ES2305530T3 - Proteinas marcadoras de tumores y usos de las mismas. - Google Patents
Proteinas marcadoras de tumores y usos de las mismas. Download PDFInfo
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Abstract
Un método de detección de autoanticuerpos antitumorales asociados con cáncer, siendo el método un inmunoensayo que comprende poner en contacto una muestra que se va a ensayar para determinar la presencia de dichos autoanticuerpos con un reactivo de inmunoensayo y detectar la presencia de complejos formados por la unión específica del reactivo de inmunoensayo con cualquier autoanticuerpo antitumoral asociado con cáncer presente en la muestra, en el que el reactivo de inmunoensayo comprende una proteína marcadora de tumores preparada a partir de un fluido corporal seleccionado del grupo constituido por líquido ascítico, derrame pleural, seroma, hidrocele y líquido de drenaje de heridas de uno o más pacientes de cáncer, en el que dicha proteína marcadora de tumores presenta una reactividad selectiva con autoanticuerpos antitumorales asociados con cáncer.
Description
Proteínas marcadoras de tumores y usos de las
mismas.
La invención se refiere a proteínas marcadoras
de tumores y a su preparación a partir de fluidos de uno o más
pacientes de cáncer, en la que dichos fluidos son los que se
acumulan en una cavidad o espacio corporal de forma natural o como
resultado del cáncer o de una intervención médica para el cáncer.
Dichos fluidos son ascitis, derrame pleural, seroma, hidrocele y
líquido de drenaje de heridas.
Dichas proteínas marcadoras de tumores son
útiles en los métodos de detección del cáncer que implican la
detección o la medición de forma cuantitativa de autoanticuerpos
contra marcadores tumorales circulantes o marcadores expresados
sobre o en células tumorales y en diversas aplicaciones de
investigación. La invención también se refiere a dichos usos.
El desarrollo y la evolución del cáncer en un
paciente generalmente se descubre que está asociado con la presencia
de marcadores en los fluidos corporales del paciente, reflejando
estos "marcadores tumorales" diferentes aspectos de la
biología del cáncer (véase Fateh-Maghadam, A. y
Steilber, P. (1993) Sensible use of tumour markers. Publicado por
Verlag GMBH, ISBN
3-926725-07-9). Con
frecuencia se descubre que los marcadores tumorales son formas
alteradas de proteínas de tipo silvestre expresadas por células
"normales", en cuyo caso la alteración puede ser un cambio en
la secuencia primaria de aminoácidos, un cambio en la estructura
secundaria, terciaria o cuaternaria o un cambio en las
modificaciones postraduccionales, por ejemplo, una glicosilación
anormal. Además, también pueden ser marcadores tumorales proteínas
de tipo silvestre que estén reguladas positivamente o
sobreexpresadas en células tumorales, posiblemente como resultado de
la amplificación de genes o de una regulación transcripcional
anormal.
Los ensayos establecidos para marcadores
tumorales presentes en fluidos corporales tienden a centrarse en la
detección de marcadores tumorales que reflejen masas tumorales y, de
este modo, son valiosos en fases tardías del proceso patológico,
por ejemplo, en el diagnóstico de enfermedades metastásicas. Los más
ampliamente usados de estos marcadores incluyen el antígeno
carcinoembrionario (CEA) y la glicoproteína denominada CA 15.3,
habiendo sido útiles ambos principalmente como indicadores de la
carga de enfermedad sistémica y de las recidivas posteriores a la
terapia (Molina, R., Zanon, G., Filella, X. et al. Use of
serial carcinoembryonic antigen and CA 15.3 assays in detecting
relapses in breast cancer patients. (1995) Breast Cancer
Res Treat 36: 41-48). Estos marcadores son
de uso limitado más temprano en el curso de la enfermedad, por
ejemplo, en la detección temprana o en la exploración de pacientes
asintomáticos. Por lo tanto, en la búsqueda de marcadores tumorales
presentes en fluidos corporales que sean útiles para ayudar al
diagnóstico más temprano en el proceso patológico, los presentes
inventores han buscado identificar marcadores que no dependan de la
propia masa tumoral.
Las diferencias entre una proteína de tipo
silvestre expresada por células "normales" y una proteína
marcadora de tumores correspondiente pueden conducir, en algunos
casos, al reconocimiento de la proteína marcadora de tumores por el
sistema inmune de un individuo como "no propia" y, por lo
tanto, provocar una respuesta inmune en ese individuo. Ésta puede
ser una respuesta inmune humoral (es decir, mediada por células B)
que conduzca a la producción de autoanticuerpos inmunológicamente
específicos para la proteína marcadora de tumores. Los
autoanticuerpos son anticuerpos de origen natural dirigidos contra
un antígeno que el sistema inmune de un individuo reconoce como
extraño, aun cuando ese antígeno se hubiera originado en realidad en
el individuo. Pueden estar presentes en la circulación como
anticuerpos libres circulantes o en forma de complejos inmunes
circulantes que consisten en autoanticuerpos unidos a su proteína
marcadora de tumores diana.
Como alternativa a la medición directa o a la
detección de proteína marcadora de tumores en fluidos corporales,
pueden desarrollarse ensayos para medir la respuesta inmune del
individuo a la presencia de una proteína marcadora de tumores en
términos de producción de autoanticuerpos. Dichos ensayos
constituyen esencialmente una detección indirecta de la presencia
de una proteína marcadora de tumores. Debido a la naturaleza de la
respuesta inmune, es probable que pueda provocarse la producción de
autoanticuerpos por una cantidad muy pequeña de proteína marcadora
de tumores circulante y, por consiguiente, los métodos indirectos
que se basan en la detección de la respuesta inmune contra
marcadores tumorales será más sensible que los métodos para la
medición directa de marcadores tumorales en fluidos corporales. Por
lo tanto, pueden ser particularmente valiosos métodos de ensayo
basados en la detección de autoanticuerpos en fases tempranas del
proceso patológico y, posiblemente, también en relación con la
exploración de pacientes asintomáticos, por ejemplo, en la
exploración para identificar individuos "con riesgo" de
desarrollar enfermedad entre una población de individuos
asintomáticos. Además, pueden ser útiles para la detección más
temprana de una enfermedad recidivante.
Las proteínas marcadoras de tumores que se ha
observado que producen autoanticuerpos en suero incluyen una clase
particular de proteína p53 mutante, descrita en la Patente de
Estados Unidos Nº 5.652.115, que puede definirse por su capacidad
para unirse a la proteína de choque térmico de 70 kd (hsp70). Pueden
detectarse autoanticuerpos de p53 en pacientes con varias
afecciones benignas y malignas diferentes (descritas en la Patente
de Estados Unidos Nº 5.652.115), pero en cada caso solo están
presentes en un subconjunto de pacientes. Por ejemplo, un estudio
que utilizaba un ensayo de ELISA para la detección de
autoanticuerpos dirigidos contra la proteína p53 en el suero de
pacientes con cáncer de mama describía que se produjeron
autoanticuerpos de p53 por el 26% de los pacientes y el 1,3% de los
sujetos de control (Mudenda, B., Green, J. A., Green, B.
et al. The relationship between serum p53 autoantibodies and
characteristics of human breast cancer, (1994) Br J Cancer
69 : 4445-4449). Una segunda proteína
marcadora de tumores que se sabe que produce autoanticuerpos en
suero es la mucina epitelial MUC1 (Hinoda, Y. et al. (1993)
Immunol Lett. 35: 163-168; Kotera, Y. et
al. (1994) Cancer Res. 54:
2856-2860).
El documento WO 99/58978 describe métodos para
usar en la detección y el diagnóstico del cáncer que se basan en la
evaluación de la respuesta inmune de un individuo contra dos o más
marcadores tumorales diferentes. Estos métodos implican
generalmente poner en contacto una muestra de fluido corporal
obtenida del individuo con un panel de dos o más antígenos
marcadores de tumores diferentes, cada uno procedente de una
proteína marcadora de tumores distinta, y detectar la formación de
complejos de los antígenos marcadores de tumores unidos a
autoanticuerpos circulantes inmunológicamente específicos para las
proteínas marcadoras de tumores. La presencia de dichos
autoanticuerpos circulantes se toma como un indicio de la presencia
de cáncer.
Los métodos de detección de cáncer basados en la
detección de autoanticuerpos circulantes son frecuentemente
inmunoensayos que utilizan un "reactivo de inmunoensayo"
reactivo con los autoanticuerpos circulantes. Típicamente, los
"reactivos" usados en dichos ensayos comprenden proteínas
marcadoras de tumores recombinantes (expresadas en células
bacterianas, de insectos, de levaduras o de mamíferos) o antígenos
marcadores de tumores sintetizados químicamente, que pueden
comprender sustancialmente proteínas marcadoras de tumores completas
o fragmentos de las mismas, tales como antígenos peptídicos cortos.
Otras fuentes potenciales de proteínas asociadas con tumores para
usar como la base de reactivos de inmunoensayo para la detección de
autoanticuerpos antitumorales incluyen células tumorales cultivadas
(y los medio agotados usados para su cultivo), tejidos tumorales y
suero de individuos con neoplasias. La mayoría de estas fuentes
tienen desventajas significativas, como se analizan a
continuación.
Con células tumorales cultivadas (y sus medios
agotados) la cantidad de proteína expresada puede variar dependiendo
de la fase de cultivo en el momento de la recogida, conduciendo a
variaciones en la calidad y la cantidad. Además, la proteína
deseada está presente generalmente a una baja concentración y, por
lo tanto, requiere mucho tiempo purificar cantidades suficientes de
proteína. Además, la reserva de células será clonal, a diferencia
de la reserva de células en un tumor que es probable que se haya
vuelto heterogénea por naturaleza durante el crecimiento de la
neoplasia, produciéndose de este modo variaciones en la proteína
(especialmente en el grado de glicosilación).
Las proteínas recombinantes expresadas en
células bacterianas no están glicosiladas y, por lo tanto, difieren
significativamente de proteínas naturalmente glicosiladas. Además,
el replegamiento de proteínas expresadas de forma recombinante
puede no ser apropiado, proporcionando de este modo una conformación
incorrecta para el reconocimiento de autoanticuerpos.
Habitualmente, el tejido tumoral sólo está
disponible en pequeñas cantidades y la purificación de proteínas a
partir del mismo es laboriosa y requiere mucho tiempo.
Habitualmente, las muestras de suero sólo están
disponibles en pequeñas cantidades y, por lo tanto, es difícil
purificar suficientes cantidades de proteína.
Los presentes inventores han determinado ahora
que pueden obtenerse ventajas significativas mediante el uso de
antígenos marcadores de tumores purificados a partir de fluidos
corporales procedentes de una cavidad o espacio corporal en el que
esté presente un tumor o con el que esté o estuviera asociado,
seleccionados del grupo constituido por líquido ascítico, derrame
pleural, seroma, hidrocele y líquido de drenaje de heridas, como el
"reactivo" en inmunoensayos de autoanticuerpos. En particular,
los inventores han observado que el uso de reactivos que comprenden
antígenos marcadores de tumores purificados a partir de fluidos
corporales procedentes de las cavidades o espacios corporales
definidos anteriormente da como resultado una sensibilidad
aumentada (en comparación con el uso de reactivos procedentes de un
fluido corporal "normal") y producen un resultado más
"clínicamente relevante". También pueden obtenerse ventajas
prácticas significativas a partir del uso de dichos fluidos como
fuente de reactivo de ensayo.
En un primer aspecto la invención se refiere a
un método de detectar autoanticuerpos antitumorales asociados con
cáncer, siendo el método un inmunoensayo que comprende poner en
contacto una muestra que se va a ensayar para determinar la
presencia de dichos autoanticuerpos con un reactivo de inmunoensayo
y detectar la presencia de complejos formados mediante la unión
específica del reactivo de inmunoensayo con cualquier autoanticuerpo
antitumoral asociado con cáncer presente en la muestra, en el que
el reactivo de inmunoensayo comprende una proteína marcadora de
tumores preparada a partir de un fluido corporal seleccionado del
grupo constituido por líquido ascítico, derrame pleural, seroma,
hidrocele y líquido de drenaje de heridas, de uno o más pacientes
de cáncer, en el que dicha proteína marcadora de tumores presenta
una reactividad selectiva con autoanticuerpos antitumorales
asociados con cáncer.
En un segundo aspecto la invención se refiere al
uso de una proteína marcadora de tumores preparada a partir de un
fluido corporal seleccionado del grupo constituido por líquido
ascítico, derrame pleural, seroma, hidrocele y líquido de drenaje
de heridas de uno o más pacientes de cáncer, en la fabricación de un
reactivo de inmunoensayo que presente una reactividad selectiva con
autoanticuerpos antitumorales asociados con cáncer.
En el primer aspecto, la invención se refiere a
un método de detección de autoanticuerpos antitumorales "asociados
con cáncer".
La expresión autoanticuerpos antitumorales
"asociados con cáncer" se refiere a autoanticuerpos que son
característicos de la patología cancerosa y que se dirigen contra
epítopos presentes en formas de proteínas marcadoras de tumores que
se expresan preferentemente en la patología cancerosa.
El método de la invención comprende un
inmunoensayo para detectar y/o medir cuantitativamente
autoanticuerpos inmunológicamente específicos para una o más
proteínas marcadoras de tumores y se caracteriza por que el
"reactivo de inmunoensayo" usado en el inmunoensayo comprende
una proteína marcadora de tumores preparada a partir de un fluido
corporal seleccionado del grupo constituido por líquido ascítico,
derrame pleural, seroma, hidrocele y líquido de drenaje de heridas
de uno o más pacientes de cáncer.
El reactivo de inmunoensayo presenta una
"reactividad selectiva" con autoanticuerpos antitumorales
asociados con cáncer. Como se usa en este documento, la expresión
"reactividad selectiva" significa que una proteína marcadora
de tumores tiene una afinidad mayor por autoanticuerpos contra el
antígeno asociado con tumor que por cualquier anticuerpo o
autoanticuerpo generado contra el mismo antígeno que existe en el
estado normal, es decir, sin posesión de tumores.
Las características generales de los
inmunoensayos, por ejemplo, ELISA, radioinmunoensayos y similares,
son bien conocidas por los especialistas en la técnica (véase
Immunoassay, E. Diamandis y T. Christopoulus, Academic Press, Inc.,
San Diego, CA, 1996). Los inmunoensayos para la detección de
anticuerpos que tienen una especificidad inmunológica en particular
(por ejemplo, autoanticuerpos que tienen una reactividad
inmunológica con una proteína marcadora de tumores dada) requieren
generalmente el uso de un reactivo que presente una reactividad
inmunológica específica con el anticuerpo bajo ensayo. Dependiendo
del formato del ensayo, este reactivo puede inmovilizarse sobre un
soporte sólido. Una muestra que se va a ensayar para determinar la
presencia del anticuerpo se pone en contacto con el reactivo y, si
existen en la muestra anticuerpos de la reactividad inmunológica
requerida, reaccionarán inmunológicamente con el reactivo para
formar complejos de autoanticuerpo-reactivo que
después pueden detectarse o medirse cuantitativamente.
Pueden aislarse muestras adecuadas de una
proteína marcadora de tumores para el uso como la base del
"reactivo de inmunoensayo" a partir de líquido ascítico,
derrame pleural, seroma, hidrocele o líquido de drenaje de heridas
usando técnicas de purificación de proteínas convencionales, tales
como las que se conocen en general en la técnica. Por ejemplo,
pueden aislarse proteínas marcadores de tumores mediante
cromatografía de afinidad usando un anticuerpo adecuado (o un
fragmento de anticuerpo) inmunológicamente específico para la
proteína marcadora de tumores. Los inventores han demostrado en los
ejemplos adjuntos que pueden purificarse varias proteínas
marcadoras de tumores diferentes usando métodos de purificación
basados en una cromatografía de afinidad. Serán evidentes para el
lector especialista métodos de purificación análogos usados para
cualquier otra proteína marcadora de tumores con el uso de un
anticuerpo o fragmento de anticuerpo adecuado.
El material de partida de líquido ascítico,
derrame pleural, seroma, hidrocele o líquido de drenaje de heridas
se obtiene de uno o más pacientes de cáncer. En este contexto, la
expresión "paciente de cáncer" incluye a un individuo al que
se le ha diagnosticado previamente que tiene cáncer. El fluido puede
obtenerse de un paciente individual o pueden combinarse entre sí
muestras de dos o más pacientes. Pueden combinarse muestras de dos
o más pacientes que tengan la misma o diferentes fases del mismo o
de diferentes tipos de cánceres. También pueden combinarse muestras
de diferentes tipos de fluidos corporales a partir de un único o de
múltiples pacientes. Ventajosamente, puede usarse un reactivo de
inmunoensayo preparado a partir de fluido obtenido de un paciente o
pacientes de cáncer con un tipo particular de cáncer para ayudar al
diagnóstico del mismo tipo de cáncer en otros individuos.
En una realización, el "paciente de cáncer"
a partir del que se obtiene el fluido puede ser el mismo paciente
que posteriormente se pretende evaluar usando el reactivo de ensayo.
Por ejemplo, puede usarse una reserva de reactivo preparada a
partir de un paciente diagnosticado con cáncer en una fecha
posterior para evaluar el estado inmune del mismo paciente, por
ejemplo, para controlar la evolución de la enfermedad y/o para
evaluar la eficacia de un ciclo de tratamiento anticanceroso en ese
paciente.
El "reactivo de inmunoensayo" o la
"preparación de marcador tumoral" pueden comprender
sustancialmente la proteína marcadora de tumores completa, por
ejemplo, una proteína marcadora de tumores sustancialmente en la
forma en la que se aísla a partir del fluido o excreción, o puede
comprender un fragmento de la proteína marcadora de tumores. Para
que sea eficaz como reactivo de inmunoensayo cualquiera de dichos
"fragmentos" debe conservar la reactividad inmunológica con
los auto(anticuerpos) para los que se desea realizar el
ensayo usando el reactivo. Pueden prepararse fragmentos adecuados,
por ejemplo, mediante escisión química o enzimática de la proteína
marcadora de tumores aislada.
Dependiendo de la naturaleza concreta del
inmunoensayo en el que se va a usar, el "reactivo" o la
"preparación de proteína marcadora de tumores" pueden
comprender una proteína marcadora de tumores, o un fragmento de la
misma, unida a una o más moléculas adicionales que le confieran
alguna característica deseable no presente de forma natural en la
proteína marcadora de tumores. Por ejemplo, la proteína marcadora de
tumores puede conjugarse con un marcador de revelado, tal como un
marcador fluorescente, un marcador de color, un marcador
luminiscente, un radiomarcador o un metal pesado tal como oro
coloidal.
La proteína marcadora de tumores, como se
prepara por el método que se describe en este documento, también
puede inmovilizarse para el uso sobre un soporte sólido tal como una
perla o superficie de un pocillo de una placa multipocillo. La
inmovilización puede ser por absorción o por unión covalente.
Preferiblemente, la proteína marcadora de
tumores (o el reactivo de ensayo que comprende dicha proteína) es,
sustancialmente, una inmunoglobulina libre en virtud del hecho de
que después del aislamiento, por ejemplo, mediante cromatografía de
afinidad, la preparación de proteína se trata para eliminar
específicamente inmunoglobulinas contaminantes.
El uso de un reactivo de inmunoensayo que
comprende una proteína marcadora de tumores (o un fragmento de la
misma), aislada a partir de fluidos obtenidos de uno o más pacientes
de cáncer, proporciona ventajas significativas sobre el uso de
otros reactivos, tales como polipéptidos expresados de forma
recombinante o sintetizados químicamente, en la detección clínica
del cáncer (incluyendo el diagnóstico, el control de recidivas de la
enfermedad o de la evolución de la enfermedad, etc.).
Podría esperarse que las características
concretas de las proteínas marcadoras de tumores aisladas a partir
de pacientes de cáncer variarán dependiendo del material fuente (por
ejemplo, tejido o fluido) a partir del que se aísle la proteína
marcadora de tumores. Por ejemplo, las características de las
proteínas aisladas a partir de la orina pueden ser diferentes de
las de las aisladas a partir de sangre completa o de suero, que a
su vez pueden ser diferentes de las de las aisladas a partir de
ascitis o de derrame pleural. A su vez, esto puede afectar a la
utilidad de la proteína marcadora de tumores como reactivo de
ensayo.
De hecho, sorprendentemente los inventores han
observado que los reactivos preparados a partir de proteínas
marcadoras de tumores aisladas a partir de fluidos procedentes de
cavidades corporales de pacientes con cáncer, en concreto, líquido
ascítico, derrame pleural, seroma o líquido de drenaje de heridas,
son generalmente más específicos para autoanticuerpos asociados con
cáncer que reactivos basados en las proteínas equivalentes aisladas
a partir de individuos "normales". Esta especificidad aumentada
para autoanticuerpos asociados con cáncer significa que los
inmunoensayos basados en el uso de reactivos preparados a partir de
fluidos procedentes de calidades corporales de pacientes con cáncer
producen resultados que son "clínicamente más relevantes" en
la detección de una respuesta inmune contra el cáncer.
Anteriormente a la presente invención, no estaba
claro cómo reactivos que comprendían antígenos preparados a partir
de fluidos procedentes de cavidades corporales de pacientes con
cáncer podían funcionar como reactivos para la detección
inmunológica de autoanticuerpos. En concreto, no se sabía si dichos
antígenos presentarían una especificidad mayor por autoanticuerpos
asociados con cáncer. No podía predecirse si los antígenos de
dichas fuentes funcionarían de forma similar a o mejor que antígenos
preparados a partir de sangre o suero, en términos de su capacidad
para detectar autoanticuerpos asociados con cáncer. Aunque se sabía
que podía haber proteínas marcadoras de tumores en fluidos
procedentes de cavidades y espacios corporales, generalmente existe
un potencial mayor para que los antígenos se degraden en estas
cavidades y espacios corporales. A su vez, esto significaría que
podrían no detectarse autoanticuerpos, así como antígenos
procedentes del suero. Además, no podía concluirse con seguridad
que los antígenos procedentes de fluidos procedentes de cavidades
fueran inmunológicamente similares a los antígenos procedentes del
suero. Por consiguiente, fue sorprendente observar que los
antígenos preparados a partir de fluidos procedentes de cavidades de
pacientes de cáncer funcionan bien como reactivos de
inmunoensayo.
Los inventores postulan que la especificidad
aumentada observada con el uso de reactivos preparados a partir de
ascitis, derrame pleural, seroma o líquido de drenaje de heridas se
debe al origen de dichos fluidos dentro de las cavidades o espacios
corporales de pacientes de cáncer. Se postula que los fluidos que se
originan en cavidades o espacios corporales debido a la presencia
de un tumor en contacto con los órganos principales pueden recoger
más formas "asociadas con cáncer" de la proteína marcadora de
tumores, que sean realmente importantes para la patología
cancerosa, y contener menos de las proteínas "normales"
correspondientes. Puesto que son generalmente las diferencias entre
las proteínas marcadoras de "tumores" y sus homólogas
"normales" las que desencadenan el desarrollo de una respuesta
inmune (es decir, la producción de autoanticuerpos), los inventores
plantean la hipótesis de que reactivos basados en el uso de
marcadores tumorales aislados a partir de pacientes con cáncer
serán más específicos para autoanticuerpos de cáncer que las
proteínas "normales" equivalentes. De hecho, éste es el caso
con antígenos marcadores de tumores aislados a partir de ascitis,
derrame pleural o seroma, como se muestra en los Ejemplos
adjuntos.
Existen ventajas prácticas adicionales asociadas
con el uso de líquido ascítico, derrame pleural, seroma, hidrocele
o líquido de drenaje de heridas como fuente de proteínas marcadoras
de tumores. Estos fluidos pueden extraerse fácilmente de pacientes
en volúmenes relativamente grandes como parte de la estrategia
terapéutica. Este material, que de otro modo se desecharía, es una
fuente valiosa de un reactivo de ensayo útil.
Dado que los fluidos tales como líquido
ascítico, derrame pleural, seroma, hidrocele o líquidos de drenaje
de heridas se producen en grandes volúmenes, había dudas acerca de
si la concentración de proteínas marcadoras de tumores en dichos
fluidos sería lo bastante elevada como para permitir el uso de
dichos fluidos como una fuente práctica de antígenos. Era razonable
esperar que la concentración de proteínas marcadoras de tumores
estaría más diluida en dichos fluidos en comparación con la sangre o
el suero. Sorprendentemente, los inventores observaron que las
concentraciones de proteínas marcadoras de tumores en dichos fluidos
son, de hecho, significativamente mayores que en el suero. Por
consiguiente, pueden obtenerse beneficios sustanciales en términos
de rendimiento con la recuperación de proteínas marcadoras de
tumores a partir de dichos fluidos.
Además, también se ha observado por los
inventores que pueden obtenerse ventajas significativas adicionales
mediante la combinación de muestras de fluidos de cavidades
corporales de dos o más pacientes. Aparte de aumentar el
rendimiento de proteína, el producto garantiza un índice de
detección al menos tan bueno como el de una proteína marcadora de
una muestra individual mientras que, al mismo tiempo, es más
uniforme en sus características entre lotes. Por lo tanto, siempre
puede confiarse en una afinidad adecuada del antígeno.
En realizaciones particulares, los métodos de la
invención pueden comprender inmunoensayos para (simultáneamente)
detectar dos o más tipos de autoanticuerpos, teniendo cada uno
especificidad por diferentes proteínas marcadoras de tumores o por
diferentes epítopos en las mismas proteínas marcadoras de tumores.
Típicamente, estos métodos implicarán el uso de un panel de dos o
más reactivos de ensayo, comprendiendo cada reactivo una proteína
marcadora de tumores diferente. Estos métodos, que en lo sucesivo
puede denominarse como "ensayos de panel", utilizan un panel
de dos o más reactivos para controlar la respuesta inmune global de
un individuo a un tumor u otro cambio carcinogénico o neoplásico.
Estos métodos detectan, por lo tanto, un "perfil" de la
respuesta inmune en un individuo dado, indicando qué marcadores
tumorales producen una respuesta inmune que da como resultado la
producción de autoanticuerpos. El uso de un panel de dos o más
reactivos para controlar la producción de autoanticuerpos contra
dos o más marcadores tumorales diferentes generalmente es más
sensible que la detección de autoanticuerpos contra marcadores
individuales y proporciona una frecuencia mucho menor de resultados
falsos
negativos.
negativos.
Los métodos de la invención se prefieren para la
detección de autoanticuerpos libres circulantes pero pueden
adaptarse para la detección de autoanticuerpos presentes en
complejos inmunes, como apreciará el lector especialista, por
ejemplo, mediante el uso competitivo de un marcador tumoral
marcado.
En aplicaciones preferidas el método de la
invención se usará para detectar la presencia de autoanticuerpos
antitumorales asociados con cáncer en sujetos o pacientes humanos y,
más preferiblemente, adoptará la forma de un inmunoensayo in
vitro, realizado sobre muestras de fluidos corporales obtenidas
del sujeto o paciente. Dichos inmunoensayos in vitro no son
invasivos y pueden repetirse con tanta frecuencia como se crea
necesaria para generar un perfil de producción de autoanticuerpos
en un paciente, ya sea antes del comienzo de la enfermedad, como en
la exploración de individuos "con riesgo", o durante el curso
de la enfermedad (que se analiza adicionalmente a continuación con
respecto a aplicaciones preferidas del método). Como se usa en este
documento, la expresión "fluido corporal", cuando se refiere
al material que se va a ensayar para determinar la presencia de
autoanticuerpos mediante inmunoensayo, incluye, entre otros,
plasma, suero, sangre completa, orina, sudor, linfa, heces, líquido
cefalorraquídeo, ascitis, derrame pleural, líquido seminal, esputo o
aspirado de pezón. El tipo de fluido corporal usado puede variar
dependiendo del tipo de cáncer implicado y de la situación clínica
en la que se use el ensayo. En general, se prefiere realizar los
ensayos sobre muestras de suero o de plasma.
Como se ha dicho anteriormente, el
"inmunoensayo" usado para detectar o cuantificar
autoanticuerpos asociados con cáncer puede llevarse a cabo de
acuerdo con procedimientos convencionales conocidas en la técnica.
En una realización más preferida, el inmunoensayo será un ELISA. En
general, los ELISA se conocen bien en la técnica. En un ELISA de
"sándwich" típico, un reactivo que tiene especificidad por los
autoanticuerpos bajo ensayo se inmoviliza sobre una superficie
sólida (por ejemplo, los pocillos de una placa de ensayo de
microtitulación convencional o la superficie de una microperla) y
una muestra de fluido corporal que se va a ensayar para determinar
la presencia de autoanticuerpos se pone en contacto con el reactivo
inmovilizado. Cualquier autoanticuerpo de la especificidad deseada
presente en la muestra se unirá con el reactivo inmovilizado.
Después, los complejos de autoanticuerpo unido/reactivo pueden
detectarse usando cualquier método adecuado. En una realización
preferida, se usa un anticuerpo secundario marcado de
inmunoglobulina anti-humano, que reconoce
específicamente un epítopo común para una o más clases de
inmunoglobulinas humanas, para detectar los complejos de
autoanticuerpo/reactivo. Típicamente, el anticuerpo secundario será
anti-IgG o anti-IgM. Habitualmente,
el anticuerpo secundario se marca con un marcador detectable,
típicamente un marcador enzimático tal como, por ejemplo, peroxidasa
o fosfatasa alcalina, que permite la detección cuantitativa
mediante la adición de un sustrato para la enzima que genera un
producto detectable, por ejemplo, un producto de color,
quimioluminiscente o fluorescente. Pueden usarse otros tipos de
marcadores detectables conocidos en la técnica con un efecto
equivalente.
El ELISA puede realizarse en un formato
cualitativo, en el que el objetivo es simplemente determinar la
presencia o ausencia de autoanticuerpos en la muestra, o en un
formato cuantitativo, que proporciona una medición de la cantidad
de autoanticuerpos presentes en la muestra. Para ensayos
cuantitativos, puede generarse una curva patrón por medición de la
señal obtenida (usando la misma reacción de detección que se usará
para el ensayo) a partir de una serie de muestras patrón que
contienen concentraciones conocidas de anticuerpos, y que tienen un
especificidad similar a la de los autoanticuerpos bajo ensayo.
Después, la cantidad de autoanticuerpos presentes en la muestra
bajo ensayo puede interpolarse a partir de la curva patrón.
Pueden realizarse ensayos de panel en un formato
multipocillo en el que cada uno de los dos o más reactivos de
ensayo se coloca en un pocillo distinto de una placa de ensayo
multipocillo o, como alternativa, en un formato de recipiente único
en el que los dos o más reactivos de ensayo se colocan en un único
recipiente.
El método de la invención puede adaptarse para
el uso en la detección de autoanticuerpos contra esencialmente
cualquier proteína marcadora de tumores para la que pueda prepararse
un "reactivo de ensayo" adecuado a partir de un fluido
corporal procedente de una cavidad corporal de un paciente de
cáncer. En particular, el método puede adaptarse para detectar o
medir autoanticuerpos contra la proteína C relacionada con el
receptor del factor de crecimiento epidérmico erbB2 (Dsouza, B.
et al. (1993) Oncogene 8: 1797-1806),
la glicoproteína MUC1 (Batra, S. K. et al., (1992) Int.
J. Pancreatology, 12: 271-283) y las proteínas
reguladoras de la transducción de señales y del ciclo celular Myc
(Blackwood, E. M. et al. (1994) Molecular Biology of the
Cell 5: 597-609), p53 (Matlashewski, G. et
al., (1984) EMBO J. 3: 3257-3262; Wolf,
D. et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:
1887-1893) y ras (o Ras) (Capella, G. et al.,
(1991) Environ Health Perspectives, 93: 125-131) y
también BRCA1 (Scully, R. et al. (1997) PNAS 94:
5605-10); BRCA2 (Sharan, S. K. et al. (1997)
Nature 386: 804-810); APC (Su, L. K. et
al., (1993) Cancer Res. 53: 2728-2731;
Munemitsu, S. et al., (1995) PNAS 92:
3046-50), CA125 (Nouwen, E. J. et al., (1990)
Differentiation, 45: 192-8), PSA (Rosenberg,
R. S. et al. (1998) Biochem Biophys Res Commun. 248:
935-939), antígeno carcinoembrionario CEA (Duffy,
M. J: (2001) Clin Chem, abril 47 (4): 624-30)
y CA19.9 (Haga, Y. et al (1989) Clin Biochem (1989),
octubre 22 (5); 363-8). Sin embargo, no se pretende
que la invención se limite a la detección de autoanticuerpos contra
estos marcadores tumorales en particular.
El método de ensayo de la invención puede
emplearse en una diversidad de situaciones clínicas diferentes. En
particular, el método puede usarse en la detección o en el
diagnóstico del cáncer, en el control de la evolución del cáncer u
otra enfermedad neoplásica en un paciente, en la detección de
cambios neoplásicos tempranos o carcinogénicos tempranos en un
sujeto humano asintomático, en la exploración de una población de
sujetos humanos asintomáticos para identificar a los sujetos que
presentan un riesgo aumentado de desarrollar cáncer, en el control
de la respuesta de un paciente de cáncer a un tratamiento
anticanceroso, en la detección de una enfermedad recidivante en un
paciente previamente diagnosticado como que tiene cáncer que se ha
sometido a un tratamiento anticanceroso para reducir la cantidad de
cáncer presente o en la selección de una vacuna anticáncer para el
uso en un paciente en particular.
Generalmente, los inventores han observado que
los niveles de autoanticuerpos asociados con cáncer muestran una
correlación positiva con la patología (véase también el documento WO
99/58979, cuyo contenido se incorpora en este documento como
referencia). Por lo tanto, cuando el método de la invención se usa
en aplicaciones clínicas, los niveles aumentados de autoanticuerpos
anti-marcadores tumorales, en comparación con
controles adecuados, se toman generalmente como un indicio de la
patología cancerosa.
Por ejemplo, cuando los inmunoensayos se usan en
el diagnóstico del cáncer, la presencia de un nivel elevado de
autoanticuerpos, en comparación con individuos de control
"normales", se toma como un indicio de que el individuo tiene
cáncer. Preferiblemente, los individuos de control "normales"
serán controles de la misma edad que no tienen ningún diagnóstico
de cáncer en base a criterios clínicos, de diagnóstico por imagen
y/o bioquímicos.
Cuando los inmunoensayos se usan en el control
de la evolución del cáncer u otra enfermedad neoplásica en un
paciente, la presencia de un nivel elevado de autoanticuerpos en
comparación con un "control normal" se toma como un indicio de
la presencia de cáncer en el paciente. El "control normal"
pueden ser niveles de autoanticuerpos presentes en individuos de
control, preferiblemente de la misma edad, que no tengan diagnóstico
de cáncer en base a criterios clínicos, de diagnóstico por imagen
y/o bioquímicos. Como alternativa, el "control normal" puede
ser un nivel de "medidas basales" establecido para el paciente
en particular bajo ensayo. El nivel de "medidas basales" puede
ser, por ejemplo, el nivel de autoanticuerpos presentes cuando se
realizó un primer diagnóstico de cáncer o un diagnóstico de cáncer
recidivante. Cualquier aumento por encima del nivel de las medidas
basales se tomará como un indicio de que la cantidad de cáncer
presente en el paciente ha aumentado, mientras que cualquier
disminución por debajo de las medidas basales se tomaría como un
indicio de que la cantidad de cáncer presente en el paciente ha
disminuido. El valor de las "medidas basales" también puede
ser, por ejemplo, el nivel antes de que comience un nuevo
tratamiento. Un cambio en el nivel de autoanticuerpos se tomaría
como un indicio de la eficacia de la terapia. La dirección del
"cambio" (es decir, aumento frente a disminución) que indique
una respuesta positiva al tratamiento dependerán de la naturaleza
concreta del tratamiento. Para cualquier tratamiento dado la
dirección del "cambio" en los niveles de autoanticuerpos que
indica un resultado positivo puede determinarse fácilmente, por
ejemplo, mediante el control de los niveles de autoanticuerpos en
comparación con otros indicadores clínicos o bioquímicos de
respuesta al tratamiento.
Cuando los inmunoensayos se usan en la
exploración de una población de sujetos humanos asintomáticos para
identificar a los sujetos que presentan un riesgo aumentado de
desarrollar cáncer, los individuos que tienen un nivel elevado de
autoanticuerpos en comparación con individuos de control
"normales" se identifican como que están "en riesgo" de
desarrollar cáncer. Preferiblemente, los individuos de control
"normales" serán controles de la misma edad en los que no se
haya identificado ninguna predisposición a desarrollar cáncer ni
ningún riesgo elevado significativo de desarrollar cáncer. Una
excepción a esto puede ser que la propia edad es un factor de riesgo
fundamental.
Cuando los inmunoensayos se usan en el control
de la respuesta de un paciente de cáncer a un tratamiento
anticanceroso, la presencia de un nivel disminuido de
autoanticuerpos después del tratamiento se toma como un indicio de
que el paciente ha respondido positivamente al tratamiento. Puede
usarse un nivel de medidas basales de autoanticuerpos tomado antes
de que comience el tratamiento con fines comparativos para
determinar si el tratamiento da como resultado una
"disminución" en los niveles de autoanticuerpos.
Cuando los inmunoensayos se usan en la detección
de enfermedad recidivante, la presencia de un nivel aumentado de
autoanticuerpos en el paciente en comparación con un "control
normal" se toma como un indicio de que la enfermedad ha
recidivado. El "control normal" pueden ser niveles de
autoanticuerpos presentes en individuos de control, preferiblemente
de la misma edad que no tengan ningún diagnóstico de cáncer en base
a criterios clínicos, de diagnóstico por imagen y/o bioquímicos.
Como alternativa, el "control normal" puede ser un nivel de
"medidas basales" establecido para el paciente en particular
bajo ensayo. El nivel de las "medidas basales" puede ser, por
ejemplo, el nivel de autoanticuerpos presente durante un periodo de
remisión de la enfermedad en base a criterios cínicos, de
diagnóstico por imagen y/o bioquímicos.
El método de ensayo de la invención puede
aplicarse en la detección de muchos tipos de cáncer diferentes,
siendo ejemplos de los mismos cánceres de mama, de vejiga,
colorrectal, de próstata y de ovario. Los ensayos pueden
complementar métodos existentes de exploración y vigilancia. Por
ejemplo, en el caso de cáncer de mama primario, podrían usarse
inmunoensayos para autoanticuerpos para alertar a los médicos para
que biopsien pequeñas lesiones en mamogramas que radiográficamente
no parezcan sospechosas o realicen un diagnóstico por imagen de las
mamas o repitan el diagnóstico por imagen antes de lo que se había
planeado. En la clínica, se espera que los métodos de ensayo de la
invención sean más objetivos y reproducibles en comparación con las
técnicas de diagnóstico por imagen actuales (es decir, mamografía y
ultrasonido), cuyo éxito puede depender del técnico.
Pueden confeccionarse "ensayos de panel"
con respecto a la aplicación clínica en particular. Un panel de
reactivos para la detección de autoanticuerpos contra al menos p53
y c-erbB2 es particularmente útil para muchos tipos
de cáncer y puede, opcionalmente, complementarse con otros
marcadores que tengan una asociación conocida con el cáncer en
particular o con una fase del cáncer en particular que se va a
detectar. Por ejemplo, para el cáncer de mama el panel podría
incluir MUC 1 y/o c-myc y BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA,
mientras que para el cáncer de vejiga el panel podría incluir,
opcionalmente, MUC 1 y/o c-myc, para el cáncer
colorrectal ras y/o APC, para el cáncer de próstata PSA y/o BRCA1
y/o BRCA2 o para el cáncer de ovario BRCA1 y/o BRCA2 y/o CA125.
Existen otras realizaciones preferidas en las que p53 o
c-erbB2 no son necesariamente esenciales. Por
ejemplo, en el caso del cáncer de mama, podrían seleccionarse
paneles adecuados de entre los siguientes:
p53 y MUC 1 con c-erbB2 y/o
c-myc y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA opcionales;
p53 y myc con c-erbB2 y/o MUC 1
y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA opcionales;
p53 y BRCA1 con c-erbB2 y/o MUC
1 y/o c-myc y/o BRCA2 y/o PSA opcionales;
p53 y BRCA2 con c-erbB2 y/o MUC
1 y/o c-myc y/o BRCA1 y/o PSA opcionales;
c-erbB2 y MUC 1 con p53 y/o
c-myc y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA opcionales;
c-erbB2 y c-myc
con p53 y/o MUC 1 y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA opcionales;
c-erbB2 y BRCA1 con p53 y/o MUC
1 y/o c-myc y/o BRCA2 y/o PSA opcionales;
c-erbB2 y BRCA2 con p53 y/o MUC
1 y/o c-myc y/o BRCA1 y/o PSA opcionales.
\vskip1.000000\baselineskip
En el caso del cáncer colorrectal, podrían
seleccionarse paneles adecuados, por ejemplo, de entre los
siguientes:
p53 y ras con c-erbB2 y/o APC
opcionales;
p53y APC con c-erbB2 y/o Ras
opcionales;
Ras y APC con p53 y/o c-erbB2
opcionales.
Dichos paneles también pueden incluir CEA o
CA19-9.
\vskip1.000000\baselineskip
En el caso del cáncer de próstata, podrían
seleccionarse paneles adecuados, por ejemplo, de entre los
siguientes:
p53 y PSA con BRCA1 y/o BRCA2 y/o
c-erbB2 opcionales;
c-erbB2 y PSA con p53 y/o BRCA1
y/o BRCA2 opcionales.
En el caso del cáncer de ovario, podrían
seleccionarse paneles adecuados, por ejemplo, de entre los
siguientes:
p53 y CA125 con c-erbB2 y/o
BRCA1 y/o BRCA2 opcionales;
c-erbB2 y CA125 con p53 y/o
BRCA1 y/o BRCA2 opcionales.
En una realización adicional, el método de
inmunoensayo de la invención puede usarse en la selección de una
vacuna anticáncer para el uso en una paciente en particular. En esta
realización, se evalúa una muestra de fluido corporal obtenida a
partir del paciente usando un panel de dos o más reactivos de
inmunoensayo, correspondiéndose cada uno con una proteína marcadora
de tumores diferente, para determinar la intensidad relativa de la
respuesta inmune del paciente a cada una de las proteínas
marcadoras de tumores diferentes. La "intensidad de la respuesta
inmune" contra una proteína o proteínas marcadoras de tumores
dadas se indica por la presencia y/o la cantidad de autoanticuerpos
asociados con cáncer específicos para esa proteína marcadora de
tumores detectada usando el inmunoensayo; cuando se cuantifican los
anticuerpos, cuanto mayor el nivel de autoanticuerpos asociados con
cáncer, más intensa la respuesta inmune. La proteína o proteínas
marcadoras de tumores identificadas como productoras de la
respuesta o respuestas inmunes más intensas en el paciente (es
decir, el nivel más elevado de autoanticuerpos) se selecciona o
seleccionan después para formar la base de una vacuna anticáncer
para el uso en el paciente.
En una realización adicional, la invención
proporciona un método de control de si la vacunación de un sujeto
con una vacuna anticáncer basada en una proteína marcadora de
tumores en particular ha tenido éxito en la producción de una
respuesta inmune humoral (es decir, anticuerpos contra dicha
proteína marcadora de tumores). Este método se basa en la misma
metodología de inmunoensayo usada para medir autoanticuerpos
antitumorales asociados con cáncer (es decir, el uso de un reactivo
de inmunoensayo basado en una proteína marcadora de tumores
purificada a partir de un fluido de una cavidad corporal) siendo la
única diferencia que lo que se mide en el ensayo es una respuesta
de anticuerpos en lugar de una respuesta de autoanticuerpos.
En esta realización, una muestra de un fluido
corporal obtenida de un paciente previamente tratado con la vacuna
anticáncer (por ejemplo, una preparación inmunogénica que comprende
la proteína marcadora de tumores pertinente, o un fragmento
antigénico de la misma, o una vacuna que comprende un ácido nucleico
que codifica dicha proteína marcadora de tumores pertinente) se
pone en contacto con un reactivo de inmunoensayo y se detectan los
complejos formados por la unión específica del reactivo de
inmunoensayo a anticuerpos asociados con cáncer presentes en la
muestra. De nuevo, el reactivo de inmunoensayo comprende una muestra
de dicha proteína marcadora de tumores preparada a partir de un
fluido corporal procedente de una cavidad o espacio corporal, como
se define en este documento, de uno o más pacientes de cáncer.
Además de las aplicaciones clínicas en la
detección del cáncer, etc., el método de la invención puede usarse
en cualquier aplicación en la que se desee ensayar la presencia de
autoanticuerpos antitumorales asociados con cáncer. Por ejemplo, el
método de la invención puede tener aplicaciones en el laboratorio
como herramienta de investigación.
La invención se entenderá adicionalmente con
referencia a los siguientes Ejemplos experimentales, junto con las
Figuras adjuntas en las que:
la Figura 1 muestra un cromatograma de
filtración en gel posterior a la destrucción de IgG de una
preparación de MUC16 (CA125) de ascitis;
la Figura 2 muestra un gel teñido con plata de
una purificación de c-myc a partir de líquido
ascítico, posterior a una cromatografía de inmunoafinidad;
la Figura 3 muestra una transferencia
inmunosondada, la purificación de c-myc a partir de
líquido ascítico, posterior a una cromatografía de
inmunoafinidad;
la Figura 4 muestra una comparación de la
reactividad de autoanticuerpos del suero de pacientes (pacientes
sin pruebas propias de cáncer de mama pero con una historia familiar
de cáncer de mama y los que tienen cáncer de mama primario) contra
MUC 1 aislada a partir de diversos fluidos corporales: orina (de
individuos "normales"), derrame pleural de un paciente de
cáncer y suero de pacientes de cáncer de mama avanzado (suero de
ABC);
la Figura 5 muestra la reactividad de
autoanticuerpos en suero de individuos normales contra MUC1 de
diversos fluidos corporales: MUC1 urinaria (normal), derrame
pleural de un paciente de cáncer y de pacientes de cáncer de mama
avanzado (suero de ABC);
la Figura 6 muestra la reactividad de
autoanticuerpos en muestras de suero de pacientes preoperatorios con
masas ováricas contra MUC16 normal (CA125) y contra MUC16 asociada
con tumor de ascitis;
la Figura 7 muestra la concentración de MUC1
asociada con cáncer en sueros, derrame pleural y líquido
ascítico;
la Figura 8 muestra la concentración de MUC1
asociada con cáncer en suero, líquido de drenaje de heridas y
seroma;
la Figura 9 muestra la reactividad de
autoanticuerpos purificados a partir de seroma del paciente M con
cáncer contra MUC1 urinaria purificada a partir del paciente M
obtenida dos años antes del diagnóstico de cáncer, MUC1 procedente
del seroma del paciente M después del diagnóstico de cáncer y
albúmina de suero bovino conjugada con péptido del núcleo de la
proteína MUC1;
la Figura 10 muestra la reactividad de
autoanticuerpos del suero contra MUC1 purificada a partir de
líquidos ascíticos combinados y contra MUC1 purificada a partir de
muestras individuales de ascitis de pacientes de cáncer;
la Figura 11 muestra la reactividad de
autoanticuerpos del suero contra MUC1 purificada a partir de
derrames pleurales combinados y contra MUC1 purificada a partir de
muestras de derrame pleural individuales de pacientes de cáncer;
y
la Figura 12 muestra una curva de calibración
preparada a partir de MUC1 de un derrame pleural.
\vskip1.000000\baselineskip
Se conjuga anticuerpo monoclonal
anti-MUC1 B55 (también conocido como NCRC 11, Xoma
Corporation) con perlas de CNBr-sepharose. El B55
puede sustituirse por otros anticuerpos monoclonales
anti-MUC1.
Los fluidos corporales inducidos por tumores
(por ejemplo, derrame pleural, ascitis, seroma o líquido de drenaje
de heridas) se diluyen 1/10 con solución salina tamponada con
fosfato (PBS) y se filtran a través de poros de 0,45 \mum.
Los fluidos corporales diluidos se incuban con
las perlas de sepharose anti-MUC1 (25 ml de fluido
diluido para 1 ml de volumen relleno de perlas) durante una noche a
4ºC con balanceo (método "discontinuo") o se hacen recircular
durante una noche a través de una columna rellena que contiene
perlas de sepharose anti-MUC1 (método en
"columna").
\vskip1.000000\baselineskip
Las perlas se rellenan mediante centrifugación y
se retira el sobrenadante.
Las perlas se resuspenden en
5-10 ml de PBS y se someten a balanceo durante 10
minutos; después se rellenan mediante centrifugación y se retira el
sobrenadante; se repite 5 veces (o hasta una A_{280 \ nm} \sim
0).
Las perlas se resuspenden en 5 ml de DEA 100 mM
a pH 11 y se someten a balanceo a temperatura ambiente durante 10
minutos.
Las perlas se rellenan mediante centrifugación y
se retira el sobrenadante; el pH se ajusta a 7 por adición de
tampón Tris a pH 7 y se dializan contra PBS durante 24 horas mínimo
(fracción de DEA 100).
Las perlas se resuspenden en 5 ml de PBS y se
someten a balanceo durante 10 minutos, después se rellenan por
centrifugación y se retira el sobrenadante; el pH se ajusta a 7 por
adición de tampón Tris a pH 7 y se dializan contra PBS durante 24
horas mínimo (fracción post-DEA).
El contenido de MUC1 de cada fracción se
confirma mediante ELISA usando, por ejemplo, el anticuerpo
monoclonal anti-MUC1 C595 (disponible de Cancer
Research Campaign Laboratories, UK) (véase el Ejemplo 5 para más
detalles) o B55 antes de la combinación de las dos fracciones y del
almacenamiento a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La columna se lava con 5 volúmenes de columna de
PBS o hasta que el eluido de una lectura de \sim0 a una A_{280 \
nm}.
Se aplica 1 volumen de columna de DEA 100 mM a
pH 11 seguido de 5 volúmenes de columna de PBS.
Las fracciones eluidas (2 ml) se recogen desde
el momento de la aplicación del DEA hasta la aplicación del PBS.
Las fracciones se dializan durante una noche
contra PBS.
Las fracciones se ensayan para determinar el
contenido de MUC1 mediante ELISA usando, por ejemplo, el anticuerpo
monoclonal anti-MUC1 C595 o B55 antes de combinar
las fracciones positivas para MUC1 y almacenarlas a -20ºC.
Para eliminar inmunoglobulinas contaminantes,
las fracciones combinadas de MUC1 se incuban con ditiotreitol (DTT)
a 50 mM durante 30 min, después con yodoacetamida (a 75 mM) antes de
someterse a la filtración en gel en una columna S300.
Las fracciones resultantes (5 ml) se ensayan
para determinar el contenido de MUC1 e inmunoglobulina humana (Ig)
por ELISA.
Las fracciones que contienen MUC1 (no
contaminada con Ig humana) se combinan y se almacenan a -20ºC.
Se añadió un volumen (por ejemplo, 50 ml) de
sulfato de amonio saturado a un volumen (por ejemplo, 50 ml) de
fluido corporal inducido por tumor (por ejemplo, derrame pleural,
ascitis, seroma o líquido de drenaje de heridas) y se incubó
durante una noche a 4ºC.
El precipitado resultante se recoge por
centrifugación (3500 rpm durante 30 min en una centrífuga de
sobremesa convencional) y se resuspende en ½ volumen de PBS.
Esta resuspensión se somete a una cromatografía
de filtración en gel a través de una columna S300 (2,5 x 100 cm)
usando PBS como el tampón de elución.
Las fracciones (de 5 ó 10 ml) se recogen y se
ensayan por ELISA para MUC16 usando, por ejemplo,
anti-CA125 de ICN o el anticuerpo
anti-MUC16 VK8 (Memorial Sloane Kettering, Nueva
York) antes de combinar las fracciones positivas para MUC16 y
almacenarlas a -20ºC.
Para eliminar inmunoglobulinas contaminantes, se
incuban combinaciones de MUC16 con NaSCN (a 1,5 M) durante 10 min,
DTT (a 50 mM) durante 30 min, y después con yodoacetamida (a 75 mM)
durante 30 min antes de someterlas a la filtración en gel, por
ejemplo, en una columna S300 o Superdex^{TM} 75.
Las fracciones resultantes (5 ml) se ensayan
para determinar el contenido de MUC16 e inmunoglobulina humana (Ig)
por ELISA.
Las fracciones que contienen MUC16 (no
contaminada con Ig humana) se combinan y se almacenan a -20ºC.
Para una muestra preparada de la forma descrita
anteriormente, se ensayaron fracciones de una filtración en gel
posterior a la destrucción de Ig para MUC16 usando anticuerpo
anti-MUC16 VK8 y para Ig humana usando un
anti-Ig humana. Los resultados se muestran en la
Figura 1. Como se demuestra claramente, se eluyen dos picos de
MUC16 sustancialmente libres de inmunoglobulinas.
La metodología es la misma que para la
purificación de MUC1 (Ejemplo 1) excepto por que:
Se usa anticuerpo monoclonal
anti-c-myc 9E10 (ATCC) (o un
anticuerpo anti-c-myc
equivalente).
La filtración en gel se realiza en una columna
Superdex^{TM} 75.
\vskip1.000000\baselineskip
La pureza de las fracciones de MUC1, MUC16 y
c-myc se evalúa mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida desnaturalizante y transferencia de Western
realizada de acuerdo con protocolos convencionales usando el sistema
BioRad^{TM} Mini Protean III^{TM} y el sistema BioRad^{TM}
DryBlot^{TM}.
Se revelaron en geles los patrones proteicos
para c-myc mediante tinción de plata (Figura 2). Las
transferencias de Western de c-myc se
inmunosondaron usando anticuerpos monoclonales 9E10 (Figura 3). En
cada caso, se identifican tanto c-myc como las
cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas.
Se añade antígeno tumoral (por ejemplo, MUC1,
MUC16 o c-myc preparados de acuerdo con los Ejemplos
1-3) diluido apropiadamente en PBS a 50 \mul por
pocillo en una placa de microtitulación convencional de 96 pocillos
y se deja secar al aire durante una noche.
La placa se lava una vez con PBS/Tween^{TM}
para eliminar cristales de sales residuales.
La placa se bloquea durante 60 min con caseína
al 0,1% o BSA al 1% en PBS.
La placa se lava 3 veces con
PBS/Tween^{TM}.
El suero (diluido 1/100 en PBS/caseína al 0,1%)
se añade a la placa por triplicado (50 \mul por pocillo) y
también los controles de anticuerpos monoclonales.
Se incuba durante 60 min a temperatura ambiente
con agitación.
La placa se lava 4 veces con
PBS/Tween^{TM}.
Se añade anticuerpo anti-Ig
conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (HRP) (Dako) a cada
pocillo (50 \mul por pocillo) a una dilución 1/8000 para
anti-humana y a 1/1000 para
anti-ratón.
Se incuba durante 60 min a temperatura ambiente
con agitación.
La placa se lava 4 veces con
PBS/Tween^{TM}.
Se añaden 50 \mul de TMB (tetrametilbenzadina)
por pocillo y se realiza una lectura cinética durante un periodo de
10 min a una A_{650 \ nm}.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando el método que se describe en el Ejemplo
4, se midieron autoanticuerpos asociados con cáncer contra MUC1 y
MUC16 en una diversidad de sueros usando MUC1 y MUC16 aisladas de
las diversas fuentes que se describen en este documento. Los
resultados generados se muestran en las Figuras 4 a 6.
La Figura 4 muestra una comparación de la
reactividad de autoanticuerpos del suero de pacientes contra MUC1
aislada a partir de diversos fluidos corporales: orina (de
individuos "normales"), derrame pleural de un paciente de
cáncer y suero de pacientes de cáncer de mama avanzado (suero de
ABC). Los sueros de pacientes ensayados eran de individuos sin
pruebas propias de cáncer de mama pero con una historia familiar de
cáncer de mama (es decir, uno o más parientes habían tenido cáncer
de mama a una edad temprana) o de individuos con cáncer de mama
primario.
Se realizaron ELISA de autoanticuerpos
convencionales como se han descrito anteriormente, utilizando MUC1
aislada de orina (normal), derrame pleural o suero de ABC como
antígeno. Los datos se normalizaron para una reacción de control
interno usando el anticuerpo monoclonal anti-MUC1
DF3 (en vez de una muestra de suero) contra cada uno de los
antígenos MUC1.
Como puede observarse por la Figura, la MUC1
procedente de orina normal (nMUC1) era sistemáticamente inferior en
su reactividad que la MUC1 procedente de derrame pleural (PE) o de
suero de ABC. Además, la MUC1 procedente de PE tenía una
reactividad similar para autoanticuerpos de MUC1 asociada con cáncer
que la MUC1 aislada a partir del suero de pacientes con ABC y, por
lo tanto, era de igual valor diagnóstico.
La Figura 5 muestra los resultados de un
experimento idéntico al de la Figura 4, excepto por que todas las
muestras de suero ensayadas eran de individuos normales (sin cáncer
de mama ni historia familiar de cáncer de mama). Como puede
observarse, no existen diferencias significativas en la reactividad
del suero para los tres antígenos diferentes.
La Figura 6 muestra la reactividad de
autoanticuerpos asociados con cáncer de MUC16 del suero de pacientes
con masas ováricas (preoperatorios) contra MUC16 (CA125) aislada a
partir del suero de individuos normales y a partir del líquido
ascítico en un paciente con cáncer de mama. Los antígenos se
prepararon como en el Ejemplo 2 y los autoanticuerpos se detectaron
usando un ensayo de ELISA como se describe en el Ejemplo 4.
Como puede verse, se observa una reactividad
enormemente aumentada de los autoanticuerpos de MUC16 asociada con
cáncer con el antígeno MUC16 de líquido ascítico en comparación con
la MUC16 "normal". Por lo tanto, este resultado experimental
confirma la utilidad del líquido ascítico como una fuente de
antígeno para la detección de autoanticuerpos asociados con
cáncer.
Los niveles de MUC1 que se encuentran de un
paciente con cáncer se compararon con los niveles que se encuentran
en líquido ascítico, derrame pleural, líquido de drenaje de heridas
o seroma, en cada caso, en el mismo paciente del que se obtuvo la
muestra de suero. La MUC1 en las muestras se cuantificó de acuerdo
con el siguiente protocolo:
Se reparten 50 \mul por pocillo de una
solución de anticuerpo en pocillos por triplicado de una placa de
microtitulación (habitualmente C595 (IgG) 1 \mug ml^{-1} y un
control negativo apropiado) y se incuban a temperatura ambiente
(RT) con agitación durante 1 h para que la proteína se adsorba a la
placa.
La placa se lava 4 veces con PBS/Tween usando
250 \mul por pocillo.
La placa se bloquea usando 100 \mul de BSA al
1% por pocillo y se incuba a RT con agitación durante 1 h.
La placa se lava 4 veces con PBS/Tween usando
250 \mul por pocillo.
Se aplican 50 \mul por pocillo del fluido que
se va a ensayar, diluido 1/10 en PBS y se incuban a RT con
agitación durante 1 h.
La placa se lava cuatro veces con PBS/Tween
usando 250 \mul por pocillo.
Se añaden 50 \mul por pocillo de C595
biotinilado (1 \mug/ml) y se incuban a RT con agitación durante 1
h.
La placa se lava 4 veces con PBS/Tween usando
250 \mul por pocillo.
Se añaden 50 \mul por pocillo de
extra-avidina peroxidasa a una dilución 1/1000 y se
incuban a RT con agitación durante 1 h.
La placa se lava 4 veces con PBS/Tween usando
250 \mul por pocillo.
Se añaden 50 \mul por pocillo de sustrato de
TMB y se realiza una lectura cinética a 650_{nm} durante 10
minutos.
Los resultados se muestran en las Figura 7 y
8.
Como será fácilmente evidente a partir de los
datos, los niveles en suero del antígeno MUC1 asociado con cáncer
son significativamente inferiores al nivel que se encuentra en
líquido ascítico, derrame pleural, seroma o líquido de drenaje
heridas. Por consiguiente, pueden obtenerse beneficios importantes
en términos de rendimiento en la recuperación de antígeno marcador
de tumores a partir de esos fluidos de cavidades corporales.
Se purificaron anticuerpos humanos a partir de
seroma del paciente M mediante cromatografía de inmunoafinidad
contra MUC1 procedente del líquido de seroma del mismo paciente de
cáncer M. Después, los anticuerpos purificados se ensayaron contra
péptido del núcleo de la proteína conjugado con BSA para MUC1 y MUC1
procedente de: orina del paciente M obtenida dos años antes del
diagnóstico de cáncer; seroma del paciente M obtenido después del
diagnóstico de cáncer. La purificación de anticuerpos a partir del
seroma se llevó a cabo de acuerdo con el siguiente protocolo:
La purificación de autoanticuerpos humanos
anti-MUC1 se realizó mediante cromatografía de
afinidad.
Se aplicó líquido de seroma diluido 10 veces en
PBS a pH 7,6, a 0,5 ml/min mediante recirculación durante una noche
a 4ºC, a una matriz de afinidad en formato de columna que consistía
en CNBr-sepharose (Pharmacia) acoplada (siguiendo
las instrucciones del fabricante) con Pt-MUC1.
Después de la aplicación del líquido de seroma,
la columna se lavó con 15 ml de PBS (asegurando la vuelta de la
lectura a A_{280 \ nm} a cero) antes de la elución del anticuerpo
usando 10 ml de NaSCN 3 M a 1 ml/min.
Se recogieron fracciones de 1 ml durante todo el
proceso, se desalaron mediante diálisis contra PBS y se ensayaron
por ELISA para determinar la presencia de anticuerpo.
Las fracciones positivas se combinaron, se
verificó la pureza del anticuerpo (mediante PAGE) y se determinó la
concentración de anticuerpo.
El ensayo de los anticuerpos purificados contra
los tres antígenos MUC1 identificados anteriormente se llevó a cabo
de acuerdo con el protocolo siguiente:
Se reparten 50 \mul por pocillo de la solución
de antígeno MUC1 en pocillos por triplicado de una placa de
microtitulación y se dejan secar a RT durante una noche.
La placa se lava 2 veces con PBS/Tween usando
250 \mul por pocillo.
La placa se bloquea con BSA al 1% usando 100
\mul por pocillo y se incuba a RT con agitación durante 1 h.
La placa se lava 2 veces con PBS/Tween usando
250 \mul por pocillo.
Se añaden 50 \mul por pocillo de solución de
anticuerpo purificado a 1 \mug/ml y se incuba a RT con agitación
durante 1 h.
La placa se lava 4 veces con PBS/Tween usando
250 \mul por pocillo.
Se añaden 50 \mul por pocillo de Ig
humana-\alpha HRP (DAKO), recién diluida de
acuerdo con las instrucciones de los fabricantes y se incuba a RT
con agitación durante 1 h.
La placa se lava 4 veces con PBS/Tween usando
250 \mul por pocillo.
Se añaden 50 \mul por pocillo de sustrato de
TMB y se realiza una lectura cinética a 650_{nm} durante 10
minutos.
Los resultados se muestran en la Figura 9.
La reactividad de los anticuerpos contra el
péptido MUC1 era insignificante. La reactividad de los anticuerpos
contra la MUC1 normal era considerablemente inferior a la observada
contra la MUC1 procedente del seroma del paciente M. Puede
deducirse a partir de este resultado que la molécula MUC1 normal es
sustancialmente diferente con respecto a su reconocimiento inmune
de la que se encuentra en el líquido de seroma de un individuo
con
cáncer.
cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Se purificó MUC1 a partir de líquido ascítico
combinado y a partir de derrames pleurales combinados de pacientes
con cáncer de mama avanzado usando el protocolo descrito en el
Ejemplo 1 y se midió su reactividad contra el suero de pacientes
con cáncer de mama primario, como se describe en el Ejemplo 4. El
antígeno de los fluidos combinados se comparó en cada caso con el
antígeno aislado de 3 muestras individuales de líquido ascítico o
derrame pleural, respectivamente, de pacientes con ABC. Los
resultados se muestran en las Figuras 10 y 11.
En el caso tanto del líquido ascítico como del
derrame pleural, la reactividad de la MUC1 de fluidos combinados es
tan buena como la de la aislada de muestras individuales. Además,
mientras que existe un gran campo de variabilidad de la reactividad
usando muestras de individuos, las muestras combinadas proporcionan
una uniformidad mayor de producto de tal modo que no se esperaría
que la reactividad variara significativamente entre lotes de
muestras combinadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon diluciones seriadas de MUC1 que se
había aislado a partir de derrame pleural. Se midieron las
concentraciones de MUC1 mediante el método que se muestra en el
Ejemplo 4, excepto por que no se usaron sueros humanos. La
detección se realizó mediante anticuerpo de ratón B55 seguido de
anti-ratón-HRP de Dako, usando
puntos finales en lugar de una lectura cinética.
Los resultados se muestran en la Figura 12 y
confirman la utilidad de las proteínas marcadoras de tumores
preparadas de acuerdo con la invención como material de
calibración.
A continuación se enumeran las fuentes de
anticuerpos que pueden usarse en la purificación de proteínas
marcadoras de tumores mediante cromatografía afinidad. La
cromatografía de afinidad puede realizarse siguiendo la metodología
general descrita en el Ejemplo 1 (con respecto a MUC1), con las
modificaciones apropiadas. Se entenderá que también pueden usarse
otros anticuerpos específicos para la proteína marcadora
pertinente.
\newpage
Antígeno carcinoembrionario (CEA):
1116NS-3d, número de ATCC
CRL-8019, hibridoma de linfocitos B que produce
anticuerpos monoclonales contra CEA; T84.66A3.1A.1F2, número de
ATCC HB-8747, hibridoma de linfocitos B que produce
anticuerpos monoclonales contra CEA.
\vskip1.000000\baselineskip
P53:
Policlonal de conejo anti-p53
humana, disponible en el mercado de Serotec Ltd, Kidlington, Oxford
OX5 1JE, Reino Unido.
Monoclonal anti-p53, clon
BP53-12, disponible en el mercado de Sigma.
\vskip1.000000\baselineskip
CA19-9:
Monoclonal de ratón
anti-CA19-9 humana, clon tipo
1116-NS-19-9, IgG1,
disponible en el mercado de Serotec Ltd, Kidlington, Oxford OX5
1JE, Reino Unido.
\vskip1.000000\baselineskip
H-ras p21:
IgG policlonal de conejo, disponible en el
mercado de Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, California,
Estados Unidos.
\vskip1.000000\baselineskip
BRCA1:
IgG policlonal de conejo, disponible en el
mercado de Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, California,
Estados Unidos.
\vskip1.000000\baselineskip
BRCA2:
IgG policlonal de cabra, disponible en el
mercado de Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, California,
Estados Unidos.
\vskip1.000000\baselineskip
APC:
IgG policlonal de conejo, disponible en el
mercado de Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, California,
Estados Unidos.
\vskip1.000000\baselineskip
PSA:
IgG monoclonal de ratón, disponible en el
mercado de Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, California,
Estados Unidos.
Claims (13)
1. Un método de detección de autoanticuerpos
antitumorales asociados con cáncer, siendo el método un inmunoensayo
que comprende poner en contacto una muestra que se va a ensayar
para determinar la presencia de dichos autoanticuerpos con un
reactivo de inmunoensayo y detectar la presencia de complejos
formados por la unión específica del reactivo de inmunoensayo con
cualquier autoanticuerpo antitumoral asociado con cáncer presente en
la muestra, en el que el reactivo de inmunoensayo comprende una
proteína marcadora de tumores preparada a partir de un fluido
corporal seleccionado del grupo constituido por líquido ascítico,
derrame pleural, seroma, hidrocele y líquido de drenaje de heridas
de uno o más pacientes de cáncer, en el que dicha proteína marcadora
de tumores presenta una reactividad selectiva con autoanticuerpos
antitumorales asociados con cáncer.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
que comprende realizar un inmunoensayo para detectar y/o medir
cuantitativamente la presencia de dos o más tipos de
autoanticuerpos, cada uno inmunológicamente específico para
proteínas marcadoras de tumores diferentes o para dos o más epítopos
de la misma proteína marcadora de tumores, en el que el
inmunoensayo se lleva a cabo usando un panel de dos o más reactivos
de inmunoensayo, comprendiendo al menos uno de dichos reactivos una
proteína marcadora de tumores preparada a partir de un fluido
corporal seleccionado del grupo constituido por líquido ascítico,
derrame pleural, seroma, hidrocele y líquido de drenaje de heridas
de uno o más pacientes de cáncer.
3. Uso del método de la reivindicación 1 o de la
reivindicación 2 para la detección o el diagnóstico de cáncer en un
paciente, en el que la muestra que se va a ensayar usando el
inmunoensayo es una muestra de fluido corporal obtenida del
paciente y en el que la presencia de un nivel elevado de
autoanticuerpos en comparación con individuos de control normales
se toma como un indicio de que el individuo tiene o está
desarrollando cáncer.
4. Uso del método de la reivindicación 1 o de la
reivindicación 2 en el control de la evolución del cáncer o de otra
enfermedad neoplásica en un paciente, en el que la muestra que se va
a ensayar usando el inmunoensayo es una muestra de fluido corporal
obtenida del paciente y en el que la presencia de un nivel elevado
de autoanticuerpos en comparación con un control normal se toma
como un indicio de la presencia de cáncer en el paciente.
5. Uso del método de la reivindicación 1 o de la
reivindicación 2 en la detección de cambios neoplásicos tempranos o
carcinogénicos tempranos en un sujeto asintomático, en el que la
muestra que se va a ensayar usando el inmunoensayo es una muestra
de fluido corporal obtenida del sujeto y en el que la presencia de
un nivel elevado de autoanticuerpos en comparación con individuos
de control normales se toma como un indicio de un cambio neoplásico
temprano o carcinogénico temprano en el sujeto.
6. Uso del método de la reivindicación 1 o de la
reivindicación 2 en la exploración de una población de sujetos
humanos asintomáticos para identificar a los sujetos que presentan
un riesgo aumentado de desarrollar cáncer, en el que las muestras
que se van a ensayar usando el inmunoensayo son muestras de fluido
corporal obtenidas de los sujetos y en el que los sujetos que
tienen un nivel elevado de autoanticuerpos en comparación con
individuos de control normales se identifican como que están en
riesgo de desarrollar cáncer.
7. Uso del método de la reivindicación 1 o de la
reivindicación 2 en el control de la respuesta de un paciente de
cáncer a un tratamiento anticanceroso, en el que la muestra que se
va a ensayar usando el inmunoensayo es una muestra de fluido
corporal obtenida del paciente y en el que la presencia de un nivel
disminuido de autoanticuerpos después del tratamiento se toma como
un indicio de que el paciente ha respondido positivamente al
tratamiento.
8. Uso del método de la reivindicación 1 o de la
reivindicación 2 en la detección de una enfermedad recidivante en
un paciente previamente diagnosticado como que tiene cáncer,
habiéndose sometido el paciente a un tratamiento anticanceroso para
reducir la cantidad de cáncer presente, en el que la muestra que se
va a ensayar usando el inmunoensayo es una muestra de fluido
corporal obtenida del paciente y en el que la presencia de un nivel
aumentado de otros anticuerpos en el paciente en comparación con un
control normal se toma como un indicio de que la enfermedad ha
recidivado.
9. Uso del método de la reivindicación 2 en la
selección de una vacuna anticáncer para usar en un paciente en
particular, en el que el inmunoensayo se lleva a cabo usando un
panel de dos o más reactivos de inmunoensayo, correspondiéndose
cada uno con una proteína marcadora de tumores diferente, para
determinar la intensidad relativa de la respuesta inmune del
paciente a cada una de las proteínas marcadoras de tumores
diferentes, en el que la proteína o proteínas marcadoras de tumores
identificadas como productoras de la respuesta o respuestas inmunes
de mayor intensidad en el paciente se selecciona o seleccionan para
formar la base de una vacuna anticáncer para el uso en dicho
paciente.
10. Un método de determinación de si un
procedimiento de vacunación, que comprende exponer a un paciente a
una preparación inmunogénica, que comprende una proteína marcadora
de tumores o un fragmento antigénico de la misma, o a una secuencia
de ácido nucleico que exprese dicha proteína marcadora de tumores,
ha tenido éxito en la producción de anticuerpos asociados con
cáncer contra la proteína marcadora de tumores en el paciente,
siendo el método un inmunoensayo que comprende poner en contacto una
muestra de un fluido corporal del paciente con un reactivo
inmunoensayo y detectar la presencia de complejos formados por la
unión específica del reactivo de inmunoensayo con cualquier
anticuerpo asociado con cáncer presente la muestra, en el que el
reactivo de inmunoensayo comprende una muestra de dicha proteína
marcadora de tumores preparada a partir de un fluido corporal
seleccionado del grupo constituido por líquido ascítico, derrame
pleural, seroma, hidrocele y líquido de drenaje de heridas de uno o
más pacientes de cáncer, en el que dicha proteína marcadora de
tumores presenta una reactividad selectiva con anticuerpos
antitumorales asociados con cáncer.
11. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1, 2 ó 10 o el uso de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en el que la proteína
marcadora de tumores se selecciona de entre MUC1, MUC16 o
c-myc.
12. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1, 2 ó 10 o el uso de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en el que la proteína
marcadora de tumores se selecciona de entre
c-erbB2, p53, ras, BRCA1, BRCA2, APC, PSA, CEA y
CA19.9.
13. Uso de una proteína marcadora de tumores
preparada a partir de un fluido corporal seleccionado del grupo
constituido por líquido ascítico, derrame pleural, seroma, hidrocele
y líquido de drenaje de heridas de uno o más pacientes de cáncer en
la fabricación de un reactivo de inmunoensayo que presente una
reactividad selectiva con autoanticuerpos antitumorales asociados
con cáncer.
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