CN103290054A - 应用昆虫细胞表达重组的中国鲎c因子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程领域，具体是一种用于内毒素检测和去除的中国鲎C因子(Factor C from Tachypleus tridentatus)基因在昆虫细胞中重组表达的方法。包括含中国鲎C因子基因的重组杆状病毒的制备及转染昆虫细胞，重组中国鲎C因子在昆虫细胞中的表达检测等。通过本方法制备的重组中国鲎C因子为研究其内毒素结合活性提供了前提，更为其作为检测内毒素和去除内毒素的应用奠定了基础。

Description

应用昆虫细胞表达重组的中国鲎C因子

技术领域：

本发明涉及生物工程领域，具体的说是制备含中国鲎C因子基因的重组杆状病毒，并用于转染昆虫细胞，表达重组的中国鲎C因子。

背景技术：

临床输液反应以热原反应危害最大，发生率最高。内毒素(即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖分子，lipopolysaccharide，LPS)是研究最透彻也是最常见的生物热原，同时更是各大药厂必须面对的难题，因为注射时即使是pg级别的痕量LPS，也会导致病人严重的热原反应。因此，灵敏可靠的内毒素诊断技术是非常必须的。

海鲎的阿米巴样细胞(amoebocytes)对LPS具有超强敏感性，在革兰氏阴性细菌入侵时，它能通过一系列的酶促反应，对外来入侵的细菌产生级联凝集反应，使入侵的微生物失效(1，2)。这一过程包括酶原状态的C因子(Factor C)识别并结合内毒素而被激活，变成活性酶的状态后，将下游的B因子激活，活化的B因子将凝固酶原转化为凝固酶，凝固酶将凝固蛋白原转化为凝固蛋白，凝固蛋白相互交联脱水而形成凝胶(3，4)。

利用海鲎血液阿米巴样细胞溶解物制成的鲎试剂，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素。自上世纪70年代中期，这一内毒素测试方法开始用于医药领域，并且很快被世界各国广泛采用，中国药典和欧美药典将其定为法定的细菌内毒素检查法。经过几十年的发展和改良，鲎试剂内毒素检测法已应用于制药、医疗器械、非内服制剂、医药制品、生物制剂、水质、食品检测以及科研等各大领域(5)。

目前世界上仅有四种海鲎，即美国鲎(Limulus polyphemus)，中国鲎(Tachypleustridentatus)，马来鲎(Tachypleus gigas)和圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)。而能够用于鲎试剂生产的仅有美国鲎和中国鲎两种，对应的鲎试剂分别称之为LAL(Limulusamoebocyte lysate)和TAL(Tachypleus Amebocyte Lysate)，二者反应原理及功效相同，但也存在理化特性的差别，如与内毒素反应的最适pH值等(6)。

虽然鲎试剂检测法(LAL/TAL)具有高灵敏度(可检测飞克级内毒素)、快速等优点，但是由于采用成分复杂的细胞裂解物作为反应原料，同样具有无法克服的缺陷。比如，非特异性干扰问题：鲎试剂除了能与内毒素反应外，还会与(1-3)-β-D-葡聚糖反应(1)。(1-3)-β-D-葡聚糖是在真菌、酵母、蘑菇、高等植物中广泛存在的一种多糖，是构成细胞壁的结构大分子。因此鲎试剂检测过程中很容易遇到(1-3)-β-D-葡聚糖的非特异性干扰，造成假阳性结果，这对于成分复杂的药物，尤其是中药，是一个很大的检测挑战(7)。再比如，批次稳定性问题：鲎试剂采用海鲎血液作为生产原料，由于季节、地域等差异，使得鲎试剂的批次差异成为常见现象。而且，由于环境污染、过度捕捞等原因海鲎的种群数量近年来急剧减少，接近灭绝(8)，使得生产鲎试剂的原材料面临日益匮乏的危险。

鲎试剂的主要成分是一系列的丝氨酸蛋白酶原(9，10)，其中C因子在内毒素检测方法中是关键分子，在内毒素介导的鲎血凝集反应系统中，它特异性识别内毒素，并第一个被内毒素激活，从而启动整个鲎血细胞中的凝集级联反应(11，12)。因此，以鲎试剂的关键分子C因子作为基础，利用其识别并结合内毒素后，由蛋白酶原被激活为活性酶形式，从而能够水解发光底物的特点，结合化学/荧光发光定量技术，可以发展出以C因子作为单一成分的内毒素检测定量技术(13)，与传统的LAL测定技术比较，重组C因子在相同的分析条件下对内毒素具有更低的背景、更高的灵敏度(14)。

基于C因子的内毒素检测技术成分单一，可以使用生物工程技术进行生产和严格的质量控制，从而避免了由原材料引起的批次不稳定性，同时保护了海鲎这一古老的“活化石”物种。尤为重要的是，这一新技术消除了传统鲎试剂对(1-3)-β-D-葡聚糖的非特异性反应，可以大大增强内毒素检测的特异性，降低“假阳性”结果的发生概率。此外，通过与内毒素的特异结合，重组C因子还可以进一步应用于医药产品、生物制品等内毒素去除。

综上，利用生物工程的方法异源表达鲎C因子，以应用于内毒素检测试剂的产品开发，具有重要的临床意义和巨大的商业价值。

参考文献：

1.Iwanaga，S.(1993)Curr Opin Immunol 5，74-82

2.Muta，T.，and Iwanaga，S.(1996)Curr Opin Immunol 8，41-47

3.Ding，J.L.，and Ho，B.(2001)Trends Biotechnol 19，277-281

4.Iwanaga，S.，and Lee，B.L.(2005)J Biochem Mol Biol 38，128-150

5.Novitsky，T.J.(1994)J.Endotoxin Res 1，253-263

6.高国政，颜锦.(1998)中国药学杂志33(3)，162

7.霍启录，邵红霞.(2003)中国中药杂志28(03)，199-201

8.Widener，J.W.，and Barlow，R.B.(1999)Biol Bull 197，300-302

9.Muta，T.，and Iwanaga，S.(1996)Curr Opin Immunol 8，41-47

10.Iwanaga，S.(1993)Curr Opin Immunol 5，74-82

11.Nakamura，T.，Morita，T.，and Iwanaga，S.(1986)Eur J Biochem 154，511-521

12.Iwanaga，S.，Miyata，T.，Tokunaga，F.，and Muta，T.(1992)Thromb Res 68，1-32

13.Ding，J.L.，and Ho，B.(2010)Subcell Biochem 53，187-208

14.Ding，J.L.，and Ho，B.(2001)Trends Biotechnol 19，277-281

发明内容：

本发明目的在于提供一种用昆虫细胞重组表达中国鲎C因子的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

1)含中国鲎C因子基因的重组杆状病毒供体质粒pFASTBacHTA-FC转化含杆状病毒基因组的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac；

2)筛选和鉴定含有C因子的重组杆粒(FC-Bacmid)；

3)抽提重组了C因子的重组杆粒DNA；

4)重组了C因子的重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞；

5)检测C因子在昆虫细胞中的表达，确定最佳表达时间和感染复数(MOI)。

本发明具有以下优点：

1.本发明首次将中国鲎C因子基因整合到杆状病毒基因组中，制备含中国鲎C因子的重组杆粒。

2.本发明首次在昆虫细胞中表达中国鲎C因子，为得到大量有活性的重组C因子奠定了基础。

附图说明：

下面结合附图和实施例对本专利进行进一步说明。

图1是重组了中国鲎C因子的杆粒的抽提和菌落PCR鉴定的结果。-为以蓝色菌落为模板，以M13 Primer F和M13 Primer R作为引物，此为负对照；1为以白色菌落作为模板，以M13Primer F和FC Primer R作为引物；2为以白色菌落作为模板，以M13 Primer R和FC PrimerF作为引物；3-6，以白色菌落作为模板，以M13 Primer F和M13 Primer R作为引物；最后两道为提纯的重组杆粒样品。m为核酸分子量标签，自上到下分别为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp。

图2是重组了中国鲎C因子的杆粒PCR鉴定的结果。+为以pFASTBACHTA-FC质粒为模板，此为阳性对照；1-4为以提纯的重组杆粒(FC-Bacmid)为模板，以FC Primer F和FC PrimerR作为引物PCR得到的条带；m为核酸分子量标签，自上到下分别为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp和500bp。

图3是重组了中国鲎C因子的杆粒DNA转染Sf9细胞后检测细胞内重组C因子的表达。泳道1为未转染杆粒DNA的Sf9细胞，此为阴性对照；2为转染了阳性对照杆粒DNA的细胞(重组蛋白分子量～90kDa)；3为转染了5μg重组杆粒DNA(FC-Bacmid)的细胞；4为转染了10μg重组杆粒DNA(FC-Bacmid)的细胞。转染细胞72小时后，通过Western Blot的方法用anti-His抗体检测重组中国鲎C因子的表达。

具体实施方式：

实施实例1含有中国鲎C因子的重组质粒pFASTBacHTA-FC转化DH10Bac感受态细胞：

取2μl浓度为0.1μg/μl的pFASTBacHTA-FC质粒转化100μl大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，冰上放30min，42℃热激90s，迅速放冰上5min，加入1ml LB，37℃复苏3.5hr后涂三抗性LB平板。37℃培养40hr后观测菌落的颜色。

其中三抗性LB平板含有50μg/ml Kanamycin，7μg/ml Gentamicin和10μg/mlTetracycline，100μg/ml Bluo-gal和40μg/ml IPTG，平板放4℃避光保存。

实施实例2含有中国鲎C因子的重组杆粒(FC-Bacmid)的筛选和鉴定：

挑如实例1中所述的白色单菌落，重新划LB平板培养，连续划两至三次，直到不产生蓝色菌落为止。挑连续划几次后仍然是白色的菌落到含有三抗性的LB试管中37℃培养4小时后，以菌液为模板用PCR法鉴定阳性克隆。

PCR体系：F：100pmol，R：100pmol，dNTPs：各50pmol，5×Prime star DNA聚合酶buffer：10μl，Prime star DNA聚合酶：5U，无菌水补足50μl。

PCR反应条件：将上述PCR反应体系混匀，第一阶段95℃预变性3min；第二阶段95℃，1min；54℃，1min；72℃，3min20s；共进行30个循环；第三阶段72℃延伸10min。

引物为：

FC Primer F：5’-ATG GTC TTA GCG TCG TTT TT-3’

FC Primer R：5’-AAT GAA CTG CCT AAT CCA TG-3’

M13 Primer F：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

M13 Primer R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’

实施实例3含有中国鲎C因子基因的重组杆粒DNA(FC-Bacmid)的抽提：

挑经过PCR鉴定为阳性的单菌落至含有50μg/ml Kanamycin，7μg/ml Gentamicin和10μg/ml Tetracycline的5ml LB培养基试管中，37℃振荡培养24小时；取1.5ml菌液，12000rpm，室温离心2min，去上清；用300μl溶液I(15mM Tris-HCl，pH 8.0，10mMEDTA，100μg/ml RNase A)轻轻重悬菌体，再加入300μl溶液II(0.2N NaOH，1％ SDS)，轻柔旋转混匀，室温放置5min；慢慢加入300μl浓度为3M的乙酸钾(pH 5.5)，边加边轻轻混匀，然后置冰上5-10min；12000rpm离心10min，将800μl上清小心转移至已加入800μl异丙醇的EP管中，轻轻混匀，然后置冰上5-10min；12000rpm，室温离心15min；弃去上清，加入500μl 70％的乙醇，翻转几次以清洗沉淀，12000rpm，室温离心15min；重复一次；仔细弃去上清，让沉淀在空气中干燥5-10min，然后用40μl TE缓冲液溶解沉淀。此为重组了C因子的杆粒DNA，冻于-20℃备用。

实施实例4含有中国鲎C因子基因的重组杆粒DNA(FC-Bacmid)转染Sf9昆虫细胞的方法：

Sf9细胞预分至六孔板中(9×10⁵细胞/孔)，27℃预培养2hr；分别取5μl或者10μl(1μg/μl)FC-bacmid与100μl不含血清和添加剂的Grace’s培养基混匀；取6μl转染试剂Cellfectin与100μl不含血清和添加剂的Grace’s培养基混匀；将上述稀释好的质粒及转染试剂混匀，室温孵育20min；同时以2ml无添加成分的Grace’s培养基洗六孔板细胞并弃去洗液。取0.8ml无添加成分的Grace’s培养基加入洗涤后的六孔板细胞中，再加入质粒和转染试剂的混合物，轻轻摇匀。同时设一个阳性对照和阴性对照。转染5小时候后换含血清及抗生素的培养基，27℃培养72小时，低速离心收集培养上清，即获得了重组中国鲎C因子的P1病毒样品。

将所得的P1病毒液依次稀释2-3个梯度加到弃去培养基的Sf9单层细胞上，作用1hr，吸去上清，将含血清的完全培养基和2.2％低熔点琼脂糖按1∶1比例混合，加X-gal至众浓度为150μg/ml，立即快速加到细胞上，等胶凝固后，倒置6孔板，置于27℃培养箱中培养，直到噬斑出现。计算噬斑数，通过公式滴度(pfu/ml)＝(1/稀释度)×噬斑数，以此确定病毒滴度。

实施实例5确定中国鲎C因子的在昆虫细胞内的最佳表达时间和感染复数(MOI)：

将P1病毒感染2×10⁶处于对数生长期的Sf9细胞，置于27℃培养箱中培养，直到细胞完全裂解，低速离心去除细胞碎片，制备高滴度病毒液；以10倍的梯度将高滴度病毒液稀释至10^-6和10^-7，分别做噬斑分析，计算噬斑数，通过公式滴度(pfu/ml)＝(1/稀释度)×噬斑数，以此确定病毒滴度；

再根据公式接种所需高滴度病毒液的体积(ml)＝MOI(pfu/cell)×细胞数÷滴度(pfu/ml)，计算出MOI为5、7、10时，需要接种高滴度病毒液的体积；同时设不接种病毒液的Sf9细胞的负对照；在感染72hr后收细胞，制备聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品。

实施实例6用Western Blot的方法检测中国鲎C因子在昆虫细胞内的表达：

当Sf9昆虫细胞处于对数生长期时，取适量高滴度的含有中国鲎C因子基因的重组杆粒(FC-Bacmid)感染细胞，27℃培养72hr后，把细胞吹起来，500g低速离心5min，弃上清，细胞沉淀加入1ml PBS重悬，取300μl，500g离心5min，吸净上清，加入100μl 1×SDSloading buffer，涡旋混匀至澄清，100℃煮10min，离心，取10μl上清上样，进行SDS-PAGE，凝胶密度为12％。电泳后用湿转方法转膜，恒压100V，2小时。将膜从电转槽中取出，去离子水稍加漂洗，浸没于5％脱脂牛奶封闭液中室温缓慢摇荡一小时。加入anti-His一抗稀释液，室温下轻摇孵育1小时。一抗孵育结束后，用PBST缓冲液漂洗膜三次，每次10分钟。然后加入二抗，室温轻摇一小时。二抗孵育结束后，用PBST漂洗膜后再浸洗三次。然后用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法检测。湿转使用电转液配置方法为：Tris-base 3.0g，甘氨酸14.4g，甲醇200mL，加去离子水至1000mL。PBST：1×PBS，Tween-200.01％。封闭液与抗体稀释液均为含5％脱脂奶粉的PBST。

Claims (4)

1.中国鲎C因子在昆虫细胞中的表达方法，其特征在于：

1)含中国鲎C因子基因的重组杆状病毒供体质粒pFASTBacHTA-FC转化含杆状病毒基因组的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac；

2)含有C因子基因的重组杆粒(FC-Bacmid)的筛选和鉴定；

3)含有C因子基因的重组杆粒DNA的抽提；

4)含有C因子基因的重组杆粒转染昆虫细胞；

5)检测C因子在昆虫细胞中的表达，确定最佳表达时间和感染复数。

2.按权利要求1所述的中国鲎C因子在昆虫细胞中的表达方法，其特征是：

a)所述含有C因子基因的重组表达质粒pFASTBacHTA-FC转化DH10Bac的方法，其特征是：取2μl浓度为0.1μg/μl的pFASTBacHTA-FC质粒转化100μl大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，冰上放30min，42℃热激90s，迅速放冰上5min，加入1ml LB，37℃复苏3.5hr后涂三抗性LB平板(50μg/ml Kanamycin，7μg/ml Gentamicin和10μg/ml Tetracycline)，37℃培养40hr后观测菌落的颜色；

b)所述含有C因子基因的重组杆粒的筛选和鉴定方法，其特征是：挑如a)中所述的白色单菌落，重新划平板培养，连续划两至三次，直到不产生蓝色菌落为止，挑连续划几次后仍然是白色的菌落到含有三抗性的LB试管中37℃培养4小时后，用PCR法鉴定阳性克隆；

PCR体系：F：100pmol，R：100pmol，dNTPs：各50pmol，5×Prime star DNA聚合酶buffer：10μl，Prime star DNA聚合酶：5U，无菌水补足50μl；

PCR反应条件：将上述PCR反应体系混匀，第一阶段95℃预变性3min；第二阶段95℃，1min；54℃，1min；72℃，3min20s；共进行30个循环；第三阶段72℃延伸10min；

引物为：

FC Primer F：5’-ATG GTC TTA GCG TCG TTT TT-3’

FC Primer R：5’-AAT GAA CTG CCT AAT CCA TG-3’

M13 Primer F：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

M13 Primer R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’

c)所述含有C因子基因的重组杆粒DNA的抽提，其特征是：挑经过PCR鉴定为阳性的单菌落至含有50μg/ml Kanamycin，7μg/ml Gentamicin和10μg/ml Tetracycline的5ml LB培养基的试管中，37℃培养 24小时；取1.5ml菌液离心去上清，用300μl溶液I(15mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM EDTA，100μg/ml RNase A)轻轻重悬菌体，再加入300μl溶液II(0.2N NaOH，1％SDS)，轻柔旋转混匀，室温放置5min；慢慢加入300μl浓度为3M的乙酸钾(pH 5.5)，边加边轻轻混匀，然后置冰上10min；12000rpm离心10min，将800μl上清小心转移至已加入800μl异丙醇的EP管中，轻轻混匀，然后置冰上10min；12000rpm，室温离心15min；弃去上清，加入500μl 70％的乙醇，翻转几次以清洗沉淀，12000rpm，室温离心15min；重复一次；仔细弃去上清，让沉淀在空气中干燥10min，然后用40μl TE缓冲液溶解沉淀。此为重组了C因子的杆粒DNA，冻于-20℃备用。

3.按权利要求1所述的中国鲎C因子在昆虫细胞中的表达方法，其特征是：含有中国鲎C因子基因的重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞及噬斑分析确定病毒滴度的方法，其操作方法是：Sf9细胞预分至六孔板中(9×10⁵细胞/孔)，27℃预培养2hr；分别取5μl或者10μl(1μg/μl)FC-bacmid与100μl不含血清和添加剂的Grace’s培养基混匀；取6ul转染试剂Cellfectin与100μl不含血清和添加剂的Grace’s培养基混匀；将上述稀释好的质粒及转染试剂混匀，室温孵育20min；同时以2ml无添加成分的Grace’s培养基洗六孔板细胞并弃去洗液；取0.8ml无添加成分的Grace’s培养基加入洗涤后的六孔板细胞中，再加入质粒和转染试剂的混合物，轻轻摇匀。同时设一个阳性对照和阴性对照；转染5小时后换含血清及抗生素的培养基，27℃培养72小时，低速离心收集培养上清，即获得了重组中国鲎C因子的P1病毒样品；

将所得的P1病毒液依次稀释2-3个梯度加到弃去培养基的Sf9单层细胞上，作用1hr，吸去上清，将含血清的完全培养基和2.2％低熔点琼脂糖按1∶1比例混合，加X-gal至众浓度为150μg/ml，立即快速加到细胞上，等胶凝固后，倒置6孔板，置于27℃培养箱中培养，直到噬斑出现；计算噬斑数，通过公式滴度(pfu/ml)＝(1/稀释度)×噬斑数，以此确定病毒滴度。

4.按权利要求1所述的中国鲎C因子在昆虫细胞中的表达方法，其特征是：确定C因子的最佳表达时间和感染复数(MOI)的操作方法：

a)将P1病毒感染2×10⁶处于对数生长期的Sf9细胞，置于27℃培养箱中培养，直到细胞完全裂解，低速离心去除细胞碎片，制备高滴度病毒液；以10倍的梯度将高滴度病毒液稀释至10^-6和10^-7，分别做噬斑分析，计算噬斑数，通过公式滴度(pfu/ml)＝(1/稀释度)×噬斑数，以此确定病毒滴度；

再根据公式接种所需高滴度病毒液的体积(ml)＝MOI(pfu/cell)×细胞数÷滴度(pfu/ml)，计算出MOI为5、7、10时，需要接种高滴度病毒液的体积；同时设不接种病毒液的Sf9细胞的负对照；在感染72hr后收细胞，制备聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白样品。

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