ES2277600T3 - Composiciones de guanilhidrazona para el tratamiento de enfermedades inflamatorias. - Google Patents

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Abstract

Un compuesto con la fórmula: (1) donde: X1 y X2 = H-; y X''1, y X''2 independientemente = GhyCH- o GhyCCH3-, donde Ghy es una parte molecular de guanilhidrazona; Z = -A-(CH2)n-A-; n = 3-8; y A = -NH(CO)-; -(CO)NH-; -NH(CO)NH-; o Z = -O- (CH2)2 -O- y sales de los mismos; o donde el compuesto tiene la siguiente fórmula: donde: X2 y X''2 = H-; X1 y X''1 independientemente = GhyCH-, o GhyCCH3-, donde Ghy es una parte molecular de guanilhidrazona; y n = 3-8; y sales de los mismos; o donde el compuesto tiene la siguiente fórmula: donde: X2 y X''2 = H-; X1 y X''1 independientemente = GhyCH-, o GhyCCH3-, donde Ghy es una parte molecular de guanilhidrazona; y n = 2-10; y sales de los mismos.

Description

Composiciones de guanilhidrazona para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.
1. Introducción
Este invento trata nuevos compuestos y composiciones útiles para tratar condiciones inflamatorias, por ejemplo, para prevenir y aliviar la caquexia, el síndrome clínico del estado de mala nutrición y la emaciación asociada con el cáncer y otras enfermedades crónicas. Más particularmente, la invención trata composiciones de guanilhidrazona aromática ("Ghy", más correctamente llamada amidinohidrazona, es decir, composiciones de NH_{2}(CNH)-NH-N=) y su uso para inhibir la captación de arginina por macrófagos y/o su conversión en urea. Estas composiciones y estos compuestos también son útiles para prevenir la generación de óxido nítrico (NO) y la secreción de citocinas por macrófagos y otros tipos de células, previniendo así la inflamación mediada por el NO y otras respuestas en personas que lo necesitan. En otra realización, los compuestos pueden usarse para inhibir la captación de arginina en tumores e infecciones dependientes de la arginina.
2. Antecedentes de la invención
La caquexia es un síndrome caracterizado por la emaciación de la masa tisular en animales enfermos, y se refleja obviamente como pérdida de peso en el huésped. La caquexia es una complicación progresiva y frecuentemente fatal que se encuentra en muchos estados de enfermedad crónica diferentes, y sus consecuencias requieren que las metas de la terapia no se dirijan exclusivamente hacia el remedio de la enfermedad subyacente. La pérdida de las reservas de proteína, la pérdida de peso corporal y, en general, el mal estado nutricional de los pacientes caquécticos pueden ser fuentes independientes de morbosidad y mortalidad. Además, la debilitación asociada con la caquexia es una limitación importante de la capacidad del paciente para tolerar terapias médicas y quirúrgicas agresivas dirigidas a la etiología primaria.
2.1. Las señales de la caquexia son distintas a las de la inanición
La caquexia es una complicación grave, frecuentemente con riesgo de muerte, que se presenta en asociación con una variedad de insultos: cáncer, quimioterapia, lesión por irradiación, infección crónica, trauma y estrés quirúrgico. Una ingesta insuficiente para suplir los todos los requerimientos de energía del huésped es un elemento constante del síndrome caquéctico. Además de esta hipofagia relativa, una característica que define la caquexia, con frecuencia también hay anorexia.
Sin embargo, estudios del síndrome indican que la caquexia no se debe sencillamente a un consumo dietético de proteínas y carbohidratos menor a los requerimientos del huésped. La caquexia difiere de la privación calórica no forzada en que el patrón de emaciación observado durante la inanición parcial o completa se asocia con una pérdida de lípidos en todo el cuerpo junto con una conservación relativa de la proteína tisular. Por el contrario, la caquexia se caracteriza por la pérdida significativa tanto de lípidos como de proteínas en las reservas tisulares.
2.2. Las implicancias de las diferencias entre la caquexia y la inanición
La explicación general de la caquexia con mayor aceptación es que las proteínas del huésped se descomponen en los tejidos para proveer una fuente de aminoácidos. Se piensa que, a su vez, estos aminoácidos son necesarios para la síntesis de la glucosa, la albúmina y las proteínas de defensa del huésped en el hígado.
Esta teoría bien establecida sugiere que las terapias dirigidas a aumentar el consumo total de calorías y proteínas deberían aliviar sustancialmente el síndrome caquéctico. Sin embargo, ni siquiera una intervención tan drástica como la nutrición parenteral total puede tratar la caquexia con eficacia. (Brennan, 1986 NEJM 305:375, Detsky, et al., 1987, ANN INTERN MED 107:195, McGeer, et al., 1989, ANN INTERN MED 110:734, Koretz, 1984, J CLIN ONCOL 2:534).
Además del fracaso de la nutrición suplemental como modalidad terapéutica, la diferencia fundamental entre el patrón de pérdida de lípidos y proteínas de la caquexia y el de la inanición también indica que la caquexia no es producto exclusivo de los requerimientos nutricionales anormalmente mayores debidos a la enfermedad subyacente ni de la anorexia causada por el trastorno de la regulación fisiológica del apetito por la enfermedad. Más bien, las diferencias sugieren la presencia de algunos cambios fundamentales en el metabolismo del huésped debidos, directa o indirectamente, a la enfermedad subyacente.
En apoyo adicional de esta conclusión, existe una acumulación de evidencia que envuelve las proteínas reguladoras y efectoras solubles producidas por el huésped, conocidas como citocinas, en la cadena de eventos que conducen a la caquexia. Se han realizado experimentos en los cuales se unieron la circulación sanguínea de un animal normal y de un animal caquéctico. En estos experimentos con los llamados animales "parabiosed", se observó que el animal de otro modo normal rápidamente presentaba caquexia, aunque la enfermedad subyacente permanecía exclusivamente en el huésped original. Estas y otras observaciones implican fuertemente a los mediadores circulatorios como causa proximal de la caquexia; es decir, esta condición catabólica no es producto pasivo de las demandas metabólicas excesivas impuestas por el crecimiento de las células o de los organismos invasores, ni es el simple resultado de una ingesta menor a la requerida para satisfacer las demandas metabólicas.
Una posibilidad en cuanto a la identidad de estos factores humorales era que los mediadores solubles producidos durante la caquexia eran las moléculas que ya se habían identificado como moléculas con relación inmunitaria/inflamatoria del huésped (citocinas), cuya secreción por linfocitos y macrófagos estaba comprobada. La teoría de que estas citocinas participan de la caquexia fue confirmada al observar que la administración del factor de necrosis tumoral exógeno (también conocido como caquectina, abreviado en la presente como "FNT") a animales experimentales imitaba muchas características de la caquexia. (Darling et al., 1990, CANCER RES 50:4008; Beutler & Cerami, 1988, ADV IMMUNOL 42:213). Además, los antisueros anti-FNT pueden aliviar muchos, pero no todos, de los síntomas de la caquexia en sistemas tumorales experimentales. (Sherry, et al., 1989, FASEB J 3:1956; Langstein, et al., 1989, SURG FORUM 15:408).
2.3. El impacto del papel de las citocinas en la caquexia en la búsqueda de terapias
Debería estar en claro que aunque se pudieran atribuir todos los aspectos del síndrome caquéctico a una sola citocina o, alternativamente, a la actividad de una combinación de varias citocinas, hormonas y otros factores humorales, tal conocimiento no brindaría por sí mismo un mecanismo celular o bioquímico para explicar los cambios metabólicos que subyacen a la caquexia ni conduciría directamente a una terapia eficaz. Por último, las citocinas deben interactuar con células diana e inducir cambios metabólicos o fenotípicos en sus blancos para tener significado fisiológico y patofisiológico. En consecuencia, la identificación general de la mediación de las citocinas y las implicancias específicas de mediadores de citocinas particulares sólo son objetivos intermedios para determinar los precisos cambios metabólicos celulares y/o sistémicos que ocurren para inducir el cuadro caquéctico completo.
Los hallazgos que implican a las citocinas como mediadoras de los diversos síndromes caquécticos, combinados con el enfoque generalizado en el hígado y los músculos periféricos como principales contribuyentes de los cambios metabólicos de la caquexia, impulsaron a muchos a estudiar los efectos de las citocinas conocidas en el hígado y las células musculares, y a buscar nuevas citocinas que afecten a estos tejidos. Sin embargo, hasta la fecha, no se ha comprobado que ninguna citocina conocida, en forma individual o combinada, movilice directamente a los aminoácidos en las reservas proteicas en sistemas in vitro que usan células típicas de estos supuestos sitios de descomposición proteica in vivo.
2.4. El óxido nítrico como mediador del shock endotóxico
El óxido nítrico (NO), una molécula producida enzimáticamente a partir de L-arginina por la sintasa del óxido nítrico (NOS), es mediador tanto de homeostasis fisiológica como de citotoxicidad inflamatoria. Moncada, S. & Higgs, A., 1993, THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE 329, 2001-2012; Nathan, C. 1992, FASEB J 6, 3051-3064. La producción de NO por medio de los isoformos constitutivos e inducibles de la NOS en células endoteliales, por ejemplo, causa vasodilatación y gobierna la tensión arterial y la perfusión tisular. Kilbourn, R. G., Jubran, A., Gross, S. S., et al., 1990, BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. 172,1132-1138. Por otra parte, la producción de NO por una NOS inducible en macrófagos activados confiere [sic] citotóxico, aumenta la permeabilidad vascular y mejora la liberación de FNT\alpha e IL-1. Ding, A. H., Nathan, C. F. & Stuehr, D. J. J Immunol. 141, 2407-2412 (1988); Kubes, P. & Granger, D. N. Am. J. Physiol. 262, H611-H615 (1992); Van Dervort, A. L., Yan, L., Madara, P. J., et al. J Immunol. 152, 4102-4109 (1994); Bouskela, E. & Rubanyi, G. M. SHOCK 1, 347-353 (1994); Hibbs, J. B.,Taintor, R. R. & Vavrin, Z. Science 235, 473-476 (1987); Granger, D. L., Hibbs, J. B., Perfect, J. R. & Durack, D. T. J. Clin. Invest. 85, 264-273 (1990). La comprensión de las diversas acciones biológicas del NO ha sido facilitada por compuestos que interfieren con la NOS para inhibir la producción del NO. Sin embargo, porque los isoformos de la NOS están altamente conservados, no se ha comprobado que los inhibidores de la NOS disponibles hayan discriminado significativamente entre las actividades de la NOS constitutiva versus la inducible.
Los inhibidores de la NOS previamente disponibles han tenido un éxito limitado en mejorar la supervivencia tras la endotoxemia, en parte porque suprimen indiscriminadamente el factor de relajación de derivación endotelial (FRDE), Cobb, J. P., et al., 1992, J. EXP. MED. 176:1175-1182; Minnard, E. A., et al., 1994, ARCH SURG. 129:142-148; Billiar, T. R., 1990, et al., J LEUKOCYTE BIOL. 48:565-569. La supresión del FRDE durante la endotoxemia podría menoscabar la supervivencia, causando vasoconstricción y una reducción del flujo sanguíneo a lechos vasculares críticos. Hasta ahora no se han referido compuestos que inhiban el NO de macrófagos inducibles por citocinas sin inhibir también el NO de derivación endotelial.
La patente estadounidense 3.560.557 divulga diguanilhidrazonas de difenil ureas y la patente de GB 923.398 divulga difenil mono- y bis-formil guanilhidrazonas.
Korytnyk et al., 1978, J. MED. Kern. 21:507-513 divulgan análogos de 4,4'-diacetil-N,N'-difenil urea bis (guanilhidrazona).
Mihich, E. y Mulhern, A. I., 1968, Cancer Research 28:354-362 divulgan diacetil-difenil-urea-bis (guanilhidrazona).
La patente estadounidense 3.143.461 divulga compuestos de diamidino difenil urea.
Todos estos documentos describen compuestos con dos partes moleculares aromáticas idénticas en los cuales cada parte se sustituye con una sola guanilhidrazona, mientras que en los compuestos de la invención se reemplaza al menos un átomo de hidrógeno del anillo de fenilo con una parte de guanilhidrazona.
3. Resumen de la invención
Esta invención trata los compuestos y el uso de los mismos para tratar la caquexia mediante la inhibición de la producción de urea, más particularmente la producción de urea por macrófagos, y la inhibición de los procesos de transporte que median la captación de arginina, particularmente por macrófagos. Los compuestos de la invención también pueden usarse para limitar o prevenir el daño inducido por respuestas mediadas por el NO asociadas con accidentes cerebrovasculares, shock, inflamación y otras afecciones relacionadas con el NO. Otro objeto de la invención trata la inhibición de la captación de arginina en el tratamiento de tumores o infecciones, donde las células tumorales, las células infectadas o el agente infeccioso requieren arginina. Otro objeto más de la invención es la inhibición de la secreción nociva de citocinas, como el factor de necrosis tumoral, por macrófagos activados.
La clase de compuestos útiles para los fines de la invención incluye, sin limitarse a ellos, aromáticos sustituidos con múltiples partes moleculares de guanilhidrazona (Ghy), más correctamente llamadas amidinohidrazonas. Se describen la síntesis y el uso de tales compuestos. La invención además abarca ensayos selectivos para probar las actividades nombradas anteriormente en compuestos adicionales, así como composiciones farmacéuticas útiles en la práctica de este método terapéutico.
Debido a la relación estrecha entre la producción de urea y la síntesis fisiológica del óxido nítrico, los compuestos de esta invención también pueden ser eficaces en la limitación de la producción celular del NO, particularmente por macrófagos.
Aunque no está limitada a ninguna teoría que explica cómo o por qué funcionan las terapias descritas y reivindicadas en la presente, la invención está basada, en parte, en el desarrollo del siguiente modelo de caquexia por los Solicitantes: en la caquexia, macrófagos activados agotan las reservas de nitrógeno del huésped, convirtiendo la arginina circulante en productos finales nitrogenosos que son eliminados del cuerpo y requieren catabolismo proteico por los músculos y/o el hígado y otros órganos para reemplazar la arginina sérica perdida. Es así que los macrófagos activados crean un "sumidero de nitrógeno" que permanentemente drena nitrógeno de las reservas sistémicas, obligando al cuerpo a compensar catabolizando proteínas tisulares para liberar aminoácidos como nuevas fuentes de nitrógeno. El modelo se basa en los experimentos de los Solicitantes que, al tratar de identificar un factor liberado por los macrófagos activados que hiciera que otros tejidos produjeran urea, hallaron que los mismos macrófagos activados sintetizan la urea directamente, descomponiendo la arginina.
Los macrófagos activados descomponen la arginina de dos maneras: (a) en urea y ornitina o (b) en citrulina y óxido nítrico (Figura 1). La urea y el óxido nítrico así generados eliminan el nitrógeno de todas las reservas de nitrógeno del cuerpo, ya que estos metabolitos no pueden reciclarse lo suficientemente para volver a usarse. En consecuencia, en la caquexia, los macrófagos activados agotan la arginina plasmática. Los mecanismos del cuerpo para mantener la homeostasis de la arginina plasmática entonces requieren el catabolismo de las proteínas en los músculos, el hígado y otros órganos para liberar fuentes de nitrógeno y arginina. El descubrimiento de que la descomposición de la arginina en el macrófago activado es una causa proximal de la movilización inapropiada de las reservas de proteína tisular permitió el desarrollo de las terapias descritas en la presente: es decir, interferencia con la captación de arginina por macrófagos activados y/o la producción de urea a partir de la arginina para detener la pérdida inexorable de la urea por el "sumidero de nitrógeno", inhibiendo así el catabolismo adicional de la proteína tisular.
Otro objeto de la invención es proporcionar compuestos y usos de los mismos para inhibir la producción de óxido nítrico por macrófagos para superar la limitación impuesta por la ausencia de un inhibidor de la sintasa de óxido nítrico específico a macrófagos. Sin limitaciones teóricas, razonamos que se podía sacar ventaja del requerimiento de la captación de arginina por los macrófagos pero no de las células endoteliales inducidas a producir NO. Se halló que los compuestos de esta invención inhiben la producción de NO por los macrófagos sin inhibición alguna de la producción del NO vasoactivo (de derivación endotelial). En consecuencia, se pueden usar los compuestos de la invención ventajosamente para contrarrestar los efectos inducidos por macrófagos y mediados por el NO que acompañan, por ejemplo, el shock endotóxico y séptico.
Lo anterior se presenta a modo de ilustración, no de limitación. Aunque la invención se desarrolló con el conocimiento del trasfondo del modelo de la fisiología de la caquexia, la invención en sí entraña el uso de análogos de arginina, arginomiméticos y otros compuestos con grupo(s) de guanilhidrazona no metabolizable para inhibir la producción de urea por los macrófagos. Una clase general de tales compuestos consiste en aromáticos que contienen guanilhidrazonas. Estos compuestos pueden sintetizarse mediante la reacción de acetilbencenos y benzaldehídos con aminoguanidina y ácido a altas temperaturas en etanol acuoso. (Ulrich, et al., 1982, DRUG DEVELOPMENT RESEARCH 2:219; y Ulrich & Cerami, 1984 MEDICINAL CHEMISTRY 27:35, que se incorporan en la presente por referencia).
Esta invención se demuestra mediante ejemplos funcionales que describen la síntesis de los compuestos usados según la invención (Sección 6, infra); un ensayo de células enteras para identificar compuestos que inhiben la producción de urea (Sección 7, infra); un ensayo de células enteras para identificar compuestos que inhiben la captación de arginina (Sección 8, infra); un ensayo de inhibición de la arginasa (Sección 9, infra); la demostración de la eficacia de la invención en un sistema de modelo animal para la caquexia (Sección 10, infra); la demostración de la eficacia de la invención para reducir la inflamación en un modelo animal usando hinchazón de la pata inducida por carrageenina (Sección 11, infra); la demostración de la eficacia de la invención in vivo para prevenir muertes inducidas por lipopolisacáridos (Sección 13, infra) sin bloquear los efectos del factor de relajación de derivación endotelial (Sección 12, infra) y la eficacia de la invención in vitro para prevenir la secreción del factor de necrosis tumoral por células RAW 264.7 estimuladas por LPS e interferón-\gamma (Sección 14, infra). Los resultados de las Secciones 12-14 indican la eficacia para prevenir la morbosidad y la mortalidad asociadas con el shock tóxico o el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica. Cinco ejemplos adicionales muestran la eficacia del Compuesto No. 14 para reducir la gravedad del infarto inducido por la oclusión de la arteria cerebral media de la rata (Sección 15, infra) y para reducir el crecimiento de un neoplasma experimental en un modelo de ratón desnudo (Sección 16, infra).
4. Breve descripción de las figuras
Fig. 1. Bioquímica de la degradación de arginina por células inflamatorias y ciclos de sustratos interorgánicos.
Fig. 2. Producción de urea por macrófagos residentes.
Fig. 3. La producción de urea por macrófagos es estimulada por LPS e interferón-\gamma. Control - \medcirc -; IFN\gamma (25 U/mL) --\medbullet--; LPS (100 ng/mL) --\lozenge--; IFN\gamma (25 U/mL) + LPS (100 ng/mL) --\blacklozenge--.
Fig. 4. Relación de la respuesta a la dosis del efecto del interferón-\gamma de LPS en la producción de urea por células RAW 264.7 con y sin la presencia de fármacos complementarios. Fig. 4A. Varias dosis de interferón-\gamma con y sin 100 ng/mL LPS; Fig. 4B. Varias dosis de LPS con y sin 25 U/mL interferón-\gamma.
Fig. 5. Dependencia de la producción de urea por RAW 264.7 de arginina extracelular. Control --\medbullet--; IFN\gamma (25 U/mL)+ LPS (100 ng/mL) --\ding{115}--.
Fig. 6. Transporte de arginina. Captación de tetra-^{3}H-arginina por células RAW 264.7 en diversos momentos después de la estimulación.
Fig. 7. Estructuras químicas de compuestos ejemplares de la invención. Fig. 7A. No. 1-7; Fig. 7B. No. 8-13; Fig. 7C. No. 14-20; Fig. 7D. No. 21-24; Fig. 7E. No. 25-27; Fig. 7F. No. 28-30; Fig. 7G. No. 31-33; Fig. 7H. No. 34-36; Fig. 71 No. 37-40; Fig. 7J. No. 41-43.
Fig. 8. Dependencia de la dosis de los efectos protectores del Compuesto No. 14 en la hinchazón de la pata de ratón inducida por carrageenina-\lambda.
Fig. 9. Comparación del efecto en la hipotensión inducida por acetilcolina del Compuesto No. 14 y del inhibidor de la sintasa del óxido nítrico conocido, L-N^{G}-metil-arginina.
Fig. 10. Efectos del Compuesto No. 14 en la mortalidad inducida por LPS.
Fig. 11. Efectos del Compuesto No. 14 en la secreción del FNT por células RAW 264.7 estimuladas por LPS/inter-
ferón-\gamma.
Fig. 12. Transferencia western del medio de células RAW 264.7 estimuladas por LPS/interferón-\gamma, mostrando la producción del FNT por células tratadas con 0,1, 5 y 25 \muM del Compuesto No. 14.
Fig. 13. Comparación de los efectos combinados del Compuesto No. 14 y de la arginina extracelular en la producción de NO y FNT por células RAW 264.7 estimuladas por LPS/IFN\gamma. Fig. 13A. Producción de NO: Control --\medbullet--; 1 \muM No. 14 --\nabla--; 5 \muM No. 14 --\ding{116}--; 25 \muM No. 14 --\boxempty--. Fig. 13B. Producción de FNT: Control --\medbullet--; 5 \muM No. 14 --\ding{116}--; 25 \muM No. 14 --\nabla--.
Fig. 14. Efectos del Compuesto No. 14 en la producción de citocinas por PBMC estimuladas por LPS/IFN\gamma. Fig. 14A. Factor de necrosis tumoral; Fig. 14B. IL-6; Fig. 14C. Proteína-1\alpha inflamatoria macrófaga Fig. 14D. Proteína-1\beta inflamatoria macrófaga.
Fig. 15. Efectos del Compuesto No. 14 en el transporte de la arginina en reposo, --\medbullet-- y células RAW estimuladas, --\nabla--.
Fig. 16. Efectos del Compuesto No. 14 en la producción de NO por células RAW 264.7 estimuladas por IFN\gamma/LPS durante 8 horas y expuestas al Compuesto No. 14 durante 4 horas más.
5. Descripción detallada de la invención
Esta invención trata los compuestos para tratar la caquexia mediante la inhibición de la producción de urea, más particularmente de la producción de urea por macrófagos. Los compuestos de la invención también pueden usarse para limitar o prevenir el daño inducido por respuestas mediadas por el NO asociadas con accidentes cerebrovasculares, shock, inflamación y otras afecciones relacionadas con el NO. Con este fin, esta invención trata la inhibición de la producción de urea y de NO por macrófagos, y, más particularmente, la inhibición de la producción de urea excesiva inducida y la inhibición de los procesos de transporte que median la captación de la arginina por los macrófagos. La invención también incluye la inhibición de la secreción nociva de citocinas, por ejemplo, el factor de necrosis tumoral (FNT). Una realización alternativa de la invención trata la inhibición de la captación de la arginina en el tratamiento de tumores o infecciones, donde las células tumorales o el agente infeccioso requieren arginina.
La clase de compuestos útiles para la invención incluye aromáticos sustituidos con múltiples porciones moleculares de guanilhidrazona, más correctamente llamadas amidinohidrazonas. Se describen la síntesis y el uso de tales compuestos. La invención además abarca ensayos selectivos para probar tal actividad en compuestos adicionales y composiciones farmacéuticas útiles en la práctica de este método terapéutico.
Históricamente, nuestros estudios iniciales estuvieron dirigidos al descubrimiento de un mediador soluble hipotético producido por macrófagos que hiciera que hepatocitos cultivados produjeran más urea. Más particularmente, nos propusimos encontrar un mediador producido por macrófagos estimulados o activados como los que se encuentran en muchos estados morbosos crónicos asociados con la caquexia. Estudios de control realizados durante los intentos iniciales por aislar una citocina que causara un aumento de la producción de urea por hepatocitos in vitro condujo al descubrimiento inesperado que los mismos macrófagos activados producen urea en cantidades importantes. La relevancia de esto para las condiciones in vivo se confirmó mediante experimentos que mostraron una mayor producción de urea por macrófagos aislados de ratones vueltos caquécticos mediante un tumor trasplantado (Figura 2). Estos estudios tuvieron la confirmación adicional de la demostración que la línea de macrófagos múrida RAW 264.7 responde a los activadores de macrófagos LPS e IFN\gamma con un aumento de la producción de urea, que depende de la disponibilidad extracelular de la arginina (Figuras 3-5). Estos estudios condujeron al ensayo de actividad farmacológica, descrito en detalle más adelante en la presente. Los compuestos usados en la invención instantánea se identificaron en base a este ensayo y se usaron en sistemas de modelos animales que muestran la eficacia de la invención Secciones 10,11,12,13,15 y 16, infra).
Los resultados anteriores indican que la secreción de citocinas por macrófagos activados es sólo un aspecto del proceso caquéctico. Desarrollamos el siguiente modelo y la siguiente hipótesis, presentados sólo con fines de explicación, sin limitar la invención a ningún mecanismo o modelo científico en particular. Los procesos metabólicos directos de los macrófagos activados son de igual importancia en este modelo. Los datos indican que, en la caquexia, los macrófagos activados producen y secretan urea en abundancia. La magnitud de la pérdida de nitrógeno, que puede atribuirse directamente a los macrófagos, puede calcularse a partir de datos de cultivos experimentales. Tales estudios muestran que un solo macrófago activado produce alrededor de 50 pg de urea/día. Si se calcula que la fracción de macrófagos activados es de alrededor del 10% de toda la población de células inmunes del ser humano, hay un total de alrededor de 10^{11} macrófagos activados. Esta población podría dar cuenta, correspondientemente, de la pérdida de alrededor de 5 gramos de nitrógeno por día, lo cual se traduce en aproximadamente 30 gramos de proteína por día. Una pérdida de esta magnitud representa una fracción importante de la pérdida de peso que se observa clínicamente a lo largo del tiempo en la caquexia crónica.
Según la invención, la inhibición de la producción de urea, en particular la inducida en macrófagos, invertirá el proceso. El metabolismo celular macrófago difiere del metabolismo hepático en cuanto a las enzimas disponibles para completar el llamado "ciclo de urea". En ambos tejidos, el paso final de la producción de urea es una partición hidrolítica por la enzima arginasa de la parte amidino de la arginina, para dar ornitina y urea (Figura 1). Una diferencia sobresaliente entre la producción de urea por macrófagos y por el hígado es que a los macrófagos les faltan cantidades importantes de la enzima transcarbamoilasa de ornitina y, por lo tanto, no pueden rescatar eficientemente la ornitina producida por la arginasa y tampoco pueden usar el amoníaco (NH_{4}) directamente para formar la urea, sino que deben depender de un suministro de arginina exógeno. En segundo lugar, parecería que hay dos enzimas de arginasa. Ambas catalizan la liberación hidrolítica de la urea. Una se encuentra especialmente en macrófagos y la segunda se encuentra típicamente en hepatocitos del hígado.
Estas diferencias entre la producción de urea por macrófagos y por el hígado tienen dos implicancias. Primero, los macrófagos agotarán la arginina selectivamente del plasma. Esta arginina circulante debe, en última instancia, ser reemplazada por la descomposición proteica en otros tejidos, porque la conversión de nitrógeno en urea es esencialmente irreversible; es decir, la urea ya no puede metabolizarse para volver a usarse. La arginina en sí se sintetiza a partir de un \alpha-queto glutarato y amoníaco por sintetasa de glutamato, sintetasa de glutamina y sintetasa de carbamoil fosfato. En segundo lugar, dado que la producción de urea depende de la captación de arginina, mientras que la síntesis de urea hepática no lo hace, tal vez sea posible bloquear selectivamente la pérdida de nitrógeno asociada con la caquexia, dejando las funciones hepáticas correspondientes relativamente inalteradas.
Además, podría ser ventajoso bloquear específicamente la forma macrófaga de la enzima arginasa y no la forma hepática. En la presente se describen ensayos in vitro para detectar la medida en la cual los compuestos de prueba inhiben específicamente cada uno de estos procesos metabólicos. Estos ensayos utilizan la línea celular macrófaga RAW 264.7. Se probaron veinte compuestos, incluidos 15 compuestos nuevos, por la inhibición de la producción de urea por macrófagos en un ensayo de la línea celular RAW 264.7. Seis de los compuestos revelan una CI_{50} de alrededor de 10 \muM o menos, y se han observado cinco compuestos adicionales con una CI_{50} de más de 10 \muM pero menos de alrededor de 100 \muM(consúltese la Sección 7.2).
Cualquier medio conocido para inhibir la producción de urea por macrófagos puede incluir el uso de metodologías de ADN recombinante, sin limitarse a ello. Por ejemplo, se introducirá en los macrófagos del huésped caquéctico un vector que expresa un mensaje antisentido complementario al ARNm de la forma macrófaga de la arginasa. Como alternativa, podría emplearse una ribozima específica para el ARNm de la forma macrófaga de la arginasa. La introducción específica de los vectores apropiados en los macrófagos se obtendrá usando portadores de liposomas.
Esta invención puede usarse para inhibir la producción del óxido nítrico (NO), particularmente de la enzima NO-sintasa. El NO es producido por macrófagos activados y células endoteliales vasculares, entre otras fuentes celulares. El NO ha sido implicado como factor patológico causativo en una variedad de afecciones inflamatorias, particularmente en circunstancias de shock y de necrosis isquémica (infarto) del miocardio y del sistema nervioso central. La NO-sintasa cataliza la oxidación de la arginina en citrulina acompañada por una liberación de NO. En consecuencia, los compuestos que inhiben la captación de la arginina serán supresores eficaces de la actividad de la NO-sintasa a nivel celular. Además, los compuestos de las clases mencionadas anteriormente podrían ser inhibidores específicos de la NO-sintasa a nivel molecular. Los datos mostrados en la presente muestran que los compuestos usados según la invención inhiben la producción del NO sin inhibir la actividad del FRDE.
En otra realización más, la invención puede usarse para tratar el shock tóxico, también conocido como síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS). Los datos descritos en la presente muestran que los compuestos de la invención actúan por dos vías independientes para prevenir la mortalidad y la morbosidad asociadas con el SRIS: (a) previniendo la captación de arginina, bloqueando así la síntesis del NO por macrófagos activados; y (b) bloqueando la secreción de citocinas como el factor de necrosis tumoral (FNT).
En otra realización más de la invención, la inhibición de la captación de la arginina puede usarse para tratar tumores o infecciones en los cuales las células tumorales o el agente infeccioso requieren arginina. Por ejemplo, los tumores con requerimientos de arginina incluyen, sin limitarse a ellos, tumores de la mama, el hígado, el pulmón y el cerebro, mientras que los agentes infecciosos con requerimientos de arginina incluyen, sin limitarse a ellos, Pneumocystis carinii, Trypanosoma brucei, T. congolense y T. evansi.
Los ejemplos de inhibidores que podrían usarse según la invención incluyen, sin limitarse a ellos, análogos de arginina; más particularmente una clase de compuestos de arileno sustituidos con partes moleculares de [(aminoiminometil)hidrazono]metilo y partes moleculares de [2-(aminoiminometil)hidrazono]etilo (en adelante llamadas colectivamente "guanilhidrazonas"); más preferentemente compuestos de difenilo con 2, 3 ó 4 partes moleculares de guanilhidrazona. Estos compuestos inhibidores tienen un análogo no hidrolizable o más del grupo guanadino de la arginina.
De los compuestos de guanilhidrazona cuya actividad se examinó en esta invención, los compuestos con una sola parte molecular de guanilhidrazona eran inactivos o requerían concentraciones de mM para lograr una reducción del 50% de la producción de urea. Los compuestos de bencilo y difenilo con 2, 3 ó 4 partes moleculares de guanilhidrazona eran activos en algunos casos con menos de 10 \muM. En todos los casos ensayados, los compuestos altamente activos inhibieron no sólo la producción de la urea, sino que inhibieron el transporte de la arginina a la célula. Una realización preferida de esta invención consiste en compuestos de fenilo sustituidos con di, tri y tetra guanilhidrazona, que tienen dos núcleos de fenilo enlazados por una alcanodiamida o dos núcleos de fenoxi enlazados por un alcano. Una segunda realización preferida consiste en triacetilfenil o triformilfenil tris(guanilhidrazonas). Los ejemplos de tales compuestos útiles que se conocían incluyen bisguanilhidrazona de monoarileno, por ejemplo, bis(guanilhidrazona) de 1,3-diacetilpiridina (2), Ulrich, 1982, un monoarileno; tris(guanilhidrazona), por ejemplo, tris(guanilhidrazona) de 1,3,5-triacetilbenceno (1), Ulrich, 1984; y una (bis(guanilhidrazona) de bisarileno, por ejemplo, bis(guanilhidrazona) de 4,4'-diacetildifenilurea (8), Korytnyk, W. et al., J. MEDICINAL CHEMISTRY 21:507-13, 1978. Estos compuestos inhiben la producción de urea por los macrófagos in vitro en concentraciones entre alrededor de 10 \muM y alrededor de 50 \muM. Compuestos nuevos adicionales de esta invención tienen actividad inhibidora en concentraciones cinco veces menores. Tales compuestos incluyen una tris(guanilhidrazona) de bisarileno, por ejemplo, tris(guanilhidrazona) de 3,5,4'-triacetildifenilurea (Figura 7.9), una tetrakis (guanilhidrazona) de bisarileno, por ejemplo, tetrakis (guanilhidrazona) de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)decanodiamida (Figura 7.14) y bis(guanilhidrazona de 3,3'-(etilendioxi)dibenzaldehído (Figura 7.16).
El ámbito de la invención además contempla compuestos de guanilhidrazono de tris arileno en los cuales cada grupo de arileno lleva 1 ó 2 sustituyentes de guanilhidrazonoalquilo. Tales compuestos pueden sintetizarse usando los métodos enseñados en la presente.
5.1. Ensayos para identificar compuestos activos
Los siguientes ensayos pueden usarse para identificar los compuestos empleados en la invención. Además, los ensayospueden usarse para determinar la CI_{50} (es decir, la concentración que logra la mitad de la inhibición máxima del parámetro ensayado) para cada compuesto probado. Cuando se usa in vivo, la dosis de cada compuesto debe formularse para lograr una gama de concentraciones circulantes que incluyan la CI_{50} medida in vitro.
Los ensayos son ejemplares y no tienen la intención de limitar el alcance del método de la invención. Las personas con destreza en la técnica apreciarán que se pueden realizar modificaciones al sistema de ensayo para desarrollar ensayos equivalentes que obtienen el mismo resultado. Se utilizó la línea celular RAW 264.7 en los ejemplos funcionales descritos en la presente. Sin embargo, la invención no se limita a la línea celular RAW 264.7, que podría reemplazarse con cualquier línea celular macrófaga o con macrófagos no transformados activados en un cultivo primario.
5.1.1. Ensayo de célula entera para la producción de urea y óxido nítrico
Por lo general, el ensayo de célula entera para la producción de urea puede realizarse de la siguiente manera: se activan macrófagos o células endoteliales (p. ej., usando factores que incluyen, sin limitarse a ellos, IFN\gamma y LPS, de acuerdo a lo descrito en los ejemplos, infra) en presencia de inhibidores de prueba. Tras un período de cultivo apropiado, p. ej., aproximadamente desde toda la noche hasta 2 días, se analiza el sobrenadante del cultivo para detectar la presencia de urea y óxido nítrico. Se puede medir la producción de urea y óxido nítrico por cualquier línea celular mediante los mismos ensayos colorimétricos usados en laboratorios clínicos para determinar las concentraciones séricas de estos mismos compuestos. Los efectos de diversas concentraciones del inhibidor pueden determinarse por comparación con el sobrenadante de cultivos de control no tratados con el inhibidor de prueba. Puede incluirse un control adicional para identificar la toxicidad en cualquier dosis inhibidora. Para tales fines, puede emplearse un ensayo para la liberación de la enzima intracelular deshidrogenasa de lactato, de acuerdo a lo utilizado en los ejemplos descritos infra, o un control equivalente.
5.1.2. Ensayo de célula entera para la captación de arginina
Se mide la inhibición de la actividad concentradora transmembranosa de la arginina por los compuestos de esta invención usando arginina con marcado radioactivo libre de portadores. Para este fin, se cultivan las células para permitir que se adhieran (p. ej., desde 2 horas hasta toda la noche) y se activan (p. ej., usando factores que incluyen pero no se limitan a IFN\gamma y LPS, de acuerdo a lo descrito en los ejemplos funcionales infra) en presencia del inhibidor de prueba. Tras un período de incubación apropiado, se agrega arginina libre de portadores al cultivo. Después de un período corto (p. ej., 5 minutos), se lavan las células con una solución que contiene arginina sin marcar para desplazar toda la arginina con marcado radioactivo no ligada específicamente a las células en cultivo. Luego se disuelven las células con lisinas y se analizan los lisatos celulares para detectar la presencia de arginina con marcado radioactivo. Los efectos de los compuestos de prueba se determinan comparando la incorporación del marcado radioactivo en las células tratadas con los cultivos celulares de control no tratados con el posible inhibidor.
En la realización descrita en el ejemplo funcional de la presente, se cultivó una población de prueba durante alrededor de 3 horas para que las células se adhirieran con firmeza. Luego se agregaron diversas concentraciones de los posibles inhibidores a cultivos paralelos. Una hora más tarde, se agregaron los estimuladores macrófagos, p. ej., LPS e IFN\gamma, sin limitarse a ellos. Dieciocho horas más tarde, se lavaron las células en una solución salina balanceada tibia suplementada con glucosa. Se agregó arginina con marcado radioactivo libre de portadores, Después de 5 minutos, se detuvo la captación activa de arginina lavando la célula tres veces con tampón, enfriado hasta 0ºC, que contenía 10 mM de arginina no marcada para desplazar todo marcado ligado externamente. Se solubilizó el contenido de las células lavadas en 100 \mul de ácido fórmico y se contó mediante técnicas estándares.
5.1.3. Ensayo de lisatos celulares para la actividad de arginasa
El ensayo de lisatos celulares para la actividad de arginasa entraña exponer un lisato celular a un tampón activador de arginasa en presencia del compuesto de prueba. Tras un período de incubación apropiado, se agrega arginina y se determina la actividad enzimática de la arginasa, p. ej., midiendo la concentración de urea en la muestra. La actividad inhibidora de los compuestos de prueba se determina comparando los resultados obtenidos con muestras de control no expuestas al compuesto de prueba. Como se demostró en los ejemplos funcionales, infra, la inhibición directa de la arginasa se determina preparando primero un sobrenadante de baja velocidad de un lisato celular en una concentración proteica entre 0,5 y 4 mg/mL. El sobrenadante se mezcla a una razón de 1:4 con un tampón de activación que contiene MnCl_{2} y albúmina, y se incuban alícuotas con diversas concentraciones del posible compuesto inhibidor. Tras un período de 20 minutos de activación por calor a 55ºC, se lleva la solución a 0,25 M de arginina, y luego se incuba a 37ºC durante 20 minutos. Se agrega TCA para remover la proteína por centrifugación. Luego se determina la concentración en urea del sobrenadante mediante ensayo colorimétrico basado en diacetilmonoxima.
5.2. Compuestos activos
Usando los bioensayos in vitro indicados anteriormente, se han identificado compuestos que inhiben la producción de urea y de óxido nítrico, así como la captación de arginina. Los resultados de estos experimentos se encuentran resumidos en la Sección 7.2. De los veinte (20) compuestos examinados, seis (6) son inhibidores eficaces en concentraciones entre 1 y 10 \muM: son los Compuestos No. 1, 9, 13, 14, 15 y 16. Seis (6) compuestos adicionales fueron eficaces en concentraciones entre 10 y 100 \muM: son los Compuestos No. 2, 8, 11, 18 y 19. El compuesto identificado como el más activo (Compuesto No. 14) se usó in vivo en modelos animales de caquexia, inflamación mediada por NO, shock inducido por endotoxinas, infarto cerebral y neoplasia. En cada uno de estos modelos, el Compuesto No. 14 demostró ser eficaz (Secciones 10, 11, 13, 15 y 16 infra).
\newpage
5.2.1. Compuestos y sus síntesis
En adelante, GhyCH- = NH_{2}(CNH)-NH-N=CH- y GhyCCH_{3}- = NH_{2}(CNH)-NH-N=CCH_{3}-. Los compuestos de la invención incluyen los tres siguientes compuestos principales. El primero consiste en compuestos con la siguiente fórmula:
1
donde
X_{1} y X_{2} = H-; y
X'_{1}y X'_{2} independientemente = GhyCH- o GhyCCH_{3}-; donde Ghy es una parte molecular de guanilhidrazona;
Z = -A-(CH_{2})_{n}-A-;
n = 3-8; y
A = -NH(CO)-, -(CO)NH-, -NH(CO)NH-;
o
Z = -O-(CH_{2})_{2}-O-
y sales de los mismos.
Para facilitar la síntesis, una realización preferida incluye estos compuestos, donde A es una sola funcionalidad. Una realización preferida incluye compuestos con la misma fórmula, donde
X_{1} y X_{2} = H-; y
X'_{1} y X'_{2} = GhyCCH_{3}-, donde Ghy es una parte molecular de guanilhidrazona;
Z = -A-(CH_{2})_{n}-A-;
n = 3-8; y
A = -NH(CO)-, -(CO)NH-, -NH(CO)NH-;
y sales de los mismos.
También incluye compuestos donde
X_{1} y X_{2} = H-; y
X'_{1} y X'_{2} = GhyCCH_{3}-, donde Ghy es una parte molecular de guanilhidrazona; y
Z = -O-(CH_{2})_{2}-O-;
y sales de los mismos.
\newpage
El segundo de los grupos principales de compuestos consiste en compuestos con la siguiente fórmula:
2
donde:
X_{2} y X'_{2} = H-;
X_{1} y X'_{1} independientemente = GhyCH-, o GhyCCH_{3}-, donde Ghy es una parte molecular de guanilhidrazona; y
n = 3-8;
y sales de los mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
Una realización preferida incluye compuestos con la misma fórmula donde
X_{2} o X'_{2} = H-;
X_{1} o X'_{1} = GhyCCH_{3}-; y
n = 3-8;
y sales de los mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
El tercer grupo principal de compuestos consiste en compuestos con la siguiente fórmula:
3
donde:
X_{2} y X'_{2} = H-;
X_{1} y X'_{1} independientemente = GhyCH- o GhyCCH_{3}-, donde Ghy es una parte molecular de guanilhidrazona; y
n = 2-10;
y sales de los mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
Una realización preferida incluye compuestos con la misma fórmula donde
X_{2} y X'_{2} = H-;
X_{1} y X'_{1} = GhyCCH_{3}-; y
n = 3-8;
y sales de los mismos.
Los compuestos de esta invención pueden sintetizarse mediante dos reacciones fundamentales. Las personas con destreza en la técnica reconocerán que se pueden sintetizar numerosas variantes por medio de estas reacciones y que las variantes tienen propiedades en común con los compuestos divulgados en la presente.
La Reacción 1 consiste en la reacción de un aromático sustituido con una amina primaria o secundaria, p. ej., 3,5-diacetilanilina, y un dicloruro de dioilo, p. ej, dicloruro de glutarilo, que dan la N,N'-difenilalcano-di-amida correspondiente. También pueden prepararse diamidas "invertidas". Se pueden preparar acetilo y ácido diacetilbenzoico mediante la reacción de KMnO_{4} y los toluenos sustituidos correspondientes. Luego pueden activarse los ácidos mediante técnicas estándares y reaccionarse con las \alpha,\omega-alcanodiaminas apropiadas para dar las "diamidas" inversas. Pueden sintetizarse diamidas directas e inversas mixtas mediante métodos bien conocidos en el campo de la síntesis de péptidos. En consecuencia, puede reaccionarse un aminoácido de N-t-butiloxicarbonilo con una anilina sustituida, seguido por la desprotección y reacción del grupo amino con un ácido benzoico sustituido activado. A menos que se indique lo contrario, cuando en la presente se utiliza el símbolo "-NH(CO)-", éste incluye el isómero
-(CO)NH-.
El método no se limita a los dicloruros de dioilo. Los derivados de tricloruro de los compuestos de trioilo pueden usarse para sintetizar alcanotriamidas de trifenilo de manera similar. Los triácidos apropiados incluyen los ácidos cíclicos, p. ej., ácido 1,3,5-ciclohexano-tricarboxílico (Aldrich Chem. Co.), ácido 1,3,5-trimetil,1,3,5-ciclohexanotricarboxílico (triácido de Kemp, Kemp y Petrakis, 1981, J. Org. Chem 46:5140), ácido 1,3,5-bencinotricarboxílico (Aldrich Chem. Co.) y ácidos tricarboxílicos lineales como el ácido 1,2,3-propanotricarboxílico (Sigma Chem. Co.). Se puede realizar la reacción idéntica donde el cloruro de dioilo se reemplaza con cloroformato de triclorometilo para dar un producto de condensación de difenilurea. Se puede realizar una alternativa a la Reacción 1 para dar un 1,n-(n-alcanodioxi)diarileno reaccionando el 1,n-dibromoalcano, p. ej., 1,2 dibromoetano y un monohidroxilarileno, p. ej., 3-hidroxiacetofenona.
Un método incluye el uso de triaminas en forma de H_{2}N-(CH_{2})_{n}-NH-(CH_{2})_{q}-NH_{2} donde (n,q = 2-6) y en forma de Y-((CH_{2})_{n}-NH_{2})_{3} donde Y puede ser uno de N (n = 2-6), C(NO_{2}) (n = 3), un C-alcano (n = 1), 1,3,5-adamantanotriilo (n = 3) ó 1,3,5-bencinotriilo (n = 1-3).
En dos realizaciones adicionales de la invención, se reacciona un isocianato de acetilo o diacetilarilo con una alcano-diamina o, como alternativa, se reacciona un amino de acetilo o diacetilarilo con un diisocianato de alcanodiilo para dar intermedios de bis-ureido que pueden reaccionarse con aminoguanidina para formar los productos finales de guanilhidrazono. Los isocianatos requeridos están disponibles en el comercio o pueden sintetizarse a partir de las aminas correspondientes por reacción con fosgeno, cloroformato de triclorometilo o carbonato de bis (triclorometilo) en tolueno o xileno a una temperatura elevada.
La Reacción 2 consiste en la reacción de una parte molecular de tipo acetofenona o benzaldehído y una aminoguanidana para dar el producto de condensación donde una aminoguanidina ligada por imino (N = C) reemplaza la parte molecular de cetona o carbonilo del arileno, formando así una guanilhidrazona, acompañada por la liberación de una molécula de agua.
5.2.2. Formulaciones farmacéuticas
Debido a sus propiedades farmacológicas, los compuestos de esta invención pueden usarse especialmente como agentes para tratar a pacientes que sufren de caquexia, respuestas nocivas mediadas por NO, infarto, tumores o infecciones que requieran arginina. Tal compuesto puede administrarse a un paciente solo o en composiciones farmacéuticas donde se mezcla con portadores o excipiente(s) apropiados.
El uso de portadores farmacéuticamente aceptables para formular los compuestos divulgados en la presente para poner la invención en práctica en dosis apropiadas para la administración sistémica está dentro del alcance de la invención. Con la selección correcta del portador y la práctica manufacturera apropiada, las composiciones de esta invención, en particular aquellas formuladas como soluciones, pueden administrarse de manera parenteral, por ejemplo, por inyección intravenosa. Los compuestos pueden formularse fácilmente usando portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosis apropiadas para la administración oral. Tales portadores permiten la formulación de los compuestos de la invención en comprimidos, píldoras, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para la ingestión oral por el paciente a ser tratado.
Las composiciones farmacéuticas apropiadas para usarse en esta invención incluyen composiciones que contienen una cantidad eficaz de los ingredientes activos para lograr el fin deseado. La determinación de las cantidades eficaces entra holgadamente en la capacidad de las personas diestras en la técnica, especialmente a la luz de la divulgación detallada provista en la presente.
Además de los ingredientes activos, esas composiciones farmacéuticas podrán contener portadores farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Las preparaciones formuladas para la administración oral pueden tener forma de comprimidos, confites, cápsulas o soluciones.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden fabricarse en formas conocidas, p. ej., mediante procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, confitado, levitación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.
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Las formulaciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Además, se pueden preparar soluciones de los compuestos activos como suspensiones oleosas apropiadas para la inyección. Los vehículos o disolventes lipofílicos apropiados incluyen aceites grasos, como el aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, como el oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Optativamente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes apropiados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse combinando los compuestos activos con el excipiente sólido, optativamente moliendo una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos tras agregar auxiliares apropiados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos para confites. En particular, los excipientes apropiados son rellenos como azúcares, que incluyen lactosa, sucrosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden agregar agentes desintegrantes, como la pirrolidona polivinílica entrecruzada, agar o ácido algínico, o una sal del mismo en forma de alginato sódico.
Se proporcionan revestimientos apropiados para los núcleos confitados. Para este fin se pueden usar soluciones concentradas de azúcar, que optativamente pueden contener goma arábiga, talco, pirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes apropiados. Se pueden agregar colorantes o pigmentos a los comprimidos o los revestimientos confitados a modo de identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de las dosis del compuesto activo.
Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse oralmente incluyen cápsulas de ajuste sin huelgo hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste sin huelgo pueden contener los ingredientes activos mezclados con un relleno como lactosa, aglomerantes como almidones y/o lubricantes como talco o estearato magnésico y, optativamente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o suspendidos en líquidos apropiados, como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden agregar estabilizantes.
5.3. Usos de los compuestos
Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis apropiada es la que logra una gama circulante de concentraciones que abarcan la CI_{50} determinada eficaz para ese compuesto, de acuerdo a lo referido en la presente en las Tablas I, II y III o determinada de la manera descrita en la presente. Por ejemplo, cuando se usan los Compuestos No. 1, 9,13 ó 15 para tratar caquexia, inflamación, shock endotóxico o shock séptico, infarto o neoplasma, sin importar la formulación escogida, la cantidad administrada debe bastar para lograr una concentración sérica o una concentración en el plasma circulante de entre alrededor de 5 \muM y 100 \muM. Cuando se usa el Compuesto No. 14 para tratar caquexia, inflamación, shock endotóxico o shock séptico, infarto o neoplasma, sin importar la formulación escogida, la cantidad administrada debe bastar para lograr una concentración sérica o una concentración en el plasma circulante de entre alrededor de 0,5 \muM y 10 \muM. Tal como se muestra en los ejemplos funcionales, una dosis parenteral diaria del Compuesto No. 14 de alrededor de 0,4 mg/Kg, usada para tratar la caquexia, y una sola dosis parenteral de 1,0 mg/Kg, para tratar la toxicidad inducida por el LPS, son eficaces en modelos múridos. Las personas diestras en la técnica apreciarán que la dosis apropiada para una vía de administración dada puede determinarse aplicando métodos farmacológicos bien conocidos por las personas diestras en la técnica.
Cuando los compuestos de esta invención se usan para tratar la inflamación crónica, debe determinarse un régimen de dosificación aplicando las técnicas farmacológicas estándares, usando las gamas de dosificación indicadas anteriormente como puntos iniciales. Para tratar afecciones inflamatorias agudas, se puede administrar una sola dosis más grande en una realización alternativa. Tal como lo muestran los ejemplos funcionales, se halló que una sola dosis parenteral de 5,0 mg/Kg del Compuesto No. 14 es eficaz para tratar tal evento agudo.
6. Ejemplo: Síntesis de los compuestos activos
Esta sección describe en detalle la síntesis y la purificación de intermedios útiles y de compuestos ejemplares de esta invención.
6.1. Síntesis de productos intermedios
En lo siguiente, se entiende que amidinohidrazona y guanilhidrazona y (aminoiminometil)hidrazono son sinónimos.
Las siguientes reacciones se usan para enlazar compuestos de arileno sustituidos mediante cadenas de alcano de diversos largos. El enlace puede ser una amida, un fenoxialcano o una urea.
6.1.1. N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)-pentanodiamida
Se trató 3,5-diacetilanilina (531 mg) en diclorometano (7 ml) que contenía piridina (0,4 ml) con 0,141 ml de dicloruro de glutarilo. Tras 1 hora, la filtración y el lavado con agua dieron 555 mg de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)pentanodiamida, pm 246-7ºC.
Análogamente, se preparó lo siguiente a partir de 3,5-diacetilanilina y los dicloruros de dioilo correspondientes:
N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)butanodiamida, pm 293-6ºC;
N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)hexanodiamida, pm 269-70ºC;
N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)heptanodiamida, pm 200-3ºC;
N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)octanodiamida, pm 183-4ºC;
N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)nonanodiamida, pm 179-80ºC;
N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)decanodiamida, pm 196-9ºC;
N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)dodecanodiamida, pm 178-9ºC;
N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)(diamida de ácido isoftálico), pm 283-4ºC.
También análogamente, se preparó N,N'-bis(3-acetilfenil)pentanodiamida, pm 174-5ºC a partir de 3-aminoacetofenona y dicloruro de glutario.
6.1.2. N-(4-acetilfenil)-N'-(3,5-diacetilfenil)urea
Se trató 4-aminoacetofenona (1,35 g) en tolueno (20 ml) con cloroformato de triclorometilo (1,2 ml). Se calentó la mezcla en reflujo durante 2 horas. Se agregó 3,5-diacetilanilina (1,77 g) y se calentó la mezcla en reflujo durante 1 hora. Luego se dejó estar 16 horas a temperatura ambiente. Se filtró el producto, se lavó con etanol y se secó para dar 0,93 g de N-(4-acetilfenil)-N'-(3,5-diacetilfenil)urea, pm 251-2ºC.
6.1.3. 1,2-Bis(3-acetilfenoxi)etano
Se trataron 3-hidroxiacetofenona (8,4 g) y 1,2-dibromoetano (5,07 g) con hidróxido potásico (3,83 g), y se calentaron bajo nitrógeno en reflujo durante 2 días. Se enfrió la mezcla, se agregó agua (200 ml) y se revolvió la mezcla durante 1 hora. Se removió el precipitado por filtración y se recristalizó a partir de isopropanol para dar 1,21 g de 1,2-bis (3-acetilfenoxi)etano, pm 120-1ºC.
6.1.4. 1,5-bis[([(3,5-diacetilfenil)-aminocarbonil)amino]-2-metilpentano
Se agregó 1,5-diisocianato-2-metilpentano (0,18 ml) a una suspensión de 3,5-diacetilanilina (0,531 g) en diclorometano (7 ml) que contenía 4-dimetilaminopiridina catalítica (10 mg). Se puso la mezcla en reflujo durante 2 horas y se dejó estar toda la noche. La filtración produjo cristales blancos, 0,30 g, pm 124-130ºC.
6.1.5. Tris[2-([(3-acetilfenil)amino-carbonilamino)etil]amina
Se reaccionó isocianato de 3-acetilfenilo (0,60 g) en diclorometano (10 ml) con tris(2-aminoetil)amina (0,146 g). Hubo una reacción vigorosa y se produjo una copiosa turbidez blanca. Se agregó metanol y se reconcentró la mezcla para producir un material cristalino que se extrajo por filtración. Rendimiento 0,61 g, pm 193ºC.
6.1.6. 3,5-diacetilfenil isocianato y N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)urea
Se suspendió 3,5-diacetilanilina (3,0 g, 16,9 mmol) en tolueno (50 ml), revolviendo en un baño de hielo. Se agregó una solución de carbonato de bis(triclorometilo) (1,67 g, 5,9 mmol) en tolueno (10 ml). Se permitió que la suspensión se calentara hasta la temperatura ambiente, y luego se revolvió toda la noche a temperatura ambiente. Entonces se calentó la mezcla en reflujo durante 4 horas, se enfrió y se filtró para dar 1,1 g de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)urea, pm dec 137-8ºC (evol. de gas). Se evaporó el filtrado para dar 2,2 g de isocianato de 3,5-diacetilfenilo en forma de polvo blanco, pm 71ºC.
6.2. Conversión de intermedios en productos finales
Las siguientes reacciones son ejemplos que ilustran una reacción de condensación general donde la amina primaria de la aminoguanidina desplaza el oxígeno de una acetofenona o de un benzaldehído o de una cetona, elabora una H_{2}O y forma la guanilhidrazona. Por lo general, todas las reacciones se llevan a cabo a una temperatura elevada con catálisis ácida en alcohol acuoso. Los productos se recuperan por cristalización al enfriarse con la adición optativa de éter de petróleo o de isopropanol. La purificación se realizó por recristalización.
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Compuesto 4, Fig. 7A.4
Clorhidrato de ácido 4-([(aminoiminometil)hidrazono]metil)cinámico
Se calentaron ácido 4-formilcinámico (1,76 g) y clorhidrato de aminoguanidina (1,22 g) en etanol al 83% (24 ml) durante 2 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 2,56 g de clorhidrato de ácido 4-([(aminoiminometil)hidrazono]metil)cinámico, pm 285-8ºC.
Compuesto 6, Fig. 7A.6
Clorhidrato de 2-([(1H-imidazol-1-il)-1,4-fenilen]etilidina)hidrazincarboximidamida
Se calentaron 4-(1H-imidazol-1-il)acetofenona (1,86 g) y clorhidrato de aminoguanidina (1,22 g) en etanol al 83% (12 ml) durante 48 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 2,6 g de clorhidrato de 2-([(1H-imidazol-1-il)-1,4-fenilen]etilidin)hidrazincarboximidamida, pm 275-6ºC.
Compuesto 7, Fig. 7A.7
Clorhidrato de 2-[(3,4-dihidroxifenil)-etilidin]hidrazincarboximidamida
Se calentaron 3,4-dihidroxiacetofenona (3,04 g) y clorhidrato de aminoguanidina (2,44 g) en etanol al 75% (16 ml) durante 4 horas bajo nitrógeno. El enfriamiento y la filtración dieron 2,7 g de clorhidrato de 2-[(3,4-dihidroxifenil)etilidin]-hidrazincarboximidamida, pm 242-5ºC.
Compuesto 9, Fig. 7B.9
Triclorhidrato de N-(4-acetilfenil)-N'-(3,5-diacetilfenil)urea tris(amidinohidrazona)
Se calentaron N-(4-acetilfenil)-N'-(3,5-diacetilfenil)urea (0,676 g), clorhidrato de aminoguanidina (0,83 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,01 g) en metanol al 83% (12 ml) durante 18 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 0,85 g de triclorhidrato de N-(4-acetilfenil)-N'-(3,5-diacetilfenil)urea tris(amidinohidrazona), pm 247-253ºC dec.
Compuesto 10, Fig. 7B.10
Clorhidrato de ácido 5-(1-[2-(aminoiminometil)hidrazono]etil)salicílico
Se calentaron ácido 5-acetilsalicílico (3,6 g) y clorhidrato de aminoguanidina (2,4 g) en etanol al 80% (25 ml) durante 2 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 5,2 g de clorhidrato de ácido 5-(1-[2-(aminoiminometil)hidrazono]etil)salicílico crudo. Se purificó 0.58 g del mismo por disolución en NaOH acuoso (pH 12,5) y reprecipitación con HCl acuoso (hasta pH 2) para dar 0,45 g de clorhidrato de 5-(1-[2-(aminoiminometil)hidrazono]etil)-salicílico, pm 312-3ºC (dec).
Compuesto 12, Fig. 7B.12
Diclorhidrato de N,N'-bis(3-acetilfenil)pentanodiamida bis(amidinohidrazona)
Se calentaron N,N'-bis(3-acetilfenil)pentanodiamida (3,66 g), clorhidrato de aminoguanidina (2,75 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,05 g) en metanol (35 ml) durante 18 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 5,412 g de diclorhidrato de N,N'-bis(3-acetilfenil)pentanodiamida bis(amidinohidrazona), pm 187-191ºC.
Compuesto 13, Fig. 7B.13
Tetraclorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)pentanodiamidatetrakis(amidinohidrazona)
Se calentaron N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)pentanodiamida (0,45 g), clorhidrato de aminoguanidina (0,55 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,01 g) en etanol al 91% (4,4 ml) durante 18 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 0,794 g de tetraclorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)pentanodiamida tetrakis(amidinohidrazona), pm 299-301ºC dec.
Compuesto 14, Fig. 7C.14
Tetraclorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)decanodiamidatetrakis(amidinohidrazona)
Se calentaron N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)decanodiamida (0,65 g), clorhidrato de aminoguanidina (0,691 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,01 g) en etanol al 91% (5,5 ml) durante 18 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 0,87 g de tetraclorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)decanodiamida tetrakis(amidinohidrazona), pm 323-4ºC dec.
Compuesto 15, Fig. 7C.15
Diclorhidrato de 2,2'-[1,2-etanodiilbis(oxi-3,1-fenilenetilidina)]bishidrazina-carboximidamida
Se calentaron 1,2-bis(3-acetilfenoxi)etano (0,894 g), clorhidrato de aminoguanidina (0,83 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,01 g) en metanol acuoso al 96% (6,25 ml) durante 18 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 1,378 g de diclorhidrato de 2,2'-[1,2-etano-diilbis(oxi-3,1-fenilenetilidina)]bis(hidrazina-carboximidamida), pm 303-7ºC.
Compuesto 16, Fig. 7C.16
Diclorhidrato de 3,3'-(etilendioxi)-dibenzaldehído bis(amidinohidrazona)
Se calentaron 3,3'-(etilendioxi)dibenzaldehído (1,08 g), clorhidrato de aminoguanidina (1,105 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,005 g) en etanol al 96% (6,25 ml) durante 18 horas bajo nitrógeno. El enfriamiento y la filtración dieron 1,428 g de diclorhidrato de 3,3'-(etilendioxi)dibenzaldehído bis(amidinohidrazona), pm 264-6ºC.
Compuesto 17, Fig. 7C.17
Diclorhidrato de 4,4'-(etilendioxi)di-m-anisaldehído bis(amidinohidrazona)
Se calentaron 4,4'-(etilendioxi)di-m-anisaldehído (0,99 g), clorhidrato de aminoguanidina (0,829 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,01 g) en metanol al 95% (10,5 ml) bajo nitrógeno durante 16 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 1,52 g de diclorhidrato de 4,4'-(etilendioxi)di-m-anisaldehído bis(amidinohidrazona), pm 322-3ºC dec.
Compuesto 18, Fig. 7C.18
Diclorhidrato de 3,3'-(trimetilendioxi)di-p-anisaldehído bis(amidinohidrazona)
3,3'-(trimetilenedioxi)di-p-anisaldehído (1,032 g), clorhidrato de aminoguanidina (0,829 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,02 g) en metanol al 95% (10,5 ml) durante 16 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 1,372 g de diclorhidrato de 3,3'-(trimetilendioxi)di-p-anisaldehído bis(amidinohidrazona), pm 233-5ºC.
Compuesto 19, Fig. 7C.19
Diclorhidrato de 1,4-bis[2-(aminoiminometil)hidrazono]ciclohexano
Se calentaron 1,4-ciclohexanodiona (2,24 g), bicarbonato de aminoguanidina (6,0 g) y ácido clorhídrico concentrado (3,67 ml) en agua (50 ml) durante 5 minutos. Se enfrió la solución y se trató con isopropanol (50 ml). Una vez completada la cristalización, la filtración dio 2,91 g de diclorhidrato de 1,4-bis[2-(aminoiminometil)hidrazono]ciclohexano, pm 260ºC dec.
Compuesto 20, Fig. 7C.20
Diclorhidrato de 2,2'-(1,4-difenil-1,4-butanodiilideno)bishidrazina-carboximidamida
Se calentaron 1,2-dibenzoiletano (4,76 g), bicarbonato de aminoguanidina (5,45 g) y ácido clorhídrico concentrado (3,33 ml) en etanol al 50% (60 ml) durante 24 horas. El enfriamiento, la concentración y la filtración dieron 4,3 g de diclorhidrato de 2,2'-(1,4-difenil-1,4-butanodiilideno)bis(hidrazina-carboximidamida), pm 285-6ºC.
6.3. Compuestos ejemplares adicionales
Compuesto 21, Fig. 7D.21
Tetraclorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)butanodiamidatetrakis(amidinohidrazona)
Se calentaron N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)butanodiamida (0,545 g), clorhidrato de aminoguanidina (0,69 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,01 g) en etanol al 91% (5,5 ml) durante 18 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 0,97 g de tetraclorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)butanodiamida tetrakis(amidinohidrazona), pm 314ºC.
Compuesto 22, Fig. 7D.22
Tetraclorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)hexanodiamidatetrakis(amidinohidrazona)
Se calentaron N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)butanodiamida (0.58 g), clorhidrato de aminoguanidina (0,69 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,01 g) en 2-metoxietanol al 91% (5,5 ml) durante 18 horas. La filtración en caliente dio 0,936 g de tetraclorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)hexanodiamida tetrakis(amidinohidrazona), pm (car.) 320-330ºC.
Compuesto 23, Fig. 7D.23
Tetraclorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)heptanodiamidatetrakis(amidinohidrazona)
Se calentaron N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)heptanodiamida (0,478 g), clorhidrato de aminoguanidina (0,553 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,01 g) en etanol al 91% (4,4 ml) durante 18 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 0,739 g de tetraclorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)heptanodiamida tetrakis(amidinohidrazona), pm 273-7ºC.
Compuesto 24, Fig. 7D.24
Tetraclorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil) (diamida de ácido isoftálico) tetrakis(amidinohidrazona)
Se calentaron N,N'-bis(3,5-diacetilfenil) (diamida de ácido isoftálico) (0,726 g) y clorhidrato de aminoguanidina (0,829 g) en 7:1 de 2-metoxietanol/agua (11,5 ml) durante 18 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 0,54 g de tetraclorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil) (diamida de ácido isoftálico) tetrakis(amidinohidrazona), (car.) pm 322-330ºC.
Compuesto 25, Fig. 7E.25
Clorhidrato de 3,3'-(pentametilendioxi)di-p-anisaldehído (0,748 g), aminoguanidina (0,553 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,01 g) en metanol (5 ml) durante 18 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 0,080 g de diclorhidrato de 3,3'-(trimetilendioxi)di-p-anisaldehído bis(amidinohidrazona), pm 195-8ºC.
Compuesto 26, Fig. 7E.26
Se trató una solución de 3,5-diacetilanilina (0,885 g) en tetrahidrofurano (10 ml) que contenía 0,45 ml de piridina con 0,65 ml de cloruro de benzoilo. Se revolvió la mezcla durante 1 hora; luego se trató con 1 ml de agua y se revolvió durante 15 minutos. Luego se diluyó con 40 ml de agua y se revolvió durante 30 minutos. La filtración y el lavado con agua e isopropanol dio agujas incoloras de N-benzoil-3,5-diacetilanilina, 1,36 g, pm 188-189ºC. Se calentó una suspensión de N-benzoil-3,5-diacetilanilina (0,844 g) en etanol acuoso al 87,5% (8 ml) que contiene 0,73 g de clorhidrato de aminoguanidina y una traza de HCl en reflujo durante 18 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 1,357 g de diclorhidrato de N-benzoil-3,5-diacetilanilina bis(amidinohidrazona) (Compuesto 26), pm 268-72ºC.
Compuesto 27, Fig. 7E.27
Se trató una suspensión de 3,5-diacetilanilina (0,531 g) en agua (8 ml) con cianamida (0,143 g) y HCl concentrado (0,25 ml) y se calentó en reflujo. Se agregaron porciones de 0,080 g de cianamida a las 2 horas y a las 4 horas. Después de 6 horas, se concentró la mezcla in vacuo hasta que se separó el material cristalino. Luego se filtró para dar 0,110 g de sólido blancuzco, pm 120-2ºC. Se trató 0,104 g de esto con clorhidrato de aminoguanidina (0,112 g) en 2,5 ml de etanol al 80% que contiene diclorhidrato de aminoguanidina (0,01 g). Después de 18 horas en reflujo, el enfriamiento y la filtración dieron 133 mg de triclorhidrato de (3,5-diacetilfenil)guanidina bis(amidinohidrazona) (Compuesto 27) en forma sólida ligeramente blancuzca, pm 270-3ºC.
Compuesto 28, Fig. 7F.28
Se trató una suspensión de 3,5-diacetilanilina (0,531 g) en agua (8 ml) con cianoguanidina (0,285 g) y HCl concentrado (0,25 ml) y se calentó en reflujo. Después de 6 horas se enfrió y se concentró la mezcla. Se eliminó por filtración 0,248 g de sólido blancuzco, pm 260-70 (dec). Se calentó 0,238 g de esto en reflujo con clorhidrato de aminoguanidina (0,221 g) en 5,5 ml de metanol acuoso al 91% durante 24 horas. La filtración dio 0,290 g de triclorhidrato de N-(3,5-diacetilfenil)biguanida bis(amidinohidrazona) (Compuesto 28) en forma de finas agujas blancas, pm 294-7ºC.
Compuesto 31, Fig. 7G.31
Se revolvieron isocianato de 4-acetilfenilo (1,2 g) y tris(2-aminoetil)amina (0,300 ml) en cloruro de metileno (10 ml) a temperatura ambiente durante 30 minutos. La filtración dio 1,35 g de tris(2-[([(4-acetilfenil)amino]carbonil)-amino]etil)amina, pm 189-90ºC. Se calentaron esta tricetona (1,0 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,77 g) en metanol (5 ml) durante 4 horas. La adición de etanol (5 ml) y filtración dieron 1,08 g de triclorhidrato de tris(2-[([(4-acetilfenil)-
amino]carbonil) amino]etil)amina tris(amidinohidrazona) (Compuesto 31) en forma de dihidrato, pm 224-5ºC (dec).
Compuesto 32, Fig. 7G.32
Se revolvieron tricloruro de 3'-aminoacetofenona (0,446 g) y 1,3,5-benceno (0,266 g) en tetrahidrofurano (5 ml) a temperatura ambiente durante 30 minutos. La filtración dio 0,500 g de N,N',N''-tris(3-acetilfenil)-1,3,5-bencenotricarboxamida, pm 270ºC. Se calentaron esta tricetona (1,0 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,87 g) en 2-metoxietanol (5 ml) durante 4 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 1,4 g de triclorhidrato de N,N',N''-tris(3-acetilfenil)-1,3,5-bencenotricarboxamida tris(amidinohidrazona) (Compuesto 32) solvatado con una molécula de 2-metoxietanol, pm 270-5ºC dec.
Compuesto 33, Fig. 7G.33
Se preparó análogamente a partir de 4'-aminoacetofenona mediante la tricetona N,N',N''-tris(4-acetilfenil)-1,3,5-bencenotricarboxamida, pm 310ºC para dar triclorhidrato de N,N',N'',-tris(4-acetilfenil)-1,3,5-bencenotricarboxamida tris(amidinohidrazona) (Compuesto 33) solvatado con tres moléculas de 2-metoxietanol, pm 295-300ºC (dec) (calentamiento lento).
Compuesto 34, Fig. 7H.34
Se revolvieron isocianato de 3,5-diacetilfenilo (0,6 g) y tris(2-aminoetil)amina (0,13 g) en cloruro de metileno (5 ml) a temperatura ambiente durante 30 minutos. La filtración dio 0,6 g de tris(2-[([(3,5-diacetilfenil)amino]carbonil)-amino]etil)amina, pm 197-8ºC. Se calentaron esta hexacetona (0,47 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,61 g) en metanol (5 ml) durante 4 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 0,86 g de heptaclorhidrato de tris(2-[([(3,5-diacetilfenil)amino]carbonil)-amino]etil)amina hexakis(amidinohidrazona) (Compuesto 34) en forma de hemietanolato de dihidrato, pm 245-6ºC dec.
Compuesto 35, Fig. 7H.35
Se revolvieron isocianato de 4-acetilfenilo (3 g) y tris(3-aminopropil)amina (1,06 g) en tetrahidrofurano (50 ml) durante 30 minutos. Se agregó etanol (100 ml) y se dejó la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. La filtración dio 2,8 g de tris(3-[([(4-acetilfenil)amino]carbonil)-amino]propil)amina, pm 184-5ºC. Se calentaron esta dicetona (0,4 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,29 g) en metanol (3 ml) durante 4 horas. La adición de etanol (3 ml) y la filtración dieron 0,5g de triclorhidrato de tris(3-[([(4-acetilfenil)-amino]carbonil)amino]propil)amina tris(amidinohidrazona) (Compuesto 35) en forma de etanolato de dihidrato, pm 209-10ºC dec.
Compuesto 36, Fig. 7H.36
Se revolvieron isocianato de 3,5-diacetilfenilo (0,4 g) y tris(3-aminopropil)amina (0,12 g) en tetrahidrofurano (5 ml) a temperatura ambiente durante 30 minutos. La filtración dio 0,32 g de tris(3-[([(3,5-diacetilfenil)amino]carbonil)-amino]propil)amina, pm 147-8ºC. Se calentaron esta hexacetona (0,4 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,49 g) en metanol (3 ml) durante 4 horas. La adición de etanol y la filtración dieron 0,58 g de heptaclorhidrato de tris (3-[([(3,5-diacetilfenil) amino]carbonil)amino]propil)amina hexakis(amidinohidrazona) (Compuesto 36) en forma del hemietanolato de dihidrato, pm 250-1ºC (dec).
Compuesto 37, Fig. 7I.37
Se revolvieron isocianato de 3-acetilfenilo (1 g) y 4'-aminoacetofenona (0,84 g) en cloruro de metileno (5 ml) a temperatura ambiente durante 30 minutos. La filtración dio 2,0 g de 3,4'-diacetil-N,N'-difenilurea, pm 252-3ºC (dec). Se calentaron esta dicetona (0,6 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,65 g) en etanol (5 = ml). El enfriamiento y la filtración dieron 0,8g de diclorhidrato de 3,4'-diacetil-N,N'-difenilurea bis(amidinohidrazona) (Compuesto 37) en forma de hemihidrato, pm 243-4ºC dec.
Compuesto 38, Fig. 7I.38
Se revolvieron isocianato de 3-acetilfenilo (0,27 g) y 3,5-diacetilanilina (0,3 g) en cloruro de metileno (5 ml) a temperatura ambiente durante 30 minutos. La filtración dio 0,5 g de 3,3',5'-triacetil-N,N'-difenilurea, pm 223-4ºC. Se calentaron esta tricetona (0,34 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (0,49 g) en etanol (5 ml) durante 4 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 0,6g de triclorhidrato 3,3',5'-triacetil-N,N'-difenilurea tris(amidinohidrazona) (Compuesto 38) en forma de hidrato, pm 245ºC dec.
Compuesto 39, Fig. 7I.39
Se calentaron N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)-urea (0,38 g), clorhidrato de aminoguanidina (0,44 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (59 mg) a 90-100ºC en 2-metoxietanol (5 ml) durante 6 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 0,66g de tetraclorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)urea tetrakis(amidinohidrazona) (Compuesto 39) en forma de hemi-metanolato de 2,5-hidrato, pm 263-4ºC dec.
Compuesto 40, Fig. 7I.40
Se calentaron clorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)-nonanodiamida (0,100 g), aminoguanidina (0,115 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (3 mg) en reflujo en etanol al 95% (2,5 ml) durante 5 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 0,18 g de tetraclorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)-nonanodiamida tetrakis(amidinohidrazona) (Compuesto 40) en forma de dihidrato, pm 295-6ºC.
Compuesto 41, Fig. 7J.41
Se calentaron clorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)-dodecanodiamida (0,100 g), aminoguanidina (0,115 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (3 mg) en etanol al 95% (2,5 ml) durante [sic] horas. El enfriamiento y la filtración dieron 0,070 g de tetraclorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)dodecanodiamida tetrakis(amidinohidrazona) (Compuesto 41) en forma de tetradihidrato, pm 268-9ºC.
Compuesto 42, Fig. 7J.42
Se trató una suspensión de 3,5-diacetilanilina (0,354 g) en cloruro de metileno (7 ml) que contiene 4-dimetilaminopiridina (5 mg) con diisocianato de 2-metil-1,5-pentanodiilo (0,18 ml). Después de calentamiento en reflujo durante 2 horas, se enfrió la mezcla. Se trató un alícuota con t-butil metil éter para dar cristales germen que se agregaron a la mezcla de reacción. Tras revolver varias horas, la filtración dio 0,120 g de 1,5-bis[([(3,5-diacetilfenil)amino]carbonil)amino]-2-metilpentano, pm 128ºC. Se calentaron esta tetracetona (0,100 g), clorhidrato de aminoguanidina (0,115 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (3 mg) en etanol al 95% (2,5 ml) durante 18 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 0,16 g de tetraclorhidrato de 1,5-bis[([(3,5-diacetilfenil)amino]caitonil)amino]-2-metilpentano tetrakis(amidinohidrazona) (Compuesto 42) en forma de tetrahidrato, pm 258-9ºC.
Compuesto 43, Fig. 7J.43
Se calentaron clorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)octanodiamida (0,100 g), aminoguanidina (0,115 g) y diclorhidrato de aminoguanidina (10 mg) en etanol al 95% (2,5 ml) durante 20 horas. El enfriamiento y la filtración dieron 0,17 g de tetraclorhidrato de N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)octanodiamida tetrakis(amidinohidrazona) (Compuesto 43) en forma de 2.5-hidrato, pm 308-9ºC.
7. Ejemplo: Ensayos de células enteras para la producción de urea y de NO
Esta sección describe en detalle los métodos y los resultados de un ensayo de cultivo celular para determinar la capacidad de los compuestos de la invención para inhibir la síntesis de urea en macrófagos activados.
7.1. Material y métodos
Se colocan células RAW 264.7 en placas con pozos de microcultivo a razón de 1x106/mL en RPMI 1640 con FBS al 10% y condiciones de cultivo estándares. Se dejan adherir durante 5 horas. Luego se activan con 25 U/mL de IFN\gamma y 0,1 \mug/mL de LPS en presencia de inhibidores de prueba. Se determina la concentración de urea presente en el medio sobrenadante tras 18 horas de cultivo mediante un ensayo de diacetilmonoxima del nitrógeno ureico en sangre, realizado en una alícuota del cultivo sobrenadante (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO). La inhibición se expresa como el porcentaje de urea comparado con el de un cultivo de control paralelo tratado en forma idéntica, salvo que la concentración del inhibidor agregado es igual a cero.
La producción de nitrito se determina mediante un ensayo del mismo sobrenadante de cultivo tisular por medio de un ensayo colorimétrico. En resumen, se mezclan 4 partes de solución de prueba que contiene el 1% (p/v) de sulfanilamida, el 0,1% de di-HCl de naftiletilendiamina (reactivo Griess), el 2,5% de H_{3}PO_{4} y una parte de medio. Se incuban durante 10 minutos y se determina la absorbencia a 560 nm. Se interpolan las concentraciones de nitrito a partir de curvas de referencia preparadas usando NaNO_{2}.
Se incluyen diversas concentraciones de los compuestos de prueba en el medio de las células RAW 264.7 estimuladas en cultivo. Se determina la concentración de urea y/o de nitrito tras 18 horas de cultivo activado y se compara con el valor de control no inhibido obtenido de al menos un cultivo paralelo. Se calcula la reducción fraccional de cada concentración del inhibidor y se interpola la CI_{50} (la concentración que da una reducción del 50%). Se disolvieron compuestos en medio con calor suave (60ºC). Aquellos con solubilidad limitada fueron disueltos en base. Se determinó la concentración de las soluciones patrón de los compuestos que no eran completamente solubles por OD_{280}.
Se probaron los sobrenadantes del cultivo para detectar la presencia de una enzima intracelular, la deshidrogenada de lactato (LDH) para determinar el grado, de haberlo, en el cual el compuesto de prueba causó muerte celular. En los ejemplos referidos a continuación en la presente, no se observó ninguna tal toxicidad celular.
7.2. Resultados
Los resultados del examen de los compuestos de guanilhidrazona para medir su capacidad para inhibir la producción de urea se presentan en las Tablas I, II y III. Los compuestos más activos, referidos en la Tabla I, mostraron una CI_{50} de menos de 10 \muM. El compuesto más activo fue una decanodiamida de tetraguanilhidrazona (Compuesto No. 14). También fueron altamente activos el homólogo de pentanodiamida del anterior (Compuesto No. 13); la etanodioxi bis(guanilhidrazona) (Compuesto No. 16); una bis(guanilhidrazona) de urea mixta (Compuesto No. 9); y la tris(guanilhidrazona) de triacetilbencina (Compuesto No. 1).
Los compuestos con uno o dos núcleos de fenilo fueron eficaces. Cuando había dos núcleos presentes, su enlace por medio de una funcionalidad de urea, diamida o alcanodioxi fue eficaz. Los compuestos de prueba con una sola funcionalidad de guanilhidrazona fueron mucho menos eficaces.
TABLA I Resultados de ensayos in vitro para compuestos que demuestran altos niveles de actividad
4
TABLA II Resultados de ensayos in vitro para compuestos activos
5
TABLA III Resultados de de ensayos de producción de urea in vitro para compuestos que demuestran actividad
6 
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8. Ejemplo: Ensayo de inhibición de células enteras para la captación de arginina
Esta sección describe en detalle los métodos y los resultados de un ensayo de cultivo celular para determinar la capacidad de los compuestos de la invención para inhibir la captación de arginina por macrófagos activados.
8.1. Materiales y métodos
Se colocan células RAW 264.7 en placas de microcultivo estándares con 96 pozos a una concentración de 10^{5}/pozo y se dejan adherir desde alrededor de 2 horas hasta toda la noche. Luego se reemplaza el medio con un medio que contiene el compuesto a probarse. Una hora más tarde, se suplementa el medio de modo que contenga 25 U/mL de IFN\gamma y 0,1 \mug/mL de LPS y se incuban los cultivos durante [sic] adicionales. Luego se enjuagan las células dos veces en una solución de sal Krebs tamponada con HEPES con glucosa al 0,1%. Se agrega tetra-^{3}H-arginina libre de portador a cada pozo (2,5 \muCi/pozo con una actividad específica de 69 mCi/mmol) y se permite que la captación activa de arginina continúe durante un período de 5 minutos, tras lo cual se enfrían las células rápidamente hasta 0ºC por lavado con solución salina helada que contiene 10 mM de arginina no marcada para desplazar toda marcación enlazada externamente. Se solubiliza el contenido de las células lavadas en 100 \muL de ácido fórmico y se cuenta mediante técnicas estándares. La Figura 6 muestra la cantidad de captación de tetra-^{3}H-arginina como función del tiempo de incubación. En experimentos posteriores para determinar la actividad de los inhibidores, se realizaron incubaciones durante 8 horas.
8.2. Resultados
Se probaron los compuestos de esta invención que fueron más activos en la supresión de la producción de urea en macrófagos activados para determinar sus efectos en la captación de arginina. Los resultados, que figuran en la Tabla I de la Sección 7.2, indican que los compuestos activos fueron inhibidores eficaces de la captación en una dosis similar a la que inhibió la producción de urea con eficacia. Estos datos sugieren que la proteína de transporte de arginina es un blanco de acción de estos compuestos.
9. Ejemplo: Ensayo de inhibición de arginasa
Esta sección describe en detalle los métodos y los resultados de un ensayo libre de células para determinar la capacidad de los compuestos de la invención para inhibir la actividad de la arginasa obtenida de los macrófagos.
9.1. Materiales y métodos
Se obtiene un sobrenadante de 1200 g x 2 minutos a partir de un lisato celular de células RAW 264.7 lavadas producido por la adición de un tampón de lisis que contiene 50 mM de Hepes, 1% de NP-40, 0,1 mg/mL fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y aprotinina a 1 \mug/mL. Se ajusta el volumen de sobrenadante de modo que la concentración proteica se encuentre entre 2 y 4 mg/ ml. Se incuba una mezcla de 1:4 del sobrenadante en tampón de activación (30 mM de MnCl_{2}, 0,3 M de glicina, 1% de BSA, pH de 9,8) que contiene varias concentraciones del inhibidor de prueba a 55ºC durante 20 minutos. La actividad de la arginasa se determina mezclando la solución anterior y 0,375 M de arginasa a razón de 1:2, con un pH de 9,8, durante 10 minutos a 37ºC. La concentración de urea tras esta incubación se determina de acuerdo a lo anterior.
9.2. Resultados
Se probaron los seis compuestos más activos en la supresión de la producción de urea celular para determinar si alguno de ellos podía inhibir la actividad de la arginasa en el ensayo de lisato celular descrito anteriormente. Los resultados no indican que la arginasa sea sensible a la inhibición por los compuestos de esta invención en las concentraciones y en las condiciones empleadas.
10. Ejemplo: tratamiento de caquexia in vivo
Se empleó un modelo animal de enfermedad catabólica proteica asociada con tumores (caquexia) para probar directamente la eficacia del Compuesto No. 14 en la reducción de las pérdidas de nitrógeno en todo el cuerpo. Se indujeron tumores en los grupos apropiados por inoculación intramuscular con 15 x 10^{6} de células AtT-20. Se sabe que este modelo causa una enfermedad catabólica proteica caracterizada por el consumo de cantidades normales de alimento, con una pérdida neta del 20% de la proteína del cuerpo entero en 14 días. Se administró el Compuesto No. 14 a los grupos "tratados" en una dosis intraperitoneal diaria de 0,4 mg/Kg. Se alojaron ratones desnudos (nu/nu) en jaulas metabólicas (4 por jaula) para facilitar la recolección de muestras de orina durante 14 días. Se midió la ingesta a diario. Había cuatro grupos de animales: 1) controles sin tumores y sin tratamiento; 2) animales con tumores y sin tratamiento; 3) animales con tumores y con tratamiento, y 4) animales sin tumores y con tratamiento. Se recogió la orina y se cuantificaron las pérdidas de urea en la orina.
Los resultados se encuentran resumidos en la Tabla IV (expresados en mg urea/grupo):
TABLA IV Actividad in vivo del compuesto #14 para suprimir la pérdida de nitrógeno en todo el cuerpo y la pérdida de urea en la orina (mg/grupo)
7
Los grupos consumieron cantidades similares de alimentos (16 \pm 2 g/día) durante este experimento.
Los datos muestran que el Compuesto No. 14 previno la excreción de urea urinaria normalmente asociada con la caquexia.
Ya que la pérdida de urea representa el 80% de las pérdidas de nitrógeno en el cuerpo entero y el consumo de nitrógeno fue similar en todos los grupos, estos datos sugieren además que el Compuesto No. 14 aumenta la retención de nitrógeno en el cuerpo entero.
El significado de estas observaciones se demuestra calculando el impacto de estas pérdidas de nitrógeno en la masa muscular. El Compuesto No. 14 previno la pérdida de aproximadamente 200 mg urea/ratón a lo largo del período de 14 días. Esto equivale a aproximadamente 100 mg de nitrógeno, 625 mg de proteína ó 2,7 g de masa muscular húmeda retenida debido al tratamiento con el Compuesto No. 14.
11. Ejemplo: Tratamiento de inflamación in vivo
Se utilizó un modelo animal estándar para probar directamente la eficacia del Compuesto No. 14 como antiinflamatorio. Se ha utilizado la hinchazón en la pata inducida por la inyección de carrageenina irritante en patas múridas para detectar fármacos antiinflamatorias útiles desde principios de la década de 1960.
Se indujo edema en la pata inyectando 50 microlitros de carrageenina-lambda al 1% en 25mM de HEPES, pH 7,4, en la superficie plantar de la pata trasera izquierda de ratones C3H/HeN. Se inyectó la pata derecha con 50 microlitros de HEPES sola. Los animales fueron divididos en dos grupos: los controles (n = 3) sólo recibieron el vehículo i.p. 1,5 horas antes de la inyección en la pata; el grupo experimental (n = 4) fue tratado con 5 mg/Kg del Compuesto No.14, i.p. 1,5 horas antes de la inyección en la pata. Tres horas tras la inyección en la pata, se midió el espesor de la pata usando una galga de espesores, y los datos se expresan en términos del cambio en espesor de la pata con carrageenina en relación con la pata con HEPES.
Los resultados se encuentran resumidos en la Tabla V, que contiene el aumento del espesor de la pata inducido por la carrageenina en mm de tres ratones de control y tres ratones tratados con el Compuesto 14. La inhibición también puede referirse como el porcentaje de inhibición de la hinchazón, según lo definido por la fórmula estándar: porcentaje de inhibición = (1 - (tratado/control)) x 100. El cálculo de este parámetro para animales tratados en los cuales el Compuesto No. 14 suprimió la hinchazón da una inhibición del 70%.
TABLA V Efecto del compuesto No. 14 en el cambio de inflamación y en el espesor de la pata
8
La Figura 8 presenta los efectos de varias dosis del Compuesto No. 14 en el mismo ensayo. Los datos muestran que dosis entre alrededor de 1 y 10 mg/Kg del peso corporal son eficaces para inhibir la hinchazón de la pata.
Estos datos muestran que el Compuesto No. 14 previno la inflamación, que se cree ser mediada por la inhibición de la producción de óxido nítrico dependiente del transporte de arginina en las células inflamatorias.
12. Ejemplo: El compuesto No. 14 no tiene ningún efecto en las respuestas vasodilatadoras mediadas por el factor de relajación de derivación endotelial
Un requisito importante del fármaco utilizado para controlar el colapso vascular y la hipotensión causados por la producción macrófaga de NO es que no interfiera con la actividad del FRDE in vivo. Tal interferencia puede causar una hipertensión incontrolada y ha impedido el uso clínico eficaz de inhibidores de NO-sintasa. Medimos el efecto del Compuesto No. 14 en la actividad del FRDE en un modelo animal y hallamos que el Compuesto 14 inhibe la producción de NO pero no inhibe la actividad del FRDE.
Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley hembras (225-250 g de peso corporal) con nembutal (50 mg/Kg, i.p.), se introdujo un tubo de traqueostomía y se colocaron sondas en la arteria carótida y la vena yugular con métodos estándares, usando tubos de polietileno (PE 50). Tracey, K. J., et al., 1986, SCIENCE 234,470-474. Se registró la tensión arterial continuamente con un transductor y registrador de presión (Modelo RS-3200, Gould Inc.). En el experimento indicado en la presente, los animales recibieron una sola dosis intraarterial de ng-metil-L-arginina (NMA; Sigma; 10 mg/Kg), del Compuesto No. 14 (50 mg/Kg) o del vehículo (0,4 ml). Se administró acetilcolina (ACh) diluida en agua estéril libre de LPS por medio de la sonda en la vena yugular en las dosis indicadas. Se diluyeron las soluciones para producir un volumen inyectable constante de 1 ml/Kg del peso corporal.
Se midió la respuesta hipotensa (FRDE) como la reducción de la tensión arterial media registrada 30 segundos tras la administración de ACh. El número de animales estudiados con cada dosis de acetilcolina fue de 4-6 para cada condición experimental. Los datos se expresan como la media \pm s.e.m.
La actividad del FRDE fue inhibida por el NMA, evidenciada por respuestas de tensión arterial atenuada en comparación con los controles tratados con el vehículo (Figura 9; véase también, Kilbourn, R. G., et al., 1990, PROC NATL. ACAD SCI. 87, 3629-3632). Por otra parte, el Compuesto No. 14 no suprimió la actividad del FRDE inducida por la acetilcolina in vivo, indicando que los animales tratados con el Compuesto No. 14 retuvieron la capacidad funcional de la actividad del NO de derivación endotelial.
13. Ejemplo: El compuesto No. 14 previene el shock entotóxico fatal
Se realizaron experimentos para evaluar los efectos del Compuesto No. 14 en la prevención de la toxicidad letal del lipopolisacárido (LPS). Se administró LPS para inducir una letalidad del 50% dentro de 72 horas en ratones BALB/c (Figura 10). Se administró LPS (E. coli 0111 :B4; Sigma) a ratones BALB/c en una dosis de 13,75 mg/Kg por inyección intraperitoneal (0,2 ml/ratón). Se sonicaron soluciones patrón de LPS (10 mg/mL) inicialmente durante 20 min, diluidas en agua libre de LPS (1,375 mg/mL), y luego se volvieron a sonicar durante 10 minutos inmediatamente antes de la inyección. Se administró el Compuesto No. 14 (1 mg/Kg, i.p.) 1,5 horas antes del LPS. El inyectado del Compuesto No. 14 estaba libre de LPS según lo medido por la prueba cuantitativa de lisato de amebocitos de Limulus cromógenos (BioWhittaker, Walkersville, MD). Los puntos de datos son de dos grupos compuestos por 10 ratones por grupo.
El Compuesto No. 14 administrado 1,5 horas antes del LPS redujo la letalidad. Se sometieron los datos a análisis estadístico usando la prueba z para proporciones independientes. La diferencia entre el control y el Compuesto No. 14 es significativa (valor de p de un extremo <0,05; z = 1,95).
No hubo señales evidentes de toxicidad en los animales que recibieron el Compuesto No. 14 solo. Tras el LPS, los controles estaban desaliñados, perdieron movilidad y se amontonaban. Estas señales visibles de toxicidad por LPS fueron suprimidas marcadamente por el Compuesto No. 14. Hubo diarrea en todos los animales, y no fue suprimido por el Compuesto No. 14.
Los inhibidores de NOS disponibles anteriormente han tenido un éxito limitado en mejorar la supervivencia de la endotoxemia, en parte porque suprimen el FRDE indiscriminadamente. Cobb, J. P., 1992, J. EXP. MED. 176:1175-1182; Minnard, E. A., et al., 1994, ARCH SURG. 129:142-148; Billiar, T. R., 1990, J. LEUKOCYTE. BIOL. 48:565-569. La supresión del FRDE durante la endotoxemia podría menoscabar la supervivencia, causando vasoconstricción y una reducción del flujo sanguíneo a lechos vasculares críticos. Estos datos ahora indican que la inhibición del NO macrófago inducible por citocinas con un agente que preserva las respuestas de NO de derivación endotelial puede conferir una ventaja para la supervivencia durante el shock séptico.
14. Ejemplo: El compuesto No. (14) previene la producción de citocinas y de NO
Esta sección describe en detalle los métodos y los resultados de un ensayo de cultivo celular para determinar la capacidad de los compuestos de la invención para inhibir la producción del FNT por macrófagos activados y muestra, para fines de explicación, no de limitación, que el Compuesto No. 14 es eficaz para bloquear la secreción del FNT por un mecanismo que es independiente de la inhibición de la captación de arginina.
Se colocaron células RAW 264.7 en placas de cultivo estándares de 6 pozos en una densidad de 10^{6}/pozo y se dejaron adherir desde 2 horas hasta toda la noche. Luego se reemplazó el medio con un medio que contenía el compuesto a probarse. Una hora más tarde, se suplementó el medio de modo que contuviera 25 U/mL de IFN\gamma y 0,1 \mug/mL de LPS y se incubaron los cultivos durante 18 horas adicionales. Luego se recogió el medio y se removieron los residuos celulares por centrifugación. Después se ensayó este sobrenadante acondicionado para detectar la presencia del FNT, usando metodologías estándares: bioensayo de citotoxicidad con células L929, radioinmunoensayo o ELISA y transferencia western con anticuerpos contra el FNT múrido.
La Figura 11 muestra que, en presencia de cantidades en aumento del Compuesto No. 14, se previno la producción del FNT bioactivo, determinada por el bioensayo de células L929, por células RAW 264.7. Los datos muestran que con 10 \muM del Compuesto No. 14 hubo una reducción de más del 99% de la acumulación del FNT en el medio de cultivo. La Figura 12 muestra una transferencia western que demuestra la ausencia de la proteína del FNT en el medio de células cultivadas con concentraciones de 5 y 25 \muM del Compuesto No. 14. La no secreción del FNT por las células tratadas con el Compuesto No. 14 no puede atribuirse sencillamente a la inhibición de la síntesis del NO por el Compuesto No. 14. El inhibidor de NOS N-metil-arginina (NMA), aun en concentraciones de 10 \muM, no inhibió la producción del FNT en este sistema. La inhibición de la producción del FNT tampoco pudo atribuirse a los efectos del agotamiento de arginina causado por el bloqueo del transporte de arginina. La Figura 13A muestra que el Compuesto No. 14, en una concentración de 5 \muM, funcionó como inhibidor de la síntesis de NO, pero que esta inhibición podía superarse parcialmente con la presencia de entre alrededor de 50 y 100 \muM de arginina en el medio. Por otra parte, los datos de la Figura 13B muestran claramente que los efectos en la secreción del FNT del Compuesto No. 14 en 5 \muM no se redujeron ni siquiera por 1,0 mM de arginina extracelular. Estos resultados muestran que el Compuesto No. 14 bloqueó específicamente la producción del FNT de los macrófagos activados por un mecanismo que no depende críticamente de la arginina.
Se han observado datos cualitativamente similares midiendo los niveles del FNT sérico de ratas estimuladas para producir el FNT por la administración parenteral de LPS. Las ratas recibieron el Compuesto No. 14, i.p., 2,0 horas antes de la estimulación por LPS. Se midieron los niveles séricos del FNT entre 2 y 3 horas después de la estimulación por LPS. Los animales tratados con el Compuesto No. 14 sólo mostraron alrededor de la mitad del nivel de FNT sérico que los controles no tratados.
Se obtuvieron resultados similares acerca de una variedad de citocinas además del FNT, p. ej., IL-6 y proteínas inflamatorias macrófagas 1\beta (MIP-1\alpha y MIP-1\beta) usando sangre periférica humana como fuente de monocitos. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) usando métodos a base de "FICOLL® ", colocándolas en placas de cultivo estándares de 6 pozos en una concentración de 10^{6}/pozo. Se dejaron adherir desde 2 horas hasta toda la noche, cuando se removieron las células no adheridas por lavado. Luego se reemplazó el medio con medio que contenía el compuesto a probarse. Una hora más tarde, se suplementó el medio de modo que contuviera 25 U/mL de IFN\gamma y 0,1 \mug/mL de LPS y se incubaron los cultivos durante 18 horas adicionales. Luego se recogió el medio y se removieron los residuos celulares por centrifugación. Entonces se ensayó este sobrenadante acondicionado para detectar la presencia de citocinas, usando las metodologías estándares del bioensayo de citotoxicidad por células L929 y el inmunoensayo (ELISA). Los resultados indicaron que, al probarse en este sistema, el Compuesto No. 14 inhibió con eficacia la producción del FNT, IL-6, MIP-1\alpha y MIP-1\beta por células PBMC humanas en una concentración de alrededor de 10-20 \muM. Las Figuras 14A-D muestran que, en presencia de cantidades del Compuesto No. 14 que aumentan de 1 a 20 \muM, se previno la producción de estas citocinas por los cultivos de células PBMC humanas.
15. Ejemplo: El compuesto No. 14 confiere protección contra el infarto cerebral focal
Esta sección describe en detalle los métodos y los resultados de un modelo animal para determinar la capacidad del Compuesto No. 14 para tratar el infarto cerebral (también conocido como accidente cerebrovascular).
\newpage
Se les dieron alimento y agua ad libitum antes y después de la cirugía a ratas Lewis (machos, 270-300 g). Los animales fueron anestesiados con cetamina (120 mg/Kg i.m.). Se permitió que respiraran espontáneamente y se mantuvo la temperatura corporal en 35,5-36,5ºC con una manta calentadora. Se afeitó el cuello ventral y el área entre el ojo y la oreja derechos. Se utilizó una incisión cervical ventral media para exponer la arteria carótida primitiva (ACP) izquierda, que se separó del tejido circundante, preservando el nervio vago. Luego se colocó un lazo de seda 4-0 alrededor de la arteria para su manipulación futura. Entonces se expuso la arteria carótida primitiva derecha y se obstruyó permanentemente con ligaduras dobles de seda 4-0.
Para realizar la craneotomía, se hizo una incisión de 1 cm de manera ortogonal en relación a la línea que une el canal auditivo externo y el canto lateral del ojo derecho. Con la ayuda de un microscopio de disección, se expuso la arteria cerebral media por un agujero de 1 mm perforado aproximadamente a 2 cm en sentido rostral de la fusión del cigoma y el hueso temporal. Se hizo la perforación bajo un goteo continuo de solución salina normal para evitar la transmisión de calor a la corteza subyacente. Se disminuyó el hueso con el taladro, dejando una cáscara delgada que se removió con un microgancho y microfórceps. Luego se cortó la duramadre y se reflejó con una aguja de calibre 30, exponiendo la arteria cerebral media (ACM) derecha aproximadamente a 1 mm de la fisura rinal.
Usando un micromanipulador y un gancho de alambre de tungsteno de 20 micrones, se elevó la arterial cerebral media derecha 0,5 mm por sobre la superficie cortical y se dividió aplicando una punta de electrocauterio al gancho de tungsteno encima del vaso. La aplicación de calor rápidamente cauterizó y separó la arteria, que cayó sobre la corteza sin ninguna lesión cortical subyacente. Para causar un accidente cerebrovascular reproducible, hay que obstruir la ACP izquierda de 30 a 60 minutos. En consecuencia, en este modelo se obstruyó la ACP izquierda durante 30 minutos. Se colocó espuma de gel quirúrgica sobre el defecto de la craneotomía y se cerraron las incisiones en la piel con suturas de vicrilo. Luego se volvieron a colocar a los animales en sus jaulas, donde tuvieron acceso libre a alimentos y agua durante 24 horas. Después de la cirugía los animales estaban algo torpes pero retomaron sus actividades, incluidos caminar, comer y beber.
Veinticuatro horas después de cortar la ACM, los animales fueron anestesiados y decapitados, y se removieron los cerebros rápidamente, sin perfusión, realizándose secciones coronales en intervalos de 1 mm con un corte de cerebro para análisis. Se sumergieron e incubaron los cortes recién preparados en 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) (2% en NaCl, 154 mM) durante 30 minutos a 37ºC en la oscuridad para tinción por actividad de dishidrogenasa mitocondrial. Los infartos cerebrales se visualizaron como áreas de tejido no teñido (blanco) fácilmente contrastado con el tejido viable que se teñía de rojo. Luego se colocaron los cortes en formalina tamponada al 10% y se determinó el área de infarto por planimetría en imágenes proyectadas de cortes de cerebro fotografiados. Se calculó el tamaño de infarto de los animales individuales sumando el área de infarto en cada corte de cerebro y dividiendo por la suma del área hemisférica de todas las partes de un animal dado (expresado como porcentaje del área hemisférica de cada corte). Los animales fueron estudiados en grupos de 10, y los datos se expresaron como el volumen de accidente cerebrovascular medio del grupo.
El tamaño de infarto medio de los controles (animales no tratados con el Compuesto No. 14) observado fue del 3,1% \pm 0,5%. Los animales que recibieron el Compuesto No. 14 (1 mg/Kg, i.v.) una hora antes de que se cortara la arteria desarrollaron un tamaño de infarto más pequeño (1,7% \pm 0,2%). Estas diferencias fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) de acuerdo a la prueba t de Student para datos no apareados. Estos experimentos indicaron que el Compuesto No. 14 redujo eficazmente el tamaño del infarto cerebral focal.
16. Ejemplo: Actividad neoplásica del compuesto No. 14
Esta sección describe en detalle los métodos y los resultados de un modelo animal de crecimiento tumoral para determinar la capacidad de los compuestos de la invención para inhibir el crecimiento tumoral y causar la regresión de los tumores. Se colocan células en matraces de cultivo tisular estándares en DMEM suplementado con suero de ternero fetal (10%). Células de ovario de hámster chino (OHC) transfectadas de manera estable con un vector de expresión mamífero secretan constitutivamente FNT humano (FNT-OHC). Los experimentos con el tumor de FINT-OHC se realizaron de la siguiente manera: el día de la inyección en ratones desnudos, se cosechan células y se inyectan de manera intramuscular (10-15 x 10^{6} células por animal) en la pata trasera de ratones desnudos nu/nu (20 g de peso corporal). Los animales son alojados y se los suministran alimentos y agua ad libitum. Se monitorea el crecimiento tumoral y cuando hay tumores establecidos (durante la semana seis), se administran los compuestos de prueba a diario (0,4 mg/Kg en forma intraperitoneal, una vez al día). Después de dos semanas se sacrifican los animales, se pesa el tumor y se mide con una galga. El tumor de FNT-OHC también hace metástasis a la piel de estos animales. Se cuenta el número de metástasis.
La administración parenteral del Compuesto No. 14 causó una reducción del tamaño del tumor en cuatro de cada cinco animales. Se pesaron los tumores de estos animales y se determinó el tamaño de los tumores. El examen de los ratones para detectar las metástasis en la piel reveló que, en promedio, se desarrollaron 2,5 \pm 1 metástasis en la piel de 4 de cada 5 controles. No hubo metástasis en la piel de ninguno de los animales tratados. Estos datos muestran que el Compuesto No. 14 tiene actividad antitumoral.
9
17. Efectos inhibidores del compuesto No. 14 en la captación de arginina y la producción de NO de células previamente quiescentes versus células activadas
Esta sección describe experimentos que miden la concentración del Compuesto No. 14 necesario para inhibir la captación de arginina y la producción de NO. Las técnicas empleadas se describen en la sección 7.1 supra.
La Figura 13A muestra los efectos del Compuesto No. 14 en la producción de NO por células RAW 264.7 que estuvieron expuestas continuamente al Compuesto No. 14 desde una hora antes de la estimulación con IFN\gamma/LPS hasta el final del ensayo, 18 horas después de la estimulación. Estos datos muestran que el Compuesto No. 14 inhibió la producción de NO antagonizada competitivamente por la arginina extracelular. Estos datos indican que la C.I._{50} para el Compuesto No. 14 en este ensayo, con concentraciones fisiológicas de arginina (100 \muM), estaba entre 3 y 5 \muM.
Tal como lo indica la Figura 6, el nivel pico de la captación de arginina por las células RAW 264.7 ocurrió aproximadamente 8 horas después de la estimulación con IFN\gamma/LPS. Cuando las células RAW 264.7 fueron expuestas al Compuesto No. 14 antes de la estimulación, como en la Figura 13B, y se midió el nivel de captación de arginina a las 8 horas, la C.I._{50} de la captación de arginina del Compuesto No. 14 fue muy similar a la observada para la producción de NO, 7,5 \muM (los datos no están ilustrados).
Sin embargo, no se pudieron atribuir todos los efectos del Compuesto No. 14 en la producción macrófago del NO a un bloqueo agudo del transporte de arginina. La Figura 15 muestra los resultados observados cuando las células RAW 264.7 fueron estimuladas por IFN\gamma/LPS sin ningún inhibidor y, 8 horas más tarde, las células fueron expuestas durante 10 minutos al Compuesto No. 14, cuando se midió la captación de arginina. Se midió C.I._{50} = 60 \pm 15 \muM (media \pm error estándar, n = 3) cuando células RAW 264.7, que habían sido estimuladas con IFN\gamma/LPS 8 horas antes, fueron expuestas al Compuesto No. 14 en un tampón libre de arginina durante 10 minutos antes de ensayar la captación de arginina. Los resultados de estos experimentos sobre la exposición aguda fueron distintos de los resultados de la exposición continua presentados anteriormente en dos maneras. Primero, aproximadamente un tercio de toda la captación de arginina ocurrió por medio de un mecanismo independiente del Compuesto No. 14, que parecía encontrarse en las células RAW 264.7 tanto no estimuladas como estimuladas. En segundo lugar, la concentración del Compuesto No. 14 necesaria para inhibir la captación de arginina en un 50% después de haber establecido el transporte de arginina inducido por IFN\gamma/LPS durante un período de horas fue mayor que la necesaria para impedir el 50% del aumento de la captación de arginina o de la producción de NO cuando se introdujo el Compuesto No. 14 antes de la estimulación.
Se observó un nivel intermedio de sensibilidad al Compuesto No. 14 cuando se expusieron células RAW 264.7 estimuladas con IFN\gamma/LPS a un inhibidor desde 8 horas después de la estimulación inicial hasta el final del experimento. En estos experimentos, se midió la producción de NO durante 12-24 horas. La Figura 16 demuestra que en tales condiciones experimentales se observó una C.I._{50} de 20 \pm 2 \mum (media \pm error estándar, n = 3).
Juntos, estos datos muestras que cuando se expusieron células RAW 264.7 al Compuesto No. 14 antes de la activación por IFN\gamma/LPS, la producción de NO y la captación de arginina inducible fueron igualmente sensibles a bajos niveles del Compuesto No. 14, mientras que la captación de arginina por células RAW 264.7 no estimuladas fue insensible al Compuesto No. 14. Por otra parte, la captación de arginina por células RAW 264.7 estimuladas por IFN\gamma/LPS y expuestas brevemente al Compuesto No. 14 después de una demora fue menos sensible al Compuesto No. 14 que cuando se dio el Compuesto No. 14 antes de la estimulación. Asimismo, se comprobó que la producción de NO por célulastratadas con el Compuesto No. 14 horas después de la estimulación era menos sensible a la inhibición por el Compuesto No. 14 que la inducción de la producción de NO por células previamente quiescentes.
Estos datos indican que harán falta niveles más altos del Compuesto No. 14, in vivo, para bloquear la producción continuada de NO por macrófagos activados de los que harían falta para prevenir la iniciación de la producción de NO por macrófagos no activados, y que el Compuesto No. 14 será más eficaz cuando se aplica a las células en forma crónica que cuando se aplica en forma aguda.
El alcance de esta invención no ha de limitarse por las realizaciones específicas descritas, que sirven de ilustraciones individuales de aspectos individuales de la invención. Métodos y componentes funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de las ilustradas y descritas en la presente, serán evidentes para las personas con destreza en la técnica a partir de la descripción anterior y de los dibujos adjuntos.

Claims (15)

1. Un compuesto con la fórmula:
10
donde:
X_{1} y X_{2} = H-; y
X'_{1}, y X'_{2} independientemente = GhyCH- o GhyCCH_{3}-, donde Ghy es una parte molecular de guanilhidrazona;
Z = -A-(CH_{2})_{n}-A-;
n = 3-8; y
A = -NH(CO)-; -(CO)NH-; -NH(CO)NH-;
o
Z = -O-(CH_{2})_{2}-O-
y sales de los mismos;
\vskip1.000000\baselineskip
o donde el compuesto tiene la siguiente fórmula:
11
donde:
X_{2} y X'_{2} = H-;
X_{1} y X'_{1} independientemente = GhyCH-, o GhyCCH_{3}-, donde Ghy es una parte molecular de guanilhidrazona; y
n = 3-8;
y sales de los mismos;
\newpage
o donde el compuesto tiene la siguiente fórmula:
12
donde:
X_{2} y X'_{2} = H-;
X_{1} y X'_{1} independientemente = GhyCH-, o GhyCCH_{3}-, donde Ghy es una parte molecular de guanilhidrazona; y
n = 2-10;
y sales de los mismos.
2. El compuesto de la reivindicación 1 con la siguiente fórmula:
13
donde:
X_{1} y X_{2} = H-; y
X'_{1} y X'_{2} = GhyCCH_{3}-, donde Ghy es una parte molecular de guanilhidrazona;
Z = -A-(CH_{2})_{n}-A-;
n = 3-8; y
A = -NH(CO)-, -(CO)NH-, -NH(CO)NH-;
y sales de los mismos;
3. El compuesto de la reivindicación 1 con la siguiente fórmula:
14
donde:
X_{1} y X_{2} = H-; y
X'_{1} y X'_{2} = GhyCCH_{3}-, donde Ghy es una parte molecular de guanilhidrazona; y
Z = -O-(CH_{2})_{2}-O-;
y sales de los mismos;
4. El compuesto de la reivindicación 1 con la fórmula:
15
donde
X_{2} y X'_{2} = H-;
X_{1} y X'_{1} = GhyCCH_{3}-; y
n = 3-8;
y sales de los mismos;
5. El compuesto de la reivindicación 1 con la siguiente fórmula:
16
donde
X_{2} y X'_{2} = H-;
X_{1} y X'_{1} = GhyCCH_{3}-; y
n = 2-10;
y sales de los mismos.
6. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.
7. Un uso del compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmcéuticamente aceptable del mismo para fabricar un medicamento para inhibir la síntesis de urea a partir de arginina plasmática en un sujeto.
8. Un uso del compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para fabricar un medicamento para aliviar la caquexia en un sujeto.
\newpage
9. Un uso del compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para fabricar un medicamento para aliviar los efectos nocivos de la síntesis de óxido nítrico en un sujeto.
10. Un uso del compuesto de la reivindicación o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para fabricar un medicamento para aliviar los efectos nocivos de la secreción de citocina en un sujeto.
11. Un uso del compuesto de la reivindicación 1 o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para fabricar un medicamento para aliviar los efectos nocivos de la secreción del factor de necrosis tumoral (FNT) en un sujeto.
12. Un uso del compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para fabricar un medicamento para tratar el shock endotóxico en un sujeto.
13. Un uso del compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para fabricar un medicamento para tratar la enfermedad neoplásica o los efectos secundarios de tal tratamiento en un sujeto.
14. Un uso del compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para fabricar un medicamento para inhibir la síntesis del óxido nítrico en un sujeto.
15. Un uso del compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para fabricar un medicamento para inhibir la síntesis de una citocina en un sujeto.
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