CN103290042A - 内毒素检测及去除关键分子中国鲎c因子克隆和序列分析 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程领域，具体是一种用于内毒素检测和去除的丝氨酸蛋白酶原-中国鲎C因子(Factor C from Tachypleus tridentatus)编码基因的制备方法和序列特异性位点比对分析。具体为具有序列表SEQ ID NO.1中的核酸碱基序列，同时中国鲎C因子基因编码的蛋白具有SEQ ID NO.2中的氨基酸序列。本发明的制备方法包括中国鲎血细胞的总RNA抽提，用RT-PCR(逆转录PCR)的方法得到中国鲎C因子的cDNA，并设计一对引物，用PCR的方法扩增了中国鲎血细胞中编码C因子蛋白的基因序列，并对其核酸、蛋白序列与美国鲎C因子进行了序列特异性位点比对分析。本发明可用于构建中国鲎C因子的表达载体，用于中国鲎C因子重组蛋白的表达。
Description
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体是指中国鲎C因子基因的克隆和序列特异性位点分析。
背景技术：
临床输液反应以热原反应危害最大，发生率最高。内毒素(即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖分子，lipopolysaccharide，LPS)是研究最透彻也是最常见的生物热原，同时更是各大药厂必须面对的难题，因为注射时即使是pg级别的痕量LPS，也会导致病人严重的热原反应。因此，灵敏可靠的内毒素诊断技术是非常必须的。
海鲎的阿米巴样细胞(amoebocytes)对LPS具有超强敏感性，在革兰氏阴性细菌入侵时，它能通过一系列的酶促反应，对外来入侵的细菌产生级联凝集反应，使入侵的微生物失效(1，2)。这一过程(如图1所示)包括酶原状态的C因子(Factor C)识别并结合内毒素而被激活，变成活性酶的状态后，将下游的B因子激活，活化的B因子将凝固酶原转化为凝固酶，凝固酶将凝固蛋白原转化为凝固蛋白，凝固蛋白相互交联脱水而形成凝胶(3，4)。
利用海鲎血液阿米巴样细胞溶解物制成的鲎试剂，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素。自上世纪70年代中期，这一内毒素测试方法开始用于医药领域，并且很快被世界各国广泛采用，中国药典和欧美药典将其定为法定的细菌内毒素检查法。经过几十年的发展和改良，鲎试剂内毒素检测法已应用于制药、医疗器械、非内服制剂、医药制品、生物制剂、水质、食品检测以及科研等各大领域(5)。
目前世界上仅有四种海鲎，即美国鲎(Limulus polyphemus)，中国鲎(Tachypleus tridentatus)，马来鲎(Tachypleus gigas)和圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)。而能够用于鲎试剂生产的仅有美国鲎和中国鲎两种，对应的鲎试剂分别称之为LAL(Limulus amoebocyte lysate)和TAL(Tachypleus Amebocyte Lysate)，二者反应原理及功效相同，但也存在理化特性的差别，如与内毒素反应的最适pH值等(6)。
虽然鲎试剂检测法(LAL/TAL)具有高灵敏度(可检测飞克级内毒素)、快速等优点，但是由于采用成分复杂的细胞裂解物作为反应原料，同样具有无法克服的缺陷。比如，非特异性干扰问题：如图1所示，鲎试剂除了能与内毒素反应外，还会与(1-3)-β-D-葡聚糖反应(1)。(1-3)-β-D-葡聚糖是在真菌、酵母、蘑菇、高等植物中广泛存在的一种多糖，是构成细胞壁的结构大分子。因此鲎试剂检测过程中很容易遇到(1-3)-β-D-葡聚糖的非特异性干扰，造成假阳性结果，这对于成分复杂的药物，尤其是中药，是一个很大的检测挑战(7)。再比如，批次稳定性问题：鲎试剂采用海鲎血液作为生产原料，由于季节、地域等差异，使得鲎试剂的 批次差异成为常见现象。而且，由于环境污染、过度捕捞等原因海鲎的种群数量近年来急剧减少，接近灭绝(8)，使得生产鲎试剂的原材料面临日益匮乏的危险。
鲎试剂的主要成分是一系列的丝氨酸蛋白酶原(9，10)，其中C因子在内毒素检测方法中是关键分子，在内毒素介导的鲎血凝集反应系统中，它特异性识别内毒素，并第一个被内毒素激活，从而启动整个鲎血细胞中的凝集级联反应(11，12)。因此，以鲎试剂的关键分子C因子作为基础，利用其识别并结合内毒素后，由蛋白酶原被激活为活性酶形式，从而能够水解发光底物的特点，结合化学/荧光发光定量技术，可以发展出以C因子作为单一成分的内毒素检测定量技术(13)，与传统的LAL测定技术比较，重组C因子在相同的分析条件下对内毒素具有更低的背景、更高的灵敏度(14)。
基于C因子的内毒素检测技术成分单一，可以使用生物工程技术进行生产和严格的质量控制，从而避免了由原材料引起的批次不稳定性，同时保护了海鲎这一古老的“活化石”物种。尤为重要的是，这一新技术消除了传统鲎试剂对(1-3)-β-D-葡聚糖的非特异性反应，可以大大增强内毒素检测的特异性，降低“假阳性”结果的发生概率。此外，通过与内毒素的特异结合，重组C因子还可以进一步应用于医药产品、生物制品等内毒素去除。综上，用分子生物学手段克隆C因子基因以应用于内毒素检测试剂的产品开发，具有重要的临床意义和巨大的商业价值。
参考文献：
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14.Ding，J.L.，and Ho，B.(2001)Trends Biotechnol 19，277-281
发明内容：
本发明主要是克隆了内毒素识别和去除的关键分子--中国鲎C因子的cDNA，并对其进行了序列特异性位点比对分析。因为鲎试剂的产量及批次稳定性均受原材料海鲎的限制，而且本身固有的非特异性缺陷，使得用分子克隆的方法得到C因子就很有必要。现在的发明主要是通过RT-PCR的方法克隆了中国鲎C因子的cDNA，并对其基因序列和蛋白序列与美国鲎进行了位点特异性分析，为进一步研究、开发中国鲎C因子的内毒素检测技术奠定了基础。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：制备中国鲎C因子基因：具有序列表SEQ IDNO.1中核酸碱基序列。制备中国鲎C因子基因编码的蛋白质具有：具有序列表SEQ ID NO.2中氨基酸序列。
中国鲎FC基因的克隆：通过RNA抽提得到中国鲎C因子的血细胞总RNA；以此总RNA为模板，用合成的单链多聚T引物，通过逆转录反应扩征C因子的总cDNA；以此鲎血细胞总cDNA为模板，以合成的正反向引物，通过聚合酶链式反应，即扩增得到具有序列表EQ ID NO.1中的碱基序列的中国鲎C因子基因。其中采用的引物为：
F：5’-ATG GTC TTA GCG TCG TTT TT-3’
R：5’-AAT GAA CTG CCT AAT CCA TG-3’
通过PCR反应扩增得到具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。
本发明具有以下优点：
1.本发明采用RT-PCR的方法克隆了中国鲎C因子的完整基因序列。
2.本发明对中国鲎C因子的核酸碱基序列及氨基酸序列与美国鲎C因子进行了位点特异
性分析，发现了二者之间存在的多处核酸碱基及氨基酸位点差异。
附图说明：
下面结合附图和实施例对本专利进行进一步说明。
图1是鲎血细胞变形裂解物形成凝胶的原理。内毒素直接激活C因子，从而启动凝集级联反应。虚线箭头表明(1-3)β-葡聚糖也可以激活凝固酶原，引起非特异性反应。
图2是克隆中国鲎C因子基因的流程图。利用RT-PCR的方法经特异性引物扩增后得到全长的C因子基因。
图3是RT-PCR扩增得到的鲎血细胞C因子基因产物的琼脂糖凝胶电泳图，1和2为总cDNA稀释5倍后作为模板扩增后得到的条带；m为核酸分子量标签，自上到下分别为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；3和4为总cDNA稀释10倍后作为模板扩增得到的条带。箭头所指为目的条带。
图4是中国鲎C因子测序后得到的核酸序列(即中国鲎C因子的基因序列)，一共为3057 个碱基。□为与报道的美洲鲎C因子序列有差别的核酸碱基位点。下划线所示分别为与正向和反向引物配对的序列。 图4-1为图4的缩略图。
图5是中国鲎C因子基因的酶切位点分布图谱。
图6是中国鲎C因子的蛋白质序列。□为与报道的美洲鲎C因子序列有差别的氨基酸残基位点。
具体实施方式：
实施方式1抽提中国鲎血细胞的总RNA。
将中国鲎从关节穿刺取血，同时加入10mmol/L咖啡因防止血凝集。在4℃，4000rpm离心10min收集血细胞。鲎血细胞总RNA的抽提如下进行：
1)取细胞沉淀(～60mm dish细胞量)，加入1ml Trizol，室温放置5min，使细胞充分裂解；
2)加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置5min，使其自然分相；
3)4℃，12000rpm离心15min，样品分三层，将上层水相小心吸出300μl转移至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min；
4)4℃，12000rpm离心15min，弃上清，RNA沉淀于管底；
5)往RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇，温和振荡离心管。4℃，12000rpm离心5min，弃上清，短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，室温放置5min，晾干沉淀；
6)加入适量(20μl)RNase Free水，充分溶解RNA；
7)溶解的RNA取2μl稀释20倍后测浓度，测得浓度为195ng/μl，储液为3.9μg/μl，用RNase Free水稀释至2μg/μl，放-70℃保存。
实施方式2逆转录PCR(RT-PCR)得到鲎血细胞的总cDNA。
1)在EP管中配制下列模板RNA/引物混合物
2)70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min；
3)离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于管底；
4)在上述EP管中配制下列反转录反应液：
5)42℃保温1hr；
6)70℃保温15min后冰上冷却，得到的cDNA溶液用于PCR扩增。
实施方式3PCR扩增中国鲎血细胞C因子的DNA序列。
参考相关文献报道的鲎C因子基因序列设计一对特异性引物，以中国鲎血细胞总cDNA为模板，PCR扩增C因子的DNA序列。其中设计的正向引物为5’-ATG GTC TTA GCG TCG TTTTT-3’，设计的反向引物为5’-AAT GAA CTG CCT AAT CCA TG-3’。以反转录得到的cDNA为模板，用Prime Star为聚合酶，进行PCR反应(参见TakaRa公司Prime Star说明书)。50μl体系：
PCR扩增程序如下：
PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：120V电泳30分钟，再80V电泳至溴酚蓝条带至凝胶边缘，停止电泳。凝胶成像，得到的条带大于3kb，小于5kb，为单一条带。将条带割下，用胶回收试剂盒回收(参见生工公司胶回收试剂盒说明书)。PCR条带割胶回收后，合成几条测序引物，进行全长测序。通过PCR扩增后的中国鲎C因子cDNA序列经过分段测序序列拼接，得到全长FC基因序列。
Claims (5)
1.一种中国鲎C因子基因，其特征在于：由SEQ ID NO.1核酸碱基序列表所示，其中序列由3057bp组成。
2.一种按权利要求1中国鲎C因子基因，其特征在于：基因编码的蛋白具有SEQ IDNo.2中氨基酸序列。
3.一种按权利要求1所述的C因子基因的制备方法，其特征在于：
a)通过RNA抽提得到中国鲎C因子的血细胞总RNA：
将中国鲎从关节穿刺取血，同时加入10mmol/L咖啡因防止血凝集；在4℃，4000rpm离心10min收集血细胞；鲎血细胞总RNA的抽提如下进行：取细胞沉淀，加入1mlTrizol，室温放置5min，使细胞充分裂解；加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置5min，使其自然分相；4℃，12000rpm离心15min，样品分三层，将上层水相(300μl)转移至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min；4℃，12000rpm离心15min，弃上清，RNA沉淀于管底；往RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇，温和振荡离心管；4℃，12000rpm离心5min，弃上清，短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，室温放置5min，晾干沉淀；加入适量(20μl)RNase Free水，充分溶解RNA；溶解的RNA取2μl稀释20倍后测浓度，用RNase Free水稀释至2μg/μl；
b)以a中的总RNA为模板，用合成的单链Oligo(dT)引物，通过逆转录反应扩增中国鲎血细胞的总cDNA；
c)以此鲎血细胞总cDNA为模板克隆中国鲎C因子全长基因。
4.按权利要求3所述的中国鲎C因子基因的克隆，其特征在于：
采用引物
F：5’-ATG GTC TTA GCG TCG TTT TT-3’
R：5’-AAT GAA CTG CCT AAT CCA TG-3’
以中国鲎血细胞总cDNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增得到具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。
5.按权利要求4中所述的FC基因的制备方法，其特征在于聚合酶链式反应的PCR体系：
F：100pmol，R：100pmol，dNTP：各50pmol，5×Prime star DNA聚合酶buffer：10μl，Prime star DNA聚合酶：2-5U，无菌水补足50μl；
PCR反应条件：将上述PCR反应体系混匀，第一阶段95℃预变性3min；第二阶段95℃，1min；54℃，1min；72℃，3min20s；，共进行30个循环；第三阶段72℃延伸10min。
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