BRPI0210681B1 - métodos e reagentes para detectar endotoxina - Google Patents

Abstract

"métodos e reagentes para detectar endotoxina". é descrito um reagente que contém um fator c do caranguejo ferradura purificado. particularmente um fator c produzido recombinantemente e um agente tensoativo podem ser usados em um ensaio sensível, rápido e reprodutível para detectar endotoxina.

Description

"MÉTODOS E REAGENTES PARA DETECTAR ENDOTOXINA" Este pedido de patente reivindica o benefício e incorpora como referência pedido de patente provisório número de série 60/310.126, depositado em 28 de junho de 2001.

Campo da Invenção A invenção diz respeito a reagentes e métodos para detectar endotoxina.

Antecedentes da Invenção Endotoxina bacteriana gram negativa é um contami-nante muito difundido de uma variedade de materiais, tais como água, alimento, produtos farmacêuticos e preparações parenterais. Os testes mais comumente usados para detectar contaminação de endotoxina empregam lisatos de amebócitos derivados de hemolinfa do caranguejo ferradura. Entretanto, à medida em que a população desses animais diminui, torna-se cada vez mais importante desenvolver métodos rápidos e confiáveis para detectar endotoxina que não se baseiem na disponibilidade de hemolinfa do caranguejo ferradura.

Sumário da Invenção A invenção fornece reagentes e métodos para detectar endotoxina. Uma modalidade da invenção é um reagente para detectar endotoxina, que compreende uma proteína do Fator C do caranguejo ferradura purificado e um agente tensoativo. O agente tensoativo pode ser um agente tensoativo anfotérico representado pela fórmula seguinte: em que é um radical alquileno que tem de 1 a 4 átomos de carbono; Y e Y' são cada qual (1) hidrogênio, (2) alquila inferior ou (3) hidroxi alquila inferior; R2 e R3 são cada qual (1) alquila inferior ou (2) hidroxi alquila inferior; n é 0 ou 1, quando n for 0, R4 é alquila que contém de cerca de 8 a cerca de 18 átomos de carbono; quando n for 1, R4 é um radical alquileno que tem de 1 a cerca de 6 átomos de carbono; Rs é uma alquila que contém de cerca de 8 a cerca de 18 átomos de carbono; e M é hidrogênio, sódio, potássio ou amônia. O agente tensoativo pode ser um agente tenso-ativo aniônico representado pela fórmula seguinte: (R6) nl- (Y) AR (S03M) n2 (E) r5oso3m (F) em que R5, Y e M têm os mesmos significados apresentados anteriormente; Rs é uma alquila de 8 a 24 átomos de carbono; nl é um número inteiro de 1 a 3; n2 é 1 ou 2; e Ar é fenila ou naftila. O agente tensoativo pode ser um agente tensoativo catiônico representado pela fórmula seguinte: em que Rs, Y e Y' têm os mesmos significados apresentados anteriormente. 0 agente tensoativo pode ser um a-gente tensoativo não-iônico representado pela fórmula seguinte : R5R7R8N -> 0 (H) em que Rs, Y e Y' têm os mesmos significados apresentados anteriormente e R7 e R8 são cada qual metila ou eti-la. O agente tensoativo pode ser aqueles agentes tensoativos não-iônicos selecionados do grupo que consiste do produto da condensação de cerca de 10 a 30 moles de óxido de etileno com o monoéster de um álcool hexaídrico que contém 6 átomos de carbono com o grupo éster contendo 10 a 20 átomos de carbono .

Ainda uma outra modalidade da invenção é um método de detectar endotoxina em uma amostra teste. Uma amostra teste é colocada em contato com (1) um reagente que compreende (a) uma proteína do Fator C do caranguejo ferradura purificado e (b) um agente tensoativo para formar uma mistura amostra teste-reagente e (2) um substrato do Fator C para formar uma amostra teste contactada. A divagem do substrato do Fator C gera um sinal detectável. A amostra teste contactada é ensaiada para verificar a presença ou ausência do sinal detectável. Um valor do sinal detectável que é aumentado em relação a uma amostra de controle que não contém endoto-xina indica uma presença de endotoxina na amostra teste.

Uma modalidade adicional da invenção é um método de detectar endotoxina em uma amostra teste. Uma amostra teste é colocada em contato com (1) um reagente que compreende (a) uma proteína do Fator C de Carcinoscorpius rotundi-cauda recombinante e (b) um agente tensoativo e (2) N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-Amido-4-metil cumarina para formar uma amostra teste contactada. A proteína do Fator C é feita pelo método de cultivar uma célula hospedeira que compreende um vetor que codifica a proteína do Fator C em um sobrenadante sob condições tais que a proteína do Fator C seja expressa no sobrenadante. A amostra teste contactada é ensaiada para verificar a presença ou ausência de um sinal fluorescente. Um valor do sinal detectável que é aumentado em relação a uma amostra de controle que não contém endotoxina indica uma presença de endotoxina na amostra teste.

Uma outra modalidade da invenção é um método de detectar endotoxina em uma amostra teste. Uma amostra teste é colocada em contato com um reagente que compreende uma proteína do Fator C do caranguejo ferradura purificada e um agente tensoativo da maneira supradescrita para formar uma mistura de amostra teste-reagente. A mistura da amostra tes- te-reagente é colocada em contato com um substrato do Fator C, em que a divagem do substrato do Fator C gera um sinal detectável. A mistura da amostra teste-reagente contactada é ensaiada para verificar a presença ou ausência do sinal detectável . Um valor do sinal detectável que é aumentado em relação a uma amostra de controle que não contém endotoxina indica uma presença de endotoxina na amostra teste.

Ainda uma outra modalidade da invenção é um método de detectar endotoxina em uma amostra teste. Uma amostra teste é colocada em contato com um reagente que compreende uma proteína do Fator C de Carcinoscorpius rotundicauda re-combinante e um agente tensoativo. A proteína do Fator C é feita pelo método de cultivar uma célula hospedeira que compreende um vetor que codifica a proteína do Fator C em um sobrenadante sob condições tais que a proteína do Fator C seja expressa no sobrenadante. A mistura amostra teste-reagente é colocada em contato com H-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-Amido-4-metila cumarina. A mistura amostra teste-reagente contactada é ensaiada para verificar a presença ou ausência de um sinal fluorescente. Um valor do sinal fluorescente que é aumentado em relação a uma amostra de controle que não contém endotoxina indica uma presença de endotoxina na amostra teste.

Também uma outra modalidade da invenção é um estojo para detectar endotoxina. O estojo compreende um reagente que compreende (a) uma proteína do Fator C do caranguejo ferradura purificada e (b) um agente tensoativo supradescri-to, juntamente com instruções para um método de detectar en- dotoxina em uma amostra teste. 0 método compreende as etapas de (1) colocar em contato uma amostra teste com um reagente que compreende (a) uma proteína do Fator C do caranguejo ferradura purificada e (b) um agente tensoativo supradescri-to para formar uma mistura amostra teste-reagente; (2) colo- car em contato a mistura amostra teste-reagente com um substrato do Fator C; em que a divagem do substrato do Fator C gera um sinal detectável; e (3) ensaiar a mistura amostra teste-reagente contactada para verificar a presença ou ausência do sinal detectável, em que o valor do sinal detectável que é aumentado em relação a uma amostra de controle que não contém endotoxinas indica uma presença de endotoxina na amostra teste.

Descrição Resumida das Figuras Figura 1. Histograma que mostra o efeito de Zwit-tergent 3-14 e Tween 20 na atividade do Fator C recombinante.

Figura 2 . Histograma que mostra o efeito de Zwit-tergent 3-14 e Tween 80 na atividade do Fator C recombinante.

Figura 3. Histograma que mostra o efeito de Zwit-tergent 3-14 e Triton X-114 na atividade do Fator C recombinante .

Figura 4. Gráfico que mostra a detecção de endotoxina com uso de um substrato DPR (N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-Amido-4-metil)-cumarina.

Figura 5. Gráfico que mostra a detecção de endotoxina com uso de substrato VPR (N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-Amido-4-metil)-cumarina.

Figura 6. Histograma que mostra a atividade do Fator C de Limulus a diferentes concentrações de Zwittergent.

Figura 7. Histograma que mostra a sensitividade da endotoxina na presença e ausência de agente tensoativo.

Figura 8 . Histograma que mostra os resultados de um ensaio de endotoxina de uma hora e uma etapa com uso de DRP-cumarina como um substrato.

Figura 9. Histograma que mostra o efeito de Zwittergent 3-14 e octiltiolglicosídeo na atividade do Fator C recombinante.

Figura 10. Histograma que mostra o efeito de Zwittergent 3-14 e Genapol C-100 na atividade do Fator C recombinante .

Figura 11. Histograma que mostra o efeito de Zwittergent 3-14 e TX-100 na atividade do Fator C recombinante.

Descrição Detalhada da Invenção A invenção é um reagente para detectar endotoxina e um método de usar o reagente. O reagente compreende uma proteína do Fator C do caranguejo ferradura purificado e um agente tensoativo. Este reagente pode ser usado em combinação com um substrato do Fator C que, mediante divagem, gera um sinal detectável para detectar endotoxina em uma amostra teste. A presença do agente tensoativo melhora a ativação do Fator C purificado pela endotoxina em até 3-7 vezes, permitindo uma medição mais rápida e sensível de níveis de endotoxina em uma amostra teste. 0 reagente preferivelmente contém um Fator C recombinante, eliminando-se assim a necessidade de um suprimento contínuo de hemolinfa do caranguejo ferradura .

Fator C purificado Um componente do reagente desta invenção compreende uma proteína do Fator C do caranguejo ferradura purificado. O Fator C nativo purificado de qualquer uma das quatro espécies de caranguejo ferradura conhecidas, Limulus poly-phemus, Carcinoscorpius rotundicauda, Tachypleudus tridenta-ta ou Tachypleudus gigas pode ser usada na prática da invenção. 0 Fator C nativo pode ser purificado bioquimicamente, ou o Fator C purificado pode ser produzido recombinantemente. 0 "Fator C purificado" na forma aqui usada significa uma composição de uma proteína do Fator C definida a seguir que contém menos de 30% em peso de componentes de li-sato de amebócito nativo de não-Fator C de qualquer uma das quatros espécies de caranguejo ferradura conhecidas. A composição especificamente inclui um sobrenadante de cultura de célula que compreende proteína do Fator C recorabinante (ver a seguir). Métodos para purificar o Fator C do caranguejo ferradura a partir de sua fonte nativa são conhecidos e estão descritos, por exemplo, em Nakamura et. al., Eur. J. Bí-ochem. 154, 511-21, 1986; Navas et al. , Biochem. Intl. 21, 805-13, 1990; Tokunaga et al., J. Biochem. 109, 150-157, 1991; patente U.S. 5.985.590 e patente U.S. 5.716.834. Qualquer um desses métodos ou seus equivalentes pode ser usado para obter um Fator C purificado. Ver também o exemplo 11. A pureza de uma preparação do Fator C pode ser avaliada por qualquer meio conhecido na tecnologia, tal como eletroforese em gel SDS.

Preferivelmente, o Fator C purificado é produzido recombinantemente. Seqüências de aminoácidos para Fator C nativo de Tachypleus tridentata e Carcinoscorpius rotundi-cauda são conhecidas, como são as seqüências de codificação de ocorrência natural para essas proteínas. SEQ ID NOS:1 e 3 fornecem seqüências de codificação para as seqüências de a-minoácido do Fator C de Tachypleus tridentata mostradas em SEQ ID NOS:2 e 4, respectivamente. SEQ ID NOS:5 e 7 fornecem seqüências de codificação para as seqüências de aminoácidos do Fator C de Carcinoscorpius rotundicauda mostradas em SEQ ID NOS:6 e 8, respectivamente. Em virtude da degeneração do código genético, podem ser conjeturadas muitas outras seqüências que codificarão cada uma dessas proteínas do Fator C nativo, e a invenção considera especificamente o uso de qualquer uma dessas seqüências de codificação para produzir um Fator C purificado.

A invenção também engloba o uso de variantes do Fator C de ocorrência natural e não-natural purificado, isto é, produzida recombinantemente, desde que as variantes mantenham uma atividade da enzima do Fator C. A atividade da enzima do Fator C pode ser avaliada com uso de qualquer ensaio de atividade da enzima do Fator C conhecida na tecnologia. Ver, por exemplo, Tokunaga et al. , J. Biochem. 109, 150-57 (1991) e Nakamura et al. , Eur. J. Biochem. 176, 89-94, 1988. Os ensaios de endotoxina descritos nos exemplos 1 e 13, a seguir, também podem ser usados. Variantes do Fator C de ocorrência natural incluem, por exemplo, produtos de variantes emenda de MRNA do Fator C ou de genes do Fator C mudados .

Variantes do Fator C de ocorrência não-natural podem ser construídos com uso de substituições, adições ou de-leções de base para produzir proteínas que têm atividade do Fator C. Variantes do Fator C de ocorrência não-natural podem diferir do Fator C de ocorrência natural em até 50, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 ou 99%, determinado com uso do programa de alinhamento Blast2 (Blosum62, Expect 10, códigos genéticos padrões). Fragmentos de Fator C nativo e produzido recombinantemente que mantêm atividade do Fator C também podem ser usados na prática de invenção. Assim, "Fator C" na forma aqui usada inclui proteínas e fragmentos de proteínas de ocorrência natural e não-natural que têm as propriedades supradescritas. Métodos de produzir proteínas recombinantemente são bem conhecidos na tecnologia e geralmente envolvem cultivar uma célula hospedeira que compreende um vetor de expressão que codifica a proteína do Fator C em m sobrenadante sob condições tais que a proteína seja expressa. A proteína expressa pode ser recuperada ou, preferivelmente, o sobrenadante que compreende a proteína expressa é usado diretamente como a fonte do Fator C recombinante. Assim, "Fator C purificado" especificamente inclui um sobrenadante que compreende o Fator C recombinante. Células hospedeiras úteis para a produção de Fator C recombinante incluem, sem limitação, células de levedura e células de insetos. A produção recombinante de Fator C de Carcinoscorpius rotundicauda em células hospedeiras Pichia pastoris e Sacchoromyces cerevisiae está especificamente descrita na patente U.S. 5.985.590.

Um método particularmente preferido de obtenção do Fator C recombinante é produzir a proteína em um sistema ba-culovirus, descrito nos exemplos 2-5. Resumidamente, um sequência de codificação do Fator C é clonada em pFASTBACl. O plasmídeo recombinante resultante é transformado em células competentes DH10BAC que contêm um bacmid com um sítio alvo mini-attTn7 e um plasmídeo auxiliar. Na presença de proteínas de transposição providas pela plasmídeo auxiliar, o elemento transponível mini-Tn7 no plasmídeo pFASTBAC pode transpor para o sítio alvo mini-attTn7 no bacmid. Colônias que contêm bacmids recombinantes são identificadas pela quebra do gene lacZa. DNA de alto peso molecular é preparado a partir de clones de DH10BAC selecionados que contêm o bacmid recombinante. Este DNA é então usado para transfectar células de inseto S9, que então secretarão o Fator C recombinante. Uma descoberta particularmente surpreendente da presente invenção é que o meio de cultura que contém o Fator C secre-tado, que foi separado das células cultivadas, pode ser usado juntamente com um agente tensoativo (descrito a seguir) como um reagente em ensaios de endotoxina sem purificação posterior.

Agente Tensoativo Reagentes da invenção também compreendem um agente tensoativo. Agentes tensoativos úteis na prática da invenção incluem aqueles descritos na patente U.S. 4.322.217, embora outros agentes tensoativos possam também ser usados. Agentes tensoativos úteis incluem agentes tensoativos anfotéricos que contêm um grupo tanto aniônico como catiônico nas suas estruturas. Ilustrativas são as sulfobetaínas representadas pela fórmula A: é um radical alquileno que tem de 1 a cerca de 4 átomos de carbono, Y é qualquer substituinte não-deletério quimica-mente adequado que inclui (1) hidrogênio, (2) alquila inferior substituída ou não-substituída, por exemplo, que contém 1 a 4 átomos de carbono, tais como metila, etila, propila ou hidroxi, etc.; R2 e R3 são cada qual selecionados de alquila inferior substituída ou não-substituída que contém 1 a 4 átomos de carbono, por exemplo, tais como metila, etila, propila, hidroxi etila, hidroxi metila, hidroxi propila, etc. n = 0 ou 1, quando n = 0, R4 é alquila substituído ou não- substituído, por exemplo, que contém cerca de 8 a cerca de 18 átomos de carbono, e quando n = 1, R, é um radical alquileno que tem de cerca de 1 a cerca de 6 átomos de carbono, R5 é um alquila substituído ou não substituído, por exemplo, que contém cerca de 8 a cerca de 18 átomos de carbono. O termo "alquileno" engloba tanto radicais polime-tileno como outros radicais alifáticos saturados divalentes.

Assim, pode haver ramificação na ligação provida pelo radical alquileno. O termo "inferior" significa um radical que contém 1 a 4 átomos de carbono.

Sulfobetaínas que podem ser usadas no reagente da presente invenção são conhecidas na tecnologia e foram descritas como agentes tensoativos zwiteriônicos. A preparação de tais compostos está descrita, por exemplo, em Fernley, J. Am. Oil Chem. Soc 55, 98-103 (1978) e na patente U.S. 3.280.179. Em agentes tensoativos de sulfobetaína preferidos, R2 e R3 na estrutura apresentada são metila. É também preferido que Rx seja propileno.

Um tipo de agente tensoativo de sulfobetaína útil tem a estrutura apresentada, em que n é igual a 0 e R4 é um radical alquila que tem de cerca de 8 a 18 átomos de carbono, preferivelmente um radical alquila de cadeia linear. Para esses agentes tensoativos de sulfobetaína, uma fonte conveniente do componente R4 é álcool graxo de sebo, que consiste de uma mistura de vários comprimentos de cadeia, com uma composição típica sendo aproximadamente 66 porcento de C18, 3 0 porcento de C16 e 4 porcento de C14 e outros. Uma outra fonte conveniente é o corte pelo meio de álcool graxo de coco destilado, que também consiste de uma mistura de vários comprimentos de cadeia, com uma composição típica sendo a-proximadamente 66 porcento de C12, 23 porcento de C14, 9 porcento de C16 e 2 porcento de C10.

Agentes tensoativos de sulfobetaína específicos da estrutura apresentada em que n é igual a 0 estão apresentados na patente U.S. 3.539.521. Um agente tensoativo particu- larmente preferido deste tipo é N-tetradecil-N,N-dimetil-3 -amonio-l-propanosulfonato, que encontra-se comercialmente disponível pela Calbiochem-Behring Corporation com o nome comercial de ZWITTERGENT 3-14.

Um outro tipo de agente tensoativo de sulfobetaína útil tem a estrutura referida em que n é igual a 1 e R4 é um radical alquileno que tem de cerca de 1 a cerca de 6 átomos de carbono. Nessas sulfobetaínas em que n é igual a 1, Rs é um radical alquila que tem de cerca de 8 a cerca de 18 átomos de carbono. É preferível que R5 seja cadeia linear. Conforme previamente discutido, fontes convenientes de radicais alquila que têm de cerca de 10 a cerca de 18 átomos de carbono são álcool graxo de sebo e álcool graxo de coco. Agentes tensoativos de sulfobetaína específicos da estrutura referida em que n é igual a 1 estão apresentados na patente U.S. 3.280.179.

Agentes tensoativos de sulfobetaína particularmente preferidos são 3 -(N,N-dimetil-n-acilamidopropilamonio)-2 -hidroxi-propano-l-sulfonatos, em que o grupo acila é derivado de álcool graxo de sebo ou álcool graxo de coco, com óleo graxo de coco sendo preferido. Técnicos habilitados perceberão que, na preparação normal desses derivados de álcoois graxos de sebo ou coco, resultará uma mistura de sulfobetaí-nas com comprimentos de cadeia de carbono variadas para os grupos acila. Conforme previamente discutido, esses álcoois graxos contém, na maior parte, comprimentos de cadeia de carbono que fornecerão grupos acila com o número desejado de átomos de carbono, isto é, de cerca de 8 a cerca de 18 áto- mos de carbono. Assim, essas misturas obtidas a partir de álcoois de ácido graxo de sebo ou coco são úteis no fornecimento de agente tensoativo de sulfobetaína para os reagentes da presente invenção.

Um material deste tipo particularmente preferido para uso em reagentes da presente invenção é N-cocoamido-propil-N,N-dimetil-N-2-hidroxipropil sulfobetaína. Um exemplo deste é LANZAINE CS, que encontra-se comercialmente disponível da Lonza, Inc., Fair Lawn, N.J.

Outros agentes tensoativos anfotéricos incluem os ácidos aminocarboxílicos de alquila de cadeia de comprimento N ilustrada pela fórmula B: Ácidos iminodicarboxílicos de alquila de cadeia de comprimento N ilustrados pela fórmula C: e alquila de cadeia de comprimento N ou betaínas de amido ilustradas pela fórmula D: onde R1# R2, R3, R4, Yen têm os mesmos significados que eles têm na fórmula A, M é hidrogênio ou um metal de formação de sal, e Y' tem o mesmo significado de Y na fórmula A. Y e Y' podem ser iguais ou diferentes. Exemplos de detergentes anfotéricos específicos são ácido N-alquilbeta-aminopropiônico, ácido N-alquil-beta-iminodipropiônico e de N-alquil-N,N,dimetil glicina; o grupo alquila pode ser, por exemplo, o derivado de álcool graxo de coco, lauril álcool, miristil álcool (ou uma mistura lauril-miristil), álcool de sebo hidrogenado, cetila, estearila ou misturas de tais ál-coois. Os ácidos aminopropiônicos e iminodipropiônicos substituídos são geralmente fornecidos na forma de sódio e outros sais, que também podem ser usados em reagentes da invenção .

Exemplos específicos incluem cocobetaína vendida pela Witco Chemical Corporation com o nome de EMCOL CC 37-18, cocoamidopropila betaína vendida pela Lonza Inc. com o nome de LOZAINE CO, e dissódio N-sebo-beta-iminodipropionato vendido pela Henkel Corporation com o nome de DERIPHAT 160.

Exemplos de outros detergentes anfotéricos são i-midazolinas graxas, tais como aquelas feitas pela reação de um ácido graxo de cadeia longa (por exemplo, de 10 a 20 átomos de carbono) com dietileno triamina e ácidos monoalocar-boxílicos que têm de 2 a 6 átomos de carbono, por exemplo 1-coco-5-hidroxietil-5-carboximetilimidazolina. Exemplos específicos incluem cocoimidazolina, que encontra-se comercial-mente disponível com o nome de AMPHOTERGE K-2 da Lonza, Inc., e imidazolina dicarboxi cáprico, que encontra-se co- mercialmente disponível com o nome de AMPHOTERGE KJ-2 pela Lonza, Inc.

Outros exemplos de agentes tensoativos úteis incluem agentes tensoativos aniônicos sintéticos, geralmente descritos como aqueles compostos que contêm grupo hidrofíli-cos e lipofílicos nas suas estruturas moleculares e ionizam em um meio aquoso para dar ânions que contêm tanto grupo li-pofílico como grupo hidrofílico. Os alquil aril sulfonatos, os alcano sulfonatos e os alquil fenóis sulfatados oxietila-dos são ilustrativos do tipo aniônico dos compostos de superfície ativa.

Os alquil aril sulfonatos são uma classe de agentes de superfície ativa aniônicos sintéticos representados pela fórmula E: (RÊ)nl_ (Y) Ar (S03M) n2 (E) Na fórmula E, Rs é um radical de hidrocarbono de cadeia linear ou ramificada que tem de cerca de 1 a cerca de 24 átomos de carbono, pelo menos um R6 tendo pelo menos 8 átomos de carbono; nl é de 1 a 3; n2 é de 1 a 2; Ar é um radical fenila ou um naftila e Y e M têm os mesmos significados que na fórmula B. Rs pode ser, por exemplo, metila, eti-la, hexila, octila, tetraoctila, iso-octila, nonila, decila, dodecila, octadecila e similares.

Compostos ilustrativos dos alquil aril sulfonatos incluem dodecilbenzeno sulfonato de sódio, decilbenzeno sul-fonato de sódio, metil dodecilbenzeno sulfonato de amônia, dodecilbenzeno sulfonato de amônia, octadecilbenzeno sulfonato de sódio, nonilbenzeno sulfonato de sódio, dodecilnaf- taleno sulfonato de sódio, hetadecilbenzeno sulfonato de sódio, eicososil naftaleno sulfonato de potássio, etilamina undecilnaftaleno sulfonato e docosilnaftaleno sulfonato de sódio.

Os alquil sulfatos são uma classe de agentes de superfície ativa aniônicos sintéticos representada pela fórmula F: R50S03M (F) em que Rs e M têm os mesmos significados que na fórmula B. Compostos ilustrativos da classe alquil sulfato de agentes tensoativos aniônicos incluem octadecil sulfato de sódio, hexadecil sulfato de sódio, dodecil sulfato de sódio, nonil sulfato de sódio, decil sulfato de amônia, tetra-decil sulfato de potássio, octil sulfato de dietanolamina, octadecil sulfato de trietanolamina e nonil sulfato de amônia.

Os alquilfenois sulfatados oxietilados são uma classe de agente de superfície ativa aniônicos sintéticos representados pela fórmula G: onde A é tanto oxigênio, enxofre, um grupo carbo-namida, um grupo tiocarbonamida, um grupo carboxílico como um grupo ester tiocarboxílico, z é um número inteiro de 3 a 8, e Rs e M têm os mesmos significados que na fórmula B. Compostos ilustrativos da classe alquil fenol sulfatado oxi- etilado de agentes tensoativos aniônicos incluem nonilfeno-xil tetraetilenoxi sulfato de amônia, dodecilfenoxi trieti-leneoxi sulfato de sódio, decilfenoxi tetraetileneoxi sulfato de etanolamina e octilfenoxi trietileneoxi sulfato de potássio .

Outros exemplos de agentes tensoativos úteis incluem compostos de superfície ativa não-iônicos que podem ser a grosso modo descritos como compostos que não ionizam, mas que adquirem características hidrofílicas a partir de uma cadeia lateral oxigenada, tal como polioxietileno; a parte lipofílica da molécula pode vir de ácidos graxos, fe-nol, álcoois, amidas ou aminas. Os compostos são normalmente feitos reagindo-se um óxido de alquileno, tais como óxido de etileno, óxido de butileno, óxido de propileno e similares, com ácidos graxos, álcoois de cadeia linear ou ramificada que contêm um ou mais grupos hidroxila, fenóis, tiofenóis, amidas ou aminas para formar polioxialquilneo glicoeteres e esteres, polioxialquilino alquilfenóis, polioxialquileno ti-ofenois, polioxialquileno amidas e similares. É geralmente preferível reagir de cerca de 3 a cerca de 30, mais preferivelmente 10 a 30 moles de óxido de alquileno por mol de ácidos graxos, álcoois, fenóis, tiofenois, amidas ou aminas.

Ilustrativos desses agentes tensoativos não-iônicos são os produtos obtidos a partir da reação de óxido de alquileno com um álcool alifático que tem de 8 a 18 átomos de carbono, tais como octila, nonila, decila, octadeci-la, dodecila, tetradecila e similares, com monoésteres de álcoois hexaídricos, o grupo ester contendo 10 a 20 átomos de carbono, tais como sorbitan monolaureato, sorbitan nonoo-leato e sorbitan monopalmitato, com alquil feno no qual o grupo alquila contém entre 4 e 2 0 átomos de carbono, tais como butila, dibutila, amila, octila, dodecila, tetradecila e similares, ou com um alquil amina na qual o grupo alquila contém entre 1 a 8 átomos de carbono.

Compostos ilustrativos de agentes tensoativos não-iônicos sintéticos incluem os produtos obtidos a partir da condensação de óxido de etileno ou óxido de propileno com o seguinte: propileno glicol, etileno diamina, dietileno gli-col, dodecil fenol, nonil fenol, tetradecil álcool, N-octadecil dietanolamida, N-dodecil monoetanolamida, polioxi-etileno (20) sorbitan nonooleato vendido com o nome de TWEEN 80 e polioxietileno (20) sorbitan monolaurato vendido com o nome de TWEEN 2 0.

Outros agentes tensoativos não-iônicos incluem ó-xidos de amina terciária de cadeia longa correspondentes à fórmula H: R5F7R8 -» 0 (H) em que Rs tem o mesmo significado que na fórmula A, e R7 e R8 cada qual radicais metila ou etila. A seta na fórmula é uma representação convencional de uma ligação se-mipolar. Exemplos de óxidos de amina adequados para uso nesta invenção incluem óxido de dimetildodecilamina, óxido de dimetiloctilamina, óxido de dimetildecilamina, óxido de di-metiltridecilamina e óxido de dimetilexadecilamina.

Agentes de superfície ativa catiônicos podem também ser usados como agentes tensoativos. Tais agentes são aqueles compostos de superfície ativa que contêm um grupo hidrofóbico orgânico e um grupo solubilizante catiônico. Grupos solubilizantes catiônicos típicos são amina e grupos quaternários. Tais agentes de superfície ativa catiônicos estão representados pela fórmula I: em que Rs, Y e Y1 têm os mesmos significados que na fórmula C.

Outros exemplos de agentes tensoativos catiônicos sintéticos adequados incluem as diaminas, tais como as de fórmula J: R9NHC2H4NH2 (J) em que R é um grupo alquila de cerca de 12 a 22 átomos de carbono, tal como N-2-aminoetil estearil amina e N-2-aminoetil miristil amina; amida ligada a aminas, tais como as de fórmula K: R5CONHC2H4NH3 (K) tais como Ν-2-amino etilestearil amida e N-amino etil miristil amida; compostos de amônia quaternária, em que tipicamente um dos grupos ligados ao átomo de nitrogênio são grupos alquila que contêm 1 a 3 átomos de carbono, incluindo tais grupos de 1 a 3 átomos de carbono que levam substituin- tes inertes, tais como grupos fenila e está presente um â-nion, tal como halogênio, acetado, metilsulfato, etc. Compostos de amônia quaternária típicos são cloreto de etil-dimetilesterail amônia, cloreto de benzil-dimetil-esterail amônia, cloreto de benzildimetil-estearil amônia, cloreto de trimetil estearil amônia, brometo de trimetilcetil amônia, cloreto de dimetiletil dilaurilamônia, cloreto de dimetil-propil-miristil amônia e os metassulfatos e acetatos correspondentes .

Um outro agente tensoativo catiônico adequado está representado pela fórmula L: em que Rs tem o mesmo significado que na fórmula A, e cada a é um número inteiro de 1 a 15. Um exemplo é po-lietileno glicol amina de sebo hidrogenado, em que R5 representa o radical sebo e a+a tem um valor médio de 5.

Outros agentes tensoativos úteis para uso no rea-gente Fator C-agente tensoativo incluem Triton X-100, Triton X-114, octil-beta-D-tioglucosídeo (OTG, Amresco #J575), Ge-napol C-100 (um alquil polioxietileno C12E10; Calbiochem #345794), Tween 20 e Tween 80.

Reagente Fator C-Agente Tensoativo Para formar um reagente da invenção, Fator C purificado e um agente tensoativo são combinados em uma solução aquosa. Uma solução tampão adequada a este propósito contém 30 mM Tris, pH 8,0, 30 mM de NaCl e 0,3% de lactose. A concentração de Fator C purificado em um reagente da invenção preferivelmente varia de 0,03-3 qg/mL. A concentração de a-gente tensoativo no reagente da invenção preferivelmente varia de 0,001-0,003%. Concentrações ideais de Fator C purificado e do agente tensoativo irão variar, dependendo, por e-xemplo, da pureza do Fator C e do agente tensoativo particular. Concentrações ideais de Fator C purificado e de agente tensoativo podem ser determinadas com uso de teste de rotina. No ensaios exemplificado nos exemplos 1 e 13, a concentração ideal do agente tensoativo ZWITTERGENT 3-14 é de 0,0025%.

Ensaio de Endotoxina O reagente supradescrito pode ser usado em um ensaio para detectar endotoxina em uma amostra de teste. A a-mostra de teste pode ser qualquer amostra que possa ser usada para detectar endotoxina, incluindo água, soluções aquo-sas, tais como tampões, preparações farmacêuticas (por exemplo, vacinas, fluidos intravenosos, preparações de fárma-cos), reagentes de geração de imagem biomédica (por exemplo, corantes, soluções radioativas), preparações de enzima (por exemplo, colagenase), meio de cultura de tecido, bebidas, sangue, urina, fluido cerebroespinhal, linfa, soro e soluções formadas pela incubação de água ou uma solução aquosa com uma amostra sólida, tais como produto comestível ou uma luva cirúrgica.

Pode ser feito um ensaio tanto de duas etapas como de uma etapa. Para realizar o ensaio de duas etapas (exemplo 1), uma amostra de teste é incubada com um reagente que contém Fator C purificado e um agente tensoativo, em seguida um substrato do Fator C que irá gerar um sinal detectável mediante divagem é adicionado. Para realizar o ensaio de uma etapa (exemplo 13) , endotoxina, o reagente que contém Fator C purificado e um agente tensoativo, e um substrato são adicionados juntos.

Substratos que irão gerar um sinal fluorescente mediante divagem são particularmente preferidos, tais como N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-Amido-4-metil cumarina ("DPR", Bachem 1-1560.0050) e N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-Amido-4-metil cumarina ("VPR", Bachem 1-1120.0050). Concentrações de DPR geralmente ficam na faixa de cerca de 10-100 mM, 25-100 mM, 5-100 mM, 75-100 mM, 25-75 mM, 50-75 mM, 25-50 mM ou 50-75 mM. Concentração de VPR geralmente fica na faixa de cerca de 50-200 mM, 50-150 mM, 50-100 mM, 50-75 mM, 75-100 mM ou 75-100 mM. A concentração ideal para um substrato particular varia. Por exemplo, a concentração ideal para DPR é de 50 nM, enquanto que a concentração ideal para VPR é de 100 mM. além disso, o substrato particular pode ser escolhido dependendo dos níveis de endotoxina esperados na amostra de teste. 0 substrato de VPR tem uma melhor faixa linear e altas concentrações e endotoxina, e o substrato de DPR tem uma melhor faixa linear a baixas concentrações de endotoxina. Assim, DPR pode ser usado em ensaios onde se deseja uma maior sensitividade, enquanto que VPR é o substrato preferido quando se esperam maiores níveis de endotoxina presentes e quando é exigida uma menor sensitividade. A fluorescência pode ser medida com uso de qualquer meio conhecido na tecnologia. Se for usado um fluoríme-tro com substratos de DPR ou VPR supradescritos, a excitação é ajustada a 3660, 380, 390 ou 395 nm (largura de incisão 4-40 nm) e a emissão é medida a 440 ou 460 nm (largura da incisão de 2,5-40 nm) . A medição pode ser tanto qualitativa como quantitativa, com referência a uma curva de concentração de endotoxina padrão. 0 ensaio pode ser realizado em um vaso transparente, tal como uma chapa de cultura de tecido de vidro ou poliestireno, ou pode ser realizado em um vaso preto (por e-xemplo, uma microplaca preta de 96 furos). Caso desejado, o ensaio pode ser adaptado para seleção de alto rendimento de múltiplas amostras, por exemplo, com uso de placas de micro-titulação de 96 orifícios.

Estoj os A invenção também fornece um estojo para uso na detecção de endotoxina. 0 estojo compreende uma proteína do Fator C do caranguejo ferradura purificado e um agente ten-soativo, da maneira supradescrita. Instruções para uso do reagente para detectar endotoxina podem também ser incluídas. Os estojos também podem incluir um substrato do Fator C para uso no ensaio.

Todas as patentes, pedidos de patente e referências citadas nesta descrição estão aqui expressamente incorporadas como referência. A descrição apresentada descreve no geral a presente invenção. Um entendimento mais completo po- de ser obtido com referência aos exemplos específicos seguintes, que são fornecidos com propósitos de ilustração a-penas e que não devem ser interpretados para limitar o escopo da invenção. EXEMPLO 1 Ensaio de endotoxina de duas etapas Endotoxina foi pré-incubada com meio de cultura que contém Fator C de Carcinoscorpius rotundicauda recombi-nante obtido de células Sf9 de produção de Fator C por 1 hora em tampão de ensaio (30 mM Tris, pH 8,0, 30 mM de NaCl, 0,3% de lactose e 0,0025% de Zwittergent 3-14). O substrato N-t-Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-Amido-4-metil cumarina (DPR-cumarina) foi adicionado à mistura a uma concentração final de 50 mM. A fluorescência gerada a partir da divagem do substrato pelo Fator C ativado foi medida depois de 15-20 minutos. Os resultados estão mostrados na figura 4. Os resultados de um ensaio similar realizado com uso do substrato N-t-Boc-Val-Pro-Arg-7-Amido-4-metil cumarina a uma concentração final de 100 mM estão mostrados na figura 5. EXEMPLO 2 Trasnfecção de bacmid DNA-Fator C em células Sf9 e colheita de sobrenadante viral recombinante Células Sf9 são semeadas a uma densidade de 5 x 106 por orifício de 35 mm em uma placa de cultura de tecido de 6 orifícios em meio de cultura de célula de inseto (ICCM) que contém 50 U/mL de penicilina e 50 mg/mL de estreptomici-na. Insect-Xpress (BioWhittake Cat. #04-10270) ou Sf-900 SFM são meios adequados; entretanto, qualquer meio comparável no qual células SF9 cresçam pode ser usado. As placas são incubadas a 27 °C por 1 hora para permitir que as células se sedimentem. Nesse ínterim, o seguinte foi preparado (cada um por orifício) : (1) 7 mg de bacmid-Fator C DNA em 100 mL de ICCM (sem antibiótico) e (2) 6 mL de CELLFECTIN (Bibco-BRL) mais 100 mL de ICCM (sem antibiótico) . Soluções (1) e (2) são misturadas suavemente e incubadas à temperatura ambiente por uma hora. A esta mistura, 0,8 mL de ICCM (sem antibiótico) é adicionado.

As células Sf9 aderidas são lavadas suavemente com 2 mL de ICCM (sem antibiótico) . Um mL de complexo de CELLFECTIN-DNA é adicionado a cada orifício e incubado a 27 °C por 5 horas. As misturas da transfecção são removidas completamente, e 2 mL de ICCM contendo antibióticos são adicionados. Depois da incubação a 27 °C por 96 horas, o sobre-nadante da cultura de célula é colhido. O sobrenadante é clarificado por centrifugação a 5.000 rpm por 10 minutos em um rotor centrífugo SIGMA 3K10, Nr. 11133. 0 sobrenadante, contendo o baculovirus recombinante, é armazenado a 4 °C. EXEMPLO 3 Amplificação do estoque viral recombinante A amplificação do vírus pode ser feita com células Sf9 tanto em uma monocamada com em suspensão. Para cultura em monocamada, o meio é decantado de uma cultura de células Sf9 de um dia 80% confluente em um frasco de cultura de tecido de 75 cm2. A monocamada de célula é infectada com 1 mL de vírus (exemplo 2) com uso de MOI de 0,1-1. O estoque de vírus é esterilizado por filtração com uso de um filtro mil- lex GV Millipore (amarelo; ligação de baixa proteína). 0 cálculo do inóculo viral é como se segue: Volume de inóculo = (MOI x número de células total / titulação de vírus em pfu/mL) Assim, para 1 x 107 células, a uma titulação de vírus de 2 x 107 pfu/mL, o volume do inóculo é de 0,5 mL. O volume do inóculo é ajustado a 1 mL com ICCM antes de ele ser introduzido nas células. O frasco é sacudido diversas vezes para assegurar que a monocamada da célula esteja completamente coberta por 1 mL de inóluco viral. O frasco é então incubado a 27 °C por uma hora sem sacudir. Depois da incubação, o frasco é colocado na vertical, e 14 mL de ICCM fresco adicionados. 0 frasco é então incubado por 3 dias a 27 °C. 0 sobrenadante da cultura é colhido em tubos livres de pirogênio estéreis e centrifugado a 2.000 rpm por 100 minutos a 4 °C usando um rotor centrífugo Sigma 3K10. Para uso imediato, o estoque viral é armazenado a 4 °C. Para armazenamento em longo prazo, o estoque viral é colocado a -80 °C.

Para cultura em suspensão, o uso de células Sf9 de crescimento na fase log com disponibilidade >95% para amplificação viral. A densidade e disponibilidade de células são determinadas. Células Sf9 foram diluídas com InsectXPRESS fresco em 1 x 106 por mL. Vírus a ser amplificado foi adicionado à cultura de Sf9 a um MOI de 0,02 (vírus/célula) , como se segue: Volume de estoque de vírus inóculo (mL) = (Total de células/mL) x (Volume total de cultura) x (MOI) / (Titulação de Vírus em pfu/mL) Frascos giratórios são incubados por três dias a 27 °C ±2 °C, com agitação constante a 90-120 rpm. A cultura de células é transferida para garrafas centrífugas estéreis e centrifugada a 2.000 rpm por 10 minutos a 4 °C. O sobrena-dante é coletado em um recipiente estéril e descartada a pelota de célula. 0 sobrenadante é filtrado através de um filtro de 0,45 pm em um recipiente estéril. 0 estoque de vírus acabado é armazenado com proteção de luz a 2-8 °C. Uma determinação da titulação é realizada da maneira explicada no exemplo 4 . EXEMPLO 4 Titulação de baculovirus A titulação de vírus (Unidades de Formação de Placa (PFU) por mL) pode ser determinada com ensaio de placa, diluição de ponto final, ou outros estojos de titulação vi-ral (por exemplo, BacPAK Baculovirus Rapid Titer Kit da Clontech #1599-1). 0 ensaio de placa é realizado em cultura de monocamada imobilizada. Ensaios de placa a ser realizados são determinados como se segue: Número de ensaios de placa = número de diluição viral x 4 (quadruplicatas) + 2 controles positivos e 2 negativos Por exemplo, 105, 106, 107, 108 para diluição viral, cada diluição em orifícios quadruplicados, seria um ensaio de placa de 16 orifícios. Incluir dois controles positivos e dois controles negativos no ensaio de placa, para um total de 20 orifícios.

Preparar uma suspensão de célula de densidade 5 x 10s células por mL em meio de soro FBS 10%. Semear placas de 6 orifícios a 2 mL por orifícios com a suspensão de células citada. As células são anexadas naturalmente duas horas antes do experimento. As células são aproximadamente 80% con-fluentes.

Preparar diluições virais seriais 10 vezes usando meio de 4,5 mL e 0,5 mL de estoque viral em tubos de 15 mL estéreis. Aspirar o meio de cada orifício. Adicionar a diluição viral 1 mb por orifício e incubar a 27 °C por 2 horas.

Aquecer 1,3 x SF-900II (Bibco-BRL #10967-032) a 27 °C. Derreter agarose 4% (Gibco 18300-013) e manter em banho de água a 50 °C . Adicionar 1,3 x meio e agarose 4% em proporção de 3:1 para fazer agarose 1% em meio de cultura. Manter este agar em um banho de água a 40 °C (por exemplo, em um béquer que possa ser levado a uma coifa).

Trabalhando rapidamente de maneira tal que a mistura de agarose não se solidifique, aspirar a solução viral das monocamadas de célula. Adicionar 2 mL de agarose 1% a cada orifício. Deixar as placas assentar na coifa com as tampas ligeiramente abertas por 10 minutos. Inverter as placas e colocá-las em uma caixa selada com toalhas de papel úmidas para dar umidade. Incubar a 27 °C por 5-7 dias, ou até que as placas sejam bem formadas.

No dia 7 de pós-infecção, adicionar 0,5 mL de vermelho neutro 0,033% (em água), incubar 3 minutos e descar- tar. Alternativamente, adicionar 0,5 mL de tripan azul 0,1% (em água), sacudir para cobrir, assentar 3 minutos e descartar. Incubar as placas por 2 horas. Com a ajuda de uma caixa de luz e um amplificador, contar as placas em cada placa. A titulação de vírus é calculadas usando a seguinte fórmula: Titulação de vírus (pfu/mL) = # de placas x diluição viral EXEMPLO 5 Infecção de células Sf9 para produção de Fator C recombinante em culturas livre de soro Células Sf9 de alta disponibilidade são usadas (por exemplo, dispon-i bí 1 idade 95-100% cm condições livres de soro) . Cultivar células Sf9 da fase log a uma densidade de célula entre 1,5 x 106 e 2,5 x 106 células por mL em cultura de suspensão. A produção do Fator C recombinante também pode ser realizada infetando-se células Sf9 crescida em cultura de monocamada. Determinar a densidade e disponibilidade de células. Diluir células Sf9 com InsectXPRESS fresco a 1,5 x 106 células por mL. Adicionar estoque de alta titulação de baculovirus recombinante à cultura de Sf9, a um MOI de (ví-rus/célula), como se segue: Volume de inóculo HTS (mL) = (Total de células/mL) x (Volume Total de cultura) x (MOI) / (Titulação de Vírus em pfu/mL) Colher o sobrenadante da cultura setenta e duas horas pós-infecção. Transferir a cultura de célula para garrafas centrífugas estéreis e centrifugar a 2.000 rpm por 10 minutos a 4 °C. Coletar o sobrenadante em um recipiente es- téril e descartar a pelota de célula. Filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,45 pm em um recipiente estéril. Filtrar ainda mais o sobrenadante através de um filtro de 0,2 pm estéril em um recipiente estéril. Este sobrenadante da cultura, que contém Fator C recombinante, pode ser armazenado a 4 °C por até um ano, e pode ser usado diretamente para formar um reagente para detecção de endotoxina de acordo com a presente invenção. EXEMPLO 6 Cultura e subcultura de células Sf9 em meio livre de soro Células Sf9 crescem, a 27 °C sem CC2. Aej_açãu máxima é preferida. Se garrafas de cultura giratórias forem usadas, folgar as tampas de rosca laterais para aumentar a ae-ração. Células Sf9 adaptadas para crescer em u meio livre de soro devem ser subeutivadas em intervalos de 4-5 dias com base em uma rotina. A subcultura a 5,0 x 105 células/mL em um frasco giratório ou de sacudida de 250 mL que contém 100 mL de meio com tampas folgadas para proporcionar máxima aeração. Agitar a cultura a 90-100 rpm. A disponibilidade de células deve ser acima de 90%.

Remover culturas de 4-5 dias do incubador a 27 °C e escovar com álcool 70%. Retirar uma alíquota de suspensão de célula para determinar a viabilidade de células e a contagem de células total com uso de corante tipan azul. Determinar a diluição de células necessária para obter 5 x 105 células/mL. Turbilhonar o frasco da cultura estoque diversas vezes e remover o volume apropriado de suspensão de célula com base no cálculo. Inocular um novo frasco giratório de 250 mL que contém meio fresco pré-aquecido o suficiente necessário para constituir o volume de cultura final a 100 mL. Colocar as culturas de volta no incubador. Ajustar a velocidade de agitação a 90-100 rpm. EXEMPLO 7 Criopreservação de culturas livres de soro de células Sf9 Crescer células tanto em uma monocamada como em suspensão. Colher as células na fase semi-log de crescimento (cerca de 2 dias) a rma disponibilidade ^30%. Manter o meio condicionado em gelo e filtro estéril.

Determinar a disponibilidade de células usando o método de exclusão de corante azul tripan. Calcular o volume necessário de meio de criopreservação (7,5% DMSO em 50% de meio ICCM livre de soro fresco e 50% de meio condicionado; esterilizar com filtro) para render uma densidade final de 1-2 x 107 células/mL. Manter a mistura de criopreservação em gelo. Nesse ínterim, centrifugar as células a partir da suspensão por 3 minutos a 800 rpm/500 x g. Descartar a amostra, se um lote de células estiver não-pelotizada e no sobrenadante.

Suspender novamente a pelota de células no volume determinado da mistura de criopreservação resfriada para obter 1-2 x 107 células/mL. Dispensar rapidamente alíquotas de 1-1,5 mL de suspensão de células em crioviais. Resfriar as células a -70 a -90 °C por 4 horas na fase gasosa superior de nitrogênio líquido. Mergulhar os viais em nitrogênio lí- quido. EXEMPLO 8 Recuperação de células Sf9 livres de soro criopre- servadas Descongelar o vial por agitação rápida em banho de água a 37 °C até que derreta. Remover o vial do banho de á-gua e esfregar com isopropanol 70% estéril. Abrir o vial, remover os conteúdos do vial em um tubo centrífugo estéril de tamanho apropriado; e diluir a suspensão de células com 5 volumes de meio InsectXPRESS (ou equivalente) que foi equilibrado em 27 °C ±2 °C em um incubador. Centrifugar a suspensão diluída a 13 5 x G por 10 minutos. Descai.Lar o fluido e suspender novamente as células em um volume de meio de cultura igual ao do meio descartado. Determinar a contagem e disponibilidade de células. Ajustar a densidade de células disponíveis entre 2 x 105 células por mL e 3 x 105 células por mL usando meio livre de soro. Transferir o frasco em um incubador a 27 °C ±2 °C em uma batedor de plataforma rotativa ajustado para sacudir continuamente e a 100-125 revoluções por minuto. Quando a contagem de células disponíveis da cultura dobrar a pelo menos cada 26 horas, a cultura pode ser expandida da maneira descrita no exemplo 6. EXEMPLO 9 Adaptação de células Sf9 à cultura de suspensão Seis a dez frascos T de monocamada de 75 cm2 con-fluentes de células Sf9 são necessários para iniciar uma cultura de suspensão de 100 mL. Desalojar as células da base dos frascos mantendo um frasco em uma mão e derramá-lo con- tra a palma da outra mão. Formar um poço de suspensão de células e realizar uma contagem de disponibilidade.

Diluir a suspensão de células a aproximadamente 5 x 105 células viáveis/mL à temperatura ambiente usando meio de crescimento suplementado por soro ou livre de soro contido em um frasco giratório de 250 mL. O topo da lâmina agitadora pode ficar ligeiramente acima da suspensão de células. Isto fornece aeração adicional. As tampas dos braços laterais deve ser bambeada em um quarto de volta.

Incubar as células a 2 7 °C a uma taxa de agitação constante de 100 rpm. Subcultivar quando a contagem de células disponív^i .9 atingir 1 2 x 1C6 células/mL (3-7 dias pós-semeadura) , aumentar a velocidade de agitação em 5 rpm por passagem até que a disponibilidade da cultura seja >80%. Repetir até que uma velocidade de agitação de 100 rpm seja alcançada para o frasco giratório ou 130-140 rpm seja alcançada para as culturas do frasco batedor. Neste ponto, reduzir a densidade de semeadura para 3 x 105 células/mL durante a subcultura.

Se blocos grandes de células persistirem (por e-xemplo, >10 células por blocos), deixar o frasco giratório-batedor ficar 2-3 minutos sem agitação antes de subcultivar. Isto permite que blocos grandes sedimentem na base. Formar um poço do terço superior das células em suspensão para contagem e semear em novas culturas. Este procedimento seleciona uma população de células que crescem como células simples. Pode ser necessário repetir esta etapa 2-3 vezes até que a formação do bloco seja reduzida. EXEMPLO 10 Efeito de diferentes detergentes e de diferentes concentrações de detergentes no ensaio de Fator C recombi-nante Materiais e métodos Os reagentes seguintes foram comprados dos fabricantes indicados: Zwittergent 3-14 (Calbiochem, Cat# 693017) , Tween 20 (ICN, Cat# 194841) , Tween 80 (ICN, Cat# 194842), Triton X-114 (ICN, Cat# 193971), n-Octil-beta-D-tioglicopiranosida (OTG, Amresco, Cat# J575) e Triton X-100 (ICN, Cat# 194854) . O ensaio do Fator C recombinante (rFC) foi real ί 7^Ηη com uso de 20 pL dc cada detergente (cipxox. 10 X a concentração final) , 150 pL de 1 EU/mL EC-6, 10 pL de sobrenadante rFC 0219011, 20 pL de 300 mM Tris, pH 8,0 e 20 pL de 0,55 mM de substrato de DPR-cumarina. Os resultados do ensaio foram lidos a 38 °C usando uma leitora Cytofluor a-justada a 390/440 nm, 5 minutos por ciclo, por 1 hora. Os dados foram colocados em gráfico depois de 30 minutos.

Resultados Conforme mostrado nas figuras 1-3 e 9-11, baixas concentrações de Zwittergent 3-14, Tween 20, Tween 80, Triton X-114, OTG, Grenapol C-100 e Triton X-100 melhorou o ensaio rFC 2-7 vezes. A faixa de concentração de melhoria para Zwittergent 3-14, Triton X-114, OTG e Triton X-100 é estreita, enquanto que a faixa de concentração de melhoria para Tween 20, Tween 80 e Genapol C-100 é ampla. A tabela 1 sumariza os resultados obtidos com o teste de nove detergentes. Esses detergentes podem ser di- vididos em três grupos: detergentes que têm uma faixa de concentração estreita para melhorar a atividade do Fator C recombinante, detergentes que têm faixa de concentração ampla para melhorar a atividade do Fator C recombinante e detergentes que inibem a atividade do Fator C recombinante.

Tabela 1 0 efeito de melhoria/inibição de Zwittergent 3-14 foi também testado usando Fator C de Limulus purificado (figura 6). Um efeito de melhoria/inibição similar foi observado, embora a relação de atividade do Fator C relativa, as concentração de detergente de melhoria e inibição foram di- ferentes daquelas no ensaio de Fator C recombinante. EXEMPLO 11 Antisera contra Fator C de Limulus Isolamos o Fator C de Limulus e gerou antisera contra a proteína. O lisato de Limulus foi primeiro separado com uma filtração em gel S-100 seguida por coluna de troca de cátion-ion. As frações foram ensaiadas para determinar a atividade do Fator C com uso do substrato de N-t-BOC-Val-Pro-Arg 7-Amido-4-metil cumarina. 0 Fator C de Limulus foi purificado 73 vezes com 80% de homogeneidade, determinada pelo ensaio de enzima e SDS-PAGE. O peso molecular do Fator C de Limulus foi He 117 kDa pelo GDS-FAGE sob condições nao redutoras. 0 baixo SDS-PAGE apresentou duas bandas principais de 79 kDa e 40kDa, correspondentes à cadeia pesada e leve. O seqüenciamento de peptídeo tríptico revelou que a seqüência de Fator C de Limulus combinou de perto com as espécies asiáticas, com >90% de identidade de seqüência. Um anticorpo policlonal específico contra o Fator C de Limulus foi gerado em coelhos. 0 IgG purificado de anti Fator C inibiu a ativação do Fator C pelo LPS, mas não teve nenhum e-feito na atividade de protease uma vez que o Fator C foi a-tivado pelo LPS. 0 Fator C antisera demonstrou a importância desta proteína no reconhecimento inicial de LPS pelo lisato de Limulus. EXEMPLO 12 Aumento na sensitividade na detecção de endotoxina na presença de agente tensoativo Foi realizado um ensaio de ponto final de 1 hora de uma etapa. Endotoxina 055:B5, 0,01, 0,1 1 e 10 EU/mL foi usado para a curva padrão. Padrões de branco e endotoxina (100 pL cada) foram adicionados a uma placa de 96 orifícios. O sobrenadante do Fator C recombinante, tampão de ensaio (150 mM de NaCl, 150 mM Tris, pH 8,0 e 1,5% de lactose, com ou sem 0,0125% de Zwittergent) e solução do substrato (0,2 mM em água) foram misturados em proporções de 1:4:5. Esta mistura foi adicionada em cada padrão branco e endotoxina. A fluorescência foi registrada no tempo zero e tempo 1 hora. A diferença de fluorescências foi (delta fluorescência) foi normalizada como o branco. A delta fluorescência normalizada foi então colocada em gráficc contra a concenLi-ação de endotoxina em uma escala log-log. Cada ponto de dados é o resultado de ensaios em duplicata.

Os resultados estão mostrados na figura 7. A sen-sitividade de detecção de endotoxina aumentou 10 vezes, quando o agente tensoativo foi incluído. EXEMPLO 13 Ensaio de endotoxina de uma etapa Um ensaio de endotoxina de uma etapa pode ser realizado em uma placa de 96 orifícios, usando 100 pL cada de padrões de branco e endotoxina. Cem microlitros de uma mistura de sobrenadante de Fator C recombinante (meio de cultura de células Sf9 infectado por Baculovius), tampão (150 mM Tri, pH 8,0, 150 mM de NaCl, 1,5% beta-lactose e 0,0125% de Zwittergent 3-14) e substrato fluorogênico (DPR-cumarina, 0,2 mM) a uma proporção de 1:4:5 são adicionados aos orifícios da placa. A placa é incubada a 37 °C por 1 hora. Exci- tação e emissão são lidas a 390 e 440 nm, respectivamente, em uma leitora de microplaca de fluorescência.

Os resultados de um ensaio de endotoxina do Fator C recombinante de uma etapa estão mostrados na figura 8.

Claims (14)

1. Reagente para aumentar a sensibilidade da detecção de endotoxina enzimática CARACTERIZADO por compreender : uma proteína do Fator C do caranguejo ferradura feita por um método de cultura de uma célula hospedeira Sf9 compreendendo um vetor que codifica a proteína do Fator C em um sobrenadante sob condições tais que a proteína do Fator C seja expressa no sobrenadante; e um agente tensoativo.

2. Reagente, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o caranguejo ferradura é Car-cinoscorpius rotundicauda.

3. Reagente, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente tensoativo é selecionado do grupo que consiste em ZWITTERGENT 3-14, Triton X-100, Triton X-114, octil-beta-D-tioglucosídeo, Genapol C-100, Tween 20 e Tween 80.

4. Método de detectar endotoxina em uma amostra teste CARACTERIZADO por compreender as etapas de: colocar em contato uma amostra teste com (1) o reagente, conforme definido na reivindicação 1, e (2) um substrato do Fator C do caranguejo ferradura feito por um método de cultura de uma célula hospedeira Sf9 compreendendo um vetor que codifica a proteína do Fator C em um sobrenadante sob condições tais que a proteína do Fator C seja expressa no sobrenadante para formar uma mistura de amostra de teste-reagente-substrato; em que a divagem do substrato do Fator C gera um sinal detectável; e ensaiar a mistura de amostra de teste-reagente-substrato para verificar a presença ou ausência do sinal detectável, em que a quantidade do sinal detectável que é aumentado em relação a uma amostra de controle que não contém endotoxina indica uma presença de endotoxina na amostra teste .

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o caranguejo ferradura é Car-nicoscorpius rotundicauda.

6. Método, de acordo com a reivindicações 3 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente tensoativo é selecionado do grupo que consiste em ZWITTERGENT 3-14, Triton X-100, Triton X-114, octil-beta-D-tioglucosideo, Genapol C-100, Tween 20 e Tween 80.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato do Fator C é selecionado do grupo que consiste em N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-Amido-4-metil cumarina e N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-Amido-4-metil cumarina.

8. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO por compreender as etapas de: colocar uma amostra teste em contato com: (1) um reagente compreendendo (a) um agente tensoativo em uma quantidade que aumenta a sensitividade de uma reação de detecção de endotoxina enzimática em relação ao reagente contendo a proteína do Fator C de caranguejo ferradura purificado mas que não compreende o agente tensoativo e (b) uma proteína do Fator C de Carcinoscorpius rotundicauda recombinante, em que a proteína do Fator C é feita pelo método de cultivar uma célula hospedeira Sf9 compreendendo um vetor que codifica a proteína do Fator C em um sobrenadante sob condições tais que a proteína do Fator C seja expressa no sobrenadante em que a proteína do Fator C é enzimaticamente ativa na presença do aqente tensoativo; e (2) N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arq-7-Amido-4-metil cumarina para formar uma mistura de amostra de teste-reaqente-substrato; e ensaiar a mistura de amostra de teste-reaqente-substrato para verificar a presença ou ausência de um sinal fluorescente, em que a quantidade de sinal fluorescente que é aumentado em relação a uma amostra de controle que não contém endotoxina indica a presença de endotoxina na amostra teste.

9. Kit para detectar endotoxina CARACTERIZADO por compreender: um reaqente conforme definido na reivindicação 1; e instruções para realizar o método conforme definido na reivindicação 4.

10. Kit, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO por compreender ainda um substrato do Fator C, em que a clivaqem do substrato do Fator C qera um sinal de-tectável.

11. Kit, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato do Fator C é selecionado do qrupo que consiste em N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro- Arg-7-Amido-4-metil cumarina e N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-Amido-4-metil cumarina.

12. Kit, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o Fator C purificado é feito pelo método de cultivar uma célula hospedeira Sf9 compreendendo um vetor que codifica a proteína do Fator C em um so-brenadante sob condições tais que a proteína do Fator C seja expressa no sobrenadante.

13.

Reagente, de acordo com a reivndicação 1, CARACTERIZADO por compreender: uma proteína recombinante do Fator C de Carcinos-corpius rotundicauda purificado; e ZWITTERGENT 3-14; em que a proteína do Fator C de Carcinoscorpius rotundicauda é enzimaticamente ativa na presença de ZWITTERGENT 3-14 e em que ZWITTERGENT 3-14 está presente em uma quantidade a qual aumenta a sensibilidade da reação de detecção da endotoxina enzimática em relação ao reagente contendo a proteína recombinante do Fator C de Carcinoscorpius rotundicauda purificado mas que não compreende ZWITTERGENT 3-14.