ES2348594T3 - Cultivo, congelación y ensayo in situ de celulas cultivadas. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la detección de al menos un parásito intracelular en una muestra, que comprende las etapas de: a) proporcionar: ES 2 348 594 T3 i) un tubo Shell-Vial que contiene un cultivo celular continuo, en el que el cultivo celular comprende una monocapa de células sobre un cubreobjetos, en el que dicho vial se ha congelado y descongelado in situ, y ii) una muestra sospechosa de contener al menos un parásito intracelular; b) añadir dicha muestra a dicho cultivo celular para producir un cultivo inoculado; c) incubar dicho cultivo inoculado en condiciones tales que dicho parásito intracelular infecte dichas células de dicho cultivo celular para producir un cultivo infectado; y d) detectar la presencia de dicho parásito intracelular dentro de las células de dicho cultivo infectado, en el que dicha detección comprende la observación de: i) efectos citopáticos que comprenden cambios en la estructura celular, ii) fluorescencia que comprende cambios en las características de emisión de compuestos cromogénicos o iii) colores que comprenden cambios en las características de absorción de luz de compuestos cromogénicos.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se define en las reivindicaciones y proporciona procedimientos y composiciones para el cultivo, congelación y ensayo in situ de células cultivadas. En particular, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones para la conservación a largo plazo de células en formatos de ensayo listos para usar. Además, la presente invención proporciona medios rápidos y fáciles de usar para diagnosticar infecciones víricas y de otro tipo. Además, la presente invención proporciona medios fáciles de usar para cultivar y almacenar células in situ para procedimientos de ensayo. De hecho, la presente invención hace que procedimientos de diagnóstico de virus, clamidias y otros organismos sean accesibles para laboratorios pequeños, incluyendo aquellos sin posibilidades de cultivo de células. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Puesto que los parásitos intracelulares (por ejemplo, virus y Chlamydia) requieren células vivas para replicarse, el diagnóstico de una infección debida a estos organismos depende del uso de animales (por ejemplo, ratones lactantes), huevos embrionados o cultivos celulares. Como los cultivos celulares son mucho menos costosos y es más fácil trabajar con ellos que con animales o huevos embrionados, los cultivos celulares han sido durante mucho tiempo el pilar de los procedimientos de diagnóstico para parásitos intracelulares y virus en particular. De hecho, los cultivos celulares son la base sobre la que se construye un laboratorio de virología. Estos cultivos pueden producirse en el propio laboratorio a partir de tejidos u órganos animales o, más comúnmente, adquirirse de proveedores comerciales.

Independientemente de su procedencia, los cultivos celulares deben mantenerse a lo largo del tiempo para asegurar un suministro en todo momento de células para cultivo y diagnóstico de infecciones causadas por parásitos intracelulares. Por ejemplo, Smith y colaboradores (Smith y col., JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 29, nº 3, páginas 463-465) desvelan la detección de VRS en secreciones nasofaringeas por la técnica de centrifugación y cultivo Shell-Vial. En el laboratorio, las células de mamífero se congelan de forma rutinaria para minimizar las oportunidades de contaminación de los cultivos, evitar errores de manipulación que podrían dar como resultado la pérdida del cultivo y minimizar el número de líneas celulares que deben manipularse diariamente. Las reservas de cultivos celulares congelados también son útiles para minimizar la deriva genética y el desplazamiento genético, la senescencia y los cambios fenotípicos indeseables que pueden producirse cuando se cultivan líneas celulares continuas y finitas durante periodos de tiempo prolongados.

Se han desarrollado procedimientos de congelación para minimizar el impacto del choque osmótico y la formación de cristales de hielo intracelulares, dos factores que contribuyen a la pérdida de viabilidad celular durante la congelación. Se usan comúnmente crioprotectores tales como glicerol y dimetilsulfóxido (DMSO) para ayudar a prevenir la muerte celular durante la congelación. Además del uso de crioprotectores, los procedimientos tradicionales usan un enfriamiento lento (de aproximadamente 1 ºC por minuto) hasta que las células alcanzan una temperatura de -25 ºC. Una vez que se alcanza esta temperatura, las células pueden enfriarse rápidamente hasta -70 ºC o -196 ºC (es decir, la temperatura del nitrógeno líquido) sin una pérdida adicional de viabilidad celular. La omisión del crioprotector o la congelación rápida causan la formación de cristales de hielo intracelulares que pueden romper las membranas celulares y dar como resultado muerte celular. Ralentizando el enfriamiento de las células, el medio externo se vuelve superenfriado y se forman núcleos de cristales de hielo en el líquido extracelular. Esto da como resultado un entorno extracelular que contiene un gradiente salino elevado artificialmente que, a su vez, causa un gradiente osmótico. Este gradiente provoca que el agua difunda hacia fuera de las células y que los crioprotectores no electrolíticos difundan hacia las células. Esta “deshidratación” de las células tiende a minimizar el choque osmótico y la formación de cristales de hielo intracelulares. (Véase, por ejemplo, Wiedbrauk y Johnston, “Mammalina Cell Culture Procedures, en Manual of Clinical Virology, páginas 33-44 [Raven Press, Nueva York, 1993] para una descripción de estos acontecimientos).

La fabricación y el uso de células crioconservadas se conoce a partir de la técnica anterior, véase, por ejemplo, Ohno y col., CYTOTECHNOLOGY, vol. 5, 1991, páginas 273277, documentos US-A-5 925 511 y Watts y col., HUMAN TOXICOLOGY, vol. 15, nº 1, 1996, páginas 30-37.

Sin embargo, los procedimientos de congelación usados comúnmente requieren equipamiento y entrenamiento especializado. Además, se usan típicamente productos químicos peligrosos tales como DMSO. Además, la descongelación de las células congeladas mantenidas en nitrógeno líquido representa riesgos tales como la explosión de los viales o tubos, así como el peligro de pérdida de viabilidad celular debido a una manipulación inapropiada (por ejemplo, una descongelación lenta más que rápida). Una vez que se han descongelado las células, el medio de congelación debe retirarse y las células deben aclararse y el cultivo revivirse antes de su uso para el cultivo y/o detección de parásitos intracelulares. Una vez revividos, los cultivos se ponen con frecuencia en formatos adecuados para la detección e identificación de virus, incluyendo placas multipocillo (por ejemplo, placas de microtitulación), tubos y portaobjetos. Por lo tanto, los cultivos deben transferirse desde su matraz de cultivo a estos otros formatos antes de su uso. Esto requiere un equipo adicional y tiempo de personal antes del uso de los cultivos según se desee. Se requieren cultivos celulares y procedimientos que sean fáciles de usar, que estén fácilmente disponibles, particularmente en formatos listos para usar, cuyo uso requiera escaso tiempo y/o experiencia por parte del operario y que sean fiables.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se define en las reivindicaciones y proporciona procedimientos y composiciones para el cultivo, congelación y ensayo in situ de células cultivadas. En particular, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones para la conservación a largo plazo de células en formatos de ensayo listos para usar. Además, la presente invención proporciona medios rápidos y fáciles de usar para diagnosticar infecciones víricas y de otro tipo. Además, la presente invención proporciona medios fáciles de usar para cultivar y almacenar células in situ para procedimientos de ensayo. De hecho, la presente invención hace que los procedimientos de diagnóstico de virus, clamidias y otros organismos sean accesibles para laboratorios pequeños, incluyendo aquellos sin posibilidades de cultivo de células.

La presente invención proporciona procedimientos para la detección de parásitos intracelulares en una muestra de acuerdo con la reivindicación 1. En algunas realizaciones, el sustrato es un cubreobjetos de vidrio. En otras realizaciones preferidas más, el sustrato de plástico es el pocillo de una placa multipocillo. En algunas realizaciones, el parásito intracelular se selecciona del grupo que consiste en virus y bacterias.

En algunas realizaciones, la observación comprende una observación para determinar la presencia de un efecto citopático, mientras que en otras realizaciones, la observación comprende una observación para determinar la presencia de células fluorescentes. En otras realizaciones más, la observación comprende una observación para determinar la presencia de células azules. En algunas realizaciones preferidas, se realizan múltiples observaciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la observación para determinar el efecto citopático se combina con la observación para determinar células fluorescentes y/o la observación para determinar células azules. Como se describe en el presente documento, en realizaciones preferidas, la observación para determinar células fluorescentes se efectúa usando anticuerpos marcados que reconocen un antígeno (por ejemplo, viral o bacteriano) presente en el cultivo (es decir, debido a la infección de las células por el virus o virus y/o bacterias). Sin embargo, no se pretende limitar la presente invención a ningún producto de fluorescencia, sustrato, enzima o color particular. De hecho, se pretende que múltiples anticuerpos y marcadores de fluorescencia encuentren utilidad en algunas realizaciones de la presente invención. Por ejemplo, se contempla que las células de la presente invención se ensayen usando múltiples preparaciones de anticuerpos con marcadores fluorescentes diferentes. Además, no se pretende limitar la presente invención a anticuerpos marcados fluorescentemente, ya que otros medios de detección encontrarán utilidad en la presente invención. También como se describe en el presente documento, la observación para determinar células azules se asocia con procedimientos de ensayo tales como los que implican el uso de un gen indicador que indica que se está expresando un gen particular. Sin embargo, no se pretende limitar la presente invención a ningún gen, producto, sustrato o color particular. De hecho, se contempla que la presente invención encuentre utilidad con múltiples genes, productos, sustratos y/o colores (es decir, se usarán múltiples genes indicadores). Además, en algunas realizaciones particularmente preferidas, el uso de un marcador o marcadores fluorescentes se combina con un procedimiento o procedimientos enzimáticos.

La presente invención también se refiere a procedimientos para la detección de una toxina en una muestra, que comprenden las etapas de proporcionar un cultivo celular que comprende células, en los que el cultivo celular se ha congelado y descongelado in situ en un sustrato, y una muestra sospechosa de contener al menos una toxina; añadir la muestra al cultivo celular para producir un cultivo inoculado; incubar el cultivo inoculado para producir un cultivo intoxicado; observar el cultivo intoxicado para determinar la presencia de un efecto citopático en las células del cultivo celular. En algunas realizaciones, el sustrato se selecciona del grupo que consiste en vidrio y plástico, por ejemplo, el vidrio es un cubreobjetos de vidrio. Por ejemplo, la toxina es una toxina de Clostridium, por ejemplo, la toxina es una toxina de Clostridium difficile. La presente invención también se refiere a la detección de diversas otras toxinas, incluyendo, pero sin limitación, verotoxinas, micotoxinas y otras toxinas de interés, en particular las que causan enfermedad y/o cambios patológicos en un huésped tras la exposición a la toxina. Además, la presente invención se refiere al uso en la detección y/o identificación de múltiples toxinas presentes en una sola muestra. La toxina o toxinas se identificarán y/o detectarán usando procedimientos distintos de la observación y caracterización del efecto citopático. Por lo tanto, la presente invención se refiere a la detección y/o identificación de toxinas usando cualquier procedimiento adecuado, incluyendo, pero sin limitación, el uso de anticuerpos, análogos de sustrato de toxina, genes indicadores, etc.

La presente invención también proporciona procedimientos para la producción de cultivos celulares congelados listos para usar de acuerdo con la reivindicación 2. En algunos un cubreobjetos de vidrio y, en realizaciones particularmente preferidas, el cubreobjetos de vidrio se pone en un tubo Shell-Vial antes de la congelación de la monocapa. La presente invención también proporciona composiciones que comprenden una monocapa de células producida de

acuerdo con estos procedimientos.

La presente invención también proporciona procedimientos para la detección de parásitos intracelulares en una muestra de acuerdo con la reivindicación 7. En algunas realizaciones, el parásito intracelular se selecciona del grupo que consiste en virus y bacterias.

En algunas realizaciones, la observación comprende una observación para determinar la presencia de efecto citopático, mientras que en otras realizaciones, la observación comprende una observación para determinar la presencia de células fluorescentes. En otras realizaciones más, la observación comprende una observación para determinar la presencia de células azules. En algunas realizaciones preferidas, se realizan múltiples observaciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la observación para determinar el efecto citopático se combina con la observación para determinar células fluorescentes y/o la observación para determinar células azules. Como se describe en el presente documento, en realizaciones preferidas, la observación para determinar células fluorescentes se efectúa usando anticuerpos marcados que reconocen un antígeno (por ejemplo, viral o bacteriano) presente en el cultivo (es decir, debido a la infección de las células por los virus y/o bacterias). Sin embargo, no se pretende limitar la presente invención a ningún producto de fluorescencia, sustrato, enzima o color particular. De hecho, se pretende que múltiples anticuerpos y marcadores de fluorescencia encuentren utilidad en algunas realizaciones de la presente invención. Por ejemplo, se contempla que las células de la presente invención se ensayen usando múltiples preparaciones de anticuerpos con marcadores fluorescentes diferentes. Además, no se pretende limitar la presente invención a anticuerpos marcados fluorescentemente, ya que otros medios de detección encontrarán utilidad en la presente invención. También como se describe en el presente documento, la observación para determinar células azules se asocia con procedimientos de ensayo tales como los que implican el uso de un gen indicador que indica que se está expresando un gen particular. Sin embargo, no se pretende limitar la presente invención a ningún gen, producto, sustrato o color particular. De hecho, se contempla que la presente invención encuentre utilidad con múltiples genes, productos, sustratos y/o colores (es decir, se usarán múltiples genes indicadores). Además, en algunas realizaciones particularmente preferidas, el uso de un marcador o marcadores fluorescentes se combina con un procedimiento o procedimientos enzimáticos.

La presente invención también se refiere a procedimientos para la detección de una toxina en una muestra, que comprenden las etapas de proporcionar una monocapa de células lista para usar, producida como se ha descrito anteriormente, y una muestra sospechosa de contener al menos una toxina; añadir la muestra a la monocapa de células para producir un cultivo inoculado; incubar el cultivo inoculado para producir un cultivo intoxicado; y observar el cultivo intoxicado para determinar la presencia de un efecto citopático en las células de la monocapa de células. Por ejemplo, la toxina es una toxina de Clostridium, por ejemplo, la toxina es una toxina de Clostridium difficile. La presente invención también se refiere a la detección de diversas otras toxinas, incluyendo, pero sin limitación, verotoxinas, micotoxinas y otras toxinas de interés, en particular las que causan enfermedad y/o cambios patológicos en un huésped. Además, la presente invención se refiere al uso en la detección y/o identificación de múltiples toxinas presentes en una sola muestra. La toxina o toxinas se identificarán y/o detectarán usando procedimientos distintos de la observación y caracterización del efecto citopático. Por lo tanto, la presente invención se refiere a la detección y/o identificación de toxinas usando cualquier procedimiento adecuado, incluyendo, pero sin limitación, el uso de anticuerpos, análogos de sustrato de toxina, genes indicadores, etc.

La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un cultivo celular congelado listo para usar adecuado para la detección de sustancias patógenas, en las que las sustancias patógenas se seleccionan del grupo que consiste en parásitos intracelulares y toxinas. Por ejemplo, los parásitos intracelulares se seleccionan del grupo que consiste en virus y bacterias, por ejemplo, las bacterias son miembros del género Chlamydia, la toxina o toxinas comprenden al menos una toxina de Crostridium, por ejemplo, la toxina es una toxina de C. difficile. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se define en las reivindicaciones y proporciona procedimientos y composiciones para el cultivo, congelación y ensayo in situ de células cultivadas. En particular, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones para la conservación a largo plazo de células en formatos de ensayo listos para usar. Además, la presente invención proporciona medios rápidos y fáciles de usar para diagnosticar infecciones víricas y de otro tipo. Además, la presente invención proporciona medios fáciles de usar para cultivar y almacenar células in situ para procedimientos de ensayo. De hecho, la presente invención hace que los procedimientos de diagnóstico de virus, clamidias y otros organismos sean accesibles para laboratorios pequeños, incluyendo aquellos sin posibilidades de cultivo de células.

Los cultivos celulares de la presente invención se congelan en un formato que está listo para el ensayo tras la descongelación de las células. Las células se congelan en cubreobjetos colocados en el interior de viales (es decir, Shell-Vial) de acuerdo con la reivindicación 2. En estas realizaciones, las células se congelan en un sustrato de vidrio sin la necesidad de privación previa de nutrientes o cualquier manipulación especial de las células antes de la congelación. Además, las células no requieren ninguna manipulación especial durante la descongelación o uso. Por lo tanto, la preparación de los cultivos celulares listos para usar puede efectuarse de una forma económica y rentable. Esto es a diferencia de los procedimientos disponibles actualmente que requieren una etapa de privación de nutrientes y/o una recuperación prolongada de las células después de la descongelación (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.935.855). Por lo tanto, la presente invención proporciona células en un formato listo para usar que requiere una manipulación mínima tanto antes de la congelación como después de la descongelación de las monocapas. En las realizaciones de Shell-Vial de la reivindicación 2, las células están unidas a un cubreobjetos.

Esto significa que un laboratorio puede obtener cultivos celulares congelados en un formato deseado para ensayo, mantener los cultivos en el congelador hasta que sean necesarios y, después, inocular los cultivos descongelados según sea necesario. Por lo tanto, el laboratorio no tiene que tener ni la capacidad ni los fondos disponibles para mantener un servicio de cultivo celular. Por ejemplo, las células en el formato listo para usar de la presente invención que son útiles en el diagnóstico de infecciones víricas (por ejemplo, virus respiratorios, herpes, etc.) pueden retirarse del congelador, descongelarse, inocularse y la respuesta respecto a la presencia o ausencia de virus determinarse en cuestión de horas o unos pocos días. Además, estas células congeladas pueden usarse para detectar otros parásitos intracelulares (por ejemplo, Chlamydia), así como la presencia de toxinas microbianas (por ejemplo, toxinas producidas por diversas especies de Clostridium).

Proporcionando cultivos celulares en un formato listo para usar, se evita la necesidad de que el operario (es decir, el microbiólogo o tecnólogo) transfiera células de matraces de cultivo a portaobjetos, placas multipocillo o tubos Shell-Vial. Además, la presente invención evita la necesidad de usar cabinas e instalaciones de cultivo celular. De hecho, el uso de tubos Shell-Vial en realizaciones particularmente preferidas minimiza la necesidad de un entrenamiento avanzado en procedimientos virológicos, así como la necesidad de incubadores especiales (por ejemplo, incubadores de CO2 usados comúnmente con cultivos celulares) y el espacio necesario para realizar los ensayos. La inoculación, incubación, tinción y evaluación de tubos Shell-Vial es relativamente sencilla. (Véase, por ejemplo, D. Leland, “Modified Virus Isolation Systems”, en Clinical Virology, W. B. Sauders Co., Filadelfia, PA [1996], en las páginas 79-90). Aunque los viales requieren un soporte de centrífuga especial y un dispositivo para retirar fácilmente los cubreobjetos del fondo de los tubos Shell-Vial, los costes relativos y los inconvenientes son pequeños en comparación con los requisitos de un laboratorio de cultivo celular típico. Además, el uso de tubos Shell-Vial puede acortar significativamente los tiempos necesarios para realizar un diagnóstico y reduce las posibilidades de contaminación y/o deterioro de las células en comparación con procedimientos de cultivo celular tradicionales.

Por lo tanto, la presente invención hace que la virología sea accesible para laboratorios que no estén equipados o no tengan experiencia con cultivos celulares.

Definiciones

Los términos “muestra” y “espécimen” en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones se usan en su sentido más amplio. Por un lado, pretenden incluir un espécimen o cultivo. Por otro lado, pretenden incluir muestras tanto biológicas como ambientales. Estos términos incluyen todos los tipos de muestras obtenidas a partir de seres humanos y otros animales, incluyendo, pero sin limitación, fluidos corporales tales como orina, sangre, materia fecal, líquido cefalorraquídeo (LCR), semen, esputo y saliva, así como tejido sólido. Estos términos también se refieren a hisopos y otros dispositivos de muestreo que se usan comúnmente para obtener muestras para cultivo de microorganismos.

Las muestras biológicas pueden ser de animales, incluyendo seres humanos, fluidos o tejidos, productos alimenticios e ingredientes tales como productos lácteos, vegetales, carne y subproductos de la carne y deshechos. Las muestras ambientales incluyen material ambiental tal como materia superficial, tierra, agua y muestras industriales, así como muestras obtenidas de instrumentos, aparatos, equipo, artículos desechables y no desechables, del procesamiento de alimentos y productos lácteos. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes de los tipos de muestra aplicables a la presente invención.

El que una muestra, ya sea biológica o ambiental, sospechosa de contener microorganismos pueda (o no) someterse primero a un enriquecimiento significa crear un “cultivo puro” de microorganismos. Por “medios de enriquecimiento” o “tratamiento de enriquecimiento”, la presente invención contempla (i) técnicas convencionales para aislar un microorganismo particular de interés lejos de otros microorganismos por medio de cualquier medio y/o técnica de cultivo y (ii) nuevas técnicas para aislar microorganismos particulares lejos de otros microorganismos. No se pretende que la presente invención se limite sólo a una etapa de enriquecimiento o tipo de medio de enriquecimiento. Por ejemplo, dentro del alcance de la presente invención se incluye, después de someter una muestra a un medio de enriquecimiento convencional, someter la preparación resultante a una purificación adicional de modo que se produzca un cultivo puro de una cepa de una especie de interés. Este cultivo puro puede analizarse después por los medios y procedimientos de la presente invención.

Como se usa en el presente documento, los términos “organismo” y “microorganismo” se usan para referirse a cualquier especie o tipo de microorganismo incluyendo, pero sin limitación, virus y bacterias, incluyendo rickettsias y clamidias. Por lo tanto, el término incluye, pero sin limitación, virus de ADN y ARN, así como organismo incluidos en los órdenes Rickettsiales y Chlamydiales.

Como se usa en el presente documento, el término “cultivo”, se refiere a cualquier muestra o espécimen que se sospeche que contiene uno o más microorganismos. Los “cultivos puros” son cultivos en los que los organismos presentes son sólo de una cepa de un género y especie particular. Esto es al contrario que los “cultivos mixtos”, que son cultivos en los que está presente más de un género y/o especie de microorganismo.

Como se usa en el presente documento, la expresión “tipo celular” se refiere a cualquier célula, independientemente de su procedencia o características.

Como se usa en el presente documento, la expresión “línea celular” se refiere a células que se cultivan in vitro, incluyendo líneas celulares primarias, líneas celulares finitas, líneas celulares continuas y líneas celulares transformadas.

Como se usan en el presente documento, las expresiones “cultivo de células primarias” y “cultivo primario” se refieren a cultivos celulares que se han obtenido directamente de un tejido animal o de insecto. Estos cultivos pueden proceder de adultos, así como de tejido fetal.

Como se usa en el presente documento, la expresión “líneas celulares finitas” se refieren a cultivos celulares que son capaces de un número limitado de duplicaciones de población antes de la senescencia.

Como se usa en el presente documento, la expresión “líneas celulares continuas” se refiere a cultivos celulares que han experimentado una fase de “crisis” durante la que una población de células en una línea celular primaria o finita aparentemente deja de crecer, pero aún así surge una población de células con las características generales de un tamaño celular reducido, una mayor velocidad de crecimiento, una eficacia de clonación superior, una oncogenicidad aumentada y una dotación cromosómica variable. Estas células son el resultado con frecuencia de una transformación espontánea in vitro. Estas células tienen una esperanza de vida indefinida.

Como se usa en el presente documento, la expresión “líneas celulares transformadas” se refiere a cultivos celulares que se han transformado en líneas celulares continuas con las características que se han descrito anteriormente. Las líneas celulares transformadas pueden obtenerse directamente de tejido tumoral y también por transformación in vitro de las células con virus completo (por ejemplo, VS40 o VEB) o fragmentos de ADN derivados de un virus transformante usando sistemas de vector.

Como se usa en el presente documento, el término “hibridomas” se refiere a células producidas por fusión de dos tipos celulares entre sí. Los hibridomas usados comúnmente incluyen los generados por fusión de células B secretoras de anticuerpos de un animal inmunizado con una línea celular de mieloma maligno capaz de un crecimiento indefinido in vitro. Estas células se clonan y se usan para preparar anticuerpos monoclonales.

Como se usa en el presente documento, la expresión “cultivo celular mixto” se refiere a una mezcla de dos tipos de células. En algunas realizaciones preferidas, las células son líneas celulares que no están modificadas por ingeniería genética, mientras que en otras realizaciones preferidas las células son líneas celulares modificadas por ingeniería genética. En algunas realizaciones, el uno o más tipos celulares son re-"permisivos” (es decir, un virus es capaz de replicarse y propagarse de una célula a otra dentro del cultivo). La presente invención incluye cualquier combinación de tipos celulares adecuados para la detección, identificación y/o cuantificación de virus en muestras, incluyendo cultivos celulares mixtos, en los que todos los tipos celulares usados no están modificados por ingeniería genética, mezclas en las que uno o más de los tipos celulares están modificados por ingeniería genética y los tipos celulares restantes no están modificados por ingeniería genética y mezclas en las que todos los tipos celulares están modificados por ingeniería genética.

Como se usa en el presente documento, la expresión “adecuado para la detección de parásitos intracelulares” se refiere a cultivos celulares que pueden usarse con éxito para detectar la presencia de un parásito intracelular en una muestra. En realizaciones preferidas, los cultivos celulares son capaces de mantener su susceptibilidad a infección y/o servir de soporte a la replicación del parásito intracelular. No se pretende limitar la presente invención a un tipo celular o parásito intracelular particular.

Como se usa en el presente documento, la expresión “susceptible de infección” se refiere a la capacidad de una célula para infectarse con un virus u otro organismo intracelular. Aunque incluye infecciones “permisivas”, no se pretende limitar así el término, ya que se pretende que el término incluya circunstancias en las que una célula se infecta pero el organismo no necesariamente se replica y/o propaga a partir de la célula infectada a otras células. La expresión “proliferación viral”, como se usa en el presente documento, describe la propagación o pase de virus infeccioso desde un tipo celular permisivo a células adicionales de un carácter permisivo o susceptible.

Como se usa en el presente documento, el término “toxina” se refiere a cualquier sustancia (habitualmente una proteína o proteína conjugada) que es perjudicial (es decir, venenosa) para células y/o organismos. Por ejemplo, el término se refiere a toxinas extracelulares producidas por diversas especies bacterianas, incluyendo, pero sin limitación, los miembros del género Clostridium. De hecho, se permite que el término incluya toxinas producidas por cualquier organismo.

Como se usan en el presente documento, las expresiones “monocapa”, “cultivo en monocapa” y “cultivo celular en monocapa” se refieren a células que se han adherido a un sustrato y crecen como una capa que tiene un espesor de una célula. Las monocapas pueden cultivarse en cualquier formato incluyendo, pero sin limitación, matraces, tubos, cubreobjetos, pocillos de placas de microtitulación, frascos rotatorios, etc. Las células también pueden crecer unidas a microportadores, incluyendo, pero sin limitación, perlas. En realizaciones particularmente preferidas, las monocapas de la presente invención se cultivan en cubreobjetos colocados en el interior de tubos Shell-Vial.

Como se usa en el presente documento, las expresiones “suspensión” y “cultivo en suspensión” se refieren a células que sobreviven y proliferan sin estar unidas a un sustrato. Los cultivos en suspensión se producen típicamente usando células hematopoyéticas, líneas celulares transformadas y células de tumores malignos.

Como se usan en el presente documento, las expresiones “medio de cultivo” y “medio de cultivo celular” se refieren a medios que son adecuados para servir de soporte al crecimiento de células in vitro (es decir, cultivos celulares). No se pretende que el término se limite a ningún medio de cultivo particular. Por ejemplo, se pretende que la definición incluya medios de crecimiento superior al normal, así como de mantenimiento. De hecho, se pretende que el término incluya cualquier medio de cultivo adecuado para el cultivo de los cultivos celulares de interés.

Como se usa en el presente documento, la expresión “parásito intracelular obligado” (u “organismo intracelular obligado”) se refiere a cualquier organismo que requiere un entorno intracelular para su supervivencia y/o replicación. Los parásitos intracelulares obligados incluyen virus, así como muchos otros organismos, incluyendo determinadas bacterias (por ejemplo, la mayoría de los miembros de los órdenes Rickettsiales [por ejemplo, Coxiella, Rickettsia y Ehrlichia]y Chlamydiales [por ejemplo, C. trachomatis, C. psittaci], etc.). La expresión “parásito intracelular” se refiere a cualquier organismo que puede encontrarse en el interior de las células de un animal huésped incluyendo, pero sin limitación, parásitos intracelulares obligados descritos brevemente anteriormente. Por ejemplo, los parásitos intracelulares incluyen organismos tales como Brucella, Listeria, Mycobacterium (por ejemplo,

M. tuberculosis y M. leprae)y Plasmodium, así como Rochalimea.

Como se usa en el presente documento, el término “antimicrobiano” se usa en referencia a cualquier compuesto que inhiba el crecimiento de o destruya microorganismos. Se pretende que el término se use en su sentido más amplio e incluye, pero sin limitación, compuestos tales como antibióticos que se producen de forma natural o sintética. También se pretende que el término incluya compuestos y elementos que sean útiles para inhibir el crecimiento de o destruir microorganismos.

Los términos “confluente” o “confluencia”, como se usan en el presente documento en referencia a una línea celular adherente, definen un estado en la que las células por todo un cultivo están en contacto entre sí creando lo que parece ser una lámina continua o “monocapa” de células.

Las expresiones “efecto citopático” o “ECP”, como se usan en el presente documento, describen cambios en la estructura celular (es decir, un efecto patológico) que son el resultado de agentes externos tales como virus y/o toxinas. Los efectos citopáticos comunes incluyen destrucción de células, formación de sincitios (es decir, células gigantes fusionadas), redondeo celular, formación de vacuolas y formación de cuerpos de inclusión. El ECP es el resultado de las acciones de un virus sobre células permisivas que afectan negativamente a la capacidad del huésped celular permisivo para realizar sus funciones necesarias para continuar siendo viable. En sistemas de cultivo celular in vitro, el ECP es evidente cuando las células, como parte de una monocapa confluente, muestran regiones de no confluencia después del contacto con un espécimen que contenga un virus. El efecto microscópico observado generalmente es focal por naturaleza y los focos se inician por un solo virión. Sin embargo, dependiendo de la carga viral de la muestra, puede observarse un ECP por toda la monocapa después de un periodo de incubación suficiente. Las células que demuestran ECP inducido por virus habitualmente cambian de morfología a una forma redondeada, y durante un periodo de tiempo prolongado pueden morir y liberarse de sus puntos de anclaje en la monocapa. Cuando muchas células alcanzan el punto de destrucción focal, el área se denomina placa viral, que aparece como un hueco en la monocapa. Los efectos citopáticos son fácilmente apreciables y distinguibles por los expertos en la materia.

Como se usa en el presente documento, el término “sustrato” se refiere a un soporte físico al que son capaces de unirse células para producir una monocapa. Se usan plásticos como sustratos para la producción y mantenimiento de monocapas, aunque en realizaciones preferidas se usan cubreobjetos de vidrio como sustrato.

Como se usa en el presente documento, el término “vidrio” se refiere al material usado comúnmente. En particular, el término se refiere a materiales duros, quebradizos, con frecuencia transparentes o translúcidos, que se producen fusionando silicatos con sosa o potasa, cal y, en algunos casos, diversos óxidos metálicos. En realizaciones particularmente preferidas de la invención, se usa vidrio tipo 2. Sin embargo, no se pretende limitar la presente invención a ningún tipo o fórmula de vidrio particular.

El término “multipocillo” se refiere a cualquier dispositivo que tiene múltiples pocillos. Estas placas multipocillo incluyen, pero sin limitación, placas de dos, cuatro, ocho, 16, 24 y 48 pocillos usados comúnmente en procedimientos de cultivo de células, así como placas de microtitulación (por ejemplo, placas de 96 pocillos) y otros formatos de placa adecuados. No se pretende que la presente invención se limite a ninguna placa o número de pocillos particular.

De hecho, se contempla que diversas placas multipocillo encontrarán utilidad en la presente invención.

La abreviatura “ONPG”, representa o-Nitrofenil-β-D-Galactopiranósido. El ONPG es un sustrato para la enzima β-galactosidasa (β-gal). La reacción entre ONPG y β-gal produce un producto amarillo que puede cuantificarse espectrofotométricamente a 405 nm.

La abreviatura “X-gal” representa el compuesto químico 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-Dgalactopiranósido o un sustrato para la enzima β-galactosidasa. La reacción entre X-gal y βgalactosidasa da como resultado la formación de un precipitado azul que es visualmente apreciable.

El término “hybriwix” representa un producto de Diagnostic Hybrids, Inc., Athens, Ohio que permite la cuantificación de cierto ADN viral en una monocapa de células infectada por hibridación de ADN. La “hibridación de ADN” es la hibridación de dos moléculas de ADN complementarias cuyas secuencias de bases coinciden de acuerdo con las normas del emparejamiento de bases. La hibridación de ADN se usa para identificar o cuantificar un ADN “diana” o desconocido por hibridación con un ADN o “sonda” conocido. La sonda está típicamente marcada con una molécula indicadora tal como 125I, un radioisótopo que puede detectarse y cuantificarse con un contador gamma.

La expresión “ensayo de reducción de placas” o “ERP”, como se usa en el presente documento, describe un procedimiento convencional usado para determinar la eficacia de fármacos antivirales por enumeración de una disminución en la formación de placas en una monocapa de células expuesta a un fármaco. Una “placa” es un área definida de “ECP”. Habitualmente es el resultado de la infección de la monocapa celular con un solo virus infeccioso que después se replica y se propaga a células adyacentes de la monocapa. Una placa también puede denominarse “foco de infección vírica”.

El término “permisivo”, como se usa en el presente documento, describe la secuencia de acontecimientos interactivos entre un virus y su supuesta célula huésped. El procedimiento comienza con la adsorción viral a la superficie de la célula huésped y termina con la liberación de viriones infecciosos. Una célula es “permisiva” si permite fácilmente la propagación del virus a otras células. Están disponibles muchos procedimientos para la determinación de la permisividad de una línea celular dada, incluyendo, pero sin limitación, ensayos de reducción de placas, comparaciones de la producción y/o cuantificación de proteínas víricas basándose en resultados obtenidos a partir de electroforesis en gel, comparaciones relativas usando análisis de hibridación para analizar contenido de ADN o ARN, etc.

El término “susceptible”, como se usa en el presente documento, describe el grado en que una célula huésped permisiva o no permisiva puede adsorber y permitir la penetración de un virus. Una línea celular puede ser susceptible sin ser permisiva en el sentido de que puede permitir la penetración de viriones pero no liberarlos. Sin embargo, una línea celular permisiva debe ser susceptible.

La expresión “sembrar sobre”, como se usa en el presente documento, describe el acto de transferir una solución acuosa de células suspendidas a un recipiente que contiene células adheridas a una superficie, después de lo cual el recipiente se almacena durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que las células suspendidas o “semillas” se asienten por gravedad y se unan de una forma relativamente uniforme a las células adheridas y se integren en la monocapa de células final como una mezcla. Un “monocapa celular mixta” es el resultado del procedimiento de “sembrado sobre”.

La expresión “sembrar en”, como se usa en el presente documento, describe la mezcla de dos o más soluciones acuosas de células de cultivo tisular suspendidas, teniendo cada suspensión celular diferentes propiedades celulares, y la transferencia de dicha mezcla de células a un recipiente que se almacena durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que las células suspendidas se asienten por gravedad y se unan de una forma relativamente uniforme de modo que la distribución de cualquier tipo celular individual sea indicativa de la proporción relativa de las células en la mezcla original.

Como se usan en el presente documento, las expresiones “compuesto cromogénico” y “sustrato cromogénico” se refieren a cualquier compuesto útil en sistemas de detección por sus características de absorción o emisión de luz. Las expresiones pretenden incluir cualquier producto de escisión enzimática, soluble así como insoluble, que sea detectable visualmente o con maquinaria óptica. En la designación de “cromogénico” se incluyen todos los sustratos enzimáticos que producen un producto final que es detectable como un cambio de color. Esto incluye, pero sin limitación, cualquier color, como se usa en el sentido tradicional de “colores”, tal como añil, azul, rojo, amarillo, verde, naranja, marrón, etc., así como compuestos fluorocrómicos o fluorogénicos que producen colores detectables con fluorescencia (por ejemplo, el amarillo-verde de la fluoresceína, el rojo de la rodamina, etc.). Se pretende que otros indicadores de este tipo como colorantes (por ejemplo, pH) y compuestos luminogénicos se incluyan en esta definición.

Como se usa en el presente documento, se pretende el significado usado comúnmente de las expresiones “indicador de pH”, “indicador redox” e “indicador de oxidación-reducción”. Por lo tanto, la expresión “indicador de pH” incluye todos los compuestos usados comúnmente para la detección de cambios de pH, incluyendo, pero sin limitación, rojo fenol, rojo neutro, azul de bromotimol, púrpura de bromocresol, verde de bromocresol, azul de bromoclorofenol, púrpura de m-cresol, azul de timol, púrpura de bromocresol, azul de xilenol, rojo de metilo, naranja de metilo y rojo de cresol. Las expresiones “indicador redox” e “indicador de oxidación-reducción” incluyen todos los compuestos usados comúnmente para la detección de potenciales de oxidación/reducción (es decir, “eH”) incluyendo, pero sin limitación, diversos tipos o formas de tetrazolio, resazurina y azul de metileno.

Como se usa en el presente documento, la expresión “suspensión de inoculación” o “inóculo” se usa en referencia a una suspensión que puede inocularse con los organismos a ensayar. No se pretende que la expresión “suspensión de inoculación” se limite a una sustancia líquida o fluido particular. Por ejemplo, las suspensiones de inoculación pueden estar compuestas por agua, solución salina o una solución acuosa. También se contempla que una suspensión de inoculación pueda incluir un componente al que se añade agua, solución salina

o cualquier material acuoso. Se contempla en una realización que el componente comprende al menos un componente útil para el microorganismo deseado. No se pretende que la presente invención se limite a un componente particular.

Como se usa en el presente documento, el término “kit” se usa en referencia a una combinación de reactivos y otros materiales.

Como se usa en el presente documento, la expresión “aislamiento primario” se refiere al procedimiento de cultivo de organismos directamente a partir de una muestra. Como se usa en el presente documento, el término “aislamiento” se refiere a cualquier cultivo de organismos, independientemente de que sea un aislamiento primario o cualquier cultivo posterior, incluyendo el “pase” o “transferencia” de cultivos de reserva de organismos para su mantenimiento y/o uso.

Como se usa en el presente documento, la expresión “diagnóstico presunto” se refiere a un diagnóstico preliminar que proporciona algunas directrices al médico que lo trata en lo que se refiere al organismo etiológico implicado en la enfermedad del paciente. Los diagnósticos presuntos se basan con frecuencia en “identificaciones presuntas”, que como se usan en el presente documento se refieren a la identificación preliminar de un microorganismo.

Como se usa en el presente documento, la expresión “diagnóstico definitivo” se usa para referirse a un diagnóstico final en el que se ha identificado el agente etiológico de la enfermedad del paciente. La expresión “identificación definitiva” se usa en referencia a la identificación final de un organismo a nivel de género y/o especie.

La expresión “molécula de ADN recombinante”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ADN que está compuesta por segmentos de ADN unidos entre sí por medio de técnicas de biología molecular.

Las expresiones “construcción de gen indicador” o “vector de gen indicador”, como se usan en el presente documento, se refieren a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia que codifica el producto de un gen indicador y secuencias de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, potenciadores, y señales de terminación y poliadenilación.

La expresión “gen indicador” se refiere a un oligonucleótido que tiene una secuencia que codifica un producto génico (típicamente una enzima) que puede ensayarse fácilmente y de forma cuantificable cuando una construcción que comprende la secuencia del gen indicador unida operativamente a un elemento promotor y/o potenciador heterólogo se introduce en células que contienen (o que puede hacerse que contengan) los factores necesarios para la activación de los elementos promotores y/o potenciadores. Los ejemplos de genes indicadores incluyen, pero sin limitación, genes bacterianos que codifican β-galactosidasa (lacZ), los genes de la cloranfenicol acetiltransferasa (cat) bacteriana, genes de luciferasa de luciérnaga y genes que codifican β-glucuronidasa (GUS).

La expresión “línea celular modificada por ingeniería genética” se refiere a una línea celular que contiene ADN heterólogo introducido en la línea celular por medio de técnicas de biología molecular (es decir, tecnología de ADN recombinante).

La expresión “transfección estable” o “transfectado de forma estable” se refiere a la introducción e integración de ADN extraño en el genoma de la célula transfectada. La expresión “transfectante estable” se refiere a una célula que ha integrado de forma estable ADN extraño en el ADN genómico.

La expresión “transfección estable” (o “transfectado de forma estable”) se refiere a la introducción o integración de ADN extraño en el genoma de la célula transfectada. La expresión “transfectante estable” se refiere a una célula que ha integrado de forma estable ADN extraño en el ADN genómico.

La expresión “marcador de selección”, como se usa en el presente documento, se refiere al uso de un gen que codifica una actividad enzimática que confiere resistencia a un antibiótico o fármaco en la célula en la que se expresa el marcador de selección. Los marcadores de selección pueden ser “dominantes”; un marcador de selección dominante codifica una actividad enzimática que puede detectarse en cualquier línea celular de mamífero. Los ejemplos de marcadores de selección dominantes incluyen el gen de la aminoglucósido 3’ fosfotransferasa bacteriana (también denominado gen neo), que confiere resistencia al fármaco G418 en células de mamífero, el gen de la higromicina G fosfotransferasa (hyg) bacteriana, que confiere resistencia al antibiótico higromicina, y el gen de la xantina-guanina fosforribosil transferasa bacteriana (también denominado gen gpt), que confiere la capacidad de crecer en presencia de ácido micofenólico. Otros marcadores de selección no son dominantes en el sentido de que su uso debe ser junto con una línea celular que carezca de la actividad enzimática pertinente. Los ejemplos de marcadores de selección no dominantes incluyen el gen de la timidina quinasa (tk), que se usa junto con líneas celulares tk -, el gen CAD, que se usa junto con células deficientes en CAD y el gen de la hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa (hprt) de mamífero, que se usa junto con líneas celulares hprt-. Una revisión del uso de marcadores de selección en líneas celulares de mamífero se proporciona en Sambrook y col. (Sambrook y col., anteriormente, en las págs.16:9-16.15).

EXPERIMENTAL

Los ejemplos siguientes se proporcionan para demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas realizaciones y aspectos preferidos de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la misma.

En la divulgación experimental siguiente, son aplicables las abreviaturas siguientes: eq (equivalentes); M (Molar); µM (micromolar); N (Normal); mol (moles); mmol (milimoles); µmol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); µg (microgramos); ng (nanogramos); pg (picogramos); l o L (litros); ml (mililitros); µl (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); µm (micrómetros); nm (nanómetros); xg (gravedad en veces); ºC (grados Centrígrados); FBS (suero fetal bovino); PBS (solución salina tamponada con fosfato); HEPES (N-{2-hidroxietil]piperazin-N’-[2-etanosulfónico]); HBSS (Solución Salina Equilibrada de Hank); MEM (Medio Mínimo Esencial); EMEM (Medio Mínimo Esencial de Eagle); DMSO (dimetilsulfóxido); ELVIS® RM (Medio de Sustitución ELVIS®); UFP (unidad formadora de placas); TNTC (demasiado numeroso para un recuento); FITC (isotiocianato de fluoresceína); Lee Laboratories (Lee Laboratories, Grayson, GA); células ELVIS® VHS (sistema inducible de virus unido a enzima); CDT (toxina de Clostridium difficile); Diagnostic Hybrids (Diagnostic Hybrids, Inc., Athens, OH); Promega (Promega, Corporation, Madison, WI); Kimble (Kimble/Kontes, Vineland, NJ); Bellco (Bellco Glass Inc., Vineland, NJ); Costar (Acton, MA); Falcon (Franklin Lakes, NJ); Chemicon (Chemicon, Inc., Temecula, CA); BBL (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD); DIFCO (Difco Laboratories, Detroit, MI);

U.S. Biochemical (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH); Chemicon (Chemicon, Inc., Temecula, CA); Fisher (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.); ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo, Maryland); Bartel’s (Bartel’s, Issaquah, WA); y BioWhittaker (Bio Whittaker, Walkersville, MD).

Las células usadas durante el desarrollo de la presente invención y descritas en los Ejemplos siguientes se obtuvieron de la ATCC, siendo la excepción que las células BGMK y PRMK se obtuvieron de BioWhittaker, y las células MRC-5 se obtuvieron tanto de la ATCC como de Bio Whittaker. Los números de la ATCC de las células están indicados en la Tabla siguiente.

Tabla 1. Líneas Celulares de la ATCC

Línea Celular

Número de la ATCC

BHK/ICP6LacZ-5

CCL-12072

A549

CCL-185

CV-1

CCL-70

HEp-2

CCL-23

hs27

HFF; CRL-1634

Mv1Lu

CCL-64

McCoy

CCL-1696

NCI-H292

CCL-1848

MRC-5

CCL-171

WI-38

CCL-75

Vero

CCL-81

MDCK (NBL-2)

CCL-34

BHK21

CCL-10

HEL299

CCL-137

HeLa

CCL-2

EJEMPLO 1 Cultivo y Congelación de Células R-Mix

5 En este Ejemplo, se describe el cultivo y congelación de R-Mix (Mixed FreshCells ™ de Diagnostic Hybrids) in situ en un cubreobjetos de vidrio colocado en un vial de una dracma (Shell-Vial).

R-Mix es una mezcla de células de pulmón de visón (Mv1Lu) y células de adenocarcinoma humano (A549). Las células se cultivaron por separado hasta la confluencia 10 en matraces de cultivo de células, se trataron con tripsina y se diluyeron en medio de cultivo celular a una densidad óptica (absorbancia a 500 nm) de 0,014 para células A549 y 0,008 para células de pulmón de visón, y después se mezclaron entre sí añadiendo un volumen equivalente de cada suspensión celular. Después, 0,75 ml de esta suspensión celular mixta se transfirieron posteriormente a un vial de vidrio de una dracma estéril (Kimble, vidrio tipo 1 de 15 USP) que contenía un cubreobjetos de vidrio circular estéril (de 12-13 mm de diámetro; Bellco, vidrio tipo 2 de USP). Los viales se almacenaron brevemente sobre una superficie plana a temperatura ambiente para permitir que las células se asentaran uniformemente por gravedad. Una vez que las células se unieron (lo que habitualmente requiere menos de 1 hora), los viales se desplazaron a un incubador a 35-37 ºC para permitir a las células crecer en una monocapa

de células mixta confluente en 3-4 días postsiembra. El medio de cultivo celular se aspiró suavemente del vial de una dracma sin alterar la monocapa de células y se añadieron 0,5 ml de medio de congelación (suero de ternera al 90 %, DMSO al 10 %) vertiendo el medio por el lateral del vial para minimizar la alteración de la lámina de células. No se realizó una etapa de privación de nutrientes. Los viales se transfirieron a una caja de congelación de poliestireno extruido (styrofoam) y la caja se puso en un congelador a -85 ºC hasta su uso.

EJEMPLO 2 Descongelación de Células R-Mix Sobre Cubreobjetos de Vidrio

En este Ejemplo, los experimentos en los que se congelaron cultivos de células R-Mix™ sobre un cubreobjetos de vidrio en un tubo Shell-Vial se recuperaron del congelador y se descongelaron sin perder la viabilidad celular. Los viales se transfirieron desde el congelador de -85 ºC directamente a un baño de agua a 35-37 ºC, en el que el líquido del baño de agua era adecuado para alcanzar el nivel del medio de congelación en el vial. En 3-4 minutos, el medio pasó de congelado a completamente acuoso. Durante este periodo de descongelación, los viales no deberían moverse o empujarse debido a que los “cristales de hielo” formados durante la congelación pueden causar abrasiones en la monocapa si el cristal contacta con la superficie celular a medida que la “fase” cristalina del medio se disuelve. Una vez descongelado, el medio de congelación se retiró por aspiración suave y se usó 1 ml de medio de sustitución RM-03T precalentado (Diagnostic Hybrids) compatible con células R-Mix™ para aclarar las células. Después, este medio se retiró por aspiración suave y se añadió 1 ml adicional de RM-03T. Los cultivos celulares se incubaron durante un tiempo breve (aproximadamente 4 horas), el medio se cambió una vez más (se usó RM-03T) y se inocularon 0,2 ml de cada aislado de virus respiratorio de laboratorio de reserva diluido (influenza A, influenza B, adenovirus, virus respiratorio sincitial [VRS], parainfluenza 1, parainfluenza 2 y parainfluenza 3). Se realizaron diluciones de virus para asegurar inóculos de virus de entre 10 y 10.000 UFP de un virus particular en cualquier vial. El vial R-Mix™ se centrifugó a 700 xg durante 60 min a temperatura ambiente y el vial se puso en el incubador a 35-37 ºC durante 22-24 h o durante más tiempo si era necesario para obtener resultados fiables. Las células se tiñeron con un anticuerpo monoclonal marcado con FITC (Chemicon) dirigido contra los aislados de virus ensayados. EJEMPLO 3 Infección de Cultivos Celulares R-Miximagen1 Congelados y Descongelados

En este Ejemplo, cultivos de células R-Mix™ frescos así como congelados y descongelados preparados como se describe en los Ejemplos 1 y 2 se infectaron con virus respiratorios de reserva (enumerados en la Tabla 2 a continuación) para determinar si las

células eran susceptibles de infección vírica y pueden usarse para el diagnóstico de una infección vírica. Los virus y las cantidades de virus eran variables, basándose en diluciones variadas realizadas sobre cada aislado de virus. Las células se fijaron aspirando primero el medio y añadiendo después 0,25 ml de solución de fijación (acetona al 80 %/agua al 20 %) a 5 cada monocapa. Después de 1-5 minutos de incubación, la solución de fijación se aspiró y se añadieron 0,2 ml del anticuerpo monoclonal marcado con FITC respectivo a las monocapas. Los viales se taparon y se incubaron durante 30 minutos a 35-37 ºC. Los cubreobjetos se retiraron de los tubos Shell-Vial, se aclararon cuidadosamente en agua y se colocaron con las células hacia abajo sobre una gota de medio de montaje de glicerol tamponado en un 10 portaobjetos de vidrio. El número de células fluorescentes en cada monocapa se contó con ayuda de un microscopio fluorescente ajustado para FITC. Los resultados obtenidos después de la fijación y tinción se muestran en la Tabla siguiente. Estos experimentos se realizaron por duplicado. Cuando el número de organismos usado era grande, la designación “TNTC” se usa en la Tabla para indicar que se contaron cinco campos microscópicos para cada uno de dos

15 cubreobjetos; se indica también un recuento promedio por campo. En esta Tabla, el “campo” se basa en 100X aumentos. Los valores obtenidos para las células congeladas/descongeladas se compararon con los obtenidos con las células frescas (es decir, el patrón de referencia).

Tabla 2. Comparación de Frescas y Congeladas/Descongeladas

Cultivos R-Mix™ para el Cultivo/Detección de Virus Respiratorios

Virus

Frescas (No Congeladas) Congeladas/Descongeladas

Influenza A

TNTC (aprox. 21/campo) TNTC (aprox. 40/campo)

Influenza B

22, 26 38, 50

Adenovirus

25, 18 25, 50

Virus Respiratorio Sincitial

10, 10 2, 10

Parainfluenza 1

237, 238 442, 400

Parainfluenza 2

TNTC (aprox. 16/campo) TNTC (aprox. 14/campo)

Parainfluenza 3

Aprox. 10/campo Aprox. 25/campo

20 Es evidente a partir de la Tabla anterior que en todos los casos, la preparación congelada/descongelada de R-Mix™ era sustancialmente equivalente a las preparaciones de células frescas no congeladas de R-Mix™, en la detección del panel de virus respiratorios usados en estos experimentos.

25 EJEMPLO 4 Cultivo y Congelación de Células ELVIS® VHS

En este Ejemplo, se ensayó el cultivo, congelación y uso de células ELVIS® VHS (Diagnostic Hybrids). Estas células se cultivaron in situ sobre un cubreobjetos de vidrio colocado en un vial de 1 dracma (es decir, Shell-Vial). Se cultivaron células ELVIS® VHS (células BHK/ICP6LacZ) hasta la confluencia en matraces de cultivo celular, se trataron con tripsina y se diluyeron en medio de cultivo de células hasta una densidad óptica (absorbancia a 500 nm) de 0,034. Después, se transfirieron 0,75 ml de esta suspensión celular a un vial de vidrio de una dracma estéril (Kimble, vidrio [borosilicato] tipo 1 de USP) que contenía un cubreobjetos de vidrio circular estéril (de 12-13 mm de diámetro; Bellco, vidrio [sosa cal] tipo 2 de USP). Los viales se almacenaron brevemente sobre una superficie plana a temperatura ambiente para permitir que las células se asentaran uniformemente por gravedad. Una vez que las células se unieron (lo que requería habitualmente menos de 1 hora), los viales se desplazaron a un incubador a 35-37 ºC para permitir a las células crecer en una monocapa de células confluente en 3-4 días postsiembra. El medio de cultivo celular se aspiró suavemente del vial de una dracma sin alterar la monocapa de células y se añadieron cuidadosamente 0,5 ml de medio de congelación (suero de ternera al 90 %, DMSO al 10 %) por el lateral del vial para minimizar la alteración de la lámina de células. No era necesaria una etapa de privación de nutrientes. Los viales se transfirieron a una caja de congelación de poliestireno extruido (styrofoam) y el paquete se puso en un congelador a -85 ºC para su almacenamiento hasta su uso. EJEMPLO 5 Descongelación y Ensayo de Células ELVIS® VHS sobre Cubreobjetos de Vidrio

En este Ejemplo, se descongelaron y ensayaron cultivos de células ELVIS® VHS congelados sobre cubreobjetos de vidrio en tubos Shell-Vial. Los viales que contenían cultivos celulares ELVIS® VHS congelados sobre cubreobjetos de vidrio preparados como se describe en el Ejemplo 4 se recuperaron del congelador a -85 ºC y se transfirieron directamente a un baño de agua a 35-37 ºC con un nivel de agua suficiente para alcanzar el nivel del medio de congelación en el vial. En 3-4 minutos, el medio pasó de congelado a completamente acuoso. Durante este periodo de descongelación, los viales no se movieron o empujaron debido a que el “cristal de hielo” puede causar abrasiones en la monocapa si el cristal contacta con la superficie celular a medida que la “fase” cristalina del medio se disuelve. Una vez descongelado, el medio de congelación se retiró por aspiración suave y se usó 1 ml de medio de sustitución precalentado RM ELVIS® (Diagnostic Hybrids) compatible con células ELVIS® VHS para aclarar las células. El medio se retiró por aspiración suave y se añadió 1 ml adicional de RM ELVIS® fresco. Se diluyeron reservas de virus de laboratorio de VHS-1 y VHS-2 (obtenidos originariamente a partir de aislados de especímenes) hasta aproximadamente 250 UFP/ml y se usaron inmediatamente 0,2 ml de estas diluciones para inocular las células (es decir, a diferencia de las células R-Mix que requerían una incubación de 4 horas de las células antes de la inoculación con virus).

El vial de ELVIS® VHS inoculado se centrifugó a 700 xg durante 60 min a temperatura ambiente y el vial se puso en el incubador a 35-37 ºC durante al menos 22-24 horas. Las células se tiñeron para inducción específica por herpes del gen indicador β-galactosidasa introducido por ingeniería genética en estas células patentadas usando un Kit de Tinción de ELVIS® VHS (Diagnostic Hybrids). Se inspeccionaron las monocapas de células para células ELVIS® VHS con tinción azul positivas usando un microscopio óptico invertido con un aumento total de 100X. También pueden usarse anticuerpos monoclonales dirigidos contra tipos específicos de virus herpes en el tampón de tinción o posterior a la tinción para el gen indicador β-galactosidasa. Los resultados se describen en el Ejemplo 6 a continuación. EJEMPLO 6 Infección de Cultivos de Células ELVIS® VHS Congelados y Descongelados

En este Ejemplos, células ELVIS® VHS congeladas y descongeladas, así como de control (es decir, frescas) se infectaron con cultivos de reserva de laboratorio de virus herpes (VHS-1 y VHS-2), como se ha descrito en el Ejemplo 5 anterior. Estos experimentos se realizaron por triplicado. Las células se ensayaron usando el Kit de Ensayo de ID/Tipado de ELVIS® VHS (Diagnostic Hybrids). En resumen, después del periodo de incubación (véase el Ejemplo 5) el medio se aspiró cuidadosamente de los viales y se añadieron 0,25 ml de solución de fijación (acetona al 80 %/agua al 20 %) a las monocapas. Después de 1-5 minutos de fijación, la solución de fijación se aspiró cuidadosamente y se añadieron 0,25 ml de Solución 2 (que contiene x-gal, dos anticuerpos monoclonales marcados con FITC dirigidos contra VHS-2 y dos anticuerpos monoclonales sin marcar dirigidos contra VHS-1) a cada monocapa. Después, las monocapas se incubaron durante 60 minutos. Después de este periodo de incubación, las monocapas se examinaron para determinar la presencia de células azules (es decir, las infectadas por VHS). A continuación, los cubreobjetos se retiraron cuidadosamente de los tubos Shell-Vial, se aclararon en agua y se pusieron con las células hacia abajo sobre una gota de medio de montaje de glicerol tamponado y se examinaron para determinar las células fluorescentes.

Durante la incubación de la Solución 2 con la monocapa infectada con VHS, el x-gal se hidrolizó por la β-galactosidasa inducida por VHS para formar un precipitado azul en el interior de las células. Las células azules pueden detectarse usando un microscopio óptico y la fluorescencia puede detectarse usando un microscopio de fluorescencia. Por lo tanto, las células infectadas con VHS-2 se reconocen por los anticuerpos monoclonales marcados con

FITC contra VHS-2; estas células aparecen azules y son fluorescentes. Sin embargo, si las células se infectan con VHS-1, se observan células azules pero no se detectará fluorescencia cuando las células se examinen bajo un microscopio fluorescente, ya que las células serán reconocidas por los anticuerpos monoclonales sin marcar dirigidos contra VHS-1. Para 5 visualizar la unión de VHS-1 y estos anticuerpos bajo un microscopio fluorescente, las monocapas se trataron con Solución 3 (que contenía anticuerpo de cabra anti-ratón marcado con FITC). Por lo tanto, para confirmar la presencia de VHS-1, los cubre objetos se retiraron del portaobjetos, se aclararon en agua y se pusieron con las células hacia abajo sobre una gota de Solución 3 y se incubaron durante 15 minutos a 35-37 ºC. Después los cubreobjetos se

10 aclararon en agua, se pusieron con las células hacia abajo sobre una gota de glicerol tamponado y se examinaron usando un microscopio fluorescente. Los resultados para tanto células con tinción azul como células fluorescentes con anticuerpos monoclonales específicos de tipo se muestran en la Tabla siguiente.

15 Tabla 3. Infección de Células ELVIS® VHS con VHS

Virus

Número de Células ELVIS® VHS Frescas Positivas Número de Células ELVIS® VHS Congeladas Positivas

Positivas a β-Gal

Positivas a Anticuerpo Positivas a β-Gal Positivas a Anticuerpo

VHS-1

40 ± 4 10 ± 1 81 ± 3 38 ± 8

VHS-2

73 ± 4 58 ± 7 14 ± 1 20 ± 2

Los resultados de la Tabla 3 parecen indicar que las células congeladas/descongeladas

pueden conducir a una mayor demostración de infección, particularmente con VHS-1. Sin

embargo, el hecho de que es necesario que las células se recuperen de una condición

20 estresante puede permitir al virus una ventaja en la infección y replicación en estas células estresadas. Por lo tanto, estas células pueden proporcionar un indicio de mayores niveles de infección a tiempos post-inoculación más tempranos. EJEMPLO 7 Evaluación Clínica de Células ELVIS® VHS Congeladas y Frescas

25 En este Ejemplo, se ensayaron células ELVIS® VHS congeladas y frescas con especímenes clínicos. En estos experimentos, los especímenes clínicos se dividieron (es decir, la muestra se dividió en porciones para su distribución) entre un laboratorio de virología clínica y un laboratorio de microbiología rural pequeño con escasa o ninguna experiencia en cultivo de células de tejidos y/o cultivo de virus. En estos experimentos, el comportamiento de células

30 ELVIS® VHS para la detección rápida de VHS en un laboratorio de virología clínica (LV) DE un hospital universitario usando los formatos fresco (F) y congelado in situ (CIS) se comparó con el comportamiento de células ELVIS® VHS en un laboratorio de microbiología de un hospital pequeño rural (LM) usando sólo el formato CIS más práctico. Estos experimentos mostraban que le uso de la congelación in situ de células ELVIS® VHS es una alternativa práctica para un almacenamiento prologando de células en el propilo laboratorio, haciendo que el ensayo rápido de herpes sea posible en todos los laboratorios de microbiología clínica.

Se cultivaron células ELVIS® VHS hasta monocapas confluentes en cubreobjetos de vidrio en viales de una dracma usando EMEM, FBS al 7 % con pen/estrep (100 unidades de penicilina y estreptomicina 100 µg/ml). Después de retirar este medio de cultivo, se añadieron 0,5 ml de medio de congelación (suero de ternera inactivado por calor al 90 % y DMSO al 10 %) y las células se congelaron a -85 ºC. Después, las células se suministraron en nieve carbónica o se enviaron a los laboratorios a temperatura ambiente para simular prácticas de rutina. Los cultivos CIS se descongelaron rápidamente a 35-37 ºC en un baño de agua. El medio de envío se retiró de todos los cultivos y se sustituyó con 1 ml de medio de cultivo celular (ELVIS® RM; Diagnostic Hybrids).

Se recogieron cincuenta especímenes clínicos de pacientes sospechosos de tener herpes genital, se dividieron en muestras iguales, se congelaron y se suministraron a los sitios de ensayo LV y LM. Cuando las células estaban listas para inocularse, se usaron 0,2 ml de espécimen para su inoculación y todos los cultivos se centrifugaron durante 60 min a 700 xg y se incubaron durante 10-24 h. Las monocapas se fijaron durante 2 min usando 0,25 ml de Solución I de fijación de células (acetona al 80 % en agua; Diagnostic Hybrids) y se tiñeron histoquímicamente durante 60 min a 35-37 ºC para detectar la β-galactosidasa inducida por VHS, una construcción de gen indicador introducida por ingeniería genética en células ELVIS®, usando el Kit de Tinción de ELVIS® VHS (Diagnostic Hybrids), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se observaron las monocapas para determinar las células azules infectadas con VHS con un microscopio óptico a 100x aumentos; posteriormente se tiparon las monocapas positivas a VHS usando anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia específicos de tipo de VHS y microscopía fluorescente. En el LV, se encontró que 25 especímenes eran positivos a VHS (11 VHS-1; 13 VHS-2) y 26 especímenes fueron negativos a VHS en los formatos de ELVIS® tanto F como CIS. No se producía una reducción apreciable en la señal de detección de ELVIS® (es decir número de células azules teñidas) entre los dos formatos de cultivo celular.

Usando el formato CIS solamente, a ciegas, el LM identificó los mismos especímenes como positivos para VHS y negativos para VHS que el LV. Además, la identidad de tipo de cada espécimen positivo para VHS coincide al 100 % entre el LV y el LM. En primer lugar, no se observaron diferencias entre las células ELVIS® VHS proporcionadas frescas o congeladas in situ. Estos datos sugieren que la necesidad de adquirir células cada semana podría sustituirse por una adquisición masiva de células congeladas in situ y listas para su uso inmediato tras una descongelación rápida. En segundo lugar, existía una concordancia del 100 % entre los resultados procedentes de un laboratorio de virología con experiencia y los resultados de un laboratorio de microbiología pequeño que nunca había realizado un ensayo basado en cultivo de células o cultivo de herpes antes de este estudio.

EJEMPLO 8 Cultivo y Congelación de Células ELVIS® VHS in situ en Placas Multipocillo de Poliestireno

En este Ejemplo, se investigó el cultivo y la congelación de células ELVIS® VHS in situ en el interior de pocillos de placas multipocillo de poliestireno. Se cultivaron células ELVIS® VHS hasta la confluencia en matraces de cultivo celular, se trataron con tripsina y se diluyeron en medio EMEM con FBS al 7 % y pen/estrep (penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 µg/ml) a una densidad óptica (absorbancia a 500 nm) de 0,028. Después, 0,75 ml de la suspensión celular se transfirieron posteriormente a pocillos individuales de una placa de 24 pocillos (Costar o Falcon). La placa se almacenó brevemente sobre una superficie plana a temperatura ambiente para permitir que las células se asentaran uniformemente por gravedad. Una vez que las células se unieron (lo que requería habitualmente menos de 1 hora), las placas multipocillo se desplazaron a un incubador de 35-37 ºC con una cámara humidificada y CO2 al 5 % para cultivarlas hasta una monocapa de células confluente en 3-4 días postsiembra. El medio de cultivo celular se aspiró suavemente de cada pocillo sin alterar la monocapa de células y se añadieron cuidadosamente 0,5 ml de medio de congelación (suero de ternera al 90 %, DMSO al 10 %), vertiéndolo por el lateral de cada pocillo para minimizar la alteración de la lámina de células. Se descubrió que no era necesaria una etapa de privación de nutrientes. Los viales se transfirieron a un paquete de congelación de poliestireno extruido (styrofoam) y el paquete se puso en un congelador a -85 ºC hasta su uso. EJEMPLO 9 Descongelación y Ensayo de Células ELVIS® VHS en Placas Multipocillo de Poliestireno

En este Ejemplo, cultivos de células ELVIS® VHS congelados en placas multipocillo preparados como se describe en el Ejemplo 8 se recuperaron del congelador y se descongelaron de la forma siguiente. Las placas se transfirieron del congelador de -85 ºC directamente a un dispositivo de calentamiento en seco ajustado a aproximadamente 35-37 ºC, diseñado para contactar directamente con la superficie de la placa multipocillo fría. En 25 minutos, el medio pasó de congelado a completamente acuoso. Durante este periodo de descongelación, las placas no se movieron o empujaron debido a que los “cristales de hielo” pueden causar abrasiones en la monocapa si el cristal contacta con la superficie celular a medida que la “fase” cristalina del medio se disuelve. Una vez descongelado, el medio de congelación se retiró por aspiración suave y se usó 1 ml de medio de sustitución precalentado ELVIS® RM (Diagnostic Hybrids) para aclarar las células. Este medio se retiró por aspiración suave y se añadió 1 ml adicional de ELVIS® RM. Se inocularon virus de reserva de laboratorio de VHS-1 y VHS-2 (los mismos usados en los Ejemplos anteriores) (0,2 ml de cada uno) inmediatamente (es decir, a diferencia de las células R-Mix, para las que se determinó que para un rendimiento óptimo, era necesaria una incubación de 4 horas antes de la inoculación). Las muestras se incubaron como se ha descrito anteriormente y después se ensayaron como se describe en el Ejemplo 10 a continuación.

EJEMPLO 10 Infección de Cultivos Celulares Multipocillo ELVIS® VHS Frescos y Congelados/Descongelados con Cultivos de Virus Herpes de Reserva de Laboratorio

En este Ejemplo, células ELVIS® VHS congeladas y descongeladas en placas multipocillo preparadas como se describe en los Ejemplo 8 y 9 se inocularon con cultivos de virus herpes para determinar la susceptibilidad de las células a la infección vírica.

Se prepararon diluciones seriadas de dos veces de reservas de laboratorios de VHS-1 y VHS-2 de título conocido y se ensayaron 0,2 ml de cada dilución (500, 250, 125, 67, 33 y 16 UFP/ml) usando células ELVIS® VHS congeladas/descongeladas preparadas en un placa multipocillo y frescas. Además, también se ensayaron células de control (células ELVIS® VHS frescas) en placas multipocillo. Después de la adición de las diluciones de virus a cada sistema de cultivo de células, las placas inoculadas se centrifugaron a 700 xg durante 60 min a temperatura ambiente y se pusieron en el incubador a 35-37 ºC durante al menos 22-24 horas.

Las células se tiñeron para inducción específica de herpes del gen indicador de βgalactosidasa introducido por ingeniería genética presente en estas células patentadas usando un Kit de Tinción de ELVIS® VHS (Diagnostic Hybrids). Se inspeccionaron monocapas de células para determinar las células ELVIS® VHS con tinción azul positivas usando un microscopio óptico invertido con un aumento total de 100X. El número de células teñidas de azul para cada procesamiento (estos ensayos se procesaron por duplicado) se registró en las Tablas a continuación, indicándose el número esperado de células teñidas de azul entre paréntesis. El número esperado de células teñida de azul se basaba en una determinación usando procedimientos de titulación de virus convencionales en células ELVIS® VHS frescas no congeladas.

Tabla 4. Número de Células ELVIS® Congeladas/Descongeladas Positivas

Virus

Dilución (UFP/ml)

500

250 125 67 33 16

VHS-1

95, 106 (100) 60, (50) 60 34, 25 (25) 9, 24 (12) 2, 5 (6) 1,1 (3)

VHS-2

89, 89 (100) 44, 55 (50) 23, 21 (25) 17, 9 (12) 3, 8 (6) 3, 1 (3)

Tabla 5. Número de Células ELVIS® Frescas Positivas

Virus

Dilución (UFP/ml)

500

250 125 67 33 16

VHS-1

58, 53 (100) 16, 32 (50) 11, 8 (25) 7, 6 (12) 0, 3 (6) 0, 2 (3)

VHS-2

116, 131 (100) 59, 52 (50) 30, 27 (25) 15, 14 (12) 5, 9 (6) 2,3 (3)

5

EJEMPLO 11 Cultivo y Congelación de Células Fibroblásticas de Prepucio Humano

En este Ejemplo, se cultivaron y congelaron in situ células fibroblásticas de prepucio humano (HFF; Diagnostic Hybrids) en un cubreobjetos de vidrio colocado en un vial de una 10 dracma (Shell-Vial). Las células HFF se cultivaron hasta la confluencia en matraces de cultivo de células, se trataron con tripsina y se diluyeron en EMEM con FBS al 10 % y gentamicina (10 µg/ml) a una densidad óptica (absorbancia a 500 nm) de 0,020. La suspensión celular se transfirió a un vial de vidrio de una dracma estéril (Kimble, vidrio tipo 1 de USP) que contenía un cubreobjetos de vidrio circular estéril (de 12-13 mm de diámetro; Bellco, vidrio tipo 2 de 15 USP). Los viales se almacenaron brevemente sobre una superficie plana a temperatura ambiente para permitir que las células se asentaran uniformemente por gravedad. Una vez que las células se unieron (lo que requería habitualmente menos de 1 hora) los viales se desplazaron a un incubador a 35-37 ºC y se dejó que crecieran en una monocapa de células confluente (3-4 días). El medio de cultivo celular se aspiró suavemente del vial de una dracma 20 sin alterar la monocapa de células y se añadieron cuidadosamente 0,5 ml de medio de congelación (suero de ternera al 90 %, DMSO al 10 %) vertiéndolo cuidadosamente por el lateral del vial para minimizar la alteración de la lámina de células. Se descubrió que no era necesaria una etapa de privación de nutrientes. Los viales se transfirieron a un paquete de congelación de poliestireno extruido (styrofoam) y el paquete se puso en un congelador a -85

25 ºC hasta su uso.

EJEMPLO 12 Descongelación de Células HFF sobre Cubreobjetos de Vidrio

En este Ejemplo, células HFF preparadas como se describe en el Ejemplo 11 se descongelaron y se ensayaron. Cultivos de células HFF congeladas en tubos Shell-Vial con cubreobjetos de vidrio se recuperaron del congelador y se descongelaron de la forma siguiente. Los viales se transfirieron del congelador de -85 ºC directamente a un baño de agua a 35-37 ºC con un nivel de agua que alcanzaba el nivel del medio de congelación en el vial. En 3-4 minutos, el medio pasó de congelado a completamente acuoso. Durante este periodo de descongelación, los viales no se movieron o empujaron debido a que los “cristales de hielo” pueden causar abrasiones en la monocapa si el cristal contacta con la superficie celular a medida que la “fase” cristalina del medio se disuelve. Una vez descongelado, el medio de congelación se retiró por aspiración suave y se usó 1 ml de medio de sustitución precalentado RM-02 (Diagnostic Hybrids) compatible con células HFF para aclarar las células. Este medio se retiró por aspiración suave y se añadió 1 ml adicional de RM-02. El espécimen (0,2 ml) se inoculó inmediatamente (es decir, a diferencia de las células R-Mix en las que se descubrió que era necesaria una incubación de 4 horas antes de la inoculación). En estos experimentos, las muestras eran toxina de Clostridium difficile (CDT; Lee Laboratories) en combinación con anti-toxina, y anti-toxina en solitario. La anti-toxina usada en estos experimentos se obtuvo de un kit de toxina de C. difficile (Bartel’s). La concentración de CDT variaba de 106 pg/ml a 100 pg/ml en un perfil de dilución seriada de 10 veces. Las muestras se reincubaron después durante hasta 48 horas. Se inspeccionaron las monocapas de células para determinar el aspecto de la citotoxicidad de las muestras no neutralizadas y la inhibición de la citotoxicidad específica de C. difficile en las muestran neutralizadas. Las células tanto frescas (no congeladas) como congeladas/descongeladas eran capaces de detectar (como se indica por

6543

su citotoxicidad) la presencia de CDT no neutralizada a 10pg/ml, 10pg/ml, 10pg/ml, 10pg/ml, 102 pg/ml y 101 pg/ml. Ni las células frescas ni las congeladas/descongeladas eran capaces de detectar citotoxicidad al nivel de 100 pg/ml de CDT.

EJEMPLO 13 Comparación de Cubreobjetos de Vidrio y Viales como Sustratos de Cultivo

En este Ejemplo, se realizaron experimentos preliminares para ensayar cubreobjetos de vidrio y tubos Shell-Vial y se ensayaron para determinar su capacidad relativa para permitir el éxito del cultivo in situ y uso de células congeladas. Estos resultados indicaban que las condiciones que promueven buenos resultados con células sobre cubreobjetos no promueven buenos resultados en tubos Shell-Vial solamente. De hecho, en estos experimentos, se sembraron una amplia diversidad de tipos celulares y células obtenidas de procedencias

humanas y no humanas tanto en tubos Shell-Vial de vidrio + cubreobjetos de vidrio frente a viales de vidrio solamente. Las líneas celulares incluían monocapas de una sola célula, monocapas de líneas celulares mixtas y monocapas de células modificadas por ingeniería genética. Las células se inocularon sobre cubreobjetos y tubos Shell-Vial a concentraciones 5 adecuadas (es decir, para producir una monocapa confluente de aproximadamente 200.000 a

400.000 células) y se incubaron a aproximadamente 35-37 ºC. Los resultados se muestran en la Tabla siguiente. En esta Tabla, “4+” indica que las monocapas estaban en muy buen estado mientras que “3+” indica que las células estaban en buen estado. En algunos casos, se observaron huecos de tamaños variables en la monocapa (es decir, había áreas en las que no 10 estaban presentes células, variando de pequeños huecos en la lámina de monocapa a grandes huecos). En algunos casos, se observaron múltiples huecos en la monocapa. Particularmente, aunque las células ELVIS® VHS en el tubo Shell-Vial no parecían inicialmente muy sanas después de la descongelación, las células se recuperaban y producían una buena monocapa después de la incubación durante una noche. Para los ensayos con células E-Mix A, parece

15 que una línea celular no sobrevivió al procedimiento muy bien. Sin embargo, estos datos se basan en un solo experimento y pueden haber sido un resultado anormal.

Tabla 6. Cultivo de Monocapas de Células en Tubos Shell-Vial Con y Sin Cubreobjetos

Monocapa de

Shell-Vial con Cubreobjetos Shell-Vial Sin Cubreobjetos

Células

Aspecto Post-Descongelación Aspecto Después de Incubación Durante la Noche Aspecto Post-Descongelación Aspecto Después de Incubación Durante la Noche

Mv1Lu

4+ 4+ Huecos pequeños 4+

H292

4+ 4+ 4+ 4+

MRC-5

4+ 4+ Huecos grandes 4+

HEp-2

4+ 4+ 4+ 3+

McCoy

4+ Muchas células muertas 4+ Principalmente células muertas

ELVIS®

4+ 4+ Muchos huecos 4+, recuperadas

MDCK

4+ 4+ 4+ 4+

LLCMK2

4+ Células muriéndose 4+ Células muriéndose

HeLa

4+ Muchas células muriéndose 4+ Muchas células muriéndose

HFF

4+ 4+ 4+ 4+

Monocapa de

Shell-Vial con Cubreobjetos Shell-Vial Sin Cubreobjetos

Células

Aspecto Post-Descongelación Aspecto Después de Incubación Durante la Noche Aspecto Post-Descongelación Aspecto Después de Incubación Durante la Noche

BGMK

4+ Pocas células muertas 4+ Pocas células muertas

A549

4+ 4+ 4+ 4+

H&V Mix (CV1/MRC-5)

4+ 4+ Huecos pequeños 4+

R-Mix

4+ 4 4+ 4

E-Mix A (RD/H292)

4+ Una línea celular en mal estado Huecos Una línea celular en mal estado

E-Mix B (BGMK /A549)

4+ 4+ 4+ 4+

MDCK/ Mv1Lu

4+ 4+ 4+ 4+

EJEMPLO 14 Cultivo y Congelación de Células de Ovario de Hámster Chino con Luciferasa

En este Ejemplo, se ensayaron células CHO/Luc (Diagnostic Hybrids) usando los

5 procedimientos descritos anteriormente para otros tipos celulares. Estas células CHO transfectadas con el receptor de la hormona estimulante de la tiroides humana y el gen indicador luciferasa se cultivaron y congelaron en los pocillos de placas multipocillo de poliestireno.

Se cultivaron células CHO/Luc en placas de 96 pocillos para un nivel de confluencia de

10 un día en medio F-12 de Ham con FBS al 10 % (sin antimicrobianos) (Medio de Cultivo Solución 1 de CHO/Luc; Diagnostic Hybrids). El medio de cultivo celular se retiró y las células se trataron con 80 µl por pocillo de medio de congelación (suero de ternera al 90 %, DMSO al 10 %). Las placas se pusieron en recipientes de poliestireno extruido (styrofoam) en un congelador a -80 ºC hasta su uso.

15 EJEMPLO 15 Descongelación de Células CHO/Luc en Placas Multipocillo de Poliestireno En este Ejemplo, células CHO/Luc preparadas como se describe en el Ejemplo 14 se descongelaron y ensayaron. Las placas que contenían células CHO/Luc congeladas se descongelaron en un incubador a 35-37 ºC durante 10 minutos y después se lavaron dos veces

20 con Medio de Cultivo Solución 1 de CHO (Diagnostic Hybrids). Después, se añadieron 100 µl por pocillo de Solución 1 de CHO a cada pocillo y se dejó que las monocapas se recuperaran durante una noche en un incubador a 35-37 ºC. Después se usaron estas células para identificar pacientes con autoanticuerpos dirigidos contra el receptor de TSH humano.

Las células descongeladas y recuperadas se estimularon durante cuatro horas con 10

5 µl de muestras de IgG (10 mg/ml) que se resuspendieron en una combinación de 90 µl de suero normal. Las células se lisaron con Tampón de Lisis Promega (Promega Corp) y la producción de luciferasa se midió usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Promega (Promega). Además de las células congeladas/descongeladas, también había células de control (frescas). Los resultados se muestran en la Tabla siguiente. En esta Tabla, los

10 resultados se muestran como un porcentaje por encima de un suero combinado normal. Se usó un coeficiente de correlación de 0,62. Se identifica un paciente positivo para autoanticuerpos de receptor de TSH humano cuando el porcentaje de reactividad supera el 130 % del del suero combinado normal. Se terminó que los pacientes 18, 19, 22, 23 y 25 eran positivos en procedimientos que usan células CHO/Luc tanto frescas como

15 congeladas/descongeladas, mientras que el paciente 24 era negativo para autoanticuerpos de TSH usando células CHO/Luc tanto frescas como congeladas/descongeladas. Estos resultados indican que las células CHO/Luc congeladas/descongeladas son adecuadas para su uso en determinaciones de enfermedades autoinmunes tales como la enfermedad de Graves.

20

Tabla 7. Autoanticuerpos contra el Receptor de TSH Humano

Número de Muestra de Paciente

% Congeladas Sobre Normal % Frescas Sobre Normal

18

138 141

19

134 136

22

149 171

23

190 178

24

130 121

25

197 186

EJEMPLO 16 Uso de Células McCoy Congeladas/Descongeladas

En este Ejemplo, se describe el uso de células McCoy congeladas y descongeladas para la detección y diagnóstico de una infección por Chlamydia trachomatis. Se prepararon células McCoy congeladas y descongeladas en tubos Shell-Vial como se ha descrito

anteriormente para otros cultivos celulares. Después de descongelar, el medio se aspiró cuidadosamente de la monocapa y se usaron 0,5 ml de HBSS para aclarar la monocapa. Después, se añadieron 0,2 ml de espécimen (o de control) en Medio de Aislamiento de Chlamydia (EMEM, FBS al 10 %, gentamicina 10 µg/ml, cicloheximida 1 µg/ml y glutamina 2 5 mM) a las monocapas. Los tubos Shell-Vial se centrifugaron durante 60 minutos a 1000 xg. Después, se añadieron 0,8 ml de Medio de Aislamiento de Chlamydia a cada monocapa y se dejó que los cultivos se incubaran durante 2 días a 35-37 ºC. Después, el medio se aspiró y las monocapas se fijaron como se ha descrito en los Ejemplos anteriores. El medio de fijación se aspiró y se añadieron 0,2 ml de un anticuerpo monoclonal (anticuerpo anti-Chlamydia marcado

10 con FITC). Las monocapas se incubaron durante 30 minutos a 35-37 ºC. Los cubreobjetos se retiraron cuidadosamente de los tubos Shell-Vial y se pusieron con las células hacia abajo sobre una gota de medio de montaje de glicerol tamponado en un portaobjetos de microscopio. Después, las células se examinaron para determinar las inclusiones fluorescentes. En resumen, la presente invención proporciona numerosos avances y ventajas sobre la

15 técnica anterior, incluyendo proporcionar un medio simple, rápido, fácil de usar para diagnosticar infecciones víricas y de otro tipo. Además, la presente invención proporciona un medio fácil de usar para cultivar y almacenar células in situ para procedimientos de ensayo. De hecho, la presente invención hace que los procedimientos de diagnóstico de virus, clamidias y otros organismos sean accesibles para laboratorios pequeños, incluyendo aquellos sin

20 posibilidades de cultivo de células. Todas estas ventajas aumentan la velocidad y exactitud de la determinación de resultados de ensayo en el diagnóstico.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para la detección de al menos un parásito intracelular en una muestra, que comprende las etapas de:

   a) proporcionar: i) un tubo Shell-Vial que contiene un cultivo celular continuo, en el que el cultivo celular comprende una monocapa de células sobre un cubreobjetos, en el que dicho vial se ha congelado y descongelado in situ,y ii) una muestra sospechosa de contener al menos un parásito intracelular;

   b) añadir dicha muestra a dicho cultivo celular para producir un cultivo inoculado; c) incubar dicho cultivo inoculado en condiciones tales que dicho parásito intracelular infecte dichas células de dicho cultivo celular para producir un cultivo infectado; y d) detectar la presencia de dicho parásito intracelular dentro de las células de dicho cultivo infectado, en el que dicha detección comprende la observación de:

   i) efectos citopáticos que comprenden cambios en la estructura celular, ii) fluorescencia que comprende cambios en las características de emisión de compuestos cromogénicos o iii) colores que comprenden cambios en las características de absorción de luz de compuestos cromogénicos.
2. 2. Un procedimiento para la producción de un cultivo celular congelado listo para usar, que comprende las etapas de:

   a) proporcionar: i) una línea celular continua y ii) un cubreobjetos colocado dentro de un tubo Shell-Vial;

   b) poner dicha línea celular sobre dicho cubreobjetos, produciéndose una monocapa de células unidas en dicho cubreobjetos; y c) congelar dicho vial para producir un cultivo celular congelado listo para usar, en el que tras la descongelación dicho cultivo celular es capaz de infectarse con al menos un parásito intracelular.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho cubreobjetos se selecciona del grupo que consiste en vidrio y plástico.

4. 4.

   El procedimiento de la reivindicación 2 ó 3, en el que dicho cubreobjetos es un

   cubreobjetos de vidrio.

5. 5.

   El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho cubreobjetos es un cubreobjetos de vidrio que se pone en un tubo Shell-Vial antes de la congelación de dicha monocapa.

6. 6.

   Un cultivo celular congelado listo para usar que comprende una monocapa celular unida a un cubreobjetos, producido de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 2.

7. 7.

   Un procedimiento para la detección de al menos un parásito intracelular en una muestra, que comprende las etapas de:

   a) proporcionar: i) la monocapa de células de la reivindicación 6 y ii) una muestra sospechosa de contener al menos un parásito intracelular;

   b) descongelar dicha monocapa de células; c) añadir dicha muestra a dicha monocapa de células para producir un cultivo inoculado; d) incubar dicho cultivo inoculado en condiciones tales que dicho parásito intracelular infecte dichas células de dicha monocapa de células para producir un cultivo infectado; y e) detectar la presencia de dicho parásito intracelular dentro de las células de dicho cultivo infectado, comprendiendo dicha detección la observación de:

   i) efectos citopáticos que comprenden cambios en la estructura celular, ii) fluorescencia que comprende cambios en las características de emisión de compuestos cromogénicos o iii) colores que comprenden cambios en las características de absorción de luz de compuestos cromogénicos.

8. 8.

   El procedimiento de la reivindicación 1 ó 7, en el que dicho parásito intracelular se selecciona del grupo que consiste en virus y bacterias.

9. 9.

   El procedimiento de la reivindicación 1 ó 7, en el que dicho efecto citopático se selecciona del grupo que consiste en destrucción celular, sincitios, redondeo de células, formación de vacuolas y cuerpos de inclusión.

10. 10.

    El procedimiento de la reivindicación 1 ó 7, en el que dicha fluorescencia comprende células fluorescentes.

11. 11.

    El procedimiento de la reivindicación 1 ó 7, en el que dicho color comprende células azules.