DE69631529T2

DE69631529T2 - Cd4-derivierte peptide die einen immunrespons inhibieren

Info

Publication number: DE69631529T2
Application number: DE69631529T
Authority: DE
Inventors: Robert Korngold; Ziwei Huang
Original assignee: Thomas Jefferson University
Current assignee: Thomas Jefferson University
Priority date: 1995-06-29
Filing date: 1996-06-28
Publication date: 2004-12-23
Anticipated expiration: 2016-06-29
Also published as: WO1997001350A1; EP0835125B1; EP0835125A1; DE69631529D1; ATE259242T1; CA2226017A1; AU6406496A; EP0835125A4; JPH11510792A

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Unterdrückung von Immunreaktionen, die durch die Aktivierung von T-Zellen ausgelöst werden. Genauer betrifft sie Verbindungen, die die Oberfläche von CD4-Proteinmolekülen vortäuschen und auf diese Weise die Wechselwirkung von CD4 und MHC, Klasse II, Genprodukten stören, sowie Verfahren zur Identifizierung und Verwendung derartiger Verbindungen zur Unterdrückung unerwünschter Immunreaktionen.
2. Hintergrund der Erfindung
Ein T-Zelle ist ein Typ von Lymphozyten, oder "weißen Blutkörperchen", der die zelluläre Immunreaktion gegenüber fremden Makromolekülen vermittelt, die als Antigene bezeichnet werden. Obwohl T-Zellen für normale Säugetier-Immunreaktionen erforderlich sind, ist es in einigen Fällen wünschenswert, ihre Aktivierung zu inhibieren: beispielsweise reagieren bei einigen Autoimmunerkrankungen die T-Zellen einer Person auf "Selbst-Antigene", d. h. Makromoleküle, die von der Person erzeugt werden, statt auf fremderzeugte Makromoleküle, und schädigen die Zellen und Gewebe der Person.
Autoimmun-T-Zell-Reaktionen werden bei Personen gefunden, die an systemischem Lupus erythematodes (SLE), rheumatoider Arthritis (RA), insulinabhängigem Diabetes und multipler Sklerose (MS) leiden und tragen zur Pathophysiologie eines jeden der Leiden bei.
T-Zellen bewirken auch eine Transplantatabstoßung und die Transplantat-versus-Wirt-Krankheit (graft versus host disease; GVHD). Die Transplantatabstoßung wird durch eine Immunreaktion gegen die transplantierten Gewebe (das Transplantat) ausgelöst, die von T-Zellen des Empfängers (Wirts) als "fremd" erkannt werden. Die Transplantat-versus-Wirt-Erkrankung wird durch transplantierte T-Zellen bewirkt, die vom Wirt erzeugte Makromoleküle als "fremd" erkennen.
2.1. Rolle von CD4 bei der T-Zell-Aktivierung
Das CD4-Molekül, ein Glied der Immunglobulin-Superfamilie, ist ein Glycoprotein, das auf der Oberfläche von Helfer-T-Zellen exprimiert wird, White, R. H. H. et al., 1978, J. Exp. Med. 148: 664–73, die einen der beiden Haupttypen von T-Zellen darstellen. Helfer-T-Zellen erkennen Antigene nur, wenn die Antigene mit den Produkten der Klasse II des Haupt-Histokompatibilitätskomplexes assoziiert sind (class II MHC). CD4 und der T-Zell-Antigenrezeptor sind an einem Signalübertragungsweg beteiligt, durch den die Anwesenheit eines Antigens zur Aktivierung einer Antigen-spezifischen Helfer-T-Zelle führt. CD4 ist an der Antigen-freien, intra-thymischen Selektion des T-Zell-Repertoirs beteiligt. Teh, H. S., et al., 1991, Nature 349: 241–43.
Das CD4-Molekül hat zwei kritische Funktionen. Erstens bindet CD4 als Co-Rezeptor mit dem T-Zell-Antigenrezeptor an einen nicht-polymorphen Abschnitt der β-Kette des Klasse II-MHC-Moleküls auf der Antigen-präsentierenden Zelle. Doyle, C. & Strominger, J. L., 1987, Nature 330: 256–59; Gay D., et al., 1987, Nature 328: 626–29; Konig, R., et al., 1995, Nature 365: 796–98. CD4 kann die T-Zell-Reaktion bis zum 300-fachen gegenüber dem Grad potenzieren, der ohne CD4 erhalten wird. Janeway, C. A., 1991, Seminars in Immunology 3: 151–160. Zweitens weisen umfangreiche Befunde darauf hin, daß CD4 ein Signalübertragungsmolekül ist. Untersuchungen haben gezeigt: daß der cytoplasmatische Schwanz von CD4 mit der Tyrosinkinase p56^kk assoziiert ist, Veillette, A., et al., 1988, Cell 55: 301–08; Barber, E. K., et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3277–81; Turner, J. M., et al., 1990, Cell 60: 755–65; daß die Stimulation von CD4 mit einem monoklonalen Antikörper gegen CD4 die Aktivität der p56^kk-Kinase erhöht, Veillette, A., et al., 1989, Nature 335: 257–9; und daß eine Vernetzung von CD4 und dem T-Zell-Antigenrezeptor sowohl die T-Zell-Antigenrezeptor-vermittelte Tyrosinphosphorylierung, June, C. H., et al., 1990, J. Immunol. 144: 1591, als auch die Lymphokinproduktion verstärkt, Anderson, P., et al., 1987, J. Immunol. 139: 678–82; Emmrich, F., et al., 1987, Eur. J. Immunol. 17: 529–34. Diese Untersuchungen implizieren, daß CD4-Moleküle mit den anderen Zelloberflächenmolekülen des T-Zell-Antigenrezeptorkomplexes während der Übertragung von Signalen wechselwirken, die zur Aktivierung der Zelle führen, Miceli, M. C. & Parnes, J. R., 1993, Adv. Immunol. 53: 59–122: z. B. mit dem T-Zell-Antigenrezeptor/CD3-Komplex, Saizawa, K., et al., 1987, Nature 328: 260–63; Rivas A., 1988, J. Immunol. 140: 2912–18; sowie mit der CD45-Tyrosinphosphatase, Dianzani, U., et al., 1990 Eur. J. Immunol. 20: 2249–57. Es wurden auch CD4-CD4-Wechselwirkungen zwischen solubilisierten CD4-Proteinen beobachtet, Davis, S. J., et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 10410.
In jüngerer Zeit wurde vorgeschlagen, daß die Oligomerisierung von CD4 an der Zelloberfläche erforderlich sein kann, um eine stabile Bindung an Klasse II-MHC einzugehen, sowie für die T-Zell-Aktivierung. Sakihama, T., et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 6444. Wenn eine Wechselwirkung zwischen membrangebundenen CD4-Proteinen besteht, sind Ergebnisse der molekularen Modellierung konsistent mit einer Beteiligung an der Wechselwirkung von CDR3- und C-C'-Schlingen der D1- Domänen von CD4-Proteinen, Langedijik, J. P. M., et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 16875–78. Die externen Domänen (D1–D4) des CD4-Moleküls sind an diesen Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt.
Die Untersuchungen zur Wechselwirkung von CD4 und MHC, Klasse II, Genprodukten wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob Mutationen an ausgewählten Resten von CD4 das Binden von CD4-transfizierten Zellen und MHC, Klasse II, tragenden Zellen blockieren. Diese Untersuchungen deuten darauf hin, daß an der Wechselwirkung große Oberflächenbereiche des CD4-Moleküls beteiligt sind, insbesondere der Hauptteil der lateralen Oberfläche der D1-Domäne und der obere Teil der D2-Domäne. Clayton, L. K. et al., 1989, Nature 339: 548–51; Moebius, U., et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 12008–12; Moebius, U., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 8259–63.
Die Apposition der CD4-Tyrosinkinase p56^kk, der T-Zell-Antigenrezeptor-Tyrosinkinase p59^fyn, und der CD45-Tyrosinphosphatase führt dann zu den Signalen, die die T-Zellen aktivieren. Veillette, A., et al., 1988, Cell 55: 301–08; Barber, E. K., et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3277–81.
2.2. Multiple Sklerose wird von CD4⁺-T-Zellen vermittelt
Pathologisch bestehen die Läsionen von MS aus perivaskulären inflammatorischen Manschetten in der weißen Substanz des zentralen Nervensystems. Diese enthalten aktivierte und nicht-aktivierte Lymphozyten, Plasmazellen, Monozyten und Makrophagen. Der Hauptteil der kleinen Lymphozyten, die in frühen Läsionen gefunden werden, gehören zur CD4⁺-T-Zell-Untergruppe vom Helfertyp. Raine, C. S., et al., 1988, J. Neuroimmunol. 20: 189–201; Raine, C. S., 1991, Neuropath. Appl. Neurobiol. 17: 265–274.
Ein Tiermodell, das für die Untersuchung der Behandlung von humaner MS nützlich ist, ist die experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE). EAE ist eine experimentell ausgelöste Erkrankung, die viele der gleichen klinischen und pathologischen Symptome aufweist wie MS, Martin, R., et al., 1992, Ann. Rev. Immunol. 10: 153–187; Hafler, D. A., et al., 1989, Immunology Today 10: 104–107. Verschiedene Untersuchungen bei Nagetieren haben gezeigt, daß ähnlich wie bei MS, CD4⁺-T-Zellen an der Pathophysiologie von EAE beteiligt sind, Traugott, U., et al., 1985, Cellular Immunology 91: 240–254; Ben-Nun, A., et al., 1981, Eur. J. Immunol. 11: 195–199; Pettineli, R. B., et al., 1981, J. Immunol. 127: 1420–1423. EAE kann bei bestimmten Stämmen von Mäusen durch Immunisierung mit Myelin in einem Adjuvans ausgelöst werden. Die Immunisierung aktiviert CD4⁺-T-Zellen, die spezifisch sind für das basische Myelinprotein (MBP) und das Proteolipid (PLP), Bernard, C. C. A., et al., 1975, J. Immunol. 114: 1537–1540; Chou, C. H., et al., 1983, J. Immunol. 130: 2183–2186; Kurchroo, V. K., et al., 1992, J. Immunol. 148: 3776–3782. Die aktivierten T-Zellen dringen in das zentrale Nervensystem ein, und ihre lokale Wirkung verursacht sowohl die anatomische Pathologie als auch die klinischen Zeichen der Erkrankung, z. B. die aufsteigende Hinterbein-Parese, die zur Paralyse führt.
Da autoreaktive CD4⁺-T-Zellen eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der Pathogenese von MS spielen, besteht ein Ansatz zur Behandlung der Erkrankung in der Inhibierung der Aktivierung von autoreaktiven CD4⁺-T-Zellen. Man kann für diesen Zweck monoklonale Antikörper (mAbs) gegen Klasse II-MHC verwenden, Steinman, L., et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7111–7114, oder solche gegen den T-Zell-Antigenrezeptor, Acha-Orbea, H., et al., 1988, Cell 54: 263–273. Man kann auch die Antigenbindung an Klasse II-MHC mit nicht-immunogenen Peptiden inhibieren, Wraith, D. C., et al., 1989, Cell 59: 247–255.
Für Anti-CD4-mAbs wurde auch gezeigt, daß sie die Entwicklung der Erkrankung EAE inhibieren, Waldor, M. K., et al., 1985, Science 227: 415–17, und verschiedene menschliche klinische Versuche laufen derzeit, um diesen Ansatz bei MS zu testen, Hafler, D. A., et al., 1988, J. Immunol. 141: 131–138; Racadot, E. et al., 1993, J. Autoimmunity 6: 771–786; Lindsly, J. W., et al., 1994, Annals of Neurology 36: 183–189.
2.3. Inhibierung von Immunreaktionen durch CD4-abgeleitete Peptide
Synthetische Peptide, die die Oberfläche des CD4-Moleküls vortäuschen, wurden dazu verwendet, die Funktion des CD4-Proteins zu blockieren. Beispielsweise wurde für Peptide, deren Sequenz sich von der Sequenz der CDR3-Schlinge des Maus-CD4-Moleküls ableitet, gezeigt, daß sie die T-Zell-Aktivierung in vitro inhibieren und auch EAE bei der Maus verbessern, Jameson, B. A., et al., 1994, Nature 368: 744–746. Diese Experimente haben gezeigt daß: (i) eine Behandlung unter Verwendung eines sich von CDR3 ableitenden Peptids die autoreaktiven T-Zellen inhibiert, jedoch nicht die normale Immunreaktion; (ii) die Behandlung mit einem sich von CDR3 ableitenden Peptid nicht zu einer pan-CD4⁺-T-Zell-Verarmung führt, einem Peptid, das für die Immunreaktion spezifisch ist, oder zu toxischen Nebenwirkungen, so daß die chronische Verwendung derartiger Peptide machbar ist; und (iii) eine Behandlung unter Verwendung eines sich von CD4-ableitenden Peptids die sekundären T-Zell-Reaktionen inhibiert, für die wahrscheinlich ist, daß sie an einem klinischen Relaps der Krankheit beteiligt wären, Jameson, B. A., et al., 1994, Nature 368: 744–746; WO 94/11014 von Jameson, B. A. et al. Die in den Untersuchungen von Jameson verwendeten Peptide enthielten eine Sequenz von 9 Aminosäuren, die sich von den Resten 86–94 von CD4 ableitete, sowie einen Aminosäure-Verknüpfer, um das Peptid zu cyclisieren.
WO 94/11014 von B. A. Jameson et al., veröffentlicht am 26. Mai 1994, beschreibt, daß Peptide, die Sequenzen aufweisen, die sich von der Sequenz der Reste 17–22, 117–128, 130–138 und 158–171 von CD4 ableiten, sowie Unterabschnitte davon, ebenfalls verwendet werden können, um eine Immunreaktion zu modulieren. Verbindungen, die eine Oberfläche darstellen, die der Oberfläche ähnlich ist, die von einer der fünf unterschiedlichen lateralen Domänen von CD4 präsentiert wird, sind in WO 94/11014 beschrieben.
Zhang, X., et al., 1996, Nature Biotechnology, 14: 472–475 beschreibt ein Peptid mit einem Molekulargewicht von etwa 1500 Dalton, das die Reste 82–89 von CD4 enthält. Es wird behauptet, daß das Peptid von Zhang et al. die Wechselwirkung von CD4 und MHC, Klasse II inhibiert, was durch Blockierung einer Antigen-induzierten IL-2-Sekretion gezeigt wird.
3. Kurzdarstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Inhibierung einer unerwünschten CD4 T-Zell-Immunreaktion bei einem humanen Patienten durch Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung, die die Wechselwirkung von CD4 und MHC, Klasse II blockiert und zwischen 1450 und 400 Dalton und vorzugsweise zwischen 1400 und 400 Dalton aufweist. Verbindungen, die die Wechselwirkung CD4/MHC, Klasse II, inhibieren, können aufgrund ihrer Fähigkeit identifiziert werden, die Rosettenbildung der humanen B-Zellen-Tumorlinie, Raji, um eine Zelle herum zu blockieren, die CD4 exprimiert, jedoch keine toxischen Wirkungen zeigen, z. B. keine Wirkungen auf die Vermehrung von transformierten Zellen. Das Verfahren umfaßt die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung, die die CD4-Oligomerbildung inhibiert, wobei die Verwendung ein Molekulargewicht von zwischen 1450 Dalton und 400 Dalton, vorzugsweise zwischen 1400 Dalton und 400 Dalton, aufweist.
Die vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf Beispiele für derartige Verbindungen, wie beispielsweise synthetische Peptide, die die Gesamtheit oder einen Teil initiieren von: den Resten 29–35 der C-C'-Schlinge der D1-Domäne; den Resten 317–323 der C-C'-Schlinge der D4-Domäne; und den Resten 346–353 des CDR3- oder FG-Kamms der D4-Domäne des CD4-Moleküls, und die die T-Zell-Aktivierung inhibieren, sowie auf das Verfahren zur Verwendung derartiger Peptide zur Inhibierung von humanen CD4-abhängigen Immunreaktionen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Peptide cyclische Peptide. Die Erfindung umfaßt die Inhibierung der T-Zell-Aktivierung durch Inkontaktbringen von T-Zellen mit einer wirksamen Menge eines Peptids, das die C-C'-Schlinge vortäuscht. Außerdem umfaßt die Erfindung Verfahren zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen bei Menschen, die dadurch verbessert werden, daß man die Funktion des CD4-Moleküls stört.
4. Kurze Beschreibung der Figuren
1A. Schema eines allgemeinen Verfahrens zur Synthese eines makrozyklischen Peptidomimetiks, das einem Tetrapeptid entspricht.
1B. Struktur eines makrozyclischen Peptidomimetiks, das dem Pentapeptid NSNQI entspricht (SEQ ID NO: 1)
1C. Struktur eines makrocyclischen Peptidomimetiks, das dem Hexapeptid KNSNQI entspricht (SEQ ID NO: 2).
2. Vergleich zwischen 4 Gruppen der Schwere von klinischen Zeichen eines EAE-Mäusemodells. Die Gruppen sind: unbehandelt, -☐-; behandelt mit rD-mPGPtide, positive Kontrolle, -
-; behandelt mit einem linearen CNSNQIC (SEQ ID NO: 44) Peptid, -Δ-; behandelt mit einem cyclischen CNSNQIC (SEQ ID NO: 45) Peptid, ···O···.
3. Inhibieren einer humanen allogenen Mischlymphozyten-Reaktion durch Peptide, die einen Teil von CD4 imitieren.
5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Inhibierung von humanen CD4 T-Zell-Immunreaktionen durch Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung, deren Molekulargewicht zwischen 1450 und 400 Dalton, vorzugsweise zwischen 1400 und 400 Dalton liegt, die spezifisch die Wechselwirkung von CD4 und MHC, Klasse II, Genprodukten blockiert. Die Verwendung von Verbindungen mit höheren Molekulargewichten ist mit Nachteilen bezüglich der Erreichung und Aufrechterhaltung einer therapeutisch wirksamen Konzentration verbunden. Bei speziellen Ausführungsformen der Erfindung ist die Verbindung ein Peptid oder Peptidomimetik, die so ausgewählt sind, daß sie die folgenden Sequenzen von humanem CD4 vortäuschen: KNSNQLIK (SEQ ID NO: 3), KNSNQIK (SEQ ID NO: 4), NSNQI (SEQ ID NO: 1) (D1-CC'-Mimetiks), KLENKEA (SEQ ID NO: 5) (D4-CC'-Mimetiks) und LSDSGQVL (SEQ ID NO: 6) (D4-FG-Mimetiks).
Gemäß weiteren Ausführungsformen der Erfindung sind die Verbindungen Peptide und Peptidomimetiks, die durch kon servative Substitutionen der obigen Sequenzen gebildet werden können.
5.1. Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren für die Wechselwirkung CD4/MHC, Klasse II
Die Fähigkeit einer Verbindung, die Wechselwirkung von Genprodukten von CD4 und MHC, Klasse II, zu inhibieren, kann durch einen Zellen-Rosetten-Assay bestimmt werden. Eine Zellinie, wie beispielsweise Cos-7, Cos-1 oder dgl. kann vorübergehend mit einem Plasmid transfiziert werden, das eine cDNA für human CD4, funktionsgemäß mit einem Promotor verknüpft, trägt. Gemäß einer alternativen Ausführungsform kann eine COS-1-Zellinie stabil mit einem Expressionsplasmid für humanes CD4 transformiert werden. Die humanes CD4 exprimierenden Zellen und eine humane MHC, Klasse II, exprimierende Zelle werden vermischt, so daß sich Zellrosetten bilden.
Die spezifische Blockierung durch eine Verbindung zeigt sich anhand einer Verminderung der Anzahl von Rosetten um wenigstens 50%, wenn die Verbindung in dem Rosettenbildungsmedium in einer Konzentration von höchstens 200 μM vorhanden ist, und die 50%-Rosetten-inhibierende Konzentration zeigt eine weniger als 20%ige Inhibierung der Proliferation von transformierten Zellinien, z. B. EB-transformierten B-Lymphoblastoid-Zellinien oder IL-2-abhängigen T-Zellinien, wie beispielsweise HT-2.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung, die die Wechselwirkung von CD4 und MHC, Klasse II, spezifisch inhibiert, außerdem charakterisiert durch eine weniger als 20%ige Inhibierung einer LPS-stimulierten Proliferation oder Phytohämagglutinin-stimulierten Proliferation von Peripherblutlymphozyten bei der 50% Rosetten-inhibierenden Konzentration.
5.2. Verbindungen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt synthetische Peptide bereit, die drei Abschnitte des humanen CD4-Moleküls imitieren: die Reste 29–35 der C-C'-Schlinge der D1-Domäne; die Reste 317– 323, der C-C'-Schlinge der D4-Domäne; und die Rest 346–353, den FG-Kamm der D4-Domäne des CD4-Moleküls. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält das synthetische Peptide ein Kernpeptid, das die Struktur eines Teils des CD4 vortäuscht, sowie N- und C-terminale Reste, die die Cyclisierung des Peptids ermöglichen. Die cyclischen synthetischen Peptide der vorliegenden Erfindung können "Kern"-Peptidsequenzen enthalten, die dem humanen und murinen CD4-Molekül gemeinsam sind oder derartigen Sequenzen ähneln.
Ein Aspekt der Erfindung ergibt sich aus der Entdeckung daß Aminosäuren aus dem CD4-Bereich 29–35, der als C-C'-Schlinge der D1-Domäne (D1-CC') bezeichnet wird, wichtig sind für die Bildung von intermolekularen Bindungen, die mit der immunologischen Aktivität verknüpft sind. Gemäß der Erfindung werden Peptide mit 3 bis 10 Aminosäuren mit Aminosäuresequenzen, die Sequenzen einschließen, die den CD4-Sequenzen 29–35 oder Teilen davon entsprechen, bereitgestellt. Die Sequenz der Reste 29–35 von CD4 ist K-N-S-N-Q-I-K (SEQ ID NO: 4). Bei gewissen Ausführungsformen kann eine oder mehrere der CD4-Sequenzen 29–35 substituiert sein. Bei gewissen Ausführungsformen wird ein Aminosäurerest zwischen zwei Aminosäureresten 29–31 oder 33–35 in Peptiden inseriert, die die gesamte oder Fragmente der CD4-Sequenzen 29–35 aufweisen. Bei Peptiden, die die gesamte oder Fragmente von CD4-Sequenzen 29–35 mit Insertionen aufweisen, können Aminosäurereste substituiert sein. Peptide können eine oder mehrere D-Aminosäuren enthalten. Wenn nur D-Aminosäuren verwendet werden, wird die Sequenz revertiert.
Eine Ausführungsform für die erfindungsgemäßen Peptide ist ein cyclisches Peptid mit einer Kern-Peptidsquenz NSNQI (SEQ ID NO: 1), die den Resten 30–34 des humanen CD4-Proteins entspricht. Andere Ausführungsformen sind Peptide, die durch Substitutionen der Prototyp-Kernsequenz NSNQI (SEQ ID NO: 1) gemäß der Formel erhalten werden:
Beispielweise kann gemäß der Formel die aminoterminale Asn, die dem Rest 30 von CD4 entspricht, durch ein Gln oder Asp ersetzt sein; das Ser, das Rest 31 von CD4 entspricht, kann durch ein Thr, Asp oder Asn ersetzt sein; und so weiter. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich die Kernsequenz von der NSNQI (SEQ ID NO: 1)-Prototyp-Kernsequenz durch eine einzige Substitution. Gemäß weiteren Ausführungsformen unterscheidet sich die Sequenz des Kerns von der Prototypsequenz von zwei, drei, vier bzw. fünf Substitutionen.
Weitere Ausführungsformen für erfindungsgemäße Peptide schließen Peptide ein, die durch Substitutionen einer zweiten Prototyp-Kernsequenz KNSNQIK (SEQ ID NO: 4) gemäß der Formel enthalten werden:
Gemäß der Formel kann das aminoterminale Lys, entsprechend dem Rest 29 von CD4, durch ein Arg oder His ersetzt sein; das Asn, das Rest 30 entspricht, kann durch ein Gln oder Asp ersetzt sein; und so weiter. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich die Kernsequenz von der KNSNQIK (SEQ ID NO: 4)-Prototyp-Kernsequenz durch eine einzige Substitution. Gemäß weiteren Ausführungsformen unterscheidet sich die Sequenz des Kerns von der Prototypsequenz durch zwei, drei, vier, fünf, sechs bzw. sieben Substitutionen.
Gemäß einer noch anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Kernsequenz, die den CD4-Aminosäureresten 29–35 entspricht, durch die Insertion von Leu in der Position zwischen dem Aminosäurerest 33 und dem Aminosäurerest 34 modifiziert, so daß die Kernsequenz eine dritte Prototyp-Kernsequenz KNSNQLIK (SEQ ID NO: 3) ist. Weitere Ausführungsformen für erfindungsgemäße Peptide schließen Peptide ein, die durch Substitutionen der Prototyp-Kernsequenz KNSNQLIK (SEQ ID NO: 3) gemäß der folgenden Formel hergestellt werden.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung, die Peptide betreffen, die den D1-CC'-Abschnitt vortäuschen, schließen Peptide mit Kernsequenzen wie folgt ein:
wobei jede Aminosäure eine L-Aminosäure ist und die Symbole und + den N-Terminus bzw. C-Terminus bezeichnen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ergibt sich aus der Entdeckung, daß Aminosäuren aus dem CD4-Abschnitt 317–323 für die Bildung von intermolekularen Bindungen, die mit der immunologischen Aktivität assoziiert sind, wichtig sind. Dieser Abschnitt wird als CC'-Schlinge der D4-Domäne von CD4 (D4-CC') bezeichnet, und seine Sequenz ist K-L-E-N-K-E-A (SEQ ID NO: 5). Gemäß der Erfindung werden Peptide mit 3–9 Aminosäuren mit Aminosäuresequenzen bereitgestellt, die Sequenzen einschließen, die den CD4-Sequenzen 317–323 oder Teilen davon entsprechen. Gemäß der Erfindung werden Peptide mit 3 bis 9 Aminosäuren mit Aminosäuresequenzen, die Sequenzen einschließen, die den CD4-Sequenzen 317–323 oder Abschnitten davon entsprechen, bereitgestellt. Gemäß einigen Aus führungsformen kann eine oder mehrere der CD4-Sequenzen 317–323 substituiert sein.
Bei den erfindungsgemäßen Peptiden können die Aminosäuren, die den CD4-Aminosäureresten 317–323 entsprechen, wie folgt substituiert sein:
Peptide können D-Aminosäuren enthalten. Wenn nur D-Aminosäuren verwendet werden, wird die Sequenz eine reverse Sequenz. Erfindungsgemäße Peptide umfassen ein Fragment von drei oder mehr Aminosäuren, und umfassen vorzugsweise Aminosäuresequenzen, die der CD4-Sequenz 319–321 E-N-K entsprechen. Die Peptide können die CD4-Sequenz 319–321 E-N-K aufweisen, oder sie können eine oder mehrere Substitutionen wie sie oben definiert wurden, aufweisen. Peptide können Peptide mit der Aminosäuresequenz einschließen, die den CD4-Aminosäuresequenzen 319–321, 319–322, 319–323, 318–321, 318–322, 318–323, 317–321, 317–322, 317–323 entsprechen. Die Peptide können eine oder mehrere D-Aminosäurereste aufweisen. Wenn das Peptid nur D-Aminosäurereste aufweist, hat es eine reverse Sequenz.
Bevorzugte Peptide sind diejenigen mit den folgenden Kernsequenzen:
worin * und + wie oben definiert sind.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ergibt sich aus der Entdeckung, daß Aminosäuren aus dem CD4-Abschnitt 346–353 wichtig für die Bildung von intermolekularen Bindungen sind, die mit einer immunologischen Aktivität verknüpft sind. Dieser Abschnitt wird als FG-Kamm der D4-Domäne bezeichnet (D4-FG), und seine Sequenz ist L-S-D-S-G-Q-V-L (SEQ ID NO: 6). Gemäß der Erfindung werden Peptide mit 3 bis 9 Aminosäuren mit Aminosäuresequenzen, die Sequenzen einschließen, die den CD4-Sequenzen 346–353 oder Abschnitten davon entsprechen, bereitgestellt. Bei einigen Ausführungsformen können eine oder mehrere der CD4-Sequenzen 346–353 substituiert sein. Peptide können eine oder mehrere D-Aminosäuren enthalten. Wenn nur D-Aminosäuren verwendet werden, ist die Sequenz eine reverse Sequenz.
Bei den erfindungsgemäßen Peptiden können die Aminosäuren, die den CD4-Aminosäureresten 346–353 entsprechen, wie folgt substituiert sein:
Die Peptide können Peptide mit einer Aminosäuresequenz einschließen, die den CD4-Aminosäuresequenzen 349–351, 349– 352, 349–353, 348–351, 348–352, 348–353, 347–351, 347–352, 347–353, 346–351, 346–352, 346–353 entsprechen, die alle CD4-Sequenzreste oder eine oder mehrere Substitutionen, wie sie oben definiert wurden, einschließen, sowie mit oder ohne die N- und C-Termini cyclisierenden Resten oder Einheiten. Bevorzugte Peptide sind die mit den folgenden Kernsequenzen:
worin * und + wie oben definiert sind.
Bei diesen Peptiden kann irgendeine oder können mehrere der Aminosäuren, einschließlich der N- und/oder C-terminalen Reste, eine D-Aminosäure sein. Wenn alle Aminosäuren D-Aminosäuren sind, ist die Reihenfolge vom N- zum C-Terminus revertiert.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich die Kernsequenz von der Prototyp-Kernsequenz durch eine einzige Substitution. Gemäß weiteren Ausführungsformen unterscheidet sich die Sequenz des Kerns von der Prototyp-Sequenz durch zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben bzw. acht Substitutionen.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung schließen die Homologen der ersten, zweiten und dritten Prototyp-Kernsequenzen ein, die aus d-Aminosäuren bestehen, die in der umgekehrten Reihenfolge verknüpft sind, d. h. die Sequenzen, von N→C aus: iqnsn, kiqnsnk und kilqnsnk. Die Reste der d- Aminosäure-enthaltenden Kernsequenzen entsprechen den Resten des CD4, jedoch in umgekehrter Reihenfolge, z. B. entspricht in der Sequenz kiqnsnk das Lys in Nachbarschaft zu Ile dem CD4-Rest 35 und das Lys in Nachbarschaft zu Asn entspricht dem CD4-Rest 29. Von den erfindungsgemäßen Peptiden werden auch Ausführungsformen mit einer, zwei, drei usw. bis zu acht Substitutionen eingeschlossen, und zwar exakt nach den oben angegebenen Formeln, außer bezüglich der Verwendung von d-Aminosäuren als Austausch-Aminosäuren. So kann beispielsweise das dAsn, das dem Rest 30 entspricht, ersetzt sein durch dGln oder dAsp; das dSer, das dem Rest 31 entspricht, durch dThr, dAsp oder dAsn und so weiter.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht aus den nicht-cyclisierten Kernpeptiden allein, und deren Verwendung zur Unterdrückung einer humanen CD4-T-Zell-Immunreaktion.
Wie somit oben ausgeführt wurde, ist bei einer Ausführungsform die Kernsequenz vom N-Terminus zum C-Terminus Asn-Ser-Asn-Gln-Ile (NSNQI) (SEQ ID NO: 1), und in einer zweiten Ausführungsform ist die Kernsequenz Ser-Asn-Gln (SNQ). Jede Aminosäure der Kernsequenz ist eine L-Aminosäure. Alternativ dazu kann eine erfindungsgemäßes cyclisches synthetisches Peptid eine "Kern"-Sequenz aufweisen, die die umgekehrte Sequenz einer der oben bezeichneten Kernsequenzen ist, d. h. vom N-Terminus zum C-Terminus IQNSN und QNS. Wenn die Kernsequenz umgekehrt ist, ist jede Aminosäure der Kernsequenz eine D-Aminosäure.
Es wurde festgestellt, daß das synthetische Peptid CNSNQIC (SEQ ID NO: 44), das durch intramolekulare Oxidation der Cysteine zu einem Cystein cyclisiert wurde, ein hochpotenter Inhibitor der humanen T-Zell-Proliferation in vitro sowie ein Inhibitor von EAE bei Mäusen war.
Die cyclischen Strukturen der erfindungsgemäßen Peptide erhöhen deren strukturelle Stabilität, so daß die Peptide die Konformation der C-C'-Schlinge des nativen CD4-Moleküls genauer abbilden. Um die Peptide zu cyclisieren, wird das Peptid mit einer ersten Aminosäure benachbart zum N-Terminus und einer zweiten Aminosäure am C-Terminus der "Kern"-Sequenz versehen. Demgemäß können die Aminosäuren benachbart zum N-Terminus und C-Terminus irgendwelche Aminosäuren sein, die miteinander eine Bindung bilden. Die Aminosäuren können jeweils entweder Cystein oder Penicillamin sein, und das Molekül wird durch Bildung einer Disulfidbindung cyclisiert.
Gemäß der Erfindung können gegebenenfalls zusätzliche 1 bis 3 Aminosäuren entweder am N-Terminus oder am C-Terminus der Kernsequenz oder an beiden Enden vorhanden sein. Diese Aminosäuren können aus der Gruppe ausgewählt sein, die besteht aus Y, W, F, I und L, und vorzugsweise ist die Auswahl ohne Ersatz, d. h. die terminalen Peptide enthalten keine wiederholten Aminosäuren.
Ohne Beschränkung auf eine Theorie wird angenommen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen einen Abschnitt der Oberfläche von CD4 vortäuschen. Die Erfindungsgemäßen Verbindungen inhibieren die Antigen-abhängige T-Zell-Aktivierung und können daher zur Behandlung und Prävention von Erkrankungen und Krankheitszuständen verwendet werden, die durch eine unerwünschte T-Zell-Aktivierung charakterisiert sind.
Gemäß einer Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Peptide, die die obige Kernsequenz NSNQI (SEQ ID NO: 1) enthalten, durch die folgende allgemeine Formel wiedergegeben werden N(H)(R')-X'Z'NSNQIZ''X''-CO-R'' worin:

(a) N(H)(R') der N-Terminus ist, wobei R' entweder Acetyl oder Wasserstoff ist, und CO-R'' der Carboxyl-Terminus ist, worin R'' entweder NH₂ oder OH ist;
(b) jede von N, S, Q und I eine L-Aminosäure ist;
(c) X' vorhanden ist oder fehlt und dann, wenn es vorhanden ist, eine L-Aminosäure oder ein Di- oder Tripeptid aus L-Aminosäuren ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Y, W und F, mit der Maßgabe, daß keine Aminosäure mehr als einmal ausgewählt wird;
(d) X'' vorhanden ist oder fehlt und dann, wenn es vorhanden ist, eine L-Aminosäure ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Y, W, F, I, L oder einem Dipeptid von L-Aminosäuren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus L und I;
(e) Z' und Z'' Aminosäuren sind, die miteinander verknüpft sind, so daß das Peptid ein cyclisches Peptid ist.

Bevorzugte Beispiele für diese Ausführungsform sind wie folgt:
Weitere Ausführungsformen für Peptide der Erfindung, die die Kernsequenz SNQ enthalten, können durch die folgende allgemeine Formel wiedergegeben werden: N(H)(R')-X'Z'SNQZ''X''-CO-R'' worin:

(a) N(H)(R') der Amino-Terminus ist, wobei R' entweder Acetyl oder Wasserstoff ist, und CO-R'' der Carboxyl-Terminus ist, worin R'' entweder NH₂ oder OH ist;
(b) jede von N, S und Q eine L-Aminosäure ist;
(c) X' vorhanden ist oder fehlt und dann, wenn es vorhanden ist, eine L-Aminosäure oder ein Di- oder Tripeptid aus L-Aminosäuren ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Y, W und F, mit der Maßgabe, daß keine Aminosäure mehr als einmal ausgewählt wird;
(d) X'' vorhanden ist oder fehlt und dann, wenn es vorhanden ist, eine L-Aminosäure ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Y, W, F, I, L oder einem Dipeptid von L-Aminosäuren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus L und I;
(e) Z' und Z'' Aminosäuren sind, die miteinander verknüpft sind, so daß das Peptid ein cyclisches Peptid ist.

Bevorzugte Beispiele für diese Ausführungsform sind wie folgt:
Gemäß einer alternativen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Peptide aus D-Aminosäuren bestehen. Die Verwendung von D-Aminosäuren hat den Vorteil einer erhöhten Beständigkeit gegen Abbau im Wirt. Gemäß einer Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Peptide, die die Kernsequenz iqnsn enthält, wiedergegeben werden durch die folgende allgemeine Formel: N(H)(R')-X''Z''iqnsnZ'X'-CO-R'' worin:

(a) N(H)(R') der Amino-Terminus ist, wobei R' entweder Acetyl oder Wasserstoff ist, und CO-R'' der Carboxyl-Terminus ist, wobei R'' entweder NH₂ oder OH ist;
(b) jede von n, s, q und i eine D-Aminosäure ist;
(c) X' vorhanden ist oder fehlt und dann, wenn es vorhanden ist, eine D-Aminosäure oder ein Di- oder Tripeptid aus D-Aminosäuren ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus y, w und f, mit der Maßgabe, daß keine Aminosäure mehr als einmal ausgewählt ist;
(d) X'' vorhanden ist oder fehlt und dann, wenn es vorhanden ist, eine D-Aminosäure ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus y, w, f, i, l oder einem Dipeptid von D-Aminosäuren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus L und I;
(e) Z' und Z'' Aminosäuren sind, die miteinander verknüpft sind, so daß das Polypeptid ein cyclisches Polypeptid ist.

Bevorzugte Beispiele für diese Ausführungsform sind wie folgt:
Weitere Ausführungsformen der Erfindung, die die Kernsequenz qns enthalten, können durch die folgende allgemeine Formel wiedergegeben werden: N(H)(R')-X''Z''qnsZ'X'-CO-R'' worin:

(a) N(H)(R') der Amino-Terminus ist, wobei R' entweder Acetyl oder Wasserstoff ist, und CO-R'' der Carboxyl-Terminus ist, wobei R'' entweder NH₂ oder OH ist;
(b) jede von n, s, und q eine D-Aminosäure ist;
(c) X' vorhanden ist oder fehlt und dann, wenn es vorhanden ist, eine D-Aminosäure ist oder ein Di- oder Tripeptid aus D-Aminosäuren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus y, w und f, mit der Maßgabe, daß keine Aminosäure mehr als einmal ausgewählt ist;
(d) X'' vorhanden ist oder fehlt und dann, wenn es vorhanden ist, eine D-Aminosäure ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus y, w, f, i, l oder einem Dipeptid aus D-Aminosäuren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus L und I;
(e) Z' und Z'' Aminosäuren sind, die miteinander verknüpft sind, so daß das Peptid ein cyclisches Peptid ist.

Bevorzugte Beispiele für diese Ausführungsform sind wie folgt:
Zusätzliche Ausführungsformen der Erfindung können dadurch ermittelt werden, daß man jede der oben angegebenen bevorzugten Sequenzen in die obige Formel einsetzt.
Somit sind erfindungsgemäße Ausführungsformen Peptide gemäß der obigen Formel, wobei das Kernpeptid aus der Gruppe von Peptiden ausgewählt ist:

wobei * und + die Amino- bzw. Carboxyltermini des Kernpeptids anzeigen.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung schließen Peptide ein, die D-Aminosäuren-enthaltende Kernpeptide enthalten, gemäß den folgenden Formeln:
wobei * und + die Carboxy- bzw. Aminotermini des Kernpeptids bezeichnen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die erfindungsgemäßen Peptide durch entsprechende Peptidometiks ersetzt werden, die einen 10-gliedrigen heterocyclischen Ring enthalten. Peptidomimetiks können synthetisiert werden, wie beschrieben wurde in der Veröffentlichung Nakanishi et al., 1993, Gene 137: 51–56, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird. Die Herstellung der Peptidomimetiks kann entweder durch Festphasen-Peptidsynthese oder Lösungsphasen-Synthese erreicht werden. Der heterocyclische Ring wird durch die Reaktion eines aktivierten 4-gliedrigen Azetidinon-Rings mit einer Hydrazino-Einheit zur Bewirkung der Makrocyclisierungsreaktion gebildet. Bei der Festphasen-Synthese kann eine alloc-Gruppe dazu verwendet werden, die Hydrazino-Gruppe zu schützen, die durch den Pd-Katalysator entfernt werden kann. Die alloc-Gruppe ist orthogonal zu der Fmoc-Schutzgruppe und daher mit dem oben beschriebenen Festphasen-Peptidsyntheseschema kompatibel.
1A zeigt ein allgemeines Schema für die Festphasen-Synthese eines makrocyclischen Peptidomimetiks mit vier Seitenketten. 1B zeigt ein Beispiel für ein erfindungsgemäßes Peptidomimetik; die Seitenketten des Peptidomimetiks entsprechend Asn, Ser, Asn, Gln mit einem C-terminalen Ile. Das in 1B gezeigt Peptidomimetik entspricht dem Peptid NSNQI (SEQ ID NO: 1), das die CD4-Reste 30–34 verkörpert. 1C zeigt ein weiteres Beispiel für ein erfindungsgemäßes Peptidomimetik. Das gezeigte Peptidomimetik entspricht dem Peptid KNSNQI (SEQ ID NO: 3), das die CD4-Reste 29–34 verkörpert. Nach der gleichen Technik können Peptiomimetiks synthetisiert werden, die irgendeinem der anderen hierin beschriebenen 4-, 5- und 6-Aminosäuren-Peptide entsprechen.
Die resultierenden makrocyclischen Peptidomimetiks eines tetrameren, pentameren oder hexameren Peptids entsprechen der Formel:
Wenn das Peptidomimetik einem Tetrapeptid entspricht, dann entspricht R₁ dem α-Kohlenstoff, dem Amin und der Seitenkette der aminoterminalen Aminosäure, R₂ entspricht der Seitenkette der zweiten Aminosäure, R₃ entspricht der Seitenkette der dritten Aminosäure, 4-N entspricht dem Aminostickstoff der vierten aminoterminalen Aminosäure, und R₄ entspricht dem α-Kohlenstoff, der Seitenkette und der Carboxyl-Einheit der carboxyterminalen Aminosäure. Ein pentameres Peptidomimetik kann dadurch konstruiert werden, daß man die carboxyterminale Aminosäure mittels einer Peptidbindung an der Carboxyl-Einheit in den R₄-Substituenten inkorporiert, oder durch Inkorporieren der aminoterminalen Aminosäure in den R₁-Substituenten mittels einer Peptidbindung zu der Amino-Gruppe.
Ein hexameres Peptidomimetik kann dadurch konstruiert werden, daß man R₁ und R₄ verlängert, so daß sie die aminoterminale bzw. carboxyterminale Aminosäure enthalten.
Die erfindungsgemäßen Peptidomimetiks können so formuliert, verabreicht und verwendet werden, wie hierin für Peptide beschrieben wird.
Jedes der erfindungsgemäßen Peptide kann dazu verwendet werden, unerwünschte Immunreaktionen in Mäusen und Menschen zu unterdrücken. Beispielsweise können Autoimmunerkankungen wie rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose und SLE durch Verabreichung von erfindungsgemäßen Verbindungen an eine Person, die an einer der Krankheiten leidet, behandelt werden. Die zur Behandlung eines Patienten benötigte Peptiddosis kann nach dem Fachmann gutbekannten Verfahren anhand der Beobachtungen bestimmt werden, daß das cyclische Peptid CNSNQIC (SEQ ID NO: 45) eine murine und humane gemischte Lymphozyten-Reaktion bei zwischen etwa 50 μM und 200 μM inhibierte, und daß eine 0,5 mg-Dosis des CNSNQIC (SEQ ID NO: 45)-Peptids bei i. v.-Verabreichung 12 Tage nach der Immunisierung im Hinblick auf eine Verbesserung der EAE bei einer Maus wirksam ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können einem Patienten verabreicht werden, der ein allogenes Transplantat erhalten hat, z. B. Knochenmark, Niere oder Pankreas. Die Abstoßung des Transplantats kann dabei vermieden werden. Die erfindungsgemäßen Peptide können in Verbindung mit immunsuppressiven Mitteln verwendet werden, wie dem Fachmann gut bekannt ist. Erfindungsgemäße Peptide können mit Vorteil einem Patienten entweder vor der Transplantation oder später verabreicht werden. Erfindungsgemäße Peptide können an Patienten verabreicht werden, die an der Transplantat-versus-Wirt-Krankheit leiden, um die Krankheit zu inhibieren.
Die erfindungsgemäßen Peptide können nach irgendwelchen bekannten Techniken oder später zu entwickelnden Techniken hergestellt werden. Die Peptide können unter Verwendung der Festphasen-Synthesetechnik hergestellt werden, die beschrieben wird von Merrifield, in J. Am. Chem. Soc., 15: 2149–2154 (1963); in M. Bodanszky et al., (1976) Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d Ed.; Kent und Clark-Lewis in Synthetic Peptides in Biology and Medicine, S. 295–358, eds. Alitalo, K. et al., Science Publishers (Amsterdam, 1985); sowie in anderen Nachschlagwerken, die dem Fachmann bekannt sind. Eine Zusammenfassung von Peptidsynthesetechniken kann gefunden werden in J. Stuart und J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, IL (1984). Die Synthese von Peptiden durch Lösungsverfahren kann auch zur Anwendung kommen, wie beschrieben ist in The Proteins, Vol. II, 3d. Ed., S. 105–237, Neurath, H., et al., Eds., Academic Press, New York, NY (1976). Geeignete Schutzgruppen für eine Verwendung bei derartigen Synthesen werden in den obigen Texten gefunden, sowie in J. F. W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY (1973).
Im allgemeinen beinhaltet die Synthese der Peptide die schrittweise Anfügung von einem oder mehreren Aminosäureresten oder geeignet geschützten Aminosäureresten an eine wachsende Peptidkette. Typischerweise wird die Carboxyl-Gruppe des ersten Aminosäurerests an einen festen Träger vorgebunden, wobei die Amino-Gruppe durch eine erste, selektiv entfernbare Schutzgruppe geschützt ist. Eine zweite, andere, selektiv entfernbare Schutzgruppe wird mit Aminosäuren verwendet, die eine reaktive Seitengruppe enthalten, wie beispielsweise Lysin. Nach der Entfernung der ersten Schutzgruppe wird die Carboxyl-Gruppe der zweiten Aminosäure an die Amino-Gruppe der ersten Aminosäure gekuppelt. Das Verfahren wird dann wiederholt, bis das Peptid komplett ist, zu welchem Zeitpunkt das Peptid von dem festen Träger entfernt wird.
Die Cyclisierung kann eine mittels Disulfid-Brücken zwischen Cysteinresten, Penicillamin-Resten oder Cystein- und Penicillamin-Resten sein. Cystein-Reste, Penicillamin-Reste oder Cystein- und Penicillamin-Reste können in Positionen des Peptids eingebaut sein, die die Abschnitte der Kernsequenzen flankieren. Intramolekulare Disulfide bilden sich spontan durch Auflösen der Peptide mit zwei Schwefelwasserstoff-Einheiten zu etwa 100 μg/ml in 0,1 M NH₄HCO₃ und beim Rühren über Nacht unter Zutritt von Raumluft bei 22°C. Alternativ können die Peptide dadurch cyclisiert werden, daß man eine Amid-Bindung zwischen einer Aminosäure an der oder in der Nähe der Amino- und der Carboxyltermini ausbildet oder durch Zugabe eines Glycin-Verknüpfers zwischen derartigen Aminosäuren. Die Cyclisierung kann auch so erfolgen, wie beschrieben wird in der Veröffentlichung Huang, Z., et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114: 9390–9401, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Daß die erfindungsgemäßen Peptide wirksam zur Behandlung einer Immunerkrankung sind, wird anhand der Ergebnisse von zwei Assays gezeigt: die Peptide inhibieren die T-Zell-Proliferation in einer MLR von humanen oder murinen T-Zellen; und die Peptide verbessern EAE bei Mäusen.
Die vorliegende Erfindung schafft pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten, sowie pharmazeutisch annehmbare Träger oder Verdünnungsmittel.
Für die parenterale Verabreichung können die erfindungsgemäßen Peptide beispielsweise als eine Lösung, Suspension oder als lyophilisierte Pulver in Assoziation mit einem pharmazeutisch annehmbaren parenteralen Träger formuliert werden. Beispiele für derartige Träger sind Wasser, Salzlösung, Ringer-Lösung, Dextroselösung und 5%iges humanes Serumalbumin. Der Träger oder das lyophilisierte Pulver können Additive enthalten, die die Isotonie aufrechterhalten (z. B. Natriumchlorid, Mannit) und die chemische Stabilität (z. B. Puffer und Konservierungsmittel). Beispielsweise wird eine parenterale Zusammensetzung, die für eine Verabreichung durch Injektion geeignet ist, dadurch hergestellt, daß man 1,5 Gew.-% aktiven Wirkstoff in 0,9% Natriumchlorid-Lösung auflöst. Die Formulierung kann mittels irgendeiner allgemein angewandten Technik sterilisiert werden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können als Einzeldosis oder in mehreren Dosen verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können entweder als individuelle therapeutische Mittel verabreicht werden, oder in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln. Die Behandlungen der vorliegenden Erfindungen können mit herkömmlichen Therapien kombiniert werden, die nacheinander oder gleichzeitig verabreicht werden können.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf irgendeine Weise verabreicht werden, die es möglich macht, daß das aktive Mittel die Zielzellen erreicht. Da Peptide einer Verdauung unterliegen, wenn sie oral verabreicht werden, wird normalerweise zur Optimierung der Absorption eine parenterale Verabreichung, d. h. intravenös, subkutan oder intramuskulär, angewandt. Die intravenöse Verabreichung kann mit Hilfe einer Infusionspumpe bewirkt werden. Alternativ dazu können die Peptide als Aerosol-Medikamente für die intranasale Inhalation oder die topische Verabreichung formuliert werden.
Die verabreichte Dosis variiert in Abhängigkeit von Faktoren wie den pharmakodynamischen Eigenschaften; der Art und dem Weg der Verabreichung; dem Alter, dem Gesundheitszustand und Gewicht des Empfängers; der Natur und dem Ausmaß der Symptome; der Art einer begleitenden Behandlung; und der Häufigkeit der Behandlung. Üblicherweise kann die Peptiddosis etwa 1 bis 3000 mg pro 50 kg Körpergewicht betragen; vorzugsweise 10 bis 1000 mg pro 50 kg Körpergewicht; stärker bevorzugt 25 bis 800 mg pro 50 kg Körpergewicht. Gewöhnlich werden 8 bis 800 mg täglich in aufgeteilten Dosen 1- bis 6-mal am Tag an eine Person verabreicht, oder in einer Form mit verzögerter Wirkstofffreisetzung, um die gewünschten Ergebnisse zu erhalten.
Beispiele
Beispiel 1. Synthese und Charakterisierung eines cyclischen Heptapeptids für die C-C'-Schlinge: CNSNQIC
Das Peptid CNSNQIC (SEQ ID NO: 45) wurde unter Verwendung herkömmlicher Verfahren der Peptidsynthese synthetisiert. Peptide wurden auf einem vollautomatischen Applied Biosystem (Foster City, CA) 430A-Peptid-Synthetisierer nach dem Verfahren von Jameson et al., 1988, Science 240: 1335 synthetisiert. Die Peptide, die interne Cystein-Reste enthielten, wurden wieder gefaltet und oxidiert, indem man sie in 100 μg/ml in 0,1 M NH₄NCO₃ auflöste und sie der Luft ausgesetzt über Nacht bei 23°C rührte. Die Peptide zeigen eine mehr als 95%ige intramolekulare Disulfidbindung am Ende dieser Prozedur, und zwar bei der Überwachung mit Ellmans-Reagenzien, HPLC-Analyse und Gelfiltration. Die Peptide wurden lyophilisiert, in Komplettmedium resuspendiert und durch ein 0,22 μ-Filter vor der Verwendung in biologischen Assays filtriert.
Das Peptid wurde durch analytische HPLC-Analyse, Massenspektrometrie-Analyse und hochauflösende 600 MHz-NMR-Spektroskopie charakterisiert. Die Analyse dieses synthetischen Peptids zeigte, daß seine Reinheit > 99% war. HPLC erfolgte mit einer analytischen HPLC Vydac C18-Säule (25 × 4,6 mm i. d., 5 μm sphärische Packung bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/min), mit UV-Detektion bei 206 nm. Es wurde zwei Lösemittel verwendet: Lösemittel A (entionisiertes Wasser/0,1% TFA) und Lösemittel B (Acetonitril/0,1% TFA).
Die an CNSNQIC (SEQ ID NO: 45) durchgeführte Massenspektrometrie unter Anwendung einer matrixunterstützten Laser-Desorptions-Massenspektrometrie (MALD-MS, LDI-1700, Biomolecular Separations, Ltd., Nevada) mit einer Sinapin säurelösung als Matrix. Es waren drei Hauptpeaks zu sehen. Der Peak bei 772,8 entsprach dem Molekülion und die anderen beiden Peaks, 796.0 und 812.0, entsprachen dessen Natrium- bzw. Kaliumsalzen.
Beispiel 2: Synthese des Peptids: YCNSNQIC
Das Peptid YCNSNQIC (SEQ ID NO: 53) wurde synthetisiert und in vitro in einem humanen und murinen MLR-Assay sowie in vivo in einem EAE-Protokoll getestet. Es wurde festgestellt, daß das Peptid eine inhibitorische Wirksamkeit aufweist, die mit der des cyclischen Peptids CNSNQIC (SEQ ID NO: 45) vergleichbar war.
Beispiel 3. Humaner Misch-Lymphozytenreaktions-(MLR)-Assay
Für diesen Assay wurden frische Peripherblut-Lymphozyten von zwei unterschiedlichen Spendern gemeinsam kultiviert; die Zellen eines Spenders waren bestrahlt und dienten als Stimulatoren. Die Vermehrung dieser aktivierten T-Zellen wurde dadurch gemessen, daß man den Einbau von ³H-Thymidin zu verschiedenen Zeitpunkten maß.
Für Human-MLR wurden 50 ml Vollblut in einem ein Antikoagulans (ACD, saure Citratdextrose) enthaltenden Röhrchen gesammelt. In konischen 50 ml-Röhrchen wurden 20 ml Blut über 20 ml Ficoll 1077 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) geschichtet und bei 2000 U/min für 35 bis 40 Minuten bei 15 bis 20°C zentrifugiert. Leukozytenfilme und Serum wurden gesammelt, in 3 × Volumina PBS zentrifugiert bei 1500 U/min für 15 min bei 15 bis 20°C. Überstände wurden verworfen, die Zellen zweimal in 50 ml PBS gewaschen und in RPMI resuspendiert, das mit 10% wärmeinaktiviertem (56°, 30 min) Humanserum (Kat, # H4522, Sigma), 50 IU/ml Pen/Strep und 2 mM (1% einer 200 mM-Vorratslösung) L-Glutamin (beide von BioWhitaker) ergänzt war. Die Lymphozytenausbeute variierte zwischen 5–8 × 10⁷.
In einer Flachbodenplatte mit 96 Vertiefungen wurden 1 × 10⁵ Responder mit 2 × 10⁵ bestrahlten (3000 rad) Stimulatoren/Vertiefung plattiert (jeweils in 100 μl zugesetzt), und für 6, 7 oder 8 Tage bei 37°C, 7% CO₂ inkubiert. Zu vierfachen Vertiefungen wurde Peptidanaloge bei einer Konzentration von 100 μM (5 mg/ml Vorrat) oder Titrationen davon zugesetzt, und zwar unmittelbar nachdem die Zellen plattiert worden waren. Zur radioaktiven Markierung wurden die Zellen mit 1 μCi [³H] Tdr/Vertiefung (25 μl) (verdünnt aus einem 1 mCi/ml-Vorrat, Amersham) für die abschließenden 6 Stunden der Inkubation inkubiert. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Faserfilter-Zellharvesters (z. B. Harvester 96, Tomtec) geerntet und in einem Beta-Counter eines Beta-Plattenlesers (1205 BS Beaplate Liquid Scintillation Counter, Wallac) mit Szintillationsfluid gezählt.
Das cyclische C-C'-Schlingen-Heptapeptid CNSNQIC (SEQ ID NO: 45) zeigte wenigstens 50% Inhibierung der alloreaktiven Proliferation von Responderzellen bei 100 μM. Dieses cyclische Peptid zeigte eine signifikant höhere Wirksamkeit als die linearen Peptide KNSNQI (SEQ ID NO: 2), KNSNQ (SEQ ID NO: 21) und NSNQI (SEQ ID NO: 1), die sich von dem gleichen C-C'-Abschnitt ableiteten.
Um die Spezifität und konformationelle Abhängigkeit der beobachteten immunsuppressiven Effekte des cyclischen Peptids CNSNQIC (SEQ ID NO: 45) zu charakterisieren, wurden zwei andere verwandte Peptide als Kontrollen verwendet. Das erste Kontrollpeptid behielt die gleiche Aminosäurezusammensetzung bei wie das cyclische C-C'-Heptapeptid, wobei bei ihm jedoch die Sequenzreihenfolge statistisch streute. Das zweite Kontrollpeptid wies die gleiche Aminosäuresequenz auf wie das cyclische C-C'-Heptapeptid, es fehlte ihm jedoch die konfor mationseinschränkende Cys-Cys-Disulfidbrücke. Diese Kontrollpeptide wurden auf ihre suppressiven Effekt auf die humane T-Zell-Aktivierung getestet. Das lineare Peptid zeigte eine sehr viel niedrigere Wirksamkeit (32,2% Inhibierung) als das cyclische Peptid (54,4% Inhibierung), während das statistische Peptid völlig inaktiv war. Diese Untersuchungen zeigten, daß eine ordnungsgemäße Aminosäuresequenz im Kontext einer dreidimensionalen Konformation für die biologische Aktivität des cyclischen C-C'-Heptapeptids nötig ist.
Beispiel 4: Murine Mischlymphozyten-Reaktion
Mäuse wurden getötet, und die Milz wurde jeweils aseptisch entfernt. Zellsuspensionen wurden dadurch hergestellt, daß man die Milzpräparate leicht durch ein Nylonsieb hindurchpreßte, die Zellen mit RPMI 1640 wusch und eine hypotone Lyse von roten Blutkörperchen bewirkte. Nach drei Wäschen in RPMI 1640 wurden die Zellen in Komplettmedium (RPMI 1640, 10% wärmeinaktiviertes FCS, 2 mM L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin) resuspendiert und 5 × 10⁵ Responderzellen mit 1 × 10⁵ Stimulatorzellen (C3H-Milzzellen, 2000 rad bestrahlt) dreifach in Platten mit 96 Rundbodenvertiefungen (Endvolumen 200 μl) inkubiert, und mit der angegebenen Peptidkonzentration (0,01, 0,1, 1, 10, 100 und 1000 μM Peptid) 5 Tage bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert. 1 μCi/Vertiefung von [³H] TdR wurde 12 Stunden bevor der Thymidineinbau gemessen wurde, zugesetzt. Markierte DNA aus den Zellen wurde auf Glasfaserfiltern mit einem PHD-Zellharvester (Cambridge, MA) geerntet, und CPM durch Flüssigkeits-Szintillationszählung unter Verwendung eines 1209 Rackbeta (LKB, Piscataway, NJ) bestimmt.
Beispiel 5. EAE-Inhibierung in vivo
Die Feststellung einer Wirkung der humanen C-C'-Schlingen-Peptidanalogen in den murinen MLR-Assays wies darauf hin, daß diese Peptide auch in vivo in Mäusen wirksam sein könnten. Zuerst wurden die C-C'-Schlingenpeptide auf eine Wirksamkeit im SJL EAE-Modell getestet. Bei unbehandelten Tieren wurde ein hoher Krankheitseintritt 12 bis 22 Tage nach zwei s. c. Inokulationen von 1 mg rohem murinen Wirbelsäulenhomogenat in komplettem Freunds-Adjuvans beobachtet. Die Schwere der Erkrankung wurde täglich unter Verwendung der eingeführten 0- bis 5-Skala bewertet, die das Ausmaß der aufsteigenden Parese beschreibt, Korngold, R., et al., 1986, Immunogenetics 24: 309–315. Das Niveau des mittleren EAE-Schweregrads erreichte bei Mäuse der unbehandelten Kontrollgruppe ein Maximum von 2,0. Wie in 2 gezeigt ist, erreichten die maximalen Schweregrade bei den Gruppen, denen das Hexapeptid CNSNQIC (SEQ ID NO: 45), entweder in linearer oder der cyclischen C-C'-Form am Tag 12 (0,5 mg i. v.) gegeben worden war, 1,0. Es werden auch die Ergebnisse für Mäusegruppen gezeigt, die das rD-mPGPtide erhielten, ein Mimetik für die Reste 86–104 eines murinen Homologen von CD4, das beschrieben wurde in Jameson et al. 1994, Nature 368: 744–746.
Beispiel 6: Wirkung von CD4-Peptidanalogen auf die MLR-Proliferation von humanen Peripherblut-Lymphozyten
Indem man dem Verfahren in der Veröffentlichung von McDonnell et al., 1992, J. Immunol. 149: 1626–1630 folgte, die durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit hierin aufgenommen wird, wurden MLR-Assays durchgeführt. Die Ergebnisse von zwei bis vier unabhängigen Versuchen sind in 3 wiedergegeben. Der Anti-CD4-Antikörper inhibierte die MLR-Proliferation von CD4⁺-T-Zellen stark und wurde als positive Kontrolle verwendet, um zu gewährleisten, daß die beobachtete Inhibierung der Peptide CD4-abhängig war. Peptide wurden mit einem 430A-Applied Biosystems-Peptid-Synthetisator unter Verwendung von Fmoc-Chemie synthetisiert. Sie wurden durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, und die Homogenität eines jeden Peptids durch analytische Umkehrphasen-HPLC bestätigt. Die Charakterisierung wurde unter Verwendung der Matrix-unterstützten Laser-Desorptions-Massenspektrometrie (MALD-MS, LDI-1700, Biomolecular Separations, Ltd., Nevada) durchgeführt. Die Sequenzen der synthetisierten Peptide sind wie folgt: D1-FG: CEVEDQKEEVQLLVFGLTC (SEQ ID NO: 46); D1-CC': KNSNQIK (SEQ ID NO: 4); D2-FG: VLQNQKKV (SEQ ID NO: 47); D2-CC': RSPRGKNI (SEQ ID NO: 48); D3-FG: LEAKTGKL (SEQ ID NO: 49); D3-CC': WQAERASSSKS (SEQ ID NO: 50); D4-FG: LSDSGQVL (SEQ ID NO: 51); D4-CC': KLENKEA (SEQ ID NO: 5); D4-CC'scr (statistisch vertauscht): AENKKEL (SEQ ID NO: 52).
Beispiel 7. Inhibierung von Wechselwirkungen CD4/MHC, Klasse II
Das cyclisch Peptid CNSNQIC (SEQ ID NO: 45) wurde bei 200 μM getestet, um festzustellen, ob das Peptid die Wechselwirkung von CD4 und MHC, Klasse II inhibierte. Der Test wurde mit rosettenbildenden Raji-Zellen und vorübergehend CD4-transfizierten COS-7-Zellen durchgeführt. Vergleiche: Moebius, U. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 12008–12; Moebius, U., et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 8259–63. Bei drei unabhängigen Assays wurde eine Inhibierung von 57%, 63% und 51% der Rosetten beobachtet.
Die Sequenz der humanen CD4-cDNA wird angegeben in Maddon, P. J. et al., 1985, CELL 42: 93–104, wobei diese Sequenz hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Maddon et al. bezeichnet Human-CD4 als "T4". Das Plasmid T4-pMV7, das die humane CD3-cDNA enthält, ist erhältlich von dem AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH (McKesson BioServices, Rockville, MD). Das 3,0 Kb EcoRI-Fragment von T4-pMV7 enthält die 1,5 Kb CD4 cDNA.
Für die Transfizierung von COS-7-Zellen wurde ein CD4-Expressionsplasmid T4-pcDNA3 dadurch konstruiert, daß man das 3,0 Kb EcoRI-Fragment von T4-pMV7 in die EcoRI-Stelle des Säugetier-Expressionsvektors pcDNA3 (INVITROGEN) subklonierte. Die Transfektion wurde mit dem DOSPER liposomalen Transfektionsreagens (BOEHRINGER MANNHEIM) bewirkt, wobei man der folgenden Modifikation des Protokolls des Herstellers folgte.

1. Säe in einer Gewebekulturplatte mit sechs Vertiefungen oder 35 mm 5 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in 2 ml DEME mit einem Gehalt von 10% FCS (fötales Kälberserum, GIBCO) und nicht-essentiellen Aminosäuren aus.
2. Inkubiere die Zellen bei 37°C, 5% CO₂ in einem Zellkulturinkubator, bis die Zellen 70 bis 80% konfluent sind. Das erfordert üblicherweise 18 bis 24 Stunden.
3. Stelle eine Mischung DOSPER/DNA her:
– Lösung A: verdünne 2 μg rekombinanter T4-pcDNA3-Plasmid-DNA mit 20 mM HBS (Hepes-gepufferte Salzlösung, GIBCO) bis auf ein Endvolumen von 50 μl.
– Lösung B: verdünne 6 μl DOSPER mit 20 mM HBS auf ein Endvolumen von 50 μl. Kombiniere Lösung A und Lösung B, mische vorsichtig und inkubieren bei Raumtemperatur 15 bis 30 min, um zu ermöglichen, daß sich der DOSPER/DNA-Komplex bildet.
4. Ersetze am Tag der Transfektion das Kulturmedium kurz vor der Zugabe der DOSPER/DNA-Mischung durch 1 ml serumfreies DMEM.
5. Gebe, ohne das vorher zugesetzte Kulturmedium zu entfernen, tropfenweise 100 μl des DOSPER/DNA-Komplexes zu den Kulturen. Es war wesentlich, den DOSPER/DNA-Komplex tropfenweise zuzugeben. Um eine gleichmäßige Verteilung sicherzustellen, mische leicht, indem die Kulturplatte geschaukelt wird.
6. Inkubieren 6 h bei 37°C, 5% CO₂ in einem Zellkulturinkubator.
7. Gebe im Anschluß an die Inkubation 1 ml DMEM mit 20% FCS zu, ohne die Transfektionsmischung zu entfernen.
8. Ersetze das Medium, das die DOSPER/DNA-Mischung enthält, 24 h nach der Transfektion durch 2 ml frisches DMEM mit 10% FCS.
9. Bestimme die CD4-Expressionsgrade als Maß für die Transfektionswirksamkeit durch Flow-Cytometrie-Analyse. Üblicherweise exprimierten zwischen 30% und 40% der transfizierten COS-7-Zellen humanes CD4 und zwar nach Maßgabe eines Immunfluoreszenz-Bindungsassays für die Wechselwirkung zwischen CD4 und MHC, Klasse II, Proteinen in Gegenwart von organischen Chemikalien durch Rosettenbildung: Raji B-Zellen 107 in 1 ml RPMI-Medium mit 10% FCS und 200 mM Glutamin wurden jeder Vertiefung 48 h nach der Transfektion zugesetzt und mit transfizierten COS-7-Zellen in Gegenwart des Testpeptids (individuell 200 μM) bei 37°C für 1 h inkubiert.

Im Anschluß an die Inkubation wurden die Vertiefungen 5- oder 6-mal gewaschen, indem man RPMI-Medium mit FCS in die Vertiefungen tropfte. Die Rosettenbildung zwischen Raji-Zellen und transfizierten COS-7-Zellen wurde mikroskopisch bei 100-facher Vergrößerung bewertet. Die Zahl von Rosetten, die mehr als fünf Raji-Zellen enthielten, wurden in 10 statistischen optischen Feldern in jeder individuellen Vertiefung gezählt; 300–400 Rosetten pro Vertiefung wurden als positive Kontrolle für die Rosettenbildung ohne irgendeine Inhibierung in Abwesenheit jeglicher Chemikalien gezählt. Die Inhibierungsaktivität bezüglich Rosettenbildung für jede Chemikalie wurde bestimmt durch das Verhältnis der Zahl der Rosetten, die in Gegenwart dieser Chemikalie erhalten wurden, zur Zahl der Rosetten in der positiven Kontrolle. Mit pcDNA3-Vektor allein transfizierte COS-7-Zellen dienten als negative Kontrollen für die Rosettenbildung. In den negativen Kontrollvertiefungen sollten keine Rosetten beobachtet werden.
In einem zweiten Konstrukt wurde das T4-pMV7-Plasmid, das einen Tn5-Neo-selektierbaren Marker enthält, durch Elektroporation in COS-1-Zellen eingeführt. Stabil transfizierte Zellen wurden durch Selektion mit G-418 isoliert, und die resultierenden Transformanten exprimierten CD4.
Raji-Zellen wurden mit Cr⁵¹ markiert und zur Rosettenbildung mit den stabil T4-pMV7-transfizierten COS-1-Zellen kombiniert. Die Zugabe von 200 μM CNSNQIC (SEQ ID NO: 45) bewirkte nach dieser Technik eine mehr als 75%ige Inhibierung der Rosettenbildung.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptid mit einer Aminosäuresequenz: N(H)(R')-X'Z'(KERNPEPTID)Z''X''-CO-R'', worin: a) N(H)(R') der Aminoterminus ist, wobei R' Acetyl oder Wasserstoff ist; und CO-R'' der Carboxyterminus ist, wobei R'' NH₂ oder OH ist; b) X' vorhanden ist oder fehlt, und dann, wenn es vorhanden ist, eine L-Aminosäure oder ein Di- oder Tripeptid aus D- oder L-Aminosäuren ist, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Y, W und F, mit der Maßgabe, dass keine Aminosäure mehr als einmal ausgewählt ist; c) X'' vorhanden ist oder fehlt, und dann, wenn es vorhanden ist, eine L-Aminosäure ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Y, W, F, I, L oder einem Dipeptid aus D- oder L-Aminosäuren, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus L und I; d) Z' und Z'' Aminosäuren sind, die so miteinander verknüpft sind, dass das Peptid ein cyclisches Peptid ist; und e) das KERNPEPTID aus der Gruppe von Peptiden ausgewählt ist, die besteht aus

wobei * und + die Amino- bzw. Carboxytermini bezeichnen und die einzelnen Buchstaben L-Aminosäuren gemäß dem Einbuchstabencode bezeichnen, oder wobei * und + die Carboxy- bzw. Aminotermini bezeichnen und die einzelnen Buchstaben D-Aminosäuren gemäß dem Einbuchstabencode bezeichnen.
Peptid nach Anspruch 1, bei dem das KERNPEPTID aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus *-K-N-S-N-Q-L-I-K-+, *-K-N-S-N-Q-I-K-+, *-N-S-N-Q-L-I-+, *-N-S-N-Q-I-+, und *-K-L-E-N-K-E-A-+, wobei * und + die Amino- bzw. Carboxytermini bezeichnen und die einzelnen Buchstaben L-Aminosäuren gemäß dem Einbuchstabencode bezeichnen, oder wobei und + die Carboxy- bzw. Aminotermini bezeichnet und die einzelnen Buchstaben D-Aminosäuren nach dem Einbuchstabencode bezeichnen.
Peptid nach Anspruch 1, bei dem das KERNPEPTID *-N-S-N-Q-I-+ ist, wobei * und + die Amino- bzw. Carboxy termini bezeichnen und die einzelnen Buchstaben L-Aminosäuren gemäß dem Einbuchstabencode bezeichnen.
Peptid nach Anspruch 3, das CNSNQIC ist.
Peptid nach Anspruch 3, das YCNSNQIC ist.
Makrocyclisches Peptidomimetik, das einem tetrameren, pentameren oder hexameren Peptid entspricht und einen 10-gliedrigen Ring gemäß der Formel aufweist:
worin: R₁ der α-Kohlenstoff, die Aminoeinheit und die Seitenkette der aminoterminalen Aminosäure eines tetrameren Peptidomimetiks oder die aminoterminale Aminosäure und der α-Kohlenstoff, das Amin und die Seitenkette der zweiten Aminosäure eines pentameren oder hexameren Peptidomimetiks ist; R₂ die Seitenkette der zweiten Aminosäure eines tetrameren oder pentameren Peptidomimetiks oder die Seitenkette der dritten Aminosäure eines pentameren oder hexameren Peptidomimetiks ist; R₃ die Seitenkette der dritten Aminosäure eines tetrameren oder pentameren Peptidomimetiks oder die vierte Aminosäure eines pentameren oder hexameren Peptidomimetiks ist; und R₄ und 4-N gemeinsam die carboxyterminale Aminosäure eines tetrameren oder pentameren Peptidomimetiks, oder die carboxyterminalen zwei Aminosäuren eines pentameren oder hexameren Peptidomimetiks sind; und die Sequenz von Aminosäuren, der R₁ bis R₄ entsprechen, ausgewählt ist aus den folgenden Sequenzen:
worin * den Aminoterminus und + den Carboxyterminus bezeichnen.
Makrocyclisches Peptidomimetik nach Anspruch 6, bei dem die Aminosäuren ausgewählt sind aus den Sequenzen: *-N-S-N-Q-+, *-N-S-N-Q-I-+, wobei 4-N und R₄ gemeinsam dem C-terminalen Q-I-Dipeptid entsprechen, und *-K-N-S-N-Q-I-+.
Peptid gemäß der Formel: N(H)(R')-X'Z'A₂A₃A₄A₅A₇Z''-CO-R'', worin: a) N(H)(R') der Aminoterminus ist, wobei R' Acetyl oder Wasserstoff ist; und CO-R'' der Carboxyterminus ist, wobei R'' NH₂ oder OH ist; b) A₂, A₃, A₄, A₅ und A₇ nach dem folgenden Schema ausgewählt sind: i. A₂ ist N, Q oder D; A₃ ist S, T, D oder N; A₄ ist N, D, E oder Q; A₅ ist Q, N, E oder M; A₇ ist I, L, V oder A; wobei die einzelnen Buchstaben L-Aminosäuren gemäß dem Einbuchstabencode bezeichnen; c) X' vorhanden ist oder fehlt, und dann, wenn es vorhanden ist, eine L-Aminosäure oder ein Di- oder Tripeptid aus D- oder L-Aminosäuren ist, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Y, W und F, mit der Maßgabe, dass keine Aminosäure mehr als einmal ausgewählt ist; d) X'' vorhanden ist oder fehlt, und dann, wenn es vorhanden ist, eine D- oder L-Aminosäure ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Y, W, F, I, L oder einem Dipeptid aus D- oder L-Aminosäuren, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus L und I; und e) Z' und Z'' Aminosäuren sind, die so miteinander verknüpft sind, dass das Peptid ein cyclisches Peptid ist.
Peptid nach Anspruch 8, wobei das Peptid ein Molekulargewicht zwischen 1450 Dalton und etwa 400 Dalton aufweist, wobei das Peptid, in einer Konzentration von höchstens 200 μM: a) mehr als 50% der Bindung von COS-Zellen, die humanes CD4 exprimieren und mit CD4 transfiziert sind, an Raji-Zellen inhibiert; und b) eine weniger als 20%-ige Verminderung des Wachstums von EB-transformierten lymphoblastoiden Zellen und IL-2-abhängigen HT-2 Zellen bewirkt.
Peptid nach Anspruch 8, das ein Molekulargewicht von weniger als 1400 Dalton aufweist.
Peptid nach Anspruch 8, das, in einer Konzentration von höchstens 200 μM: a) eine weniger als 20%-ige Abnahme der Reaktion von Lymphozyten des humanen peripheren Bluts auf Lipopolysaccharide bewirkt; und b) mehr als 25% des Ansprechens einer humanen gemischten Lymphozyten-Reaktion inhibiert.
Verbindung nach Anspruch 10, die ein Molekulargewicht von weniger als 1400 Dalton aufweist.
Peptid nach Anspruch 8, wobei das Peptid ein Peptidomimetik ist.
Peptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 oder 8 bis 13 oder ein makrocyclisches Peptidomimetik, wie es in Anspruch 6 oder 7 beansprucht wird, zur Verwendung als Arzneimittel.
Peptid oder makrocyclisches Peptidomimetik nach Anspruch 14 zur Verwendung als Arzneimittel zur Unterdrückung der humanen CD4-T-Zell-Immunantwort bei einem Individuum.
Peptid oder makrocyclisches Peptidomimetik nach Anspruch 14 zur Verwendung bei der Behandlung eines medizini schen Zustands, der eine Beziehung zu einem allogenen Transplantat aufweist.
Peptid oder makrocyclisches Peptidomimetik nach Anspruch 14 zur Verwendung bei der Behandlung von Multipler Sklerose.
Verwendung eines Peptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 oder 8 bis 13 oder eines makrocyclischen Peptidomimetiks, wie es in Anspruch 6 oder 7 beansprucht wird, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Suppression einer humanen CD4-T-Zell-Immunantwort bei einem Individuum.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Individuum einen medizinischen Zustand aufweist, der eine Beziehung zu einem allogenen Transplantat aufweist.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Individuum einen medizinischen Zustand aufweist, der eine Beziehung zu Multipler Sklerose aufweist.