ES2258260T3 - Proceso para la preparacion de beta-lactamas. - Google Patents
Proceso para la preparacion de beta-lactamas.Info
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Abstract
DERIVADOS DEL (BETA)-LACTAM SE SINTETIZAN MEDIANTE REACCION ENZIMATICA DEL AMINO (BETA)-LACTAM PADRE CON EL AGENTE ACILATANTE CORRESPONDIENTE, LA CONCENTRACION DEL AGENTE ACILATANTE MAS LA CONCENTRACION DEL DERIVADO DEL (BETA)-LACTAM EN LA MEZCLA DE REACCION ES DE ALREDEDOR DE 400 MM.
Description
Proceso para la preparación de
\beta-lactamas.
La invención se relaciona con un proceso para la
preparación de derivados de \beta-lactama por
acilación enzimática de la amino \beta-lactama
madre con un agente de acilación. La amino
\beta-lactama puede ser el ácido
6-aminopenicilánico (6-APA), el
ácido
7-amino-desacetoxicefalosporánico
(7-ADCA), el ácido
7-aminocefalosporánico (7-ACA) o el
7-amino-3-cloro-3-cefem-4-carboxilato
y el agente de acilación puede ser un derivado de
D-fenilglicina o
D-\underbar{p}-hidroxifenilglicina.
Actualmente, las \beta-lactamas
semi-sintéticas tales como Ampicilina, Amoxicilina,
Cefaclor, Cefalexina, Cefadroxil y Cefaloglicina son preparadas en
la industria por métodos químicos, por ejemplo reaccionando una
amino \beta-lactama tal como el ácido
6-aminopenicilánico, usualmente teniendo su grupo
carboxilo protegido, con un derivado de cadena lateral activado,
seguido por la eliminación del grupo de protección por hidrólisis.
Es importante debido a, por ejemplo, el rendimiento, que la amino
\beta-lactama, por ejemplo el
6-APA, sea usada en una forma seca, pura,
preferiblemente con una pureza superior al 97%. Por ejemplo, la
Ampicilina (ácido
6-D-\alpha-aminofenilacetamidopenicilánico)
puede ser preparada reaccionando el 6-APA, que tiene
un grupo carboxilo protegido apropiado, con cloruro del ácido
D-fenilglicina, seguido por la eliminación del grupo
de protección por hidrólisis. Estas reacciones típicamente
involucran pasos costosos tales como condiciones por debajo de cero
grados Celsius y solventes orgánicos como cloruro de metileno y
reactivos de sililación.
La producción enzimática de la Ampicilina a
partir del 6-APA puro y un derivado de la
D-fenilglicina (tal como un alquil éster inferior)
es conocida de la solicitud de patente de Alemania Occidental que
tiene el No. de publicación 2,163,792, la Patente Austriaca No.
243,986, la solicitud de patente Holandesa No.
70-09138, la solicitud de patente de Alemania
Occidental que tiene el No. de publicación 2,621,618 y la solicitud
de patente europea que tiene el No. de publicación 339,751. Los
procesos descritos en el arte anterior han usado típicamente
derivados de D-fenilglicina por debajo de 50 mM y
6-APA por debajo de 25 mM, el rendimiento más alto
reportado fue de 88% (solicitud de patente europea que tiene el No.
de publicación 339,751).
La amino \beta-lactama tal como
el 6-APA es comúnmente producida por hidrólisis
enzimática de una penicilina fermentada (por ejemplo penicilina V o
penicilina G) seguida por la eliminación de la cadena lateral
liberada (ácido fenoxiacético, etc). Además de las impurezas que se
originan de la fermentación, la solución cruda resultante
típicamente contiene la amino \beta-lactama a una
concentración de 150-200 mM. La solución cruda puede
ser purificada y cristalizada para obtener 6-APA
puro o 7-ADCA (en el caso del 7-ADCA
la penicilina fermentada ha sido pasada a través de otro proceso
antes del paso de la hidrólisis).
Las desventajas potenciales de los métodos
enzimáticos conocidos para la producción de Ampicilina, Amoxicilina
y Cefalexina (ninguno ha sido aún escalado a una aplicabilidad
industrial) son el alto costo (pérdidas de rendimiento) y las altas
inversiones debido a las necesarias operaciones unitarias incurridas
cuando la amino \beta-lactama es aislada,
purificada y secada antes de ser usada como materia prima para la
reacción que conduce a una \beta-lactama
semi-sintética. Además, las concentraciones de
partida del 6-APA son muy bajas (típicamente menores
que 50 mM), haciendo así el aislamiento de la Ampicilina formada más
difícil y de esta manera más costoso. También, un rendimiento más
alto en la formación enzimática de la Ampicilina es deseado.
Un proceso para la síntesis enzimática de la
Amoxicilina es descrito en Agric. Biol. Chem. 44 (1980), 821
et seg., cuyo proceso es ejecutado en un medio de reacción
que contiene 2.5% en volumen o más de 2-butanol y 5%
en volumen de otros alcoholes. Cuando uno de los últimos alcoholes
mencionados o 2.5% de 2-butanol son usados, la
concentración inicial de los materiales de partida,
D-\alpha-(p-hidroxifenil) glicina
metil éster y ácido 6-aminopenicilánico, es muy
baja, es decir 100 y 50 mM, respectivamente. Cuando 5% de
2-butanol es usado, la concentración inicial de los
materiales de partida,
D-\alpha-(\underbar{p}-hidroxifenil)
glicina metil éster y ácido 6-aminopenicilánico, es
460 y 230 mM, respectivamente. Se ha establecido en este documento
que la adición de más de 100 mM de
D-\alpha-(\underbar{p}-hidroxifenil)
glicina metil éster y de más de 50 mM de ácido
6-aminopenicilánico suprimen marcadamente el rango
de conversión del ácido 6-aminopenicilánico en
amoxicilina. La conclusión de esta declaración es que la enseñanza
de esta publicación se aparta del incremento de la concentración de
la amino \beta-lactama y del agente de acilación
en la mezcla de reacción.
Después de la fecha efectiva de presentación de
la solicitud de patente sobre esta invención, específicamente
18-21 de Septiembre de 1990, un cartel fue publicado
en un taller de la OTAN. El cartel estaba relacionado con la
preparación de cefalosporinas y, de acuerdo a este cartel, trabajar
a baja temperatura tiene varios efectos positivos sobre la reacción.
La mayor concentración del agente de acilación usada por este
trabajo fue de 355 mM de
D-\alpha-fenilglicina metil éster
y no había indicación en el cartel de acuerdo a lo cual pudiera ser
ventajoso usar una mayor concentración del agente de acilación.
Ha sido ahora, sorprendentemente, encontrado que
el rendimiento en la preparación enzimática de derivados de
\beta-lactama puede ser mejorado llevando a cabo
la reacción a altas concentraciones del agente de acilación.
Aquí los términos amino
\beta-lactama, agente de acilación y derivados de
\beta-lactama cubren los dos materiales de
partida, respectivamente, y el producto resultante relacionados con
el proceso de esta invención. Por lo tanto, el proceso de esta
invención puede ser ilustrado por el siguiente esquema de
reacción:
amino
\beta-lactama + agente de acilación \rightarrow
derivado de
\beta-lactama
El derivado de \beta-lactama
tiene una actividad antibiótica sustancialmente más alta que la
amino \beta-lactama. La amino
\beta-lactama tiene un grupo amino libre que es
acilado por la reacción de acuerdo a esta invención. El agente de
acilación puede estar en su forma ácida libre o puede estar en forma
activada tal como amidas o ésteres. Aquí el término núcleo de
\beta-lactama comprende ambos la amino
\beta-lactama y el derivado de
\beta-lactama. La concentración del núcleo de
\beta-lactama establecido aquí a continuación es
de esta manera la concentración de la amino
\beta-lactama más la concentración del derivado de
\beta-lactama.
Es una característica importante del proceso de
esta invención que la concentración del agente de acilación más la
concentración del derivado de \beta-lactama en la
mezcla de reacción esté por encima de 400 mM. Una forma de obtener
esta concentración en la mezcla de reacción es adicionando, en un
proceso en lotes, el agente de acilación a la mezcla de reacción en
una cantidad suficiente para dar una concentración inicial del
agente de acilación en la mezcla de reacción de más de alrededor de
400 mM.
Por el proceso de esta invención, es posible y
atractivo usar una solución cruda de la amino
\beta-lactama, por ejemplo el
6-APA o el 7-ADCA, sin dilución. La
perdida de la amino \beta-lactama, por ejemplo el
6-APA o el 7-ADCA, durante los pasos
de purificación y/o aislamiento es de esta manera evitada, y las
inversiones en los equipos de purificación para, por ejemplo, la
Ampicilina, la Amoxicilina y la Cefalexina son de esta manera
minimizadas ya que el equipamiento de purificación anteriormente
usado para el aislamiento del 6-APA ahora puede ser
usado para el aislamiento de la Ampicilina, la Amoxicilina y la
Cefalexina.
Ventajosamente, el alto rendimiento de acuerdo a
esta invención puede ser obtenido sin la necesidad de bajas
temperaturas y solventes orgánicos como cloruro de metileno. Así, un
rendimiento del 96% de Ampicilina fue obtenido a 20ºC.
Correspondientemente, esta invención proporciona
un proceso para la reacción enzimática de una amino
\beta-lactama, por ejemplo, el ácido
6-aminopenicilánico, el ácido
7-aminodesacetoxicefalosporánico, el ácido
7-aminocefalosporánico o el
7-amino-3-cloro-3-cefem-4-carboxilato,
con un agente de acilación, por ejemplo, un derivado de
D-fenilglicina o
D-\underbar{p}-hidroxifenilglicina.
En un aspecto, este proceso está caracterizado en
que la concentración de la amino \beta-lactama de
partida en la mezcla de reacción está en el rango de alrededor de 50
a alrededor de 750 mM, preferiblemente por encima de alrededor de
100 mM, más preferido por encima de alrededor de 150 mM, aún más
preferido por encima de alrededor de 200 mM. En otro aspecto, este
proceso está caracterizado en que la concentración inicial de la
amino \beta-lactama de partida en la mezcla de
reacción está en el rango de alrededor de 50 a alrededor de 750 mM,
preferiblemente por encima de alrededor de 100 mM, más preferido por
encima de alrededor de 150 mm, aún más preferido por encima de
alrededor de 200 mM. En aún un aspecto adicional, este proceso está
caracterizado en que la cantidad inicial del agente de acilación,
por ejemplo, derivado de D-fenilglicina o
D-\underbar{p}-hidroxifenilglicina,
en la mezcla de reacción está por encima de la solubilidad de dicho
agente en la mezcla de reacción (preferiblemente al menos 50% por
encima de la solubilidad); o la cantidad inicial del agente de
acilación en la mezcla de reacción está por encima de la mitad de la
solubilidad de dicho agente de acilación más la cantidad inicial de
la amino \beta-lactama en la mezcla de reacción
(preferiblemente por encima de la solubilidad del agente de
acilación en la mezcla de reacción + la cantidad inicial de la amino
\beta-lactama). En aún un aspecto adicional, esta
invención se relaciona con un proceso donde la concentración del
agente de acilación más la concentración del derivado de
\beta-lactama en la mezcla de reacción está por
encima de alrededor de 450 mM, preferiblemente por encima de
alrededor de 500 mM, más preferido por encima de 650 mM, aún más
preferido por encima de 700 mM. En un aspecto adicional, esta
invención se relaciona con un proceso donde la concentración
inicial del agente de acilación en la mezcla de reacción está por
encima de alrededor de 450 mM, preferiblemente por encima de
alrededor de 500 mM, más preferido por encima de alrededor de 650
mM, aún más preferido por encima de alrededor de 700 mM.
Las ventajas de esta invención son, inter
alia, las que siguen:
1) El uso de un solvente orgánico tal como
cloruro de metileno es omitido lo que evita la contaminación.
2) El uso de agentes de sililación es
evitado.
3) El uso de la extracción a baja temperatura tal
como 0ºC puede ser omitido.
4) La alta concentración de reactivos es una
ventaja para la purificación siguiente.
5) El derivado de \beta-lactama
resultante tiene una alta pureza no vista aún en el mercado en un
volumen comercial.
6) El contenido de subproductos en la mezcla de
reacción es muy bajo.
7) Comparado con la síntesis química, son usados
menos pasos.
Ejemplos de derivados de
\beta-lactama que pueden ser producidos por el
proceso de esta invención son la Ampicilina, la Amoxicilina, el
Cefaclor, la Cefalexina, el Cefadroxil.
El agente de acilación puede ser un derivado de
D-fenilglicina o
D-\underbar{p}-hidroxifenilglicina
tal como un alquil (metil, etil, n-propil o
isopropil) éster inferior o una amida que no es sustituida en el
grupo -CONH_{2}. La amida es preferida. El derivado puede ser
usado en la forma de una sal, por ejemplo, la sal del HCL o la sal
del H_{2}SO_{4}. El agente de acilación puede ser añadido en
una forma activa o la forma activa puede ser formada in
situ.
La enzima a ser usada en el proceso de esta
invención puede ser cualquier enzima que catalice la reacción en
cuestión. Tales enzimas han sido conocidas desde alrededor de 1966.
Las enzimas a ser usadas son, por ejemplo, las llamadas penicilina
acilasa o penicilina amidasa y clasificadas como E.C. 3.5.1.11. Un
número de enzimas microbianas son conocidas de tener esta actividad,
derivadas por ejemplo del Acetobacter, de las Xanthomonas, de la
Mycoplana, del Protaminobacter, de las Aeromonas (solicitud de
patente de Alemania Occidental que tiene el No. de publicación
2,163,792) de las Pseudomonas, (Patente Austriaca No. 243986), del
Flavobacterium (solicitud de patente Holandesa No.
70-09138), del Aphanocladium, del Cefalosporium
(solicitud de patente de Alemania Occidental que tiene el No. de
publicación 2,621,618), del Acetobacter pasteurianum, del
Bacillus megaterium, de las Xanthomonas citrii
(solicitud Europea de patente que tiene el No. de publicación
339,751), de la Kluyvera citrofila (Agr. Biol. Chem.
37 (1973), 2797-2804) y de la Escherichia
coli, (solicitud de patente de Alemania Occidental que tiene el
No. de publicación 2,930,794). La enzima de la Escherichia
coli esta disponible comercialmente. La enzima también puede ser
la así llamada ampicilina hidrolasa, acilasa o amidasa. En relación
con esto, se hace referencia, inter alia, a Hakko to
Kogyo 38 (1980), 216 et seg., el contenido del cual está
incorporado como referencia.
Es preferido usar la enzima en una forma
re-usable, por ejemplo, en forma inmovilizada o
atrapada. La inmovilización puede ser hecha por cualquier método
conocido. La enzima de Escherichia coli inmovilizada está
comercialmente disponible de Boehringer Mannheim GmbH, Alemania,
bajo el nombre comercial Enzygel.
El proceso de esta invención es generalmente
llevado a cabo en un sistema que contiene agua. Si es deseado, un
solvente orgánico puede ser añadido.
La solubilidad del agente de acilación tal como
el derivado de D-fenilglicina o
D-\underbar{p}-hidroxifenilglicina
variará con la identidad del derivado y con la composición del medio
de reacción. En un sistema acuoso como el usado en los ejemplos, la
solubilidad de la sal de HCl de la D-fenilglicina
amida es típicamente aproximadamente 450 mM. Sin embargo, la
solubilidad es muy dependiente de los componentes de la sal en la
solución, así como del valor de pH y la temperatura de la solución.
En algunas realizaciones del proceso de la invención, la mezcla de
reacción inicial es una lechada que contiene
\beta-lactama y/o agente de acilación no
disueltos, los cuales se disolverán parcialmente o totalmente
durante el curso de la reacción. La \beta-lactama
formada puede precipitarse durante la reacción y, también, los
productos de la hidrólisis del agente de acilación tal como la
D-fenilglicina y la
D-\underbar{p}-hidroxifenilglicina,
pueden precipitarse. Por lo tanto, en muchos casos la mezcla de
reacción será una lechada durante toda la
reacción.
reacción.
La amino \beta-lactama, por
ejemplo el 6-APA o el 7-ADCA, usada
en el proceso de esta invención puede ser obtenida por hidrólisis
enzimática de las cefalosporinas o penicilinas fermentadas, (por
ejemplo penicilina V, penicilina G o cefalosporina C) o sus anillos
alargados análogos (por ejemplo V-DCA y
G-DCA) o derivados de los mismos seguido por la
eliminación de los subproductos de la hidrólisis, si se desea (ácido
fenoxiacético etc). Ventajosamente, la solución cruda puede ser
usada directamente sin purificación o dilución adicional.
Generalmente, la temperatura de reacción del
proceso de esta invención puede variar entre alrededor de 0ºC y
alrededor de 35ºC, especialmente entre alrededor de 10ºC y alrededor
de 30ºC. Temperaturas en el rango de alrededor de
20-30ºC pueden ser preferidas para una operación
conveniente. El valor apropiado de pH depende del tipo y la pureza
de la enzima. Usando la enzima de Escherichia coli, el valor
de pH está típicamente en el rango de alrededor de 5.5 hasta
alrededor de 7.5, preferiblemente en el rango de alrededor de 6.1
hasta alrededor de 7. Para la preparación de Amoxicilina, un pH en
el rango de alrededor de 5.5 hasta alrededor de 6.4 es preferido.
El control del valor de pH puede ser usado. Tiempos apropiados de
reacción están desde varios minutos a varias horas, en particular
desde alrededor de 1/2 hora hasta alrededor de 8 horas.
Concentraciones de enzimas apropiadas pueden estar desde alrededor
de 1 U/ml a alrededor de 100 U/ml (1 U = una unidad de actividad de
la enzima, ver abajo)
Usando el proceso de acuerdo a esta invención,
rendimientos extraordinariamente altos pueden ser obtenidos. Los
rendimientos altos son obtenidos usando las enseñanzas de esta
invención y seleccionando apropiadamente la concentración del agente
de acilación, la proporción entre la concentración del agente de
acilación y la amino \beta-lactama de partida, el
valor de pH y la enzima.
La recuperación y purificación del producto puede
ser logrado por métodos conocidos per se, por ejemplo por
cristalización.
Como definición de la actividad de la penicilina
G acilasa lo siguiente es usado: una unidad (U) corresponde a la
cantidad de enzima que hidroliza por minuto 1 \mumol de penicilina
G bajo condiciones estándares (5% de penicilina G, buffer de fosfato
de sodio 0.2 M, valor de pH 8.0, 28ºC).
| Columna: | RP LC-18, (250 x 4.6 mm; 5 \mum) |
| Eluente A: | 25 mM de buffer fosfato, valor de pH 6.5 |
| Eluente B: | acetonitrilo |
| Gradiente: | ||
| Tiempo, | eluente B, | |
| Minutos | % | |
| 0 \rightarrow 10 | 1 \rightarrow 20 | |
| 10 \rightarrow 20 | 20 |
Flujo: 1 ml/min. Detección: 215
nm.
Tiempos de retención en minutos:
4.1 (D-PG); 6.3 (7-ADCA); 8.1
(6-APA); 9.1 (D-PGA); 13.4
(Cefalexina); 13.9 (Ampicilina); 18
(D-PGM).
Columna: RP LC-18,
5 \mum, (250 x 4.6
mm)
\vskip1.000000\baselineskip
Solvente: 5% de acetonitrilo en 25
mM de buffer fosfato, valor del pH: 6.5. Flujo: 1 ml/min. Detección
UV a 215
nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Tiempos de retención en minutos:
2.5
(D-\underbar{p}-hidroxifenilglicina);
3.3 (HPGA); 5.4 (6-APA); 13.2
(Amoxicilina).
Esta invención es adicionalmente ilustrada por
los siguientes ejemplos los cuales, sin embargo, no deben
considerarse como limitativos del alcance de la protección.
Una solución de 100 mM de 6-APA y
D-PGA en una concentración como se indica en la
tabla 1 es ajustada a un valor de pH de 6.4 y equilibrada a 20ºC y
345 U de enzima soluble de Escherichia coli, suministrada de
Gesellschaft für Biotechnologische Forschung GmbH, Braunschweig,
Alemania, son añadidas, (volumen total: 20 ml).
La síntesis es llevada a cabo a 25ºC y a
condiciones de pH-stat Los máximos rendimientos,
basados en el análisis HPLC son mostrados en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
mM D-PGA \+ \hskip1,5cm \+ rendimiento máximo \+
\hskip1,5cm \+ tiempo de reacción,\cr \+ \+ de la Ampicilina, %
\+ \+ horas\cr 270 \+ \+ 74 \+ \+ 9\cr 750 \+ \+ 98 \+ \+
24\cr}
Lo mismo que se describió en el Ejemplo 1,
solamente 100 mM de 7-ADCA son usados en vez de
6-APA. Bajo estas condiciones la Cefalexina es
obtenida y los rendimientos máximos a diferentes concentraciones de
D-PGA\cdotHCL son mostrados en la tabla 2.
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
mM D-PGA \cdot HCL \+ \hskip1,2cm \+ rendimiento
máximo\cr \+ \+ de la Cefalexina, %\cr 300 \+ \+ 65\cr 700 \+ \+
92\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
250 mM de 6-APA y 700 mM de sal
de sulfato de D-PGA son ajustados a un valor de pH
como el indicado en la tabla 3, y la síntesis enzimática es llevada
a cabo a 20ºC y condiciones de pH stat, volumen total 20 ml y 700 U
de enzima soluble de Escherichia coli.
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
valor del pH \+ \hskip1,2cm \+ rendimiento máximo \+
\hskip1,2cm \+ tiempo de reacción,\cr \+ \+ de la Ampicilina, %
\+ \+ horas\cr 3.0 \+ \+ 60 \+ \+ 48\cr 6.4 \+ \+ 94 \+ \+ 21\cr
7.0 \+ \+ 93 \+ \+
3\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
Comenzando con 180 mM de 6-APA y
700 mM de D-PGA a valor de pH de 6.4 y 600 U de
enzima soluble de Escherichia coli (volumen total: 20 ml) y
corriendo la síntesis a temperaturas como las indicadas en la Tabla
4, los rendimientos máximos de la Ampicilina obtenidos son mostrados
en la Tabla 4.
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Temperatura, ºC \+ \hskip1,2cm \+ rendimiento máximo, % \+
\hskip1,2cm \+ tiempo de reacción,\cr \+ \+ \+ \+ horas\cr 10
\+ \+ 95 \+ \+ 72\cr 20 \+ \+ 96 \+ \+ 22\cr 35 \+ \+ 60 \+ \+
4\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo fue ejecutado de manera análoga al
Ejemplo 1 usando D-PGM en vez de
D-PGA. Los rendimientos máximos de la Ampicilina
obtenidos son como los establecidos en la Tabla 5.
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
D-PGM mM \+ \hskip1,2cm \+ Ampicilina formada, %
\+ \hskip1,2cm \+ tiempo de reacción,\cr \+ \+ \+ \+ horas\cr
270 \+ \+ 74 \+ \+ 12\cr 700 \+ \+ 86 \+ \+
25\cr}
\newpage
La penicilina V parcialmente purificada del caldo
de fermentación por filtración, extracción en butil acetato y
devuelta a una fase acuosa resultando en una solución de 10%
(peso/volumen) de penicilina V es hidrolizada por Semacylase^{TM}
(penicilina V acilasa inmovilizada de Novo Nordisk A/S) a un valor
de pH de 7.0. El ácido fenoxiacético es eliminado por extracción y a
la solución de 6-APA resultante (150 mM),
conteniendo cantidades menores de subproductos de
6-APA y de la penicilina V degradada, son añadidos
45 U/ml de la enzima soluble de Escherichia coli y
D-PGA (a una concentración final de 700 mM). El
valor del pH es ajustado a 6.4 y a la reacción se le permite
proceder a 25ºC manteniendo el valor de pH constante.
Bajo estas condiciones un total de 135 mmoles de
Ampicilina (90%) son formados por litro de volumen de reacción.
500 mg de la enzima inmovilizada son suspendidos
en 10 ml con agua. La solución de la enzima fue mezclada con una
solución de 6-APA y D-PGA a un
volumen total de 25 ml la mezcla resultante conteniendo 230 mM de
6-APA y 920 mM de D-PGA, teniendo un
valor de pH de 6.4 y equilibrada a temperatura ambiente. La reacción
de síntesis fue permitida proceder a condiciones de pH stat durante
22 horas después de lo cual 91% de 6-APA fueron
convertidos a Ampicilina.
Una mezcla de 968 mg de 6-APA y
3718 mg de HPGA en agua es ajustada a pH 6.2 a 15ºC y 1656 U de
penicilina G acilasa soluble de E. coli son añadidas hasta un
volumen final de 29.8 ml. La síntesis es permitida a proceder a
temperatura constante, usando ácido sulfúrico 2 M para mantener el
pH a 6.2. Después de 27.3 horas la mezcla de reacción contenía 136.6
mM de Amoxicilina, correspondiendo a un rendimiento de 91% basado en
el consumo de 6-APA.
1656 U de penicilina G acilasa soluble de E.
coli son añadidas a una mezcla de 6-APA y HPGA
(200 mM y 750 mM de concentración final, respectivamente) en agua a
pH 6.0 y 30ºC. Después de reaccionar durante 9 horas manteniendo la
temperatura y el pH constantes usando ácido sulfúrico 2 M para la
titulación, 190 mM de Amoxicilina fueron producidos (95% de
rendimiento) basado en el análisis HPLC.
Comenzando con 150 mM de 6-APA,
600 mM de HPGA, 1656 U de penicilina G acilasa soluble de E.
coli, 140 mM de Amoxicilina (93%) fueron producidos después de 8
horas, cuando la reacción fue llevada a cabo a pH 5.7 y a 35ºC.
Las mismas condiciones descritas en el ejemplo 9,
usando 200 mM de 6-APA y 450 mM de HPGA resultaron
en una conversión del 91% del 6-APA a la Amoxicilina
después de 9 horas.
6-APA es ácido
6-aminopenicilánico, 7-ADCA es ácido
7-aminodesacetoxicefalosporánico,
D-PGA es D-fenilglicinamida,
D-PGM es D-fenilglicina metil éster,
V-DCA es ácido
7-fenoxiacetamidodesacetoxicefalosporánico,
G-DCA es ácido
7-fenilacetamidodesacetoxicefalosporánico y HPGA es
D-\underbar{p}-hidroxifenilglicinamida.
Claims (26)
1. Un proceso para la preparación de un
derivado de \beta-lactama por reacción enzimática
de una amino \beta-lactama siendo una penicilina o
un derivado de la misma, ácido
7-aminodesacetoxi-cefalosporánico,
ácido 7-aminocefalosporánico o
7-amino-3-cloro-3-cefem-4-carboxilato
con el correspondiente agente de acilación, cuyo proceso enzimático
es llevado a cabo con una penicilina amidasa o una penicilina
acidasa como la enzima, caracterizado en que la concentración
del agente de acilación más el derivado de
\beta-lactama en la mezcla de reacción está por
encima de 400mM, a condición de que el proceso no tenga lugar en un
sistema cosolvente orgánico-agua termodinámicamente
controlado usando concentraciones de entre 30 y 90% de
co-solventes orgánicos.
2. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 1,
adicionalmente caracterizado por la recuperación y
purificación del derivado de \beta-lactama.
3. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 1
o 2, donde el derivado de \beta-lactama es
Ampicilina, Amoxicilina, Cefaclor, Cefalexina o Cefadroxil.
4. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado en que la temperatura
está por debajo de 35ºC.
5. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado en que la reacción es
ejecutada a una temperatura en el rango de 0 a 35ºC, preferiblemente
por encima de 10ºC.
6. Un proceso de acuerdo a la Reivindicación 5,
caracterizado en que la temperatura está por debajo de
30ºC.
7. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la
concentración inicial del agente de acilación en la mezcla de
reacción está por encima de 400 mM.
8. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la mezcla
de reacción contiene menos de 2.5% (en volumen) de
2-butanol, preferiblemente menos de 2% (en volumen)
de butanol.
9. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la
amino-\beta-lactama madre es ácido
6-aminopenicilánico.
10. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que el agente
de acilación es D-fenilglicina o
D-p-hidroxifenilglicina o derivados
de los mismos.
11. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 4-10, caracterizado en
que el derivado de \beta-lactama es Ampicilina,
Amoxicilina, Cefaclor, Cefalexina o Cefadroxil.
12. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la
concentración de la amino \beta-lactama en la
mezcla de reacción está en el rango de 50 a 750 mM, incluyendo amino
\beta-lactama no disuelta, preferiblemente por
encima de 100 mM, más preferiblemente por encima de 150 mM, lo más
preferido por encima de 200 mM.
13. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la
concentración inicial de la amino \beta-lactama en
la mezcla de reacción está en el rango de 50 a 750 mM, incluyendo
amino \beta-lactama no disuelta.
14. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la
concentración del agente de acilación más la concentración del
derivado de \beta-lactama en la mezcla de
reacción está por encima de 450 mM, y de esta manera,
preferiblemente, la Amoxicilina es preparada.
15. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la
concentración inicial del agente de acilación más la concentración
del derivado de \beta-lactama en la mezcla de
reacción está por encima de 450 mM, y de esta manera,
preferiblemente, la Amoxicilina es preparada.
16. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la
concentración del agente de acilación más la concentración del
derivado de \beta-lactama en la mezcla de reacción
está por encima de 500 mM, preferiblemente, por encima de 600 mM y
lo más preferido por encima de 700 mM.
17. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la
concentración inicial del agente de acilación está por encima de 700
mM.
18. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la
reacción es ejecutada a un valor de pH en el rango de 5 a 7.
\newpage
19. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la
\beta-lactama de partida es preparada por
hidrólisis de la Penicilina V, la penicilina G, el ácido
7-fenoxiacetamidodesacetoxicefalosporánico
(V-DGA), el ácido
7-fenilacetamidodesacetoxicefalosporánico
(G-DGA) o la Cefalosporina C o un derivado de los
mismos y, opcionalmente, eliminación de la cadena lateral liberada
por la hidrólisis.
20. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que el agente
de acilación es una amida o un éster que contiene
1-3 átomos de carbono en la parte éster,
preferiblemente una amida, lo más preferido una amida donde el grupo
-CONH_{2} es no sustituido.
21. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la enzima
usada es deEscherichia coli, Acetobacter pasteurianum,
Xanthomonas citrii, Kluyvera citrophila o Bacillus
megaterium.
22. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la enzima
usada puede ser clasificada como EC 3.5.1.11.
23. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la enzima
usada es capaz de hidrolizar la penicilina G o la Ampicilina.
24. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que un
material biológico re-usable enzimáticamente activo
es usado.
25. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la
reacción enzimática es llevada a cabo en un sistema acuoso
opcionalmente junto con un solvente orgánico.
26. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, caracterizado en que la
mezcla de reacción contiene menos de 5% (en volumen) de
2-butanol.
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