ES2329664T3 - Metodos y reactivos para detectar endotoxina. - Google Patents
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Abstract
Un reactivo para incrementar la sensibilidad de la detección de endotoxina enzimática, que comprende: una proteína del factor C de límulo purificada; y un tensoactivo, en donde la proteína del factor C de límulo purificada es enzimáticamente activa en la presencia del tensoactivo y en donde el tensoactivo está presente en una cantidad que incrementa la sensibilidad de una reacción de detección de endotoxina enzimática relacionada con un reactivo que contiene la proteína del factor C de límulo purificada pero que no comprende el tensoactivo.
Description
Métodos y reactivos para detectar
endotoxina.
La invención se relaciona con reactivos y
métodos para detectar endotoxina.
La endotoxina bacteriana gram negativa es un
contaminante de amplia expansión de una variedad de materiales, tal
como agua, alimento, productos farmacéuticos, y preparaciones
parenterales. Las pruebas más comúnmente utilizadas para la
contaminación de endotoxina emplean lisatos amebocito derivados de
hemolinfa de límulo. Como las poblaciones de estos animales se
reducen, sin embargo, llega a ser muy importante para desarrollar
métodos rápidos y confiables para detectar endotoxina que no confía
en la disponibilidad de hemolinfa de límulo. La solicitud de
patente Europea EP-A-0837330
describe un método para inactivar la sustancia activante de reacción
limulus al exponer un producto biológico a un tensoactivo a una
temperatura que varía del punto de congelamiento del
tensoactivo
a 50ºC.
a 50ºC.
La invención proporciona reactivos, métodos y
equipos para detectar endotoxina como se define en las
reivindicaciones adjuntas.
Fig. 1. La gráfica muestra el efecto de
Zwittergent 3-14 y Tween 20 en la actividad del
Factor C recombinante.
Fig. 2. La gráfica muestra el efecto de
Zwittergent 3-14 y Tween 80 en la actividad del
Factor C recombinante.
Fig. 3. La gráfica muestra el efecto de
Zwittergent 3-14 y Triton X-114 en
la actividad del Factor C recombinante.
Fig. 4. El gráfico muestra la detección de
endotoxina utilizando un sustrato DPR
(N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-Amido-4-metilo)-coumarina.
Fig. 5. El gráfico muestra la detección de
endotoxina utilizando un sustrato VPR
(N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-Amido-4-metilo)-coumarina.
Fig. 6. La gráfica muestra la actividad del
Factor C Limulus en diferentes concentraciones de dipolaridad.
Fig. 7. La gráfica muestra la sensibilidad de
endotoxina en la presencia y ausencia del tensoactivo.
Fig. 8. La gráfica muestra resultados de un
ensayo de endotoxina de una etapa, de una hora, utilizando
DPR-coumarina como un sustrato.
Fig. 9. La gráfica muestra el efecto de
zwittergent 3-14 y octiltiolglicosida en la
actividad del Factor C recombinante.
Fig. 10. La gráfica muestra el efecto de
zwittergent 3-14 y Genapol C-100 en
la actividad del Factor C recombinante.
Fig. 11. La gráfica muestra el efecto de
Zwittergent 3-14 y TX-100 en la
actividad del Factor C recombinante.
La invención es un reactivo para detectar
endotoxina y un método para utilizar el reactivo. El reactivo
comprende un proteína del factor C de límulo purificada y un
tensoactivo en donde la proteína del factor C de límulo purificada
es enzimáticamente activa en la presencia del tensoactivo y en donde
el tensoactivo está presente en una cantidad que incrementa la
sensibilidad de una reacción de detección de endotoxina enzimática
relacionada con un reactivo que contiene la proteína del factor C
de límulo purificada pero que no comprende el tensoactivo. Este
reactivo se puede utilizar en conjunto con un sustrato para el
Factor C que, luego de división, genera una señal detectable para
detectar endotoxina en una muestra de prueba. La presencia del
tensoactivo mejora la activación del Factor C purificado por
endotoxina tanto como 3-7 veces, que permite la
medición más rápida y sensible de los niveles de endotoxina en una
muestra de prueba. El reactivo contiene preferiblemente un Factor C
recombinante, eliminando así la necesidad de un suministro continuo
de hemolinfa de límulo.
Un componente del reactivo de esta invención
comprende una proteína del factor C de límulo purificada. El Factor
C nativo purificado de cualquiera de las cuatro especies de límulo
conocidas, Limulus polyphemus, Carcinoscorpius
rotundicauda, Tachypleudus tridentata, o Tachypleudus
gigas, se pueden utilizar en la práctica de la invención. El
Factor C nativo se puede purificar bioquímicamente o el factor C
purificado se puede producir recombinantemente.
"Factor C purificado" como se utiliza aquí
significa una composición de una proteína de Factor C como se define
aquí después que contiene menos de 30% en peso de componentes de
lisato amebocito nativo sin Factor C de cualquiera de las cuatro
especies de límulo conocidas. La composición específicamente incluye
un sobrenadante de cultivo celular que comprende la proteína de
Factor C recombinante (ver adelante). Los métodos para purificar el
factor C de límulo de su fuente nativa se conocen y se describen,
por ejemplo, en Nakamura et al., Eur. J. Biochem. 154,
511-21, 1986; Navas et al., Biochem. Intl.
21, 805-13, 1990; Tokunaga et al., J.
Biochem. 109, 150-157, 1991; Patente Estaodunidense
5,985,590, y Patente estadounidense 5,716,834. Cualquiera de estos
métodos o sus equivalentes se pueden utilizar para obtener un
factor C purificado. Ver también el Ejemplo 11. La pureza de una
preparación del Factor C se puede evaluar por cualquier medio
conocido en la técnica, tal como Electrofóresis de gel SDS.
Preferiblemente, el Factor C purificado se
produce recombinantemente. Las secuencias de aminoácido para el
Factor C nativo de Tachypleus tridentata y Carcinoscorpius
rotundicauda se conocen, como las secuencias codificantes de
ocurrencia natural para estas proteínas. La SEQ ID NOS:1 y 3
proporcionan secuencias codificantes para las secuencias de
aminoácido de Factor C Tachypleus tridentata mostradas en la
SEQ ID NOS:2 y 4, respectivamente. La SEQ ID NOS:5 y 7 proporcionan
secuencias codificantes para las secuencias de aminoácido del Factor
C Carcinoscorpius rotundicauda mostradas en la SEQ ID NOS:6
y 8, respectivamente. Debido a la degeneración del código genético,
muchas otras secuencias se pueden prever que codificarán cada una de
estas proteínas del Factor C nativo, y la invención específicamente
contempla el uso de cualquiera de estas secuencias codificantes para
producir un factor C purificado.
La invención también abarca el uso de variantes
del factor C, de ocurrencia natural y no natural, es decir,
producidas recombinantemente, dado que las variantes retienen una
actividad de enzima del factor C. La actividad de enzima del factor
C se puede evaluar utilizando cualquier ensayo para la actividad de
enzima del factor C conocida en la técnica. Ver, por ejemplo,
Tokunaga et al., J. Biochem. 109, 150-57
(1991) y Nakamura et al., Eur. J. Biochem. 176,
89-94, 1988. También se pueden utilizar ensayos de
endotoxina descritos en los Ejemplos 1 y 13, adelante. Las
variantes del Factor C de ocurrencia natural incluyen, por ejemplo,
productos de variantes de empalme de mARN del Factor C o genes del
Factor C mutados.
Se pueden construir variantes del Factor C de
ocurrencia no natural utilizando sustituciones, adiciones, o
eliminaciones base para producir proteínas que tienen la actividad
del Factor C. Las variantes del Factor C de ocurrencia no natural
pueden diferir del factor C de ocurrencia natural tanto como 50, 75,
80, 85, 90, 95, 97, 98, o 99%, como se determina utilizando el
programa de alienación Blast2 (Blosum62, Expect 10, códigos
genéticos estándar). Los fragmentos del Factor C producido
recombinantemente y nativo que retienen la actividad del Factor C
también se pueden utilizar en la práctica de la invención. Así,
"Factor C" como se utiliza aquí incluye proteínas de
ocurrencia natural y no natural y fragmentos de proteína que tienen
las propiedades descritas anteriormente.
Los métodos para producir proteínas
recombinantemente son bien conocidos en la técnica y generalmente
involucran cultivar una célula anfitriona que comprende un vector
de expresión que codifica la proteína de Factor C en un
sobrenadante bajo condiciones de tal forma que se expresa la
proteína. La proteína expresada se puede recuperar o,
preferiblemente, el sobrenadante que comprende la proteína expresada
se utiliza directamente como la fuente de Factor C recombinante.
Así, el "factor C purificado" específicamente incluye un
sobrenadante que comprende el Factor C recombinante. Las células
anfitrionas útiles para la producción del Factor C recombinante
incluyen, sin limitación, células de levadura y células de
insectos. La producción recombinante del Factor C de
Carcinoscorpius rotundicauda en células anfitrionas
Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae se describe
específicamente en la Patente estadounidense 5,985,590.
Un método particularmente preferido para obtener
el Factor C recombinante es producir la proteína es un sistema
baculovirus, como se describe en los Ejemplos 2-5.
En resumen, una Secuencia que codifica el factor C se clona en
pFASTBAC 1. El plásmido recombinante resultante se transforma en
células competentes DH10BAC que contienen un bácmido con un sitio
objetivo mini-attTn7 y un plásmido auxiliar. En la
presencia de proteínas de transposición proporcionadas por el
plásmido auxiliar, el elemento transponible mini-Tn7
en el plásmido pFASTBAC puede transponer al sitio objetivo
mini-attTn7 en el bácmido. Las colonias que
contienen bácmidos recombinantes se identifican por la interrupción
del gen lacZ\alpha. El ADN de alto peso molecular se prepara a
partir de clones DH10BAC seleccionados que contienen el bácmido
recombinante. Este ADN luego se utiliza para transfectar células de
insectos S9, que luego secretarán el Factor C recombinante. Un
descubrimiento particularmente sorprendente de la presente
invención es que el medio de cultivo que contiene el Factor C
secretado, que se ha separado de los cultivos celulares, se puede
utilizar junto con un tensoactivo (descrito adelante) como un
reactivo en ensayos de endotoxina sin purificación adicional.
Los reactivos de la invención también comprenden
un tensoactivo. Los tensoactivos útiles en la práctica de la
invención incluyen aquellos descritos en Patente estadounidense
4,322,217, aunque también se pueden utilizar otros tensoactivos.
Tensoactivos útiles incluyen tensoactivos amfotéricos que contienen
un grupo aniónico y catiónico en su estructura. Son ilustrativas
las sulfobetaínas representadas por la Fórmula A:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R_{1} es un radical alquileno que tiene de 1 a
aproximadamente 4 átomos de carbono,
Y es cualquiera, el sustituyente químicamente
adecuado no nocivo que incluye (1) hidrógeno, (2) alquilo inferior
sustituido o no sustituido, por ejemplo, que contiene 1 a 4 átomos
de carbono tal como metilo, etilo, propilo, o hidroxi etc.;
R_{2} y R_{3} cada uno se seleccionan de
alquilo inferior sustituido o no sustituido que contiene 1 a 4
átomos de carbono, por ejemplo, tal como metilo, etilo, propilo,
hidroxietilo, hidroxi metilo, hidroxipropilo, etc.
n=0 o 1,
cuando n=0, R_{4} es alquilo sustituido o no
sustituido, por ejemplo, que contiene aproximadamente 8 a
aproximadamente 18 átomos de carbono, y
cuando n=1, R_{4} es un radical alquileno que
tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono,
R_{5} es un alquilo sustituido o no sustituido, por ejemplo, que
contiene aproximadamente 8 a aproximadamente 18 átomos de
carbono.
El término "alquileno" abarca radicales
polimetileno y otros radicales alifáticos saturados divalentes. Así,
se pueden ramificar en el ligado proporcionado por el radical
alquileno. El término "inferior" significa un radical que
contiene 1 a 4 átomos de carbono.
Las sulfobetaínas que se pueden utilizar en el
reactivo de la presente invención se conocen en la técnica y se han
descrito como tensoactivos dipolares. Se describe la preparación de
tales compuestos, por ejemplo, en Fernley, J. Am. Oil Chem. Soc.
55, 98-103 (1978) y Patente estadounidense
3,280,179. En tensoactivos sulfobetaína preferidos, R_{2} y
R_{3} en la estructura anterior son metilo. También se prefiere
que R_{1} sea propileno.
Un tipo de tensoactivo sulfobetaína útil tiene
la estructura anterior en donde n es igual a 0 y R_{4} es un
radical alquilo que tiene de aproximadamente 8 a 18 átomos de
carbono, preferiblemente un radical alquilo de cadena recta. Para
estos tensoactivos sulfobetaína, una fuente conveniente del
componente R_{4} es alcohol graso de sebo, que consiste de una
mezcla de varias longitudes de cadena, con una composición típica
que es aproximadamente 66 porciento C_{18}, 30 porciento
C_{16}, y 4 porciento C_{14} y otros. Otra fuente convencional
es el corte medio de alcohol graso de coco destilado, que también
consiste de una mezcla de varias longitudes de cadena, con una
composición típica que es aproximadamente 66 porciento C_{12}, 23
porciento C_{14}, 9 porciento C_{16} y 2 porciento
C_{10}.
Los tensoactivos específicos sulfobetaína de la
estructura anterior en donde n es igual a 0 se establecen en la
Patente estadounidense 3,539,521. Un tensoactivo particularmente
preferido de este tipo es
N-tetradecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato,
que está disponible comercialmente de
Calbiochem-Behring Corporation bajo el nombre
comercial ZWITTERGENT 3-14.
Otro tipo de tensoactivo sulfobetaína útil que
tiene la estructura anterior en donde n es igual a 1 y R_{4} es
un radical alquileno que tiene de aproximadamente 1 a
aproximadamente 6 átomos de carbono. En estas sulfobetaínas en
donde n es igual a 1, R_{5} es un radical alquilo que tiene de
aproximadamente 8 a aproximadamente 18 átomos de carbono. Se
prefiere que R_{5} sea de cadena recta. Como se discutió
previamente, las fuentes convenientes de radicales alquilo que
tienen de aproximadamente 10 a aproximadamente 18 átomos de carbono
son alcohol graso de sebo y alcohol graso de coco. Los tensoactivos
sulfobetaína específicos de la estructura anterior en donde n es
igual a 1 se establecen en la Patente estadounidense 3,280,179.
Particularmente los tensoactivos sulfobetaína
preferidos son
3-(N,N-dimetil-N-acilamidopropilamonio)-2-hidroxipropano-1-sulfonatos,
en donde el grupo acilo se deriva de alcohol graso de sebo o alcohol
graso de coco, con alcohol graso de coco preferido. Se reconocerá
por aquellos expertos en la técnica que, en la preparación normal
de estos derivados de alcoholes grasos de coco o de sebo, resultará
en una mezcla de sulfobetaínas con varias longitudes de cadena de
carbono para los grupos acilo. Como se discutió previamente, estos
alcoholes grasos contienen, para la mayor parte, longitudes de
cadena de carbono que proporcionarán grupos acilo con el número
deseado de átomos de carbono, es decir, de aproximadamente 8 a
aproximadamente 18 átomos de carbono. Así, estas mezclas obtenidas
de alcoholes grasos de coco o de sebo son útiles para proporcionar
el tensoactivo sulfobetaína para los reactivos de la presente
invención.
Un material de este tipo particularmente
preferido para uso en los reactivos de la presente invención es
N-cocoamido-propil-N,N-dimetil-N-2-hidroxipropilo
sulfobetaína. Un ejemplo de esto es LONZAINE CS, que está disponible
comercialmente de Lonza, Inc., Fair Lawn, N.J.
Otros tensoactivos amfotéricos incluyen los
ácidos alquilaminocarboxílicos de cadena larga N ilustrados por la
Fórmula B:
ácidos alquiliminocarboxílicos de
cadena larga ilustrados por la Fórmula
C:
y alquilo de cadena larga N o
betaínas amido ilustradas por la Fórmula
D:
en donde R_{1}, R_{2}, R_{3},
R_{4}, Y, y n tienen el mismo significado como el que ellos tienen
en la Fórmula A, M es hidrógeno o un metal formador de sal, y Y'
tiene el mismo significado como Y en la Fórmula A. Y y Y' pueden
ser los mismos o diferentes. Ejemplos de detergentes amfotéricos
específicos son ácido
N-alquilbeta-aminopropionico, ácido
N-alquil-beta-iminodipropionico,
y
N-alquil-N,N-dimetilglicina;
el grupo alquilo puede ser, por ejemplo, derivados de alcohol graso
de coco, alcohol laurilo, alcohol miristilo (o una mezcla de
lauril-miristilo), alcohol de sebo hidrogenado,
cetilo, estearilo, o mezclas de tales alcoholes. Los ácidos
aminopropiónicos e iminodipropiónicos sustituidos se suministran
frecuentemente en el sodio u otras formas de sal, que también se
pueden utilizar en los reactivos de la
invención.
Ejemplos específicos incluyen cocobetaína
vendida por Witco Chemical Corporation bajo el nombre EMCOL CC
37-18, cocoamidopropil betaína vendida por Lonza
Inc. bajo el nombre LONZAINE CO, y disodio
N-sebo-beta-iminodipropionato
vendido por Henkel Corporation bajo el nombre de DERIPHAT 160.
Ejemplos de otros detergentes amfotéricos son
las imidazolinas grasas tal como aquellas hechas al hacer reaccionar
un ácido graso de cadena larga (por ejemplo, de 10 a 20 átomos de
carbono) con dietileno triamina y ácidos monohalocarboxílicos que
tienen 2 a 6 átomos de carbono, por ejemplo
1-coco-5-hidroxietilo-5-carboximetilimidazolina.
Ejemplos específicos incluyen cocoimidazolina, que está disponible
comercialmente bajo el nombre AMPHOTERGE K-2 de
Lonza, Inc., yeimidazolina dicarboxi cáprica, que está disponible
comercialmente bajo el nombre AMPHOTERGE KJ-2 de
Lonza, Inc.
Otros ejemplos de tensoactivos útiles incluyen
tensoactivos sintéticos aniónicos, generalmente descritos como
aquellos compuestos que contienen grupos hidrófilos y lipófilos en
su estructura molecular y se ionizan en un medio acuoso para dar
aniones que contienen el grupo lipófilo y el grupo hidrófilo. Los
alquil aril sulfonatos, los alcano sulfatos, y fenoles alquilo
oxilatados sulfatados son ilustrativos del tipo aniónico de los
compuestos activos de
superficie.
superficie.
Los alquil aril sulfonatos son una clase de
agentes activos de superficie aniónica sintética representados por
la Fórmula E:
(E)(P_{6})_{n1}-(Y)Ar(SO_{3}M)_{n2}
En la Fórmula E, R_{6} es un radical de
hidrocarburo de cadena recta o ramificada que tiene de
aproximadamente 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, por lo
menos uno de R_{6} tiene por lo menos 8 átomos de carbono; n 1 es
de 1 a 3; n2 es de 1 a 2; Ar es un radical fenilo o naftilo, y Y y M
tienen el mismo significado como en la Fórmula B. R_{6} puede
ser, por ejemplo, metilo, etilo, hexilo, octilo, tetraoctilo,
iso-octilo, nonilo, decilo, dodecilo, octadecilo, y
similares.
Los compuestos ilustrativos de los alquil aril
sulfonatos incluyen dodecilbenceno sulfonato de sodio, decilbenceno
sulfonato de sodio, metildodecilbenceno sulfonato de amonio,
dodecilbenceno sulfonato de amonio, octadecilbenceno sulfonato de
sodio, nonilbenceno sulfonato de sodio, dodecilnaftaleno sulfonato
de sodio, hetadecilbenceno sulfonato de sodio, eicososil naftaleno
sulfonato de potasio, etilamina undecilnaftaleno sulfonato y
docosilnaftaleno sulfonato de sodio.
Los alquilsulfatos son una clase de agentes
activos de superficie aniónica sintética representados por la
Fórmula F:
(F)R_{S}OSO_{3}M
en donde R_{5} y M tienen el
mismo significado como en la Fórmula B. Los compuestos ilustrativos
de la clase alquilsulfato de tensoactivos aniónicos incluyen
octadecil sulfato de sodio, hexadecil sulfato de sodio, dodecil
sulfato de sodio, nonil sulfato de sodio, decil sulfato de amonio,
tetradecil sulfato de potasio, dietanolamino octil sulfato,
trietanolamina octadecil sulfato, y nonil sulfato de
amonio.
Los alquilfenoles oxilatados sulfatados son una
clase de agentes activos de superficie aniónica sintética
representados por la Fórmula G:
en donde A es oxígeno, azufre, un
grupo carbonamida, un grupo tiocarbonamida, un grupo carboxílico, o
un grupo tiocarboxílico, z es un entero de 3 a 8, y R_{5} y M
tienen el mismo significado como en la Fórmula B. Los compuestos
ilustrativos de la clase fenol alquil oxietilatada sulfatada de
tensoactivos aniónicos incluyen sulfato de sodio nonilfenoxil
tetraetilenoxi de amonio, dodecilfenoxi trietilenoxi sulfato,
etanolamina decilfenoxi tetraetilenoxi sulfato, y octilfenoxi
trietilenoxi sulfato de
potasio.
Otros ejemplos de tensoactivos útiles incluyen
compuestos activos de superficie no iónica, que se pueden describir
ampliamente como compuestos que no ionizan pero adquieren
características hidrófilas de una cadena lateral oxigenada, tal
como polioxietileno; la parte lipófila de la molécula puede venir de
ácidos grasos, fenol, alcoholes, amidas, o aminas. Los compuestos
se hacen usualmente al hacer reaccionar un óxido alquileno, tal
como óxido de etileno, óxido de butileno, óxido de propileno y
similares, con ácidos grasos, alcoholes de cadena recta o
ramificada que contienen uno o más grupos hidroxilo, fenoles,
tiofenoles, amidas, o aminas para formar glicoéteres
polioxialquileno y ésteres, polioxialquilen alquilfenoles,
polioxialquilen tiofenoles, polioxialquileno amidas y similares. Se
prefiere generalmente hacer reaccionar de aproximadamente 3 a
aproximadamente 30, más preferiblemente 10 a 30, moles de óxido de
alquileno por mol de ácidos grasos, alcoholes, fenoles, tiofenoles,
amidas, o aminas.
Ilustraciones de estos tensoactivos no iónicos
son los productos obtenidos de la reacción de óxido de alquileno
con un alcohol alifático que tiene de 8 a 18 átomos de carbono, tal
como octilo, nonilo, decilo, octadecilo, dodecilo, tetradecilo y
similares, con monoésteres de alcoholes hexahídricos, el grupo éster
que contiene 10 a 20 átomos de carbono tal como monolaureato
sorbitán, monooleato sorbitán y monopalmitato sorbitán, con un
alquil fenol en el que el grupo alquilo contiene entre 4 y 20 átomos
de carbono, tal como butilo, dibutilo, amilo, octilo, dodecilo,
tetradecilo, y similares, o con una amina alquilo en la que el grupo
alquilo contiene entre 1 a 8 átomos de carbono.
Los compuestos ilustrativos de tensoactivos
sintéticos no iónicos incluyen los productos obtenidos de óxido de
etileno condensado o óxido de propileno con los siguientes:
propilenglicol, etilendiamina, dietilenglicol, dodecil fenol, nonil
fenol, tetradecil alcohol, N-octadecil
dietanolamida, N-dodecil monoetanolamida,
polioxietileno (20) sorbitán monooleato vendido bajo el nombre
TWEEN 80 y polioxietileno (20) sorbitan monolaurato vendido bajo el
nombre TWEEN 20.
\newpage
Otros tensoactivos no iónicos incluyen óxidos
amina terciara de cadena larga que corresponden a la Fórmula H:
(H)R_{5}R_{7}R_{8}N\rightarrowO
en donde R_{5} tiene el mismo
significado como en la Fórmula A, y R_{7} y R_{8} son cada uno
radicales metilo o etilo. La flecha en la Fórmula es una
representación convencional de un enlace semi-polar.
Ejemplos de óxidos amina adecuados para uso en esta invención
incluyen óxido de dimetildodecilamina, óxido de dimetilooctilamina,
óxido de dimetildecilamina, óxido de dimetiltridecilamina, y óxido
de
dimetilhexadecilamina.
Los agentes activos de superficie catiónica
también se pueden utilizar como tensoactivos. Tales agentes son
aquellos compuestos activos de superficie que contienen un grupo
hidrófobo orgánico y un grupo solubilizante catiónico. Los grupos
solubilizantes catiónicos típicos son grupos amina y cuaternarios.
Tales agentes activos de superficie catiónica se representan por la
Fórmula I:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R_{5}, Y, y Y' tienen el
mismo significado como en la Fórmula
C.
Otros ejemplos de tensoactivos catiónicos
sintéticos adecuados incluyen las diaminas tales como aquellas de
la Fórmula J:
(J)R_{9}NHC_{2}H_{4}NH_{2}
en donde R es un grupo alquilo de
aproximadamente 12 a 22 átomos de carbono, tal como
N-2-aminoetilo estearil amina y
N-2-aminoetilo miristil amina;
aminas ligadas a amida tal como aquellas de la Fórmula
K:
(K)R_{5}CONHC_{2}H_{4}NH_{3}
tal como
N-2-amino etilostearil amida y
N-amino etilo miristil amida; compuestos de amonio
cuaternario en donde típicamente uno de los grupos ligados al átomo
de nitrógeno son grupos alquilo que contienen 1 a 3 átomos de
carbono, que incluyen tal 1 a 3 grupos alquilo carbono que llevan
sustituyentes inertes, tal como grupos fenilo y está presente un
anión tal como halógeno, acetato, metilosulfato, etc. Los compuestos
de amonio cuaternario típicos son cloruro de
etilo-dimetiloestearil amonio, cloruro de
bencil-dimetil-estearil amonio,
cloruro de bencildimetil-estearil amonio, cloruro
de trimetil estearil amonio, bromuro de trimetilocetil amonio,
cloruro de dimetiletil dilaurilamonio, cloruro de
dimetil-propil-miristil amonio, y
los metosulfatos correspondientes y
acetatos.
Otro tensoactivo catiónico adecuado se
representa por la Fórmula L:
en donde R_{5} tiene el mismo
significado como en la Fórmula A y cada a es un entero de 1 a 15. Un
ejemplo es la polietilenglicol amina de sebo hidrogenado en donde
R_{5} representa el radical de sebo y a+a tiene un valor promedio
de
5.
\newpage
Otros tensoactivos útiles para uso en el
reactivo de tensoactivo del Factor C incluyen Triton
X-100, Triton X-114, octilbeta-
D-tioglucosida (OTG, Amresco #J575), Genapol
C-100 (un alquil polioxietileno C12E10; Calbiochem
#345794), Tween 20, y Tween 80.
Para formar un reactivo de la invención, el
factor C purificado y un tensoactivo se combinan en una solución
acuosa. Una solución de amortiguador adecuada para este propósito
contiene 30 mM Tris, pH 8.0, 30 mM NaCl, y 0.3% lactosa. La
concentración del factor C purificado en un reactivo de la invención
preferiblemente varía de 0.03-3 \mug/ml. La
concentración de tensoactivo en el reactivo de la invención
preferiblemente varía de 0.001-0.003%. Las
concentraciones óptimas del factor C purificado y del tensoactivo
variará, dependiendo, por ejemplo, de la pureza del Factor C y el
tensoactivo particular. Las concentraciones óptimas del factor C
purificado y de tensoactivo se pueden determinar utilizando la
prueba de rutina. En la concentración ejemplificada de ensayo en
los Ejemplos 1 y 13, la concentración óptima del tensoactivo
ZWITTERGENT 3-14 es 0.0025%.
El reactivo descrito anteriormente se puede
utilizar en un ensayo para detectar endotoxina en una muestra de
prueba. La muestra de prueba puede ser cualquier muestra en la que
será útil detectar endotoxina, que incluye agua, soluciones acuosas
tal como amortiguadores, preparaciones farmacéuticas (por ejemplo,
vacunas, fluidos intravenosos, preparaciones de fármaco), reactivos
de formación de imagen biomédicos (por ejemplo, tintes, soluciones
radioactivas), preparaciones de enzima (por ejemplo, colagenasa),
medio de cultivo de tejido, bebidas, sangre, orina, fluido
cerebroespinal, linfa, suero, y soluciones formadas al incubar agua
o una solución acuosa con una muestra sólida, tal como un polvo
alimenticio o un globo quirúrgico.
Se puede desarrollar un ensayo de una etapa o
dos etapas. Para desarrollar el ensayo de dos etapas (Ejemplo 1),
una muestra de prueba se incuba con un reactivo que contiene el
factor C purificado y un tensoactivo, luego se agrega un sustrato
del Factor C que generará una señal detectable luego de división.
Para desarrollar el ensayo de una etapa (Ejemplo 13), se agregan
juntas endotoxina, el reactivo que contiene factor C purificado y
un tensoactivo, y un sustrato.
Los sustratos que generarán una señal
fluorescente luego de división se prefieren particularmente, tal
como N-t-BOCAsp
(Obzl)-Pro-Arg-7-Amido-4-metilcoumarina
("DPR", Bachem 1-1560.0050) y
N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-Amido-4-metilcoumarina
("VPR", Bachem 1-1120.0050). Las
concentraciones de DPR generalmente varían de aproximadamente
10-100 mM, 25-100 mM,
5-100 mM, 75-100 mM,
25-75 mM, 50-75 mM,
25-50 mM, o 50-75 mM. La
concentración de VPR generalmente varía de aproximadamente
50-200 mM, 50-150 mM,
50-100 mM, 50-75 mM,
75-150 mM, o 75-100 mM.
La concentración óptima de un sustrato
particular varía. Por ejemplo, la concentración óptima para DPR es
50 mM, en donde la concentración óptima para VPR es 100 mM. Más aún,
el sustrato particular se puede seleccionar dependiendo de los
niveles de endotoxina se espera que están presentes en la muestra de
prueba. El sustrato VPR tiene un rango lineal mejor en mayores
concentraciones de endotoxina, y el sustrato DPR tiene un mejor
rango lineal en concentraciones inferiores de endotoxina. Así, el
DPR se puede utilizar en ensayos en los que se desea sensibilidad
mayor, en donde el VPR es el sustrato preferido cuando niveles de
endotoxina mayores se esperan por estar presentes y se requiere una
sensibilidad inferior.
La fluorescencia se puede medir utilizando
cualquier medio conocido en la técnica. Si un fluorímetro se utiliza
con los sustratos DPR o VPR descritos anteriormente, la excitación
se establece a 360, 380, 390, o 395 nm (amplitud de ranura de
5-40 nm) y la emisión se mide utilizando 440 o 460
nm (amplitud de ranura de 2.5-40 nm). Se puede
hacer medición cualitativa o cuantitativa, por referencia a una
curva de concentración de endotoxina estándar.
El ensayo se puede llevar a cabo en un
recipiente claro, tal como un vidrio o placa de cultivo de tejido de
poliestireno, o se puede llevar a cabo en un recipiente negro (por
ejemplo, una microplaca de 96 pozos negra). Si se desea, el ensayo
se puede adaptar para detección de alto rendimiento de múltiples
muestras utilizando, por ejemplo, placas de microtítulo de 96
pozos.
La invención también proporciona un equipo para
uso en detectar endotoxina. El equipo comprende una proteína del
factor C de límulo purificada y un tensoactivo, como se describió
anteriormente. Se puede incluir instrucciones para utilizar el
reactivo para detectar endotoxina. También los equipos pueden
incluir un sustrato del Factor C para uso en el ensayo.
La endotoxina se preincuba con medio de cultivo
contiene el Factor C de Carcinoscorpius rotundicauda
recombinante obtenidos de células Sf) que producen el Factor C
recombinante durante 1 hora en amortiguador de ensayo (30 mM Tris,
pH 8.0, 30 mM NaCl, 0.3% lactosa, y 0.0025% Zwittergent
3-14). El sustrato
N-t-Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-Amido-4-metilcoumarina
(DPR-coumarina) se agrega a la mezcla en una
concentración final de 50 mM. La fluorescencia generada de la
división del sustrato al activar el Factor C se mide después de
15-20 minutos. Los resultados se muestran en la
Fig. 4. Los resultados de un ensayo similar llevados a cabo
utilizando el sustrato
N-t-Boc-Val-Pro-Arg-7-Amido-4-metilcoumarina
en una concentración final de 100 mM se muestran en la Fig. 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células Sf9 se siembran en una densidad de 5
x 10^{6} por 35 mm de pozo en una placa de cultivo de tejido de 6
pozos en medio de cultivo celular de insecto (ICCM) que contiene 50
U/ml penicilina y 50 mg/ml estreptomicina.
Insect-Xpress (BioWhittaker Cat.
#04-10270) o Sf-900 SFM son medios
adecuados; sin embargo, cualquier medio comparable en el que las
células SF9 crecidas se puede utilizar. Las placas se incuban a 27ºC
durante 1 para permitir a las células fijar. Mientras tanto, se
preparan los siguientes (cada uno por pozo): (1) 7 mg de ADN del
Factor C bácmido en 100 ml de ICCM (sin antibióticos) y (2) 6 ml
CELLFECTIN (Gibco-BRL) más 100 ml ICCM (sin
antibióticos). Se mezclan soluciones (1) y (2) gentilmente y se
incuban a temperatura ambiente durante una hora. A esta mezcla, se
agrega 0.8 ml de ICCM (sin antibióticos).
Las células Sf9 adheridas se lavan gentilmente
con 2 ml de ICCM (sin antibióticos). Uno ml de complejo de
CELLFECTIN-DNA se agrega a cada pozo y se incuba a
27ºC durante 5 horas. Las mezclas de transfección se remueven
completamente, y se agrega 2 ml de ICCM que contiene antibióticos.
Después de incubación a 27ºC durante 96 horas, el sobrenadante de
cultivo celular se cosecha. El sobrenadante se clarifica mediante
centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos en un rotor de disco
rotativo SIGMA 3K10, Nr. 11133. El sobrenadante, que contiene el
baculovirus recombinante, se almacena a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede hacer amplificación de virus con
células Sf9 en una monocapa o en suspensión. Para el cultivo de
monocapa, el medio se decanta de un cultivo de 80% confluente de
células Sf9 de un día de edad en un matraz de cultivo de tejido de
75 cm^{2}. La monocapa celular se infecta con 1 ml del virus
(Ejemplo 2) utilizando un MOI de 0.1-1. El
almacenamiento del virus se filtra estéril utilizando un filtro
Millipore GV millex (amarillo; unión de proteína inferior). El
cálculo del inóculo vírico es como sigue:
Volumen de
inóculo = \frac{MOI \ x \ numero \ de \ célula \
total}{t\text{í}tulo \ de \ virus \ en \
pfu/ml}
Así, para células 1 x 10^{7}, en un título de
virus de 2 x 10^{7} pfu/ml, el volumen del inóculo es 0.5 ml. El
volumen del inóculo se ajusta a 1 ml con ICCM antes de ser
introducido a las células.
El matraz se sacude varias veces para asegurar
que la monocapa celular se cubre completamente mediante el inóculo
vírico de 1 ml. El matraz luego se incuba a 27ºC durante una hora
sin sacudir. Después de incubación, el frasco se coloca vertical, y
se agrega 14 ml de ICCM fresco. El matraz luego se incuba durante 3
días a 27ºC.
El sobrenadante de cultivo se cosecha en tubos
libres de pirógeno estériles y se centrifuga a 2000 rpm durante 10
minutos a 4ºC utilizando un rotor de disco rotativo Sigma 3K10. Para
uso inmediato, el almacenamiento vírico se almacena a 4ºC. Para
almacenamiento a largo plazo, el almacenamiento vírico se coloca a
-80ºC.
Para el cultivo de suspensión, se utiliza
células Sf9 crecidas de fase log con viabilidad >95% para
amplificación del matraz. La densidad celular y la viabilidad se
determinan. Las células Sf9 se diluyen con InsectXPRESS fresco en 1
x 10^{6} células por ml. El virus a ser amplificado se agrega al
cultivo Sf9, en un MOI de 0.02 (virus/célula), como sigue:
Vol. inóculo
almacenamiento de virus = \frac{(células \ total)/ml) x (Vol. \
Total \ cultivo) x (MOI)}{(t\text{í}tulo \ de \ virus \ en \
pfu/ml)}
Se incuban frascos de centrifugación durante
tres días a 27ºC +/- 2ºC, con agitación constante a
90-120 rpm. El cultivo celular se transfiere a
botellas de centrífuga estériles y se centrifuga a 2000 rpm durante
10 minutos a 4ºC. El sobrenadante se recolecta en un recipiente
estéril y se descarga el glóbulo celular. El sobrenadante se filtra
a través de un filtro de 0.45 \mum en un recipiente estéril. El
sobrenadante se filtra adicionalmente a través de un filtro estéril
de 0.2 \mum en un recipiente estéril. El almacenamiento del virus
finalizado se almacena para protección contra la luz a
2-8ºC. Se desarrolla una determinación de título
como se explica en el Ejemplo 4.
El título de virus (Unidades Formadoras de Placa
(PFU) por ml) se puede determinar con ensayo de placa, dilución de
punto final, u otros equipos de título víricos (por ejemplo, Equipo
de Título Rápido de Baculovirus BacPAK por Clontech
#K1599-1). Se desarrolla ensayo de placa en cultivo
de monocapa inmovilizado. Los ensayos de placa a ser desarrollados
se determinan como sigue:
Número de
ensayo de placa = Número de dilución vírica x 4 (cuadruplicados)+2
controles negativos y
negativos
Por ejemplo, 10^{5}, 10^{6}, 10^{7},
10^{8} para dilución vírica, cada dilución en placas de
cuadruplicado, debe ser un ensayo de placa de 16 pozos. Incluyen
dos controles positivos y dos controles negativos en el ensayo de
placa, para un total de 20 pozos.
Preparar un suspensión celular de 5 x 10^{5}
células por ml densidad en 10% FBS medio de suero. Placas de 6
pozos membranas en 2 ml por pozo con la suspensión celular anterior.
Las células se les permiten adherir durante dos horas antes de
experimentos. Las células son -80% confluentes.
Preparar diluciones vírica seriales de 10 veces
utilizando medio de 4.5 ml y 0.5 ml de almacenamiento vírico en
tubos de 15-ml estériles. El medio aspirado de cada
pozo. Ayuda la dilución vírica 1 ml por pozo y se incuban a 27ºC
durante 2 horas.
Se calienta 1.3x SF-900II
(Gibco-BRL #10967-032) a 27ºC. Se
funde 4% de agarosa (Gibco 18300-012) y se mantiene
en un baño de agua a 50ºC. Se agrega 1.3x media y 4% de agarosa en
una relación 3:1 para elaborar 1% de agarosa en medio de cultivo.
Se mantiene este agar en un baño de agua 40ºC (por ejemplo, en un
beaker que se puede llevar a una campana).
El trabajo rápido de la mezcla agarosa no se
solidifica, se aspira la solución vírica de las monocapas celulares.
Se agrega 2 ml de 1% agarosa a cada pozo. Se deja reposar las
placas en la campana con las cubiertas ligeramente abiertas durante
10 minutos. Se invierten las placas y se ponen en una caja sellada
con toallas de papel húmedas para proporcionar humedad. Se incuba a
27ºC durante 5-7 días, o hasta que las placas se han
formado bien.
En el día 7 de post-infección,
se agrega 0.5 ml de 0.033% rojo neutro (en agua), se incuba 3
minutos, y se descarga. Alternativamente, se agrega 0.5 ml 0.1% de
azul tripan (en agua), se sacude para cubrir, se reposa 3 minutos,
y se descarga. Se incuban las placas durante 2 horas. Con la ayuda
de una caja de iluminación y un magnificador, se cuentan las placas
en cada plato. El título de virus se calcula utilizando la siguiente
Fórmula:
Título de virus
(pfu/ml) = # de placas x dilución
vírica
Se utilizan células Sf9 altamente viables (por
ejemplo, viabilidad de 95-100% en condiciones libres
de suero). Se cultivan células Sf9 en fase log en una densidad
celular de entre 1.5 x 10^{6} y 2.5 x 10^{6} células por ml en
cultivo de suspensión. La producción del Factor C recombinante
también se puede llevar a cabo al infectar Células Sf9 que crecen
en el cultivo de monocapa. Se determinan la densidad celular y
viabilidad. Se diluyen células Sf9 con InsectXPRESS fresco en 1.5 x
10^{6} células por ml. Se agregan baculovirus recombinantes de
almacenamiento de alto título para el cultivo Sf9, en un MOI de 1
(virus/célula), como sigue:
Vol. de inóculo
de HTS (ml) = \frac{(células \ totales/ml)x(vol. \
total \ de \ cultivo)x(MOI)}{(T\text{í}tulo \ de \
virus \ en \
pfu/ml)}
Se cosecha el sobrenadante de cultivo setenta y
dos horas postinfección. Se transfiere el cultivo celular en
botellas de centrífuga estériles y se centrifuga a 2000 rpm durante
10 minutos a 4ºC. Se recolecta el sobrenadante en un recipiente
estéril y se descarga el glóbulo celular. Se filtra el sobrenadante
en un filtro de 0.45 \mum en un recipiente estéril. Se filtra
adicionalmente el sobrenadante en un filtro estéril, de 0.2 \mum
en un recipiente estéril. Este sobrenadante del cultivo, que
contiene el Factor C recombinante, se puede almacenar a 4ºC durante
hasta un año y se puede utilizar directamente para formar un
reactivo para la detección de endotoxina de acuerdo con la presente
invención.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Las células Sf9 crecen en 27ºC sin CO_{2}. Se
prefiere aireación máxima. Si se utilizan botellas de cultivo para
centrifugar, se aflojan las tapas rosca laterales para incrementar
la aireación. Las células Sf9 adaptadas para crecer en medio libre
de suero se debe subcultivar en intervalos de 4-5
días en una base de rutina.
El subcultivo a 5.0 x 10^{5} células/ml en
matraz de centrifugación o agitación de 250 ml que contiene 100 ml
de medio con tapas aflojadas para proporcionar aireación máxima. Se
agita el cultivo a 90-100 rpm. La viabilidad
celular debe estar por encima de 90%.
Se remueven cultivos de 4-5 días
de edad del incubador a 27ºC y se tapan con 70% de alcohol. Se toma
una alícuota de la suspensión celular para determinar la viabilidad
celular y el conteo total celular utilizando tinte azul tripan. Se
determina la dilución celular necesaria para obtener 5 x 10^{5}
células/ml. Se hace girar el matraz de cultivo almacenado varias
veces y se remueve el volumen apropiado de la suspensión celular
con base en el cálculo. Se inocula un nuevo matraz de centrifugación
de 250 ml que contiene suficiente medio fresco precalentado
necesario para elaborar el volumen de cultivo final de 100 ml. Se
colocan los cultivos en el incubador. Se establece la velocidad de
agitación a 90-100 rpm.
El crecimiento de células Sf9 en una monocapa o
en suspensión. Se cosechan las células en fase media log de
crecimiento (aproximadamente 2 días) en una viabilidad de >90%.
Se mantiene el medio acondicionado en hielo y filtro estéril.
Determinar la viabilidad celular utilizando el
método de exclusión de tinte de azul trifan. Se calcula el volumen
requerido del medio de criopreservación (7.5% DMSO en 50% de medio
ICCM libre de suero fresco y 50% de medio acondicionado; se filtra
estéril) para producir una densidad final de 1-2 x
10^{7} células/ml. Se mantiene la mezcla de criopreservación en
hielo. Mientras tanto, se centrifugan células de la suspensión
durante 3 minutos a 800 rpm/500 x g. Deseche la muestra si un lote
de células no se sedimenta y en el sobrenadante.
Se resuspende el sedimento celular en el volumen
determinado de mezcla de criopreservación congelada para obtener
1-2 x 10^{7} células/ml. Se dispensa rápidamente
1-1.5 ml alícuotas de la suspensión celular en
criorecipientes. Se congelan células a -70 a -90ºC durante 4 horas
en la fase gaseosa superior de nitrógeno líquido. Los frascos se
sumergen en nitrógeno líquido.
Se descongela el recipiente mediante agitación
rápida en baño de agua de 37ºC justo antes de fusión. Se remueve el
frasco del baño de agua y se tapa con 70% de isopropanol estéril. El
frasco se abre, se remueven los contenidos del frasco en un tubo de
centrifuga estéril de tamaño apropiado; y se diluye la suspensión
celular con 5 volúmenes de medio InsectXPRESS (o equivalente) que
se ha equilibrado de 27ºC +/- 2ºC en un incubador. Se centrifuga la
suspensión diluida a 125 x G durante 10 minutos. Se descarga el
fluido y se resuspenden las células en un volumen de medio de
cultivo igual al fluido descargado. Se determina el conteo celular y
la viabilidad. Se ajusta la densidad celular viable entre 2 x
10^{5} células por ml y 3 x 10^{5} células por ml utilizando
medio libre de suero. Se transfiere el matraz en un incubador de
27ºC +/- 2ºC en un agitador de plataforma rotatorio se establece
para agitación continua y 100-125 revoluciones por
minuto. Cuando el conteo celular viable del cultivo dobla por lo
menos cada 26 horas, el cultivo se puede expandir como se describe
en el Ejemplo 6.
Seis de diez matraces T de monocapa confluentes
de 75 cm^{2} de Células Sf9 se requieren para iniciar un cultivo
de suspensión de 100 ml. Se desalojan células del fondo de los
matraces al sostener un matraz en una mano y golpearlo con la palma
de la otra mano. Se agrupa la suspensión celular y se desarrolla un
conteo de viabilidad.
Se diluye la suspensión celular en
aproximadamente 5 x 10^{5} células viables/ml a temperatura
ambiente utilizando medio de crecimiento libre de suero o
complementado con suero que contiene un matraz de centrifugación de
250 ml. La parte superior la cuchilla agitadora se puede agitar
ligeramente por encima de la suspensión celular. Esto proporciona
aireación adicional. Las tapas laterales del soporte se pueden
aflojar al girarlas un cuarto de vuelta.
Se incuban las células a 27ºC en una velocidad
de agitación constante de 100 rpm. Se subcultiva cuando el conteo
celular viable alcanza 1-2 x 10^{6} células/ml
(3-7 días postsiembra), se incrementa la velocidad
de agitación en 5 rpm por pasaje hasta que la viabilidad del cultivo
es >80%. La repetición hasta una velocidad de agitación de 100
rpm se alcanza por el matraz de centrifugación o
130-140 rpm se alcanza por los cultivos del matraz
de centrifugación. En este punto, se reduce la densidad de siembra a
3 x 10^{5} células/ml durante subcultivo.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Si grandes grupos de células persisten (por
ejemplo, >10 células por grupo), que dejan el matraz de
centrifugación/agitación reposar 2-3 minutos sin
agitación antes de subcultivo. Esto permite que grandes grupos se
resuelvan en el fondo. Se agrupa un tercio de la parte superior de
la suspensión celular para conteo y siembra en nuevos cultivos.
Este procedimiento selecciona una población celular que crece como
células únicas. Es necesario repetir esta etapa 2-3
veces hasta que se reduce el agrupamiento.
Los siguientes reactivos se compran de los
fabricantes indicados: Zwittergent 3-14 (Calbiochem,
Cat# 693017), Tween 20 (ICN, Cat# 194841), Tween 80 (ICN, Cat#
194842), Triton X-114 (ICN, Cat# 193971),
n-Octilbeta-D-tioglicopiranosida
(OTG, Amresco, Cat# J575), y Triton X-100 (ICN,
Cat# 194854). El ensayo de Factor C recombinante (rFC) se lleva a
cabo utilizando 20 \mul de cada detergente (-10 X de concentración
final), 150 \mul de 1 EU/ml EC-6, 10 \mul del
sobrenadante rFC 031901I, 20 \mul de 300 mM Tris, pH 8.0, y 20
\mul de 0.55 mM sustrato DPR-coumarina. Los
resultados del ensayo se leen a 38ºC utilizando un lector Cytofluor
establecido a 390/440 nm, 5 minutos por ciclo, durante 1 hora. Los
datos se grafican después de 30 minutos.
Como se muestra en la Figs. 1-3
y 9-11, las bajas concentraciones de Zwittergent
3-14, Tween 20, Tween 80, Triton
X-114, OTG, Genapol C-100 y Triton
X-100 mejoran el ensayo rFC 2-7
veces. El rango de concentración mejorado para Zwittergent
3-14, Triton X-114, OTG y Triton
X-100 es estrecho, mientras que el rango de
concentración mejorado para Tween 20, Tween 80 y Genapol
C-100 es amplio.
La Tabla 1 resumen los resultados obtenidos al
probar nueve detergentes. Estos detergentes se pueden dividir en
tres grupos: detergentes que tienen un rango de concentración
estrecho para mejorar la actividad del Factor C recombinante,
detergentes que tienen amplio rango de concentración para mejorar la
actividad del Factor C recombinante, y detergentes que inhiben la
actividad del Factor C recombinante.
Efecto de mejorar/inhibir de Zwittergent
3-14 también se prueba utilizando el factor C
Limulus purificado (Fig. 6). Se observa un efecto similar de
mejorar/inhibir, aunque la relación de la actividad del Factor C
relativa, las concentraciones de detergente mejoradas e inhibidas
son diferentes de aquellas en el ensayo de Factor C
recombinante.
Aislamos el factor C de Limulus y se genera
antisuero contra la proteína. El lisato Limulus primero se separa
con una filtración de gel S-100 seguido por columna
de intercambió de ión-catión. Las fracciones se
ensayan para la actividad del factor C utilizando el sustrato
N-t-BOC-Val-Pro-Arg
7-Amido-4-metilcoumarina.
El factor C Limulus se purifica 73 veces con 80% homogeneidad como
se determina por el ensayo de enzima y SDS-PAGE. El
peso molecular del Factor C Limulus es 117 kDa mediante
SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras. El
SDS-PAGE reducido muestra dos bandas principales de
79 kDa y 40 kDa, que corresponden a la cadena pesada y liviana. El
secuenciamiento de péptido Triptico revela que la secuencia de
factor C Limulus cercanamente igual a las especies Asiáticas, con
> 90% de identidad de secuencia. Un anticuerpo policlonal
específico contra el Factor C Limulus se genera en conejos. El
anti-factor C purificado IgG inhibe la activación de
factor C por LPS pero no tiene efecto en la actividad proteasa una
vez el factor C se activa por LPS. El antisuero de factor C
demuestra la importancia de esta proteína en el reconocimiento
inicial de LPS por el lisato Limulus.
En una etapa, se desarrolla un ensayo de punto
final de 1 hora. La endotoxina 055:B5, 0.01, 0.1, 1, y 10 EU/ml se
utilizan para la curva estándar. El blanco y las endotoxinas
estándar (100 \mul cada uno) se agregan a cada placa de 96 pozos.
El sobrenadante de Factor C recombinante, el amortiguador de ensayo
(150 mM NaCl, 150 mM Tris, pH 8.0, y 1.5% lactosa, con o sin
0.0125% Dipolaridad) y solución de sustrato (0.2 mM en agua) se
mezclan en relaciones de 1:4:5. Esta mezcla se agrega a cada blanco
y endotoxina estándar. La fluorescencia se registra en el tiempo
cero y 1 hora de tiempo. La diferencia en las fluorescencias
(fluorescencia delta) se normaliza con el blanco. La fluorescencia
delta normalizada luego se injerta contra la concentración de
endotoxina en una escala log-log. Cada punto de
datos es el resultado de ensayos de duplicado.
Los resultados se muestran en la Fig. 7. La
detección de la sensibilidad de endotoxina se incrementa 10 veces
cuando se incluye el tensoactivo.
Un ensayo de endotoxina una etapa se puede
llevar a cabo en una placa de 96 pozos, utilizando 100 \mul de
cada uno de blanco y endotoxina estándar. Cien microlitros de una
mezcla de sobrenadante de Factor C recombinante (medio de cultivo
de virus Sf9 infectada por Baculovirus), amortiguador (150 mM Tri,
pH 8.0, 150 mM NaCl, 1.5% beta-lactosa, y 0.0125%
Zwittergent 3-14) y sustrato fluorogénico
(DPR-coumarina, 0.2 mM) en una relación de 1:4:5 se
agrega a los pozos de la placa. La placa se incuba a 37ºC durante 1
hora. Se leen la excitación y emisión a 390 y 440 nm,
respectivamente, en un lector de microplaca de fluorescencia.
Los resultados de un ensayo de endotoxina del
Factor C de una etapa se muestran en la Fig. 8.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Chen, Lin
\hskip1cmPepe, Michael
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos y Reactivos para detectar
Endotoxina
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 02877.00008
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/310,125
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-06-28
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Versión Windows 4.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1906
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tachypleudus tridentata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tachypleudus tridentata
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3467
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tachypleudus tridentata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1019
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tachypleudus tridentata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Carcinoscorpius
rotundicauda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1083
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Carcinoscorpius
rotundicauda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3438
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Carcinoscorpius
rotundicauda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1019
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Carcinoscorpius
rotundicauda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Un reactivo para incrementar la sensibilidad
de la detección de endotoxina enzimática, que comprende:
- una proteína del factor C de límulo purificada; y
- un tensoactivo,
en donde la proteína del factor C de límulo
purificada es enzimáticamente activa en la presencia del tensoactivo
y en donde el tensoactivo está presente en una cantidad que
incrementa la sensibilidad de una reacción de detección de
endotoxina enzimática relacionada con un reactivo que contiene la
proteína del factor C de límulo purificada pero que no comprende el
tensoactivo.
2. El reactivo de la reivindicación 1 en donde
el tensoactivo se selecciona del grupo que consiste de:
(I) tensoactivos amfotéricos representados por
las siguientes Fórmulas
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R_{1} es un radical
alquileno que tiene de 1 a 4 átomos de
carbono;
Y y Y' son cada uno hidrógeno o un alquilo
inferior sustituido o no sustituido;
R_{2} y R_{3} son cada uno un alquilo
inferior sustituido o no sustituido;
n es 0 o 1, en donde cuando n es 0, R_{4} es
alquilo que contiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 18
átomos de carbono, y cuando n es 1,
R_{4} es un radical alquileno que tiene de 1 a
aproximadamente 6 átomos de carbono;
R_{5} es un alquilo sustituido o no
sustituido; y
M es hidrógeno o un metal formador de sal;
(II) tensoactivos aniónicos representados por
las siguientes Fórmulas:
(E)(R_{6})_{n1}-(Y)Ar(SO_{3}M)_{n2}
en donde R_{6} es un radical de
hidrocarburo de cadena recta o ramificada que tiene de
aproximadamente 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, en donde
por lo menos uno de R_{6} tiene por lo menos 8 átomos de
carbono;
n 1 es de 1 a 3;
n2 es de 1 a 2;
Ar es un radical fenilo o naftilo; y
Y y M tienen el mismo significado como en la
Fórmula (B);
(F)R_{5}OSO_{3}M
en
donde
R_{5}, y M tienen el mismo significado como en
la Fórmula (B);
(III) tensoactivos catiónicos representados por
la siguiente Fórmula:
en
donde
A es oxígeno, azufre, un grupo carbonamida, un
grupo tiocarbonamida, un grupo carboxílico, o un grupo éster
tiocarboxílico;
z es un entero de 3 a 8; y
R_{5}, y M tienen el mismo significado como en
la Fórmula (B);
(IV) tensoactivos no iónicos representados por
la siguiente Fórmula:
(H)R_{5}R_{7}R_{8}N\rightarrowO
en
donde
R_{5} tiene el mismo significado como en la
Fórmula (A);
R_{7} y R_{8} son cada uno metilo o
etilo;
\newpage
(IV) tensoactivos catiónicos representados por
las siguientes Fórmulas:
en
donde
R_{5}, Y, y Y' tienen el mismo significado
como en la Fórmula C;
(J)R_{9}NHC_{2}H_{4}NH_{2}
en donde R es un grupo alquilo de
aproximadamente 12 a 22 átomos de
carbono;
(J)RsCONHC_{2}H_{4}NH_{3}x
en donde R_{5} tiene el mismo
significado como en la Fórmula
(A);
en donde R_{5} tiene el mismo
significado como en la Fórmula A y cada a es un entero de 1 a 15;
y
(V) aquellos tensoactivos no iónicos
seleccionados del grupo que consiste del producto de condensación de
aproximadamente 10 a 30 moles de óxido de etileno con el monoéster
de un alcohol hexahídrico que contiene 6 átomos de carbono con el
grupo éster que contiene 10 a 20 átomos de carbono.
3. El reactivo de la reivindicación 1 en donde
el límulo es Limulus poliphemus.
4. El reactivo de la reivindicación 1 en donde
el límulo es Carcinoscorpius rotundicauda.
5. El reactivo de la reivindicación 1 en donde
el límulo es Tachypleus tridentatus.
6. El reactivo de la reivindicación 1 en donde
el límulo es Tachypleus gigas.
7. El reactivo de la reivindicación 1 en donde
la proteína de Factor C se hace por el método de cultivar una
célula anfitriona que comprende un vector que codifica la proteína
de Factor C en un sobrenadante bajo condiciones de tal forma que la
proteína de Factor C se expresa en el sobrenadante.
8. El reactivo de la reivindicación 7 en donde
la célula anfitriona es una célula sf9.
9. El reactivo de la reivindicación 7 en donde
el límulo es Carcinoscorpius rotundicauda.
10. El reactivo de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 en donde el tensoactivo se selecciona del
grupo que consiste de ZWITTERGENT 3-14, Triton
X-100, Triton X-114,
octil-beta-D-tioglucosida,
Genapol C-100, Tween 20, y Tween 80.
11. El reactivo de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 en donde el tensoactivo es ZWITTERGENT
3-14.
\newpage
12. El reactivo de la reivindicación 1, en donde
la proteína del factor C de límulo purificada se purifica de
proteína del factor C Carcinoscorpius rotundicauda
recombinante, y el tensoactivo es ZWITTERGENT
3-14.
13. El reactivo de la reivindicación 11 o
reivindicación 12 que comprende adicionalmente un sustrato del
Factor C.
14. El reactivo de la reivindicación 13 en donde
el sustrato del Factor C es
N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-Amido-4-metilcoumarina.
15. Un método para detectar endotoxina en una
muestra de prueba, que comprende las etapas de:
poner en contacto una muestra de prueba con (1)
el reactivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y (2)
un sustrato del Factor C para formar una muestra de mezcla del
reactivo de sustrato de prueba, en donde la división del sustrato
del Factor C genera una señal detectable; y
ensayar la mezcla de reactivo de sustrato de
muestra de prueba para la presencia o ausencia de la señal
detectable, en donde una cantidad de la señal detectable que se
incrementa relacionada con una muestra de control que no contiene
endotoxina indica una presencia de endotoxina en la muestra de
prueba.
16. El método de la reivindicación 15 en donde
el sustrato del Factor C se selecciona del grupo que consiste de
N-t-BOC-Asp
(Obzl)-Pro-Arg-7-Amido-4-metilcoumarina
y
N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-Amido-4-metilcoumarina.
17. Un equipo para detectar endotoxina, que
comprende:
el reactivo de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12; y
instrucciones para el método de la
reivindicación 15.
18. El equipo de la reivindicación 17 que
comprende adicionalmente un sustrato del Factor C, en donde la
división del sustrato del Factor C genera una señal detectable.
19. El equipo de la reivindicación 18 en donde
el sustrato del Factor C se selecciona del grupo que consiste de
N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-
Arg-7-Amido-4-metilcoumarina
y
N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-Amido-4-metilcoumarina.
20. El reactivo de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12 en donde la proteína del factor C de límulo
purificada está presente en una concentración de
0.03-3 \mug/ml.
21. El reactivo de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12 en donde la concentración del tensoactivo
es 0.001-0.003%.
22. El reactivo de la reivindicación 12 en donde
la concentración del ZWITTERGENT 3-14 es
0.0025%.
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Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1318848C (zh) * | 2003-11-26 | 2007-05-30 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种用于细菌内毒素鲎试验检测法的缓冲液及其制备方法 |
| WO2005112972A1 (en) * | 2004-05-07 | 2005-12-01 | Peptimmune, Inc. | Methods of treating disease with random copolymers |
| WO2006052835A2 (en) * | 2004-11-05 | 2006-05-18 | Dow Agrosciences Llc | Cryopreservation of cells |
| US20060223074A1 (en) * | 2005-04-05 | 2006-10-05 | Bunch Thomas A | Spotting compositions and methods of use thereof |
| US8038885B2 (en) * | 2005-10-14 | 2011-10-18 | The Regents Of The University Of California | Formation and encapsulation of molecular bilayer and monolayer membranes |
| US9233846B2 (en) * | 2005-10-14 | 2016-01-12 | The Regents Of The University Of California | Formation and encapsulation of molecular bilayer and monolayer membranes |
| EP3190185A1 (en) * | 2006-07-07 | 2017-07-12 | Seikagaku Corporation | Pro-clotting enzyme, and method for detection of endotoxin or (1-3)-beta-d-glucan using the same |
| EP2078052B1 (en) | 2006-10-31 | 2010-07-28 | Surmodics Pharmaceuticals, Inc. | Spheronized polymer particles |
| US9090737B2 (en) * | 2007-11-13 | 2015-07-28 | Surmodics, Inc. | Viscous terpolymers as drug delivery platform |
| US8772041B2 (en) * | 2008-05-22 | 2014-07-08 | The Regents Of The University Of California | Membrane precursors and membranes formed therefrom |
| US7846678B2 (en) * | 2008-08-18 | 2010-12-07 | BioDtech, Inc. | Enhancing endotoxin detection |
| EP2348976B1 (en) | 2008-10-29 | 2020-12-02 | T2 Biosystems, Inc. | Nmr detection of coagulation time |
| US8974808B2 (en) | 2008-12-23 | 2015-03-10 | Surmodics, Inc. | Elastic implantable composites and implants comprising same |
| US9415197B2 (en) * | 2008-12-23 | 2016-08-16 | Surmodics, Inc. | Implantable suction cup composites and implants comprising same |
| US9480643B2 (en) | 2008-12-23 | 2016-11-01 | Surmodics Pharmaceuticals, Inc. | Implantable composites and implants comprising same |
| US20100168807A1 (en) * | 2008-12-23 | 2010-07-01 | Burton Kevin W | Bioactive terpolymer compositions and methods of making and using same |
| US8951546B2 (en) * | 2008-12-23 | 2015-02-10 | Surmodics Pharmaceuticals, Inc. | Flexible implantable composites and implants comprising same |
| AU2010265985B2 (en) | 2009-06-26 | 2016-04-21 | Charles River Laboratories, Inc. | Heat-treated Limulus amebocyte lysates |
| US9068280B2 (en) | 2010-01-05 | 2015-06-30 | The Regents Of The University Of California | Droplet bilayer formation using throughput liquid handling techniques |
| WO2011146463A2 (en) * | 2010-05-17 | 2011-11-24 | BioDtech, Inc. | Enhancing endotoxin detection |
| US9598532B2 (en) | 2010-08-30 | 2017-03-21 | Surmodics, Inc. | Terpolymers as pressure-sensitive adhesives |
| ES2650170T3 (es) | 2011-02-28 | 2018-01-17 | Seikagaku Corporation | Agente para la medición de endotoxinas |
| WO2012118800A2 (en) * | 2011-02-28 | 2012-09-07 | BioDtech, Inc. | Enhancing endotoxin detection |
| EP2732046B1 (en) | 2011-07-13 | 2017-09-06 | T2 Biosystems, Inc. | Nmr methods for monitoring blood clot formation |
| EP2748651B1 (en) | 2011-09-21 | 2017-08-30 | T2 Biosystems, Inc. | Nmr methods for endotoxin analysis |
| EP2578207A3 (en) | 2011-10-05 | 2015-10-07 | Jacob J. Schmidt | Masking apertures enabling automation and solution exchange in sessile droplet lipid bilayers |
| CU24073B1 (es) | 2011-12-27 | 2015-01-29 | Ct De Investigación Y Desarrollo De Medicamentos Cidem | COMPOSICIÓN A PARTIR DE EXTRACTO DE HEMOCITOS DE LANGOSTA PARA LA DETECCIÓN DE LIPOPOLISACÁRIDOS, PEPTIDOGLICANOS Y 1,3-ß-D-GLUCANOS |
| CN103290054A (zh) * | 2012-02-27 | 2013-09-11 | 上海拜生生物科技有限公司 | 应用昆虫细胞表达重组的中国鲎c因子 |
| CN103290042A (zh) * | 2012-02-27 | 2013-09-11 | 上海拜生生物科技有限公司 | 内毒素检测及去除关键分子中国鲎c因子克隆和序列分析 |
| CN103290041A (zh) * | 2012-02-27 | 2013-09-11 | 上海拜生生物科技有限公司 | 中国鲎c因子原核及昆虫杆状病毒重组表达载体的构建 |
| EP2740791A1 (en) * | 2012-12-05 | 2014-06-11 | MicroCoat Biotechnologie GmbH | Method for recombinant production of horseshoe crab Factor C protein in protozoa |
| US9739733B2 (en) | 2012-12-07 | 2017-08-22 | T2 Biosystems, Inc. | Methods for monitoring tight clot formation |
| EP3663400A1 (en) * | 2012-12-10 | 2020-06-10 | Seikagaku Corporation | Method for producing novel recombinant factor c, method for mitigating reaction inhibition in endotoxin assays, and method for measuring endotoxin |
| CN104356211B (zh) * | 2014-09-22 | 2017-08-29 | 山东信得科技股份有限公司 | 一种应用Triton X‑114和尿囊素去除重组蛋白质溶液中内毒素的方法 |
| CN111077307B (zh) * | 2018-10-21 | 2022-08-23 | 厦门鲎试剂生物科技股份有限公司 | 一种用革兰氏阴性细菌感染快速检测脓毒病的新方法 |
| JP7349104B2 (ja) * | 2019-11-13 | 2023-09-22 | 株式会社島津製作所 | ベロ毒素の検出方法 |
| JPWO2021210669A1 (es) | 2020-04-16 | 2021-10-21 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4322217A (en) * | 1980-06-27 | 1982-03-30 | Mallinckrodt, Inc. | Process for preparing Limulus lysate |
| BE889407A (fr) * | 1980-06-27 | 1981-10-16 | Mallinckrodt Inc | Amelioration du procede de preparation d'un lysat de limule |
| JPH03187378A (ja) * | 1989-12-16 | 1991-08-15 | Taiyo Fishery Co Ltd | 酵素前駆体ファクターｃの調整方法及びその調整試薬 |
| JP3524120B2 (ja) * | 1992-05-08 | 2004-05-10 | 生化学工業株式会社 | 前処理剤、前処理方法、前処理された試料による測定法、測定用キット及び試料の判定方法 |
| JP3402476B2 (ja) | 1992-08-24 | 2003-05-06 | 生化学工業株式会社 | リポ多糖結合性タンパク質及びその製造法 |
| JP3429036B2 (ja) * | 1993-09-30 | 2003-07-22 | 生化学工業株式会社 | エンドトキシンの特異的測定剤 |
| US5716834A (en) * | 1994-08-19 | 1998-02-10 | National University Of Singapore | Cloned factor C cDNA of the Singapore horseshoe crab, Carcinoscorpius rotundicauda and purification of factor C proenzyme |
| JP3869094B2 (ja) * | 1996-10-21 | 2007-01-17 | 生化学工業株式会社 | エンドトキシンの測定方法 |
| DE69734046T2 (de) | 1996-10-21 | 2006-06-14 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Verfahren zur Bestimmung von Endotoxin |
| WO1999015676A1 (en) * | 1997-09-19 | 1999-04-01 | National University Of Singapore | A novel generation of cloned horseshoe crab recombinant factor c for detection and removal of endotoxin |
| JP3957386B2 (ja) * | 1998-01-08 | 2007-08-15 | 生化学工業株式会社 | 昆虫体液反応性物質の特異的測定剤及び測定方法 |
| AU7980300A (en) * | 1999-10-15 | 2001-04-23 | National University Of Singapore, The | Recombinant proteins and peptides for endotoxin biosensors, endotoxin removal, and anti-microbial and anti-endotoxin therapeutics |
-
2002
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