PT1470234E - Síntese enzimática de ésteres de n (alfa)-acil-l-arginina - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "SÍNTESE ENZIMÁTICA DE ÉSTERES DE N(ALFA)-ACIL-L-ARGININA"

Esta invenção diz respeito a um processo para a preparação de ésteres de Na-acil-L-arginina com actividade protectora contra microrganismos.

Muitos agentes antímicrobianos são conhecidos para protecção contra bactérias específicas e gerais. Porém, a maioria deles mostram incompatibilidades com a pele humana e as membranas mucosas da cavidade bucal, tais como irritações e alergias, e são tóxicos para os seres humanos também.

Por outro lado, foi demonstrado que os ésteres derivados do ácido lãurico e de L-arginina são substâncias biologicamente activas, em particular, o éster etílico da laurilamida do monocloridrato de L-arginina, a partir daqui designado por LAE. O LAE tem a estrutura química da fórmula (1).

Estudos biológicos realizados em diferentes centros de investigação mostraram o LAE como actuando principalmente sobre a membrana externa e citoplasmática dos microrganismos e, também, no meio citoplasmático, impedindo a sua proliferação. A sua acção depende do tipo de microorganismo e do período de exposição. 2

Além disso, o seu metabolismo em ratos ioi estudado mostrando uma rápida absorção e o metabolismo em aminoãcidos que ocorrem naturalmente e o ácido lãurico do ácido gordo, que são eventualmente excretados como dióxido de carbono e ureia. Estudos toxícolôgicos têm demonstrado que o LAE é totalmente inofensivo para os seres humanos e os animais.

Estes factos tornam o LAE e os compostos relacionados muito interessantes como conservantes para alimentos e aplicações cosméticas. A preparação destes produtos por métodos químicos tradicionais tem sido descrita nas patentes ES-515643, WO-A-96 21642 e WO-A-Ol 94292.

Moran et al. descreveram a síntese catalisada por hidrolase de derivados de éster de glicerilo de aminoãcidos protegidos por N-“ {J. Chem. Soc,, Perkin Trans. 1, 2001; 17: 2063-2070).

Clapés et al. descreveram a formação de ligações de éster e de amida entre o grupo de carboxilo de arginina e de uma amina ou álcool gordo (Blotechnology e Bioengineering 1999, 63: 333-343).

Braun e Kuhl descreveram a esterificação com papaína de dipéptidos e protegidos aminoãcidos de Ν“ com etanol {Pharmazle 1997; 52: 203-206) .

Foi o objectivo da presente invenção o de fornecer um novo processo para obter tal tipo de compostos, que é mais eficiente e mais selectivo do que os métodos químicos tradicionais, e, portanto, garante produtos finais livres de subprodutos e fáceis de isolar. 3 A existência de percursos de degradação metabólica reversível para este tipo de compostos representa quase um caminho natural para se alcançar o LAE. Deste modo o processo da invenção fornece um processo por reacções enzimáticas revertidas em solventes orgânicos para se obter o LAE e compostos semelhantes a partir do seu ácido orgânico rapidamente disponível correspondentemente. A síntese da invenção refere-se à obtenção de ésteres de N-a-L-acil-arginina de acordo com a fórmula (2), em que:

X": é Br"' Cl'1 ou HSCV R1; é uma cadeia de alquilo linear de um ácido gordo saturado ou ácido de hidroxilo de 8 a 14 átomos de carbono ligados ao grupo de α-aminoácidos através de uma ligação de amida. R2: é uma cadeia de alquilo linear ou ramificada de 1 a 18 átomos de carbono ou de um grupo aromático. -NH3

nh2 nh2

e n pode ser de 0 a 4; a partir do ácido orgânico adequado da fórmula (2) em que R2 é -H. (2)

X 4 (2) X 4 Θ coor2 R3-(CHi)„-/ NHRi 0 composto mais preferido da classe de compostos acima é o LAE. A invenção é ilustrada nas figuras 1 a 4:

Figura 1 - Preparação de LAE, relação de rendimento-tempo;

Figura 2 - Preparação de LAE, relação de rendimento-tempo;

Figura 3 - Dispositivo para a realização do processo da invenção;

Figura 4 - Preparação de LAE, relação rendimento-tempo. A biocatãlise utilizando enzimas nas reacções de hidrólise reversas para se obterem produtos com interesse industrial importante é descrita em muitas referências.

Este tipo de processo pode ser realizado num meio aquoso, com ou sem solventes orgânicos miscíveis ou imiscíveis, ou em um solvente orgânico, ou sem qualquer solvente de todo. Neste último caso, a reacção tem naturalmente de um conteúdo mínimo de água para que ela tenha lugar, como a enzima caso contrário perde a sua actividade sob tais circunstâncias. O solvente orgânico geralmente contém menos de 1% em peso de água, e é referido como solvente orgânico de baixo conteúdo de água.

Frequentemente, o conteúdo de água ê fixado no início da reacção e nenhum controlo é realizado ao longo do processo, no entanto, em 5 reacções em que a água é consumida ou produzida, o conteúdo de água toma-se um valor critico e tem de ser controlado pela adição ou eliminação de água a partir do meio usando hidratos de sal ou por outros meios hidratantes ou de drenagem física e/ou química. O conteúdo de água em um meio orgânico é frequentemente medido como a actividade de água. A magnitude da actividade de água representa a quantidade de água não ligada e depende do conteúdo de água, mas também da natureza do solvente. A actividade de água é um parâmetro termodinâmico definido como a proporção da pressão parcial do vapor de água acima da solução em questão para aquela acima da água pura à mesma temperatura e à mesma pressão total, quando o equilíbrio entre o líquido e a fase gasosa foi atingida. Então a actividade de água é essencialmente igual à humidade fracionária na fase gasosa. A atividade de água de água pura tem um valor de 1.

Além do conteúdo de água, o tipo de solvente, o pH empregue e a temperatura pode afectar a cinética, a produtividade e/ou ossubprodutos do processo, uma vez que todos estes factores têm uma influência sobre a actividade enzimática.

Como afirmado anteriormente, a reacção de hidrólise inversa catalítica é realizada regularmente sob condições de uma baixa quantidade de água. Por outro lado, as enzimas não são solúveis em solventes orgânicos, apesar da presença de baixas quantidades de água. Isto foi resolvido pela adsorção em suportes sólidos. A adsorção pode ser alcançada através da adição da quantidade necessária do adsorvente à mistura ou reacção ou por sefornecer a enzima, pré-adsorvida ao suporte. Se o método de pré-adsorção é seleccionado, em seguida, a enzima tem de ser absorvida no nível 6 correcto de ionização por meio de um tampão de pH correcto ao processo de adsorção.

Esta invenção diz respeito a um novo método para a produção de ésteres de N^-acil-L-arginina com actividade microbiológíca, derivados de um ácido gordo e de L-arginina, de acordo com a fórmula (2) , utilizando o ácido orgânico apropriado como matéria-prima e enzimas em um meio de baixo conteúdo de água. O método ê baseado na esterificação enzimaticamente promovida de um acido de N“-acil-L-arginina, que possui uma cadeia de alquilo linear de um acido gordo saturado ou com o ácido de hidroxilo de 8 a 14 átomos de carbono ligados ao grupo de α-aminoácido através de uma ligação amídica, com um álcool que consiste de uma cadeia linear ou ramificada de 1 a 18 átomos de carbono ou de um grupo fenilico. Este método tem uma elevada selectividade, está isento de subprodutos, utiliza condições moderadas e envolve reagentes e solventes de baixa toxicidade. A enzima pode ser obtida a partir de uma fonte microbiana, ou a partir de células ou tecidos vegetais ou animais e pode estar presente, como uma mistura purificada ou bruta, relativamente impura de vários tipos diferentes de enzimas. A preparação enzimática pode estar sob qualquer forma, tal como um pó livre, ou um pó liofilizado, ou ligada covalentemente ou adsorvida sobre um suporte sólido. A enzima pode ser utilizada como uma dispersão livre na mistura da reacção ou sobre um suporte sólido, feita de materiais tais como polipropilenos, poliamidas, terras diatomáceas, argilas, zeólitos, carvão vegetal activado, celulose de carboximetilo, ésteres de celulose e outras celuloses substituídas, resinas de trocas iõnicas, polissacãridos insolúveis, gotas de vidro porosas, óxido de alumínio, celite ou gel de sílica. A forma 7 de realização mais preferida para a síntese de LAE é a de utilizar um suporte sólido, e entre eles, a celite. Faz com que a enzima seja mais fácil de remover a partir do meio de reacção por métodos habituais (por exemplo, filtração, centrifugação) e para reciclã-los para um novo arranque do processo. O processo da invenção é realizado na presença de uma hidrolose. As enzimas que são adequadas para a preparação dos compostos de fórmula (2) são as lipases e as esterases, uma vez que é formada uma ligação de éster, e as peptidases e as proteases, uma vez que os substractos principais são derivados de aminoãcidos naturais. Entre elas, as enzimas mais adequadas são as proteases, tais como bromelainas, clostripaína, colagenases, elastases, ficina, calicreínas, metalopeptidases, papaína, quimopapaína, pepsina, peptidases, proteinases, tripsinas, quimotripsinas e carboxipeptidases, mas a escolha depende do produto de reacção desejado, uma vez que a enzima é escolhida pela sua afinidade e actividade específica para os dois substractos, o ácido orgânico e os precursores alcoólicos. Portanto, para a síntese enzimãtica de LAE, a clostripaína, ficina, calicreínas, papaína, quimopapaína e tripsinas são preferidas, mais preferivelmente a papaína de Caríca papaya.

As enzimas têm sido absorvidas nos sólidos sólidos referidos anteriormente na invenção de acordo com técnicas usuais bem conhecidas de um especialista na matéria, tais como a liofilização ou humidificação, ao nível adequado de ionização fornecidas por meio de uma solução-tampão de pH. O pH, para trabalhar a partir de papaína de Caríca papaya é de 3 a 10, preferivelmente entre 8 e 8,5. 8

Como alguns álcoois são líquidos, a reacção pode prosseguir sem a adição de solventes adicionais. Em todos os outros casos, para dispersar os sistemas enzimáticos e os reagentes ou para os solubilizar, um solvente deve ser utilizado como, por exemplo, quaisquer dos álcoois estericamente impedidos, acetonitrilo, éteres cíclicos, hidrocarbonetos clorinados, cetonas, ésteres, éteres, hidrocarbonetos aromáticos e hidrocarbonetos alifáticos. Em geral todos estes solventes são adequados, uma vez que dissolvem os reagentes e não afectam a actividade enzimática. A composição de solvente é totalmente dependente do produto, que é pretendido. A água ou uma solução-tampão adequada também pode ser adicionada, para atingir o melhor conteúdo de água para a actividade enzimática. Então, em um elevado conteúdo de água o processo de hidrólise ê importante, mas a um nível muito baixo de conteúdo de água o processo de hidrólise não ocorre, a enzima perde a sua actividade. A atividade de água preferível para o processo da invenção está entre 0,02 e 0,1. A actividade de água para a papaína de Carica papaya situa-se entre cerca de 0,03 e 0,5, mais preferivelmente de 0,05 a 0,2, mais preferivelmente de 0,06 a 0,09.

Para aumentar o rendimento da reacção, em alguns casos, é necessário remover a água gerada empregando um método químico e/ou de drenagem física, na forma de trocadores de água ou sais hidratados ou secantes químicos ou seivas moleculares ou destilação azeotrópica, mas a um tal ritmo que o conteúdo de água no meio de reacção não caia abaixo do conteúdo mínimo de água para a actividade enzimática. Essas ferramentas para remover a água podem estar no interior do recipiente de reacção ou em um local separado através do qual uma determinada quantidade do meio de reacção, filtrado ou não, é reciclado. 9 A temperatura deve ser definida no ponto de congelamento do solvente, por exemplo, -50 °C para o hexano ou -45 °C para o acetonitrilo ou 11 °C para 1,4-dioxano e, abaixo do ponto de ebulição do solvente, por exemplo, 81 °C para o acetonitrilo ou 101 °C para 1,4-dioxano ou 76 °C para o etanol, mais preferivelmente entre 15 °C e 50 °C, mesmo mais preferivelmente entre 20 °C e 45 °C e mais preferivelmente entre 25 °C a 40 °C. A mistura de reacção também pode conter sais, solventes, agentes dessecantes ou enzimas adicionais associados aos diferentes tipos de suportes sólidos, que são diferentes dos definidos nas reivindicações, para a realização da conversão dos ácidos derivados de L-arginina mencionados para os respectivos ésteres. 0 progresso da reacção é determinado por meios convencionais, tais como a cromatografia {camada fina, gás, líquido com elevado desempenho, e afins) ou medições de condutividade. O tempo de reacção pode variar de 1 h a 7 dias, dependendo dos parâmetros de reacção tais como a temperatura, pH, solventes, a enzima, suporte sólido, substractos, actividade de água e sistema de drenagem. Depois da conversão completa ou desejada dos substractos para os produtos finais ter sido alcançada, a enzima é removida por meios convencionais, tais como a filtração ou a centrifugação. Os produtos da reacção de elevada pureza química, em seguida, são isolados por meios convencionais, tais como a evaporação simples do solvente, cristalização, precipitação, destilação a vácuo e/ou métodos cromatograficos.

EXEMPLOS 10

Os exemplos exibidos são apenas uma selecção, e não representam uma restrição para as condições, as enzimas, os solventes ou os sistemas de drenagem do método sintético, em outros casos.

Exemplo 1: O cloridrato de N^lauroil-L-arginina (obtido a partir de cloreto de lauroilo e L-arginina em meio alcalino) é colocado em um recipiente de reacção selado e dissolvido em etanol, contendo 0,5% de ácido bórico/tampão 0,1 M de borato pH = 8,2, para se obter uma concentração de cloridrato de N^lauroil-L-arginina de 32 g/L.

Um catalisador ê preparado, que é composto por celite que adsorve 8%da enzima da papaína de Carica papaya. A adsorção é realizada em pH = 8,2 e a preparação compreende 8% em peso da enzima relativamente ao adsorvente e 4% de 1,4-ditio-DL-treitol em peso do adsorvente. O sistema catalítico é adicionado à solução em uma proporção de 6/1 referida à quantidade de cloridrato de N“~lauroil-L-arginina. O sistema é purgado com árgon. A reacção é realizada a 25 °C durante 7 dias e ao mesmo tempo agitando suavemente. A evolução do processo é apresentado na figura 1.

Após a conclusão da reacção, a mistura de reacção é filtrada para remover a enzima adsorvida e o produto final, o LAE, é isolado por meios convencionais. O rendimento do processo é de 79% de LAE puro.

Exemplo 2; 11 0 processo é realizado nas mesmas condições que no exemplo 1, mas utilizando etanol com 0,6% de solução-tampão e a uma temperatura de reacção de 40 °C durante 36 horas. A evolução do processo é apresentada na figura 2. A mistura de reacção é filtrada para remover a enzima adsorvida e o produto final, o LAE, é isolado por meios convencionais. 0 rendimento do processo é de 85% de LAE puro.

Exemplo 3:

Este exemplo demonstra a utilização de um agente de secagem em um dispositivo externo.

Tal como a figura 3 mostra, a mistura de reacção inicial é colocada em um recipiente fechado (a) sob atmosfera inerte (b) e equipado com: • um dispositivo de agitação (c); • uma manga para manter a temperatura a 35 °C por um líquido de aquecimento ou de arrefecimento (d); e • um filtro de saída (e) , através do qual um fluxo controlado da mistura de reacção filtrada é tomado por uma bomba peristãltica (f) . Este fluxo é passado através de uma coluna de secagem de seiva molecular (g) , de tal forma que a actividade da água no recipiente é mantida a aproximadamente 0,06. A mistura de reacção inicial tem a mesma composição como no exemplo 2. A reacção é realizada durante 24 horas a 35 °C. A evolução do processo é apresentada na figura 4. 12 A mistura de reacção é filtrada para remover a enzima adsorvida e o produto final, o LAE, é isolado por meios convencionais. 0 rendimento do processo é de 98% de LAE puro.

Lisboa, 29 de Outubro de 2008

Claims (13)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a preparação de um éster de N^-acil-L-arginina, derivado de ácidos gordos e aminoãcidos dibásicos esterifiçados, de acordo com a seguinte fórmula: 0

coor2 R3-(CH ύη-\ NHR, em que: X~: é Br"' Cl"' ou HS04" Ri: ê uma cadeia de alquilo linear de um ácido gordo saturado ou ácido de hidroxilo de 8 a 14 átomos de carbono ligados ao grupo de oí-aminoácidos através de uma ligação de amida. R2: é uma cadeia de alquilo linear ou ramificada de 1 a 18 átomos de carbono ou de um grupo aromático. ê : *3: -NH3 nh2 -NH-( NH2 NH NH em que n pode ser de 0 a 4, a partir do ácido orgânico e álcool apropriados, catalizado por uma hidrolase em um meio orgânico de baixo conteúdo de água que contém menos de 1% em peso de água. 2

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que os substracctos de partida são um álcool com cadeia de alquilo linear ou ramificada de 1 a 18 átomos de carbono ou aromáticos; e um ácido de N°-acil-L-arginina, como sal catiônico ou sal de ácido, de acordo com a seguinte fórmula: 0

coor2 R3-(CH2)„-( NHRj em que: X": é Br~' Cl-' ou HS<V R1: é uma cadeia de alquilo linear de um ácido gordo saturado ou ácido de hidroxilo de 8 a 14 átomos de carbono ligados ao grupo de a-aminoãcidos através de uma ligação de amida, R2, é H ou um catião orgânico ou inorgânico R3: é:

em que n pode ser de 0 a 4. 3

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o éster de N“-acilo-L-arginina é o éster de etilo da laurilamida de L-arginina (LAE).

4. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o ácido de partida de N“-acilo-L-arginina é a N “-laurilamida de L-arginina.

5. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, em que a referida hidrolase é uma protease.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que a referida protease é papaína de Cari ca jpapaya.

7. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, em que a enzima é adsorvida sobre um suporte sólido selecionado a partir do grupo que consiste de polipropilenos, poliamidas, terras diatomãceas, argilas, zeólitos, carvão vegetal activado, celulose de carboximetilo, ésteres de celulose e outras celuloses substituídas, resinas de troca de iões, polissacãridos insolúveis, gotas de vidro porosas, óxido de alumínio, celite e géis de sílica.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a enzima de adsorção para o suporte sólido é realizada por liofilização ou humidificação de uma mistura do suporte sólido e uma dispersão do catalisador enzimãtico na solução tampão apropriada,

9. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, em que o solvente de reacção é seleccionado a partir do grupo que consiste de álcoois estericamente inibidos, acetonitrilo, éteres cíclicos, hidrocarbonetos clorinados, cetonas, ésteres, 4 éteres, hidrocarbonetos aromáticos, hidrocarbonetos alifáticos e as suas misturas.

10. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, em que a reacção é realizada a uma actividade de água entre 0,02 e 0,1.

11. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, em que a reacção ê realizada a uma temperatura entre 2 0 °C e 45 °C.

12. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, em que a hidrolase ê papaína de Carica papaya e a reacção é realizada a um pH entre 3 e 10.

13. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, em que a água produzida na mistura de reacção é drenada por um agente de secagem ou um método físico, colocado dentro ou fora do recipiente de reacção. Lisboa, 29 de Outubro de 2008