ES2314037T3 - Sintesis enzimatica de esteres de n(alfa)-acil-l-arginina. - Google Patents
Sintesis enzimatica de esteres de n(alfa)-acil-l-arginina. Download PDFInfo
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Abstract
Proceso para preparar un éster de Nalfa-acil-L-arginina, derivado de ácidos grasos y aminoácidos dibásicos esterificados, según la siguiente fórmula: (Ver fórmula) donde: X - es Br-, Cl- , o HSO4- R1: es una cadena de alquilo lineal de un ácido graso saturado, o hidroxi-ácido de 8 a 14 átomos de carbono unida al grupo alfa-aminoácido a través de un enlace amídico. R 2: es una cadena de alquilo lineal o ramificado de 1 a 18 átomos de carbono o aromático. R3: es: (Ver fórmula) donde n puede ser de 0 a 4; a partir del ácido orgánico y alcohol apropiados, catalizado por una hidrolasa en un medio orgánico de bajo contenido en agua que contiene menos de un 1% en peso de agua.
Description
Síntesis enzimática de ésteres de
N^{\alpha}-acil-L-arginina.
Esta invención se refiere a un proceso para
preparar ésteres de
N^{\alpha}-acil-L-arginina
con actividad protectora frente a microorganismos.
Se conocen muchos
anti-microbianos que protegen frente a bacterias
específicas y generales. Pero muchos de ellos manifiestan
incompatibilidades con la piel humana y las membranas de la mucosa
de la cavidad oral, tales como irritaciones y alergias, y además
son tóxicos para los seres humanos.
Por otro lado, se ha demostrado que los ésteres
derivados del ácido láurico y L-arginina son
sustancias biológicamente activas, en particular, el éster etílico
de la laurilamida del monohidrocloruro de
L-arginina, llamado en la presente memoria como
LAE. LAE tiene la estructura química de fórmula (1).
\vskip1.000000\baselineskip
Estudios biológicos llevados a cabo en distintos
centros de investigación mostraron que LAE actúa principalmente
sobre la membrana externa y citoplasmática de los microorganismos y,
también, dentro del medio citoplasmático, previniendo su
proliferación. Su acción depende del tipo de microorganismo y del
tiempo de exposición.
Además, ha sido estudiado su metabolismo en
ratas, mostrando una rápida absorción y metabolismo en aminoácidos
naturales y el ácido graso ácido láurico, que son finalmente
excretados como dióxido de carbono y urea. Estudios toxicológicos
han demostrado que LAE es completamente inocuo en animales y seres
humanos.
Estos hechos hacen muy interesantes a LAE y
compuestos relacionados como conservantes para alimentos y
aplicaciones cosméticas.
La preparación de estos productos por métodos
químicos tradicionales ha sido descrita en las solicitudes de
patente ES-515643,
WO-A-96 21642 y
WO-A-0194292.
Moran et al. describieron la síntesis
catalizada por hidrolasa de derivados éster glicerílico de
aminoácidos N^{\alpha}-protegidos (J. Chem. Soc.,
Perkin Trans. 1, 2001:17:2063-2070).
Clapés et al. describieron la formación
de enlaces amida y éster entre el grupo carboxilo de la arginina y
una amina o alcohol grasos (Biotechnology and Bioengineering 1999;
63:333-343).
Braun y Kuhl describieron la esterificación con
papaína de aminoácidos y dipéptidos
N^{\alpha}-protegidos con etanol (PHarmazie 1997;
52:203-206).
El objeto de la presente invención era
proporcionar un nuevo proceso para obtener dicho tipo de compuestos,
que son más eficaces y selectivos que los métodos químicos
tradicionales, y por ello, garantizan productos finales libres de
sub-productos y fáciles de aislar.
La existencia de rutas metabólicas de
degradación reversibles para este tipo de compuestos representa una
forma casi natural para obtener LAE. Por consiguiente, el proceso de
la invención proporciona un proceso por reacciones enzimáticas
inversas en disolventes orgánicos para obtener LAE y compuestos
similares a partir de su ácido orgánico correspondiente fácilmente
disponible.
La síntesis de la invención se refiere a la
obtención de ésteres de
N^{\alpha}-acil-L-arginina
según la fórmula (2), donde:
X^{-}: es Br^{-}, Cl^{-}, o
HSO_{4}^{-}
R_{1}: es una cadena de alquilo lineal de un
ácido graso saturado o hidroxi-ácido de 8 a 14 átomos de carbono
unida al grupo \alpha-aminoácido a través de un
enlace amida.
R_{2}: es una cadena de alquilo lineal o
ramificado de 1 a 18 átomos de carbono o un grupo aromático.
R3: es:
\hskip1.5cm
y n puede ser de 0 a 4; a partir del ácido
orgánico apropiado de fórmula (2) donde R_{2} es -H.
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto mas preferido de la clase de
compuestos de mas arriba es LAE.
La invención se ilustra en las figuras 1 a
4:
Figura 1 - Preparación de LAE, relación
rendimiento-tiempo;
Figura 2 - Preparación de LAE, relación
rendimiento-tiempo;
Figura 3 - dispositivo para realizar el proceso
de la invención;
Figura 4 - Preparación de LAE, relación
rendimiento-tiempo.
La biocatálisis, usando enzimas en reacciones de
hidrólisis inversa para obtener productos con importante interés
industrial, está descrita en muchas referencias.
Este tipo de proceso puede ser realizado en un
medio acuoso con o sin disolventes orgánicos miscibles o
inmiscibles, o en un disolvente orgánico, o sin disolvente si
quiera. En los últimos casos, la reacción necesita, naturalmente,
un contenido mínimo de agua para que tenga lugar, o si no, la enzima
pierde su actividad bajo dichas circunstancias. El disolvente
orgánico normalmente contiene menos del 1% en peso de agua, y se
llama disolvente orgánico con bajo contenido en agua.
A menudo, el contenido en agua está fijado al
comienzo de la reacción y no se realiza ningún control a lo largo
del proceso, sin embargo, en reacciones donde se consume o produce
agua, el contenido en agua se convierte en un valor crítico y tiene
que ser controlado por adición o eliminación de agua del medio,
utilizando hidratos de sales u otros medios físicos o químicos
humectantes o drenantes.
El contenido de agua en un medio orgánico es
frecuentemente medido como actividad de agua. La magnitud de la
actividad de agua representa la cantidad de agua no unida y depende
del contenido de agua, pero también de la naturaleza del
disolvente.
La actividad de agua es un parámetro
termodinámico definido como la relación de presión parcial de vapor
de agua sobre la solución en cuestión con respecto al agua pura de
la misma temperatura y a la misma presión total, cuando se ha
alcanzado el equilibrio entre la fase líquida y gaseosa. Entonces,
la actividad de agua es esencialmente igual a la humedad fraccional
en la fase gaseosa. La actividad de agua del agua pura tiene un
valor de 1.
Además del contenido en agua, el tipo de
disolvente, el pH empleado y la temperatura pueden afectar a la
cinética, el rendimiento y/o sub-productos del
proceso, ya que todos estos factores influyen sobre la actividad
enzimática.
Tal como se indicó mas arriba, la reacción
catalítica de hidrólisis inversa, regularmente se realiza bajo
condiciones de una baja cantidad de agua. Por otro lado, las enzimas
no son solubles en disolventes orgánicos a pesar de la presencia de
bajas cantidades de agua. Esto se ha resuelto por la adsorción sobre
soportes sólidos. La adsorción se puede producir añadiendo a la
mezcla de reacción, la cantidad adecuada de adsorbente o
proporcionando la enzima pre-adsorbida sobre el
soporte. Si se selecciona el método de
pre-adsorción, entonces, la enzima tiene que ser
adsorbida en el nivel de ionización correcto utilizando una solución
tampón pH correcto en el proceso de adsorción.
Esta invención se refiere a un nuevo método para
producir ésteres de
N^{\alpha}-acil-L-arginina
con actividad microbiológica derivados de un ácido graso y
L-arginina, según la fórmula (2), utilizando el
ácido orgánico apropiado como material de partida y enzimas en un
medio con bajo contenido en agua.
El método está basado en la esterificación,
promovida de forma enzimática, del ácido de
N^{\alpha}-acil-L-arginina,
que tiene una cadena de alquilo lineal de un ácido o hidroxi-ácido
graso saturado con 8 a 14 átomos de carbono enlazado a un grupo
\alpha-aminoácido a través de un enlace amídico
con un alcohol que consiste en una cadena lineal o ramificada de 1
a 18 átomos de carbono o un grupo fenílico. Este método tiene una
elevada selectividad, está exento de sub-productos,
utiliza condiciones suaves e implica reactivos y disolventes de baja
toxicidad.
La enzima puede ser obtenida a partir de una
fuente microbiana, o a partir de células o tejidos de plantas o
animales y puede estar presente como un purificado o una mezcla en
bruto, relativamente impura, de varios tipos diferentes de enzimas.
La preparación de la enzima puede estar en cualquier forma, como un
polvo libre, o un polvo liofilizado, o unida o adsorbida de forma
covalente sobre un soporte sólido. La enzima puede ser utilizada
como una dispersión libre en la mezcla de reacción o sobre un
soporte, hecho de materiales como polipropilenos, poliamidas,
diatomitas, arcillas, zeolitas, carbono activo, carboximetil
celulosa, ésteres de celulosa y otras celulosas sustituidas,
resinas de intercambio iónico, polisacáridos insolubles,
microesferas de vidrio poroso, óxido de aluminio, celite, o geles
de sílice. La realización mas preferida para la síntesis de LAE es
utilizando un soporte sólido, y entre éstos, celite. Éste hace que
la enzima sea retirada con mas facilidad del medio de reacción por
métodos habituales (por ejemplo, filtración, centrifugación) y que
se recicle para empezar de nuevo el proceso.
El proceso de la invención se efectuará en
presencia de una hidrolasa. Las enzimas que son apropiadas para la
preparación de los compuestos de fórmula (2) son lipasas y
esterasas, puesto que se forma un enlace éster, y peptidasas y
proteasas, si los sustratos principales son derivados naturales de
aminoácidos. Entre ellas, las enzimas mas apropiadas son proteasas,
como bromelaínas, clostripaína, colagenasas, elastasas, ficina,
calicreínas, metalopeptidasas, papaína, quimopapaína, pepsina,
peptidasa, proteinasas, tripsinas, quimotripsinas y
carboxipeptidasas, pero la elección depende del producto de reacción
deseado, ya que la enzima se elige por su afinidad y actividad
específica hacia ambos sustratos, el ácido orgánico y los
precursores alcohólicos. Por ello, para la síntesis enzimática de
LAE, se prefieren clostripaína, ficina, calicreínas, papaína,
quimopapaína y tripsinas, mas preferiblemente papaína de
Carica papaya.
Las enzimas han sido adsorbidas sobre los
soportes sólidos, previamente mencionados en la invención, según
técnicas habituales bien conocidas para un experto en la materia,
tales como liofilización o humectación, al nivel de ionización
apropiado proporcionado por medio de una solución tampón pH. El pH
de trabajo para la papaína de Carica papaya es de 3 a 10,
preferiblemente entre 8 y 8,5.
Como algunos alcoholes son líquidos, la reacción
se puede continuar sin la adición de disolventes. En todos los
otros casos, para dispersar los sistemas y reactivos enzimáticos o
para solubilizarlos, se debería usar un disolvente, tal como
cualquiera de los alcoholes con impedimento estérico, acetonitrilo,
éteres cíclicos, hidrocarburos clorados, cetonas, ésteres, éteres,
hidrocarburos aromáticos e hidrocarburos alifáticos. En general,
todos estos disolventes son apropiados, ya que disuelven reactivos y
no afectan a la actividad enzimática. La composición del disolvente
es totalmente dependiente del producto deseado.
También se puede añadir agua o una solución
tampón apropiada, para conseguir el óptimo contenido en agua para
la actividad enzimática. Así, con un alto contenido en agua, el
proceso de hidrólisis es importante, pero con un muy bajo contenido
en agua, el proceso de hidrólisis no tiene lugar, con lo que la
enzima pierde su actividad. La actividad de agua preferida para el
proceso de la invención es entre 0,02 y 0,1. La actividad de agua
para la papaína de Carica papaya es entre aproximadamente
0,03 y 0,5, mas preferiblemente 0,05 a 0,2, mucho mas
preferiblemente 0,06 a 0,09.
Para aumentar el rendimiento de la reacción, en
algunos casos, es necesario retirar el agua generada, empleando un
método de drenaje químico y/o físico, en forma de intercambiadores
de agua o sales hidratadas o desecantes químicos o tamices
moleculares o destilación azeotrópica, pero en una proporción tal
que el contenido en agua del medio de reacción no caiga por debajo
del contenido mínimo en agua para que se desarrolle la actividad
enzimática. Estas herramientas para retirar el agua pueden estar
dentro del recipiente de la reacción o en un lugar separado a
través del cual recircula cierta cantidad del medio de reacción,
filtrado o no.
La temperatura debe estar en el punto de
congelación del disolvente, por ejemplo, -50ºC para hexano o -45ºC
para acetonitrilo u 11ºC para 1,4-dioxano, y por
debajo del punto de ebullición del disolvente, por ejemplo, 81ºC
para acetonitrilo o 101ºC para 1,4-dioxano o 76ºC
para etanol, mas preferiblemente entre 15ºC y 50ºC. Incluso mas
preferiblemente entre 20ºC y 45ºC y mucho mas preferiblemente entre
25ºC y 40ºC.
La mezcla de reacción también puede contener mas
sales, disolventes, agentes desecantes o enzimas unidas a distintos
tipos de soportes sólidos, que son diferentes de los definidos en
las reivindicaciones, para conseguir la conversión de los
mencionados ácidos derivados de L-arginina en los
respectivos ésteres.
El progreso de la reacción se determina por
medios convencionales como cromatografía (de capa fina, de gas,
líquida de alto rendimiento, y similares) o por medidas de
conductividad. El tiempo de reacción puede variar de 1 h a 7 días,
dependiendo de los parámetros de la reacción como la temperatura, el
pH, el disolvente, la enzima, el soporte sólido, los sustratos, la
actividad de agua y el sistema de drenaje. Una vez producida la
conversión completa o deseada de los sustratos al producto final, la
enzima es retirada por medios convencionales como filtración o
centrifugación. Luego, los productos de reacción de alta pureza
química se aíslan por medios convencionales como evaporación simple
del disolvente, cristalización, precipitación, destilación en vacío
y/o métodos cromatográficos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos expuestos son sólo una selección, y
no representan una restricción a las condiciones, enzimas,
disolventes o sistemas de drenaje del método de síntesis en otros
casos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El hidrocloruro de
N^{\alpha}-lauroil-L-arginina
(obtenido a partir de cloruro de lauroilo y
L-arginina en medio alcalino) se coloca en un
recipiente de reacción sellado y se disuelve en etanol, que contiene
un 0,5% de solución tampón de ácido bórico/borato 0,1 M pH=8,2,
para obtener una concentración de hidrocloruro de
N^{\alpha}-lauroil-L-arginina
de
32 g/L.
32 g/L.
Se prepara un catalizador compuesto por celite
que adsorbe el 8% de la enzima papaína de Carica papaya. La
adsorción se realiza a pH=8,2 y la preparación comprende un 8% en
peso de la enzima en relación al adsorbente y un 4% de
1,4-ditio-DL-treitol
en peso del adsorbente.
El sistema catalítico se añade a la solución en
una relación de /16 en referida a la cantidad de hidrocloruro
de
N^{\alpha}-lauroil-L-arginina.
N^{\alpha}-lauroil-L-arginina.
El sistema se purga con argón.
La reacción se lleva a cabo a 25ºC durante 7
días y con agitación suave. La evolución del proceso se muestra en
la figura 1.
Tras la finalización de la reacción, la mezcla
de reacción es filtrada para retirar la enzima adsorbida y el
producto final, LAE, es aislado por medios convencionales. El
rendimiento del proceso es del 79% de LAE puro.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El proceso se lleva a cabo bajo las mismas
condiciones que el ejemplo 1, pero utilizando etanol con un 0,6% de
solución de tampón y a una temperatura de reacción de 40ºC durante
36 horas. La evolución del proceso se muestra en la figura 2.
La mezcla de reacción es filtrada para eliminar
la enzima adsorbida y el producto final, LAE, es aislado por medios
convencionales. El rendimiento del proceso es del 85% de LAE
puro.
\newpage
Ejemplo
3
Este ejemplo demuestra el uso de un agente
desecante en un aparato externo.
Como muestra la figura 3, la mezcla de reacción
inicial es colocada en un recipiente cerrado (a) bajo atmósfera
inerte (b) a equipado con:
- \bullet
- Un agitador (c);
- \bullet
- una camisa para conservar la temperatura a 35ºC por un líquido caliente o refrigerante (d); y
- \bullet
- un filtro de salida (e), a través del cual se saca , por una bomba peristáltica (f), un flujo controlado de la mezcla de reacción filtrada. Este flujo se hace pasar a través de una columna desecante de tamiz molecular (g) de tal forma que la actividad de agua en el vaso se conserva a 0,06.
La mezcla de reacción inicial tiene la misma
composición que en el ejemplo 2. La reacción se lleva a cabo
durante 24 horas a 35ºC.
La evolución del proceso se muestra en la figura
4.
La mezcla de reacción es filtrada para retirar
la enzima adsorbida y el producto final, LAE, es aislado por medios
convencionales. El rendimiento del proceso es del 98% de LAE
puro.
Claims (13)
1. Proceso para preparar un éster de
N^{\alpha}-acil-L-arginina,
derivado de ácidos grasos y aminoácidos dibásicos esterificados,
según la siguiente fórmula:
donde:
X^{-} es Br^{-}, Cl^{-}, o
HSO_{4}^{-}
R_{1}: es una cadena de alquilo lineal de un
ácido graso saturado, o hidroxi-ácido de 8 a 14 átomos de carbono
unida al grupo \alpha-aminoácido a través de un
enlace amídico.
R_{2}: es una cadena de alquilo lineal o
ramificado de 1 a 18 átomos de carbono o aromático.
R_{3}: es:
\hskip1.5cm
donde n puede ser de 0 a 4; a partir del ácido
orgánico y alcohol apropiados, catalizado por una hidrolasa en un
medio orgánico de bajo contenido en agua que contiene menos de un 1%
en peso de agua.
2. El proceso tal como se reivindica en la
reivindicación 1, donde los sustratos de partida son un alcohol con
cadena alquilo lineal o ramificada de 1 a 18 átomos de carbono o
aromático; y un ácido
N^{\alpha}-acil-L-arginina,
como sal catiónica o sal ácida, según la siguiente fórmula:
\newpage
donde:
X^{-} es Br^{-}, Cl^{-}, o
HSO_{4}^{-}
R_{1}: es una cadena de alquilo lineal de un
ácido graso saturado o hidroxi-ácido de 8 a 14 átomos de carbono
unida al grupo \alpha-aminoácido a través de un
enlace amídico.
R_{2}: es H o un catión orgánico o
inorgánico.
R_{3}: es:
\hskip1.5cm
donde n puede ser de 0 a 4.
3. El proceso tal como se reivindica en la
reivindicación 1, donde el éster de
N^{\alpha}-acil-L-arginina
es el éster etilo de la laurilamida de L-arginina
(LAE).
4. El proceso tal como se reivindica en la
reivindicación 2, donde la
N^{\alpha}-acil-L-arginina
de partida es la N^{\alpha}-laurilamida de
L-arginina.
5. El proceso tal como se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicha hidrolasa es
una proteasa.
6. El proceso tal como se reivindica en la
reivindicación 5, donde dicha proteasa es papaína de Carica
papaya.
7. El proceso tal como se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la enzima es
adsorbida sobre un soporte sólido seleccionado del grupo que
consiste en polipropilenos, poliamidas, diatomitas, arcillas,
zeolitas, carbono activo, carboximetil celulosa, ésteres de celulosa
y otras celulosas sustituidas, resinas de intercambio iónico,
polisacáridos insolubles, microesferas de vidrio poroso, óxido de
aluminio, celite y geles de sílice.
8. El proceso tal como se reivindica en la
reivindicación 7, donde la adsorción de la enzima sobre el soporte
sólido se lleva a cabo por liofilización o humectación de una mezcla
del soporte sólido y una dispersión del catalizador enzimático en
la solución tampón apropiada.
9. El proceso tal como se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el disolvente de
reacción se selecciona del grupo que consiste en alcoholes con
impedimento estérico, acetonitrilo, éteres cíclicos, hidrocarburos
clorados, cetonas, ésteres, éteres, hidrocarburos aromáticos e
hidrocarburos alifáticos y mezclas de éstos.
10. El proceso tal como se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la reacción es
llevada a cabo a una actividad de agua entre 0,02 y 0,1.
11. El proceso tal como se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la reacción es
llevada a cabo a una temperatura entre 20ºC y 45ºC.
12. El proceso tal como se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la hidrolasa es
papaína de Carica papaya y la reacción se realiza a un pH
entre 3 y 10.
13. El proceso tal como se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el agua generada
en la mezcla de reacción es drenada por un agente desecante o un
método físico, situado dentro o fuera del recipiente de
reacción.
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