ES2292187T3 - Aislamiento, propagacion y diferenciacion dirigida de celulas madre del sistema nervioso central de mamiferos. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO IN VITRO MEDIANTE EL CUAL UNA POBLACION HOMOGENEA DE CELULAS PRECURSORAS PLURIPOTENCIALES PROCEDENTES DEL NEUROEPITELIO EMBRIONICO DE MAMIFEROS (CELULAS MADRE SNC), SE PUEDE MULTIPLICAR HASTA 10 SUP,9 VECES EN CULTIVO, MANTENIENDO SIMULTANEAMENTE SU CAPACIDAD DE DIFERENCIARSE EN NEURONAS, OLIGODENDROCITOS Y ASTROCITOS. SE PRESENTAN CONDICIONES QUIMICAMENTE DEFINIDAS, QUE PERMITEN DERIVAR UN GRAN NUMERO DE NEURONAS, HASTA EL 50 % DE LAS CELULAS MULTIPLICADAS, A PARTIR DE LAS CELULAS MADRE. ADEMAS, SE HAN IDENTIFICADO CUATRO FACTORES - PDGF, CNTF, LIF Y T3 - QUE GENERAN, INDIVIDUALMENTE, UNA PROPORCION SIGNIFICATIVAMENTE MAYOR DE NEURONAS, ASTROCITOS U OLIGODENDROCITOS. DICHOS PROCEDIMIENTOS DEFINIDOS PERMITEN UNA PREPARACION A GRAN ESCALA DE CELULAS MADRE DEL SNC, NEURONAS, ASTROCITOS Y OLIGODENDROCITOS, BAJO CONDICIONES DEFINIDAS QUIMICAMENTE, CON EFICIENCIA Y CONTROL. LA PRESENTE INVENCION PRESENTA ASIMISMO CULTIVOS IN VITRO DE NEURONAS MADURAS, DIFERENCIADAS EN ESTADO TERMINAL, ESPECIFICAS DE ZONA, DERIVADAS DE CULTIVOS DE CELULAS MADRE SNC PLURIPOTENCIALES, Y TAMBIEN UN PROCEDIMIENTO IN VITRO MEDIANTE EL CUAL SE PUEDEN PRODUCIR NEURONAS DIFERENCIADAS.
Description
Aislamiento, propagación y diferenciación
dirigida de células madre del sistema nervioso central de
mamíferos.
La presente invención se refiere a una
tecnología en la que se aíslan células madre procedentes de cerebro
embrionario y adulto, se propagan y se diferencian eficientemente
en cultivo para generar grandes números de células nerviosas. Esta
tecnología, por vez primera, permite generar grandes números de
muchos tipos diferentes de neuronas que se encuentran en un cerebro
normal y proporciona una nueva base para la terapia génica, la
terapia de células, un nuevo rastreo de factores de crecimiento y
un rastreo de fármacos para trastornos del sistema nervioso.
El cerebro está constituido por tipos de células
nerviosas muy diversos que realizan interconexiones específicas y
que, una vez destruidas, no regeneran a las células nerviosas
(neuronas). Además, el cerebro está protegido por una barrera de
sangre-cerebro (hematoencefálica) que bloquea
eficazmente el flujo de grandes moléculas al cerebro, haciendo
ineficaz la inyección periférica de potenciales fármacos para el
factor de crecimiento. Así, un reto principal al que se enfrenta
actualmente la industria biotecnológica consiste en encontrar un
mecanismo eficaz para suministrar potenciales productos de terapia
génica directamente al cerebro con el fin de tratar trastornos del
sistema nervioso.
Además, para una enfermedad degenerativa tal
como el Parkinson, el enfoque más amplio para recuperar una función
neuronal perdida puede ser reemplazar las células dañadas por
células sanas más que simplemente un producto génico sencillo. Así,
el éxito actual y futuro de la terapia génica y la terapia de
células depende del desarrollo de células adecuadas que (1) puedan
portar una copia sana de un gen enfermizo (es decir, un gen normal),
(2) puedan ser trasplantadas al cerebro y (3) puedan ser integradas
en la red neuronal del hospedante. Este desarrollo requiere de
manera ideal células de origen neuronal que (1) proliferen en
cultivo hasta formar un gran número, (2) sean susceptibles a
diversos métodos de transferencia de genes y (3) se integren y
comporten como las células de un cerebro normal. Sin embargo, no ha
habido este tipo de células para fines terapéuticos, ya que las
neuronas no se dividen y, por lo tanto, no se pueden propagar en
cultivo.
Como alternativas, diversas células
transformadas de orígenes neurales y no neurales tales como glias,
fibroblastos, e incluso células de la musculatura, que pueden
proliferar en cultivo, se han utilizado como posibles vehículos
para suministrar un gen de interés a las células del cerebro. Sin
embargo, no se espera y no se puede esperar que células de este
tipo proporcionen funciones neuronales. Otro enfoque alternativo ha
sido obligar a una célula neural de origen desconocido a dividirse
en cultivo modificando genéticamente alguna de sus propiedades, al
tiempo que conserve algo de su capacidad de convertirse y funcionar
como una neurona. A pesar de que algunas células
"inmortalizadas" pueden exhibir determinadas características de
una neurona, no está claro si estas células alteradas son
ciertamente una alternativa viable para fines clínicos.
Un cerebro fetal en desarrollo contiene la
totalidad de las células germinales para las células de un cerebro
adulto, así como todos los programas necesarios para orquestarlos
hacia la red final de neuronas. En las fases tempranas de
desarrollo, el sistema nervioso está poblado por células germinales,
de las que todas las otras células, principalmente neuronas,
astrocitos y oligodendrocitos, se derivan durante las subsiguientes
fases de desarrollo. Claramente, células germinales de este tipo,
que son precursores del desarrollo normal del cerebro serían
ideales para todas las terapias basadas en genes y basadas en
células, si estas células germinales pudieran aislarse, propagarse
y diferenciarse en tipos de células maduras.
La utilidad de las células primarias aisladas,
tanto para la investigación básica como para la aplicación
terapéutica depende del grado al que las células aisladas se
asemejen a las del cerebro. Se desconoce cuántos tipos diferentes
de células precursoras existen en el cerebro en desarrollo. Sin
embargo, pueden existir varios tipos de células distintos:
un precursor a neuronas únicamente
("progenitor neuronal comprometido" o "neuroblasto"),
un precursor a oligodendrocitos solamente
("oligodendroblasto"),
un precursor a astrocitos solamente
("astroblasto"),
un precursor bipotencial que puede convertirse
en neurona u oligodendrocito, neurona o astrocito y oligodendrocito
o astrocito, y
un precursor multipotencial que conserva la
capacidad de diferenciarse en uno cualquiera de los tres tipos de
células.
El análisis del mapeo de destino y estudios de
trasplante in vivo han demostrado que diferentes tipos
neuronales y células no neuronales se pueden derivar de las mismas
células precursoras^{1-5}. Análisis in
vitro han sugerido también que células multipotenciales están
presentes en el cerebro en desarrollo^{6,7}. Sin embargo, el
análisis del linaje solo no identifica directamente las células
multipotenciales; y tampoco define los mecanismos que pueden
impulsarlas a diferentes destinos. Células precursoras procedentes
del sistema nervioso central (SNC) se han expandido in vitro
y se ha observado^{8-12} una diferenciación en
neuronas y glia y, según se detalla más abajo, se han obtenido
tipos de células acusadamente diferentes, incluso cuando las
condiciones del cultivo utilizadas eran aparentemente las
mismas.
mismas.
Debido a la actual falta de comprensión de la
histogénesis durante el desarrollo del cerebro, muchos
investigadores han utilizado diversos términos sueltos para
describir las células que han estudiado, por ejemplo progenitor
neuronal, precursor neural, precursor neuroepitelial, célula madre
multipotencial, etc. Así, la naturaleza de las células descrita
hasta la fecha en la bibliografía y las condiciones de cultivo para
obtenerlas únicamente se puede comparar una con otra por su
capacidad de diferenciación reseñada. El objeto completo del
aislamiento, caracterización y uso de células madre procedentes del
SNC ha sido recientemente revisado^{33, \ 34, \ 38}.
En resumen, hasta la fecha no se han encontrado
condiciones, a pesar de muchos informes, de identificar, propagar y
diferenciar con éxito células madre multipotenciales. Una
recopilación útil de estudios que informan del cultivo de células
precursoras del SNC se encuentra en la Tabla 3, pág. 172 de una
revisión reciente^{34} y que se ofrece adicionalmente en lo que
sigue.
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Vicario-Abejon, C., Johe, K.,
Hazel, T., Collazo, D. y McKay, R., Functions of basic fibroblast
growth factor and neurotrophins in the differentiation of
hippocampal neurons, Neuron 15,
105-114 (1995)^{12}.
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Células expandidas por
Vicario-Abejon et al. son significativamente
diferentes de las descritas en la presente invención, a pesar de
que el tejido de partida (hipocampo embrionario), el mitógeno
(factor de crecimiento fibroblastico básico, bFGF - siglas en
inglés), y el medio basal(N2) son similares en ambos
informes. Casi todas las células expandidas por
Vicario-Abejon et al. fracasaron en
diferenciarse en cualesquiera tipos de células, y murieron en
ausencia de bFGF (tal como se establece en el documento, pág. 106).
Esto también se refleja en la Fig. 3 del documento en el que el
número de neuronas MAP2 positivas es excesivamente bajo
(50-100 células de un número inicial de células de
aproximadamente 80.000 por pocillo; es decir, bastante menos del 1%
en todas las condiciones reseñadas). Así, diferencias en las
condiciones del cultivo, sutiles como pueden ser, pueden
proporcionar células con propiedades significativamente diferentes,
y esto, de hecho, es consistente con la observación principal de la
presente invención de que el entorno extracelular puede desplazar
las propiedades de desarrollo de las células madre del SNC.
Vicario-Abejon et al.
utilizaron las siguientes condiciones de cultivo que difieren de las
descritas en la presente invención:
1. Utilizaron una disociación enzimática,
tripsina al 0,1-0,25% + DNAasa I al 0,4% para la
disociación inicial del tejido, así como para el subsiguiente pase.
La presente invención, la disociación enzimática provoca
efectivamente la proteolisis de receptores de FGF y determina que
las células no respondan a bFGF y conduce a la diferenciación.
2. Utilizaron suero de bovino fetal al 10% para
detener la actividad de tripsina y para cebar a las células desde 4
horas hasta durante una noche antes de cambiar a un medio exento de
suero. En la presente invención, el suero, incluso a una
concentración menor que 1%, desplaza las células madre a un destino
astrocítico.
3. Las células se sembraron a una mucho mayor
densidad de 45.000 células por cm^{2} y luego se hicieron crecer
hasta confluencia antes del pase por tripsina y suero. En la
presente invención, una alta densidad de células inhibe la
proliferación y provoca una diferenciación espontánea, incluso en
presencia de bFGF.
4. bFGF fue administrado sólo intermitentemente
cada 2-3 días, y a 5 ng/ml, menor que la
concentración óptima descrita en la presente invención. Esta
condición conduce a una diferenciación parcial de las células y una
subsiguiente heterogeneidad de los tipos de células en el
cultivo.
5. El medio basal, consistente en componentes
"N2", consistía en 5 ng/ml de insulina, menor que la
concentración óptima descrita en la presente invención.
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Este estudio utilizó condiciones de cultivo que
son muy similares a las descritas por Vicario-Abejon
et al. -bFGF como el mitógeno primario, medio exento de
suero e hipocampo E16 (edad embrionaria 16 días). Sin embargo,
informa del aislamiento y la expansión de una población precursora
(neuroblastos) bastante diferentes de las células de
Vicario-Abejon et al. (no definido), así como
las células madre multipotenciales descritas en la presente
invención. Las células reseñadas tenían las siguientes propiedades
que contrastaban acusadamente con las de células madre del SNC:
1. Las células expandidas bajo la condición
reseñada son neuronas mitóticas con expresiones antigénicas de
neurofilamento, nestina, enolasa específica para neuronas,
galactocerebrósido y MAP2 (Tabla I, pág. 3604). Las células madre
del SNC en expansión reseñadas en la presente invención expresan
nestina solamente, son negativas para los an-
tígenos anteriores y, por lo tanto, son una población de células molecularmente distintas de las descritas por Ray et al.
tígenos anteriores y, por lo tanto, son una población de células molecularmente distintas de las descritas por Ray et al.
2. El análisis ultraestructural de las células
expandidas en cultivo "demostró su morfología neuronal
histotípica". Las células madre del SNC en expansión exhibían
una morfología no neuronal, completamente diferente.
3. Las "neuronas" mitóticas tenían un
tiempo de duplicación de 4 días y podían ser pasadas y desarrolladas
en forma de líneas de células continuas. Las células madre del SNC
se duplican cada 20-24 horas y exhiben una
regresión característica de la capacidad mitótica y de
diferenciación a lo largo del tiempo, de modo que no pueden
mantenerse indefinidamente como líneas de células estables.
4. El sistema de cultivo desarrollado por Ray
et al. genera "cultivos de células neuronales casi
puros". El sistema de cultivo en la presente invención genera
células madre multipotenciales que pueden diferenciarse en los tres
tipos de células principales del cerebro, es decir neuronas,
oligodendrocitos y astrocitos.
Ray et al. utilizaron las siguientes
condiciones de cultivo que difieren de los de la presente
invención.
1. Los hipocampos embrionarios se trituraron
mecánicamente sin el uso de una enzima; sin embargo, las células se
extendieron en placas a aproximadamente 100.000 células por
cm^{2}, óptimo para la supervivencia neuronal, pero una densidad
de células casi 10 veces mayor que la óptima para la expansión de
células madre del SNC.
2. bFGF fue administrado a razón de 20 ng/ml,
intermitentemente, cada 3-4 días.
3. El medio "N2" basal contenía 5 \mug/ml
de insulina, menor que el óptimo. El cambio de medio también se
prolongó cada 3-4 días.
4. Las células se hicieron pasar utilizando
tripsina.
En definitiva, incluso diferencias aparentemente
pequeñas en las condiciones del cultivo pueden dar como resultado
un aislamiento de tipos de células muy diferentes.
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Ray y Gage informan del aislamiento y la
propagación de células "que ya han sido comprometidas a una vía
neuronal son y expresan fenotipos neuronales (neuroblastos)"
procedentes de la médula espinal utilizando bFGF. De nuevo, a pesar
de que el mitógeno primario es bFGF, sus condiciones de cultivo son
diferentes y obtenían células acusadamente diferentes de las
células madre del SNC.
1. Se utilizó médula espinal
E14-E16, una fase mucho más tardía de desarrollo que
la óptima para las células madre.
2. El tejido se disoció enzimáticamente mediante
papaína y DNasa.
3. La extensión inicial en placas se realizó en
suero de bovino fetal al 10%.
4. Hubo un enriquecimiento preliminar de una
población de células no adherentes.
5. Hubo un cambio de medio intermitente y un
suplemento de bFGF cada 3-4 días.
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Gage et al. informaron del aislamiento,
la propagación y el trasplante de células procedentes del
hipocampo adulto. Estas mezclas de células se mantuvieron en
cultivo durante un año a través de múltiples pases. El 80% de ellas
exhibían propiedades más bien inusuales tal como la
co-expresión de antígenos gliales y neuronales, al
tiempo que seguían siendo mitóticas. Estas propiedades no son
exhibidas por las células madre aisladas de la zona subventricular
estriada adulta.
De nuevo, utilizando bFGF como un mitógeno
primario, los autores derivaron células acusadamente diferentes de
las células madre del SNC reseñadas en la presente invención.
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Estos autores informan del aislamiento y la
propagación de células madre multipotenciales procedentes de la
zona subventricular del cerebro adulto utilizando bFGF. Una
diferencia significativa en las condiciones de cultivo utilizadas
por Gritti et al. es que las células se propagan en forma
de esferas agregadas sin la fijación a la superficie de la
placa. Las condiciones de cultivo desarrolladas por Gritti et
al. requieren esta agregación de células para formar esferas,
utilizando bFGF o factor de crecimiento epidérmico (EGF- siglas en
inglés) como una etapa esencial para la propagación de células
multipotenciales. Esta etapa de agregación sola distingue
esencialmente al sistema de cultivo reseñado del de la presente
invención. La agregación fomenta interacciones
célula-célula indefinidas y da como resultado
desplazamientos incontrolables de diferenciación/destino y, en su
conjunto, una mucho menor expansión y diferenciación. Además, este
sistema de cultivo y el resultado obtenido por Gritti et al.
se limitan al cerebro adulto en donde se obtuvo un número
extremadamente pequeño de células (10^{5} células por cerebro) y
no han sido extendidas a diversas regiones del cerebro
embrionario.
El proceso en la presente invención permite la
propagación de células madre por todo el SNC en desarrollo así como
el cuerpo estriado del cerebro adulto. También utiliza un cultivo
adherente y evita activamente el contacto
célula-célula y una alta densidad de células. Como
resultado, permite una expansión mucho más eficaz de las células en
un estado multipotencial no diferenciado y un control mucho más
preciso y eficaz sobre la diferenciación de las células
expandidas.
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Estos tres estudios describen los cultivos en
esfera originales de células precursoras neurales procedentes
de cerebro adulto y embrionario utilizando EGF (factor de
crecimiento epidérmico). Las células expandidas se diferencian en
neuronas y astrocitos, pero no en oligodendrocitos y, así, se piensa
que son una población bipotencial más que multipotencial. Otra
propiedad diferenciadora de las células es que responden solamente
a EGF y no a bFGF en particular, mientras que las células madre del
SNC responden de modo similar tanto a EGF como bFGF. De nuevo, las
condiciones del cultivo en esfera no son equiparables con las
empleadas en la presente invención, ya que requieren una agregación
de células en las que se espera que se produzcan muchas
interacciones adicionales no defi-
nidas.
nidas.
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Este documento informa de los efectos del factor
de crecimiento derivado del cerebro (BDNF- siglas en inglés) sobre
cultivos en esfera de células precursoras neurales embrionarias
propagadas con EGF. No existe ningún refuerzo adicional del sistema
de cultivo per se.
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Este estudio utiliza el cultivo en esfera con
EGF según se describe antes para someter a ensayo un suplemento del
medio comercialmente disponible, denominado "B27". El estudio
informa simplemente que el uso de B27 refuerza la supervivencia de
células (no la supervivencia neuronal) en un cultivo mixto
que contiene neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.
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Los autores informan de la existencia de células
precursoras multipotenciales en el telencéfalo de ratón E10 al
cultivar células sencillas procedentes del cerebro en bFGF más
suero. Los resultados se basaron en 700 células expandidas
clonalmente durante 10 días, algunas de las cuales, cuando se
diferencian en presencia de medio acondicionado con bFGF, suero y
astrocitos, podían dar lugar a neuronas. No había una expansión en
masa de las células.
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Los autores utilizan el sistema de cultivo
clonal reseñado en la referencia^{43} antes descrita para someter
a ensayo la eficacia mitogénica de bFGF y EGF sobre las células
corticales procedentes de embriones E10 y E17. De nuevo, la
condición de cultivo se aplica estrictamente a microcultivo en medio
con contenido en suero para demostrar la existencia de diferentes
células precursoras en el cerebro en desarrollo. No existe ninguna
expansión en masa, cultivo a largo plazo ni protocolo de
diferenciación sistémico.
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Este es un documento de revisión breve que
resume diversos estudios dirigidos para aislar células precursoras
y sus derivados en cultivo. Está de alguna manera anticuado y la
mayoría de los estudios originales relevantes citados han sido
comentados anteriormente.
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\vskip1.000000\baselineskip
Este es también un documento de revisión breve
que resume mayoritariamente trabajos previos procedentes del
laboratorio de los autores en relación con sus estudios de
microcultivo en los que potenciales de diferenciación de
determinados clones de precursores se someten a ensayo en presencia
de medio acondicionado con FGF de carácter ácido (aFGF), bFGF,
suero y/o astrictos.
Además, Sabate et al.^{32} informaron
del cultivo de un progenitor neural humano con una capacidad de
diferenciación indefinida. Davis y Temple^{6} demostraron la
existencia de células madre multipotenciales en la corteza mediante
el co-cultivo con células epiteliales durante un
breve plazo (menos de 100 células en su totalidad).
Sin embargo, la diferenciación de las células no
podía controlarse en ninguno de los informes reseñados que excluían
el análisis de sus relaciones de linaje y los mecanismos que
regulaban la elección del destino.
La presente invención proporciona un método para
propagar eficazmente las células germinales no diferenciadas, es
decir las células madre del sistema nervioso central (SNC), en
cultivo y define condiciones para convertir eficazmente las células
no diferenciadas en tipos de células maduras. Estas células no
diferenciadas o "células madre del SNC" exhiben la capacidad
multipotencial para diferenciarse en los tres tipos de células
principales de un cerebro maduro - neuronas, astrocitos y
oligodendrocitos. Además de ello, las mismas condiciones de cultivo
permiten el aislamiento, la expansión y diferenciación de células
multipotenciales equivalentes procedentes del cerebro adulto.
Desde la descripción inicial, han aparecido
informes adicionales. La investigación más reciente y el uso de
células madre del SNC y progenitores neurales han sido
revisados^{47-52} adicionalmente. Además, Reynolds
y Weiss^{53} informaron que progenitores estriados embrionarios,
generados en forma de esferas que utilizaban EGF, eran capaces de
diferenciarse en los tres tipos de células que incluían
oligodendrocitos, astrocitos y neuronas. La frecuencia de las
células que responden a EGF quedaba limitada a solamente el 1% del
cultivo primario inicial. La subclonación para establecer una
autorrenovación era cuestionable, ya que se utilizaron hasta 500
células/pocillo para generar los "clones" secundarios. La
diferenciación de las células se indujo incorporando suero al 1% en
el medio. Sin embargo, a partir de los clones derivados de células
sencillas no se presentaron datos que demostraran los tres tipos de
células.
Weiss et al.^{54} informaron que las
células madre del SNC multipotenciales podrían aislarse a partir de
la médula espinal adulta y de los tercero y cuarto ventrículos
utilizando una combinación de EGF y bFGF, pero no con uno
cualquiera solo.
Svendsen et al.^{55} informaron que
células precursoras neurales aisladas del cuerpo estriado del
mesencéfalo de embriones de ratas de 16 días de edad (E16), cuando
se injertaban en cerebros de rata adultos lesionados, no eran
capaces de diferenciarse en neuronas. También informaron que las
células del mesencéfalo generadas por EGF, pero no las células
estriadas se diferenciaban en neuronas
tirosina-hidroxilasa (TH)-positivas,
si bien en un número muy bajo (0,002%). No existía ninguna
caracterización de células in vitro para asegurar que el
cultivo primario utilizado no contuviera neuronas
post-mitóticas trasladadas desde el tejido,
especialmente dado el hecho de que el resultado sólo se podía
obtener con tejido E16, cuando la mayoría de las células TH ya
habían nacido.
Schinstine e Iacovitti^{56} informaron que
algunos de los astrocitos derivados de células precursoras neurales
generadas por EGF expresaban antígenos neuronales tales como tau y
MAP2. Qian et al.^{57} informaron que diferentes
concentraciones de bFGF hacían proliferar células similares a las
madre de corteza de ratón E10 con potenciales de diferenciación
variables que oscilaban desde sólo neuronales a
multipotenciales.
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Palmer et al.^{65} informaron que
células madre del SNC multipotenciales podían aislarse del hipocampo
de rata adulta. El 84% de las células que expandían, sin embargo,
co-expresaban MAP2c y O4, marcadores neuronales y
oligodendrogliales inmaduros. Únicamente el 0,2% eran MAP2ab
positivas y menos del 0,01% eran positivas para otros marcadores
neuronales tales como tau y neurofilamento 200. Propiedades de este
tipo son bastante diferentes de las propiedades descritas en los
Ejemplos en la presente solicitud.
Finley et al.^{66} informaron que la
línea de células de carcinoma embrionario de ratón, P19, puede
formar una polaridad neuronal y puede ser electrofisiológicamente
activa cuando es inducida por ácido retinoico y suero. Strubing
et al.^{67} informaron que las células madre embrionarias
desarrolladas en medio que contenía suero podían diferenciarse en
neuronas electrofisiológicamente activas in vitro. Okabe
et al.^{68} también informaron de la diferenciación de
algunas de las células madre embrionarias en neuronas in
vitro.
Gritti et al.^{46} informaron que
células madre multipotenciales podían aislarse a partir del
subepéndimo de ratón adulto por parte de EGF y bFGF que, cuando se
diferenciaban, podían ser electrofisiológicamente activas y
expresar inmunorreactividades a GABA, glutamato y ChAT, pero no
otras. Sin embargo, la frecuencia de este tipo de neuronas no se
documentó y, así, es difícil determinar lo eficaz que era la
maduración neuronal. Además de ello, estos fenotipos neuronales,
derivados de células madre en división, no fueron directamente
demostrados mediante marcaje con BrdU. Esto es particularmente
relevante, ya que los cultivos agregados son extremadamente
propensos a ser contaminados por parte de neuronas primarias
procedentes del tejido, que los traslada durante varios pases. De
hecho, Weiss et al.^{49} establecieron que solamente
células GABA-positivas podían obtenerse a partir de
sus cultivos. La mayoría de las células
GABA-positivas pueden ser oligodendrocitos.
Feldman et al.^{69} reseñaron estudios
electrofisiológicos de precursores neurales de rata generados por
EGF. Encontraron que la mayoría, si no todas las células
electrofisiológicamente activas son de hecho no neuronales, y que
las células gliales contienen canales de Na sensibles a la tensión
que evocan conductancias similares a potenciales de acción.
Resultados como estos ilustran que la
identificación de células madre del SNC, que definen condiciones que
definen establemente las propiedades de las células madre del SNC
durante largo plazo y que controlan su diferenciación en tipos de
células maduras, no son ni obvios ni predecibles para los expertos
en esta técnica.
La presente invención describe un cultivo in
vitro de células madre del sistema nervioso central de un
mamífero, un método para el cultivo in vitro de las células
madre y un método para la diferenciación de las células madre.
En el cultivo in vitro de las células
madre del sistema nervioso central de un mamífero, las células madre
conservan la capacidad multipotencial de diferenciarse en neuronas,
astrocitos y oligodendrocitos. Las células madre se pueden derivar
de tejido del sistema nervioso central de un ser humano, feto o
adulto. Además de ello, el tejido del sistema nervioso central
puede ser hipocampo, corteza cerebral, cuerpo estriado, septum,
diencéfalo, mesencéfalo, cerebelo o médula espinal.
Además de ello, las células madre se pueden
diferenciar en neuronas maduras que exhiben una polaridad
axon-dendrita, terminales sinápticos y la
localización de proteínas implicadas en la sinaptogénesis y la
actividad sináptica, que incluyen receptores neurotransmisores,
transportadores y enzimas de procesamiento. Además, las células
madre conservan su capacidad de generar subtipos de neuronas con
diferencias moleculares entre los subtipos.
En un método para el cultivo in vitro de
las células madre, en el que las células madre conservan la
capacidad multipotencial de diferenciarse en neuronas, astrocitos y
oligodendrocitos, en el que las células procedentes del sistema
nervioso central:
a) se disocian mediante trituración
mecánica;
b) se extienden en placas a la densidad inicial
óptima de 1 x 10^{6} células (procedentes del hipocampo y septum)
o de 1,5 x 10^{6} células (procedentes de otras regiones del SNC)
por cada 10 cm de placa revestida con poli-ornitina
y fibronectina;
c) se cultivan en la ausencia completa de
suero;
d) son diariamente suministradas con un factor
de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en
- i)
- un factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) a una concentración de al menos 10 ng/ml,
- ii)
- EGF a una concentración de al menos 10 ng/ml,
- iii)
- TGF-alfa a una concentración de al menos 10 mg/ml, y
- iv)
- FGF de carácter ácido (aFGF) a una concentración de al menos 10 ng/ml más 1 \mug/ml de heparina;
e) se reemplaza por medio reciente el 100% del
medio de cultivo cada dos días;
f) se hace pasar cada 4 días después de la
extensión en placa mediante tratamiento de las células cultivadas
con solución salina y raspado de las células de la placa; y
g) se vuelven a extender en placas las células
pasadas a razón de 0,5 x 10^{6} células por cada 10 cm de placa
prerrevestida con poli-ornitina y fibronectina.
El método es aplicable a células madre derivadas
del tejido del sistema nervioso central procedente de un ser
humano, feto o adulto. De nuevo, el tejido del sistema nervioso
central puede ser el hipocampo, la corteza cerebral, el cuerpo
estriado, septum, diencéfalo, mesencéfalo, cerebelo o médula
espinal.
El método de la invención para la expansión y el
cultivo in vitro de células madre del sistema nervioso
central de un mamífero, en el que las células madre conservan la
capacidad multipotencial de diferenciarse en neuronas, astrocitos y
oligodendrocitos, comprende las etapas de
a) disociar células procedentes del tejido del
sistema nervioso central mediante trituración mecánica en ausencia
de cationes divalentes;
b) cultivar las células disociadas adheridas a
una placa en un medio de cultivo exento de suero y químicamente
definido;
c) extender en placas células disociadas a una
densidad que no exceda de 20.000 células/cm^{2} y, en pases
subsiguientes, volver a extender en placas las células cultivadas a
una densidad que no exceda de 10.000 células/cm^{2}:
d) añadir diariamente a las células de cultivo
un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en
- i)
- bFGF a una concentración de al menos 10 ng/ml,
- ii)
- EGF a una concentración de al menos 10 ng/ml,
- iii)
- TGF-alfa a una concentración de al menos 10 mg/ml, y
- iv)
- aFGF a una concentración de al menos 10 ng/ml más 1 \mug/ml de heparina;
e) reemplazar por medio reciente el medio de
cultivo cada dos días;
f) hacer pasar las células cultivadas en el
espacio de cuatro días después de la extensión en placa de modo que
no excedan de una confluencia del 50%; y
g) hacer pasar las células cultivadas mediante
tratamiento de las células cultivadas con solución salina exenta de
cationes divalentes y raspar las células de la placa.
La solicitud describe también un método para la
diferenciación de un cultivo in vitro de células madre del
sistema nervioso central de un mamífero, en el que las células madre
conservan la capacidad multipotencial de diferenciarse en neuronas,
astrocitos y oligodendrocitos, en donde las células procedentes del
sistema nervioso central
a) se disocian mediante trituración
mecánica;
b) se extienden en placas a la densidad inicial
óptima de 1 x 10^{6} células (procedentes del hipocampo y septum)
o de 1,5 x 10^{6} células (procedentes de otras regiones del SNC)
por cada 10 cm de placa pre-revestida con
poli-ornitina y fibronectina;
c) se cultivan en la ausencia completa de
suero;
d) son diariamente suministradas con un factor
de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en
- i)
- un factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) a una concentración de al menos 10 ng/ml,
- ii)
- EGF a una concentración de al menos 10 ng/ml,
- iii)
- TGF-alfa a una concentración de al menos 10 mg/ml, y
- iv)
- FGF de carácter ácido (aFGF) a una concentración de al menos 10 ng/ml más 1 \mug/ml de heparina;
e) se reemplaza por medio reciente el 100% del
medio de cultivo cada dos días;
f) se hace pasar cada 4 días después de la
extensión en placa mediante tratamiento de las células cultivadas
con solución salina y raspado de las células de la placa;
g) se vuelven a extender en placa las células
pasadas a 0,5 x 10^{6} células por cada 10 cm de placa
prerrevestida con poli-ornitina y fibronectina;
y
h) se retira el factor de crecimiento aclarando
las células con solución salina o tratándolas con tripsina y,
subsiguientemente, con un inhibidor de tripsina y luego se continúa
cultivando las células en el medio exento de suero sin el factor de
crecimiento.
Además, la diferenciación se puede dirigir
específicamente añadiendo un segundo factor de crecimiento a las
células cultivadas, ya sea antes o después de retirar el primer
factor de crecimiento de las células cultivadas. El segundo o
añadido factor de crecimiento puede ser factor de crecimiento
derivado de plaquetas (PDGF - siglas en inglés), factor
neurotrópico ciliar (CNTF - siglas en inglés), factor inhibidor de
leucemia (LIF - siglas en inglés) u hormona tiroides, yodotironina
(T3).
El método de la invención para la diferenciación
de un cultivo in vitro de células madre del sistema nervioso
central de un mamífero, en el que las células madre conservan la
capacidad multipotencial de diferenciarse en neuronas, astrocitos y
oligodendrocitos, comprende las etapas de:
a) disociar células procedentes de tejido del
sistema nervioso central mediante trituración mecánica en ausencia
de cationes divalentes;
b) cultivar las células disociadas adheridas a
una placa en un medio de cultivo exento de suero y químicamente
definido;
c) extender en placas células disociadas a una
densidad que no exceda de 20.000 células/cm^{2} y, en pases
subsiguientes, volver a extender en placas las células cultivadas a
una densidad que no exceda de 10.000 células/cm^{2}:
d) añadir diariamente a las células cultivadas
un primer factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste
en
- i)
- bFGF a una concentración de al menos 10 ng/ml,
- ii)
- EGF a una concentración de al menos 10 ng/ml,
- iii)
- TGF-alfa a una concentración de al menos 10 mg/ml, y
- iv)
- aFGF a una concentración de al menos 10 ng/ml más 1 \mug/ml de heparina;
e) reemplazar por medio reciente el medio de
cultivo cada dos días;
f) hacer pasar las células cultivadas en el
espacio de cuatro días después de la extensión en placa de modo que
no exceda de una confluencia del 50%; y
g) hacer pasar las células cultivadas mediante
tratamiento de las células cultivadas con solución salina exenta de
cationes divalentes y raspar las células de la placa; y
h) separar el primer factor de crecimiento de
las células cultivadas, en donde dicha separación da como resultado
la diferenciación de las células cultivadas en neuronas, astrocitos
y/u oligodendrocitos.
La presente solicitud describe también un
cultivo in vitro de neuronas maduras específicas para la
región y terminalmente diferenciadas, derivadas de cultivos de
células madres del SNC multipotenciales de mamífero y un método de
cultivo in vitro para la generación de las neuronas
diferenciadas.
En el método para la generación in vitro
de neuronas maduras específicas para la región y terminalmente
diferenciadas, procedentes de cultivos de células madre del SNC
multipotenciales de mamífero, las células madre del SNC
multipotenciales procedentes de una región específica se cultivan en
un medio de cultivo exento de suero y químicamente definido que
contiene un factor de crecimiento; el medio es reemplazado por medio
exento de factor de crecimiento; las células madre se recolectan
mediante tripsinización; se extienden en placas a una densidad de
entre 100.000 y 250.000 células por centímetro cuadrado; y se
cultivan en un medio de cultivo exento de suero, exento de ácido
glutámico y químicamente definido. La región específica del SNC de
la que se derivan las células madre multipotenciales se selecciona
del grupo que consiste en corteza, tubérculo olfatorio, retina,
septum, eminencia gangliónica lateral, eminencia gangliónica media,
amígdala, hipocampo, tálamo, hipotálamo, mesencéfalo ventral y
dorsal, tronco cerebral, cerebelo y médula espinal.
Además, el medio de cultivo exento de suero y
químicamente definido se puede seleccionar de N2 (DMEM/F12,
glucosa, glutamina, bicarbonato de sodio, 25 \mug/ml de insulina,
100 \mug/ml de apotransferrina humana, 25 nM de progesterona, 100
\muM de putrescina, 30 nM de selenito de sodio, pH 7,2^{8}) o
medio modificado con N2. El factor de crecimiento se puede
seleccionar del grupo que consiste en bFGF, EGF,
TGF-alfa y aFGF.
Además, el medio de cultivo exento de suero,
exento de ácido glutámico y químicamente definido se puede
suplementar con entre 10-100 ng/ml de factor
neurotrópico derivado del cerebro. El método es aplicable a células
madre del SNC multipotenciales derivadas del tejido del sistema
nervioso central procedente de cualquier mamífero, incluida la rata
y el ser humano.
La presente solicitud también describe cultivos
in vitro de neuronas maduras específicas para la región y
terminalmente diferenciadas, derivadas de cultivos de células madre
del SNC multipotenciales de mamíferos procedentes de una región
específica del SNC. La región específica de la que se derivan las
células madre multipotenciales se selecciona del grupo consistente
en corteza, tubérculo olfatorio, retina, septum, eminencia
gangliónica lateral, eminencia gangliónica media, amígdala,
hipocampo, tálamo, hipotálamo, mesencéfalo ventral y dorsal, tronco
cerebral, cerebelo y médula espinal. De igual manera, el cultivo
in vitro de neuronas diferenciadas específicas para la
región se puede derivar de cualquier célula madre del SNC
multipotencial de mamífero, incluida la rata y el ser humano.
La figura 1A muestra la diferenciación
controlada de células madre del SNC a alta densidad. Células
precursoras, nestina-positivas, de rápida división
fueron marcadas con BrdU durante las últimas 24 horas de la
proliferación. Después, se inició la diferenciación mediante
retirada de bFGF (día 0) y se continuó durante hasta 6 días. A los
tiempos indicados las células se fijaron y tiñeron para BrdU y
antígenos neuronales. Se muestran las relaciones de células
doblemente teñidas para BrdU y cada antígeno neuronal con respecto a
las células BrdU positivas totales (BrdU+). Hasta el 50% de células
BrdU+ expresaba antígenos neuronales y su expresión era dependiente
del tiempo. MAP2 positivo (MAP2+), círculo en negro; TuJ1 positivo
(TuJ1+), rombo gris; neurofilamento L positivo (neurofilamento L+),
cuadrado en blanco; neurofilamento M positivo (neurofilamento M+),
triángulo en negro.
La figura 1B muestra las proporciones de
neuronas MAP2+ (\bullet), oligodendrocitos GalC+ (+) y astrocitos
GFAP+ (o) en clones diferenciados. Clones de diversos tamaños que
oscilaban entre 39 células y 2800 células se diferenciaron durante
6 días y se analizaron para dos tipos de células por cada clon
mediante inmunohistoquímica doble. En la Tabla I se da una lista
parcial y la inmunotinción se muestra en la fig. 3. El número de
neuronas aumentaba con el tamaño creciente del clon, constituyendo
el 50% del clon.
La figura 1C muestra una comparación de las
eficacias mitogénicas de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y
factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF). Células (densidad
inicial de 1 x 10^{4} por placa) sutilmente disociadas del
hipocampo (HI) E16, corteza (CTX) E14 y cuerpo estriado (ST), y capa
subependimal de adulto (Adulto) se expandieron con EGF (20 ng/ml) o
bFGF (10 ng/ml). Colonias que surgían después de 10 días de
expansión se tiñeron para nestina, una proteína filamentosa
intermedia característica de células precursoras del SNC^{13,14}.
Se muestra el número relativo de colonias promediado de al menos 2
experimentos para cada región (bFGF = 1). Estaban presentes
colonias veinticinco veces más nestina+ por placa cuando las células
embrionarias se desarrollaban en bFGF (recuadro con puntos) que en
EGF (recuadro con barras). A altas densidades (1 x 10^{6} y 2,5 x
10^{6}), la condición de bFGF dio células BrdU+/nestina+ 10 veces
mayores que EGF. Los dos factores de crecimiento eran igualmente
mitogénicos para las células adultas. Cuando se diferenciaban
clones expandidos en EGF y bFGF, neuronas y oligodendrocitos se
encontraron en cantidades similares; sin embargo, los clones
expandidos en EGF dieron lugar a un número significativamente mayor
de astrocitos GFAP+.
Las figuras 2A-D muestran un
clon típico de células madre del SNC. Las células se marcaron
mediante un círculo en la placa en el espacio de 24 horas de la
extensión en placa antes de la primera mitosis y luego se
expandieron durante hasta 10 días (fig. 2A). En la figura 2B se
muestra una vista más ampliada de otro clon antes de la
diferenciación, inmunoteñido con anticuerpo
anti-nestina. Obsérvese la morfología radial
homogénea de las células nestina-positivas,
consistente con la morfología nestina-positiva en el
neuroepitelio in vivo. La figura 2C muestra un clon hermano
a un pequeño aumento, que ha sido diferenciado durante 6 días e
inmunoteñido con un anticuerpo específico para neuronas, TuJ1.
Obsérvese la presencia diseminada y no localizada de neuronas
TuJ1-positivas por todo el clon. En la figura 2D se
muestra una vista más ampliada de las mismas células. Las células
TuJ1-positivas asumen una morfología neuronal
típica. Son evidentes morfologías heterogéneas en las células
TuJ1-negativas no neuronales.
Las figuras 3A-J muestran
ejemplos de clones representativos de células del hipocampo
embrionarias (3A, 3C, 3E, 3G, 3I) y células subependimales adultas
(3B, 3D, 3F, 3H, 3J) doblemente teñidas con combinaciones de
anticuerpos para revelar diferentes tipos de células dentro de
clones individuales; anti-MAP2, neuronal;
anti-GalC, oligodendrítico;
anti-GFAP, astrocítico. Las dos inmunorreacciones se
desarrollaron secuencialmente y se distinguieron utilizando dos
cromógenos distintos a través de la reacción con fosfatasa alcalina
(azul, indicada por flechas) frente a la reacción de peroxidasa de
rábano picante (rojo, indicadas por cabezas de flecha).
Las células en las figuras 3A y 3B se tiñeron
doblemente con anti-MAP2 (neuronal, flechas) y
anti-GFAP (astrocítico, cabezas de flecha) y
muestran que los clones expandidos con bFGF derivados de cerebro
embrionario o adulto se diferencian tanto en neuronas como en
astrocitos. (Los oligodendrocitos están sin teñir en esta
tinción).
Las células en las figuras 3C y 3D se tiñeron
doblemente con anti-GalC (oligodendrocítico,
flechas) y anti-GFAP (astrocítico, cabezas de
flecha) y muestran que clones expandidos con bFGF derivados de
cerebro embrionario o adulto se diferencian tanto en
oligodendrocitos como en astrocitos. (Las neuronas están sin teñir
en esta tinción).
Las figuras 3E y 3F muestran clones
diferenciados en presencia de factor de crecimiento derivado de
plaquetas (PDGF). Las células se tiñeron doblemente con
anti-MAP2 (neuronal, flechas) y
anti-GFAP (astrocítico). La mayoría de las células
eran MAP2+ y solamente unas pocas eran GFAP+.
Las figuras 3G y 3H muestran clones
diferenciados en presencia de factor neurotrófico ciliar (CNTF). Las
células se tiñeron doblemente con anti-MAP2
(neuronal) y anti-GFAP (astrocítico, cabezas de
flecha). Todas las células eran intensamente GFAP+.
Las figuras 3I y 3J muestran clones
diferenciados en presencia de la hormona tiroides, triyodotironina
(T3). Las células se tiñeron doblemente con
anti-GalC (oligodendrocítico, flechas) y
anti-GFAP (astrocítico, cabezas de flecha).
Aumentaron células GFAP+ y, en particular, GalC+. Disminuyeron
células MAP2+ (Tabla IV).
La figura 4 muestra la diferenciación de células
madre del SNC humano en neuronas en un cultivo de alta densidad.
Células del SNC expandidas con bFGF a una elevada densidad se
diferenciaron mediante la retirada de bFGF ("WD"). El número
de neuronas que expresan proteína tau se determinó mediante
inmunocitoquímica en cultivo durante la fase de expansión ("antes
de WD") frente a después de la diferenciación ("después de
WD"). El drástico aumento en las neuronas
post-mitóticas solamente después de la retirada de
bFGF indica que éstas fueron generadas a partir de las células
madre en división.
Las figuras 5A-F muestran
células madre humanas teñidas con antisuero anti-tau
específico de seres humanos (Chemicon) que identifican neuronas.
Células madre del SNC humano en proliferación en un cultivo de alta
densidad no expresan la proteína tau, un marcador neuronal (figura
5A). Después de 6 días de diferenciación, sin embargo, muchas
células con una morfología neuronal típica expresan un alto nivel de
proteína tau (figura 5B). Con el fin de demostrar adicionalmente
que estas neuronas se derivan de hecho de células madre en división,
las células madre se marcaron con 10 \muM de bromodesoxiuridina
(BrdU), un indicador de la mitosis, durante 24 horas justo antes de
la retirada de bFGF. Estas células se diferenciaron luego durante 6
días, se tiñeron doblemente con antisuero anti-tau
específico de seres humanos (FITC, verde) y anticuerpo
anti-BrdU (rodamina, rojo). La figura 5C muestra
una vista muy aumentada de las subsiguientes neuronas
tau-positivas según se observa a través de
fluorescencia FITC. La figura 5D muestra el mismo campo de visión
que la figura 5D, pero observada a través de fluorescencia con
rodamina para revelar núcleos BrdU-positivos. La
mayoría de las neuronas tau-positivas son también
positivas para BrdU, demostrando que se derivaron de células madre
mitóticas antes de la retirada de bFGF.
Con el fin de demostrar adicionalmente la
multipotencialidad de células madre del SNC humano, éstas se
cultivaron a una densidad clonal según se describe para las células
de roedores. La figura 5E muestra un clon típico a un bajo aumento,
que ha sido expandido a partir de una sola célula durante 20 días,
ha sido subsiguientemente diferenciado durante 12 días y ha sido
inmunoteñido con el anticuerpo anti-MAP2, específico
para neuronas. Las neuronas son abundantes en el clon. La figura 5F
muestra una vista a mayor aumento del clon en la figura 5E para
indicar que las células MAP2-positivas tienen una
morfología neuronal típica.
Las figuras 6A-D demuestran una
diferenciación dirigida de células madre del SNC humano. Células
madre del SNC humano, después de 16 días de expansión, se hicieron
desarrollar clonalmente durante 20 días adicionales y luego se
diferenciaron en presencia o ausencia de factores simples, PDGF (10
ng/ml), CNTF (10 ng/ml) o T3 (3 ng/ml). La figura 6A muestra un
clon control no tratado, con aproximadamente 50% de neuronas
MAP2-positivas (flechas) y 2-10% de
astrocitos GFAP-positivos (cabezas de flecha). La
figura 6B muestra un clon tratado con PDGF, en el que el 75% de las
células son neuronas MAP2-positivas (flechas) y
2-10% son astrocitos GFAP-positivos
(cabezas de flecha). La figura 6C muestra un clon tratado con CNTF,
en el que el 85% son astrocitos GFAP-positivos
(cabezas de flecha) y solamente el 9% son neuronas
MAP2-positivas (flechas). La figura 6D muestra un
clon tratado con T3 con un número incrementado de oligodendrocitos
O4- y/o GalC-positivos (flechas) y de astrocitos
GFAP-positivos (cabezas de flecha).
Las figuras 7A-7I muestran que
un gran número de neuronas maduras con una polaridad
axón-dendrítica y una actividad sináptica correctas
pueden ser obtenidas de forma rutinaria a partir de células madre
del SNC expandidas durante largo tiempo. Las células madre del
hipocampo procedentes de embriones de rata E16 se expandieron en
cultivos durante 16 días y a través de 4 pases. Justo antes del
último pase, las células de rápida división se marcaron con 10
\muM de BrdU durante una noche, se les hizo el pasaje utilizando
tripsina y se extendieron en placas sobre portaobjetos de cámara.
Las células se mantuvieron durante 21 días para permitir una
diferenciación constitutiva y una maduración de neuronas.
Subsiguientemente, se analizaron mediante inmunocitoquímica el
grado de maduración y los subtipos neuronales generados.
Fig. 7A: Neuronas teñidas con anticuerpo TuJ1
vistas a un bajo aumento (100x) para ilustrar que la producción de
neuronas es eficaz.
Fig. 7B: Morfología típica de neuronas revelada
por anticuerpos TuJ1 (400x).
Fig. 7C: Morfología típica de neuronas revelada
por anticuerpos MAP2 (400x).
Fig. 7D: Neuronas teñidas con anticuerpo
sinapsina. Solamente se tiñen neuronas maduras que contienen
vesículas sinápticas.
Fig. 7E: Tinción con BrdU. Todas las células en
el cultivo, neuronas y glía, están marcadas con BrdU.
Fig. 7F: Tinción doble con sinapsina y BrdU. Las
células maduras sinapsina-positivas son también
BrdU-positivas, demostrando que se derivan de
células madre mitóticas en cultivo.
Fig. 7G: La tinción del anticuerpo
anti-sinapsina en puntos marca los terminales de
axón presinápticos específicamente en grandes neuronas maduras.
Fig. 7H: Las estructuras
sinapsina-positivas están estrechamente aplicadas a
procesos dendríticos revelados por la tinción con anticuerpo
MAP2.
Fig. 7I: Las proteínas MAP2 y sinapsina están
estrechamente asociadas pero no co-localizadas,
sugiriendo una interacción
presináptica-postsináptica.
La figura 8 muestra que neuronas derivadas de
células madre expresan diversos receptores neurotransmisores y
transportadores de los que se espera están implicados en la
transmisión sináptica, según se detecta por RT-PCR.
Células madre expandidas durante largo tiempo derivadas de la
corteza de roedores E16 se diferenciaron durante 14 días y se
recolectaron para preparar ARN. Las células madre no diferenciadas
también se prepararon con el fin de comparar una inducción
específica para la diferenciación. El ARN procedente de un cerebro
entero de rata adulta se utilizó como control positivo. Se
utilizaron cebadores específicos para familias de NMDA
(D-aspartato de N-metilo) y AMPA
(ácido
\alpha-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol-propiónico)
de subtipos de receptor glutamato, así como para diversos
transportadores GABA. Obsérvese especialmente la inducción
específica de los receptores NMDA R1, AMPA R1 y AMPA R2 en células
diferenciadas.
Las figuras 9A-F muestran
ejemplos de neuronas típicas derivadas de células madre del
hipocampo de embriones de rata que habían sido expandidas in
vitro durante 16 días (aproximadamente 16 divisiones celulares a
lo largo de 4 pases) y se habían diferenciado durante un total de
21 días. Las células madre del SNC mitótico se marcaron por
impulsos con bromodesoxiuridina (BrdU) durante las últimas 24 horas
antes de la diferenciación. Las neuronas resultantes se
inmunotiñeron por tres veces con anticuerpos contra BrdU (fig. 9A),
MAP2ab (fig. 9B) y sinapsina (fig. 9C). La vista compuesta de la
célula teñida por tres veces se muestra en la fig. 9D. El marcaje
con BrdU demuestra que la neurona diferenciada se derivaba de un
precursor mitótico en el cultivo y que es una neurona terminalmente
diferenciada, ya que conserva el nivel mitótico durante la fase de
diferenciación prolongada. MAP2ab es una proteína específica de
neuronas bien establecida, presente solamente en neuronas maduras y
localizada la mayoría de las veces en dendritas. La sinapsina es una
proteína de la vesícula sináptica bien establecida y, así, localiza
terminales sinápticos en axones. Las neuronas marcadas por tres
veces, tal como se muestra en la fig. 9D, establecieron que células
madre del SNC mitóticas expandidas durante largo tiempo se
diferenciaban terminalmente en neuronas maduras con una polarización
subcelular adecuada que contenía estructuras dendríticas
(post-sinápticas) y axonales
(pre-sinápticas) distintas de las esperadas de
neuronas totalmente funcionales. Otras proteínas de la vesícula
sináptica también se localizan en el mismo modelo de terminales de
axón en puntos aplicadas al soma y dendritas. Las fig. 9E y fig. 9F
muestran otra célula madre del SNC del hipocampo derivada de una
neurona madura doblemente teñida para la sinaptofisina y MAP2ab,
respectivamente.
La figura 10 muestra un campo de neuronas
procedentes de células madre del SNC del hipocampo vistas por
microscopía de electrones de transmisión. Son evidentes la
abundante presencia de sinapsis que contienen vesículas sinápticas
y densidades post-sinaptícas.
Las figuras 11A-D muestran
registros electrofisiológicos intracelulares procedentes de neuronas
sencillas obtenidas de células madre del SNC del septum E15.5 de
rata. Consistentes con esta morfología, estos registros demuestran
que las redes neuronales derivadas de células madre del SNC son
también electrofisiológicamente activas. Así, cuando se estimularon
células individuales con un electrodo, estas células condujeron
potenciales de acción (Fig. 11A), demostraron la presencia de
diversos canales de iones sensibles a la tensión (fig. 11B) y
provocaron potenciales excitatorios e inhibitorios
post-sinápticos en respuesta a la aplicación al baño
del neurotransmisor excitatorio, glutamato (figs. 11C y D). Estos
ejemplos establecen sin duda alguna que las células madre del SNC
dan lugar a tramas neuronales terminalmente diferenciadas y
electrofisiológicamente funcionales.
Diversos fenotipos neuronales observados in
vivo se obtienen a partir de los cultivos de células madre del
SNC. Ejemplos de algunos de estos fenotipos neuronales se muestran
en las figuras 12-18 y en la Tabla VII.
La figura 12 muestra la expresión de receptores
de dopamina D1 y D2 procedentes de células madre del SNC aisladas
de la eminencia gangliónica lateral y media de E15.5. ARNs totales
se aislaron a partir de cultivos de células madre del SNC
respectivos, diferenciados durante períodos variables
(0-20 días). Se muestra el modelo de electroforesis
del ADN, amplificado por RT-PCR (reacción en cadena
de la polimerasa de transcripción inversa). Se muestran los
resultados procedentes de cinco preparaciones de cultivo
independientes, realizadas en paralelo en un solo gel. Los números
por encima de las pistas indican los días de diferenciación. D1 =
receptor de dopamina, D1; D2 = receptor de dopamina, D2.
Las figuras 13A-D muestran
neuronas colinérgicas procedentes de células madre del SNC del
septum. Células madre del SNC derivadas del septum E16 se
diferenciaron durante 18-21 días. Las neuronas
colinérgicas fueron confirmadas mediante histoquímica de
acetilcolina esterasa (no mostrada), mediante inmunotinción para
acetilcolina transferasa (fig. 13A) y para el transportador de
acetilcolina (fig. 13C). En cada caso, células madre del SNC se
incubaron con el marcador mitótico, BrdU (10 \muM), durante 24
horas justo antes de conmutar a la condición de diferenciación
(figs. 13B y D).
Las figuras 14A-F muestran
neuronas que contienen neuropéptidos obtenidas de células madre del
SNC de la eminencia gangliónica lateral (cuerpo estriado) 15.5 de
rata. Estas son unas neuronas neuropéptido
Y-positiva (Fig. 14A),
BrdU-positiva (fig. 14B), una neurona
met-encefalina-positiva (fig. 14C),
BrdU-positiva (fig. 14D) y una neurona
leu-encefalina-positiva (fig. 14E),
BrdU-positiva (fig. 14F).
Las figuras 15A-F muestran
morfologías típicas de varios subtipos de neuronas derivados de
células madre del SNC del mesencéfalo ventral E12.5 de rata. Las
figuras 15A y B muestran una neurona TH-positiva y
BrdU-positiva (fig. 15A - tinción con TH; fig. 15B
- tinción con BrdU). Las figuras 15C y D muestran otra neurona
TH-positiva y MAP2ab-positiva (fig.
15C - tinción con TH; fig. 15D - tinción con MAP2ab). La figura 15E
muestra neuronas teñidas con anticuerpo anti-GABA.
La figura 15F muestra neuronas teñidas mediante histoquímica con
acetilcolina-esterasa.
Las figuras 16A-D muestran
ejemplos de neuronas procedentes de células madre de la médula
espinal. La figura 16A muestra una neurona acetilcolina
esterasa-positiva derivada de las células madre del
SNC de la médula espinal E13.5 de rata, que también es
BrdU-positiva (fig. 16B). Se muestran neuronas
colinérgicas mediante la tinción con
acetilcolina-transferasa (fig. 16C) que son también
BrdU-positivas (fig. 16D).
Las figuras 17A y B muestran neuronas
GABAérgicas derivadas de células madre del SNC del hipocampo E15.5
de rata, que han sido teñidas doblemente para ácido glutámico
descarboxilasa (fig. 17A) y GABA (fig. 17B). Las figuras 17C y D
muestran una neurona calrretinina-positiva (fig.
17C), MAP2ab-positiva (fig. 17D) del hipocampo.
Las figuras 18A-F muestran
neuronas derivadas de células madre del SNC del tálamo e hipotálamo
E13.5 de rata. La figura 18A muestra neuronas talámicas teñidas
para tau; la figura 18B muestra el mismo campo de visión teñido
para BrdU. La figura 18C muestra una neurona hipotalámica teñida
para tau; la figura 18D muestra el mismo campo de visión teñido
para BrdU. Las figuras 18E y F muestran neuronas
sinapsina-positivas de células madre del SNC del
tálamo e hipotálamo, respectivamente.
En esta solicitud, se definen condiciones que
permiten una expansión en masa de hasta 10^{9} veces en cultivo y
la diferenciación controlada de células madre del SNC
multipotenciales procedentes del cerebro embrionario y adulto de
mamíferos. En ambos casos, clones derivados de células sencillas se
diferencian en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. La adición
de factores sencillos puede desplazar drásticamente la proporción de
tipos de células dentro de un clon.
El proceso para aislar, propagar y diferenciar
las células madre del SNC se da a continuación en detalle. El
proceso contiene cuatro etapas esenciales que deben seguirse en
concierto para un aislamiento y diferenciación con éxito de las
células madre del SNC. Las cuatro etapas esenciales son como
sigue:
(1) La disociación inicial de células
procedentes de tejido se realiza mediante trituración mecánica y no
mediante digestión enzimática. Con el tejido adulto, es necesario
digerir primero enzimáticamente el tejido y luego disociar las
células del tejido mediante trituración mecánica.
Trituración significa agitación suave de
conjuntos de células provocados por el movimiento fluido que se
produce durante la acción de pipeteado repetitiva mediante la cual
células individuales se vuelven sueltas y se disocian de células
vecinas. La trituración se realiza en una solución salina exenta de
cationes divalentes, cuya ausencia ayuda a romper las interacciones
entre proteínas de adhesión a la célula sobre la superficie de la
célula. Células madre de en rápida división en la zona ventricular
son sólo débilmente adherentes, y la simple retirada de los
cationes divalentes del medio y una suave agitación mediante
pipeteado son suficientes para disociar el tejido en células la
mayoría de ellas sencillas. A continuación, las células se cultivan
en ausencia completa de suero. Incluso una breve exposición al
suero afecta de manera perjudicial a la capacidad de diferenciación
de las células madre, de modo que ya no son capaces de diferenciarse
en neuronas y oligodendrocitos. El pre-revestimiento
de las placas con poli-L-orinitina
y fibronectina facilita la adhesión de las células a las placas.
(2) Las células madre del SNC exhiben una
propiedad innata de diferenciarse espontáneamente, lo que refleja
un mecanismo regulador que controla el ciclo celular en función de
la concentración libre de factor de crecimiento, el mitógeno. Con
el fin de suprimir la diferenciación de las células madre en otros
tipos de células y de conservar una homogeneidad, el factor de
crecimiento debe ser suministrado diariamente a una concentración
de 10 ng/ml o superior. El factor de crecimiento se puede
seleccionar de (1) factor de crecimiento fibroblástico básico
(bFGF), (2) EGF, (3) TGF-alfa o (4) FGF de carácter
ácido (aFGF). Si se selecciona el factor de crecimiento de
fibroblastos de carácter ácido, también se debe suministrar heparina
a una concentración de 1 \mug/ml.
(3) Incluso un suministro continuo de bFGF u
otro factor de crecimiento seleccionado es insuficiente para
inhibir la diferenciación, si se deja que el cultivo alcance una
densidad crítica mayor que aproximadamente 50%. Lo más
probablemente, esto se debe a factor o factores endógenos todavía no
definidos secretados por las propias células en división que
antagonizan la acción de bFGF. Así, con el fin de separar del
cultivo factores de este tipo y de reducir la interacción
célula-célula lo más posible, las células deben ser
pasadas con frecuencia cada 4 días después de la extensión en
placas, y debería realizarse una nueva extensión en placas a una
baja densidad de aproximadamente 0,5 x 10^{6} por cada 10 cm de
placa, es decir en el intervalo de 1 x 10^{2} a 1 x 10^{6}
células por 10 cm de placa, pre-revestidas con
poli-ornitina y fibronectina.
(4) El pase de las células por parte de tripsina
da como resultado una separación proteolítica de un componente
receptor de bFGF e inhabilita el efecto mitogénico de bFGF. La
velocidad de renovación del receptor es lo suficientemente lenta
durante el período en el que las células no son capaces de reconocer
el mitógeno y activan la vía de diferenciación.
Con el fin de evitar este proceso, las células
se tratan con solución salina tamponada de Hank (HBSS- siglas en
inglés) para separar cationes divalentes en el cultivo que
interrumpe las interacciones iónicas entre las cadherinas y las
integrinas sobre la superficie de la célula y las proteínas de la
matriz extracelular sobre la placa de cultivo, determinando que las
células se redondeen. En este punto las células madre pueden ser
raspadas de la placa con un raspador sin dañar las células.
Otras células en el cultivo se mantienen
estrechamente ligadas a la placa y el raspado las elimina,
permitiendo así una selección eficaz de células madre no
diferenciadas que se dividen rápidamente.
La diferenciación de las células madre del SNC
se consigue separando simplemente el mitógeno, bFGF u otro factor
de crecimiento seleccionado, del medio. La especificación de los
tipos de célula, es decir neuronas, oligodendrocitos y astrocitos,
se produce constitutivamente. Con el fin de una diferenciación
controlada eficaz, las células deben estar en un estado homogéneo
que se puede conseguir siguiendo las etapas 1-4
anteriores.
Estos procesos proporcionan un sistema de
cultivo para obtener con control y eficacia una población homogénea
de las células madre del SNC que se pueden diferenciar en neuronas,
oligodendrocitos y astrocitos. Lo destacado de las características
de este sistema es:
(1) producción de un gran número de las células
madre del SNC con el potencial de formar muchos subtipos neuronales
diferentes, oligodendrocitos y astrocitos que se pueden trasplantar
a un cerebro;
(2) diferenciación controlada in vitro
bajo condiciones exentas de suero, que permite la investigación de
nuevos factores de crecimiento y citoquinas;
(3) células que se dividen rápidamente
accesibles a la manipulación genética para la introducción de genes
extraños;
(4) generación de neuronas maduras in
vitro, adecuadas para el rastreo genético y farmacológico; y
(5) derivación directa de células precursoras
intermedias procedentes de las células madre para el enriquecimiento
de una población sencilla de células.
El aislamiento de las células madre del SNC de
la manera anteriormente descrita permite, además, una diferenciación
dirigida de las células tratándolas con factores de crecimiento
específicos. Una importancia práctica de esta diferenciación
dirigida a la biotecnología es que un tipo de células sencillo se
puede enriquecer in vitro. Así, una nueva aplicación de
factores de crecimiento previamente descritos PDGF^{37} (factor de
crecimiento derivado de plaquetas), CNTF (factor neurotrófico
ciliar) y T3 (hormona tiroides, tri-yodotironina)
sería dirigir las células madre del SNC para generar neuronas,
astrocitos y oligodendrocitos, respectivamente.
Otra importancia práctica, especialmente para
PDGF, es que las neuronas inducidas por PDGF parecen ser realmente
progenitores neuronales que pueden proliferar adicionalmente y
expandirse en cultivo por parte de PDGF. Estas células se
diferencian solamente en neuronas o en neuronas y oligodendrocitos,
y difieren de las células madre. El aislamiento de progenitores
neuronales a partir del SNC de mamíferos por parte de PDGF no se ha
descrito previamente.
El hipocampo embrionario de rata (día de
gestación 16; el día de concepción es el día 1, Taconic Farm) se
diseccionó en solución salina tamponada de Hank (HBSS) y se disoció
mediante breve trituración mecánica en HBSS. Las células se
recogieron mediante centrifugación y se resuspendieron en un medio
exento de suero que contenía DMEM/F12, glucosa, glutamina,
bicarbonato de sodio, 25 \mug/ml de insulina, 100 \mug/ml de
apotransferrina humana, 25 nM de progesterona, 100 \muM de
putrescina, 30 nM de selenito de sodio, pH 7,2^{8}, más 10 ng/ml
de factor de crecimiento fibroblástico básico humano
recombinante^{12} (bFGF; R&D Inc.).
1 x 10^{6} células se extendieron en placas
por cada 10 cm de placa de cultivo de tejido de plástico
pre-revestida con 15 \mug/ml de
poli-L-ornitina y 1 \mug/ml de
fibronectina de plasma bovino (Gibco). bFGF se añadió diariamente y
el medio se cambió cada 2 días. Las células se hicieron pasar a una
confluencia del 50% (4 días después de la extensión inicial en
placa) al incubarlas brevemente en HBSS y rasparlas con un raspador
de células.
Se encontraron células con una capacidad
multipotencial por todo el neuroepitelio en desarrollo. Bajo
condiciones de cultivo idénticas, se podían preparar células
similares procedentes de otras regiones del SNC en desarrollo
incluida la corteza cerebral, cuerpo estriado, septum, diencéfalo,
mesencéfalo, cerebelo y médula espinal. De la corteza y del cuerpo
estriado E14 y del hipocampo E16, aproximadamente el 70% de células
sutilmente disociadas respondían a bFGF en el espacio de 2 días de
la extensión en placa al sufrir una mitosis.
Células del hipocampo aisladas de cerebros de
rata embrionarios se expandieron mediante la adición diaria de
factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) en medio exento de
suero. El suministro contínuo de bFGF era importante para reprimir
la diferenciación y para mantener una población homogénea de células
que se dividían rápidamente y que expresaban nestina, una proteína
filamentosa intermedia característica de células precursoras del
SNC^{13,14}. Menos del 1% de las células expresaba el marcador
astroglial GFAP o los marcadores oligodendrogliales, O4 y GalC.
Las células se hicieron pasar durante 4 días
después de la extensión en placa, tiempo durante el cual el número
de células aumentó rápidamente con un tiempo de duplicación de
células medio de aproximadamente 24 horas. Las células pasadas se
volvieron a extender en placa a razón de 0,5 x 10^{6} células por
cada 10 cm de placa y se dejó que se propagaran adicionalmente. Las
células se podían subcultivar hasta cinco veces de esta manera
hasta un total de 20 días in vitro, tiempo durante el cual se
podía esperar de manera ideal un rendimiento de 2^{20} células.
Después de este período de tiempo, la tasa mitótica de las células
disminuyó rápidamente y las células perdieron gradualmente su
capacidad multipotencial, exhibiendo características gliales y
siendo incapaces de diferenciarse en neuronas.
Grandes números de células procedentes de la
corteza, el cuerpo estriado y el septum, aisladas de embriones de
12-18 días de gestación, podían también expandirse
en cultivo en masa de la misma manera. El transcurso en el tiempo
de la expansión era similar al de las células del hipocampo. La
expansión continua estaba de nuevo limitada por la pérdida
constitutiva de la multipotencialidad después de aproximadamente 20
días de la división de la célula. Así, esta regresión parece ser
una propiedad característica de las células madre del SNC.
No está disponible ningún marcador antigénico
sencillo que identifique de forma única células madre
multipotenciales procedentes de otros precursores in vitro.
La identidad de una población precursora solamente se puede
confirmar mediante la capacidad de diferenciación de las células.
Las condiciones definidas para el cultivo en masa en esta solicitud
también permitían una expansión clonal en donde las células fueron
extendidas en placas a una densidad extremadamente baja de células,
de modo que las células sencillas estaban bien aisladas.
La capacidad de diferenciación de las células
expandidas en el cultivo en masa se confirmó en cada pase
extendiendo 200 células por cada 10 cm de placa y sometiéndolas a
cultivo bajo condiciones como las descritas anteriormente. En el
espacio de 24 horas de la extensión en placas, células sencillas
bien aisladas fueron marcadas con un anillo de 3 mm (Nikon) en el
fondo de la placa. La viabilidad inicial de las células sencillas
marcadas era 5-10%, y cada placa proporcionaba
típicamente 10-20 clones marcados. Solamente una
sola célula residía en cada círculo. La subsiguiente población de
células dentro de cada círculo son la progenie de esa célula
sencilla. Clones se expandieron hasta durante 10 días
(500-2000 células). El tiempo de duplicación medio
era de aproximadamente 24 horas.
El potencial de desarrollo de células expandidas
se sometió a ensayo diferenciando directamente las células. La
retirada de bFGF inició la diferenciación en el espacio de 24 horas.
Para iniciar la diferenciación de células de alta densidad, células
que se dividían rápidamente, que habían estado en cultivo durante 12
días y se hicieron pasar tres veces se incubaron durante al menos
24 horas con 10 \muM de BrdU (bromodesoxiuridina) antes del pase.
80-85% de las células incorporaban BrdU. Las células
se recolectaron mediante raspado utilizando tripsina, seguido de
inhibidor de tripsina de haba de soja en el medio exento de suero.
Fueron extendidas en placas por duplicado a razón de 40.000
células/cm^{2} en portaobjetos de cámara de múltiples pocillos
(LabTek) pre-revestidos con
poli-L-ornitina y fibronectina, y se
cultivaron en el medio exento de suero sin bFGF. A los tiempos
indicados, las células se fijaron y tiñeron con diversos anticuerpos
de acuerdo con un proceso estándar.
Las células inmunopositivas se recontaron bajo
un aumento de 400x. Se hizo un recuento de al menos cinco campos
con un número total de células mayor que 1000 por muestra. Los
resultados mostrados (fig. 1A) son recuentos de células de la media
de dos experimentos. Los reactivos de anticuerpos utilizados eran:
antisuero anti-nestina; anti-MAP2
(clon HM-2, Sigma) y antisuero
anti-tau (Sigma) monoclonales,
anti-neurofilamentos L y M monoclonales (clones NR4
y NN18, Boehringer-Mannheim),
anti-beta tubulina tipo III (TuJ1),
anti-GFAP monoclonal (ICN), A2B5 (ATCC), O4 y
anti-galactocerebrósido (GalC).
A lo largo de un período de 6 días se produjo un
aumento progresivo en el número de células que expresaban varios
antígenos específicos para neuronas bien establecidos, incluidos
MAP2a, b y c, beta-tubulina tipo 3 (TuJ1), tau y
neurofilamentos L, M y H (Fig. 1A). Hasta el 50% de las células
expresaba los antígenos neuronales y exhibía una morfología
neuronal compleja. Las células restantes expresaban GFAP, GalC/O4 o
nestina. Mientras que neuronas y glia han sido observadas
previamente en cultivo expandido, estos ejemplos son los primeros
en establecer que la diferenciación de células precursoras
proliferantes se puede iniciar en un instante preciso y que surgen
rápidamente múltiples tipos de células. Estas condiciones permiten
un análisis del linaje a gran escala in vitro.
Para determinar si la población precursora
contiene progenitores comprometidos separados que dan lugar
independientemente a neuronas y glia, células que se dividían
rápidamente se extendieron en placas a una densidad clonal (200
células por cada 10 cm de placa) y células sencillas bien aisladas
se marcaron con círculos de 3 mm de diámetro. El
5-10% de las células sencillas marcadas sobrevivió y
proliferó con un tiempo de duplicación de 24 horas para generar
clones. Después de diversos períodos de expansión (los tamaños de
los clones oscilan entre 2^{4} y 2^{10} células), se inició la
diferenciación de clones lavando las placas una vez con HBSS y
cultivándolas en el mismo medio, pero en ausencia de bFGF (fig.
2).
Para la subclonación (datos no mostrados en la
Tabla II), las placas clonales se lavaron y se dejaron brevemente
en HBSS hasta que las células se redondeaban. Se recogieron clones
de 500-2000 células en un volumen de 50 \mul con
un pipeteador ajustable, al tiempo que se observaba a través de un
microscopio. Cada clon se volvió a extender en placas en una placa
de 10 cm y células sencillas se marcaron y cultivaron como
antes.
Tipos de células dentro de los clones se
analizaron durante los primeros seis días de diferenciación mediante
doble tinción con combinaciones de anticuerpos específicos para el
tipo de célula que reaccionan con células mutuamente
exclusivas:
neuronas = MAP2+, tau+, TuJ1+, neurofilamento
L+, o neurofilamento M+;
astrocitos = GFAP+; y
oligodendrocitos = O4+ o GalC+.
La doble tinción se realizó secuencialmente
utilizando un kit comercial (Zymed) de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. Para la tinción de oligodendrocitos, las células
fijadas con paraformaldehído al 4% se tiñeron primeramente para los
antígenos O4 o GalC de la superficie de la célula sin
permeabilización. El primer anticuerpo se desarrolló con una
reacción de fosfatasa alcalina (azul) y el segundo con una reacción
de peroxidasa (roja) (Zymed).
Como en el cultivo de alta densidad, hacia los
seis días, el 50% de las células en un clon expresaban antígenos
neuronales incluidos MAP2, tau y beta-tubulina tipo
III (Tabla I, figs. 3A y C). En la Tabla I, clones de células
precursoras del hipocampo se expandieron, diferenciaron y analizaron
como se describe arriba. Arriba se presenta una lista parcial de
clones típicos. Se muestran el número total de células (tamaño del
clon) y las células teñidas positivas para los antígenos
específicos para el tipo de célula. Su proporción relativa se da en
porcentaje entre paréntesis. Se cuantificó un total de 48 clones
procedentes de 4 pases diferentes en 6 experimentos separados. La
media total indica la composición media de cada uno de los tipos de
células en los 48 clones.
La expresión del neurofilamento se demoró bajo
estas condiciones. En promedio, el 8% de las células en un clon era
GalC+ y tenía una morfología de oligodendrocito típica. Un 8%
adicional expresaba GFAP y exhibía una morfología de astrocito
característica. Las restantes células no estaban teñidas por ninguno
de los anticuerpos específicos para los tipos de células
diferenciadas, sino que reaccionaban con anticuerpos A2B5 y/o
anti-nestina. Un máximo del 20% de las células
murió durante la diferenciación. Se obtuvieron resultados idénticos
independientemente de que los clones se obtuvieran a partir de
células sutilmente disociadas sin ningún pase previo o partir de
células después de 4 pases (26 días).
Células con una capacidad multipotencial se
encontraban a lo largo de todo el neuroepitelio en desarrollo. Bajo
condiciones de cultivo idénticas, células similares se podían
preparar a partir de otras regiones del SNC en desarrollo, incluida
la corteza cerebral, el cuerpo estriado, septum, diencéfalo,
mesencéfalo, cerebelo y médula espinal. Cuando se expandían
clonalmente, casi todos los clones contenían múltiples tipos de
células definidos tanto por la morfología como por la expresión del
antígeno con neuronas que constituían el 50% del clon.
Clones proliferantes de las células
multipotenciales contenían una morfología uniforme y modelos de
expresión de antígeno. A pesar de ello, la separación de
morfologías neuronales y no neuronales se producía rápidamente en
el espacio de 24 horas y solamente después de la retirada del
mitógeno. Las neuronas tempranas estaban uniformemente distribuidas
por todo el clon sin una polaridad o localización obvia sugiriendo
la ausencia de progenitores neuronales comprometidos durante la
expansión clonal. Además de ello, el número de neuronas aumentaba
linealmente con el tamaño creciente del clon y constituía de forma
reproducible el 50% del clon (fig. 1B).
Con el fin de determinar adicionalmente si los
clones en expansión consistían en progenitores comprometidos
proliferantes, se recogieron clones y se volvieron a extender de
nuevo en placas. 10-15% de las células dieron lugar
a clones de segunda generación. De nuevo, la totalidad de los
subclones contenían neuronas, astrocitos, oligodendrocitos y
células sin teñir (Tabla II). Más específicamente, en la Tabla II se
muestran la composición del tipo de célula de subclones obtenidos
de tres clones independientes, HI6, HI8, HI19. Se cuantificó un
total de 84 subclones a partir de 13 clones parentales
independientes en dos experimentos separados. Solamente se presenta
una lista parcial. La media total indica la composición media de
cada tipo de célula procedente de los 84 subclones. Ningún subclón
consistía solamente en un tipo de célula. Estos datos indican que
los precursores multipotenciales sufren divisiones simétricas para
regenerar células hijas con una capacidad multipotencial.
La capa subependimal del cerebro de rata adulta
contiene células mitóticas nestina-positivas que
podían expandirse en cultivo agregado en presencia de factor de
crecimiento epidermal (EGF), pero no bFGF^{15}. Algunas de las
células en los agregados mostraban propiedades neuronales y
astrocíticas. Para definir con mayor precisión su capacidad de
desarrollo, la población mitótica (1% de 1 x 10^{5}
células/cerebro) que revestía el ventrículo lateral del cuerpo
estriado de rata adulta se expandió en presencia de bFGF y se
comparó con los precursores embrionarios. Rodajas del cerebelo
procedentes de 250 g de cerebros de rata adulta
(10-20 por experimento) se prepararon y la región
subependimal del cuerpo estriado que revestía los ventrículos
laterales se cortaron bajo el microscopio en HBSS oxigenada. Las
células se disociaron incubando tejidos desmenuzados a la
temperatura ambiente durante 10 minutos con tripsina (1 mg/ml),
hialuronidasa (0,7 mg/ml) y ácido quinurénico (0,2 mg/ml) en HBSS
oxigenada. Estas células se lavaron una vez en HBSS con 0,7 mg/ml de
ovomucoide y 0,2 mg/ml de ácido quinurénico, se resuspendieron y se
trituraron mecánicamente en la misma solución. Las células
disociadas se recuperaron por centrifugación y se cultivaron en el
medio exento de suero más bFGF (10 ng/ml) según se describe para
las células embrionarias.
La morfología y características de desarrollo de
las células adultas nestina-positivas eran similares
a las de las células embrionarias. Después de la retirada de bFGF,
los clones marcados se diferenciaban en múltiples tipos de células
que expresaban MAP2, TuJ1, GFAP y GalC (Fig. 3B y D). De manera
notable, la misma alta proporción de neuronas se encontró en clones
diferenciados de células adultas como en los clones embrionarios
(Tabla III). Más específicamente, la Tabla III muestra la
composición del tipo de células de clones diferenciados, derivados
de células subependimales adultas. Se cuantificaron 23 clones de
tres experimentos independientes.
Células sutilmente disociadas de diversas
regiones de cerebro embrionario se cultivaron en presencia de EGF
(20 ng/ml) o bFGF (10 ng/ml) bajo condiciones idénticas según se
describe arriba. Células adultas sutilmente disociadas se
prepararon como se describe arriba y se cultivaron bajo condiciones
idénticas a las de las células embrionarias. El posible efecto de
la densidad inicial de células sobre la respuesta mitogénica se
sometió a ensayo variando la densidad inicial de células desde 1 x
10^{4} a 2,5 x 10^{6} por placa. A baja densidad, se midió la
eficacia de la formación de la colonia; a alta densidad, se hizo un
recuento de células mitóticas BrdU+/nestina+. Colonias expandidas
con EGF y bFGF se diferenciaron también retirando los mitógenos y
los tipos de células se analizaron como se describe arriba.
Bajo las condiciones de cultivo de estos
ejemplos, EGF era un mitógeno con la misma eficacia que bFGF para
células adultas (fig. 1C) y, cuando se diferenciaban los clones,
éstos dieron lugar a los tres tipos de células. Clones embrionarios
expandidos con EFG, con y sin pase, también se diferenciaban en los
tres tipos de células. A diferencia de las células adultas, sin
embargo, EGF era al menos 10 veces menos eficaz que bFGF como
mitógeno para las células embrionarias de varias regiones
diferentes, independientemente de la densidad inicial de células
(fig. 1C). Así, con la excepción de los efectos proliferantes de
EGF, estos datos revelan que las células multipotenciales
procedentes de los SNCs embrionario y adulto son acusadamente
similares. TGF\alpha (10 ng/ml) también era un mitógeno para las
células multipotenciales y no se podía distinguir de EGF, mientras
que aFGF (10 ng/ml) en presencia de heparina (1 \mug/ml)
mimetizaba los efectos de bFGF.
El análisis clonal sugiere que los precursores
multipotenciales no están comprometidos antes de la retirada del
mitógeno y, así, señales extracelulares pueden regular la
determinación del tipo de célula. Los autores de la invención
sometieron a ensayo si la proporción de los tipos de células
generados dentro de un clon podía ser influenciada por factores de
crecimiento y citoquinas, ya sea durante la proliferación o la
diferenciación.
La influencia de factores de crecimiento sobre
la especificación del tipo de células se sometió a ensayo añadiendo
éstas al cultivo dos días antes de la retirada de bFGF y durante 6
días de diferenciación. Diariamente se añadieron factores y el
medio se cambió cada 2 días. Al término de los 6 días se analizaron
los clones en cuanto a la composición del tipo de célula mediante
doble tinción como se describe arriba. Las concentraciones finales
de los factores eran 10 ng/ml de PDGF-AA, -AB o -BB,
10 ng/ml de CNTF y 3 ng/ml de T3.
En clones embrionarios, la proporción de
neuronas aumentaba significativamente en presencia de PDGF (10
ng/ml, -AA, -AB o -BB) durante la diferenciación. Hasta el 80% de
las células eran neuronales con la expresión de MAP2, tau, TuJ1 o
NF-M, y un número menor de células se expresaba O4,
GalC y GFAP (figs. 3E y F, Tabla IV). Más específicamente, la Tabla
IV muestra la composición clonal media de cada tipo de célula
obtenida cuando los clones se diferenciaban durante 6 días en
ausencia (no tratado) o en presencia de diferentes factores. Se
prepararon placas clonales de células después de 0-3
pases. El tamaño del clon oscilaba entre 17 y 5336 células. Los
tipos de células diferenciados se analizaron como se describe
arriba.
Las células que expresan los antígenos
neuronales mostraban una morfología menos madura bajo estas
condiciones. Cuando se trataban con factor neurotrófico ciliar
(CNTF), los clones dieron lugar casi exclusivamente a astrocitos
(figs. 3G y H, Tabla IV). De manera notable, menos del 1% de las
células era MAP2-positivas en este estado. Las
células tratadas con CNTF eran intensamente
GFAP-positivas y todas mostraban una morfología
plana astrocítica. LIF mostró efectos idénticos que CNTF.
La hormona tiroides,
tri-yodotironina (T3), influía sobre la
diferenciación de los precursores multipotenciales hacia un destino
glial mixto (figs. 3I y J, Tabla IV). Astrocitos y oligodendrocitos
aumentaron ambos 3 veces y había una acusada disminución en la
proporción de neuronas. Como en el caso de los clones no tratados,
células GalC- y O4-positivas mostraban morfologías
de oligodendrocitos características. Los clones eran de un tamaño
similar en todos los experimentos y el análisis numérico de células
muertas mostró que la muerte selectiva de células no puede ser la
responsable de los cambios en la proporción de tipos de células. Se
obtuvieron resultados similares con células madre multipotenciales
procedentes de la corteza y del cuerpo estriado embrionarios.
Además, las células multipotenciales derivadas de la capa
subependimal del cerebro adulto mostraron respuestas de
diferenciación cuantitativamente similares a PDGF, CNTF y T3 (fig.
3, Tabla IV). Esto enfatiza la naturaleza general de estas
vías.
Otros factores que fueron sometidos a ensayo
durante este estudio y que no mostraron ningún efecto instructivo
significativo en la determinación del tipo de célula eran: NGF,
NT-3, BDNF, TGFb1, IL1b, IL2-11,
G-CSF, M-CSF,
GM-CSF, oncoestatina M, factor de células madre,
eritropoyetina, interferón gamma, ácidos 9-cis y
todos los -trans retinoicos, acetato de retinilo, dexametasona y
corticosterona.
Tejidos de diversas regiones de cerebros fetales
humanos se obtuvieron de fetos de 45 a 114 días en períodos de
gestación. Los tejidos se disociaron en HBSS mediante trituración
mecánica según se describe arriba. Las células se recogieron por
centrifugación, se resuspendieron, se extendieron en placas a razón
de 1 x 10^{6} células por cada 10 cm de placa y se expandieron en
un medio exento de suero más 10 ng/ml de bFGF bajo condiciones
idénticas a las descritas para las células madre del SNC fetales de
roedores de arriba.
Aproximadamente 25-50% de las
células humanas, dependiendo de la edad y de la región, tenía una
morfología de la célula madre del SNC y respondían a bFGF mediante
una rápida división de la célula. Células madre del SNC humanas se
expandieron en cultivo hasta durante 36 días. El tiempo de
duplicación medio era de aproximadamente 48 horas, lo que contrasta
con la contraparte de roedores con un tiempo de duplicación de 24
horas. Tras la retirada de bFGF, la diferenciación de células madre
del SNC fetales humanas se produjo rápidamente y surgieron
múltiples tipos de células. En cultivo de alta densidad, las células
se diferenciaron durante hasta 13 días y los subsiguientes tipos de
células presentes se analizaron mediante inmunocitoquímica según se
describe para el cultivo de células de roedores. Antes de la
diferenciación por la retirada de bFGF, en el cultivo están
presentes pocas neuronas tau-positivas (fig. 4). En
contraposición, después de la retirada del bFGF, hasta el 40% de
las células del cerebro fetal humanas expandidas con bFGF en cultivo
en masa eran neuronas inmunorreactivas con antisuero
anti-tau específico para seres humanos. Una mayoría
de las neuronas tau-positivas en cultivo podía
marcarse con BrdU (bromodesoxiuridina), el indicador de la mitosis,
en un espacio de 24 horas antes de la retirada de bFGF (figs. 5C y
D). Este resultado demuestra que las condiciones de cultivo
definidas para las células madre del SNC de roedores se aplica
igualmente bien para la expansión y diferenciación eficaces de
células madre del SNC humanas para generar grandes números de
neuronas en cultivo.
Con el fin de analizar adicionalmente la
multipotencialidad de las células madre del SNC fetales humanas en
el cultivo en masa, células en división se extendieron en placas a
una densidad clonal (100-200 células por cada 10 cm
de placa) y se expandieron adicionalmente durante 20 días (tamaño
del clon = 2^{10}). Subsiguientemente, se diferenciaron clones
retirando bFGF y analizando los tipos de células inmunorreactivos
para anticuerpos específicos para neuronas, astrocitos y
oligodendrocitos. La mayoría de las células fetales humanas
clonalmente expandidas se diferenciaban para dar origen a los tres
tipos de células - neuronas, astrocitos y oligodendrocitos (figs.
5E y F). Al igual que con las células madre de roedores, neuronas
MAP2-positivas constituían aproximadamente el 50%
del clon (Tabla V). Las células restantes tenían una morfología
glial grande alargada. Aproximadamente el 10% de las células
expresaba antígeno astrocítico maduro, GFAP, y aproximadamente el 2%
expresaba antígenos oligodendrocíticos O4 o galactocerebrósido
(GalC) (Tabla V). Este análisis clonal demuestra, así, que el
sistema de cultivo descrito en esta memoria permite un aislamiento,
expansión en masa y diferenciación eficaces de células madre
multipotenciales procedentes del SNC fetal humano.
Además de la multipotencialidad y de las
propiedades de auto-renovación de células madre del
SNC, la capacidad de diferenciarse en un tipo de célula en
respuesta a una señal extracelular es la propiedad definitoria clave
de células madre del SNC de roedores según se demuestra arriba. Los
tres factores extracelulares, PDGF, CNTF y T3, también dirigían la
diferenciación de los clones de células del SNC humanas de una
manera idéntica (Tabla V, figs. 6A-D). Así, en
presencia de PDGF, células neuronales MAP2-positivas
aumentaban hasta un 71% de un clon, significativamente mayor que el
46% en el cultivo control no tratado. En contraposición, en
presencia de CNTF, disminuían las células
MAP2-positivas y aumentaban drásticamente los
astrocitos GFAP-positivos hasta un 85% de los
clones. T3 aumentaba las células oligodendrogliales O4 o
GalC-positivas, así como las células astrogliales
GFAP-positivas, mientras que disminuían neuronas
MAP2-positivas (Tabla V). Estos resultados
demuestran las similitudes cuantitativamente entre las células
madre del SNC de seres humanos y de roedores y la capacidad de
aplicación universal del presente sistema de cultivo para una
expansión y diferenciación eficaces de células madre del SNC de
mamíferos.
La multipotencialidad de células madre del SNC y
su diferenciación dirigida por parte de señales extracelulares
definidas establece inequívocamente que las neuronas se derivan
directamente de células madre. Así, el origen de la diversidad
neuronal observada en el cerebro maduro parte de células madre del
SNC. ¿Pueden las células madre del SNC expandidas en cultivo
durante un largo plazo conservar la capacidad de madurar para formar
una polaridad axonal-dendrítica, con el fin de
interactúar con otras células y formar sinapsis? Con el fin de
investigar el grado al que las neuronas derivadas de células madre
del SNC pueden madurar in vitro bajo condiciones exentas de
suero, se dejó que células madre derivadas del hipocampo de rata
embrionario se diferenciaran durante hasta 21 días a alta
densidad.
Subsiguientemente, las neuronas se tiñeron con
diversos anticuerpos que reconocían proteínas específicas para
axones o dendritas. Sinapsina, sinaptofisina, sinaptobrevina y
sintaxina son proteínas que se encuentran en las vesículas
sinápticas de neuronas maduras en los terminales del axón y están
implicada en la exocitosis de neurotransmisores. Las cuatro
proteínas estan muy co-localizadas en las neuronas
derivadas de células madre, en un modelo en puntos, lo más
probablemente delineando los terminales del axón. Los procesos que
portan las proteínas de la vesícula sináptica eran delgados, muy
elaborados, viajaban durante una larga distancia y decoraban el
perímetro de neuronas vecinas (fig. 7G). Estas contenían proteínas
específicas para axones tales como tau y neurofilamento y estaban
desprovistas de proteínas específicas para dendritas tales como
MAP2a y MAP2b (fig. 7H y 7I).
Estos resultados indican que, de manera similar
a las neuronas generadas in vivo, neuronas derivadas de
células madre exhiben una adecuada polaridad
axón-dendrita y exhiben una actividad sináptica.
Neuronas derivadas de células madre también expresaban receptores
neurotransmisores principales, transportadores y enzimas de
tratamiento importantes para las funciones del neurotransmisor.
Estos incluian miembros de receptores glutamato, receptores GABA y
receptores dopamina (fig. 8). Además, las células madre conservan su
capacidad de generar subtipos de neuronas con diferencias
moleculares entre los subtipos.
Entendiendo los programas moleculares que
gobiernan la organización de la diversidad neuronal complejas en el
cerebro adulto de mamíferos es un objetivo principal de la
neurobiología del desarrollo. La mayoría de los dominios
estructurales en el cerebro adulto y subpoblaciones de neuronas
post-mitóticas que los comprenden se generan
durante el desarrollo embrionario. Las propiedades del desarrollo de
las células precursoras inmediatas que dan lugar a neuronas
específicas, sin embargo, son ampliamente desconocidas. Tampoco son
claras la fase precisa de diferenciación y el principio molecular
general mediante el cual las neuronas adquieren sus fenotipos
neurotransmisores.
Una línea emergente de evidencias es que desde
las fases tempranas del desarrollo, el tubo neural y las vesículas
del cerebro son diseñados por una expresión espacial y temporal de
un cierto número de proteínas nucleares y segregadas^{58,59}.
Esta evidencia es consistente con la hipótesis de que el
neuroepitelio temprano está constituido por células precursoras
predeterminadas y que la organización cortical madura, por ejemplo,
deriva de una "proto-corteza"^{60}, temprana
predeterminada.
La idea del neuroepitelio prederminado, sin
embargo, está en contra con otras observaciones de estudios en
representación en mapa de destino in vivo y de estudios de
trasplante^{5,61-63}. Una conclusión principal de
estos experimentos es que determinadas poblaciones de precursores
son multipotenciales y/o ampliamente plásticas con respecto a los
linajes neuronales frente a los gliales, así como los fenotipos
neuronales tales como fenotipos neurotransmisores y el destino
laminar o regional. Con el fin de reconciliar estos dos conjuntos
de observaciones aparentemente contradictorias, deben abordarse
varios asuntos principales. ¿Qué es la capacidad de diferenciación
de la célula precursora que da directamente origen a neuronas
terminalmente diferenciadas? ¿Qué información, si es que hay
alguna, contiene la célula precursora con respecto al fenotipo
específico de las neuronas?.
Para contestar a estas cuestiones, los autores
de la invención han aislado con éxito del neuroepitelio temprano de
rata células precursoras multipotenciales, células madre del SNC, y
han examinado cuantitativamente su capacidad de diferenciación
in vitro^{64} (véanse también los Ejemplos
1-3, 5 y 6). Bajo condiciones constitutivas sin
influencia exógena, clones de células madre del SNC se diferenciaban
en los tres tipos principales de células - neuronas, astrocitos y
oligodendrocitos. En presencia de factores extracelulares sencillos,
sin embargo, su elección de destino podía dirigirse hacia tipos de
células sencillos. Además, células madre multipotenciales de este
tipo eran con mucho la mayoría de poblaciones expandibles en
cultivo, lo que sugiere que eran abundantes en el neuroepitelio.
Estas propiedades se han compartido también por células madre del
SNC procedentes del cerebro fetal humano. Así, estas son las
propiedades definitorias de células madre del SNC de mamíferos que
constituyen la mayor parte del SNC embrionario y son los precursores
directos a las neuronas del cerebro adulto.
Entonces, ¿qué es la capacidad de desarrollo de
células madre del SNC multipotenciales con respecto a fenotipos
neuronales? En este Ejemplo, los autores de la invención examinaron
el grado de información incorporada en las células madre del SNC
aisladas para guiar una diferenciación terminal y una maduración de
neuronas y para la generación de subpoblaciones específicas de
neuronas. Los autores de la invención encontraron que a pesar de
que las células madre del SNC están ampliamente distribuidas en
grandes números por todo el neuroepitelio y son igualmente
multipotenciales con respecto a los tres tipos principales de
células, las células madre del SNC derivadas de una región distinta
dan origen a fenotipos neuronales apropiados solamente para esa
región. Concluyeron que la información que especifica los fenotipos
neuronales específicos para la región está presente en el estado de
célula madre multipotencial, que esta información es establemente
heredada a través de muchas divisiones celulares in vitro y
que, cuando se diferencia bajo condiciones constitutivas en ausencia
de influencia externa, las células madre del SNC no son
equivalentes y cada una da origen a conjuntos sólo restringidos de
neuronas apropiados para la región de la que se originaban las
células madre del SNC.
En los Ejemplos 1-3, 5 y 6, los
autores de la invención limitaron la diferenciación de clones de
células madre del SNC solamente al instante más temprano de la
maduración en el que los tres fenotipos celulares, es decir
neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, podían ser tomados como
muestras sin topar con la muerte significativa de la célula. Por lo
tanto, la diferenciación neuronal estaba limitada solamente a las
fases tempranas de diferenciación. Los autores de la invención
decidieron examinar en que medida neuronas derivadas de células
madre del SNC podían diferenciarse in vitro bajo condiciones
constitutivas, es decir en medio exento de suero, mínimo definido
en ausencia de factores exógenos.
La diferenciación neuronal abarca muchas fases
distintas de la maduración celular. Una de las características
iniciales que se esperan de una neurona funcional es la polarización
de una neurona en distintos compartimientos, es decir soma,
dendrita y axón. Los autores de la invención examinaron diversas
condiciones de cultivo definidas para fomentar la diferenciación de
clones de células madre del SNC multipotenciales en neuronas
polarizadas. Bajo condiciones clonales encontraron que la
supervivencia neuronal está también limitada para permitir la
caracterización sistemática de fenotipos tardíos de diferenciación
neuronal. De manera interesante, la adición de diversos factores
neurotróficos comercialmente disponibles, que incluyen familias de
NGF y FGF no podía superar esta barrera.
Sin embargo, al aumentar simplemente la densidad
celular de células madre del SNC en diferenciación era suficiente
para una supervivencia eficaz neuronal, y neuronas polarizadas con
una morfología madura podían obtenerse de forma reproducible al
cabo de 14-21 días en medio N2 en ausencia de
glutamato y de cualesquiera otros factores exógenos. Aunque no es
esencial, la suplementación ocasional del cultivo con factor
neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) facilitaba generalmente de
manera adicional la supervivencia neuronal a largo plazo y, por lo
tanto, se utilizaba en este Ejemplo.
Específicamente, células madre del SNC se
aislaron y expandieron en condiciones definidas tal como se describe
previamente antes en los Ejemplos 1-3, 5 y 6.
Diferentes neuronas se derivaron aislando células madre del SNC de
diferentes regiones del sistema nervioso central y de diferentes
fases del desarrollo del SNC. Las condiciones de diferenciación
para obtener todos los fenotipos neuronales eran idénticas y las
diferentes neuronas se derivaban solamente de permitir la expresión
de información inherente ya incorporada en las células madre del
SNC expandidas.
Más específicamente, en el último ciclo
mitótico, la diferenciación fue manifiestamente desencadenada por
la retirada del mitógeno, por ejemplo bFGF, reemplazando el medio
exento de mitógeno por medio de crecimiento. Al mismo tiempo, o
algunos días más tarde sin ninguna consecuencia diferencial, las
células se recolectaron mediante tripsinización y centrifugación de
acuerdo con procesos convencionales. La tripsina fue inactivada
añadiendo inhibidor de tripsina. El sedimento de células resultante
se resuspendió en el mismo medio de crecimiento N2 sin bFGF ni
ningún otro factor y se extendió en placas a una alta densidad de
células, óptimamente a 125.000 células por centímetro cuadrado,
sobre placas de cultivo de tejido pre-revestidas con
poli-L-ornitina (15 \mug/ml) y
fibronectina (1 \mug/ml) o laminina (1 \mug/ml). Dos a cuatro
días más tarde, el medio N2 fue reemplazado por medio N2 sin ácido
glutámico. La alta densidad de células era necesaria para una
diferenciación neuronal eficaz, y la ausencia de ácido glutámico
era necesaria para permitir una supervivencia a largo plazo de
neuronas maduras.
Las neuronas se mantuvieron durante largos
períodos (hasta 30 días) bajo estas condiciones, cambiando el medio
cada 3-4 días. La suplementación del medio con 20
ng/ml de BDNF humano recombinante facilitó adicionalmente la
supervivencia y maduración neuronales. Al cabo de
12-30 días de diferenciación, las células se fijaron
con paraformaldehído al 4% y los fenotipos neuronales se
identificaron mediante inmunocitoquímica frente a proteínas
marcadoras.
Con el fin de demostrar directamente que las
neuronas maduras y diversos subtipos de neuronas en cultivo se
producían directamente a partir de las células madre del SNC
mitóticas, las células madre del SNC procedentes de diversas
regiones del cerebro embrionario (véase más abajo para los
ejemplos), que habían sido expandidas in vitro durante largo
tiempo (aproximadamente 16 días y 16 divisiones celulares a lo largo
de 4 pases) fueron manifiestamente diferenciadas durante un total
de 21 días tal como se describe arriba. Las células madre del SNC
mitóticas se marcaron por impulsos con bromodesoxiuridina (BrdU)
durante las últimas 24 a 48 horas antes de la diferenciación. Desde
todas las regiones, hasta el 86% de neuronas
MAP2ab-positivas también eran positivas para BrdU.
Hacia las 24 horas del marcaje con BrdU, aproximadamente el 50%-75%
de las neuronas, imnunopositivas para los antígenos específicos
para diferentes subtipos neuronales, también eran positivas para
BrdU. Antes de la etapa de diferenciación manifiesta, no se
observaron neuronas que expresaran MAP2ab ni ningún otro antígeno
específico para el subtipo en ninguno de los cultivos de células
madre del SNC. Así, consistente con los ejemplos previos (Ejemplos
1-8) todas las neuronas y subtipos neuronales que se
reseñan más abajo se produjeron exclusivamente a partir de células
madre del SNC mitóticas y expandidas durante largo tiempo.
Las neuronas, así obtenidas, contenían una
localización distinta de proteínas dendríticas tales como MAP2ab
procedentes de proteínas axonales tales como tau, neurofilamentos y
varias proteínas de la vesícula sináptica. En la fig. 9 se muestran
neuronas típicas derivadas de células madre del hipocampo
embrionario de rata. Las neuronas maduras fueron inmunoteñidas tres
veces con anticuerpos contra BrdU (fig. 9A), MAP2ab (fig. 9B) y
sinapsina (fig. 9C). En la fig. 9D se muestra la tinción
combinada.
Las figuras 9E y F muestran otro ejemplo típico
de neuronas derivadas de células madre del hipocampo teñidas dos
veces para la sinaptofisina (fig. 9E), una proteína de la vesícula
sináptica que marca terminales del axón, y MAP2ab (Fig. 9C) que
marca el proceso dendrítico. Estos resultados de inmunotinción
demuestran la polarización de neuronas en axones y dendritas y
sugiere significativamente numerosas uniones sinápticas. Un examen
adicional de estas morfologías mediante microscopía electrónica
confirmó la abundante presencia de sinapsis que contenían vesículas
sinápticas y densidades sinápticas (fig. 10).
Estas redes neuronales también eran
electrofisiológicamente funcionales. Conducían potenciales de acción
(fig. 11A), contenían diversos canales de iones sensibles a la
tensión (fig. 11B) y transmitían potenciales excitatorios e
inhibitorios post-sinápticos cuando eran provocados
por aplicación en baño del neurotransmisor excitatorio, glutamato
(figs. 11C y D). Así, estos resultados demuestran inequívocamente
que la totalidad de la información necesaria y suficiente para
formar neuronas maduras y sinaptogenésis a partir del estado
mitótico está autocontenida y es estable dentro de las células
madre del SNC expandidas durante largo tiempo.
Células madre del SNC expandidas durante largo
tiempo, derivadas de varias regiones diferentes del neuroepitelio,
dieron origen a distintas subpoblaciones de neuronas. Así, células
madre del SNC se aislaron a partir de varias regiones diferentes
del SNC embrionario de rata en los instantes en los que se sabía que
se encontraban en el comienzo o a la mitad de la neurogénesis -
corteza (CTX), septum (SEP), eminencia gangliónica lateral (LG -
siglas en inglés), eminencia gangliónica media (MGE - siglas en
inglés), hipocampo en el día de gestación embrionaria 15,5 (E
15,5), tálamo, hipotálamo E13.5, mesencéfalo ventral y dorsal E12.5
y médulas espinales E11.5-E13.5. A partir de cada
una de estas regiones, cultivos casi homogéneos de células madre del
SNC se podían expandir durante largo tiempo (típicamente durante 16
días con un tiempo de duplicación medio de 24 horas) de acuerdo con
las condiciones de cultivo descritas previamente^{64}.
Las propiedades generales de las células madre
del SNC en expansión tales como morfología, velocidad mitótica y
características de diferenciación, no se podían distinguir entre
diferentes regiones, incluido el hipocampo que ha sido descrito
antes en detalle^{64}. En el análisis clonal, cada una de estas
regiones contiene muchos clones de células madre del SNC con una
capacidad multipotencial de diferenciarse en neuronas, astrocitos y
oligodendrocitos en proporciones relativas idénticas a los clones de
células madre del hipocampo previamente detallados^{64}.
La cuestión precisa es entonces si sólo hay un
tipo de célula madre que constituye todo el neuroepitelio y que la
especificación regional y la diversidad neuronal se producen en
etapas subsiguientes de desarrollo, o si las células madre del SNC
en la etapa multipotencial contienen la información para fenotipos
neuronales regionalmente distintos.
Las eminencias gangliónicas lateral y media son
dos estructuras estrechamente adyacentes que se desarrollan en
paralelo formando el cuerpo estriado y el globo pálido en el cerebro
adulto. Receptores de dopamina, D1 y D2 se expresan en el cuerpo
estriado, pero D2 solamente está presente en el pálido. La expresión
de receptores D1 y D2 procedentes de células madre del SNC aisladas
a partir de las eminencias gangliónicas lateral y media E16 fue
examinada por RT-PCR (fig. 12). Antes de la
diferenciación, las células madre del SNC procedentes de cualquier
región no expresaban receptores de dopamina. Después de 9 días de
diferenciación, los receptores D1 y D2 fueron expresados en células
madre derivadas de la LGE, pero solamente el receptor D2 se
expresaba en células procedentes de la MGE. Este modelo de
diferenciación era estable a lo largo del transcurso de la
diferenciación durante 21 días del examen (fig. 12).
Neuronas colinérgicas del septum han sido
críticamente atribuidas al brote de la enfermedad de Alzheimer.
Estas neuronas aparecen durante E15-E18 en ratas.
Células madre del SNC derivadas del septum E16 se diferenciaron
durante 18-21 días bajo las condiciones definidas
según se describen anteriormente, y la presencia de neuronas
colinérgicas fue confirmada mediante histoquímica de acetilcolina
transferasa y mediante inmunotinción para la acetilcolina
transferasa y para el transportador de acetilcolina vesicular. La
figura 13 A muestra una neurona colinérgica derivada de células
madre del SNC septal, inmunoteñida para la acetilcolina transferasa.
La figura 13B muestra el mismo campo de visión que la fig. 13A,
teñido para el marcador mitótico BrdU. Las figuras 13C y D muestran
otro ejemplo de una neurona colinérgica teñida dos veces para el
transportador vesicular de acetilcolina y BrdU,
respectivamente.
La Tabla VII resume el número de neuronas
MAP2ab-positivas por centímetro cuadrado y las
proporciones de diferentes fenotipos neuronales con relación a las
neuronas MAP2ab positivas totales derivadas de células madre del SNC
de varias regiones y edades diferentes. Aproximadamente
4-5% de las neuronas MAP2-positivas
eran colinérgicas. En contraposición, las células madre del SNC del
hipocampo y cortical no dieron origen a neuronas colinérgicas.
Aproximadamente 0,4% de neuronas derivadas de
células madre del SNC de las LGE y MGE también expresaban el
transportador vesicular de acetilcolina, un marcador específico de
neuronas colinérgicas (Tabla VII). Aproximadamente 2,8% a 10,7% de
neuronas derivadas de las LGE y MGE contenían varios neuropéptidos
diferentes, tales como neuropéptido Y,
met-encefalina y leu-encefalina
(fig. 14; Tabla VII). Las figuras 14A, C y D muestran neuronas
derivadas de células madre del SNC de la LGE típicas teñidas para el
neuropéptido Y, met-encefalina y
leu-encefalina, respectivamente. Las figuras 14B, D
y F muestran la inmunotinción para BrdU de los mismos campos que en
las figs. 14A, C y E, respetivamente.
Cuando se diferenciaban células madre del SNC
expandidas del mesencéfalo ventral E12.5, aproximadamente 2,6 \pm
0,3% de neuronas MAP2-positivas expresaban tirosina
hidroxilasa, la enzima clave para la síntesis de dopamina y un
marcador bien establecido de neuronas dopaminérgicas (Tabla VII). La
figura 15A muestra una neurona TH-positiva derivada
de células madre del SNC típica y la figura 15B muestra la
correspondiente tinción con BrdU del mismo campo. Todas las células
TH-positivas son neuronas como se muestra por la
doble tinción para TH y MAP2ab (figs. 15C y D, respectivamente). La
mayoría de las neuronas restantes eran positivas para el marcador
de neurogas GABAérgicas, ácido glutámico descarboxilasa (GAF) asi
como para la propia GABA (fig. 15E) y/o para acetilcolina esterasa
(fig. 15F; Tabla VII) que se sabe es expresada en neuronas
monoaminérgicas en este área.
En contraposición, células madre del SNC
derivadas del mesencéfalo dorsal no generaban neuronas
TH-positivas (Tabla VII). Casi todas las neuronas
de este área (100,9 \pm 9,1%) expresaban acetilcolina esterasa
(Tabla VII). Lo más probable es que sean neuronas monoaminérgicas,
consistentes con el modelo in vivo. De manera significativa,
no surgían neuronas TH-positivas procedentes de
células madre del SNC derivadas de la corteza, septum, hipocampo,
cuerpo estriado y médula espinal (Tabla VII). Así, en paralelo con
el modelo de expresión in vivo conocido, la generación de
neuronas TH-positivas era única para las células
madre del SNC del mesencéfalo ventral in vitro.
Células madre del SNC procedentes de la zona
cervical y médulas espinales torácicas E13.5 se expandieron y
diferenciaron. 1,2 \pm 0,1% de neuronas
MAP2-positivas eran colinérgicas que contenían
transportador vesicular de acetilcolina (Tabla VII). Las neuronas
colinérgicas que también expresan acetilcolina transferasa y son
BrdU-positivas se muestran en las figuras 16C y D,
respectivamente. 39,3 \pm 2,5% de las neuronas expresaba
acetilcolina esterasa (Tabla VII), la mayoría de las cuales se
espera que sean monoaminérgicas. Una neurona
acetilcolinaesterasa-positiva y
BrdU-positiva típica se muestra en las figuras 16A y
B, respectivamente.
Neuronas derivadas de células madre del SNC del
hipocampo y de la corteza E15.5 no expresaban tirosina hidroxilasa,
acetilcolina esterasa, acetilcolina transferasa ni transportador
vesicular de acetilcolina (Tabla VII). Esto es apropiado para la
conocida ausencia de estos marcadores en el hipocampo in
vivo. Aproximadamente el 30% de neuronas
MAP2ab-positivas eran GABAérgicas, indicado por la
expresión de GAD y GABA. Las figuras 17A y B muestran ejemplos
típicos de la tinción GAD- y GABA-positiva,
respectivamente, que se solapan por completo. En las figuras 17C y
D, respectivamente, se muestra una neurona calretinina- y
MAP2ab-positiva del hipocampo típica.
Neuronas maduras también se pueden derivar con
una eficacia igual a partir del tálamo e hipotálamo E13.5. Estas
neuronas contienen excepcionalmente largos procesos axonales. Una
neurona talámica típica, teñida para la proteína axonal, tau, y
BrdU se muestra en las figuras 18A y B, respectivamente. Una neurona
hipotalámica típica teñida para tau y BrdU se muestra en las
figuras 18C y D, respectivamente. La tinción con sinapsina de
neuronas talámicas e hipotalámicas se muestra en las figuras 18E y
F, respectivamente.
Los ejemplos dados anteriormente, se han
seleccionado en base a poblaciones solamente bien establecidas in
vivo en la bibliografía y también en base a marcadores bien
definidos, comercialmente disponibles. En la Tabla VII se muestra
un resumen de las proporciones de diferentes fenotipos neuronales
procedentes de diversas células de madre del SNC regionales. Estos
ejemplos son sólo una parte de la diversidad neuronal presente en
cultivos derivados de células madre del SNC.
En resumen, estos resultados demuestran de forma
concluyente que distintas subpoblaciones de neuronas se generan en
cultivo a partir de células madre del SNC expandidas, y que los
tipos de neuronas generadas quedan restringidos de una manera
específica para la región que corresponde a aproximadamente a los
modelos de expresión in vivo. La información que especifica
el fenotipo neuronal está, por lo tanto, embutida en el estado de
célula madre multipotencial. Además de ello, esta información
especificativa es congénitamente estable a lo largo de muchas
divisiones celulares y queda establecida durante el subsiguiente
proceso de diferenciación. Estos resultados demuestran directamente
que el neuroepitelio de mamíferos está, de hecho, dividido en un
modelo en mosaico de diferentes tipos de células madre del SNC
multipotenciales con información hereditaria restringida que
especifica fenotipos neuronales en ausencia de cualesquiera otras
interacciones. Así, todos los subtipos neuronales encontrados en el
cerebro maduro de mamíferos pueden ser generados in vitro
mediante una diferenciación apropiada de células madre del SNC.
Estas neuronas y las células madre del SNC
capaces de diferenciarse en neuronas de este tipo proporciona el
elemento clave para la terapia génica, la terapia celular y la
identificación de nuevas moléculas terapéuticas (proteínas,
péptidos, ADN, oligonucleótidos, compuestos orgánicos sintéticos y
naturales) dirigidos a trastornos del sistema nervioso.
El comportamiento de las células madre in
vitro proporciona importantes conocimientos sobre el desarrollo
del SNC. Una proliferación eficaz y una diferenciación controlada de
las células precursoras permitía un análisis cuantitativo de su
capacidad de desarrollo. Estas células exhiben propiedades que son
esperadas de células madre: rápida proliferación,
multipotencialidad y auto-regeneración. Además de
ello, las células procedentes del cerebro adulto eran
cuantitativamente equivalentes a las células embrionarias, indicando
que las células madre persisten en el adulto.
Las células multipotenciales podían aislarse
eficazmente a partir de muchas regiones del SNC en desarrollo,
indicando que son abundantes por todo el neuroepitelio. Esto
contrasta con la noción ampliamente mantenida de que las células
madre son raras. La diferenciación de las células madre se puede
dirigir eficazmente mediante factores extracelulares que se sabe
están presentes durante el desarrollo del
SNC^{16-23}. Esto sugiere que diferentes factores
extracelulares pueden actuar sobre una sola clase de células madre
para generar diferentes tipos de células. Un mecanismo instructivo
similar también ha sido observado in vitro con células madre
aisladas del sistema nervioso periférico^{24}.
Múltiples tipos de células aparecen rápidamente
cuando las células madre se diferencian in vitro. En
contraposición, neuronas, astrocitos y oligodendrocitos aparecen en
distintos instantes in vivo. Claramente, mecanismos
adicionales deben regular la elección del destino in vivo. La
expresión temporal y espacial de factores extracelulares y sus
receptores puede ser una parte del mecanismo.
Otro mecanismo de regulación de la elección del
destino in vivo puede implicar etapas intermedias de
diferenciación. La identificación de la célula precursora de
oligodendrocitos bipotencial, O-2A, a partir del
nervio óptico post-natal demostró directamente que
durante el desarrollo se producen progenitores
restringidos^{25,26}. Las células madre son distintas de las
células O-2A. Sus orígenes, propiedades y
capacidades de desarrollo difieren. Dando por hecho que las células
madre se diferencian en oligodendrocitos, la vía de diferenciación
puede implicar una fase intermedia obligatorio, un estado progenitor
comprometido tal como la célula O-2A. Las
respuestas similares de las dos células a T3 y CNTF^{27,28}, puede
reflejar esta etapa común.
Existe también evidencia del análisis del linaje
in vivo e in vitro en cuanto a la presencia de otras
restricciones del linaje, incluidos precursores neuronales y de
oligodendrocitos bipotenciales y progenitores neuronales
comprometi-
dos^{6,7,29,30}. Estos también pueden surgir de la diferenciación de células madre. El ensayo clonal descrito en esta memoria permitirá definir cuantitativamente las contribuciones relativas de compromiso de linaje frente a factores instructivos y selectivos en estas células intermedias.
dos^{6,7,29,30}. Estos también pueden surgir de la diferenciación de células madre. El ensayo clonal descrito en esta memoria permitirá definir cuantitativamente las contribuciones relativas de compromiso de linaje frente a factores instructivos y selectivos en estas células intermedias.
En resumen, la presente solicitud revela
que:
(1) se puede hacer que la mayoría de las
regiones del cerebro y de la médula espinal fetales puedan
multiplicarse en cultivo bajo condiciones de cultivo completamente
definidas para proporcionar hasta un incremento de 1.000.000.000 de
veces en el número de células;
(2) el cultivo de células madre homogéneo puede
ser excitado para diferenciarse bajo condiciones controladas con
precisión, en las que hasta el 50% de las células se diferencian en
neuronas, mientras que las células restantes se convierten en
astrocitos y oligodendrocitos;
(3) muchos tipos diferentes de neuronas se
generan en cultivo;
(4) se han identificado factores de crecimiento
que dirigen eficazmente las células madre a diferenciarse en un
sólo tipo de célula, es decir neurona, astrocito u oligodendrocito;
y
(5) se han aislado y expandido células madre
equivalentes a partir de la capa subependimal de adultos utilizando
un proceso similar.
Estos resultados enumerados proporcionan las
siguientes ventajas frente al estado actual de la técnica. En
primer lugar, esta tecnología de células madre del SNC permite un
cultivo a gran escala de células madre homogéneas en un estado no
diferenciado. Cuanto más tiempo se puedan mantener las células en el
estado de célula madre, tanto mayor será el rendimiento de neuronas
que se pueden derivar del cultivo, permitiendo con ello una
transferencia más eficaz de genes y una selección a gran escala de
esas células que portan el gen de interés.
En segundo lugar, este sistema de cultivo
permite una diferenciación controlada de las células madre, en donde
el 50% de las células expandidas se convierte ahora en neuronas.
Esta eficaz diferenciación, combinada con una eficaz proliferación,
proporciona rutinariamente más de 100 millones de neuronas a partir
de la neocorteza de un cerebro fetal de rata en un período de dos
semanas.
En tercer lugar, la diferenciación de las
células madre en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos se produce
constitutivamente, en donde los tres tipos de células continúan
madurando en cultivo, lo más probablemente debido a interacciones
de nutrición unos con otros, tal como durante el desarrollo normal
del cerebro. Surgen muchos tipos diferentes de neuronas, que
responden a muchos factores de crecimiento y que contienen
neurotransmisores y sus receptores. Así, una parte importante del
desarrollo del cerebro puede ser recapitulada en un entorno
manipulable, destacando con ello el potencial de extraer y someter a
ensayo nuevos factores neurotrópicos normalmente secretados por
estas células.
Finalmente, estos resultados permiten el
establecimiento de condiciones mediante las cuales neuronas
inmaduras en división se pueden derivar directamente de las células
madre y se pueden expandir adicionalmente para permitir un
aislamiento a gran escala de tipos específicos de neuronas en
cultivo.
La tecnología de células madre de la presente
invención se puede desarrollar para la aplicación directa a muchos
aspectos diferentes del descubrimiento de terapia y de fármacos para
trastornos del sistema nervioso. En lo que sigue se esbozan cuatro
ejemplos para aplicaciones comerciales potenciales, es decir la
terapia génica para la enfermedad de Parkinson, la terapia celular,
la investigación de nuevos factores de crecimiento y ensayos para
el rastreo de fárma-
cos.
cos.
Las células madre del SNC cumplen de sobra los
criterios técnicos como vehículos para las terapias génicas y las
terapias celulares en general. Las células madre se pueden expandir
rápidamente bajo condiciones controladas con precisión y
reproducibles. Además, estas células son fácilmente accesibles a
todos los protocolos de transferencia de genes estándares tales
como a través de tratamiento con retrovirus, adenovirus, liposomas y
fosfato de calcio, así como subsiguientes protocolos de selección y
expansión. Las células madre expandidas se diferencian eficazmente
en neuronas en masa.
Además, debe enfatizarse que dos propiedades
adicionales de las células madre las hacen únicas como la base
fundamental del desarrollo terapéutico dirigido al sistema nervioso
en seres humanos. En primer lugar, una vez que las células madre
son obligadas a diferenciarse en tipos de células maduras, la
totalidad de las interacciones moleculares se encuentran dispuestas
en el sistema de cultivo para generar, madurar y sobrevivir una
diversidad de diferentes tipos de células y subtipos neuronales.
Estas interacciones recapitulan una parte importante del proceso
natural de desarrollo del cerebro. Por lo tanto, las células madre,
en calidad de vehículos de la terapia génica y de la terapia
celular, no sólo reestablecen un gen o factor potencial sencillo a
suministrar, sino también toda la infraestructura para la
regeneración del nervio.
En segundo lugar, las células madre en cultivo
se expanden a partir de los precursores germinales multipotenciales
del desarrollo normal del cerebro. Por lo tanto, estas células madre
conservan la capacidad de convertirse no solamente en tres tipos de
células diferentes, sino también en muchos diferentes tipos de
neuronas en función de los entornos medioambientales a los que
están expuestos. Esta amplia plasticidad, que es la propiedad
inherente de las células madre, sugiere de manera precisa que, una
vez trasplantadas, las células pueden conservar la capacidad de
conformarse en muchas regiones diferentes del cerebro del hospedante
y de diferenciarse en neuronas específicas para esa región
particular del hospedante. Estas propiedades intrínsecas de las
células madre primarias son bastante diferentes de las líneas
celulares tumorigénicas existentes, en las que una cierta
diferenciación neuronal puede ser inducida bajo condiciones
artificiales. Por lo tanto, con estas propiedades únicas, células
madre del SNC humano expandible contienen un importante potencial
comercial por sí mismas, con un pequeño desarrollo adicional.
La enfermedad de Parkinson resulta
principalmente de la degeneración de neuronas liberadoras de
dopamina en la sustancia negra del cerebro y el agotamiento
resultante del neurotransmisor de dopamina en el cuerpo estriado.
La causa de esta degeneración es desconocida, pero los síntomas de
degenaración motrices de la enfermedad pueden aliviarse
administrando periféricamente el precursor de dopamina,
L-dopa, en el brote temprano de la enfermedad. A
medida que la enfermedad continúa empeorando, L-dopa
ya no es eficaz y, actualmente, no hay disponible ningún
tratamiento adicional. Un tratamiento prometedor que se está
desarrollando consiste en trasplantar neuronas de la sustancia
negra ricas en dopamina procedentes del cerebro del feto en el
cuerpo estriado del cerebro del paciente. Resultados obtenidos de
diversos centros clínicos se muestran extremadamente optimistas.
Sin embargo, se estima que se necesitan hasta 10 cerebros fetales
con el fin de obtener células suficientes para una operación de
trasplante. Este requisito hace inviable la amplia aplicación del
trasplante de neuronas primarias como realidad terapéutica. Este es
exactamente el tipo de problema resuelto por la tecnología de
células madre del SNC de la presente solicitud, en la que un pequeño
número de células puede ser expandido en cultivo hasta
1.000.000.000 de veces.
Se reconoce ahora ampliamente que el trasplante
de células productoras de dopamina es la terapia más prometedora de
la enfermedad de Parkinson grave y que para una terapia eficaz es
esencial una población estable de células o una línea de células
tratada genéticamente para producir dopamina. Tirosina hidroxilasa
(TH) es la enzima clave para la síntesis de dopamina. Se pueden
producir células madre del SNC humanas derivadas de ganglios
basales fetales que expresen el gen tirosina hidroxilasa (TH). Estas
células se pueden expandir, diferenciar y trasplantar en el cuerpo
estriado del paciente. Dado que las células se derivan originalmente
del cuerpo estriado primordial, tendrán la mejor opción de
integrarse en esta región del cerebro. La producción de células de
este tipo y su trasplante con éxito en modelos de animales dará como
resultado la aplicación más prometedora de la terapia génica hasta
la fecha.
En la mayoría de las enfermedades neurológicas,
a diferencia de la enfermedad de Parkinson, la causa de los
síntomas no puede ser atribuida a un sólo factor. Esta condición
hace ineficaz el enfoque terapéutico de introducir un único gen
mediante terapia génica. Más bien, se requerirá la sustitución del
complejo neuronal del hospedante por células sanas. Dado que las
células madre del SNC son las células germinales naturales del
cerebro en desarrollo, la capacidad de convertirse en células del
cerebro maduro, las células madre procedentes de la médula espinal
y diferentes regiones del cerebro se pueden utilizar directamente
para repoblar nervios degenerados en diversas neuropatías.
Se están desarrollando varias líneas de células
madre específicas que sobreexpresan diversos factores de
crecimiento, que están actualmente en ensayos clínicos. Esta
aplicación combina la plasticidad única de las células madre y la
terapia génica mediada por el factor de crecimiento para
proporcionar no solamente el beneficio del suministro dirigido de
la proteína, sino también una regeneración neuronal amplia en zonas
específicas.
Ejemplos primarios de factores de crecimiento
actualmente en ensayos clínicos o bajo desarrollo completo por
diversas compañías se listan más abajo en la Tabla VI^{31}. Hasta
la fecha, ensayos de factores de crecimiento han quedado limitados
a dirigir la inyección periférica de grandes dosis, lo que conlleva
riesgos importantes de efectos secundarios, ya que la mayoría de
los factores de crecimiento afectan a muchas poblaciones diferentes
de neuronas y de tejidos no neurales y con una semivida corta. Estos
problemas se pueden superar generando a partir de células madre del
SNC varias poblaciones de células o líneas de células que expresen
establemente estos factores de crecimiento y que demuestren su
capacidad de diferenciarse en neuronas y de segregar los factores
de crecimiento en regiones periféricas y centrales específicas.
Uno de los principios centrales de la
neurobiología moderna es que cada una de las neuronas de mayor
proyección, si no todas la neuronas, requieren señales específicas
(factores tróficos) para alcanzar sus células diana y sobrevivir.
Las neuropatías en muchas enfermedades pueden ser provocadas por o
pueden implicar una carencia de factores de crecimiento de este
tipo. Estos factores de crecimiento representan la siguiente
generación de fármacos preventivos y terapéuticos para trastornos
del sistema nervioso y, por lo tanto, el enorme capital invertido
en la investigación de nuevos factores de crecimiento por parte de
la industria biotecnológica.
Implícito en la observación de que una
diversidad de neuronas maduras pueden ser producidas a partir del
cultivo de células madre del SNC es que diversos factores de
crecimiento son segregados por las células en fase de
diferenciación para la determinación de tipos de célula, maduración
y el soporte continuado de su supervivencia y que las células
contienen la maquinaria receptora necesaria para responder a esos
factores de crecimiento y, probablemente, a otros. La mayoría de
los factores de crecimiento actualmente conocidos en el sistema
nervioso se descubrieron por sus efectos sobre los nervios
periféricos y, lo más probablemente, representan una fracción muy
pequeña de factores de crecimiento existentes en el cerebro.
La investigación de factores de crecimiento del
cerebro ha sido difícil, principalmente debido a que tipos de
células neuronales particulares son difíciles de aislar del cerebro
y de mantenerlos en condiciones de cultivo definidas. La
diferenciación de las células madre en neuronas supera este problema
y abre nuevos ensayos para rastrear factores de crecimiento
potenciales.
Dado que se están identificando cada vez más
receptores neurotransmisores y proteínas transductoras de señales a
partir del cerebro, está resultando claro que el dogma de un
neurotransmisor que activa un receptor es una suprasimplificación.
La mayoría de los complejos receptores de neuronas están
constituidos por subunidades de proteínas codificadas por varios
genes, y cada gen sintetiza muchas variaciones diferentes de la
proteína. Estas variaciones resultan en una amplia gama de posibles
combinaciones de receptores y no un solo receptor, que pueden
interactuar con un neurotransmisor. Por consiguiente, se puede
producir una gama de salida de señales por parte de una sola acción
de neurotransmisor. La señal específica efectuada por un
neurotransmisor en una neurona depende entonces de qué complejo
receptor es producido por la célula. Así, la diversidad celular debe
ir paralela con la diversidad molecular y constituir un elemento
estructural principal en el que se basa la complejidad de la
función del cerebro.
El descubrimiento de fármacos por parte de la
farmacología tradicional ha sido realizado sin el conocimiento de
una complejidad de este tipo utilizando un homogeneizado de cerebro
completo y animales, y la mayoría de los análogos producidos de
neurotransmisores con amplias acciones y efectos secundarios. La
siguiente generación de fármacos farmacéuticos, con el propósito de
modificar funciones específicas del cerebro, se puede obtener
rastreando potenciales químicos contra neuronas que exhiben un
perfil específico de neurotransmisores, complejos receptores y
canales de iones.
\newpage
Células madre del SNC, expandidas y
diferenciadas en neuronas en cultivo expresan varios
neurotransmisores y complejos de receptores. Se pueden desarrollar
muchas líneas de células derivadas de células madre y progenitores
neuronales de diferentes regiones del cerebro que, cuando se
diferencian en neuronas maduras, exhibirían un perfil único de
complejos de neurotransmisor y receptor. Líneas de células
neuronales de este tipo serían herramientas valiosas para diseñar y
rastrear fármacos potenciales.
En resumen, la tecnología de células madre del
SNC de esta solicitud ofrece amplios e importantes potenciales para
tratar trastornos del sistema nervioso.
A lo largo de esta solicitud se han citado los
siguientes artículos científicos.
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69. Feldman, D.H., Thinschmidt,
J.S., Peel, A.L., Papke, R.L. y Reier, P.J.,
Exp. Neurology 140, 206-217
(1996).
Mientras que la invención ha sido descrita en
relación con lo que actualmente se considera son las realizaciones
más prácticas y preferidas, ha de entenderse que la invención no
está limitada a las realizaciones descritas.
\vskip1.000000\baselineskip
Clones de células precursoras
del hipocampo
embrionario
\newpage
Subclones procedentes de clones
de células precursoras del hipocampo
embronario
\newpage
Clones de células subependimales
de
adulto
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Leyendas de la Tabla
VII
^{1} Los números para los diferentes fenotipos
nuronales se dan como el porcentaje de neuronas
MAP2ab-positivas por centímetro cuadrado para cada
región. MAP2ab, proteína a y b asociada a microtúbulos; TH,
tirosina hidroxilasa; AchE, aceticolina esterasa; VAT,
transportador de acetilcolina vesicular; ChAT, colina acetil
transferasa; GAD, ácido glutámico descarboxilasa; NPY, neuropéptido
Y; L-Enk, leu- encefalina; M-Enk,
met-encefalina.
^{2} Regiones de las que se derivaron células
madre del SNC. SEPT, septum 15.5; LGE, eminencia gangliónica
lateral E15.5; MGE, eminencia gangliónica media 15.5; HI, hipocampo
E15.5; VM, mesencéfalo ventral E12.5; DM, mesencéfalo dorsal
E12.5; SPC, médula espinal E13.5.
^{3} Se muestra el número medio de células
MAP2ab-positivas por centímetro cuadrado. Los
números iniciales de células extendidas en placa para todas las
regiones era de 125.000 células por centímetro cuadrado \pm
error medio estándar.
Claims (12)
-
\global\parskip0.970000\baselineskip
1. Un método para la expansión y cultivo in vitro de células madre del sistema nervioso central de un mamífero, en el que las células madre conservan la capacidad multipotencial de diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, que comprende las etapas de:a) disociar células procedentes de tejido del sistema nervioso central mediante trituración mecánica en ausencia de cationes divalentes;b) cultivar las células disociadas adheridas a una placa en un medio de cultivo exento de suero;c) extender en placas células disociadas a una densidad que no exceda de 20.000 células/cm^{2} y, en pasos subsiguientes, volver a extender en placas las células cultivadas a una densidad que no exceda de 10.000 células/cm^{2};d) añadir diariamente a las células de cultivo un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en- i)
- bFGF a una concentración de al menos 10 ng/ml,
- ii)
- EGF a una concentración de al menos 10 ng/ml,
- iii)
- TGF-alfa a una concentración de al menos 10 mg/ml, y
- iv)
- aFGF a una concentración de al menos 10 ng/ml más 1 \mug/ml de heparina;
e) hacer pasar las células cultivadas en el espacio de cuatro días después de la extensión en placa, de modo que no exceda de una confluencia del 50%; yf) hacer pasar las células cultivadas tratando las células cultivadas con solución salina. - 2. Un cultivo de adhesión in vitro de células madre del sistema nervioso central de un mamífero, en donde el cultivo se puede obtener por el método de la reivindicación 1, y en donde las células madrea) expresan nestina;b) conservan la capacidad multipotencial de diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos; yc) se diferencian tras la retirada de mitógeno.
- 3. Un método para la diferenciación de un cultivo in vitro de células madre del sistema nervioso central de un mamífero, en el que las células madre conservan la capacidad multipotencial de diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, que comprende las etapas de:a) disociar células procedentes de tejido del sistema nervioso central mediante trituración mecánica en ausencia de cationes divalentes;b) cultivar las células disociadas adheridas a una placa en un medio de cultivo exento de suero;c) extender en placas células disociadas a una densidad que no exceda de 20.000 células/cm^{2} y, en pasos subsiguientes, volver a extender en placas las células cultivadas a una densidad que no exceda de 10.000 células/cm^{2};d) añadir diariamente a las células cultivadas un primer factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en
- i)
- bFGF a una concentración de al menos 10 ng/ml,
- ii)
- EGF a una concentración de al menos 10 ng/ml,
- iii)
- TGF-alfa a una concentración de al menos 10 mg/ml, y
- iv)
- aFGF a una concentración de al menos 10 ng/ml más 1 \mug/ml de heparina;
e) se hacen pasar las células cultivadas en el espacio de cuatro días después de la extensión en placa, de modo que no exceda de una confluencia del 50%;f) se hacen pasar las células cultivadas tratando las células cultivadas con solución salina; yg) separar el primer factor de crecimiento de las células cultivadas, en donde dicha separación da como resultado la diferenciación de las células cultivadas en neuronas, astrocitos y/u oligodendrocitos. - 4. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el que en la etapa (b), el medio de cultivo se define químicamente, el medio de cultivo se reemplaza por medio reciente cada dos días y en el que en la etapa (f) la solución salina está exenta de cationes divalentes y las células se raspan de la placa.
- 5. El método o cultivo in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la células madre se derivan de tejido del sistema nervioso central de un ser humano.
- 6. El método o cultivo in vitro de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las células madre se derivan del tejido del sistema nervioso central de un feto no humano.
- 7. El método o cultivo in vitro de la reivindicación 5, en el que las células madre se derivan de tejido del sistema nervioso central de un adulto.
- 8. El método o cultivo in vitro de las reivindicaciones 5, 6 ó 7, en el que las células madre se derivan de tejido del sistema nervioso central seleccionado del grupo que consiste en hipocampo, corteza cerebral, cuerpo estriado, septum, diencéfalo, mesencéfalo, cerebelo y médula espinal.
- 9. El cultivo in vitro de la reivindicación 2, en el que las células madre se diferencian en neuronas maduras que exhiben:a) una polaridad axón-dendrita,b) terminales sinápticos, yc) localización de proteínas implicadas en la sinaptogénesis y la actividad sináptica, que incluyen
- i)
- receptores de neurotransmisores,
- ii)
- transportadores, y
- iii)
- enzimas de procesamiento.
- 10. El cultivo in vitro de la reivindicación 2, en el que las células madre conservan su capacidad de generar subtipos de neuronas con diferencias moleculares entre los subtipos.
- 11. El método de la reivindicación 3, que comprende, además, añadir un segundo factor de crecimiento a las células cultivadas después de separar el primer factor de crecimiento de las células cultivadas, en el que el segundo factor de crecimiento es diferente del primer factor de crecimiento.
- 12. El método de la reivindicación 11, en el que el segundo factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor neurotrópico ciliar (CNTF), factor inhibidor de leucemia (LIF) y hormona tiroides, yodotironina (T3).
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