CZ381392A3

CZ381392A3 - Process for preparing beta-lactams

Info

Publication number: CZ381392A3
Application number: CS923813A
Authority: CZ
Inventors: Svend Gunnar Kaasgaard; Ulla Veitland
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1990-07-04
Filing date: 1991-07-03
Publication date: 1993-12-15
Also published as: AU8208691A; NO307710B1; JPH05507623A; DE69133509T2; SK381392A3; EP0537255B1; FI925988A0; FI925988A; ZA915142B; NO930006L; DE69133509D1; KR100222606B1; CA2086250A1; PT98205B; ATE317912T1; US5525483A; ES2258260T3; NO930006D0; JP3115593B2; EP0537255A1

Description

Vynález se týká způsobu přípravy a výroby ''-lektánových derivátů enzymovým acylovéním matečných amino-laktamů z-n _v působením acylujíčího činidla· Jako amino-ý?-laktam se může použít kyselina 6-aminopenicilanová (nadále 6-APA), 7-aminodesacetoxycefalosporsnová (nadále 7-ADCA), 7-aminocefalosporanová (nadále (7-ACA) nebo některý ester kyseliny 7-emino-5chlor-3-cefem-4-karboxylovéj acylujícím činidlem může být deri vát D-fenylglycinu nebo D-p-hydroxyfenyIglyčinu.

Dosavadní stav

V tuto dobu se polosynthetické ý3-lektamy, jako je ampi

V cilin, amoxicilin, cefaclor, cefalexin, cefadroxil a cefaloglycin připravují průmyslově chemickými synthesami, , například reakcí amino- ^-laktamů, jako je kyselina 6-aminopenicilanoV vá, jejíž kerboxylová skupina je obvykle chráněna, s aktivovaným derivátem postranního řetězce. Potom se odstraní hydroly sou krycí skupina. Ze zřetelem například na výtěžek je nutné, aby amino- β -lektám, na příklady tedy 6-APA, byl použit v suché a čisté formě, s výhodou o čistotě nad 97%· Tak například lze připravit ampicilin (kyselinu 6-D-^-aminof eny láce tamidopenici lanovou) reakcí 6-APA s vhodně krytou karboxylovou skupinou, s -chloridem D-fenylglycinu, načež se hydrolysou odstraní krycí skupina. Taková reakce obvykle zahrnuje velmi nákladné stupně, jako je práce za teploty pod 0°C s použitím rozpouštědel, jsko je methylenchlorid, jakož i silylaČních činidel.

Enzymový příprava ampicilihu z čisté kyseliny 6-APA a deri vátu D-fenylglycinu, jako je některý z nižších alkylesterů, je známa ze západoněmecké patentové přihlášky 2 163 792, dále

-2rakouského patentového spisu 243 986, holandské patentové přihlášky 70-09 138, západoněmecké patentové přihlášky 2 621 618 a evropské patentové přihlášky 339 751. Dříve popisované postupy typicky používaly menší množství, než je 50 mM derivátu D-fenylglycinu a pod 25 mM 6-APA, a nejvyšší dosažený výtěžek činil dle evropské patentové přihlášky 339 751 88%.

Amino-/Sůak tam, jako je 6-APA, se obvykle získává enzymoV vou hydrolysou fermentovaného penicilinu, například penicilinu V nebo penicilinu 0 s následujícím odstraněním uvolněného postranního řetězce (kyselina fencxyoctcvá atd). Kromě nečistot, pocházejících z fermentování, obsahuje takto získaný surový roztok typicky amino-β-laktam v koncentraci 150-200 mM. Surový roztok se dá vyčistit a krystalováním se takto získá čistá 6-APA nebo 7-ADCA ( v případě 7-ADCA se podrobí fermentovaný penicilín ještě dalšímu postupu před provedením hydrolysečního stupně).

Závažnými nedostatky známých enzymových postupů při výrobě ampicilinu, amoxicilinu a cefalexinu (z žádného postupu se nepodařilo dospět k průmyslovému využití) jsou vysoké náklady (ztráty na výtěžku), jakož i investiční náklady ns provedení operací, probíhajících v nákladných zařízeních, hlavně isoluje-li se, čistí a duší amino-/í? -laktam před použitím jako surovina pro reakci, jež vede k polosynthetickému ^-laktamu. Dále pak použitelná výchozí koncentrace 6-APA je velmi nízká (typicky pod 50 mM) a tím se znesnadňuje a hodně prodražuje isolování vzniklého ampicilinu. Takže je žádoucí dosáhnout vyšších výtěžků při enzymové přípravě ampicilinu.

Způsob enzymové synthesy amoxicilinu byl popsán v Agric,

Biol.Chem. 44. 821 (1980); provádí se v prostředí, obsahujícím objemově 2,5% či více 2-butanolu a 5% dalšího alkoholů či alkoholů. Použije-li se některý z posléze uviděných alkoholů nebo 2,5% 3&η±ηκειϊη 2-butanolu, pak je počáteční koncentrace výchozí látky, tedy jak methylesteru D-^-(p-hydroxyfenyl)-glycinu. tak i' 6-amindJpehicilanové kyseliny velmi nízká, například 100 a

-550 mM v tom kterém případě. Při koncentraci 2-butanolu 5% činí počáteční koncentrace výchozích látek, tedy methyiesteru D-oÍ-(p-hydrosyfenyl)-glycinu a kyseliny 6-aminopenicilanové 460 a 230 mM v tom kterém případě. V citované práci se poukazuje na to, že použitý více než 100 mM methyiesteru D-^~(p-hydroxyfenyl)~glyčinu a nad 50 ?nM 6-aminopenicilanové kyseliny zcela , patrným způsobem potlačuje konversi kyseliny 6-aminopenicilanové na amoxicilin. Závěr z tohoto tvrzení citované publikace znamená, že nelze zvyšovat koncentraci amino-tt-laktamů a acylujícího

P činidla v reakční směsi.

Po datu podání přihlášky k udělení patentu podle tohoto vynálezu, totiž 18-21.09.1990, bylo zveřejnění sdělení z pracoven NATO; týká se to přípravy cefalosporinů a podle tohoto sdělení má postup, prováděný za nízké teploty,několik positivních účinků na průběh reakce. N-jvyšší koncentrace acylujícího činidla, použi tého při tomto postupu, odpovídala 555 methyiesteru D—^-fenyl glycinu a není zde ani náznak toho, proč má být výhodné použití vyšších koncentrací acylujícího činidla.

Podstata tohoto, vynálezu

Nyní bylo. s překvapením zjištěno, že se dá zvýšit výtěžek při enzymové přípravě derivátů ^-laktamů prováděním reakce za vyšších koncentrací acylujícího činidla.

Takže nadále výrazy amino-/^-laktam, acylující činidlo a derivát ý^-laktamu odpovídají dvěma výchozím látkám v tom kterém případě, a produktu, jak se získává postupem podle tohoto vynálezu. Takže postup podle tohoto vynálezu lze zachytit schématem:

/) _z amino-p-lektám + acylující činidlo = derivát yí'.-laktamů

Derivát ^-iektamu'má podstatně vyšší antibiotické účinky a vlastnosti ve srovnání s amino-pžLaktamem. Amino-ý^-laktam má

-4volnou aminoskupinu, jež se postupem podle tohoto vynálezu acyluje. Acylující činidlo může být ve formě volné kyseliny, nebo v aktivované formě, jako je některý z amidů či esterů.

Takže výraz $ -laktamové jádro zahrnuje jak amino-^-laktam tak i /^-laktamové deriváty. Takže zmiňovaná koncentrace ^-laktamového jádra znamená koncentraci amino-^-laktamu + koncentraci derivátu ^-laktamu.

Je velmi důležitým zjištěním při postupu podle tohoto vynálezu, že koncentrace acylujícího činidla + koncentrace derivátu -lektánu v reakční směsi se může pohybovat nad 400 nlí. Jednou z možností, jak dosáhnout takovém koncentrace v reakční směsi je postupné přidávání acylujícího činidla do reakční směsi v množství dostačujícím k tomu, aby počáteční koncentrace acylujícího činidla v reakční směsi činila více, než 400ij»Rá.

Při postupu podle tohoto Vynálezu je možné a velmi lákavé použití surového rozteku amino--lektánu, například c~A?A nebo 7-ADCA bez jakéhokoli ředění. Odpadá tak ztráta amino-ý2>-r Isktamu, například 6-APA nebo 7-ADCA v průběhu čistění a/nebo isolační stupně, jakož i investice do čistících zařízení pro například ampicilin, amoxocilin a cefalexin; ty se sníží na minimum, protože se dají použít ona čistící zařízení,, která se dříve použila při isolování 6-APA a nyní pro isjřlaci ampicilinu., amoxicilinu a cefalexinu.

S výhodou lze dosáhnout postupem podle tohoto vynálezu vysokých výtěžků bez nutnosti práce za nízkých teplot a bez organických rozpouštědel, jako je methylenchlorid. Takže při práci za teploty 20°C lze dosáhnout v případě ampicilinu výtěžku 96%.

Podle tohoto tedy tento vynález)/ zajištuje způsob enzymové přípravy amino-ý?-laktamu, například kyseliny 6-aminopenicilanové, 7-aminodesacetoxycefalosporanové, 7-aminocefslosporanové nebo esteru 7-amino-3-chlor-3-cefem-4-ksrboxylcvé kyseliny působením acylujícího činidle, jako je například derivát D-fenylglyčinu nebo D-p-hydroxyfenylglycinu.

-5Podle jednoho aspektu se postup podle tohoto vynáěhzu vyznačuje tím, že se koncentrace výchozího amino-^-laktamu v reakční směsi pohybuje v rozmezí odm asi 50 do asi 750 mM, s výhodou nad asi 100 -)pM, výhodněji nad asi 150 nM a nejvýhodněji nad asi 200 mM. Podle jiného aspektu se postup podle tohoto vynálezu vyznačuje tím, že počáteční koncentrace výchozího amino-(J3 laktamu v reakční 50 do asi 750 mM, s výhodou ^ozmesi oc ssr se pohybuje · si 100 mM, výhodněji nad asi 150 mM a nejvýhodněji nad asi mM. Podle dalšího aspektu se postup podle tohoto vynále; vyznačuje tím, že počáteční množství acylačního činidla, například derivátu D-řenylglycínu nebo D-p-hydxoxyfenylglycinu v reakční směsi je vyšší, než to odpovídá rozpustnosti řečeného činidla v reakční směsi a s výhodou nejméně nad asi nejméně 50%, vztaženo na rozpusnost řečeného činidla. Kebo počáteční množství acylačního činidla v reakční směsi je vyyší než to odpovídá polovině rozpustnosti řečeného acylačního činidla + počáteční množství amino-ý^-laktamu v re_skční směsi, s výhodou tedy nad rozpustností acylačního činidla v reakční směsi + počáteční množství amino-ý&-laktamu. A ještě podle dalšího aspektu se tento vynález týká postupu, kdy koncentra ce acylačního činidla + koncentrace derivátu ^-laktamu v reakční směsi je nad asi 450 mM, s výhodou nad asi 500 mM, výhodněji nad asi 650 mM a dokonce nejvýhodněji na^ asi 700 mM. Podle ještě dalšího aspektu se tento vynález týká postupu, kdy počáteční koncentrace acylačního činidla v reakční směsi je nad asi 450 mM, výhodněji nad asi 500 mM, ještě výhodněji nad asi 650 mM a dokonce nejvýhodněji nad asi 700 mM.

Výhody podle tohoto vynálezu jsou, kromě jiného, tyto:

1) Odpadá použití organického rozpouštědla, jako je methylenchlorid a tím odpadá i znečistění ovzduší,

2) Odpadá použití silylečního činidla,

3) Může se opomenout extrahování sa nízkých teplot, jako je o°c,·

-64) Vysoká koncentrace reagujících složek je velkou výhodou při následujícím čistění,

5) Získávaný § -laktamový derivát se vyznačuje vysokou čistotou, nevídanou s porovnáním s dosavadní výrobou,

6) Obsah vedlejších produktů v reakční směsi odpovídá velmi nízké úrovni,

7) Ve srovnání s chemickými synthesami je nezbytně nutný menší počet reakčních stupňů.

Podrobný ponis tohoto vynálezu

Jako příklady (^-lektamových derivátů, které se mohou vyrobit postupem podle tohoto vynálezu, lze jmenovat ampicilin, amoxicilin, cefaclř, cefalezin, cefadroxil.

Acylačním činidlem může být derivát D-fenylglyčinu nebo

D-p-hydroxyfenylglycinu, jako je některý nižší alkylester, třeba methyl-; ethyá; n-propyl- nebo isopropylester, nebo amid, nesubstituovanové skupině -CONE^. Za výhodné látky lze označit amidy. Derivát se může použít ve formě soli, například kyseliny chlorovodíkové nebo sírové. Acyleční činidlo je možno přidávat.v odpovídající aktivní formě, nebo se může tato aktivní forma tvořit in šitu.

Enzymem, použitelným při postupu podle tohoto vynálezu, může být kterýkoli enzym, katalysující předmětnou reakci. Takové enzymy jsou známé od r. kolem 1966. Použitelné enzymy zahrnu jí například penicilin-amidasu nebo pěnicilin-HX±±annKacylasu a jsou klasifikovány jako E.C. 3.5.1.11. Tato účinnost je známa u velkého počtu mikrobiálních enzymu, např. z Acetobecter, Kant monas. Mycoplana, Protaminohacter. Aeromonas (viz západoněmecká patentová přihláška 2 163 792), Pseudomonas (australský pstento vý spis 243 986), Plevobacterium (holandská patentová přihláška 70 09 138).ěAphanocladlum, Cephalosporium .(západoněmecká paten tová přihláška 2 621 618). Acetobacter pasteurianum. Bacillus megaterium. Xanthomonas citrii (evropská patentová přihláška

-7339 751), Kluyvera citrophilla (Agr.Biol.Chem. 37, 2797 (1973), a Escherichia coli (západoněmecká patentová přihláška 2 930 794)· Posléze uvedený mikroorganismus je obchodně dostupný. Jako enzym se může rovněž použít tzv.ampicilin-hydrolasa, -acylasa nebo -amidasa. V této souvislosti se kromě jiného odkazuje na časopis Hakko to Kogyo 33, 216 (1980); obsah je zde dále připojen.

Je výhodné používat takový enzym ve formě k použití kdykoliv, například tedy uchovávaný v nějaké nádobce nebo v imobilisované formě. Imobilisování lze provést jakoukoli ze známých method, přičemý imobilisovaný mikroorganismus Escherichie coli je běžně obchodně dostupný od Boehringer Iťíannheim C-mbH (Hěmecko) pod obchodním označením Enzygel.

Postup podle tohoto vynálezu se obvykle provádí v prostředí, obsahujícím vodu, ale je-li to vhodné, lze přidat organické rozpouštědlo.

Rozpustnost acylačního činidla, jako je některý derivát D-fenylglycinu nebo D-p-hydroxyfenylglycinu bude kolísat v závislosti na tom či onom derivátu, jakož i na složení reakčního prostředí. Ve vodném prostředí, jak je používáno v příkladech bude rozpustnost hydrochloridu amidu D-fenylglycinu činit asi 450 ?nM. Avšak rozpustnost značně závisí na solích jako složkách roztoku, jakož i na hodnotě pH a na teplotě roztoku. Při některých provedeních postupu podle tohoto vynálezu tvoří počáteční reakční směs suspensi, obsahující nerozpuštěné acylační činidlo a/nebo β -laktam, s k rozpuštění dojde částečně nebo dokonale v průběhu reakce. Vzniklý-laktam se může vysrážet v průběhu reakce, a může se rovněž vysrášet produkt či produkty hydrolysy acylačního činidla, jako je D-fenylglycin a D-p-hydroxyfenylglycin. Takže v některých případech bude reakční směs ve formě suppense po celou dobu průběhu reakce.

Aroino·^ -laktam, například 6-APA nebo 7-ADCA, jek se používá při postupu podle tohoto vynálezu, se múze připravit enzymovou hydrolysou fsrmentačně připravených penicilinů nebo

-8cefalosporinů, jako je například penicilín V, penicilín G nebo cefalosporin C nebo jejich analogů s rozšířeným kruhem, například V-DCA a G-DCA nebo odpovídajících jejich derivátů s následujícím oddělením vedlejších produktů, vzniklých hydrolysou. Jako je tomu například u kyseliny f.enoxyoctové a podobných. S výhodou se může surový roztok použít přímo bes jakéhokoli dalšího čistění nebo ředění.

Reakční teplota při postupu podle tohoto vynálezu kolísá mezi asi 0°C a asi 35°C, zvláště v rozmezí od asi 10°C do asi 30°C_e Pro běžně prováděné postupy jsou výhodné teploty v rozmezí od asi 20 do 30°C. Vhodná hodnota pH je závislá ns typu a čistotě enzymu. 2a použití enzymu z Hscherichia coli bude hodnota pH ₍se pohybovat s výhodou v rozmezí od asi 5,5 do asi 7,5, s vtódou od asi 6,1 do asi 7. Při přípravě amoxicilinu je výhodná hodnota pH v rozmezí od asi 5,5 do asi 6,4. Hodnotu pH lze průběžně kontrolovat. Za vhodnou reakční dobu lze označit rozmezí od několika minut dc několika hodin, zvláště od asi 30 minut do asi 8 hodin· Vhodná koncentrace enzymu může kolísat od asi lU/ml do asi 100 U/ml (1 U odpovídá jednotce enzymové aktivity, viz ještě dále).

Při vyu_^žití postupu podle tohoto vynálezu lze dosáhnout mimořádně vysokých výtěžků. Vysokých výsledků se dá rovněž dosáhne použitím výsledkl/ podle tohoto vynálezu a vhodnou volbou koncentrace acylačního činidla, využitím poměru mezi koncentrací acylačního činidla a výchozích amino-laktamu, hodnoty pH a příslušného enzymu.

Produkt lze isolovat a čistit postupy, které jsou jako takové obecně známé, například krystalováním.

Definice a postupy analysování

Bnzvmová aktivita

K definování aktivity penicilin-G-acylašyse postupuje takto; jedna jednotka (U) odpovídá onomu množství enzymu, jež zhydrolysuje za minutu 1 ^mol penicilinu G ze standardisovanýhh

podmínek (5% penicilinu G, 0,2 M pufr z foBforečněnu pH 8,0, 28°C). kapalinová , VysokotlakováVanalysa reakční^složek:
Kolona: R? DC-	18 (250 x 4,6 mm;	5 prc)
Elučná činidlo A:	25 alS fosfátový pufr, pH 6,5
Eluční činidlo 3:	acetonitril
Gradient
	čas v	eluční činidlo 3
	minutách	%
	0 až 10	1 - 20
	10 až 20	20
Průtok: 1 ml/min,	detekce při 215	nm.

Retenční doba v minutách: 4,1 (D-PG); 6,3 (7-ADCA); 8,1 (6-APA); 9,1 (D-PGA); 13,4 (cefalexin), 13.9 (ampicilin);

(D-PGm).

Vysokotlaková kapalinová chromatografie amoxicilinu

Kolona: RP LC-18, 5 yxm (250 x 4,6 mm)

Rozpouštědlo: 5% acetonitrilu v 2£t 25 TúM fosfátového pufru, pH 6,5, průtok: 1 ml/min, Detekce v UF: 215 nm

Retenční doby v minutách: 2,5 (D-p-hydroxyfenyIglycin), 3,3 (HP GA); 5m4 (6-APA); 13,2 (amcxici lin)

- Vynále.z je dále doložen připojenými příklady, jimž však není jeho rozsah jakkoli omezován.

-10Příkled 1

Enzymová synthesa ampicilinu jek je uvede 345 U fur cko).

Roztok 100 iriM 6-APA a D-PGA v koncentracích, to uvedeno v tabulce 1 se upraví na hodnotu pH 6,4, se do rovnovážného stavu za teploty 20°C a přidá se rozpustného enzymu z Escherichia coli (Gesellschaft Biotechnologische Porschung GmbH, Braduschweig, Reme Celkový objem: 20 ml.

a konstantních poápodle vyhodnocení jsou patrné z tabulSynthesa se provádí za teploty 25°C mínek, pokud se pH týká. Rejvyšší výtěžky vysokotlakovou kapalinovou chromatografií ky 1.

nlvl D-PC-A

270

750nejvyšší výtěžek ampicilinu, %

Rekční doba, hodin o

✓

Příklad 2

Enzymová synthesa cefalexinu

Podobný postup, jako v příkladu 1, ale použije se místo 6-APA 100 mM 7-APCA. Za uvedených podmínek se získá cefalexin a nejvyšší výtěžky za různých koncentrací D-PGA.HC1 jsou uvedeny v tabulce 2,

Tabulka 2

rdi D-PGA.BC1	nejvyšší výtěžek cefslexinu,
300	65
700	92

-11Příklad 3

Závislost na pH

Hodnota pH směsi 250 mM 6-APA a 700 mM soli kyseliny sírové a D-PGA se upraví na hodnotu, jak je uvedena v tabulce a enzymová synthesa se provede za teploty 20° s konstantních podmínek pH; celkový objem 20 ml za použití 700 J rczpustneno enzymu z Escherichia ccli s bulka_3

Hodnota pH	nejvyšší výtěžek ampicilinu, %	reakční hodin
6,0	60	48
M	54	21
7,0	93

Příklad 4

Závislost na teplotě

Vychází se z ISO mM 6-APA	ε 700 mM D-PGA za hodnoty pH
6,4 a 600 U rozpustného	enzymu z	Escherichia coli, celkový
objem 20 ml; synthesa se	provádí	zs teplotních podmínek, jak
je to uvedeno v tabulce	γ, tamže	jsou rovněž nejvyšší výtěžky
ampicilinu·
Tabulka	4
Teplota °C nejvyšší	' výtěžek	% reakční doba, hodin
10	95	72
20	96	22
35. p . ···	60	4
Příklad 5

Tento příklad byl proveden obdobně jako postup z příkla

-12du 1, ele sa použití D-PGM místo D-PGA. Nejvyšší výtěžky ampicilinu, jak byly dosaženy, jsou v tabulce 5.

Tabul ka 5

D-PGM, mM

270

700

Vzniklý ampicilin, 7 74 66 reakční doba, hodin 12 25

Příklad 6

Penicilín V, částečně vyěistěný z fermentační zépary filtrací, extrakcí do butylacetátu a převedený zpět do vodné fáze tak, že vznikne 10%ní vodný roztok (hmota dle objemu) se hydrolysuje semacylasou TM (imobilisovaná penicilín V-scylasa od Novo Nordisk A/S) sa hodnoty pK 7,0. Vzniklá fencxyoctová kyselina se odstraní extrakcí a ke vzniklému roztoku 6-APA (150 mM), který obsahuje menší množství vedlejších produktů z degradace penicilinu V a 6-APA, se přidá 45 V/ml rozpustného enzymu z Escherichia coli a D-PGA (až do konečné koncentrace 700 mM). Hodnota pH se upraví na 6,4 a reakce se nechá probíhat za teploty 25°C a za udržování konstantní hodnoty pH.

Za takových podmínek vznikne celkem 135 mmol ampicilinu (90% na litr reakčního objemu.

Příklad 7

Použití iroobilisované penicilin-G-acylasy oď firmy Eoehringer (Mannheim)

500 mg imobilisovaného enzymu se suspenduje ve vodě až k dosažení objemu 10 ml. Roztok enzymu se smíchá s roztokem 6-APA a B-FGA na celkový objem 25 ml vzniklé' směsi, obsahující 230 mM 6-APA a 920 mM D-PGA o hodnotě pH 6514, to vše sa teploty místnosti. Synthesní reakce se pak nechá probíhat za konstantníct

-13podmínek pH po 22 hodin; během té doby 91% 6-APA se převede na ampicilin.

Příklad 8

Enzymová synthesa amoxicllinu

Směs 968 mg 6-APA a 3718 mg HPGA ve vodě se upraví ns hodnotu pH 6,2 a za teploty 15°^c se přidá 1656 U rospustné penicilin-G-acylasy z S.coli až do konečného objemu 29,8 ml. Synthesa se nechá probíhat za konstantní teploty a za použití 2 M rozteku kyseliny sírové k udržení hodnoty pH na X 6,2.

Po 27,3 hodinách reakční směs obsahovala 136,6 mM amoxicilinu, což odpovídá výtěžku 91%, přepočteno na spotřebu 6-APA.

Přiklad 9

Snzym&vá synthesa amoxicilinu

1656 U rozpustné penicilin-G-scylasy z B.coli se přidá do směsi 6-APA a HPGA (200 mM a 750 mM konečné koncentrace v tom kterém případu), to ve vodě za teploty 30°C a hodnoty pH 6,0. Reakce se provádí 9 hodin za konstantní teploty i hodnoty pH, jež se udržuje titrscí 2 N roztokem sírové kyseliny.

Vznikne 190 mM amoxicilinu (95%), přepočteno na podkladech i .

vysokotlakově kapalinové chromatografie.

Příklad 10

Enzymová synthesa amoxicilinu

Za podmínek, jak jsou uvedeny v příkladu 9, ale za použití 200 mM 6-APA a 450 mM HPGA _{ge docílí 9l%ní konV}erse 6-APA na; amoxilin v průběhu 9 hodin.

Zkratky

6-APA: 6-aminopenicilanová kyselina, 7-ADCA: 7-aminodesacet-14oxycefalosporanové kyselina; D-PGA: amid D-fenylglyčinu;

D-PGM methylester D-fenylglyčinu, V-DCA: 7-fenoxyacetamidodesacetoxycefalosporanová kyselina; 6-DCA: 7-fenylacetamidodesacetoxycefalosporanové kyselina a HPGA: tas amid D-p-hydro xyfenylglyčinu·

Claims

Patentové

X TJ 30 X} r“ > ° ba -> -u o < c· O! 03 7; «- 5> m >_o X 1 ' o < Γ-z m LO x> N ba < n ár o “Tý-

1. Způsob výroby $ -laktamových derivátů enzymovou reakcí některého z amino- ^-laktamů, jako je penicilín nebo jeho derivát, kyselina 7-aminoóesacetoxycefalosporanová, 7-aminocefalosporanová nebo ester kyseliny 7-amino-3-chlor3-cefem-4-karboxylové s odpovídajícím acylaěním činidlem v reakční směsi, obsahující méně než 5% (objemově)

2-butanolu, pokud je vznikající ód -laktamový derivát amoxicilinem a acylaěním činidlem jící se tím, že koncentrace acylačniho činidla v reakční směsi spolu s koncentrací /^-.laktamového derivátu v reakční směsi je nad asi 4CO mM. ^J j e ,P-ot-( p-hydroxy fenyl )gly methyles ter ' cmu, vyznacu2. Způsob výroby -laktamových derivátů enzymovou reakcí matečného amino--laktamu s odpovídajícím acylaěním činidlem v reakční směsi obsahující méně než 5% (objemově) 2-butanolu, pokud je vznikajícím /jt> -laktamovým derivátem amoxicilin a acylaěním činidlem methylester D-o4-(p-hydroxyfenyl) glycinu, vyznačující se tím, že koncentrace acylačniho činidla spolu s koncentrecí φ-laktamového derivátu v reakční směsi je nad asi 400 mM a teplota pod asi 35°C.
3.

teplota se

Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím,- že pohybuje pod asi 35°C.
4. Způsob podle kteréhokoli z vyznačujícíVnse tím, že použitá teplota předcházejících nároků, je pod asi 3O°C.
5. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že počáteční koncentrace acylačniho činidla v reakční směsi je nad asi 400 mM.

z·

o.

vyznáčující výhodou pod

Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, se tím, že reakční směs obsahuje pod asi 2,5%, s asi 2% (objemově) 2-butanolu.
7. Způsob podle kteréhokoli z předcházejích nároků, vyznačující se tím, že se jako výchozí amino——laktam používá kyselina 6-aminopenicilanová, 7-aminodesacetoxycefalosporanová, 7-aminocefalosporanová nebo ester kyseliny 7-amino-3-chlor-3cef em-4-karboxylové·
8. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, še se jako acylační činidlo používá D-fenylglycin nebo D-p-hydroxyfenylglycin nebo některý z jejich derivátů·
9· Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků vyznačující se tím, že vzniklým -lektamovým derivátem je ampicilin, ^rnoxicilin, cefsclor, cefalexin nebo cefedroxil.
10, Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že koncentrace amino-y?-laktamu v reakční směsi se pohybuje v rozmezí od asi 50 do asi 750 mM, počítaje v to nerozpuštěný amino- ^-laktam, s výhodou nad asi 100 mM, výhodněji nad asi 150 mM a nejvýhodněji nad asi 20Ó mM,
11, Způsob podle kteréhokoli z předcházejích nároků, vyznačující se tím, že počáteční koncentrace amino- ^>-laktamu v reakční směsi, se pohybuje v rozmezí od asi 50 do asi 750 mM, počítaje v to nerozpuštěný amino- ^>-laktam.
12* Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že koncentrace acylačního činidla spplu s koncentrací fp -laktamového derivátu v reakční směsi je nad asi 450 mM, a to s výhodou, připr_fivuje-li se amoxicilin.
13. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že počáteční koncentrace acylačního činidla v reakční směsi je nad asi 450 mM, s výhodou pokud se připravuje amoxicilin.
14_ř Způsob podle,kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že koncentrace acylačního činidla spolu s koncentrací /^-laktamového derivátu odpovídá nad asi 500 mM, s výhofou nad asi 650 mM a nejvýhodněji nad asi 700 mM.

-1715 · Způsob vyznačující se tím, je nad asi 700 mM.

podle kteréhokoli z předcházejících nároků, že počáteční koncentrace acylačního činidla l6. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se reakce provádí za teploty v rozmezí od asi 0 do asi 35°C, s výhodou nad asi 10°C.
17. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se reakce provádí za hodnoty pH v rozsahu od asi 5 do asi 7.
18. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se výchozí amino-Z^-laktam připravuje υ

hydroiysou pq^picilinu V, penicilinu G, kyseliny 7-fenoxyacetamidodesacetoxycefalosporanové (V-DCA), kyseliny 7-fenylacetamidodesacetoxycefalosporanové (G-DCA) nebo cefalosporinu C či někte rého z jejich derivátů, a případně se odděluje postranní řetězec, uvolněný hydroiysou.
19. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že počáteční množství acylačního činidla v reakční směsi je vyšší, než to. odpovídá rozpustnosti řečeného s * činidla v reakční směsi a výhodou je asi nad 50% rozpustnosti řečeného činidla v reakční směsi.
20. Způsob podle kteréhokoli z« předcházejících nároků, vyznačující se tím, že počáteční množství acylačního činidla v reakční směsi odpovídá asi více než polovině rozpustnosti řečeného činidla plus počátečního množství amino-f^-laktamu v reakční směsi a s výhodou množství acylačního činidla v r--akční směsi je nad hranicí rozpustnosti řečeného činidla v reakční směsi plus počáteční množství amino-^-lsktamu v reakční směsi.
21. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, .že ecylačním činidlem je amid nebo ester obsahující 1 až 3 atomy uhlíku v esterové části, s výhodou vsakamid, nejvýhodněji amid, kde skupina -CElíI^ je ge^ubstituována.

-1822. Způsob podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že použitý enzym je z Escherichia coli. Acetohacter pasteurianum. Xanthomonas citrii, Kluyvera citronhila a Bacillus megaterium.
23· Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že použitý enzym může být klasifikovaán jak EC 3.5.1.11.
24. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že použitý enzym je schýný bydrolysovat penicilín G nebo ampicilin.
25. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se použije enzymově aktivní, opakovaně použitelný biologický materiál.
26. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se enzymová reakce provádí ve vodném systému, případně za přítomnosti organického rozpouštědla.
27. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, ze výtěžek získaného A-laktamového derivátu činí nejméně 90% (molárně), přepočteno na celkové množství /fy-laktamového jádra, s výhodou nejméně asi 95% (molárně).