ES2307314T3

ES2307314T3 - Injertos hechos de membrana amniotica; metodos de separacion, conservacion y uso de dichos injertos en cirugias.

Info

Publication number: ES2307314T3
Application number: ES98908712T
Authority: ES
Inventors: Scheffer C. G. Tseng
Original assignee: TissueTech Inc
Current assignee: TissueTech Inc
Priority date: 1997-02-28
Filing date: 1998-02-25
Publication date: 2008-11-16
Anticipated expiration: 2018-02-25
Also published as: EP0918529B1; DE69839437D1; TW398982B; US6152142A; BR9805921A; WO1998037903A1; CA2252758C; US6326019B1; EP0918529A4; CA2252758A1; EP0918529A1; JP2002515899A

Abstract

Un método para obtener de membrana amniótica humana y prepararla para ser utilizada como injerto quirúrgico, que comprende las etapas de: limpiar la placenta humana; separar dicha membrana amniótica de la placenta de su corion; montar dicha membrana amniótica sobre un sustrato, con la superficie epitelial de dicha membrana no dando la cara a dicho sustrato; y congelar y descongelar dicha membrana amniótica montada para matar las células de dicha membrana sin alterar la integridad de la matriz extracelular.

Description

Injertos hechos de membrana amniótica; métodos de separación, conservación y uso de dichos injertos en cirugías.

Campo técnico

Esta invención se refiere a injertos de membrana amniótica. Esta invención también abarca: un método para separar y conservar membrana amniótica para un injerto; el injerto que es creado por dicho método.

Estado de la técnica Terminología

Una membrana amniótica tiene dos componentes principales: la membrana basal y el estroma. El lado de la membrana amniótica dominado por la membrana basal se llama "lado de la membrana basal". El lado de la membrana amniótica dominado por el estroma se llama "lado del estroma". Un autoinjerto es un transplante de tejido del mismo receptor. Cuando se utiliza en túneles subcutáneos, los autoinjertos del amnios se convierten en una estructura permanente. Por otro lado, los aloinjertos son reemplazados por material de tipo hialina. Un aloinjerto es un transplante de tejido en un receptor a partir de una donación de otro individuo de la misma especie.

Aplicaciones Clínicas Previas

Ya en 1910 en cirugías documentadas, y en revisiones por Trefold y Trefold-Sauder en 1979, se ha utilizado la membrana fetal, incluyendo el amnios (membrana amniótica), y el corion (envoltura externa del feto). Véase Trefold y Trefold-Sauder, The Amniosn in Surgery, Past and present, 134AM J. OBSTRET. GYNECOL 833 (1979). En un principio, en 1910, la membrana fetal era utilizada por Davys, en pieles quemadas y ulceradas, con una cubierta adicional de parafina templada y apósito. En 1940, De Rötth utilizó membrana fetal para la reconstrucción oftálmica del simbléfaron., y tuvo un éxito en uno de seis casos. Véase De Rötth, Plastic Repair of Conjunctival Defects with Fetal Membranes, 23 ARCHIVES OF OPHTALMOLOGY 522 (1940). En 1952, Douglas pensó que el corion podría ser más útil para uso en piel. Massee y colegas, en 1962, utilizaron las membranas fetales en perros para tratar depresiones pélvicas tras exenteración total; sin embargo, los ensayos en seres humanos resultaron decepcionantes.

El amnios aislado a solas, fue utilizado primero por Brindeau en 1935 y Burger en 1937 como un injerto en la formación de vaginas artificiales. Entre 1941 y 1948, Kubanyi utilizó amnios "vivo" en pacientes con quemaduras, heridas traumáticas en la piel, y fístulas enterocutáneas secundarias a cirugía para lisis de adherencias. El amnios aislado, con conservación en una técnica llamada "amniosplastina", fue descrito primero por Chao y asociados en 1940. Chao utilizó amniosplastina para reparación dural continua, lesiones del nervio periférico, injerto de la conjuntiva y reparación flexora y de tendones. En la literatura rusa, en 1942, esta técnica también se utilizó por Pikin para traumatismos recientes.

Aunque todas las descripciones eran entusiastas, la mención de "amniosplastina" desapareció de la literatura sin una explicación real. Durante un periodo de treinta años no se encontraron descripciones críticas con respecto al amnios aislado no vivo con conservación. Además, si hubo fallos de tratamiento durante ese tiempo, no fueron descritos. Este vacío en la investigación acabó en 1972 con la investigación de Trefold y asociados, arriba citada. Trefold, utilizando amnios aislado con una forma precoz de preparación, mostró que la orientación con el lado del estroma hacia abajo proporcionaba un "agarre" mas consistente. En 1972, Robson y colegas notaron que, cuando se utilizaba en heridas de piel de grosor parcial, no se producía el "agarre", y el amnios se separaba. En los años 1973 y siguientes, Trefold y asociados describieron su uso como un apósito sobre heridas de piel con todo su grosor, para reemplazar peritoneo pélvico, y para cubrir superficies profundas expuestas en procedimientos de injerto de pedículo, para tratar heridas de piel no curadas en pacientes diabéticos, como un injerto sobre el defecto quirúrgico de la glosectomía total o glosectomía, como un apósito biológico en onfalocele y en la prevención de adherencias meningocerebrales tras daño en la cabeza.

Métodos Previos de Preparación y conservación

Todas las aplicaciones mencionadas arriba parece que han utilizado tejido vivo extraído y conservado "de forma viva" en una solución especial antes de su uso. Por ejemplo, de Rötth puso la membrana fetal, el amnios y el corion todo junto, sin separación, en "solución Locke tibia" y, de una a quince horas después de la cesárea, se implantó el tejido a los pacientes. Las descripciones que aparecen después de 1980 se refieren a membranas amnióticas vivas que han sido utilizadas (véase 34 J. REPRODUCTIVE MED. 198 (1989) y 27 J. PEDIATRIC SURGERY 882 (1992)). Para la "amniosplastina", Chao y asociados aislaron la membrana, la colocaron en alcohol al 70%, y después la secaron en una estufa antes de usarla. Robson y asociados enjuagaron la membrana en una solución de NaOH al 0,025% y mostraron que ésta permanecía estéril hasta seis semanas cuando se almacenaba en salino con penicilina a 4ºC. Trefold y asociados encontraron que las membranas amnióticas almacenadas a 4ºC en solución salina 0,5 N, a la que se añadió polimixina, ampicilina, gentamicina, y amfotericina B, eran estériles tras cuatro horas y permanecían así durante, al menos, 48 horas. Badawy y cols. describen el uso de un injerto de membrana amniótica colocado en solución salina y congelado después a -20ºC. Véase 34 J. REPRODUCTIVE MED. 198, supra. Waikakul y cols. describen un injerto de membrana amniótica liofilizada. 27 BULLETIN OF THE HOSPITAL FOR JOINT DISEASES 50 (1990). La EP 0735135 describe un amnios almacenado en solución conservante y después liofilizado en ella. La Patente de EE.UU Nº 4,361,552 describe un apósito de amnios fijado por entrecruzamiento.

Descripción de la invención

La membrana amniótica humana, obtenida y conservada de una nueva forma, se convierte en un injerto que es eficaz en: promover la curación de defectos del epitelio de la córnea con ulceración persistente; reducir la inflamación; angiogénesis y cicatrización; restaurar el fenotipo epitelial; más numerosos usos en reconstrucción de la superficie ocular; y como un sustrato alternativo a autoinjerto conjuntival durante la extirpación de la "esclerótica desnuda"de pterigia. Además, cuando se combina con aloinjertos de limba, el transplante de membrana amniótica es útil para reconstrucción de la superficie ocular en pacientes con penfigoide cicatrizal ocular avanzada, con síndrome de Stevens-Johnson, quemaduras químicas y térmicas, aniridia, queratitis atópica y deficiencia idiopática de células madre limbares. Tras obtener y limpiar la placenta, se separa, por disección directa, el amnios del corion, se alisa sobre un papel de filtro, con la superficie del epitelio no dando la cara al papel, y se corta en pequeñas láminas. Estas láminas se almacenan en un medio compuesto, por ejemplo, por Medio Eagle Modificado de Dulbecco y glicerol, en la relación 1:1 (v/v), y se congela a -80ºC hasta justo antes de su uso como injerto. Cuando se descongela a temperatura ambiente el día de uso, las células de la membrana injerto se han muerto, probablemente debido a los cristales de hielo del medio de almacenamiento circundante. El lado de la membrana adherida al papel de filtro es opuesto al lugar quirúrgico.

Mejor forma para llevar a cabo la invención Método para Selección, Preparación y Conservación del Injerto

Para preparar y conservar los injertos de membrana amniótica humana, se usará el siguiente método.

Primero, se toma la placenta lo antes posible después del parto. Preferiblemente, la placenta se toma inmediatamente después de un parto por cesárea electiva (C/S) de un bebé normal sano.

Para evitar cualquier enfermedad potencial de transmisión sanguínea, se hace un escrutinio previo de la mujer embarazada para VIH-1, VIH-2, VTLH-1, virus de la hepatitis B y C y sífilis, utilizando pruebas de serología convencionales. Para este método, sólo se utilizan, para producir injertos amnióticos, aquellas placentas en las que la sangre materna revela resultados de serología negativos.

La placenta humana que cumple el criterio de selección de arriba se transfiere al laboratorio en una bolsa de plástico estéril almacenada en un recipiente helado. Se realizan los siguientes procedimientos bajo condiciones estériles, tal como se utiliza de forma rutinaria para cultivos tisulares.

1. Bajo una campana de flujo laminar, se enjuaga la placenta varias veces con solución salina equilibrada para eliminar el exceso de coágulos sanguíneos. La solución salina equilibrada está disponible, por ejemplo, bajo la marca BSS® de Alcon Inc., 6201 South Freeway, Fort Worth, TX 76101. El enjuague también podría contener antibióticos para ayudar en la limpieza y conservación. Un ejemplo de una formulación antibiótica eficaz contiene 50 \mug/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina, 100 \mug/ml de neomicina, y 2,5 \mug/ml de amfotericina B. Además, la membrana se puede tratar de tal forma que contenga otras sustancias que serían transferidas al receptor una vez puesto el injerto. Ejemplos de sustancias que pueden estar impregnadas dentro del injerto de membrana son: medicamentos, hormonas, polipéptidos, para ayudar a la curación del área quirúrgica u otros tratamientos.

2. Con dos juegos de fórceps, se separa fácilmente, por disecciones directas, la membrana aminótica de la placenta del corion restante, mientras se sumerge en la solución salina equilibrada que contiene los antibióticos arriba mencionados.

3. Después, la membrana amniótica separada, como una lámina, se monta/fija sobre un sustrato, por ejemplo, un filtro de nitrocelulosa estéril, de tal forma que la superficie epitelial se mantiene expuesta cuando se alisa. Así, la capa de estroma/fibroblástica yace sobre el filtro. La membrana basal yace sobre la capa de estroma, y la epitelial yace sobre la membrana basal. El filtro será inerte con respecto a la membrana amniótica y el medio de almacenamiento se discute a continuación. El filtro contendrá lejía o cloro y será estable en el medio de almacenamiento, especialmente cuando se congela y descongela. Una fuente de dicho filtro es Millipore Inc., y se vende como producto número 162-0180. Otros sustratos útiles son membranas de nitrocelulosa 162-0115, membranas de nitrocelulosa de soporte 162-0090 y papel de filtro secante seco 162-0118, todos de Biorad.

Las láminas de membranas amnióticas que se han adherido/montado sobre el filtro de nitrocelulosa se cortan en diferentes tamaños, por ejemplo, 2,5-3,0 cm. x 2,0-2,5 cm. y 1,2-1,5 cm x 1,75-2,0 cm. y se almacenan en un medio de cultivo a temperaturas por debajo de congelación. Es importante apreciar que la congelación de los injertos (las láminas cortadas y montadas en el filtro de la membrana amniótica) y su descongelación posterior, inmediatamente antes de su uso, da como resultado la muerte de las células de la membrana, probablemente por los cristales de hielo, formados en la membrana, a partir del líquido en el medio de cultivo. De ese modo, al matar las células, el injerto resultante no es rechazado tras la cirugía. Sin embargo, la integridad de la matriz extracelular no está alterada a pesar de la congelación y descongelación. Aunque las células se podrían matar por otros medios convencionales, el uso de la congelación-descongelación no introduce agentes o condiciones que pueden afectar de forma adversa a la membrana almacenada o al injerto completo, haciendo que éste no sea "aceptado" o que sea rechazado, o dañe la curación del ojo, etc.

Aunque servirá cualquier temperatura por debajo de la congelación, la temperatura de -80ºC ha sido típicamente usada para almacenar los injertos. Además, este método de conservación es eficaz con respecto a la esterilidad y eficacia para el almacenamiento a largo plazo más allá de un año, incluso cuando las láminas de membrana cortadas, almacenadas y congeladas sean enviadas a largas distancias en hielo seco.

Un ejemplo de un medio eficaz está compuesto por Medio Eagle Modificado de Dulbecco al 50% (más adelante "medio DMEM") (de GIBCO) y glicerol al 50% (V/V). Sirve un intervalo de glicerol del 30% al 50%.La función del glicerol es la de mantener el estado de hidratación de la membrana amniótica: demasiada poca hidratación o demasiada hidratación es perjudicial, 60% a 90% de hidratación es eficaz para el propósito previsto. El glicerol actúa como un agente altamente oncótico o hiperosmótico; también actúa como extensor de plasma. Ejemplos de otros agentes hiperosmóticos que se utilizan son: dextrano, albúmina, y manitol. El propósito general del medio de almacenamiento, como el DMEM, es el de proporcionar nutrientes y mantener el equilibrio electrolítico de la membrana amniótica. Otros ejemplos de medios de almacenamiento apropiados son: medio de Liebowitz, MEM, y NCTC, todos ellos fabricados por Life Technologies.

Si las láminas de membrana amniótica, sobre el filtro de papel, se utilizan "cerca del periodo", dentro de las veinticuatro horas de la recogida, entonces, no es esencial el uso de un medio de almacenamiento; sin embargo, las células tienen que matarse, tal como se indicó anteriormente.

Injerto preparado según al método indicado anteriormente

Un injerto que comprende el amnios, de placenta humana, al que se le ha eliminado el corion, que está preparado y conservado de acuerdo con el método indicado anteriormente. Este injerto se ha enjuagado con solución salina equilibrada y antibióticos. El injerto puede contener sustancias terapéuticas que han sido absorbidas por él. El injerto está montado sobre un papel de filtro, que tiene características apropiadas, tal como se ha indicado anteriormente. El injerto se almacena en una composición de medio de cultivo y en un agente altamente oncótico a temperaturas de congelación. Antes de su uso, el injerto se descongela.

Método para utilizar la membrana amniótica preparada como un injerto quirúrgico

En ojos con defecto epitelial persistente y ulceración, tras inyección anestésica retobulbar, se desbrida la base de la úlcera con esponjas quirúrgicas (un ejemplo de esponja quirúrgica apropiada se vende bajo la marca MICROSPONGE® de Alcon Surgical, Inc., 6201 South Freeway, Fort Worth, TX 76134-2099) y fórceps del 0,12, y también se elimina del área donde el epitelio se vuelve más adherente, el epitelio mal adherido adyacente al borde de la úlcera. La membrana amniótica, que recientemente se sacó del medio de almacenamiento y se descongeló a temperatura ambiente, se despega del papel de filtro de nitrocelulosa, se transfiere al ojo receptor, con la superficie del estroma mirando hacia el ojo y se ajusta para cubrir el defecto, recortando el exceso de los bordes de la lámina de membrana/injerto. En otros casos, se puede utilizar el lado opuesto. Luego, esta membrana creada se sujeta al borde del defecto por suturas interrumpidas de nylon 10-0, y en algunos casos, por suturas corrientes de nylon 10-0. Después de tapar los nudos, la superficie de la córnea se vuelve más lisa, como resultado del rellenado de la membrana aminótica bien aproximada en el lecho de la úlcera. Excepto para úlceras profundas, generalmente es suficiente una capa de membrana. Pero también es viable usar dos o más capas. Se aplican unas lentes de contacto vendaje junto con un ungüento antibiótico oftálmico tópico que comprende neomicina, polimixin b sulfato y dexametasona. Un ejemplo de dicho ungüento antibiótico oftálmico apropiado se vende bajo la marca MAXITROL® de Alcon Laboratories, Inc., 6201 South Freeway, Fort Worth, TX 76134.

Las presente invención es más eficaz que las de Rötth en la reconstrucción de la superficie de la conjuntiva para la lisis de del simbléfaron. Además, la invención se puede usar para reconstruir la superficie de la conjuntiva dañada durante la eliminación quirúrgica de tumores, lesiones, o tejido cicatrizante. La citología de impresión puede demostrar que la conjuntiva reconstruida recupera el fenotipo epitelial normal con células cáliz, cuyo número es mayor que el control normal. Las células cáliz secretan mucina y tienen forma de cáliz. Una membrana producida por el método inventado, cuando se utiliza como un parche, puede reducir la bruma de la córnea, una forma de cicatrización, inducida por la queratectomía fotorrefrativa del láser excimer y queratectomía terapéutica, un procedimiento utilizado en el presente en pacientes, para corregir la miopía y el astigmatismo, y para eliminar las partes enfermas de la córnea, respectivamente. Este método y producto, también se pueden utilizar por sí mismos o conjuntamente con células madre transplantadas para reconstruir superficies dañadas por varias causas que llevan a deficiencia de células madre nimbales.

Este injerto amniótico se puede utilizar para promover cirugías de glaucoma exitosas corrigiendo la ampolla de filtración. El uso quirúrgico de los injertos amnióticos hechos de acuerdo con esta invención, pueden prevenir la reaparición de queratopatías en banda, prevenir la adhesión durante la cirugía muscular, y ayudar a la reconstrucción de la órbita en cirugías oculoplásticas. La queratopatía en banda es el depósito de calcio en la superficie de la córnea.

Además de los usos oftálmicos mencionados, también se prevé que la membrana amniótica de esta invención también pueda ser usada: como un injerto o apósito para cubrir heridas de la piel quemada o quirúrgicas; para prevenir la adherencia en todas las cirugías intraperitoneales u otra reconstrucción en las superficies serosas que cubren el abdomen, cavidad pectoral y pericardio; para reconstruir todas las superficies mucosas que cubren las cavidades oral y nasal, tractos respiratorios, tractos gastrointestinales, y tractos urogenitales; como un sustrato para soportar la reparación de las meninges en cirugías de cerebro; como un sustrato para promover la regeneración de nervios en los sistemas nervioso central y periférico; y para reconstruir tejidos blandos para prevenir la adherencia en reparaciones de articulación y tendón.

Se cree que los cirujanos, científicos e investigadores se beneficiarán de la información proporcionada en los siguientes artículos:

1. Kim JC, Tseng SCG. Transplantation of preserved human amniostic membrane for surface reconstruction in severely damaged rabbit corneas. Cornea. 1995;14:473-84.

2. Tsubota K, Satake Y, Ohyama M, et al. Surgical reconstruction of the ocular surface in advanced ocular cicatricial pemphigoid and Stevens-Johnson syndrome. Am J Ophthalmol. 1996;122:38-52.

3. Lee S. Tseng SCG. Amniostic membrane transplantation for persistent epithelial defects with ulceration. Amn J Ophthalmol. 1997;123:303-312.

4. Prabhasawat P, Barton K, Burkett G, Tseng SCG. Comparison of conjunctival autografts, amniostic membrane grafts and primary closure for pterygium excision. Ophthalmology. 1997;104:974-985.

5. Tseng SCG, Prabhasawat P, Lee S. Amniostic membrane transplantation for conjunctival surface reconstruction. Am J Ophthalmol. 1997; Dec. issue, 124:765-774.

6. Prabhasawat P, Tseng SCG. Impression cytology study of epithelial phenotype of ocular surface reconstructed by preserved human amniostic membrane. Arch Ophthalmol. 1997; Nov. issue, 115:1360-1367.

7. Barton K, Budenz DL, Khaw PT, Tseng SCG. Amniostic membrane transplantation in glaucoma surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci 1997; 38:S473.

8. Wang M, Gray T, Prabhasawat P, Ma X, Ding F-y, Hernandez E, Sanabria O, Culbertson W, Hanna K, Forster RK, Tseng SCG. Corneal haze is reduced by amniostic membrane matrix in excimer laser photoablation in rabbits. Invest Ophthalmol Vis Sci 1997; 38:S405.

9. Tseng SCG, Prabhasawat P, Barton K, Gray TB, Meller D. Amniostic membrane transplantation with or without limbal transplantation for corneal surface reconstruction in patients with limbal stem cell deficiency. Arch Ophthalmol, in press 1998 (April).

Aplicaciones industriales

Un objeto de esta invención es preparar injertos hechos de membrana amniótica.

Otro objeto de esta invención es preparar injertos hechos de membrana amniótica que se pueden almacenar durante largos periodos de tiempo.

Otro objeto de esta invención es preparar injertos que han sido tratados de tal forma que los injertos contienen agentes que pueden ser administrados al receptor cuando se unen al receptor.

Otro objeto de esta invención esproporcionar un sustrato mejorado alternativo al autoinjerto conjuntival durante la extirpación de la "esclerótica desnuda" de pterigia.

Otro objeto de la invención es proporcionar un sustrato mejorado alternativo al colgajo para promover curación de defectos del epitelio corneal con ulceración.

Otro objeto de esta invención es proporcionar un tratamiento mejorado para la reconstrucción de la superficie conjuntival para la lisis del simbléfaron.

Otro objeto de esta invención es proporcionar un tratamiento mejorado para la extirpación quirúrgica de tumores, lesiones, o tejido cicatrizante de la superficie conjuntival o corneal.

Otro objeto de esta invención es reducir la bruma de la córnea inducida por queratectomía fotorrefrativa/terapéutica con láser excimer.

Otro objeto de esta invención es promover cirugías de glaucoma exitosas corrigiendo escapes de ampolla de filtración.

Otro objeto de esta invención es prevenir la reaparición de queratopatía en banda.

Otros objetos de la invención y ventajas sobre el estado de la técnica, así como diferencias con respecto al estado de la técnica, se apreciarán totalmente a partir de la siguiente discusión de: Embriogénesis e Histología; Componentes; Aplicaciones en Investigación Básica; y la Descripción de las Realizaciones Preferidas, junto con la descripción de numerosos usos propuestos del injerto mejorado resultante.

Embriogénesis e Histología

Antes del proceso de implantación del blastocisto, se desarrolla un espacio entre la masa embrionaria y los trofoblastos adyacentes. El epitelio amniótico deriva del ectodermo fetal (el disco embrionario). Además de las células epiteliales, también puede derivar del embrión una capa de células de tipo fibroblasto, pero esto no es seguro. Los elementos "perdidos" importantes del amnios humano son células de músculo liso, nervios, vasos linfáticos, y, lo más importante, vasos sanguíneos. Probablemente, el amnios humano se desarrolla aproximadamente en el 7º u 8º día del desarrollo del blastocisto normal. El amnios se fusiona con el corion durante las semanas 10 y 12 del embarazo, cuando se expande la cavidad amniótica. El amnios permanece desprovisto de vasos hasta término. Esta es la razón de por qué es posible la separación entre el amnios y el corion vía la interfaz, es decir, la zona intermedia. El amnios normal es de 0,2 a 0,5 mm de grosor.

Histológicamente, el amnios comprende cinco capas. La superficie interna consiste en un epitelio simple cuboidal, que yace sobre la membrana basal. El estroma no vascularizado contiene mesénquima fetal e incluye la capa compacta, la capa fibroblástica y la capa esponjosa. Existen cuatro porciones anatómicas diferentes del amnios. Primera, el amnios reflejado es aquella porción contigua a la parte membranosa del corion. Segunda, el amnios de la placenta yace sobre la superficie fetal de la placenta, que es directamente contigua a la superficie adventicia de los vasos coriónicos. Tercera, el amnios también cubre el cordón umbilical, que es contiguo a la gelatina de Wharton. La gelatina de Wharton es la matriz extracelular a través de la cual atraviesan los vasos umbilicales. Cuarta, en el embarazo de gemelos diamniosindicoriónicos, los amnioss están "fusionados", con lo cual, en el primero es contiguo con la parte membranosa del corion fusionado y en el segundo, el amnios está fusionado con amnios.

Componentes

Distintos tejidos del cuerpo tienen distintos componentes de colágeno y glucosaminoglicanos (más adelante, "GAGs"). Se ha mostrado que el estroma amniótico contiene colágeno I y III y fibronectina, y tiene una distribución perilaminar de colágenos tipo V y VII. La lámina basal del amnios contiene una red de fibrillas de colágeno tipo IV, laminina, y proteoglucano heparin sulfato. Las fibras de colágeno del amnios están estrechamente distribuidas sin sustancias de fondo, formando una gruesa capa colagenosa. En placenta de seres humanos y monos, se piensa que el ácido hialurónico (más adelante "HA") es el único GAG encontrado, pero este descubrimiento todavía no se muestra en el amnios. Esta característica de composición es responsable, en parte, de la fuerza elástica percibida durante el embarazo.

El lado de la membrana basal de la membrana amniótica se puede utilizar para soportar el crecimiento epitelial para mantener la polaridad epitelial. Se ha encontrado que, cuando se crecen fibroblastos humanos o células A431 de carcinoma epitelial, el lado del estroma de la membrana amniótica es comparable a colágeno aislado, pero es más grande que una simple superficie plástica en el crecimiento de células de cultivo. Cuando se empareda en una cámara Boyden, esta membrana se puede utilizar para estudios de migración de células nucleares polimorfas (más adelante "migración PMN") en los procesos de leucodiapedisis, invasión vascular endotelial, y metástasis tumoral, a través de la membrana basal. Aunque el amnios no está inervado, el amnios de aves expresa, al menos, once tipos diferentes de receptores para neurotransmisores, incluyendo: acetilcolina, norepinefrina, histamina, 5-hidroxitriptamina, VIP, urotensina II, neurotensina, y somatostatina-28.

Aplicaciones en investigación básica

Con la ventaja del contenido de esta membrana basal, el amnios humano puede utilizarse como un sustrato para cultivar neuronas del sistema nervioso periférico y central y para promover regeneración axonal cuando se implanta en el sistema nervioso central. Este efecto parece no ser dependiente de células vivas y está mediado por la matriz amniótica, la cual promueve el poder regenerativo del hospedador, y puede estar más potenciado cuando se añade con un factor de crecimiento nervioso (más adelante "NGF") en la regeneración de nervio periférico escindido.

Claims

1. Un método para obtener de membrana amniótica humana y prepararla para ser utilizada como injerto quirúrgico, que comprende las etapas de:

limpiar la placenta humana;

separar dicha membrana amniótica de la placenta de su corion;

montar dicha membrana amniótica sobre un sustrato, con la superficie epitelial de dicha membrana no dando la cara a dicho sustrato; y

congelar y descongelar dicha membrana amniótica montada para matar las células de dicha membrana sin alterar la integridad de la matriz extracelular.

2. Un método según la Reivindicación 1, en el que;

dicha etapa de matar dichas células sin alterar la integridad de la matriz extracelular se logra congelando dicha membrana amniótica en líquido tras dicho montaje; y

descongelando dicha membrana justo antes de su uso como un injerto.

3. Un método según las reivindicaciones 1 o 2, donde dicha membrana amniótica montada está contenida en un líquido que comprende un agente hiperosmótico y un medio de cultivo en cantidades apropiadas para permitir matar las células de dicha membrana sin alterar la integridad de dicha matriz extracelular durante dichas etapas de congelación y descongelación.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha etapa de congelación de dicha membrana amniótica comprende mantener dicha membrana amniótica montada a una temperatura lo suficientemente baja para permitir que dicha membrana amniótica sea almacenada durante más de un año sin perder su eficacia como un injerto quirúrgico.

5. Un método según la reivindicación 4, donde dicha temperatura es -80ºC.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende proporcionar dicha membrana amniótica con, al menos, uno de un medicamento, una hormona, un polipéptido, para transferirlo al receptor de dicho injerto, una vez que dicho injerto esté colocado.

7. Un injerto quirúrgico que comprende:

membrana amniótica humana preparada montada sobre un sustrato, dicha membrana amniótica ha sido congelada y descongelada bajo condiciones que dan como resultado la muerte de las células de dicha membrana amniótica sin alterar la integridad de la naturaleza extracelular de dicha membrana amniótica.

8. Un injerto quirúrgico según la reivindicación 7, donde dicha membrana amniótica fue congelada en un líquido que comprende un agente hiperosmótico y un medio de cultivo.

9. Un injerto quirúrgico según las reivindicaciones 7 y 8, donde dicha membrana amniótica fue mantenida a una temperatura lo suficientemente baja para permitir que dicha membrana amniótica sea almacenada durante más de un año sin perder su eficacia como injerto quirúrgico.

10. Un injerto quirúrgico según la reivindicación 9, donde la temperatura es -80ºC.

11. Un injerto quirúrgico según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el cual dicha membrana tiene una capa de estroma que tiene una superficie; siendo dicha superficie la superficie de dicho injerto que es aplicado en el lugar de la cirugía.

12. Un injerto quirúrgico según la reivindicación 11, en el cual; dicha membrana está montada en un sustrato, con dicha superficie de dicha capa del estroma dando la cara a dicho sustrato.

13. Un injerto quirúrgico según la reivindicación 11, en el cual; dicha membrana está montada a un sustrato, con dicha superficie de la capa basal dando la cara a dicho sustrato.

14. Un injerto quirúrgico según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en el cual dicha membrana contiene, al menos, uno de antibióticos, hormonas celulares, polipéptidos y medicamentos.

15. Un injerto quirúrgico según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, y en combinación con esto;

un medio de cultivo y un agente hiperosmótico, para almacenar dicha membrana amniótica en un estado de congelación.

16. Un injerto quirúrgico según la reivindicación 15, en el cual; dicho medio de cultivo es DMEM; y

dicho agente hiperosmótico es glicerol.