ES2284524T3

ES2284524T3 - Moleculas de acidos nucleicos procedentes de plantas, que codifican enzimas, las cuales participan en la sintesis de almidon.

Info

Publication number: ES2284524T3
Application number: ES00958396T
Authority: ES
Inventors: Claus Frohberg
Original assignee: Bayer CropScience AG
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 1999-08-11
Filing date: 2000-08-08
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2020-08-08
Also published as: DE19937348A1; WO2001012826A3; US6590141B1; AU6993700A; EP1200615B8; BR0013115A; WO2001012826A2; EP1200615B1; CA2378173A1; CN1378600A; DE50014279D1; ATE360700T1; CA2378173C; AU780737B2; JP2003507020A; EP1200615A2

Abstract

Molécula de ácido nucleico que codifica una proteína con la actividad biológica de una sintasa de almidón, escogida entre el conjunto que se compone de

Description

Moléculas de ácidos nucleicos procedentes de plantas, que codifican enzimas, las cuales participan en la síntesis de almidón.

El presente invento se refiere a moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una enzima, la cual participa en la síntesis de almidón en plantas. En el caso de esta enzima se trata de una nueva isoforma de la sintasa de almidón.

Además, este invento se refiere a vectores, así como a células anfitrionas transformadas con las moléculas de ácidos nucleicos o los vectores que se describen, en particular a células vegetales y a plantas regenerables a partir de éstas.

Por añadidura, se describen procedimientos para la producción de células vegetales y plantas transgénicas, las cuales a causa de la introducción de moléculas de ADN, que codifican una sintasa de almidón, sintetizan un almidón modificado en cuanto a sus propiedades. El presente invento se refiere también al almidón obtenible a partir de las células vegetales y plantas conformes al invento, así como a procedimientos para la producción de este almidón.

En atención a la importancia creciente, que se atribuye en los últimos tiempos a las sustancias constituyentes vegetales como fuentes renovables de materias primas, una de las misiones de la investigación biotecnológica es la de esforzarse en una adaptación de estas materias primas vegetales a los requisitos de la industria elaboradora. Con el fin de hacer posible una utilización de materias primas renovables en el mayor número posible de sectores de empleo, es necesario, además de esto, conseguir una gran diversidad de sustancias.

Junto a los aceites, las grasas y las proteínas, los polisacáridos constituyen las esenciales materias primas renovables procedentes de plantas. Una posición central primordial en el caso de los polisacáridos la ocupa, junto a la celulosa, el almidón, que es una las sustancias almacenadas más importantes en plantas superiores. En este caso el maíz, es una de las plantas más interesantes, ya que es mundialmente la planta de cultivo más importante para la producción de almidón.

El polisacárido almidón es un polímero a base de eslabones fundamentales químicamente uniformes, a saber las moléculas de glucosa. Sin embargo, en este caso, se trata de una mezcla muy compleja de diferentes formas moleculares, que se diferencian en lo que se refiere a su grado de polimerización y a la aparición de ramificaciones de las cadenas de glucosa. Por lo tanto, un almidón no constituye ninguna materia prima uniforme. Se establece diferencia en particular, del almidón de amilosa, que es un polímero esencialmente no ramificado, a base de moléculas de glucosa unidas por enlaces \alpha-1,4-glicosídicos, con respecto al almidón de amilopectina, que por su parte constituye una mezcla compleja a base de cadenas de glucosa ramificadas de manera diversa. Las ramificaciones se establecen en este caso por medio de la aparición de uniones por enlaces \alpha-1,6-glicosídicos adicionales. En las plantas típicas utilizadas para la producción de almidón, tales como p.ej. maíz o patata, el almidón sintetizado se compone en aproximadamente un 20%-25% de almidón de amilosa y en aproximadamente un 75%-80% de almidón de amilopectina.

Para hacer posible una utilización lo más amplia que sea posible de un almidón, se manifiesta como deseable poner a disposición plantas, que estén en situación de sintetizar un almidón modificado, que se adecue especialmente para diferentes finalidades de utilización. Una posibilidad, de poner a disposición tales plantas, consiste -junto a las medidas de cultivación- en la modificación genética deliberada del metabolismo de almidón que presentan las plantas productoras de almidón, mediante métodos de tecnología genética. Son premisa para ello, no obstante, la identificación y la caracterización de las enzimas que participan en la síntesis y/o la modificación del almidón, así como el aislamiento de las correspondientes moléculas de ADN, que codifican estas enzimas. Las vías de síntesis bioquímicas, que conducen a la formación de un almidón, son esencialmente conocidas. La síntesis de almidón en células vegetales tiene lugar en los plastidios. En tejidos activos fotosintéticamente, éstos son los cloroplastos, y en tejidos inactivos fotosintéticamente, que almacenan almidón, éstos son los amiloplastos.

Las más importantes enzimas que participan en la síntesis de almidón, son las sintasas de almidón así como las enzimas ramificadoras. En el caso de las sintasas de almidón, se han descrito ya diversas isoformas, todas las cuales catalizan una reacción de polimerización por transferencia de un resto de glucosilo desde la ADP-glucosa a los \alpha-1,4-glucanos.

Las enzimas ramificadoras catalizan la introducción de ramificaciones \alpha-1,6 en \alpha-1,4-glucanos lineales.

Las sintasas de almidón se pueden subdividir en dos clases: las sintasas de almidón fijadas a granos de almidón (del inglés "granule-bond starch synthases"; GBSS), y las sintasas de almidón solubles (del inglés "soluble starch synthases"; SS). Esta diferenciación no se puede realizar de manera inequívoca en cualquier caso, puesto que algunas de las sintasas de almidón se presentan tanto en una forma fijada a granos de almidón como también en una forma soluble (Denyer y colaboradores, Plant J. 4 (1993), 191-198; Mu y colaboradores, Plant J. 6 (1994), 151-159).

Basándose en comparaciones de secuencias de ADNc y de aminoácidos, para plantas de maíz se han descrito hasta ahora, junto a la clase de las sintasas de almidón fijadas a granos de almidón, GBSSI, dentro de la clase de las sintasas solubles, por su parte, por lo menos tres isoformas diferentes.

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A la isoforma I de la sintasa de almidón (= SSI) pertenecen unos genes, que en maíz codifican una proteína zSSI de aproximadamente 76 kDa (Mu y colaboradores, Plant J. 6 (1994), 151-159), y que hasta ahora sólo se han descrito para plantas monocotiledóneas, tales como p.ej. para arroz (Baba y colaboradores, Plant Physiol. 103, (1993), 565-573), y son expresadas predominantemente en el endospermo. Estas proteínas son estimuladas, por regla general, por un citrato y son independientes de las denominadas moléculas de cebadores.

En contraposición a ello, las sintasas de almidón de la isoforma II (= SSII) son por regla general dependientes de moléculas de cebadores y muestran la homología más alta entre secuencias con respecto a las isoformas SSII, que en el pasado se habían designado parcialmente como GBSSII, procedentes de guisantes (Dry y colaboradores, Plant J. 2, (1992), 193-202) y de patatas (Edwards y colaboradores, Plant J 8, (1995), 283-294).

Al considerar la SSII procedente de maíz se tiene que diferenciar entre los genes o respectivamente ADNc's, que en la bibliografía son designados como zSSIIa y zSSIIb (Ham y colaboradores, Plant Mol. Biol. 37, (1998), 639-649; Imparl-Radosevich, Arch. Biochem. Biophys. 362, (1999), 131-138), y la denominada proteína SSII, una proteína de aproximadamente 180 kDa (el peso molecular se determina mediante filtración en gel (Mu y colaboradores, Plant J. 6, (1994), 151-159) procedente del endospermo de maíz, cuyo nombre está basado en investigaciones bioquímicas más tempranas (Boyer y Preiss, Plant Physiol. 67, (1981), 1.141-1.145; Mu y colaboradores, Plant J. 6, (1994), 151-159). Hasta hoy en día no se ha esclarecido todavía definitivamente la cuestión acerca de qué gen corresponde realmente a esta proteína de 180 kDa (Imparl-Radosevich, Arch. Biochem. Biophys. 362, (1999), 131-138). Cao y colaboradores (Plant Physiol. 120, (1999), 205-215), proponen al denominado gen du1 como el gen que corresponde a la proteína de 180 kDa.

La tercera clase descrita hasta ahora de genes de sintasas de almidón, que se designan como SSIII, codifican en patatas una proteína de 139 kDa (Abel y colaboradores, Plant J. 10, (1996), 981-991; Marshall y colaboradores, Plant Cell 8, (1996), 1.121-1.135), que constituye en tubérculos de patatas un 80% de la actividad de la sintasa de almidón. A causa de la alta conservación de determinadas regiones de la secuencia del terminal de C en comparación con la secuencia de aminoácidos de SSIII de patata, para el gen designado originalmente como gen du1, procedente de maíz, se propuso el cambio de nombre al de zSSIII (Cao y colaboradores, Plant Physiol. 120, (1999), 205-215), designando el prefijo "z" al organismo original Zea mays.

Solamente para la isoforma GBSS I se consiguió hasta ahora determinar la función exacta en el caso de una síntesis de almidón. Las plantas, en las que esta actividad enzimática se ha reducido grandemente o por completo, sintetizan un almidón exento de amilosa (el denominado en inglés "waxy" = "ceroso") (Shure y colaboradores, Cell 35 (1983), 225-233; Visser y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289-296; y el documento de solicitud de patente internacional WO 92/11376), de tal manera que a esta enzima se le atribuye un cometido decisivo en el caso de la síntesis del almidón de amilosa. Este fenómeno se observa asimismo en células de la alga verde Chlamydomonas reinhardtii (Delrue y colaboradores, J. Bacteriol. 174 (1992), 3.612-3.620). En el caso de la Chlamydomonas se pudo mostrar, además de esto, que la GBSS I no solamente participa en la síntesis de la amilosa, sino que posee también una influencia sobre la síntesis de las amilopectinas. En mutantes, que no tienen ninguna actividad de GBSS I, falta una determinada fracción de la amilopectina sintetizada normalmente, que tiene glucanos de cadenas más largas.

Las funciones de las isoformas de las sintasas de almidón solubles no se han puesto en claro hasta ahora. Se supone que las sintasas de almidón solubles participan, en común con enzimas ramificadoras, en la síntesis de la amilopectina (véase p.ej. Ponstein y colaboradores, Plant Physiol. 92 (1990), 234-241), y que ellas desempeñan una función importante en el caso de la regulación del régimen de síntesis de almidón.

Aparte de en el caso del maíz, se identificaron sintasas de almidón solubles también en una serie de otras especies de plantas. Se han aislado, por ejemplo hasta la homogeneidad, sintasas de almidón solubles, procedentes de guisantes (Denyer y Smith, Planta 186 (1992), 609-617) y de patatas (Edwards y colaboradores, Plant J. 8 (1995), 283-294). En estos casos, se puso de manifiesto que la isoforma, identificada como SS II, de la sintasa de almidón soluble, es idéntica a la sintasa de almidón fijada a granos de almidón GBSS II (Denyer y colaboradores, Plant J. 4 (1993), 191-198 (Edwards y colaboradores, Plant J. 8 (1995), 283-294). Para algunas otras especies de plantas se describió, con ayuda de métodos cromatográficos, la presencia de varias isoformas de SS, por ejemplo en el caso de cebada (Tyynelä y Schulman, Physiologia Plantarum 89 (1993) 835-841; Kreis, Planta 148 (1980), 412-416), y en el caso de trigo (Rijven, Plant Physiol. 81 (1986), 448-453). Se describieron asimismo secuencias de ADN, que codifican estas proteínas, (véase, por ejemplo, el Nº de acceso U48227 al GenBank; Vrinten y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 261 (3), (1999), 463-471).

A fin de poner a disposición otra posibilidades adicionales para modificar plantas arbitrarias, que almacenan almidón, en el sentido de que ellas sinteticen un almidón modificado, es necesario identificar en cada caso secuencias de ADN, que codifican otras isoformas de las sintasas de almidón.

El presente invento está basado, por consiguiente, en la misión de poner a disposición moléculas de ácidos nucleicos, que codifiquen enzimas que participen en la biosíntesis de almidón, y con cuya ayuda sea posible producir plantas modificadas por tecnología genética, que presenten una actividad aumentada o disminuida de estas enzimas, con lo que se llegue a una modificación de las propiedades químicas y/o físicas del almidón sintetizado en estas plantas, y que éste sea, por lo tanto, mejor adecuado para finalidades de utilización generales y/o especiales.

El problema planteado por esta misión se resuelve mediante la puesta a disposición de las formas de realización reseñadas en las reivindicaciones de esta patente.

El presente invento se refiere, por consiguiente, a moléculas de ácidos nucleicos, que codifican proteínas con la actividad biológica de una sintasa de almidón, o un fragmento biológicamente activo de una de tales proteínas, codificando tales moléculas preferiblemente unas proteínas con la secuencia de aminoácidos indicada bajo la Seq ID No. 2.

En particular, el invento se refiere a unas moléculas de ácidos nucleicos, que contienen la secuencia de nucleótidos indicada bajo la Seq ID No. 1 o una parte de ésta, de manera preferida a unas moléculas que comprenden la región codificadora indicada en la Seq ID No. 1 o respectivamente correspondientes secuencias de ribonucleótidos.

El invento se refiere también a moléculas de ácidos nucleicos, que tienen una secuencia, que es complementaria con respecto a la secuencia total o a una parte de la secuencia representada bajo la Seq ID No. 1.

Objeto del invento son asimismo unas moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una sintasa de almidón o un fragmento biológicamente activo de ésta y/o cuya secuencia, a causa de la degeneración del código genético, se desvía de las secuencias de nucleótidos de las moléculas antes descritas.

Además, el presente invento se refiere a moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una sintasa de almidón o un fragmento biológicamente activo de ésta, y que se hibridan con una de las moléculas antes descritas.

En los casos de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento se puede tratar de moléculas tanto de ADN como también de ARN. Unas correspondientes moléculas de ADN son, por ejemplo, moléculas genómicas o moléculas de ADNc (cromosomal). Las moléculas de ARN pueden ser, por ejemplo, moléculas de ARNm (mensajero) o de ARN antisentido.

El presente invento se refiere, por lo tanto, también a secuencias de nucleótidos de intrones, que están contenidos en unas secuencias genómicas, que se corresponden con las secuencias de ADNc indicadas bajo la Seq ID No. 1. El aislamiento y la identificación de las correspondientes secuencias de intrones se puede realizar, por ejemplo, mediando utilización de las moléculas de ácidos nucleicos indicadas bajo la Seq ID No. 1, por ejemplo mediante escrutinio de una biblioteca de ADN genómico.

El concepto de "hibridación" significa, en el marco de este invento, una hibridación en condiciones convencionales de hibridación, de manera preferida en condiciones rigurosas, (tal como se describen, por ejemplo, en la obra de Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Clonación molecular, un manual de laboratorio], 2ª edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). De manera especialmente preferida, "hibridación" significa que aparece una hibridación bajo las siguientes condiciones:

Tampón de hibridación:: 2 x SSC: 10 x solución de Denhardt (Fikoll 400 + PEG + BSA; relación 1:1:1); 0,1% de SDS, EDTA 5 mM, Na_{2}HPO_{4} 50 mM; 250 \mug/ml de ADN de esperma de arenque; 50 \mug/ml de ARNt; ó tampón fosfato de sodio 0,25 M, de pH 7,2; EDTA 1 mM, 7% de SDS

Temperatura de hibridación: T = 65 hasta 68ºC

Tampón de lavado:: 0,2 x SSC; 0,1% de SDS

Temperatura de lavado: T = 40 hasta 68ºC.

Las moléculas de ácidos nucleicos, que se hibridan con las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, pueden proceder en principio de cualquier organismo arbitrario (es decir de procariotas o eucariotas, en particular de bacterias, hongos, algas, plantas u organismos animales), que posea tales moléculas. Ellas proceden preferiblemente de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, en particular de plantas útiles, y de manera especialmente preferida de plantas que almacenan almidón, en particular de maíz.

Las moléculas de ácidos nucleicos, que se hibridan con las moléculas conformes al invento, se pueden aislar p.ej. a partir de bibliotecas genómicas o a partir de bibliotecas de ADNc de diferentes organismos. Alternativamente, ellas se pueden preparar por medio de métodos de tecnología genética o mediante una síntesis química.

La identificación y el aislamiento de tales moléculas de ácidos nucleicos, a partir de plantas o de otros organismos, se puede efectuar en este caso mediando utilización de las moléculas conformes al invento o de partes de estas moléculas o respectivamente de los complementos inversos de estas moléculas, p.ej. mediante hibridación de acuerdo con procedimientos clásicos (véase p.ej. también la obra de Sambrook y colaboradores 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Como sonda de hibridación se pueden utilizar p.ej. moléculas de ácidos nucleicos, que tienen exactamente, o en lo esencial, la secuencia de nucleótidos indicada bajo la Seq ID No. 1, o partes de esta secuencia. En el caso de los fragmentos utilizados como sonda de hibridación, puede tratarse también de fragmentos de ADN sintéticos, que se habían producido con ayuda de las técnicas corrientes de síntesis de ADN, y cuya secuencia coincide en lo esencial con la de una molécula de ácido nucleico conforme al invento. Si se han identificado y aislado unos genes, que se hibridan con las secuencias conformes al invento, se necesitan una determinación de la secuencia y un análisis de las propiedades de las proteínas codificadas por esta secuencia.

Además, el invento se refiere al plásmido IR 65/87, que se ha depositado el 5 de agosto de 1999 bajo el número DSM 12970 en la Colección Alemana de Microorganismos, Brunswick, Alemania (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen, Braunschweig, Deutschland), así como la molécula de ácido nucleico que está contenida en la inserción del plásmido IR 65/87, la cual codifica una proteína con la actividad enzimática de una sintasa de almidón. Además de esto, el presente invento se refiere a fragmentos de la molécula de ácido nucleico que está contenida en la inserción del plásmido IR 65/87, preferiblemente a fragmentos, que comprenden la región codificadora o una parte de ésta. Además, el presente invento se refiere también a moléculas de ácidos nucleicos, que se hibridan con la molécula de ácido nucleico que está contenida en la inserción del plásmido IR 65/87, así como a moléculas de ácidos nucleicos que tienen una secuencia, que es complementaria con respecto a la inserción total, o a una parte de ésta, de la molécula de ácido nucleico que está contenida en el plásmido IR 65/87. Además de esto, el invento se refiere a moléculas de ácidos nucleicos, cuya secuencia de nucleótidos, en comparación con las moléculas de ácidos nucleicos de la inserción del plásmido IR 65/87, se desvía de ella a causa de la degeneración del código genético.

El presente invento se refiere también a fragmentos y a variantes alélicas de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento antes descritas.

Por fragmentos se entienden en este caso partes de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, que codifican una proteína conforme al invento o ciertas partes de esta proteína y que, por regla general, son oligo- o polinucleótidos, que se componen de aproximadamente 25 a 150, preferiblemente de por lo menos 150, de manera especialmente preferida de por lo menos 500, en particular de por lo menos 1.000 y de manera especialmente preferida de por lo menos 3.500 nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento.

Por el concepto de "fragmento" se entiende en este contexto una parte de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, que codifica una parte de la proteína descrita y que es funcionalmente activa. Además, el fragmento puede codificar también un ARNm antisentido o puede estar contenido en una molécula, que confiere un efecto de cosupresión o un efecto de mutagénesis in vivo. "Funcionalmente activa" significa en este contexto, que la actividad biológica de la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico conforme al invento en una célula vegetal conforme al invento, es o bien aumentada o reducida.

En los casos de las variantes alélicas se puede tratar tanto de variantes que se presentan en la naturaleza, como también de variantes preparadas sintéticamente o producidas mediante técnicas de ADN recombinantes.

El invento se refiere también a derivados de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, antes descritas. La expresión "derivado" significa en este contexto, que las secuencias de estas moléculas se diferencian en una o varias posiciones de las secuencias de las moléculas de ácidos nucleicos antes descritas, y que tienen un alto grado de homología con respecto a estas secuencias, en particular con respecto a la región codificadora de la secuencia de nucleótidos indicada bajo la SEQ ID No. 1. "Homología" significa en este caso una identidad entre secuencias de por lo menos 50%, en particular una identidad de por lo menos 70%, de modo preferido de más que 85% y de modo especialmente preferido de más que 95%. Las desviaciones con respecto a las moléculas de ácidos nucleicos anteriormente descritas pueden haber resultado en este caso por deleción (supresión), sustitución, inserción o recombinación.

El concepto de "homología" significa dentro del marco del presente invento que existe una equivalencia funcional y/o estructural entre las correspondientes moléculas de ácidos nucleicos, o entre las proteínas codificadas por ellas. En los casos de las moléculas de ácidos nucleicos, que son homólogas con respecto a las moléculas anteriormente descritas y que constituyen derivados de estas moléculas, se trata por regla general de variaciones de estas moléculas, que constituyen unas modificaciones, que ejercen la misma función biológica. En este caso, se puede tratar tanto de variaciones, que aparecen de una manera natural, por ejemplo de secuencias procedentes de otros organismos, como de mutaciones, pudiendo estas mutaciones haber aparecido de una manera natural o haber sido introducidas mediante una mutagénesis deliberada.

Las proteínas codificadas por las diferentes variantes (fragmentos, derivados, variantes alélicas) de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento presentan determinadas características comunes con la secuencia de aminoácidos definida bajo la Seq ID No 2. A éstas pertenecen p.ej. la actividad enzimática, el peso molecular, la reactividad inmunológica, la conformación, etc., así como propiedades físicas, tales como p.ej. el comportamiento de movimiento en las electroforesis en gel, el comportamiento cromatográfico, los coeficientes de sedimentación, la solubilidad, las propiedades espectroscópicas, la estabilidad; el valor óptimo del pH, el valor óptimo de la temperatura, etc.

Características importantes de una sintasa de almidón son: i) su localización en el estroma de los plastidios de células vegetales; ii) su capacidad para la síntesis de poliglucanos unidos por enlaces en \alpha-1,4 mediando utilización de ADP-glucosa como substrato. Esta actividad puede ser determinada tal como se describió en Denyer y Smith (Planta 186 (1992), 606-617).

Las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento pueden proceder de un organismo pro- o eucariótico, que exprese los genes descritos, de manera preferida de plantas, en particular de plantas que sintetizan almidón o que respectivamente almacenan almidón. Éstas pueden ser plantas tanto monocotiledóneas como también dicotiledóneas. En este caso, se prefieren en particular p.ej. especies de cereales (tales como cebada, centeno, avena, trigo, etc.), maíz, arroz, guisante, mandioca, patata, etc.

En los casos de las proteínas codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento se trata de una isoforma, no identificada ni caracterizada hasta ahora, de una sintasa de almidón vegetal. Estas proteínas tienen la actividad enzimática de una sintasa de almidón y muestran en la región de los aminoácidos 740 hasta 1.170 de la secuencia de aminoácidos indicada bajo la Seq ID No. 2 una homología significativa con respecto a la SSIII procedente de patata (Marshall y colaboradores, Plant Cell 8, (1996), 1.121-1.135) y con respecto a la isoforma (du1) designada como zSSIII, procedente de maíz (Cao y colaboradores, Plant Physiol. 120, (1999), 205-215). Las proteínas codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento se diferencian de la SSIII procedente de patata y de la zSSIII procedente de maíz de una manera significativa por su terminal de N. Además, el punto isoeléctrico calculado de la proteína indicada bajo la SEQ ID No. 2 se diferencia significativamente de los puntos isoeléctricos calculados para la SSIII procedente de patata y para la zSSIII procedente de maíz. Además de esto, la proteína indicada bajo la SEQ ID No. 2 tiene, en comparación con la zSSIII (peso molecular calculado de aproximadamente 188 kDa), un peso molecular calculado, reducido de manera manifiesta, de aproximadamente 132 kDa. A diferencia de la zSSIII, los genes de la isoforma conforme al invento son expresados más intensamente en hojas jóvenes que en el endospermo.

El presente invento se refiere, por lo tanto, en una forma de realización adicional a las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento anteriormente descritas, que codifican unas proteínas con la actividad biológica de una sintasa de almidón, codificando tales moléculas preferiblemente unas proteínas, que en la región del terminal de N presentan una homología de por lo menos 50%, de manera preferida de por lo menos 65%, en particular de por lo menos 80% y de manera especialmente preferida de por lo menos 95% con la secuencia de aminoácidos indicada bajo la Seq ID No. 2. Por el concepto "terminal de N" se entienden en este contexto los aminoácidos 1 a 150, preferiblemente los aminoácidos 1 a 300 y de manera especialmente preferida los aminoácidos 1 a 480 de la secuencia aminoácidos indicada bajo la SEQ ID No. 2.

En una forma de realización adicional del invento, las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento codifican unas proteínas con la actividad biológica de una sintasa de almidón, codificando tales moléculas unas proteínas, que tienen un punto isoeléctrico calculado de pI = 6,95 pH \pm 1,00 pH, preferiblemente de pI = 6,95 pH \pm 0,75 pH, de manera especialmente preferida de pI = 6,95 pH \pm 0,50 pH.

En una forma de realización adicional, las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento codifican unas proteínas con la actividad biológica de una sintasa de almidón, que tienen por lo menos una deleción en por lo menos uno de los ocho motivos de secuencia, que son característicos para las sintasas de almidón, que han sido descritos por Cao y colaboradores (Plant Physiol. 120, (1999), 205-215). Preferiblemente, en el caso del motivo delecionado (suprimido) se trata del motivo designado por Cao y colaboradores (Plant Physiol. 120, (1999), 205-215) como motivo de secuencia VII. Por lo tanto, en una forma de realización adicional, las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento codifican proteínas con la actividad biológica de una sintasa de almidón, que tienen por lo menos una deleción en uno o varios de los motivos de secuencias VII, escogidos entre el conjunto que consiste en

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(compárese el motivo de secuencia VII como se define en Cao y colaboradores, Plant Physiol. 120, (1999), página 207, Tabla 1).

Son conocidos para un experto en la especialidad procedimientos para la identificación de dichos motivos de secuencias, y se pueden basar en comparaciones de secuencias de aminoácidos con los motivos de secuencias VII característicos, descritos por Cao y colaboradores (véase más arriba).

En otra forma de realización adicional preferida del invento, las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento codifican proteínas con la función de una sintasa de almidón, que tienen una deleción de por lo menos 2 aminoácidos, de manera especialmente preferida de por lo menos 5 aminoácidos, en particular de por lo menos 10 aminoácidos y de manera especialmente preferida de por lo menos 20 aminoácidos, en uno o varios de los motivos de acuerdo con las SEQ ID No. 3 hasta 29.

En otra forma de realización adicional especialmente preferida del invento, el mencionado motivo de secuencia VII de las proteínas codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, anteriormente descritas, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: (1)SH-AMRYG-(11), pudiendo estar ocupadas las posiciones 3, 4, 5 y 11 de este motivo por cualquier aminoácido arbitrario. En la SEQ ID No. 2, el motivo de secuencia VII comienza en el aminoácido 1.067 (= S) y termina en el aminoácido 1.077 (= S). De manera especialmente preferida, junto a la posición 3 se encuentra un aminoácido escogido entre el conjunto que consiste en T, L, M, Q ó R. Junto a la posición 4 se encuentra preferiblemente un aminoácido escogido entre el conjunto que consiste en I, L ó M. Junto a la posición 5 se encuentra preferiblemente un aminoácido escogido entre el conjunto que consiste en I, Y, M, T ó V. Junto a la posición 11 se encuentra preferiblemente un aminoácido escogido entre el conjunto que consiste en S, T, C ó A.

El presente invento se refiere también a la utilización de las moléculas de ácidos nucleicos antes descritas para el escrutinio de bibliotecas de ácidos nucleicos, en particular de bibliotecas de ADNc y genómicas, y/o como sonda de hibridación. Además de esto, el presente invento se refiere también a la utilización de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, antes descritas, para la producción de células vegetales transgénicas o de plantas transgénicas.

Además, el invento se refiere a vectores, en particular plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores habituales en la tecnología genética, que contienen las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, que se han descrito anteriormente.

En una forma de realización preferida, las moléculas de ácidos nucleicos, contenidas en los vectores, están unidas con elementos reguladores, que garantizan la transcripción y la síntesis de un ARN traducible en células procarióticas o eucarióticas, o en un sistema exento de células.

Elementos reguladores para la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento en microorganismos (p.ej. E.coli, S. cerevisiae) se han descrito suficientemente en la bibliografía. Promotores, que permiten una expresión particularmente fuerte del gen que está dispuesto detrás, son p.ej. el promotor de T7 (Studier y colaboradores, Methods in Enzymology 185, (1990), 60-89), lacuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer y colaboradores, en: Rodriguez y Chamberlin (compiladores), Promotors, Structure and Function [Promotores, estructura y función]; Praeger, Nueva York, (1982), 462-481; DeBoer y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25), Ip1, rac (Boros y colaboradores, Gene 42 (1986), 97-100). Por regla general, las cantidades de proteínas alcanzan su apogeo desde el centro hasta hacia el final de la fase logarítmica del ciclo de crecimiento de los microorganismos. Para la síntesis de proteínas se utilizan preferiblemente, por lo tanto, promotores inducibles. Éstos conducen con frecuencia a unos rendimientos más altos de una proteína que los promotores constitutivos. La utilización de promotores constitutivos fuertes conduce, a través de la transcripción y la traducción constantes de un gen clonado, con frecuencia, a que se pierda energía para otras funciones esenciales de las células, y con ello se decelere el crecimiento de las células (Bemard R. Glick/Jack J. Pasternak, Molekulare Biotechnologie [Biotecnología molecular] (1995), Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg Berlin Oxford, página 342). A fin de alcanzar un valor óptimo de la cantidad de proteínas, se aplica, por lo tanto, frecuentemente un procedimiento de dos etapas. Primeramente, las células anfitrionas se cultivan en unas condiciones óptimas hasta llegar a una densidad celular relativamente alta. En la segunda etapa se induce entonces la transcripción, según sea el tipo del promotor empleado. En este contexto es especialmente adecuado un promotor tac inducible por lactosa o por IPTG (= isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido) (deBoer y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25). Se han descrito asimismo en la bibliografía señales de terminación para la transcripción.

Ciertos elementos reguladores destinados a la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento en células vegetales, se describen en conexión con las células vegetales conformes al invento.

La expresión de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento en células procarióticas, por ejemplo en Escherichia coli, es importante por cuanto que de esta manera se hace posible una caracterización más exacta de las actividades enzimáticas de las enzimas, que son codificadas por estas moléculas. En particular, es posible caracterizar el producto, que es sintetizado por las correspondientes enzimas, en ausencia de otras enzimas, que participan en la síntesis de un almidón en una célula vegetal. Este hecho permite establecer conclusiones acerca de la función, que ejerce la correspondiente proteína en el caso de la síntesis de un almidón en una célula vegetal.

Además de esto, mediante técnicas de biología molecular habituales (véase p.ej. Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^{a} edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) es posible introducir diferentes mutaciones en las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, con lo que se llega a la síntesis de proteínas con unas propiedades biológicas eventualmente modificadas. En este caso, es posible, por una parte, la producción de mutantes por deleción, en las que, mediante deleciones progresivas desde el extremo 5' ó desde el extremo 3' de la secuencia de ADN codificadora, se producen unas moléculas de ácidos nucleicos, que conducen a la síntesis de unas proteínas acortadas de una manera correspondiente. Mediante tales deleciones junto al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos, es posible, por ejemplo, identificar unas secuencias de aminoácidos, que son responsables de la translocación de la enzima en los plastidios (péptidos de tránsito). Esto permite preparar de una manera deliberada unas enzimas, que, por eliminación de las correspondientes secuencias, ya no están localizadas en los plastidios, sino en el citosol, o que, por causa de la adición de otras secuencias de señal, están localizadas en otros compartimientos.

También es concebible el intercambio del péptido de tránsito propio por otro péptido de tránsito, que media en la localización en plastidios. Como secuencia de señal de plastidio se puede utilizar, por ejemplo, la de la ferrodoxina: NADP^{+}-oxidorreductasa (FNR) procedente de espinaca. Esta secuencia contiene la región no traducida en 5' así como la secuencia flanqueadora de péptido de tránsito del ADNc de la proteína de plastidio ferrodoxina: NADP^{+}-oxidorreductasa (FNR) procedente de espinaca (nucleótidos desde -171 hasta +165; Jansen y colaboradores, Current Genetics 13, (1988), 517-522).

Además, como secuencia de señal de plastidio se puede utilizar, por ejemplo, el péptido de tránsito de la proteína cerosa procedente de maíz, más los primeros 34 aminoácidos de la proteína cerosa madura (Klösgen y colaboradores, Mol Gen Genet. 217, (1989), 155-161). Además de esto, el péptido de tránsito de la proteína cerosa procedente de maíz (véase más arriba) se puede utilizar también sin los 34 primeros aminoácidos de la proteína cerosa madura.

Por otra parte, también es concebible la introducción de mutaciones puntuales en las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento en unas posiciones, en las que una modificación de la secuencia de aminoácidos tiene una influencia, por ejemplo, sobre la actividad enzimática o sobre la regulación de la enzima. De esta manera, se pueden producir, p.ej., unos mutantes, que poseen un valor de k_{cat} y/o K_{m} modificado, o que ya no están sometidos a los mecanismos de regulación presentes normalmente en la célula, a través de una regulación alostérica o de una modificación covalente.

Por lo demás, se pueden producir unos mutantes, que tienen una especificidad modificada para un substrato o para un producto, tales como p.ej. unos mutantes que, como substrato, utilizan ADP-glucosa-6-fosfato en vez de ADP-glucosa. Además, se pueden producir unos mutantes que tienen un perfil modificado de actividad y temperatura.

Para la manipulación por tecnología genética en células procarióticas, las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, o ciertas partes de estas moléculas, se pueden introducir en plásmidos, que permiten una mutagénesis o una modificación de secuencias mediante recombinación de secuencias de ADN. Con ayuda de procedimientos clásicos (compárese la obra de Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, EE.UU.) se pueden llevar a cabo intercambios de bases, o se pueden añadir secuencias naturales o sintéticas. Para la unión de los fragmentos de ADN unos con otros, se pueden adosar adaptadores o engarzadores a los fragmentos. Además, se pueden emplear unas manipulaciones, que ponen a disposición unos adecuados sitios de corte por restricción o que eliminan los ADN o sitios de corte por restricción superfluos. Allí donde entran en cuestión inserciones, deleciones o sustituciones, se pueden utilizar una mutagénesis in vitro, una reparación con cebadores (del inglés "primer repair"), una restricción o una ligación. Como métodos de análisis se llevan a cabo generalmente un análisis de las secuencias, un análisis por restricción y otros métodos bioquímicos y de biología molecular.

Además, el presente invento se refiere a vectores, que contienen las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, antes descritas, estando unidas las moléculas de ácidos nucleicos en una orientación en el mismo sentido con elementos reguladores, que garantizan la transcripción y la síntesis de un ARN traducible en células pro- o eucarióticas.

El significado del concepto de "orientación en el mismo sentido" es conocido para un experto en la especialidad.

En otra forma de realización, el invento se refiere a células anfitrionas, en particular a células procarióticas o eucarióticas, que han sido transformadas con una molécula de ácido nucleico conforme al invento, antes descrita, o con un vector conforme al invento, así como a células, que proceden de células transformadas de esta manera y contienen una molécula de ácido nucleico conforme al invento o un vector conforme al invento. En este caso, se trata de manera preferida de células bacterianas, de manera especialmente preferida de células vegetales.

Además, el presente invento se refiere a un procedimiento para la producción de una célula anfitriona, siendo modificada genéticamente una célula anfitriona por medio de la introducción de una molécula de ácido nucleico conforme al invento y/o de un vector conforme al invento. La célula anfitriona puede ser en este caso de origen tanto procariótico como también eucariótico. En este caso, se trata preferiblemente de células bacterianas, en particular de células vegetales.

El concepto de "modificada genéticamente" significa en este caso, en el contexto del presente invento, que la célula anfitriona, en particular una célula vegetal, ha sido modificada en su información genética por introducción de una molécula de ácido nucleico conforme al invento, y que la presencia o la expresión de la molécula de ácido nucleico conforme al invento conduce a una modificación fenotípica. Una modificación fenotípica significa en este caso, de manera preferida, una modificación medible de una o varias funciones de las células. Por ejemplo, células vegetales conformes al invento, modificadas genéticamente, muestran una disminución de la actividad de la proteína conforme al invento o un aumento de la activididad de la proteína conforme al invento.

Son objeto del invento, además, las proteínas o los fragmentos biológicamente activos de éstas, que se codifican por las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, así como ciertos procedimientos para su preparación, siendo cultivada una célula anfitriona conforme al invento en unas condiciones, que permiten la síntesis de la proteína, y siendo aislada a continuación la proteína a partir de las células cultivadas y/o a partir del medio de cultivo. Las propiedades características de las proteínas conformes al invento ya fueron descritas anteriormente en conexión con la descripción de las correspondientes moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento.

Mediante la puesta a disposición de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento es posible, por fin, con ayuda de métodos de tecnología genética, intervenir en el metabolismo del almidón de plantas, de una manera que no era posible hasta ahora, y modificarlo en el sentido de que se llegue a la síntesis de un almidón modificado, que esté modificado, por ejemplo, en sus propiedades físico-químicas, en particular en la relación de amilosa a amilopectina, en el grado de ramificación, en la longitud media de las cadenas, en el contenido de fosfatos, en el comportamiento de engrudado, en el tamaño de los granos de almidón y/o en la forma de los granos de almidón (morfología de los granos de almidón), en comparación con un almidón sintetizado en plantas de tipo salvaje. Mediante un aumento de la actividad de las proteínas conformes al invento, por ejemplo mediante sobreexpresión de correspondientes moléculas de ácidos nucleicos, o mediante la puesta a disposición de mutantes, que ya no están sometidos a los mecanismos de regulación propios de la célula, y/o que poseen unas diferentes dependencias respecto de la temperatura en lo que se refiere a su actividad, existe la posibilidad del aumento del rendimiento en plantas modificadas correspondientemente por tecnología genética.

La importancia económica de la posibilidad de la intervención en la síntesis de un almidón solamente en el caso del maíz es manifiesta: el maíz es mundialmente la planta más importante para la obtención de almidón. Aproximadamente un 80% del almidón producido anualmente en todo el mundo se obtiene a partir de maíz.

Por consiguiente, es posible la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento en células vegetales, con el fin de aumentar la actividad de la correspondiente sintasa de almidón. Además, es posible modificar las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento según métodos conocidos para un experto en la especialidad, con el fin de obtener unas sintasas de almidón conformes al invento, que ya no estén sometidas a los mecanismos de regulación propios de las células, o respectivamente que tengan unas dependencias modificadas de la temperatura o unas especificidades modificadas para substratos o respectivamente para productos.

En el caso de la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento en plantas, existe fundamentalmente la posibilidad de que la proteína sintetizada pueda estar localizada en cualquier compartimiento arbitrario de la célula vegetal. A fin de conseguir la localización en un determinado compartimiento, se tiene que suprimir (delecionar) la secuencia que garantiza la localización en plastidios y unir la región codificadora remanente eventualmente con secuencias de ADN, que garantizan la localización en el respectivo compartimiento. Tales secuencias son conocidas (véanse, por ejemplo, Braun y colaboradores, EMBO J. 11 (1992), 3.219-3.227; Wolter y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald y colaboradores, Plant J. 1 (1991), 95-106). Ejemplos de secuencias de señal en plastidios ya se han citado anteriormente en otro contexto.

El presente invento se refiere, por consiguiente, también a células vegetales transgénicas, que se habían transformado con una molécula de ácido nucleico conforme al invento o con un vector conforme al invento, así como a células vegetales transgénicas, que proceden de células transformadas de tal manera. Tales células contienen una molécula de ácido nucleico conforme al invento, estando unida ésta preferiblemente con unos elementos de ADN reguladores, que garantizan la transcripción en células vegetales, en particular con un promotor.

Para la introducción de un ADN en una célula anfitriona están a disposición un gran número de técnicas. Estas técnicas comprenden la transformación de células vegetales con un ADN T mediando utilización de Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, la transformación de protoplastos por medio de un poli(etilenglicol), la inyección, la electroporación de ADN, la introducción de los ADN mediante el enfoque biolístico, así como otras posibilidades.

La utilización de la transformación, mediada por agrobacterias, de células vegetales se ha investigado intensamente y se describe de una manera suficiente en el documento de solicitud de patente europea EP-A2-0120516; y en Hoekema, EN: The Binary Plant Vector System [El sistema binario de vectores de plantas] Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), capítulo V; Fraley y colaboradores, Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46 y An y colaboradores EMBO J. 4, (1985), 277-287. Acerca de la transformación de patatas, véase p.ej. Rocha-Sosa y colaboradores (EMBO J. 8, (1989), 29-33).

También se describió la transformación de plantas monocotiledóneas mediante vectores que se basan en Agrobacterium (Chan y colaboradores, Plant Mol. Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei y colaboradores, Plant J. 6, (1994) 271-282; Deng y colaboradores, Science in China 33, (1990), 28-34; Wilmink y colaboradores, Plant Cell Reports 11, (1992), 76-80; May y colaboradores, Bio/Technology 13, (1995), 486-492; Conner y Domisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie y colaboradores, Transgenic Res. 2, (1993), 252-265). Un sistema alternativo para la transformación de plantas monocotiledóneas es la transformación mediante el enfoque biolístico (Wan y Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasil y colaboradores, Bio/Technology 11 (1993), 1.553-1.558; Ritala y colaboradores, Plant Mol. Biol. 24, (1994), 317-325; Spencer y colaboradores, Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631), la transformación de protoplastos, la electroporación de células parcialmente permeabilizadas, la introducción de un ADN por medio de fibras de vidrio. En particular la transformación de maíz se describió múltiples veces en la bibliografía (compárense p.ej. los documentos WO 9506128A2, EP-A2-0513849, EP-A1-0465875, EP-A1-292435; y las citas de Fromm y colaboradores, Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon-Kamm y colaboradores, Plant Cell 2, (1990), 603-618; Koziel y colaboradores, Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc y colaboradores, Theor. Appl. Genet. 80, (1990), 721-726).

También se describió ya la transformación exitosa de otros tipos de cereales, p.ej. para cebada (Wan y Lemaux, véase más arriba; Ritala y colaboradores, véase más arriba; Krens y colaboradores, Nature 296, (1982), 72-74) y para trigo (Nehra y colaboradores, Plant J. 5, (1994), 285-297).

Elementos reguladores para la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento en células vegetales son, en principio, cualquier promotor, intensificador, terminador, etc., que sea activo en células vegetales. El promotor se puede escoger en este caso de tal manera que la expresión se efectúe constitutivamente en las plantas conformes al invento o solamente en un determinado tejido, en un momento determinado del desarrollo de las plantas o en un momento determinado por influencias externas. En lo que se refiere a la planta, el promotor puede ser homólogo o heterólogo. Promotores convenientes son p.ej. el promotor de ARN 35S del virus del mosaico de coliflor (en inglés "Cauliflower Mosaic Virus") (véase, por ejemplo, el documento US5352605) y el promotor de ubiquitina (véase, por ejemplo, el documento US 5614399) para una expresión constitutiva, el promotor del gen de patatina B33 (Rocha-Sosa y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 23-29) para una expresión específica para tubérculos en patatas, o un promotor que asegura una expresión solamente en tejidos que son activos para fotosíntesis, p.ej. el promotor ST-LS1 (Stockhaus y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7.943-7.947; Stockhaus y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 2.445-2.451), el promotor Ca/b (véanse, por ejemplo, los documentos US 5656496, US 5639952, y Bansal y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 3.654-3.658) y el promotor SSU de Rubisco (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.034.322, US 4.962.028). Sin embargo, se pueden utilizar también unos promotores, que solamente son activados en un momento determinado por influencias externas (véase, por ejemplo, el documento WO 9307279A1). En este caso pueden tener un interés especial los promotores de proteínas de choque térmico (en inglés "heat-schock"), que permiten una inducción sencilla. Además de esto, ciertos promotores específicos para semillas, tales como p.ej. el promotor USP procedente de Vicia faba, garantizan una expresión específica para semillas en Vicia faba y en otras plantas (Fiedler y colaboradores, Plant Mol. Biol. 22, (1993), 669-679; Bäumlein y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 225, (1991), 459-467). Además, se pueden emplear también promotores específicos para frutas, tales como p.ej. los que se describen en el documento WO9101373A1. De manera especialmente preferida se utilizan unos promotores para una expresión específica para el endospermo, tales como p.ej. el promotor de glutelina (Leisy y colaboradores, Plant Mol. Biol. 14, (1990),41-50; Zheng y colaboradores, Plant J. 4, (1993), 357-366), el promotor de HMG procedente de trigo, el promotor de USP, el promotor de faseolina o promotores de genes de zeína procedentes de maíz (Pedersen y colaboradores, Cell 29, (1982), 1.015-1.026; Quatroccio y colaboradores, Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93). Con ayuda de promotores específicos para el endospermo es posible aumentar la cantidad de transcritos de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento en el endospermo, en comparación con el endospermo de correspondientes plantas de tipo salvaje.

Se utiliza de manera especialmente preferida el promotor shrunken 1 (sh-1) procedente de maíz (Werr y colaboradores, EMBO J. 4, (1985), 1.373-1.380).

Además, puede estar presente una secuencia de terminación, que sirve para la terminación correcta de la transcripción, así como para la adición de una cola de poli-A junto al transcrito, a la que se atribuye una función en el caso de la estabilización de los transcritos. Tales elementos han sido descritos en la bibliografía (compárese p.ej. la cita de Gielen y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 23-29) y son intercambiables de una manera arbitraria.

Además de esto, con ayuda de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, es posible producir células vegetales y plantas, en las que esté disminuida la actividad de una proteína conforme al invento. Esto conduce a la síntesis de un almidón con unas propiedades químicas y físicas modificadas, en comparación con un almidón procedente de células vegetales de tipo salvaje.

Un objeto adicional del invento son, por consiguiente, también células vegetales transgénicas, en las que esté disminuida la actividad de una proteína conforme al invento en comparación con correspondientes células vegetales no modificadas genéticamente de plantas de tipo salvaje.

El concepto de "planta de tipo salvaje"/"célula vegetal de tipo salvaje" significa, en el contexto del presente invento, que se trata de unas plantas/células vegetales, que sirvieron como material de partida para la producción de las plantas/células vegetales conformes al invento, es decir cuya información genética, aparte de la modificación genética introducida, corresponde a la de una planta/célula vegetal conforme al invento.

La producción de células vegetales con una actividad disminuida de una proteína conforme al invento se puede conseguir, por ejemplo, mediante la expresión de un correspondiente ARN antisentido, o mediante la expresión de una ribozima construida correspondientemente, que disocia específicamente a unos transcritos, que codifican una de las proteínas conformes al invento. Además, la disminución de la actividad se puede conseguir mediante la introducción de aquellas moléculas de ADN, que a través de un efecto de cosupresión conducen a una disminución de la expresión de genes endógenos, que codifican una proteína conforme al invento. Por lo demás, la producción de células vegetales con una actividad disminuida de una proteína conforme al invento, se puede efectuar mediante una mutagénesis in vivo. En este caso, a través de una recombinación homológa, se pueden introducir mutaciones o inserciones en un gen endógeno que codifica la proteína conforme al invento. La mutación o inserción conduce a una disminución de la expresión del gen endógeno, que codifica una proteína conforme al invento, o a la síntesis de una proteína inactiva conforme al invento.

Preferiblemente, para la reducción de la actividad de una proteína de acuerdo con el invento en células vegetales, se expresa un ARN antisentido.

Para ello se pueden utilizar, por una parte, moléculas de ADN, que comprenden toda la secuencia que codifica una proteína de acuerdo con el invento, inclusive secuencias flanqueadoras eventualmente presentes, así como también moléculas de ADN, que comprenden solamente ciertas partes de la secuencia codificadora, teniendo estas partes que ser lo suficientemente largas, como para producir un efecto antisentido en las células. Por añadidura, se pueden utilizar también, no obstante, moléculas genómicas de ADN, que codifican por ejemplo un intrón. Por lo general, se pueden utilizar secuencias con hasta una longitud mínima de 15 pb (pares de bases), de manera preferida con una longitud de 100-500 pb, para conseguir una inhibición antisentido eficiente, en particular secuencias con una longitud de más que 500 pb. Por regla general, se utilizan unas moléculas de ADN que son más cortas que 5.000 pb, preferiblemente secuencias, que son más cortas que 2.500 pb. Se utilizan preferiblemente moléculas de ADN, que son homólogas en lo que se refiere a las especies de plantas que se han de transformar.

También es posible la utilización de unas secuencias de ADN, que presentan un alto grado de homología con respecto a las secuencias de las moléculas de ADN de acuerdo con el invento, pero que no son totalmente idénticas. La homología mínima debería ser mayor que aproximadamente 65%. Se ha de preferir la utilización de secuencias con unas homologías situadas entre 95 y 100%.

Alternativamente, la disminución de la actividad de la proteína conforme al invento en las células vegetales se puede efectuar también mediante un efecto de cosupresión. El procedimiento es conocido para un experto en la especialidad, y se describe, por ejemplo, en Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344), Niebel y colaboradores, (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103), Flavell y colaboradores (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43-46), Palaqui y Vaucheret (Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149-159), Vaucheret y colaboradores, (Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 311-317), de Borne y colaboradores (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613-621) y otras fuentes.

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Como en el caso de la tecnología antisentido antes descrita, también aquí se podrían utilizar tanto unas moléculas de ADN, que comprenden la región codificadora total de la molécula de ácido nucleico conforme al invento, como también unas moléculas de ADN, que solamente comprenden ciertas partes de la secuencia codificadora. Asimismo, es concebible la utilización de intrones.

La expresión de ribozimas para la disminución de la actividad de determinadas enzimas en células es conocida para un experto en la especialidad, y se describe, por ejemplo, en el documento de patente europea EP-B1-0321201. La expresión de ribozimas en células vegetales se describe p.ej. en Feyter y colaboradores (Mol. Gen. Genet. 250, (1996), 329-338).

Además, la disminución de la actividad de la molécula de ácido nucleico conforme al invento en las células vegetales se puede conseguir también mediante la denominada "mutagénesis in vivo", en la que mediante una transformación de células se introduce en células un oligonucleótido híbrido de ADN y ARN ("quimeroplasto") (Kipp, P.B. y colaboradores, Poster session [sesión de muestra en el ``5th International Congress of Plant Molecular Biology (5º Congreso Internacional de Biología Molecular de Plantas), 21-27 de septiembre de 1997, Singapur; R. A. Dixon y C.J. Amtzen, Informe de Congreso acerca de "Metabolic Engineering in Transgenic Plants" (Ingeniería metabólica en plantas transgénicas), Keystone Symposia, Copper Mountain, CO, USA, TIBTECH 15, (1997), 441-447; en la solicitud de patente internacional WO 9515972A1; Kren y colaboradores, Hepatology 25, (1997), 1.462-1.468; Cole-Strauss y colaboradores, Science 273, (1996), 1.386-1.389).

Una parte del componente de ADN del oligonucleótido de ARN y ADN es homóloga con respecto a una secuencia de ácido nucleico de un gen endógeno que codifica una molécula de ácido nucleico conforme al invento, pero tiene, en comparación con la secuencia de ácido nucleico del gen endógeno, una mutación, o contiene una región heteróloga, que está rodeada por las regiones homólogas. Mediante emparejamiento de bases de las regiones homólogas del oligonucleótido de ARN y ADN y de la molécula endógena de ácido nucleico, seguido por una recombinación homóloga, se puede transferir la mutación o la región heteróloga, contenida en el componente de ADN del oligonucleótido de ARN y ADN, al gen endógeno de una célula vegetal. Esto conduce a una disminución de la actividad de una proteína conforme al invento.

Además, para un experto en la especialidad es conocido el hecho de que él puede alcanzar la actividad de una proteína conforme al invento mediante la expresión de derivados no funcionales, en particular de mutantes dominantes en trans y/o mediante la expresión de antagonistas/inhibidores de tales proteínas. Los antagonistas/inhibidores de tales proteínas comprenden, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o moléculas con unas propiedades similares de fijación. Por ejemplo, se empleó un anticuerpo scFv citoplasmático, a fin de modular la actividad de la proteína fitocromo A en plantas de tabaco modificadas por tecnología genética (Owen, Bio/Technology 10, (1992), 790-794; Review [Revisión]: Franken, E., Teuschel, U. y Hain, R., Current Opinion in Biotechnology 8, (1997), 411-416; Whitelam, Trends Plant Sci. 1, (1996), 268-272).

El concepto de "disminución de la actividad" significa, dentro del marco del presente invento, una disminución de la expresión de genes endógenos, que codifican una proteína conforme al invento, y/o una disminución de la cantidad de una proteína conforme al invento en las células, en particular una disminución de la actividad enzimática de la proteína conforme al invento en las células. La disminución de la expresión se puede determinar, por ejemplo, mediante una medición de la cantidad de transcritos que codifican la proteína conforme al invento, p.ej. mediante un análisis por transferencia de borrón Northern. Una disminución significa en este caso, preferiblemente, una disminución de la cantidad de transcritos, en comparación con correspondientes células no modificadas genéticamente, en por lo menos 50%, de manera preferida en por lo menos 70%, de manera especialmente preferida en por lo menos 85% y de manera muy especialmente preferida en por lo menos 95%.

La disminución de la cantidad de una proteína conforme al invento se puede determinar, por ejemplo, mediante un análisis por transferencia de borrón Western. Una disminución significa en este caso preferiblemente una disminución de la cantidad de una proteína conforme al invento, en comparación con correspondientes células no modificadas genéticamente, en por lo menos 50%, de manera preferida en por lo menos 70%, de manera especialmente preferida en por lo menos 85% y de manera muy especialmente preferida en por lo menos 95%.

La disminución de la actividad enzimática de la proteína conforme al invento se puede determinar, por ejemplo, tal como se describe en Denyer y Smith (Planta 186 (1992), 609-617). Una disminución de la actividad enzimática, en comparación con correspondientes células no modificadas genéticamente, significa en este caso preferiblemente una disminución en por lo menos 50%, de manera preferida en por lo menos 70%, de manera especialmente preferida en por lo menos 85% y de manera muy especialmente preferida en por lo menos 95%.

Para el concepto de "modificada genéticamente" es válido lo mismo que ya se dijo anteriormente en otro contexto.

Por lo tanto, son objeto del presente invento en particular también células vegetales transgénicas,

a): que contienen por lo menos una molécula de ADN, que puede conducir a la síntesis de por lo menos un ARN antisentido, el cual produce una disminución de la expresión de genes endógenos, que codifican una proteína conforme al invento;

b): que contienen por lo menos una molécula de ADN que, a través de un efecto de cosupresión, conduce a una disminución de la expresión de genes endógenos, que codifican una proteína conforme al invento;

c): que contienen por lo menos una molécula de ADN, que conduce a la síntesis de por lo menos una ribozima, la cual disocia específicamente a transcritos de genes endógenos, que codifican una proteína conforme al invento; y/o

d): que, a causa de una mutagénesis in vivo, tienen una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga de ADN en por lo menos un gen endógeno, que codifica una proteína conforme al invento, produciendo la mutación o la inserción una disminución de la expresión del gen, o la síntesis de una proteína inactiva conforme al invento.

Además, con ayuda de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, es posible producir células vegetales y plantas, en las que está aumentada la actividad de una proteína conforme al invento. Esto conduce a la síntesis de un almidón con unas propiedades químicas y/o físicas modificadas, en comparación con el almidón procedente de células vegetales de tipo salvaje y de plantas de tipo salvaje.

Un objeto adicional del invento son también células vegetales transgénicas, en las que está aumentada la actividad de una proteína conforme al invento, en comparación con correspondientes células vegetales no modificadas genéticamente, de plantas de tipo salvaje.

Para la producción de células vegetales conformes al invento, que presentan una actividad aumentada de la proteína conforme al invento, en comparación con correspondientes células vegetales de tipo salvaje, no modificadas genéticamente, se utilizan unas moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento en una orientación en el mismo sentido, que comprenden la región codificadora de una sintasa de almidón conforme al invento. En otra forma de realización, se pueden utilizar también ciertas partes de la región codificadora, siempre y cuando que ellas codifiquen una proteína de sintasa de almidón catalíticamente activa. En una forma de realización especialmente preferida, se utilizan las moléculas de ácidos nucleicos indicadas bajo la SEQ ID No. 1.

El concepto de "aumento de la actividad" significa, en este caso, dentro del marco del presente invento, un aumento de la expresión de genes endógenos, que codifican una proteína conforme al invento, y/o un aumento de la cantidad de la proteína conforme al invento en las células, en particular un aumento de la actividad enzimática de la proteína conforme al invento en las células.

El aumento de la expresión se puede determinar, por ejemplo, mediante una medición de la cantidad de transcritos que codifican la proteína conforme al invento, p. ej. mediante un análisis por transferencia de borrón Northern. Un aumento significa en este caso de manera preferida un aumento de la cantidad de transcritos, en comparación con correspondientes células no modificadas genéticamente, en por lo menos 50%, de manera preferida en por lo menos 100%, en particular en por lo menos 500% y de manera muy especialmente preferida en por lo menos 1.500%.

El aumento de la cantidad de una proteína conforme al invento se puede determinar, por ejemplo, mediante un análisis por transferencia de borrón Western. Un aumento significa en este caso preferiblemente un aumento de la cantidad de una proteína conforme al invento, en comparación con correspondientes células no modificadas genéticamente, en por lo menos 50%, de manera preferida en por lo menos 100%, en particular en por lo menos 500% y de manera especialmente preferida en por lo menos 1.500%.

De manera especialmente preferida, el aumento de la actividad enzimática de la proteína conforme al invento se puede determinar tal como se describe en Denyer y Smith (véase más arriba).

Un aumento de la actividad enzimática, en comparación con correspondientes células no modificadas genéticamente, significa en este caso de manera preferida un aumento en por lo menos 50%, preferiblemente en por lo menos 100%, en particular en por lo menos 500% y de manera muy especialmente preferida en por lo menos 1.500%.

En una forma de realización preferida del invento, en los casos de las células vegetales transgénicas conformes al invento, con una actividad aumentada de una proteína conforme al invento, en comparación con células vegetales procedentes de plantas de tipo salvaje, se trata de aquellas células vegetales, que proceden de tejidos que almacenan almidón, de manera preferida de tubérculos y del endospermo, en particular del endospermo de plantas de maíz.

Sorprendentemente, se encontró que unas células vegetales, en las que está aumentada la actividad de la proteína conforme al invento, en particular en células vegetales del endospermo, en comparación con correspondientes plantas de tipo salvaje, sintetizan un almidón, que está modificado en sus propiedades físico-químicas en comparación con el almidón sintetizado en plantas de tipo salvaje, en particular en el endospermo, de tal manera que éste se adecua mejor para ciertas finalidades especiales de utilización.

Las células vegetales conformes al invento pueden pertenecer a cualquier especie arbitraria de plantas, es decir a plantas tanto monocotiledóneas como también dicotiledóneas.

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De manera preferida, se trata de células vegetales procedentes de plantas útiles en la agricultura, es decir de plantas, que son cultivadas por los seres humanos para finalidades de alimentación o para finalidades técnicas, en particular industriales. Preferiblemente, el invento se refiere a plantas que forman fibras (p.ej. las de lino, cáñamo, algodón), que almacenan aceites (p. ej. las de colza, girasol, soja), que almacenan azúcares (p.ej. las de remolacha azucarera, caña de azúcar, sorgo azucarado, plátano) y que almacenan proteínas (p.ej. las de leguminosas).

En otra forma preferida de realización, el invento se refiere a células vegetales procedentes de plantas forrajeras (p.ej. las de hierbas forrajeras y de pastos, alfalfa, trébol, etc.), y de plantas de legumbres (p.ej. las de tomate, lechuga, achicoria).

En una forma especialmente preferida de realización, el invento se refiere a células vegetales procedentes de plantas que almacenan almidones (p.ej. las de trigo, cebada, avena, centeno, patata, maíz, arroz, guisantes, mandioca o haba de mung), en particular son preferidas las células vegetales que proceden de maíz, arroz, trigo y patata.

Las células vegetales conformes al invento se pueden utilizar para la regeneración de plantas enteras.

Las plantas obtenibles mediante regeneración de las células vegetales transgénicas conformes al invento, son asimismo objeto del presente invento.

Además, son objeto del invento unas plantas, que contienen las células vegetales conformes al invento, antes descritas. En los casos de las plantas conformes al invento se puede tratar en principio de plantas de cualquier especie arbitraria de plantas, es decir de plantas tanto monocotiledóneas como también dicotiledóneas. De manera preferida, se trata de plantas útiles, es decir de plantas, que son cultivadas por los seres humanos para finalidades de alimentación o para finalidades técnicas, en particular industriales. De manera preferida, el invento se refiere a células vegetales procedentes de plantas que forman fibras (p.ej. las de lino, cáñamo, algodón), que almacenan aceites (p.ej. las de colza, girasol, soja), que almacenan azúcares (p.ej. las de remolacha azucarera, caña de azúcar, sorgo azucarado, plátano) y que almacenan proteínas (p.ej. las de leguminosas).

En otra forma preferida de realización, el invento se refiere a plantas forrajeras (p.ej. las de hierbas forrajeras y de pastos (alfalfa, trebol, etc.)], y a plantas de legumbres (p.ej. las de tomate, lechuga, achicoria).

En una forma especialmente preferida de realización, el invento se refiere a plantas que almacenan almidones (p.ej. las de trigo, centeno, avena, cebada, patata, maíz, arroz, guisantes, mandioca, haba de mung), se prefieren en particular plantas de maíz, arroz, trigo y patata.

En otra forma preferida adicional de realización, las plantas conformes al invento tienen una actividad aumentada de una proteína conforme al invento en células vegetales de tejidos que almacenan almidón, en comparación con correspondientes células vegetales no modificadas genéticamente de plantas de tipo salvaje, preferiblemente en células vegetales procedentes de tubérculos o del endospermo, de manera especialmente preferida en células vegetales del endospermo de plantas de maíz.

En una forma adicional de realización del invento, unas plantas, que contienen las células vegetales conformes al invento con una actividad aumentada de la proteína conforme al invento, tienen un rendimiento aumentado y/o un contenido aumentado de almidón, en comparación con correspondientes plantas de tipo salvaje, no modificadas,.

El concepto de "rendimiento aumentado" significa en este caso de manera preferida un aumento de la producción de sustancias constituyentes, en particular de almidón, y/o de biomasa, en particular cuando ésta se mide en el peso en fresco por planta.

El concepto de "contenido aumentado en almidón" significa, en este caso, que el contenido en almidón en células vegetales conformes al invento se ha aumentado en por lo menos 10%, de manera preferida en por lo menos 20%, en particular en por lo menos 30%, y de manera especialmente preferida en por lo menos 40%, en comparación con células vegetales de plantas de tipo salvaje no modificadas.

Son conocidos para un experto en la especialidad procedimientos para la determinación del contenido de almidón.

Un aumento tal del rendimiento y/o del contenido de almidón se refiere preferiblemente a partes cosechables de plantas, tales como semillas, frutas, raíces almacenadoras, tubérculos, raíces, flores, capullos, brotes, tallos o madera.

El aumento del rendimiento es, conforme al invento, de por lo menos 3%, referido a la biomasa y/o a las sustancias constituyentes, en comparación con correspondientes plantas no transformadas del mismo genotipo, cuando éstas son cultivadas en las mismas condiciones, preferiblemente de por lo menos 5%, en particular de por lo menos 10% y de manera especialmente preferida de por lo menos 20% o incluso de 40%, en comparación con plantas de tipo salvaje.

El presente invento se refiere también a procedimientos para la producción de plantas transgénicas, en los que

a): se modifica genéticamente una célula vegetal mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico conforme al invento y/o de un vector conforme al invento; y

b): a partir de la célula se regenera una planta; y eventualmente

c): a partir de la planta de acuerdo con b) se producen otras plantas adicionales:

Para la modificación genética introducida de acuerdo con la etapa a) es válido lo mismo que ya se explicó anteriormente en otro contexto. Por ejemplo, unas células vegetales modificadas genéticamente muestran una disminución de la actividad de la proteína conforme al invento o un aumento de la actividad de la proteína conforme al invento.

La regeneración de plantas de acuerdo con la etapa b) se puede efectuar según métodos que son conocidos para un experto en la especialidad.

La producción de otras plantas adicionales de acuerdo con la etapa c) del procedimiento conforme al invento se puede efectuar p.ej. mediante una reproducción vegetativa (por ejemplo, a través de plantones, tubérculos o a través de un cultivo de callos y de una regeneración de plantas enteras) o mediante una reproducción generativa. La reproducción generativa tiene lugar, en este caso, preferiblemente de una manera controlada, es decir, unas plantas escogidas con determinadas propiedades se cruzan unas con otras y se reproducen.

El presente invento se refiere también a las plantas obtenibles mediante los procedimientos conformes al invento.

El presente invento se refiere también a un material de reproducción de plantas conformes al invento, así como a las plantas transgénicas producidas de acuerdo con el procedimiento conforme al invento. El concepto de material de reproducción comprende en este contexto los componentes de la planta, que son adecuados para la producción de descendientes por una vía vegetativa o generativa. Para la reproducción vegetativa se adecuan por ejemplo plantones, cultivos de callos, rizomas o tubérculos. Otro material de reproducción comprende, por ejemplo, frutas, semillas, arbolitos nacidos de semillas, protoplastos, cultivos de células, etc. De manera preferida, en el caso del material de reproducción se trata de tubérculos y semillas.

En una forma de realización adicional, el presente invento se refiere a ciertas partes de plantas cosechables de plantas conformes al invento, tales como frutas, raíces almacenadoras, raíces, flores, capullos, brotes o tallos, de manera preferida semillas o tubérculos, así como a piensos, que contienen estas partes de plantas cosechables, de manera preferida semillas o tubérculos. Las partes de plantas cosechables conformes al invento, preferiblemente semillas o tubérculos y/o piensos, pueden estar caracterizadas por un valor energético modificado, de manera preferida por un valor energético aumentado.

Por el concepto de "valor energético" se ha de entender en este contexto en particular la "energía digerible". El concepto de "energía digerible" se define como: energía digerible = energía en bruto del pienso menos el poder calorífico de los excrementos (Landwirtschaftliches Lehrbuch [Libro de texto agrícola] 2: Tierzucht [Ganadería], compilador: D. Schmidt, 5^{a} edición, 1982, Eugen Ulmer GmbH & Co, página 244). Por la energía en bruto se ha de enter el índice calorifíco total medible en Joules de un pienso. Son conocidos para un experto en la especialidad procedimientos para la determinación del "poder calorífico" o respectivamente de la "energía digerible".

El aumento del valor energético es conforme al invento de por lo menos 3%, preferiblemente de por lo menos 10%, en particular de por lo menos 30% y de manera especialmente preferida de por lo menos 60%.

Las células vegetales y plantas transgénicas conformes al invento, a causa de la expresión o respectivamente de la expresión adicional de una molécula de ácido nucleico conforme al invento y/o a causa del aumento o de la disminución de la actividad de una proteína conforme al invento, sintetizan un almidón, que está modificado por ejemplo en sus propiedades físico-químicas, en particular en la relación de amilosa a amilopectina, en el grado de ramificación, en la longitud media de las cadenas, en el contenido en fosfatos, en el comportamiento de engrudado, en el tamaño de los granos de almidón y/o en la forma de los granos de almidón en comparación con un almidón sintetizado en plantas de tipo salvaje. En particular, un almidón de este tipo puede estar modificado en lo que se refiere a la viscosidad y/o a las propiedades de formación de geles de engrudos de este almidón en comparación con un almidón de tipo salvaje.

Es objeto del presente invento, por consiguiente, también el almidón obtenible a partir de las células vegetales transgénicas conformes al invento y de las plantas conformes al invento y/o del material de reproducción conforme al invento.

A causa de las propiedades físico-químicas modificadas, los almidones conformes al invento muestran unas propiedades funcionales modificadas. Unas propiedades funcionales importantes del almidón o respectivamente de sus soluciones acuosas son, por ejemplo, el comportamiento de retrogradación, las propiedades de formación de películas, la tenacidad o resistencia de los geles, la viscosidad, la estabilidad cromática, la digestibilidad enzimática, la estabilidad frente a procesos de congelación y descongelación, la estabilidad frente a los ácidos, la estabilidad frente a la cizalladura, la transparencia, la capacidad de fijación de agua, las propiedades de engrudado así como las propiedades de unión y pegamiento. Los almidones conformes al invento se pueden modificar según métodos conocidos para un experto en la especialidad y se adecuan, en una forma no modificada o modificada, para diferentes utilizaciones en el sector alimentario o no alimentario.

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Fundamentalmente, la posibilidad de empleo del almidón se puede subdividir en dos grandes sectores. Uno de los sectores comprende los productos de hidrólisis del almidón, principalmente glucosa y eslabones de glucanos, que se pueden obtener a través de procedimientos enzimáticos o químicos. Éstos sirven como sustancias de partida para otras modificaciones químicas y otros procesos químicos adicionales, tales como los de fermentación. Para obtener una reducción de los costos pueden ser importantes, en este caso, la sencillez y la realización barata de un procedimiento de hidrólisis. Actualmente, éste se lleva a cabo en lo esencial por vía enzimática mediando utilización de una amiloglucosidasa. Sería concebible un ahorro de costos mediante un empleo de una menor cantidad de enzimas. Una modificación de la estructura del almidón, p.ej. un aumento del tamaño de la superficie de los granos, una digestibilidad más fácil por medio de un menor grado de ramificación, o una estructura estérea, que limite la accesibilidad para las enzimas empleadas, podría producir este ahorro.

El otro sector, en el que se utiliza el almidón a causa de su estructura polimérica como un denominado almidón natural, se clasifica en otros dos sectores adicionales de empleo:

1.: La industria alimentaria

\quad: El almidón es un aditivo clásico para muchos alimentos, en los cuales él toma a su cargo esencialmente la función de la fijación o aglutinación de aditivos acuosos o respectivamente provoca un aumento de la viscosidad o también una gelificación elevada. Importantes características de propiedades son los comportamientos de fluencia y sorción, la temperatura de hinchamiento y engrudamiento, la viscosidad y el rendimiento de espesamiento, la solubilidad del almidón, la transparencia y la estructura del engrudo, la estabilidad frente al calor, a la cizalladura y a los ácidos, la tendencia a la retrogradación, la capacidad para la formación de películas, la estabilidad en procesos de congelación y descongelación, la digestibilidad, así como la capacidad para la formación de complejos p.ej. con iones inorgánicos u orgánicos.

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2.: La industria no alimentaria

\quad: En este gran sector, el almidón se emplea como sustancia auxiliar para diversos procesos de producción o respectivamente como aditivo en productos técnicos. En el caso de la utilización del almidón como una sustancia auxiliar, se ha de citar aquí en particular la industria del papel y del cartón. El almidón sirve, en este caso, en primer término para la retardación (retención de materiales sólidos), la aglutinación de partículas de materiales de carga y relleno y de partículas de materiales finos, como material de consolidación y para la deshidratación. Además de esto, se aprovechan las ventajosas propiedades del almidón en lo que se refiere a la rigidez, la dureza, el sonido o tono, el tacto, el brillo, la lisura, la resistencia a la formación de fisuras, así como las superficies.

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2.1: Industria del papel y del cartón

\quad: Dentro del proceso de fabricación de papel se han de diferenciar cuatro sectores de aplicación, a saber la superficie, el estucado, la masa y la proyección (atomización).

\quad: Las exigencias planteadas al almidón en lo que se refiere al tratamiento de superficies, son esencialmente un alto grado de blancura, una viscosidad adaptada apropiada, una alta estabilidad de la viscosidad, una buena formación de películas, así como una escasa formación de polvo fino. En el caso de la utilización en el estucado, desempeñan un cometido importante el contenido de materiales sólidos, una viscosidad adaptada, una alta capacidad de aglutinación y fijación, así como una alta afinidad para los pigmentos. Como adición a la masa son importantes una distribución rápida, uniforme y exenta de pérdidas, una alta estabilidad mecánica y una completa retención en el velo de papel. En el caso del empleo del almidón en el sector de la proyección o atomización, son importantes asimismo un contenido adaptado y apropiado de materiales sólidos, una alta viscosidad, así como una alta capacidad de aglutinación y fijación.

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2.2: Industria de los pegamentos

\quad: Un gran sector de empleo de los almidones consiste en la industria de los pegamentos, en donde las posibilidades de empleo se clasifican en cuatro sectores parciales: la utilización como una cola pura de almidón, la utilización de colas de almidón tratadas con agentes químicos especiales, la utilización de un almidón como aditivo para resinas sintéticas y dispersiones de polímeros, así como la utilización de almidones como agentes extendedores para pegamentos sintéticos. Un 90% de los pegamentos a base de almidón se emplean en los sectores de la fabricación de cartón ondulado, de la fabricación de sacos, bolsas y cucuruchos de papel, de la fabricación de materiales compuestos para papel y aluminio, de la fabricación de cartonajes y de cola rehumedecible para sobres, sellos de correo, etc.

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2.3: Industria textil y de agentes para el cuidado de materiales textiles

\quad: Un gran sector de empleo para los almidones como agentes auxiliares y materiales aditivos es el sector de la fabricación de materiales textiles y de agentes para el cuidado de materiales textiles. Dentro de la industria textil hay que establecer diferencia entre los siguientes cuatro sectores de empleo:

\quad: El empleo del almidón como agente de apresto, es decir, como sustancia auxiliar para el alisamiento y el reforzamiento del comportamiento de trepa con el fin de proteger contra las fuerzas de tracción que atacan al tejer, así como para aumentar la resistencia a la abrasión al tejer,

\quad: el del almidón como agente para el apresto de materiales textiles, sobre todo después de tratamientos previos que empeoran la calidad, tales como el blanqueo, la tinción, etc.,

\quad: el del almidón como agente de espesamiento en la producción de pastas de agentes colorantes para la evitación de difusiones de los colorantes, así como

\quad: el del almidón como aditivo a agentes de formación de urdimbre para hilos de costura.

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2.4: Industria de los materiales de construcción

\quad: El cuarto sector de empleo es la utilización de los almidones como aditivo en el caso de materiales de construcción. Un ejemplo de esto es la fabricación de planchas de cartón yeso, en la que el almidón mezclado en la papilla de yeso se engruda con el agua, se difunde junto a la superficie de la plancha de yeso, y allí fija el cartón a la plancha. Otros sectores de empleo son la adición a fibras de revoques y minerales. En el caso de un hormigón transportable los productos de almidón se emplean para retardar el fraguado.

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2.5: Estabilización de suelos

\quad: Un mercado adicional para el almidón se recomienda en la preparación de agentes para la estabilización de suelos, que se emplean en el caso de movimientos artificiales de tierras para la protección provisional de las partículas del suelo frente al agua.

\quad: Los productos combinados a base del almidón y de emulsiones de polímeros han de equipararse, de acuerdo con los conocimientos actuales, a los productos empleados hasta ahora, en cuanto a su efecto de disminución de la erosión y de la formación de costras, pero se encuentran manifiestamente por debajo de éstos en cuanto al precio.

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2.6: Empleo en los casos de agentes fitoprotectores y fertilizantes

\quad: Un sector de empleo está situado en la utilización de almidón en agentes fitoprotectores con el fin de modificar las propiedades específicas de las formulaciones. Así, se puede emplear el almidón para mejorar la humectación y mojadura de agentes fitoprotectores y fertilizantes, para la liberación dosificada de las sustancias activas, para la transformación de sustancias activas líquidas, volátiles y/o malolientes en sustancias moldeables, estables y microcristalinas, para la mezcladura de compuestos incompatibles y para la prolongación de la duración de la acción por medio de una disminución de la descomposición.

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2.7: Industria de fármacos, medicinas y productos cosméticos

\quad: Otro sector de empleo consiste en el sector de la industria de fármacos, medicinas y productos cosméticos. En la industria farmacéutica, el almidón se puede emplear como agente aglutinante para tabletas o para la dilución de agentes aglutinantes en cápsulas. Además, el almidón puede servir como agentes disgregantes para tabletas, puesto que ellos, después de haberse tragado las tabletas, absorben líquido y después de un breve periodo de tiempo se hinchan hasta tal punto que la sustancia activa es puesta en libertad. Los polvos medicinales para espolvorear deslizantes y sobre heridas están basados, por motivos cualitativos, en un almidón. En el sector de la cosmética, se emplean almidones, por ejemplo, como vehículos y soportes de materiales aditivos a polvos para espolvorear, tales como perfumes, aromas y ácido salicílico. Un sector de utilización relativamente grande para el almidón se encuentra en las pastas dentífricas.

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2.8: Adición de almidón a carbones y briquetas

\quad: El almidón ofrece un sector de empleo como material aditivo a carbones y briquetas. Un carbón puede ser aglomerado o bien briqueteado con una adición de almidón de manera cuantitativa para dar un producto de alto valor, con lo que se impide una descomposición prematura de las briquetas. La cantidad añadida de almidón está situada, en el caso de carbón para barbacoas, entre 4 y 6%, y, en el caso de un carbón aumentado en calorías, entre 0,1 y 0,5%. Por lo demás, los almidones están ganando en importancia como agentes aglutinantes, puesto que mediante su adición a carbones y briquetas se puede reducir manifiestamente la expulsión de sustancias nocivas y dañinas.

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2.9: Tratamiento de lodos de minerales y carbones

\quad: El almidón se puede emplear además en el tratamiento de lodos de minerales y carbones como agente de floculación.

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2.10: Agente auxiliar para moldeo por colada o fundición

\quad: Otro sector de empleo es como aditivo a agentes auxiliares para el moldeo por colada o la fundición. En diversos procedimientos de moldeo por colada o fundición se requieren núcleos o machos, que se producen a partir de arenas mezcladas con agentes aglutinantes. Como agente aglutinante se emplea actualmente de manera predominante una bentonita, que se ha mezclado con almidones modificados, en la mayor parte de los casos almidones hinchables.

\quad: La finalidad de la adición de un almidón es la de aumentar la resistencia a la fluencia así como la de mejorar la resistencia de aglutinación. Además de esto, los almidones hinchables pueden presentar otros requisitos técnicos de producción, tales como los de ser dispersables en agua fría, ser rehidratables, ser bien miscibles en arena, y tener una alta capacidad de fijación de agua.

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2.11: Empleo en la industria de los cauchos

\quad: En la industria de los cauchos, el almidón se puede emplear para el mejoramiento de la calidad técnica y óptica. Las razones de ello son, en este caso, el mejoramiento del brillo superficial, el mejoramiento del tacto y del aspecto; para esto, se esparce almidón, antes de la vulcanización en frío, sobre las superficies recauchutadas pegajosas de los materiales de caucho, así como el mejoramiento de la capacidad del caucho para la estampación e impresión.

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2.12: Preparación de materiales sustitutivos del cuero

\quad: Otra posibilidad de utilización de los almidones modificados consiste en la preparación de materiales sustitutivos del cuero.

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2.13: Almidón en polímeros sintéticos

\quad: En el sector de los materiales sintéticos y plásticos se destacan los siguientes sectores de empleo: la inclusión de productos de transformación del almidón en el proceso de elaboración (el almidón es solamente un material de relleno y carga, no existe ninguna unión directa entre el polímero sintético y el almidón) o, alternativamente, la inclusión de productos de transformación del almidón en la preparación de polímeros (el almidón y el polímero pasan a formar una unión firme).

La utilización del almidón como un material de carga puro no es competitiva, en comparación con la de otras sustancias tales como talco. Se establece un cuadro diferente, cuando pasan a tener importancia las propiedades específicas de los almidones y se modifica con ello manifiestamente el perfil de propiedades de los productos finales. Un ejemplo de esto es la utilización de productos de almidón en el caso de la elaboración de materiales termoplásticos, tales como un polietileno. En este caso, el almidón y el polímero sintético se combinan mediante coexpresión en la relación de 1:1 para dar una "tanda patrón" [en inglés "master batch"], a partir de la que se producen diversos productos con un polietileno granulado mediando utilización de tecnologías de procesos habituales. Mediante la inclusión de un almidón en láminas de polietileno se puede conseguir una permeabilidad aumentada de sustancias en el caso de cuerpos huecos, una permeabilidad mejorada al vapor de agua, un comportamiento antiestático mejorado, un comportamiento antiapelmazante mejorado, así como una capacidad de impresión mejorada con tintas acuosas.

Otra posibilidad es la utilización del almidón en espumas de poliuretanos. Con la adaptación de los derivados de almidón, así como mediante la optimización técnica de los procesos, es posible controlar deliberadamente la reacción entre polímeros sintéticos y los grupos hidroxi de los almidones. El resultado de ello son láminas de poliuretanos, que, mediante la utilización de un almidón, adquieren los siguientes perfiles de propiedades: una disminución del coeficiente de dilatación térmica, una disminución del comportamiento de contracción, un mejoramiento del comportamiento bajo presión y tensión, un aumento de la permeabilidad al vapor de agua sin que se modifique la absorción de agua, una disminución de la inflamabilidad y de la densidad de desgarramiento, ningún escurrimiento de partes combustibles, ausencia de halógenos y envejecimiento disminuido. Las desventajas, que actualmente están todavía presentes, son una resistencia reducida a la compresión, así como una resistencia disminuida a los impactos.

Entre tanto, el desarrollo de productos ya no se limita solamente a las láminas. También se pueden producir productos sólidos de materiales sintéticos, tales como cacerolas, macetas, planchas y cubetas, con un contenido de almidón de más que 50%. Por lo demás, se han de valorar favorablemente las mezclas de almidones y polímeros, puesto que tienen una degradabilidad biológica muchísimo más alta.

Además, a causa de su extremada capacidad para fijar agua, los polímeros por injerto de almidón han adquirido una importancia extraordinaria. Estos son productos con una cadena principal a base de un almidón y con un retículo lateral a base de un monómero sintético, que se ha injertado de acuerdo con el principio del mecanismo de encadenamiento de radicales. Los polímeros por injerto de almidón, disponibles hoy en día, se distinguen por una mejor capacidad de fijación y retención de hasta 1.000 g de agua por gramo de almidón, junto con una alta viscosidad. Los sectores de utilización para estos agentes superabsorbentes se han ampliado grandemente en los últimos años y se encuentran en el sector de la higiene, con productos tales como pañales y sábanas bajeras, así como en el sector agrícola, p.ej. en formaciones de gránulos de semillas.

Son de carácter decisivo para el empleo de los nuevos almidones modificados por tecnología genética, por una parte, la estructura, el contenido de agua, el contenido de proteínas, el contenido de lípidos, el contenido de fibras, el contenido de cenizas y fosfatos, la relación de amilosa a amilopectina, la distribución de las masas moleculares, el grado de ramificación, el tamaño y la forma de los granos, así como la cristalinidad, y, por otra parte, también las propiedades que desembocan en las siguientes características: el comportamiento de fluencia y de sorción, la temperatura de engrudamiento, la viscosidad, el rendimiento de espesamiento, la solubilidad, la estructura y la transparencia de los engrudos, la estabilidad frente al calor, a la cizalladura y a los ácidos, la tendencia a la retrogradación, la gelificación, la estabilidad frente a procesos de congelación y descongelación, la formación de complejos, la fijación de yodo, la formación de películas, la fuerza de pegamiento, la estabilidad frente a las enzimas, la digestibilidad y la
reactividad.

La producción de almidones modificados mediante intervenciones por tecnología genética en una planta transgénica puede modificar, por una parte, las propiedades de los almidones obtenidos a partir de la planta, de tal manera que ya no aparezcan como necesarias otras modificaciones adicionales mediante procedimientos químicos o físicos. Por otra parte, los almidones modificados mediante procedimientos de tecnología genética pueden ser sometidos a otras modificaciones químicas, lo que conduce a otros mejoramientos adicionales de la calidad para determinados sectores de empleo entre los que se han citado anteriormente. Estas modificaciones químicas y físicas son fundamentalmente conocidas. En particular, en este caso, se trata de modificaciones mediante

-: un tratamiento por calor,

-: un tratamiento con ácidos,

-: la producción de éteres de almidón

: almidón-alquil-éteres, -O-alil-éteres, -hidroxialquil-éteres, -O-carboximetil-éteres, éteres de almidón nitrogenados (que contienen N), éteres de almidón fosforados (que contienen P), éteres de almidón sulfurados (que contienen S),

-: la producción de almidones reticulados,

-: la producción de polímeros por injerto con almidón

-: una oxidación y

-: esterificaciones, que conducen a la formación de almidones con fosfato-, nitrato-, sulfato-, xantato-, acetato- y citrato. Otros ácidos orgánicos se pueden emplear asimismo para la esterificación.

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El presente invento se refiere además a un procedimiento para la producción de un almidón modificado que comprende la etapa de la extracción del almidón a partir de una (célula de) planta conforme al invento, descrita anteriormente, y/o a partir de partes que almacenan almidón de una tal planta. Preferiblemente, un procedimiento tal comprende también la etapa de la cosecha de las plantas cultivadas y/o de las partes que almacenan almidón de estas plantas, antes de la extracción del almidón, y de manera especialmente preferida además la etapa de la cultivación de plantas conformes al invento, antes de la cosecha. Son conocidos para un experto en la especialidad procedimientos para la extracción del almidón de plantas o de partes de plantas que almacenan almidón. Además, se han descrito procedimientos para la extracción del almidón a partir de diferentes plantas que almacenan almidón, p.ej. en la obra ``Starch: Chemistry and Technology [Almidón: química y tecnología] (compiladores: Whistler, BeMiller y Paschall (1994), 2^{a} edición, Academic Press Inc. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; véanse p.ej. el capítulo XII, páginas 412-468: Mais und Sorghum-Stärken: Herstellung [Almidones de maíz y sorgo: preparación]; de Watson; el capítulo XIII, páginas 469-479: Tapioca-, Arrowroot- und Sagostärken: Herstellung [Almidones de tapioca, arruruz (maranta) y sagú: preparación]; de Corbishley y Miller; el capítulo XIV, páginas 479-490: Kartoffelstärke: Herstellung und Verwendungen [Almidón de patata: producción y utilizaciones]; de Mitch; el capítulo XV, páginas 491 hasta 506: Weizenstärke: Herstellung, Modifizierung und Verwendungen [Almidón de trigo: preparación, modificación y utilizaciones]; de Knight y Oson; y el capítulo XVI, páginas 507 hasta 528: Reisstärke: Herstellung und Verwendungen [Almidón de arroz: Preparación y utilizaciones]; de Rohmer y Klem; Maisstärke [Almidón de maíz]: Eckhoff y colaboradores, Cereal Chem. 73 (1996) 54-57, la extracción de almidón de maíz a una escala industrial se consigue por medio de la denominada "molienda en húmedo" (del inglés "wet milling")). Los dispositivos, que se utilizan habitualmente en el caso de procedimientos para la extracción de almidón a partir de un material vegetal son separadores, decantadores, hidrociclones, secadores por atomización y secadores en capa fluidizada.

Objeto del presente invento es además un almidón, que es obtenible mediante el procedimiento conforme al invento antes descrito.

El invento se refiere además a un almidón obtenible a partir de las células vegetales conformes al invento y/o de las plantas conformes al invento, así como a un almidón obtenible a partir de tejidos que almacenan almidón, en particular tubérculos y granos, de plantas conformes al invento.

En una forma adicional de realización, el presente invento se refiere a la utilización de los almidones conformes al invento en el sector industrial, preferiblemente para la producción de alimentos, piensos y papel.

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Fig. 1

Mapa del plásmido IR 65/87

LB: extremo izquierdo del ADN T

35S-T: Terminador de 35S (Frank y colaboradores Cell 21, (1980), 285-294)

PAT: Resistencia a fosfinotricina, véase el documento EP-A2-0275957

35S-P: Promotor de CaMV 35 (Frank y colaboradores, Cell 21, (1980), 285-294)

Ubiquitina-P: Promotor de ubiquitina (Christensen y colaboradores, Plant Mol. Biol. 18, (1992), 675-689)

Intrón de ubi.: Intrón de ubiquitina (Christensen y colaboradores, Plant Mol. Biol. 18, (1992), 675-689)

SS6: Región codificadora de la secuencia de nucleótidos indicada bajo la SEQ ID No.1

NOS: Terminador de nos (Depicker y colaboradores, J. Mol. Appl. Genet. 1, (1982), 561573)

RB: Extremo derecho del ADN T

Ampicilina: Gen de resistencia frente a ampicilina (Yanisch-Perron y colaboradores, Gene 33, (1985), 103-119)

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Medios y soluciones utilizados en los Ejemplos

20xSSC	175,3 g de NaCl
	88,2 g de citrato de sodio
	hasta 1.000 ml con ddH_{2}O (H_{2}O doblemente destilada)
	pH 7,0 con NaOH 10 N

YT	8 g de extracto de levadura Bacto
	5 g de triptona Bacto
	5 g de NaCl
	hasta 1.000 ml con ddH_{2}O

Medio para el aislamiento de los protoplastos (100 ml)

Celulasa Onozuka R S (Meiji Seika, Japón)	800 mg
Pectoliasa Y23	40 mg
KNO_{3}	200 mg
KH_{2}PO_{4}	136 mg
K_{2}HPO_{4}	47 mg
CaCl_{2} 2H_{2}O	147 mg
MgSO_{4} 7H_{2}O	250 mg
Albúmina de suero bovino (BSA)	20 mg
Glucosa	4.000 mg
Fructosa	4.000 mg
Sacarosa	1.000 mg
pH	\hskip0.12cm 5,8
Osmolalidad	660 mosm.

Solución 1 para el lavado de los protoplastos: como la solución para el aislamiento de los protoplastos, pero sin celulasa, pectoliasa ni BSA

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Tampón de transformación

a)	Glucosa	0,5 M
	MES	0,1%
	MgCl_{2} 6H_{2}O	25 mM
	pH	5,8
	ajustar a 600 mosm.

b)	Solución de PEG 6000
	Glucosa	0,5 M
	MgCl_{2} 6H_{2}O	100 mM
	pH	6,5

Al tampón antes mencionado dentro de b) se le añade PEG 6000 poco antes del uso de la solución (40% en peso de PEG). La solución se filtra a través de un filtro estéril de 0,45 \mum.

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Solución de W5

CaCl_{2}	125 mM
NaCl	150 mM
KCl	5 mM
Glucosa	50 mM

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Medio para la cultivación de protoplastos (datos en mg/l)

KNO_{3}	3.000
(NH_{4})SO_{4}	500
MgSO_{4} 7H_{2}O	350
KH_{2}PO_{4}	400
CaCl_{2} 2H_{2}O	300

Fe-EDTA y elementos traza como en el medio de Murashige y Skoog (Physiol. Plant. 15 (1962), 473).

\newpage

m-Inosita	100
Tiamina HCl	1,0
Amida de ácido nicotínico	0,5
Piridoxina HCl	0,5
Glicina	2,0
Ácido glucurónico	750
Ácido galacturónico	750
Galactosa	500
Maltosa	500
Glucosa	36.000
Fructosa	36.000
Sacarosa	30.000
Asparagina	500
Glutamina	500
Prolina	300
Hidrolizado de caseína	500
Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)	0,5
pH	5,8
Osmolalidad	600 mosm.

En los Ejemplos se utilizan los siguientes métodos

1.: Transformación de maíz

(a): Producción de protoplastos del linaje celular DSM 6009

\quad: Aislamiento de los protoplastos

\quad: A los 2-4 días, preferiblemente a los 3 días después del último cambio de medio de un cultivo en suspensión de protoplastos se filtra con succión el medio líquido y las células remanentes se enjuagan con 50 ml de la solución 1 para el lavado de protoplastos y de nuevo se filtra con succión hasta sequedad. En cada caso a 2 g de la masa celular cosechada se le añaden 10 ml del medio para el aislamiento de los protoplastos. Las células y los agregados de células resuspendidas/os se incuban a 27 \pm 2ºC mediando un ligero sacudimiento (a 30 hasta 40 rpm) durante 4 hasta 6 horas en la oscuridad.

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\quad: Purificación de los protoplastos

\quad: Tan pronto como se haya efectuado la liberación de por lo menos 1 millón de protoplastos/ml (observación con microscopio), se tamiza la suspensión a través de un tamiz de acero inoxidable y de nilón de 200 o respectivamente 45 \mum de anchura de mallas. La combinación de un tamiz de 100 \mum y de otro de 60 \mum hace posible igual de bien la separación de los agregados de células. El material filtrado que contiene protoplastos se valora con un microscopio. Usualmente éste contiene de 98-99% de protoplastos. El resto son células individuales no digeridas.

\quad: Las preparaciones de protoplastos con este grado de pureza se utilizan para los experimentos de transformación, sin ninguna centrifugación en gradiente adicional. Mediante una centrifugación (a 100 rpm en un rotor vibratorio (100 x g, 3 min) se sedimentan los protoplastos. El material sobrenadante se desecha y los protoplastos se vuelven a suspender en la solución 1 de lavado. La centrifugación se repite y los protoplastos se vuelven a suspender luego en el tampón de transformación.

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(b): Transformación de los protoplastos

\quad: Los protoplastos resuspendidos en el tampón de transformación se cargan con un título de 0,5-1 x 10^{6} protoplastos/ml en porciones de 10 ml dentro tubitos de polialómero con una capacidad de 50 ml. El ADN utilizado para la transformación se disuelve en un tampón de Tris-EDTA (TE). Por cada ml de la suspensión de protoplastos se añaden 20 \mug de ADN plasmídico. Como vector se utiliza en este caso un plásmido que confiere resistencia a fosfinotricina (compárese p.ej. el documento EP-A2-0513849). Después de la adición de ADN, se agita cuidadosamente la suspensión de protoplastos, a fin de distribuir el ADN homogéneamente en la solución. Inmediatamente después de esto se añaden gota a gota 5 ml de una solución de PEG.

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\quad: Mediante una basculación cuidadosa de los tubitos se distribuye homogéneamente la solución de PEG. Después de esto se añaden de nuevo 5 ml de la solución de PEG y se repite la mezcladura a fondo homogénea. Los protoplastos permanecen durante 20 min en la solución de PEG a \pm 2ºC. Después de esto los protoplastos se sedimentan mediante una centrifugación durante 3 minutos (100 g; 1.000 rpm). El material sobrenadante se desecha. Los protoplastos se lavan mediante una agitación cuidadosa en 20 ml de la solución de W5 y después de esto se centrifugan de nuevo. A continuación, ellos se vuelven a suspender en 20 ml del medio para la cultivación de protoplastos, se centrifugan nuevamente y se vuelven a suspender de nuevo en el medio de cultivo. El título se ajusta a 6-8 x 10^{5} protoplastos/ml y los protoplastos se cultivan en porciones de 3 ml en cápsulas de Petri (\diameter 60 mm, altura 15 mm). Las cápsulas de Petri selladas con película Parafilm se colocan en la oscuridad a 25 \pm 2ºC.

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(c): Cultivo de protoplastos

\quad: Durante las primeras 2-3 semanas después del aislamiento y de la transformación de los protoplastos, éstos se cultivan sin la adición de un medio fresco (de nueva aportación). Tan pronto como las células regeneradas a partir de los protoplastos se han desarrollado para dar unos conglomerados celulares con más de 20-50 células, se añade 1 ml de medio fresco para cultivo de protoplastos, que como agente osmótico contiene sacarosa (90 g/l).

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(d): Selección de células de maíz transformadas y regeneración de las plantas

\quad: A los 3-10 días después de la adición de un medio fresco, los conglomerados celulares que se han formado a partir de los protoplastos se pueden extender en placas sobre medios de agar con 100 mg/l de L-fosfinotricina. Un medio N6 con las vitaminas del medio de cultivo de protoplastos, 90 g/l de sacarosa y 1,0 mg/l de 2,4 D es igualmente adecuado que un medio análogo, por ejemplo con las sales macro- y micronutritivas del medio MS (Murashige y Skoog (1962), véase más arriba).

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\quad: Sobre el medio selectivo pueden seguir creciendo sin impedimentos los callos que han procedido de protoplastos transformados establemente. Después de 3-5 semanas, preferiblemente 4 semanas, los callos transgénicos son transferidos a un medio de selección fresco, que contiene asimismo 100 mg/l de L-fosfinotricina, pero que ya no contiene ninguna auxina. En el transcurso de 3-5 semanas, aproximadamente un 50% de los callos de maíz transgénicos, los cuales tienen integrado en su genoma el gen de la L-fosfinotricina-acetiltransferasa, diferencian unas primeras plantas sobre este medio, en presencia de L-fosfinotricina.

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(e): Cultivación de plantas regeneradas transgénicas

\quad: El tejido de maíz embriogénico, transformado, se cultiva en presencia de 5 x 10^{-4} M de L-fosfinotricina sobre un medio N6 exento de hormonas (Chu C.C. y colaboradores, Sci. Sin. 16 (1975), 659). Sobre este medio se desarrollan embriones de maíz, que expresan el gen de la fosfinotricina-acetiltransferasa (gen de PAT) de una manera suficientemente fuerte, para dar plantas. Los embriones no transformados, o los que tienen una actividad de PAT solamente muy débil, se mueren. Tan pronto como las hojas de las plantas in-vitro hayan alcanzado una longitud de 4-6 mm, éstas se pueden transferir a tierra. Después de haber separado por lavado con respecto de restos de agar junto a las raíces, las plantas se trasplantan a una mezcla de légamo, arena, vermiculita y tierra unitaria en la relación de 3:1:1:1 y durante los primeros 3 días después de su transplante, se adaptan al cultivo en tierra con una humedad relativa del aire 90-100%. La cultivación se efectúa en una cámara climática con un período de luz de aproximadamente 25.000 Lux durante 14 h, a la altura de la planta, con una temperatura de día/noche de 23 \pm 1/17 \pm 1ºC. Las plantas adaptadas se cultivan con una humedad del aire de 65 \pm 5%.

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4.: Marcación radiactiva de fragmentos de ADN

\quad: La marcación radiactiva de fragmentos de ADN se llevó a cabo con ayuda de un estuche de marcación con cebadores aleatorios de ADN [DNA-Random Primer Labelling Kit] de la entidad Boehringer (Alemania) de acuerdo con los datos del fabricante.

\newpage

Los siguientes Ejemplos ilustran el invento sin limitarlo de ninguna manera:

Ejemplo 1 Identificación, aislamiento y caracterización de un ADNc, que codifica una nueva isoforma de una sintasa de almidón procedente de Zea mays

Para la identificación de un ADNc que codifica una nueva isoforma de la sintasa de almidón procedente de Zea mays, se aisló primeramente el ARN total a partir de granos de maíz (a los 15 hasta 20 días después de la polinización) según el método de Logemann y colaboradores (Anal. Biochem. 163, (1987), 21-26). A continuación, se utilizó 1 mg de ARN total, a fin de preparar un ARN poli A+ mediando utilización del estuche de purificación de ARNm Oligotex (de Quiagen) según los datos del fabricante.

Partiendo de 5 \mug del ARN poli A+, a continuación, con ayuda del estuche para síntesis de ADNc ZAP de la entidad Stratagene, se construyó una biblioteca de ADNc. La biblioteca contenía aproximadamente 9 x 10^{5} fagos recombinantes independientes con un tamaño de la inserción de ADNc de aproximadamente 1,3 kb.

A continuación, se llevó a cabo el denominado "levantamiento de calvas" (en inglés "plaque-lifting") en aproximadamente 4 x 10^{5} fagos. Para ello, se utilizaron filtros Hybond N (de Amersham). Después de una prehibridación durante 4 horas a 42ºC en un tampón A (5 x SSC, 0,5% de BSA, 5 x Denhardt, 1% de SDS, tampón de fosfato 40 mM, de pH 7,2; 100 mg/l de ADN de esperma de arenque, 25% de formamida), los filtros se hibridaron con un fragmento EcoRI/XhoI (ADNc total) marcado radiactivamente (con el estuche de marcación de ADN cebado aleatoriamente [DNA-Random Primer Labelling Kit], de Boehringer Mannheim), del ADNc SSIII procedente de Solanum tuberosum (número de acceso al GenBank: Nº X 94400). Después de 12 h, los filtros se lavaron tres veces, en cada caso durante 20 minutos a 55ºC, en un tampón que contenía 3 x SSC, 0,5% de SDS. A continuación, se colocó encima una película de rayos X durante aproximadamente 14 h.

Las calvas que se hibridaban fuertemente se aislaron, se diluyeron, se extendieron en placas nuevamente y se transfirieron a un filtro. Estas se hibridaron y lavaron de nuevo de la manera antes descrita. Después de una excisión in-vivo de los fagos aislados según los datos del fabricante (Stratagene), se aislaron diferentes plásmidos, que fueron caracterizados mediante un análisis por restricción. A continuación, se determinaron las secuencias de ADN de los plásmidos, que tenían las inserciones de ADNc más largas. Uno de estos plásmidos, que se designó como pZm_SS6, contenía la secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 1.

Ejemplo 2 Preparación de un vector para la transformación de plantas

Partiendo de un fragmento NotI/Bsp 120 I del plásmido pZm_SS6, que contiene la región codificadora total de la secuencia de nucleótidos indicada bajo la SEQ ID No. 1, se preparó mediante procedimientos clásicos el vector IR65/87 (véase la Figura 1), que, entre otras cosas, es adecuado para la producción de plantas de maíz transgénicas, que tienen una actividad aumentada (tanda de sobreexpresión) o una actividad disminuida (tanda de cosupresión) de la sintasa de almidón conforme al invento, y se depositó en la Colección Alemana de Microorganismos (DSM, en alemán "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen") el 5 de agosto de 1999 bajo el número de deposito DSM 12970.

El vector IR65/87 se utilizó para la transformación de plantas de maíz según los métodos antes descritos.

A continuación, se seleccionaron plantas transgénicas, que tenían o bien una actividad aumentada o una actividad disminuida de la proteína conforme al invento en comparación con correspondientes plantas de maíz no transformadas.

<110> Aventis CropScience GmbH

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<120> Moléculas de ácidos nucleicos procedentes de plantas que codifican enzimas, que participan en la síntesis de almidón

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<130> AGR 1999/M 225

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<140> 19 937 348.5

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<141> 1999-08-11

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<160> 29

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 4121

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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<220>

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<221> CDS

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<222> (442) .. (3954)

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<400> 1

1

2

3

4

5

6

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<210> 2

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<211> 1170

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<212> PRT

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<213> Zea mays

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<400> 2

7

8

9

10

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<210> 3

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: motivo VII

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<400> 3

11

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<210> 4

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: motivo VII

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<400> 4

12

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<210> 5

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: motivo VII

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<400> 5

13

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<210> 6

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: motivo VII

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<400> 6

14

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<210> 7

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: motivo VII

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<400> 7

15

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<210> 8

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: motivo VII

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<400> 8

16

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<210> 9

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: motivo VII

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<400> 9

17

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<210> 10

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: motivo VII

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<400> 10

18

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<210> 11

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: motivo VII

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<400> 11

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<210> 12

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: motivo VII

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<400> 12

20

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<210> 13

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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37

Claims

1. Molécula de ácido nucleico que codifica una proteína con la actividad biológica de una sintasa de almidón, escogida entre el conjunto que se compone de

(a): moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos indicada bajo la Seq ID No. 2.

(b): moléculas de ácidos nucleicos, que comprenden la secuencia de nucleótidos representada bajo la SEQ ID No. 1;

(c): moléculas de ácidos nucleicos, que comprenden la región codificadora de la secuencia de nucleótidos del ADNc, que está contenido en el plásmido IR 65/87, que se había depositado bajo el número de deposito DSM 12970;

(d): moléculas de ácidos nucleicos, cuya secuencia de nucleótidos se desvía de la secuencia de las moléculas de ácidos nucleicos mencionadas bajo (a), (b) o (c), a causa de la degeneración del código genético;

(e): moléculas de ácidos nucleicos, cuya secuencia es idéntica en más de un 85% con la región codificadora de la secuencia de nucleótidos indicada bajo la SEQ ID No. 1; y

(f): moléculas de ácidos nucleicos, cuya secuencia es idéntica en más de un 70% con la región codificadora de la secuencia de nucleótidos indicada bajo la SEQ ID No. 1, y que codifican una proteína, cuyos aminoácidos terminales de N 1 hasta 150 manifiestan una identidad de secuencias de por lo menos 65% con respecto a la secuencia de aminoácidos que se compone de los aminoácidos 1 a 150 de la SEQ ID No. 2.

2. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que es una molécula de ADN.

3. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que es una molécula de ARN.

4. Vector que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Vector de acuerdo con la reivindicación 4, que contiene uno o varios elementos reguladores, que garantizan la transcripción de las mencionadas moléculas de ácidos nucleicos y/o la síntesis de un ARN traducible en una célula pro- y/o eucariótica.

6. Vector de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 4 a 5, en el que la mencionada molécula de ácido nucleico está unida en una orientación en el mismo sentido con unos elementos reguladores, que garantizan la transcripción y la síntesis de un ARN traducible en células pro- y/o eucarióticas, o en el que la mencionada molécula de ácido nucleico está unida en una orientación antisentido con elementos reguladores, que garantizan la transcripción y la síntesis de un ARN no traducible en células pro- y/o eucarióticas.

7. Célula anfitriona bacteriana o vegetal, que ha sido modificada genéticamente mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 3 o de un vector de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 4 a 6.

8. Célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 7, que es una célula vegetal.

9. Proteína codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones
1 a 3.

10. Procedimiento para la preparación de una proteína de acuerdo con la reivindicación 9, en el que una célula anfitriona de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 7 a 8 se cultiva en unas condiciones que permiten la síntesis de la proteína, y la proteína se aísla a partir de las células cultivadas y/o del medio de cultivo.

11. Célula vegetal transgénica de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la mencionada molécula de ácido nucleico, que codifica una proteína con la actividad biológica de una sintasa de almidón, está bajo el control de elementos reguladores, que permiten la transcripción de un ARNm traducible en células vegetales.

12. Célula vegetal transgénica de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque en esta célula vegetal la actividad de una proteína de acuerdo con la reivindicación 9 está disminuida en comparación con correspondientes células vegetales no modificadas genéticamente, procedentes de plantas de tipo salvaje.

13. Célula vegetal transgénica de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque en esta célula vegetal la actividad de una proteína de acuerdo con la reivindicación 9 está aumentada en comparación con correspondientes células vegetales no modificadas genéticamente, procedentes de plantas de tipo salvaje.

14. Planta que contiene células vegetales de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 8 y 11 hasta 13.

15. Planta de acuerdo con la reivindicación 14, que es una planta útil.

16. Planta de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 14 a 15, que es una planta que almacena almidón.

17. Planta de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 14 a 16, que es una planta de maíz.

18. Planta de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizada porque el rendimiento de almidón ha aumentado en por lo menos un 10% en comparación con plantas no transformadas del mismo genotipo.

19. Procedimiento para la producción de una célula vegetal transgénica de acuerdo con la reivindicación 8, en el que una célula vegetal se modifica genéticamente mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 3 y/o de un vector de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones
4 a 6.

20. Procedimiento para la producción de una célula vegetal transgénica de acuerdo con la reivindicación 14, en el que

(a): una célula vegetal se modifica genéticamente mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 3 y/o de un vector de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 4 a 6;

(b): a partir de la mencionada célula se regenera una planta; y eventualmente

(c): a partir de la planta de acuerdo con (b) se producen otras plantas adicionales.

21. Material de reproducción de una planta de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 14 a 18, que contiene células vegetales de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 8 y 11 hasta 13.

22. Procedimiento para la producción de un almidón modificado que comprende la etapa de la extracción del almidón a partir de una célula vegetal de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 8 y 11 hasta 13, a partir de una planta de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 14 a 18 y/o a partir de un material de reproducción de acuerdo con la reivindicación 21.