SK381392A3

SK381392A3 - Process for production of beta lactams

Info

Publication number: SK381392A3
Application number: SK3813-92A
Authority: SK
Inventors: Sven G Kaasgaard; Ulla Veitland
Original assignee: Gist Brocades Bv
Priority date: 1990-07-04
Filing date: 1991-07-03
Publication date: 1995-11-08
Also published as: EP0537255B1; ES2258260T3; DE69133509D1; NO930006D0; AU8208691A; KR100222606B1; PT98205B; JP3115593B2; DE69133509T2; WO1992001061A1; ATE317912T1; JPH05507623A; ZA915142B; NO930006L; US5525483A; RU2136759C1; NO307710B1; CA2086250A1; FI925988A; CA2086250C

Description

Oblast techniky

Vynález se tyká zpúsobu prípravy a výroby β -laktamových derivátú enzymovým acylováním matačnýoh amino- /fi-laktamú púsobením acylujícího Činidla· Jako amino-^ilaktam se múže použit kyselina 6-aminopenioilanová (nadále 6-APA), 7-aminodesacetoxycefalosporanová (nadále 7-ADCA), 7-aminocefalosporanová (nadále (7-ACA) nebo nekterý ester kyseliny 7-amino-3chlor—3-oeŕem-4-karboxylové$ acylujícím činidlem múže být derivát D-fenylglycinu nebo D-p-hydroxyfenylglycinu,

Dosavadní stav

V tuto dobu se polosynthetické ^-laktamy, jako Je ampicilin, amoxicilin, cefaclor, cefalexin, cefadroxil a cefaloglycin pŕipravují prúmyslovš chemickými aynthesami, napríklad reakci amino-<0 -laktamu, jako je kyselina 6-aminope ničila nová, jejíž karboxylová skupina je obvykle chránená, s aktivovaným derivátom postranního ŕetezoe· Potom se odstráni hydrolysou krycí skupina, Se zretelem napríklad na výtežek je nutné, aby amino--laktam, napŕíklady tedy 6-APA, byl použit v suché a čisté forme, s výhodou o čistote nad 97z’i· Tak napríklad lze pŕipravit ampicilin (kyselinu 6-D-,^·-aminofenylacetamidopenioilanovou) reakci 6-APA s vhodne krytou karboxylovou skupinou, s chloridem D-fenylglycinu, načež se hydrolysou odstráni krycí skupina. Taková reakce obvykle zahrnuje volmi nákladné stupne, jako je práce za teploty pod 0°C s použitím rozpouštédel, jako je methylenchlorid, jakož i silylačních činidel,

Enzymový príprava ampicilinu z čisté kyseliny 6-APA a derivátu D-fenylglycinu, jako je nekterý z nižších alkylesterú, je známa ze západonemecké patentové prihlášky 2 163 792, dále z —2— rakouského patentového spisu 243 986, holandské patentové prihlášky 70-09 138, západonemecké patentové prihlášky 2 621 618 a evropské patentové prihlášky 339 751· Dŕíve popisované postupy typicky používaly menší množství, než je 50 mM derivátu D-fenylglyoinu a pod 25 m2S 6-APA, a najvyšší dosažený výtéžek činil dle evropské patentové prihlášky 339 751 88%.

Amino-ýVlaktam, jako je 6-APA, se obvykle získává enzymovou hydrolysou fermentovaného penicilínu, napríklad penicilínu V nebo penicilínu 0 s následujícím odstránením uvolneného poetranního ŕetezce (kyselina fenoxyoctová atd)· Kromš nečistôt, pocházejícíoh z fermentování, obsahuje takto získaný surový roztok typicky amino-/^-laktam v koncentraci 150-200 mM« Surový roztok se dá vycistit a krystalováním se takto získá čistá 6-APA nebo

7-ADCA ( v pŕípadš 7-ADCA se podrobí fermentovaný penicilín ješté dalšímu postupu pred provedením hydrolysačního stupné).

Závažnými nedostatky známých enzymovýoh postúpil pri výrobé ampicilinu, amoxicilinu a cefalexinu (z zadného postupu se nepodarilo dospet k priemyslovému využití) jsou vysoké náklady (ztráty na výtežku), jakož 1 investiční náklady na provedení operaoí, probíhajících v nákladných zaŕíženích, hlavné isoluje-11 se* čistí a duší amino-j)3-laktam pred použitím jako surovina pro reakol, jež vede k polosynthetiokému ^-laktamu. Dále pak použitelná výchozí koncentrace 6-APA je velmi nízká (typicky pod 50 mM) a tím se znesnadnuje a hodne prodražuje isolování vzniklého ampicilinu. Takže je žádouoí dosáhnout vyšších výtéžkft pri enzýmové príprave ampicilinu.

Zpúsob enzýmové synthesy amoxicilinu byl popsán v Agric.

Biol,Chem. M. 821 (1980)j provádí se v prostredí, obsahujícím objemové 2,5% či více 2-butanolu a 5% dalsího alkohold či alkohold. Použije-li ce nekterý z posléze uvedených alkohold nebo 2,5% hutenatka 2-butanolu, pak je poSáteční koncentrace výchozí látky, tedy jak methylesteru D-<X-(p-hydroxyfenyl)-glycinu tak i 6-amin£penicllanové kyseliny velmi nízká, napríklad 100 a

') ' r~‘ ''ί ' ‘'.v ^r-. ’j·* ^r .'/*·*>’ 'J**· ··’ A •j.“¹»::⁴’*:;.·· «*;··. · . -i :\. .·..>· )·/.»;· „·’Ίΐ(··. r ~iy •Ä'ivíii ·.' .t*ú ·>#·

5/' .r·.-* λ·>

t+750 Ä v tom kterém pripadá· P?í počáteční koncentrace výchOBÍci;lM$l^

D- -( p-hydroxyf enyl)-gly ointt ^'^;l^^.alÍ^<feíSÄpíMetó^ÄoR^'' 460 a 2J0 nM v tom kterém .^rSVV.rýj, ·- je na to, že použitývíce ne2 iOÔ;^- _____ ' ·'·’*’·* w'·- ^;'.j·./ ·<.» '&£.ŕ , A -y-i ?'$'· xyfenyl)-glycinu a nad 50 rôS 6^aainopenlciXan©Texyeeltäy eeela r patrným zpúsobem potlačuje na amoxicilin. Záver b tohoto ná, že nelze zvyšovet konceňtŕa.á|L|:'íe^Bí^ činidla v reakční sešsí.

Po d a tu podání prihlášky nále zu, to tiž 18-21,09· 1990, - by

NATO; týka se to prípravy má postup, provádený za· nízká':tepläty;|Ä©^Ô^k;/^sx^y^^tt^áÍBAÄ.._ na prúbeh reakce· Nejvyšší\kehóéh^á^e^9^l^í^^^íW^B^íWÍr|^1^b^^.;? tého pri tomto postupu,' ý ctn Λ oni Λ4β1*Λΐρ'^Λή?ν:’:^#Λ·*Χ+»«4ΐ.ΐί#<^%^^Λ'Λ t^·-:/·'/+*’+''.

Podstata tohoto .vynálezu

t. .-a . -^-^ί·.’^·’?/^'-.''*^’·’·.'. ^í-Sp^r-'j’.ťiú-i Ά&Ρ PA·,i.^;-.-' --/...-,j* -y-Z :·ν·+⁴:.·?Λ./_;ί-^;Λ;-·: +-'+' .+· '·' .'. 'i;; >·. U-1;

Nyní bylo s prekvapením’Bjišt^hoŕ' ze ee 'WlÉ^ýšil.^ýtáSek:

pri enzýmová príprave derivátú provádeňíÄ ieákce .

za vyšších kone en trs cí acyluá£cí&^ . -..¹

Takže na dále výrazy amino-^4lalc$É^ Č jOyäl0'ýá'^?/'+ derivát β -laktamu odpovídají dváma výchozím látkán v tom'kterém prípade a produktu, jak s e /sdískáyá nálezu. Takže postup podie tohoto-výíiáláBÚiΛβθ'W^hytlt .ec^ffiép·;; ' tem: ..Ay3 Ayy.A JŽS&f'A' y^y y. ,.A\P 33/ .

amino-$>-laktam + acylující činidlo;'..»derivát -laktamu

Derivát /^-laktamu má podstatné yýšší ^ a vlastnosti ve srovnání s wai.äe+$!3LBti^^

-4volnou aminoskupinu, jež sé postupem podie tohoto vynálezu acyluje# Acylující činidlo muže být ve formé volné kyseliny* nebo v aktivované formé, jako je nékterý z amidú Si esterú·

Takže výraz ^-laktamovó jádro zahrnuje jak amino- 0-lektaa tak i (β-laktamové deriváty· Takže zmiňovaná koncentraoe 0-laktamového jádra znamená koncentraci amino-^-laktamu ♦ koncentraoi derivátu -laktamu·

Je velmi dúležitým zjiäténím pri postupu podie tohoto vynálezu, že koncentrace acylujícího činidla 4- koncentraoe derivátu /P-laktamu v reakční smési se múže pohybovat nad 400 hU* Jednou z možností, jak dosáhnout takovéfe koncentraoe v reakční smési je postupné pridávání acylujícího činidla do reakční smési v množství dostaôujícím k tomu, aby počáteoní koncentraoe scylujícího činidla v reakční smési činila více, než 400/sB,

Pri postupu podie tohoto Vynálezu je možné a velmi lákavé použití surového roztoku amino- /^-laktamu, napríklad 6-APA nebo 7-ADCA bez jakóhokoli redéní· Odpadá tak ztráta amino-^3<r laktamu, napríklad 6-APA nebo 7-ADCA v prúbéhu čistení a/nebo i ao lační stupné, jakož i investice do čistících zaŕízení pro napríklad ampicilin, amoxocilin a cefalexini ty se sníží na minimum, protože se dají použít ona čističi zaŕízení,, která se dŕíve použila pri isolování 6-APA a nyní pro istiaci ampioilinu, amoxicilinu a cefalexinu.

S výhodou lze dosáhnout postupem podie tohoto vynálezu vysokých výtéžkú bez nutnosti práce za nízkých teplôt a bez organických rozpouštédel, jako je methylenchlorid® Takže pri práci za teploty 20°C lze dosáhnout v prípade ampicilinu výtéžku 96%.

Podie tohoto tedy tento vynálezu zajičfcuje zpúsob enzymové prípravy amino-(p -laktamu, napríklad kyseliny 6-aminopenicilanovó, 7-aminodesacetoxycefalosporGnové, 7-aminocefalosporanové nebo esteru 7-amino-3-chlor-3-cefem-4-karboxylové kyseliny púsobením acylujícího činidla, jako je napríklad derivát D-fenylglycinu nebo D-p-hydroxyfenylglycinu.

Podie jednoho aspektu se postup podie tohoto vynáBfeSU'J vyznačuje tím, že se koncentraoe výchozího amino-/^-laktamu j v xeekční smesi pohybuje v rozmezí od» asi 50 do asi 750 xaBä>'Í s výhodou nad asi 100 ?nM, výhodné ji nad asi 150 nM a nejvýhod* néji nad asi 200 mM· Podie jiného aspektu se postup podie tohoto vynálezu vyznačuje tím, že počáteční koncentraoe výohoziho amino-^b laktamu v reakční smési se pohybuje v rozmezí od asi do asi 750 mM, s výhodou nad asi 100 mM, výhodnéji nad asi 150 mM a nejvýhodneji nad asi 200 mM. Podie dalšího aspektu se postup podie tohoto vynálezu vyznačuje tím, že počáteční j množství acylačního činidla, napríklad derivátu D-fenylglyčinu nebo D-p-hydíoxyfenylglyoinu v reakční smési je vyšší, než to'\ odpovídá rozpustnosti ŕečeného činidla v reakční smési a s výhodou nejméné nad asi nejméné 50%, vztaženo na rozpusnost tečeného činidla. Nebo počáteční množství aoylačního činidla v reakční smési je vy#ší než to odpovídá polovine rozpustnosti ŕečeného aoylačního činidla + počáteční množství amino-^-laktamu v renkční smési, s výhodou tedy nad rozpustnosti aoylačního činidla v reakční smési + počáteční množství amino-ý^¹ -Isktamu. A ješté podie dalšího aspektu se tento vynález týká postupu, kdy koncentra ce aoylačního činidla + koncentraoe derivátu /^-laktamu v reakční smési je nad asi 450 mM, s výhodou nad asi 500 mM, výhodnéji nad asi 650 mM a dokonce nejvýhodneji nag/ asi 700 mM. Podie ješté dalšího aspektu se tento vynález týká postupu, kdy počáteční koncentraoe aoylačního činidla v reakční smési je nad asi 450 mM, výhodnéji nad asi 500 mM, ješté výhodnéji nad asi 650 mM a dokonoe nejvýhodneji nad asi 700 mM·

Výhody podie tohoto vynálezu jsou, kromé jiného, tyto:

1) Odpadá použití organického rozpouštédla, jako je methylenchlorid a tím odpadá i znečistení ovzduší,

2) Odpadá použití silylačního činidla,

3) M&že se opomenout extrahování za nízkych teplôt, jako je 0^ο0„

-64) Vysoká koncentrace reagujících složek je velkou výhodou pri následujícím čistšní,

5) Získávaný -laktamový derivát se vyznačuje vysokou čistotou, nevídanou s porovnáním s dosavadni výrobou,

ó) Obsah vedlejších produktú v reakční smesi odpovída velmi nízke úrovni,

7) Ve srovnání s chemickými synthesami je nezbytnš nutný menší počet reakčních stupňú·

Podrobný popis tohoto vynálezu

Jako príklady $ -laktamových derivátú, které se mohou vyrobit postupem podie tohoto vynálezu, lze jmenovat ampl£ cilin, amoxicilin, cefaclŕ, cefalexin, cefadroxil·

Acylaoním činidlem múze být derivát D-fenylglycinu nebo

D-p-hydroxyfenylglycinu, jako je nekterý nižší alkylester, treba methyl·; ethylťg n-propyl- nebo 'isopropylester, nebo amid, nesubsíituovähýve skupine -CQIíHg. Za výhodné látky lze označiť amidy. Derivát 3e múze použít ve forme soli, napríklad kyseliny chlorovodíkové nebo sírové· Acylační činidlo je možno pŕidávat v odpovídající aktivní forme, nebo se múze tato aktivní forma tvoŕit in situ.

Enzymem, použitelným pri postupu podie tohoto vynálezu, muže být kterýkoli enzým, katalysující predmetnou reakci. Takové enzymy jsou známé od r. kolem 1966. Použitelné enzymy zahrnují napríklad penicilin-amidasu nebo penieilin-axtósastHxacylasu a jsou klasifikovány jako E.C. 3·5·1·11· Tato účinnost je známa u velkého počtu mikrobiálních enzymú, napr. z Acetobaoter. hanthomonas. Mycoplana. Pr o tamino ha c t er. Aeromonas (viz západonémecká patentová prihláška 2 163 792), Pseudomonas (austrálsky patentový spis 243 986), Flavo ba c t er ium (holandská patentová prihláška 70 09 138). Aphanocladlum, Cephalosporium (západonémecká patentová prihláška 2 621 618). Acetobaoter pasteurianura, Bacillus megaterium. hanthomonaa citril (evropská patentová prihláška /

339 75i), Kluyvera citrophilla (Agr.Blol.Chem. ²797 (1973), ^a Escherichia coli (západonémecká patentová prihláška 2 930 794)· Posleze uvedený mikroorganismus je obchodne dostupný. Jako enzým se múže rovneŽ použít tzv.ampicilin-hydrolasa, -acylaea nebo -amidasa. V této souvislosti se krome jiného odkazuje no. časopis Hakko to Kogyo 38. 216 (1980); obsah je zd< dále pripojen.

Je výhodné používat takový enzým ve forme k použití kdykoliv, napríklad tedy uchovávaný v nejaké nádoboe nebo v imobilisované forme. Imobilisování lze provóst jakoukoli ze znániých method, pŕičemý imobilisovaný mikroorganismus Escherichia coli je bežné obchodné dostupný od Boehringer Mannheim GmbH (Néraécko) pod obohodním označením Enzygel. a

Postup podie tohoto vynálezu se obvykle provádí v prostredí, obsahujícím vodu, ®le je-li to vhodné, lze pŕidat organické rozpouštédlo.

Rozpustnost acylačniho činidla, jako je nékterý derivát D-fenylglycinu neho D-p-hydroxyfenylglycinu bude kolís.at v závislosti na tom Či onom derivátu, jakož i na složení reakčního prostredí. Ve vodném prostredí, jak je používáno v pŕíkladech, bude rozpustnost hydrochloridu amidu D-fenylglycinu činit asi 450 psM. Avšak rozpustnost značné závisí na solích jako složkách roztoku, jekož i na hodnote pH a na teplotu roztoku. Pri nekterých provedeních postupu podie tohoto vynálezu tvorí počáteční reakční smes suspensi, obsahující nerozpustené acylační činidlo a/nebo ^-laktam, s k rozpustení dôjde částečné nebo dokonale v prúbčhu reakce. Vzniklý β -laktam se múže vysrážet v prúbehu reakce, a múže se rovnéž vysrážet produkt či produkty hydrolysy acylačniho činidla, jako je D-fenylglycin a D-p-hydroxyfenylglycin. Takže v nékterých prípadoch bude reakční smés ve forme suppense po celou dobu prúbehu reakce.

Amino-^-laktam, napríklad 6-APA nebo 7-ADCA, jak se používa pri postupu podie tohoto vynálezu, se múže pŕipravit anzymovou hydrolysou fermentačné pripravených penicilinú nebo

I cefalosporinú, jako je napríklad penicilín V, penicilín G nebo cefalosporin C nebo jejich analogÄ s rozšíreným kruham, napríklad V-DCA a G-DCA nebo odpovídajících Jejich derivátft s následujícím oddelením vedlejäích produktft, vzniklých hydrolysou* Jako jô tomu napríklad u kyseliny fenoxyoctové a podobných* S výhodou se muže surový roztok použít pŕímo bes jakéhokoll dalšího čistení nebo redení*

Reakční teplota pri postupu podie tohoto vynálezu kolísá mezi asi 0°C a asi 35°C, zvláste v rozmezí od asi 10°C do asi 30°C* Pro bežne provádené postupy jsou výhodné teploty v rozmezí od asi 20 do 30°C, Vhodná hodnota pH je závislá na typu a čistote enzýmu. Za použití enzýmu z Escherichia coli bude hodnota pH se pohybovat s výhodou v rozmezí od asi 5,5 do asi 7,5, s 5?odou od asi 6,1 do asi 7. Pri príprave amoxicilinu je výhodná hodnota pH v rozmezí od asi 5,7 do asi 6,4* Hodnotu pH lae pr&bčžne kontrolovat. Za vhodnou reakční dobu Ize cznacit roamozí od nekolika minút do nekolika hodín, zvláste od asi 30 minút do asi Q hodin* Vhodná koncentrace enzýmu múze kolísat od asi lU/ml do asi 100 U/ml (1 U odpovídá jeónotce enzymové aktivity, viz ješte dále)«

Pri vyu^Jžftf postupu podie tohoto vynálezu Ize dosáhnout mimorédné vysokých výtčžkň. Vysokých výsledkä se uá rovnéž dosáhnout použitím výsledkl' podie tohoto vynálezu a vhodnou volbou koncentrace acylačního Činidla, využitím pomeru mezi koncentrscí aoylačního činidla a výchozích amino_/^)-laktamu_p hodnoty pH a príslušného enzýmu*

Produkt Ize isolovat a čistit postupy, které jsou jako takové obecné známé, napríklad krystalováním.

Ľefinice a postup?/ analysování

Enzymová aktivita

K definovaní aktivity penicilin-G-acylaéýse postupuje takto: jedna jednotka (U) odpovídá onomu množství enzýmu, jež zhydrolysuje za minutu 1 umol penicilínu G za standárdisovsnýhh podmínek (5% penicilínu G, 0,2 M pufr z fosforečnanu sodného, pH 8,0, 28°G).

kapalinová

VysokotlakováVanalysa reakčníaložek:

-9Kolona: RP LC-18

Hlučná činidlo A: Hluční činidlo B:

(250 x 4,6 mm; 5 pm) miĎí fosfátový pufr, acetonitril pH 6,5

Gradient čas v minutách až 10 10 až 20 eluční činidlo B %

- 20

Prutok: Ϊ ml/min, úetekce pri 215 nm.

Retenční doba v minutách: 4*1 (L-PG)j. 6,3 (7-ADGA); 8,1 (b-APA); 3,1 (D-PGA); 13,4 (cefalexin), 13.5 (nmpicilin)i 18 (D-PGm).

Vysokotlako\^rá kapalinová chromátografie amoxicilinu

Kolona: RP LC-18, 5 ^m (250 x 4,6 mm)

Rozpouštedlo: 5% acetonitrilu v SS 25 mM fosfátového pufru, pH 6,5, prútok: 1 ml/min, Detekce v UF: 215 nm

Retenční doby v minutách: 2,5 (D-p-hydrcxyfenylglycin), 3,3 (IIP GA)i 5m4 (6-APA); 13,2 (amoxlci lin)

Vynález je dále doložen pripojenými príklady, jimž však není jeho rozsah jakkoli omezován.

-10Pŕíklad 1

Enzymová synthesa ampicillnu

Roztok 100 núl 6-APA a D-PGA v koncentraci ch, jak á® to uvedeno v tabulce 1 se upraví na hodnotu pH 6,4, uvede se do rovnovážneho 3tavu za teploty 20°C a pridá se 345 U rozpustného enzýmu z Escherichia coli (Gesellschaft fur Biotechnologische Porsciiung GmbH, BranGáchweig, Nemecko), Celkový objem: 20 ml.

Synthesa se provádí za teploty 25°C a konstantních podmínek, pokud se pH týká. Nejvyšší výtéžky podie vyhodnocení vysokotlakovou kapalinovou chromatografií jsou patrná z tabúlky 1.

T a b u 1 k a._ 1 nM D-PGA najvyšší výtežek ampicílinu, % kekční doba, hodín

270

750

Príklad 2

Enzymová synthesa cefalexinu

Podobný postup, jako v príkladu 1, ale použije se místo 6-APA 100 mM 7-ADCA. Za uvedených podmínek se získá cefalexin a nejvyšší výtéžky za rúzných koncentraci ΰ-PGA.HCI jsou uvedený v tabulce 2.

Tabulka 2 mM D-PGA.HCI nejvyšší výtežek cefalesinu,

Λί*

300

700

-uPríklad 3

Závislúst na pH

Hodnota pH smési 250 mM 6-APA a 700 mM soli kyseliny sírové a D-PGA se upraví na hodnotu, jak je uvedená v tabuloe 3 a ensymová synthesa se pxovede za teploty 20° a konstantních podmínek pK; celkový objem 20 ml za použití 700 U rozpustného enzýmu z Escherichia coli

T a b u 1 k a 3

Hodnota pH	najvyšší výtéžek arapioilinu, %	reakční doba hodin
6,0	60	48
6,4	94	\ 21
7.0	93	3

Príklad 4

Závislost na teplote

Vychází se z 180 mM 6-APA a 700 mM I)-PGA «a hodnoty pH

6,4 a 600 U rozpustného enzýmu z Hscherjchla coljl; celkový objem 20 ml; synthesa se provádí za teplotních podmínek, jak je to uvedeno v tabulce fy, tamže jsou rovnéž nejvyéší výtéžky

ampicilinu.	T a b u 1 k a 4	•
f Teplota °C	ne jvyšší výtéžek %	\ -V reakční aoba, hodin
10	95	72 \
20	96	22
35	60	4
Príklad 5

Tento príklad byl proveden obdobné jako postup z pri kla· du 1, ele za použití D-PGM místo D-PGA. Najvyšší výtéžky ampicilinu, jak byly dosažany, jsou v tabulce 5·

Tabúl ka 5
D-PGM, mM	Vzniklý ampicilín, %	reakční doba, hodín
270	74	12
700 ,	86	25
Príklad 6

Penicilín V, Sáatečne vyoisténý s fermentační zápary filtraci,, extrakcí do butylacítátu a prevedený zpét do vodné fáze tek, že vznikne 10%ní vodný roztok (hmota dle objemu) se hydrolysuje semacylásou TM (ímobilisovaná penicilín V-acy~ lasa od Novo Nordisk A/S) za hodnoty pH 7,0, Vzniklá fenoxyoctová kyselina 3e odstráni extrakcí a ke vzniklómu roztoku

6-APA (150 mM), který obsahuje menší množství vediejäích produktu z degradace penicilínu V a 6-APA, se pridá 45 U/ml rozpustného enzýmu z Bsoherichia coli a D-PGA (až do konečné koncentráca\700 mM). Hodnota pH se upraví na 6,4 a reakce se nechá probíhat za teploty 25°C a za udržovaní konštantní hodnoty pH.

Za takových podmínek vznikne celkem 135 mmol ampicilinu (90%) na litr reakčního objemu.

Príklad 7

Použití imobllisované penlcilin-G-acylasy odT firmy Boehringer (Mannheim)

500 mg imobilisovaného enzýmu se suspenduje ve vode až k dosažení objemu 10 ml. Ho stok enzýmu se smíchá s roztokem 6-APA a D-PGA na celkový objem 25 ml vzniklé smesi, obsahující 230 mM 6-APA a 92 0 mM D-PGA o hodnote pH óy.4, to vše za teploty míatnosti. Synthesní reakco se pak nechá p. obíhat za konstantních j

podmínek pH po 22 hodia; bohém té doby 31% 6—APA se pž>e» vede na ampicilín.

Príklad 8

Enzymová aynthesa amoxicilinu

Onen 368 mg 6-ΛΡΛ a 3718 mg HPGA ve vode se upraví na hodnotu pH 6,2 a aa teploty 15°^c se pridá 1656 U roepuatné penicilin-G-acylasy z E.coli až do konečného objemu 29,3 ml, Syáthesa se nechá probíhat za konštantní teploty s za použití 2 M roztoku kyseliny sírové k udržení hodnoty pH na S 6^2,

Po 27,3 hodinách reakční sraée obsahovala 136,6 πώί amoxicilinu, což odpovídá výtéžku 91%, pŕepočteno ns spotrebu 6-APA.

Príklad 9

Bngymfevá syntheaa amoxicilinu

1656 U rozpustné penicilin-G-ecylasy z E,coli se pridá cio smési 6-APA a HPGA (200 raM a 750 raEA konečné koncentrace v tom kterém prípadu), to ve vode za teploty 3C°C a hodnoty pH 6,0. Reakce so provádí S hodia za konštantní teploty i hodnoty pH, jež se udržuje titrací 2 N roztokem sírové kyseliny. Vznikne 190 mM amoxicilinu (95%·), pŕepočteno na. podkladoch vysokotlakové kapalinové chromatografie.

Príklad 10

Enzymová synthssa amoxicilinu

Za podmínek, jak j3ou uvedený v použití 200 mM 6-APA a 450 mM HPGA

S

6-APA na amoxilin v prúbéhu 9 hodin.

príkladu 9, ale za dooílí 9!%ní konverse

Zkrátky

6-APA: 6-arainopeničilanová kyselina, 7-ADCA: 7-aminodesacet14 '’P··'. : ' ' .·».*, .:

D’. '^'íW-SD ·' ·;\-: - 'r ·· ·.' >/.-' ., · t.·,, ·<

. . ··?> '*· '^:···'Λ ,, oxycefalosporanová kyselina} D-PGA: amid D-fenylelyclnuj<' D-PGM methylester D-fenylglyčinu, V-DCA: 7~fenoxyoeGfcamidodesacetoxycefalosporanová kyselina} b-DCA: 7-fanyäacetamidodesacetoxycefalosporanová kyselina a HPGA: j&px ar*id D-$-hýdf0xyfenylglycinu. - _; . ^Λ-

Claims

Patentové nároky

S

1. Zpúsob výroby P -laktamovýoh de.rivát& enzymovau reakci nékterého z amino- ^-laktamú, jako je penicilín nebo jeho derivát, kyselina 7-aminodesacetoxycefaloGporanová,

7-aminocefalosporanová nebo ester kyseliny 7-araino-3-chlor3-ceŕem~4-karboxylové s odpovídajícím acylacním činidle» v; reakční smeai, obsahující méné než 5% (objemové) 2-butanol<, pokud je vznikající ^-laktamový derivát aiaoxiciline» a acylacním činidlera je/D--(p-hydroxyfenyl)glyčinu, vyznačuzlSethyles ter jící se tím, že koncentrace acylačního činidla v reakční sméoi spolu s koncentrací ý%.lsktainového derivátu v reakční smesi je nad asi 400 mfá.
2, Zpúsob výroby ^“laktamovýoh derivátú enzymovou reakci matečného amino- ^-lsktamu s odpovídajíoím acylacním óinidleín v reakční smesi obsaňující mene než 5% (objemové) 2-butanolu, pokud je vznikájícím ^-laktamovým derivátem amoxicilin. a acylacním Činidlám methylester C-Q^-(p-hydroxyfenyl)glycínu, vyznačujici se tím, že koncentrace acylačního Činidla spolu s koncentrací ^-laktamového derivátu v reakční srnési je nad asi 400 mM s teplota pod asi 35^cC.
3.

teplota

Zpúsob podie nároku 1, vyznačujici se tím, že se pohybuje pod asi 35°C.
4. Zpúsob podie kteréhokoli z vyznačujícílse tím, že použitá teplota predcházejících nárokú, je pod asi 30°C.
5. Zpúsob podie kteréhokoli z predcházejících nárokú, vyznačujici se tím, že počáteční koncentrace acylačního činidla v reakční smesi je nad asi 400 mM.
6. Zpúsob podie kteréhokoli z predcházejícíéh nárokú, vyznačujici se tím, že reakční smes obsahuje pod asi 2,5%, s výhodou pod asi 2% (objemové) 2-butanolu.
7. Zpusob podie kteréhokoli z pŕeeoházejích nárokú, vy značujíci ee tím, že ee jako výchozí amino-/y^-laktam používá kyselina 6-aminopenicilínová, 7-aminodesacetoxycefalooporanová, 7-aminoceí‘alosporanová nebo ester kyseliny 7-amino-3-ohlor-3cefem-4-karbcxylcvé.

G, Zpúsob podie kteréhokoli z pŕedcházejících nárokú, vyzncčující se tím, že se jako acylační činidle používa D-fenylglycin nebo D-p-hydroxyŕenylglyoin nebo nékterý r jejich derivátu,
9, Zpúsob pošle kteréhokoli z pŕedcházejícich nárokú, vy značujíci se tím, že vzniklým (β'-lak tonovým derivátom arapicilin, anoxicilin, cefaclor, cefalexin nebo oefadroxil.
10, Zpúsob podie kteréhokoli z pŕedcházejících nárokú, vyznáčující se tím, že koncentrace amino-^?-laktamu v reakční smesi se pohybuje v rozmezí od asi 50 do asi 750 mlií, počíta je v to nerozpustený amino-jj^-laktam, s výhodou nad asi 100 mM, výhodnej! nad asi 150 mM a nejvýhodnéji nad asi 200 mM.
11, Zpúsob podie kteréhokoli z pŕedcházejích nárokú, vyznačující se tím, že počáteční. koncentrace amino-^-laktamu v reakční smesi se pohybuje v rozmezí od asi 50 do asi 750 mM, po číta j e v to nerozpustený amino-^-laktam,
12, Zpúsob podie kteréhokoli z pŕedcházejících nárokú, vyznačující se tím, že koncentrace aoylačního činidla spplu s koncentraci -laktemovóho derivátu v reakční smési je nad asi

450 mM, a to s výhodou, pŕipr_J?vuje-li se amoxloilin.
13· Zpúsob podie kteréhokoli z pŕedcházejících nárokú, vyznacující se tím, že počáteční koncentrace acylaóního činidla v reakční smési je nad asi 450 mM, s výhodou pokud se pripravuj amoxioilin,
14, Zpúsob podie.kteréhokoli z pŕedcházejících nárokú, vysnaôující se tím, že koncentrace acylačního činidla spolu s koncentraci F?-laktamového derivátu odpovídá nad asi 500 mM, s výhofou nad asi &50 mM a nejvýhodnéji nad asi 700 mM.
15 · Zpúsob podie kteréhokoli z pŕedcházejících nárokft, vyznačujíeí se tím, že počátecní koncentrace acylačního činidla je nad asi 700 mM.
16. Zpúsob podie kteréhokoli z pŕedcházejících nár?ik&, vyznačujíoí se tím, ze se reakce provádí za teploty v rozmezí od asi 0 do asi 35 °C, s výhodou nad asi 10°C,
17· Zpúsob vyznaóující se tím, od asi 5 do asi 7.

podie kteréhokoli z pŕedcházejících nárokÄ, že se reakce provádí za hodnoty pH v rozsahu
18. Zpúsob podie kteréhokoli z pŕedcházejících nárokÄ, vyzuačující se tím, že se výchozí amino-((b-lakte» pripravuje hydrolysou penicilínu V, penicilínu G, kyseliny 7-fenoxyaoetamidodesacetoxyceŕslosporanové (V-ĽCA), kyseliny 7-fenyleoetamidodesacetoxycefalosporanové (G-DCA) nebo cefslosporínu C či nekteréhc z jejich derivátÄ, a prípadne se oddeluje postranní ŕetezec, uvolnéný hydrolysou.
19. Zpúsob podie kteréhokoli z pŕedcházejícich nárokÄ, vyznáčující se tím, že počátecní množství acylačního činidla v reakční sméei je vyšší, než to odpovída rozpustnosti ŕečeného S činidla v reakční smesi a výfco&ou je osi nad 50% rozpustnosti ŕečeného činidla v reakční smesi.
20. Zpúsob podie kteréhokoli z& pŕedcházejících nárokÄ, vyznáčující se tím, že počátecní množství acylačního činidla v reakční smesi odpovída asi více než polovine .rozpustnosti ŕečeného činidla plus počátečního množství amino-jp-laktaniu v reakční smesi a s výhodou množství acylačního činidle v reakční smSsi je nad hranici rozpustnosti. ŕečeného činidla v reakční smesi plus počátecní množství amino-^-lakťamu v reakční smesi.
21. Zpúsob podie kteréhokoli z pŕedcházejících nárokÄ, vyznačujíci se tím, že acylačním činidlem je amid nebo ester obsehující 1 až 3 atómy uhlíku v esterové části, s výhodou však amid, nejvýhodneji amid, kde skúpina^^-CBhíh, je ne substituována.

ía
22. Zpúsob podie ktoráhckoli z pŕedchozíeh nárokú, vyznacující ae tím, že použitý enzým je z Escherichia coli. Aoetobacter pasteurjanum. Xanthomonas citrii. Kluyvera oltrophila a Bacillus raegaterium.
23. Zpúsob podie kt réhokoli z pŕedcházejících nárokú, vyznačujúci se tím, že použitý enzým múže být klasifikovaán j-k RC 3.5.1.11.
24. Zpúsob podie kteréhokoli a pŕedcházejicich nárokú, vyznačujúci se tím, že použitý enzým je schpný hydrolysovat penicilín G nebo ampicilin.
25. Zpúsob podie kteréhokoli z pŕedcházejícich nárokú, vyznačujúci se tím, že so použije enzymová aktívni, opakovane použitelný biologický materiál.
26. Zpúsob podie kteréhokoli z pŕedcházejícich nárokú, vyznačujúci se tím, že se enzymová reakce provádí ve vodnéra systému» prípadne za prítomnosti organického rozpouštedle.
27. Zpúsob podie kt réhokoli z pŕedcházejícich nárokú, vyznačujúci se tím, že výtežek získaného --la kt átriového derivátu činí nejmóne 90% (molárne), pŕepočteno na celkové množství (£>-1 akt átriového jadra, s výhodou nejméné asi 95% (molárné).