si los fragmentos del péptido 3(1-1 2)[MCP-1] poseían actividad biológica, se prepararon fragmentos del péptido 3. Se halló que el péptido 3(10-12)[MCP-1], es decir, WVQ, es un inhibidor potente de todas las quimiocinas analizadas (Tabla 6). Los residuos de aminoácidos de las posiciones 10-12 (WVQ) están conservados en muchas otras quimiocinas, por ejemplo MCP-3, MIP1\alpha, MIP1\beta, RANTES, EOTAXINA e IL8, aunque SDF1 tiene la secuencia WIQ. WVQ inhibió las cuatro quimiocinas representativas analizadas, aunque, a diferencia del péptido 3(1-12)[MCP-1] (SEQ ID NO:1), fue un inhibidor más potente que todas las quimiocinas diferentes de MCP-1, con DE_{50} de aproximadamente 1 \muM. En consecuencia, estos tripéptidos, WVQ y WIQ, así como los análogos no peptídicos basados en estos tripéptidos, son inhibidores de quimiocina pan-específicos. Más aún, se halló que WVQ tenía buena selectividad Duffy (es decir, selectividad de 10).

El péptido 3(7-9)[MCP-1], es decir, KQK, no se unió a DARC (constante de asociación = > 50 \muM) pero se unió fuertemente a los receptores de quimiocinas de las células THP-1 (constante de asociación = 500 nM-1 \muM; el número de sitios es aproximadamente 15.000 por célula). Este agente inhibió la migración de las células THP-1 inducida por MCP-1, pero no inhibió la migración inducida por MIP1\alpha, IL-8 o SDF1\alpha. En consecuencia, se encontró que KQK con una DE_{50} = 2-5 \muM es un inhibidor específico de MCP-1, es decir, no tuvo efecto sobre la actividad inducida por MIP1\alpha, SDF1\alpha o IL8 aun a 100 pM. También se analizaron cuatro tripéptidos y un dipéptido de secuencia aleatoria (RGD, GGA, TTT, APG y VE). Ninguno de estos inhibió en forma significativa la migración inducida por cualquiera de las quimiocinas. En consecuencia, el tripéptido KQK fue específico para inhibir la actividad de MCP-1, que muestra una especificidad más de 100 veces mayor para MCP-1 que para todas las otras quimiocinas analizadas.

Los equivalentes tripeptídicos de KQK de MIP1\alpha, SDF1\alpha y IL8, basados en un alineamiento de residuos de cisteína conservados en las secuencias de quimiocinas, posteriormente se analizaron para determinar su inhibición de migración de MIP1\alpha inducida por quimiocinas. En cada caso, el tripéptido fue altamente específico para su quimiocina afín (> 100 veces más específica en cada caso). Por ejemplo, SEE, el péptido afín de MIP1\alpha, mostró una selectividad 100 veces mayor para MIP1\alpha que para las otras quimiocinas. Además, KLK fue un inhibidor específico y potente de SDF 1, y KEN fue un inhibidor específico y potente de IL8. En ningún caso el tripéptido inhibió significativamente la migración inducida por cualquiera de las quimiocinas no afines, incluso a 100 \muM. Se prevé que los tripéptidos en los que se realiza una sustitución conservadora tienen la misma especificidad que el tripéptido nativo. Más aún, los correspondientes tripéptidos de otras quimiocinas pueden ser específicos para sus quimiocinas afines.

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TABLA 6

35

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Ejemplo 8 Farmacocinética y Toxicidad In Vivo

Cuando se administró ^{3}H-D-ala péptido 3(1-12)[MCP-1] (^{3}H-D-ala unido a Asp) como un bolo IV o SQ a ratones, se alcanzaron las concentraciones máximas en 1 hora. Este péptido radiomarcado se excretó rápidamente (aproximadamente 4 horas), principalmente a través del riñón. Los datos de biodistribución indicaron que el órgano blanco primario fue el riñón, con cantidades mucho menores detectadas en sangre, hígado e intestino. En contraste, se detectó CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13} péptido 3(3-12)[MCP-1) durante 24 horas o más en la circulación, presumiblemente como resultado de su unión a Duffy. La comparación directa de ^{3}H-D-ala péptido 3(1-12)[MCP-1] (no unión a DARC y eliminación rápida) y CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] (débil unión a Duffy y buena semivida sérica) indica que los péptidos de la invención pueden ser particularmente útiles para incrementar la semivida de otros agentes farmacéuticos.

Se usó una técnica de DL_{50} modificada para determinar el valor de DL_{50} intravenosa de ratón para CRDLeu_{4}Ile_{11}
Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1]. La DL_{50} = 11,4 mg/ratón IV, que es 569 mg/kg. Esta es equivalente a una dosis IV humana de 39 gramos. Esta es diez veces mayor que la dosis eficaz observada en el modelo de asma o el modelo de endotoxemia (véase los siguientes Ejemplos). La administración intraperitoneal de 11 mg no causó letalidad. Desde el punto de vista histológico, la toxicidad se limitó a los riñones y tejidos linfoides.

A la dosis letal, se observó apoptosis de linfocitos en el bazo y tejido linfoide asociado al intestino. La toxicidad limitante de la velocidad fue en el riñón. Hubo un aumento dependiente de la dosis en nefrosis tubular aguda. Esto muy probablemente es debido al enorme bolo intravenoso (569 mg/kg) de un péptido de peso molecular bajo que se excreta muy rápidamente (primer paso) por el riñón. Es muy similar al cambio observado en los pacientes con liberación masiva de mioglobina o hemoglobina después de lesiones por aplastamiento o hemólisis masiva. A la dosis letal, se observó evidencia histológica de nefrosis tubular aguda y muerte celular linfoide moderada.

Utilizando una fase in vivo de un estudio de toxicidad aguda en rata, no se hallaron cambios clínicamente detectables asociados con la administración del agente de ensayo de dosis de hasta 10 mg IV. En un estudio de toxicidad de dosis repetida de 7 días en ratas, no se observaron signos clínicos en los animales tratados.

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Ejemplo 9 Uso de los Agentes de la Invención en un Modelo de Inflamación Dérmica en Rata

Para evaluar la eficacia de un agente de la invención en la prevención de la inflamación dérmica inducida por lipopolisacáridos (LPS) y MCP-1 en la rata, se administraron tres dosis diferentes de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1]. Se estimuló una respuesta inflamatoria por inyección intradérmica (abdomen ventral) de 500 ng de MCP-1 o 100 ng de MCP-1 junto con un vehículo de solución salina tamponada con fosfato libre de endotoxinas (como control negativo) y un lipopolisacárido bacteriano (LPS; como control positivo). Cada sustancia se inyectó en un sitio diferente. Los resultados obtenidos de los animales cuando se compararon con los animales tratados con CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] y tratados con PBS (diluyente control). Treinta minutos antes de la administración intradérmica de agonista, los animales recibieron una dosis inicial intravenosa (3, 30 o 300 mg) y una dosis de depósito subcutáneo (0,1, 1 o 10 mg) (en el dorso) del inhibidor de pan-quimiocinas CRDLeu_{4}Ile_{11}Cys_{l3}péptido 3(3,12)[MCP-1) (véase, por ejemplo, la Figura 17). Los animales se sacrificaron 20-24 horas pos-inyección. Se recolectaron sangre y orina. Los sitios de inyección intradérmica del agonista se recolectaron, bisecaron y se evaluó el grado de respuesta inflamatoria por histopatología e inmunofluorescencia cuantitativa (fijada y congelada) (por ejemplo, después de la inyección de MCP-1, se determinó el número de monocitos/macrófagos en la piel usando el anti-CD14 (MCA342 de Serotec; clon ED2) a 3 \mug/ml toda la noche a 4ºC. El segundo anticuerpo fue FITC anti-ratón de rata (415-096-100 de Jackson ImmunoResearch) a 28 \mug/ml durante 6 horas a temperatura ambiente). Además, se evaluó la toxicidad de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3,12)[MCP-1] por recolección de las siguientes muestras de tejido en formalina 10% tamponada neutra para análisis histológico: pulmón, hígado, riñón, bazo, timo, corazón y sitio de inyección del antagonista (agente de ensayo).

Los resultados de un experimento típico se muestran en las Figuras 9 y 10. El tratamiento sistémico con CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13} péptido 3(3-12)[MCP-1] anuló completamente el reclutamiento de monocitos/macrófagos inducido por MCP-1 (p = 0,009). Esto es coherente con la inhibición potente de la migración inducida por MCP-1 que se observa in vitro con este agente. Por otra parte, CRDLeu_{4}Ile_{11}Cys_{13} péptido 3(3-12)[MCP-1] redujo el número de monocitos/macrófagos del tejido residente que recibió sólo PBS y también en la piel no tratada. Esto es coherente con una regulación por disminución sistémica del reclutamiento de monocitos/macrófagos 24 horas después de un tratamiento único con CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3,12)[MCP-1). En contraste, el D-ala péptido 3(1-12)[MCP-1] no tuvo efecto in vivo (p=0,754), de acuerdo con su carencia de actividad in vitro en el ensayo de migración.

También se observó una sustancial reducción (>80%) en la cantidad de monocitos/macrófagos reclutados en respuesta al LPS bacteriano inyectado. El LPS fue un inductor más potente del reclutamiento de macrófagos que MCP-1 aun a 500 ng de dosis. Los estudios previos sugirieron que la acumulación de macrófagos mediada por LPS fue fuertemente dependiente de TNF-\alpha (un quimioatrayente que no es quimiocina) ya que los anticuerpos neutralizantes de TNF-\alpha redujeron marcadamente la inflamación inducida por LPS. Sin embargo, en modelos de endotoxemia (Ejemplo 10) el CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] redujo marcadamente los incrementos del TNF-\alpha plasmático inducidos por LPS, lo que sugiere que las quimiocinas pueden cumplir un papel en la inducción de TNF-\alpha, y que tanto la señalización de quimiocinas como la señalización de TNF-\alpha pueden ser necesarias para la inflamación máxima inducida por LPS.

Si bien MCP-1 es bastante específico como quimioatrayente de monocitos/macrófagos, la inyección dérmica de LPS induce el reclutamiento de una variedad más amplia de leucocitos, que incluye las células T y B y los neutrófilos. Se usaron anticuerpos específicos de células B de ratas (MCA 1432 de Serotec) a razón de 10 \mug/ml toda la noche a 4ºC para determinar si CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys13 péptido 3(3-12)[MCP-1] afectó el reclutamiento de esta subpoblación de leucocitos. El anticuerpo secundario fue FITC anti-ratón (415-096-100 de Jackson ImmunoResearch, como antes). Como en los monocitos/macrófagos, CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] sustancialmente inhibió el reclutamiento de las células B al sitio de la inyección de LPS (Figura 10). En consecuencia, los efectos antiinflamatorios de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] y otros derivados, análogos y variantes del péptido 2 no se limitan a reducir o inhibir la acumulación de macrófagos sino que también inhiben el reclutamiento de otros subconjuntos de leucocitos.

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Ejemplo 10 Uso de los Agentes de la Invención en un Modelo de Endotoxemia Murina

Se usa un modelo de endotoxemia de ratón para analizar péptidos en cuanto a su actividad funcional y de citoquina in vivo de una manera rápida. A ratones CD-1 hembras se les inyectó por vía i.p. (abdomen ventral) 583 \mug de LPS y TNF-\alpha, IFN-\gamma, IL-4 y proteína de MCP-1 y se determinaron los niveles de ARNm. Treinta minutos antes de la administración de LPS, a los animales se les administró una de las tres dosis diferentes de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] en forma de dosis inicial intravenosa y una dosis en bolo subcutáneo (en el dorso). Ratones tratados con PBS y sin administración de LPS fueron los controles positivos y negativos. Dos horas después, los animales se sometieron a eutanasia y se recolectó suero. El suero se separó del pellet celular y se congeló hasta el análisis por ELISA de los niveles de citoquinas. Se recogieron muestras de pulmón e hígado para el análisis de ARNm y el CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] demostró una reducción dependiente de la dosis de TNF-\alpha sérico. También se determinaron los niveles séricos y de ARNm de IL-4, IFN-\gamma y MCP-1.

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Ejemplo 11 Uso de los Agentes de la Invención en un Modelo de Asma en Ratón

Para determinar si el aumento de las dosis de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] altera el número de células y tipo de células dentro del pulmón, a los ratones se les inyectó CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1]por vía intravenosa, intravenosa e intratraqueal, o intratraqueal sola. Los ratones se sacrificaron 20-24 horas pos-inyección. Se recogieron los pulmones para el aislamiento de las células, que posteriormente se contaron y caracterizaron por tinción de superficie para CD3, CD4, CD8, B220 y Mac-1.

El número total de células aisladas de los pulmones fue mayor en todos los grupos que recibieron dosis bajas de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13} péptido 3(3-12)[MCP-1] (0,3 \mug IV y/o 10 \mug IT) en comparación con los ratones tratados con PBS. No hubo diferencias significativas en la cantidad total de células aisladas de los pulmones de ratones tratados con dosis altas de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] en comparación con los controles de PBS.

Por análisis FACS, la dosis alta de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] redujo significativamente los porcentajes de células CD3, CD4 y B220 por todas las vías de administración en comparación con los controles de PBS. En contraste, no existieron diferencias significativas en los porcentajes de células CD3, CD4 o B220 de los grupos tratados con dosis bajas de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] por todas las vías de administración.

Otro estudio evaluó la capacidad de dos concentraciones crecientes de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] para reducir el infiltrado inflamatorio pulmonar, inhibir los aumentos de anticuerpo IgE y alterar los porcentajes de células inflamatorias específicas en los pulmones y sangre de ratones estimulados por vía intratraqueal con ovoalbúmina. Véase Gonzalo et al., J. Clin. Invest., 98, 2332 (1996): Gonzalo et al., J. Exp. Med., 188, 157 (1998).

Los ratones se sensibilizaron con 0,1 mg de ovoalbúmina en 200 \mul de PBS (diluyente control) por vía intraperitoneal (Tabla 76). Ocho días después de la sensibilización, los ratones recibieron una dosis inicial intravenosa (0,3 o 30 \mug) y una dosis de depósito subcutánea (10 \mug o 1 mg) del inhibidor de pan-quimiocinas CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1]. Treinta minutos después de la administración de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1], los ratones se estimularon con ovoalbúmina al 1% o PBS (diluyente control) por vía intratraqueal. Veintiún días después de la sensibilización, los ratones recibieron una segunda dosis inicial intravenosa (0,3 o 30 \mug) y una dosis subcutánea (10 \mug o 1 mg) del inhibidor de pan-quimiocinas CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cysl3péptido 3(3-12)[MCP-1]. Treinta minutos después de la administración de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1], los ratones se estimularon con ovoalbúmina al 2% o PBS (diluyente control) por vía intratraqueal. Los ratones se sacrificaron 3 horas después del estímulo con ovoalbúmina el día 21. Se recogieron los pulmones para histopatología y el aislamiento de las células para recuentos de células totales y análisis FACS. Los PBL se recolectaron para el análisis FACS. El suero se recolectó para determinar los niveles de IgE.

Por análisis FACS, hubo porcentajes significativamente menores de células CD3, CD4, B220 y Mac-1 en los pulmones de ratones tratados con ambas dosis de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] (0,3 IV/10 \mug por vía subcutánea o 30 \mug IV/1 mg por vía subcutánea) en comparación con los ratones que recibieron PBS antes del estímulo con OVA. El porcentaje de células CD8 fue similar en todos los grupos. Además, el número total de células aisladas de los pulmones de los ratones con CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] fue similar a los ratones tratados con PBS pero significativamente menor que en los ratones tratados con OVA y PBS, lo que sugiere que el agente alteró el tráfico de las células inflamatorias en el pulmón. En la sangre, hubo porcentajes significativamente mayores de células CD3 y CD4 y porcentajes menores de B220 en los ratones tratados con ambas dosis de CRDLeu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] en comparación con los ratones tratados con OVA (control positivo) y los ratones tratados con PBS (diluyente control). Los ratones tratados con la dosis alta tuvieron menos células Mac-1 en el compartimiento PBL en comparación con los otros grupos.

Desde el punto de vista histológico, todos los ratones tratados con la dosis alta de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] presentaron mínimos o ningún infiltrado inflamatorio en el pulmón, de modo similar a los ratones tratados con PBS solo. Los ratones que recibieron la dosis baja de CRDLeu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] también presentaron inflamación mínima en comparación con los ratones tratados con PBS y OVA. Se observaron escasos eosinófilos sólo en el grupo de PBS OVA (control positivo), que es una respuesta esperada para la sensibilización con OVA.

Los niveles de IgE fueron significativamente superiores en los ratones tratados con PBS y OVA en comparación con todos los otros grupos. La IgE no fue detectable por encima del valor umbral en todos los grupos de ratones tratados con CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1].

Un tercer estudio evaluó la capacidad de tres dosis crecientes de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] para reducir el infiltrado inflamatorio pulmonar, inhibir los aumentos de anticuerpo IgE y alterar los porcentajes de células inflamatorias específicas en el pulmón de los ratones estimulados por vía intratraqueal con ovoalbúmina. Los ratones se sensibilizaron con 0,1 mg de ovoalbúmina o PBS (diluyente control) por vía intraperitoneal. Ocho días después de la sensibilización, los ratones recibieron una dosis subcutánea (10,3 \mug, 103 \mug, o 1,03 mg) del inhibidor de pan-quimiocinas CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1]. Treinta minutos después de la administración del CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1], los ratones se estimularon con ovoalbúmina al 1% o PBS (diluyente control) por vía intratraqueal. Quince, dieciocho y veintiún días después de la sensibilización, los ratones recibieron dosis subcutáneas (10,3 o 103 \mug o 1,03 mg) del inhibidor de pan-quimiocinas CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 36g (3-12)[MCP-1]. Treinta minutos después de la administración de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1], los ratones se estimularon con ovoalbúmina al 2% el día 21. Se recogieron los pulmones para histopatología y aislamiento de las células para recuentos de células totales y análisis FACS. El suero se recolectó para determinar los niveles de IgE, IL-4 e
IFN-\gamma.

Por análisis FACS, hubo porcentajes significativamente menores de células Mac-1 en el pulmón de los ratones tratados con todas las dosis de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] en comparación con los ratones que recibieron PBS solo antes de ser estimulados con OVA. Desde el punto de vista histológico, todos los ratones tratados con la dosis alta o media de CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] presentaron menos infiltrados inflamatorios en el pulmón en comparación con los ratones que no fueron tratados con el péptido pero estimulados con OVA (control positivo). Los ratones tratados con PBS solo presentaron una inflamación mínima en el pulmón. Todos los ratones estimulados con OVA presentaron eosinófilos en el pulmón. De modo similar a los ratones tratados con PBS solo (control negativo), los niveles de IgE fueron significativamente menores en los ratones tratados con CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] en comparación con ratones tratados con PBS y OVA (control positivo).

En consecuencia, cuando se administró CRD-Leu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] por vía IV y subcutánea, o por vía subcutánea sola, alteró el tráfico de linfocitos en el pulmón después de la exposición a un antígeno. Lo que es más significativo, CRDLeu_{4}Ile_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] redujo la inflamación celular en el pulmón, las respuestas de IgE y la concentración de IL-4 en suero, las cuales están fuertemente asociadas con el asma. Las respuestas de IgE son dependientes de la respuesta de las células T Th2, que producen IL-4 e IL-5. Por ende, la observación de que CRD-Leu_{4}I1e_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] tiene un efecto de reducir IgE después del estímulo con OVA indica fuertemente que CRD-Leu_{4}I1e_{11}Cys_{13}péptido 3(3-12)[MCP-1] también puede reducir IL-4 e IL-5.

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Ejemplos 12

Tripéptidos Preferidos y sus Análogos

Los tripéptidos preferidos de la invención incluyen los péptidos KXK, donde X es uno de los veinte aminoácidos naturales, por ejemplo, KQK y KLK, así como péptidos que tiene KXK. Como se describe a continuación, los péptidos KXK son antiinflamatorios por dos mecanismos distintos. Algunos péptidos KXK son activadores de TGF-beta y otros son antagonistas de quimiocinas, y un subconjunto son ambas cosas (véase la Tabla B).

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TABLA B

37

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Para analizar si un tripéptido KXK activa a TGF-beta, se puede usar un ensayo tipo ELISA directo. TGF-\beta1 latente recombinante humana producido en células CHO (R&D Systems) se incubó con el activador de ensayo. Por ejemplo, 200 ng de TGF-\beta1 latente (a 20 \mug/ml) se incubaron con el péptido de ensayo con una concentración final de 100 nM a 37ºC durante 90 minutos. Después de la incubación, el TGF-\beta se incuba con el dominio extracelular recombinante del receptor de TGF-\beta tipo II (R2X) que se une sólo a las formas activas y no latentes de TGF-\beta1 (Clin. Chim. Acta, 235, 11 (1995)). Por ejemplo, 1 \mug de R2X purificado se recubre en una placa de ELISA Maxisorp en 50 \mul de carbonato de sodio 100 mM durante 2 horas a 4ºC, y posteriormente se bloqueó la unión de la proteína no específica por incubación con 5% de sacarosa y 5% de Tween-20 en solución salina tamponada con Tris durante 1 hora a temperatura ambiente.

La muestra de TGF-\beta posteriormente se incuba con los pocillos recubiertos y bloqueados durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. Los pocillos se lavan 3 veces rápidamente con solución salina tamponada con Tris que contiene 0,05% de Tween 20 entre cada incubación. Si alguno de los TGF-\beta1 latentes ha sido activado por incubación con el péptido de ensayo, es capturado por el R2X, mientras que el TGF-\beta1 latente remanente se elimina por lavado. El TGF-\beta1 activo capturado posteriormente se detecta por incubación con un agente de detección adecuado, tal como un anticuerpo anti-TGF-beta policlonal conjugado a peroxidasa. Por ejemplo, los pocillos se incuban con 200 \mul de anticuerpo anti-TGF-\beta1 de pollo BDA 19 acoplado a una peroxidasa de rábano durante 90 minutos a temperatura ambiente con agitación. Cualquier peroxidasa presente se detecta posteriormente usando un sustrato cromógeno adecuado (por ejemplo, solución de sustrato K-BLUE TMB). La cantidad de TGF-\beta activo generado se estima por interpolación de una curva estándar construida usando cantidades conocidas de TGF-\beta1 activo (R&D Systems).

La actividad antagonista de quimiocinas se puede determinar usando el ensayo de migración de THP-1 trans-pocillo descrito anteriormente en que el péptido se incuba en el compartimiento superior con las células mientras que se usa una quimiocina como quimioatrayente en el compartimiento inferior. Se analizaron cuatro quimiocinas: IL-8; SDF-1\alpha; MCP-1 y MIP1\alpha: los signos + en la Tabla 8 indican que el péptido fue activo como inhibidor de la migración inducida por al menos una de estas cuatro quimiocinas quimioatrayentes. La cantidad de signos + es un indicador cualitativo de la actividad de cada péptido en cada ensayo. Un signo menos indica actividad no detectable en el ensayo y n.d. indica que hasta la fecha no se ha realizado ningún intento para estimar la actividad del péptido dado en este ensayo.

KFK fue tan activo como RFK. Sin embargo, en marcado contraste con los informes previos, otros miembros de la serie KXK también fueron activos como activadores de TGF-\beta. Por ejemplo, KYK fue más activo que KFK. En consecuencia, la sustitución de lisina por arginina incrementa la variedad de aminoácidos de la posición 2 que activan a TGF-\beta.

KLK y KIK son de interés particular, ya que estos agentes son moléculas de acción antiinflamatoria dual. Estos tripéptidos son antagonistas específicos del receptor de SDF-1\alpha CXCR4, y también activan a TGF-\beta. En consecuencia, KLK, KIK y sus análogos y derivados, por lo tanto, probablemente son agentes farmacéuticos particularmente útiles para la prevención o tratamiento de una amplia variedad de trastornos antiinflamatorios.

Para la eosinofilia de injertos, tal como la asociada con el rechazo agudo a trasplantes, puede ser particularmente beneficioso un inhibidor de pan-quimiocinas o un inhibidor selectivo del reclutamiento de eosinófilos (tal como KKK o un análogo de éste). Tales agentes se pueden usar solos o en conjunto con dosis menores de esteroides, tales como prednisolona, que se usan actualmente para controlar los episodios de rechazo agudo. Los efectos secundarios graves están asociados con el uso de la dosis más alta de prednisolona (u otros esteroides) usada durante el rechazo agudo, y el uso de los agentes que reduzcan o anulen la necesidad de dar esteroides sería particularmente útil.

También se consideran los análogos de los péptidos KXK, por ejemplo los análogos de KQK. La cadena central (en un compuesto de fórmula V con R^{7} como sustituyente) se reemplaza con un sustituyente general R, donde R es la cadena lateral de alguno de los aminoácidos. Estos análogos (por ejemplo, la clase general de fluoroalquenos de un compuesto de fórmula (VI) son útiles para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades donde se desea la activación de TGF-\beta y/o la inhibición de la señalización de quimiocinas. Seleccionando un miembro apropiado de esta clase de moléculas, es posible manipular genéticamente las propiedades deseadas de la molécula. En consecuencia, la selección de análogos de KYK proporciona la potente activación de TGF-\beta en ausencia de inhibición de quimiocinas, mientras que los análogos de KLK tienen ambas propiedades. Los análogos de KQK tienen acción inhibidora sobre uno o más receptores de quimiocinas pero no activan a TGF-\beta.

En consecuencia, KYK, sus análogos y derivados se pueden seleccionar para usar en las enfermedades donde es particularmente beneficiosa la regulación por aumento de TGF-\beta, por ejemplo en aterosclerosis u osteoporosis. En contraste, los análogos de KQK se pueden seleccionar cuando se desea inhibición de quimiocinas pero la regulación por aumento de TGF-\beta puede no ser beneficiosa, por ejemplo en el tratamiento de la infección por VIH. .

Los péptidos KXK y sus isósteros pueden ser útiles para tratar la densidad mineral ósea baja, donde la elevación de TGF-beta y la inhibición selectiva de MCP-1 es probable que sean especialmente sinérgicas.

Los derivados o análogos de la clase KXK se pueden usar solos o en combinación con otras terapias para el tratamiento de trastornos inflamatorios u otras enfermedades o indicaciones tales como las que se describen en la presente. Por ejemplo, derivados o análogos de KYK se pueden usar en conjunto con esteroides para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, ya que permiten reducir las dosis normales de esteroides usados para reducir los efectos secundarios asociados con el uso crónico de esteroides.

También se prevé que las sustituciones conservadoras de los aminoácidos en las posiciones 1 y 3 no afectan las actividades de las moléculas. En consecuencia, una o ambas cadenas laterales de lisina (sea en un péptido o en un análogo tal como (VI)) pueden estar sustituidas con una cadena lateral arginilo o una cadena lateral ornitilo.

Claims

1. Un péptido aislado y purificado que comprende no más de 30 residuos de aminoácidos y que comprende una variante peptídica del péptido de quimiocina MCP-1, donde la variante peptídica comprende cualquiera de las SEQ ID Nos. 1, 7 a 11, 13 y 14, o una versión de secuencia D inversa cíclica (CRD) de dicha variante peptídica, o donde dicha variante peptídica es Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Ile-Gln, y donde el péptido inhibe la actividad de al menos una quimiocina nativa.

2. Un péptido definido de acuerdo con la reivindicación 1 para usar como medicamento.

3. Un péptido definido de acuerdo con la reivindicación 1 para usar como medicamento para el tratamiento de una indicación asociada con actividad inducida por quimiocinas.

4. Un péptido definido de acuerdo con la reivindicación 1 para usar en la inhibición de la actividad de más de una quimiocina.

5. Un péptido definido de acuerdo con la reivindicación 1 para usar como medicamento para modular la actividad inducida por quimiocinas de células hematopoyéticas en un sitio fisiológico preseleccionado, y donde dicho péptido está unido a un resto localizador de sitio.

6. Una composición farmacéutica que comprende un péptido definido de acuerdo con la reivindicación 1 y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.