ES2256913T3 - Antagonistas de arginina para la inhibicion de la hipotension sistemica asociada a la produccion de oxido nitrico o al factor de relajacion derivado endotelial. - Google Patents
Antagonistas de arginina para la inhibicion de la hipotension sistemica asociada a la produccion de oxido nitrico o al factor de relajacion derivado endotelial.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA LA PROFILAXIS O TRATAMIENTO DE UN ANIMAL CON HIPOTENSION SISTEMICA INDUCIDA POR PRODUCCION INTERNA DE OXIDO DE NITROGENO. EL PROCEDIMIENTO SUPONE ADMINISTRAR UNA CANTIDAD TERAPEUTICAMENTE EFECTIVA DE CIERTOS DERIVADOS DE LA ARGININA PARA INHIBIR LA FORMACION DE OXIDO DE NITROGENO A PARTIR DE LA ARGININA. PREFERENTEMENTE, LA ARGININA N G - SUSTITUIDA O UNA ARGININA N G , N G- DISUSTITUIDA (QUE TIENE AL MENOS UN HIDROGENO EN UN GRUPO AMINO -GUANIDINO TERMINAL SUSTITUIDO POR OTRA ESPECIE ATOMICA) SE ADMINISTRA A UN ANIMAL QUE POSIBLEMENTE ESTE DESARROLLANDO O SUFRA YA DICHA HIPOTENSION SISTEMICA INDUCIDA. LOS DERIVADOS DE LA QUININA SON PREFERENTEMENTE DE LA CONFIGURACION L E INCLUYEN SUS SALES DE ADICION FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLES. SE PUEDE ASI OBTENER LA PROFILAXIS O EL TRATAMIENTO DE HIPOTENSION SISTEMICA EN UN PACIENTE, CUANDO HA SIDO INDUCIDA POR TRATAMIENTO QUIMIOTERAPEUTICO CON MODIFICADORES DE LA RESPUESTA BIOLOGICA, TALES COMO EL FACTOR DE LA NECROSIS TUMORAL O LA INTERLEUQUINA 2. EL TRATAMIENTO DE UN ANIMAL PARA HIPOTENSION SISTEMICA INDUCIDA POR ENDOTOXINA, POR EJEMPLO, EL CHOQUE SEPTICO, PODRIA REALIZARSE POR TRATAMIENTO CON LOS DERIVADOS DE LA ARGININA.
Description
Antagonistas de arginina para la inhibición de la
hipotensión sistémica asociada a la producción de óxido nítrico o al
factor de relajación derivado endotelial.
La presente invención se refiere a la profilaxis
y el alivio de la hipotensión producida por la producción de óxido
nítrico.
En 1980, Furchgott y Zawadski
(Nature 288: 373-376) han demostrado
que las células endoteliales, que cubren los vasos sanguíneos,
pueden ser estimuladas a liberar una sustancia que relaja los
músculos vasculares suaves, es decir, provoca una vasodilatación.
Debido a que la naturaleza química de esta sustancia es totalmente
desconocida, simplemente fue nombrada como factor relajante
derivado del endotelio (EDRF, por las siglas de la extensión
inglesa, Endothelium-derived Relaxing
Factor). Está, ahora ampliamente aceptado, que muchas
sustancias naturales actúan como vasodilatadores fisiológicos y
median toda o parte de su acción para estimular la liberación de
EDRF; estas sustancias incluyen, acetilcolina, histamina,
bradiquinina, leucotrienos, ADP, ATF, sustancia P, serotonina,
trombina y otros. Aunque el extremadamente breve tiempo de vida del
EDRF (varios segundos) dificulta los esfuerzos para identificar
esta molécula químicamente, en 1987 algunos laboratorios indicaron
que el EDRF podría ser óxido nítrico (NO), que se descompone
espontáneamente a nitrato y a nitrito. Un problema fundamental en
aceptar esta hipótesis del NO, es que no se conoce que los sistemas
de mamíferos contengan una vía enzimática que podría sintetizar NO;
adicionalmente, se desconoce un precursor probable para la
biosíntesis. Después de observar que el análogo de la arginina
L-N^{G}-metilarginina
(L-NMA) podría inhibir la síntesis vascular de
NO/EDRF inducida por acetilcolina e histamina, y que la síntesis de
NO/EDRF podría ser restituida adicionando
L-arginina en exceso, ciertos inventores actuales
propusieron que la arginina fuera el precursor fisiológico de la
biosíntesis de NO/EDRF (Sakuma y col., PNAS 85
8664-8667, 1988). Fueron reportadas pruebas
adicionales que soportan esta propuesta casi simultáneamente.
Ciertos inventores demostraron que la inhibición de la síntesis de
NO/EDRF en cobayas anestesiadas eleva la tensión sanguínea,
sugiriendo que NO/EDRF es un regulador fisiológico importante de la
tensión sanguínea (Aisaka y col., BBRC 160
881-886, 1989). No obstante las evidencias
acumuladas que soportan la síntesis de NO, se comprende por los
expertos en la técnica que otros óxidos de nitrógeno podrían estar
presente y podrían ser activos y reducir la tensión sanguínea.
Dentro de esta especificación, la sigla NO se debe comprender que
representa al óxido nítrico y cualquiera de los óxidos de nitrógeno
adicionales vasoactivos.
Otros laboratorios han demostrado que las células
de macrófagos se vuelven "Activadas" por el tratamiento de
12-36 horas con gamma-interferón,
endotoxinas bacterianas y varias citoquinas. Esta "Activación"
esta relacionada con la iniciación de la muerte de las células
tumorales y la generación de nitrito y nitrato a partir de
L-arginina. Fue observado que los macrófagos
activados forman NO a partir de L-arginina (como
células endoteliales) y que este NO reacciona con el oxígeno
posteriormente para formar metabolitos de un nitrógeno más oxidado
que parecen ser inertes fisiológicamente (Stuehr y col., J Exp.
Med. 169: 1011-1020, 1989). La
enzima responsable de la síntesis de NO (sintetasa de óxido
nítrico) ha sido caracterizada parcialmente por algunos de los
inventores (Stuehr y col. BBRC 161:
420-426, 1989) y actúa para oxidar el grupo
amino terminal de la arginina, dando como resultado en la
producción de NO y citrulina. Se cree ahora que el NO obtenido de
macrófagos es un importante agente tumoricida y bactericida. Debido
a que las endotoxinas bacterianas, interferón gamma y otras
citoquinas, pueden dar inicio a la generación de NO por células de
macrófagos y parece que: 1) la generación de NO por células
endoteliales puede ser estimulada por estímulos similares y 2) el
shock séptico (i.e., vasodilatación sistémica inducida por
endotoxinas bacterianas) ser resultado de la activación masiva de
la biosíntesis de NO. La especulación de que la última hipótesis era
correcta, fue alimentada por una información previa de que los
niveles de nitrato en la orina son elevados por el tratamiento de
ratas con exceso de endotoxinas bacterianas (Wagner y col.,
PNAS: 80 4518-4521,
1983).
1983).
Es bien conocido que las citoquinas causan
alteraciones morfológicas y funcionales de las células endoteliales
que son descritas como "activación celular endotelial". Parece
que mediadores inmunes distintos como el factor de necrosis tumoral
(TNF), interleuquina-1 (IL-1), y
gamma-interferón incluyendo (el IFN ó I) inducen
diferentes, aunque parcialmente superpuestos, patrones de la
activación de células endoteliales incluyendo el incremento de la
actividad procoagulante (Bevilaqua, 1986), producción
de PGI2 (Rossi, 1985 Science 229,174),
extensión de antígeno HLA (Pober 1987) y moléculas de
adherencia de linfocitos (Harlan 1985;
Cavender 1987). Aunque se reporta que estas citoquinas
causan hipotensión poco claros (Goldblum y col. 1989;
Tracey y col. Science 234: 470, 1986). Un
mediador potencial de la actividad vascular modificada es el
EDRF.
El documento EP 0 230 037 se refiere a que
ciertos derivados de arginina han sido propuestos como útiles en
las enfermedades isquemicas. Gold y col. (1989) FASEB
3 (3): A494, 2653 se refiere a la influencia de los análogos de
arginina y a la disminución de la relajación del músculo suave
dependiente del endotelio vascular.
En estudios, tanto clínicos como en animales
(Dvorak, 1959), sobre los efectos modificadores de la
respuesta biológica, la hipotensión y la ruptura vascular han
constituyeron la toxicidad que limite una dosis muy
importan-
te.
te.
La presente invención involucra el uso de un
inhibidor de la formación de óxido nítrico a partir de arginina en
la fabricación de un medicamento para la profilaxis o el
tratamiento de la hipotensión sistémica.
La presente invención adicionalmente involucra un
inhibidor en la formación de óxido nítrico a partir de arginina
para uso medicinal en humanos, en el que el inhibidor son
N^{G}-aminoarginina,
N^{G}-nitroarginina,
N^{G}-metil-arginina,
N^{G}-etilarginina,
N^{G}-propilarginina,
N^{G}-butilarginina, arginina
N^{G}N^{G}-disustituida a partir de metiéster
de L-nitroarginina.
La presente invención hace posible la profilaxis
o el tratamiento en animales de la hipotensión sistémica producida
por un modificador de la respuesta biológica como son las
citoquinas, IFN, TNF, IL-1 e IL-2.
Dicho método implica la administración, preferentemente
intravascular de una cantidad terapéuticamente eficaz de un
inhibidor de la formación de óxido nítrico a partir de arginina.
Aunque la administración preferible es intravascular, son
consideradas que otras rutas de administración, por ejemplo, como el
uso parenteral como intraperitoneal, intramuscular o inyección
subdérmica pueden resultar útiles. La administración enteral o
tópica pueden también constituir beneficios para ciertas
condiciones clínicas.
En una realización, el inhibidor es arginina
N^{G}-sustituida o una arginina
N^{G}N^{G}-disustituda, que se administra a un
animal en el que se está desarrollando o experimentando hipotensión
sistémica posiblemente por NO inducida. Los antagonistas de
arginina de la presente invención son preferentemente de la
configuración "L" e incluyen cualquiera de las sales
adicionales aceptables farmacéuticamente como las comparables con
los tratamientos previstos.
Un uso particular de la presente invención es la
profilaxis o tratamiento de la hipotensión sistémica producida en
un paciente por el tratamiento con una sustancia química
terapéutica con factor de necrosis tumoral ó
interleuquina-2 ó ambos. En este aspecto, el método
supone administrar intravascular una cantidad eficaz
terapéuticamente de arginina N^{G}-sustituida o
una arginina N^{G}N^{G}-disustituda al paciente
de quimioterapia.
Un aspecto importante de la presente invención es
el tratamiento de un animal por hipotensión sistémica producida por
endotoxinas, es decir, shock séptico. Aunque aquí la profilaxis es
inapropiada, el tratamiento es esencial, el tratamiento involucra
la administración intravascular de una cantidad eficaz
terapéuticamente a un animal hipotensivo de un antagonista de
arginina como arginina N^{G}-sustituida, arginina
N^{G}N^{G}-disustituda por,
N^{G}-aminoarginina o
N^{G}-nitroarginina.
El shock séptico es una afección con peligro de
muerte que resulta de la exposición a endotoxinas bacterianas. Se
manifiesta por el colapso cardiovascular y es mediada por la
liberación de citoquinas como factor de necrosis tumoral. Algunos
de estas citoquinas provocan la liberación de sustancia vasculares
activas. En el presente estudio, la administración de 40 \mug/kg
de endotoxinas bacterianas en perros causó a los 30 a 90 minutos un
decrecimiento del 33% en la resistencia vascular periférica y una
caída del 54% de la media de la tensión arterial sanguínea. La
resistencia vascular y la tensión arterial sistémica se
normalizaron en 1,5 minutos después de la administración
intravenosa de
N^{G}-metilo-L-arginina
(20 mg/kg), un inhibidor selectivo y potente de la síntesis de
óxido nítrico. Aunque la inyección de
N^{G}-metilo-L-arginina
incrementa la tensión sanguínea en los perros del control, el
efecto hipertenso es mucho mayor en los perros endotoxémicos (24,8
\pm 4,7 vs. 47,8 \pm 6,8 mm Hg, n=4). La
N^{G}-metilo-L-arginina
provocó solamente un aumento moderado en la tensión sanguínea en
los perros que se vuelven hipotensivos por infusión intravenosa e
ininterrumpida de nitroglicerina (17.1 \pm 5.0 mm Hg, n=3). Estas
conclusiones indican que el exceso de producción de óxido nítrico
es un colaborador importante del shock endotóxico. Además, nuestras
conclusiones demuestran por primera vez, la utilidad de los
inhibidores de la síntesis de óxido nítrico en el shock endotóxico
e indican que tales inhibidores pueden ser de un valor terapéutico
en el tratamiento del shock séptico.
Los antagonistas preferidos de arginina
N^{G}-sustituida de la configuración L para los
usos como se describe la presente solicitud incluyen
N^{G}-aminoarginina,
N^{G}-nitroarginina, y
N^{G}-alquilarginina como
N^{G}-metilarginina, N^{G} etilarginina,
N^{G}-propilarginina o
N^{G}-butilarginina. Las cantidades eficaces
terapéuticamente de los antagonistas de la arginina disustituida ó
sustituida inhiben la producción en el animal o el paciente de
óxido nítrico a partir de arginina, obviando por lo tanto, sus
efectos hipotensivos.
En un sentido más general, la presente invención
podría relacionarse con la profilaxis o el tratamiento de un animal
por hipotensión sistémica relacionada con la inducción de la
producción de óxido nítrico. Dicho tratamiento involucra el
administrar una cantidad terapéutica eficaz de un antagonista de
arginina a un animal intravascular para la producción inhibidora
del óxido nítrico a partir de arginina. Los antagonistas de
arginina efectivos pueden incluir una gran variedad de compuestos,
particularmente los derivados de arginina que inhiben la producción
de óxido nítrico. Muchos sustituyentes también deben servir, por
ejemplo, los grupos funcionales del grupo guanidino de la arginina o
los análogos de la citrulina. La síntesis del óxido nítrico
produciendo hipotensión puede estar directa o indirectamente
inducida por al menos uno de estos: IFN, TNF, IL-1,
IL-2 y endotoxinas. En un aspecto preferido, los
antagonistas de arginina utilizables como se describe en la presente
solicitud incluyen arginina N^{G}-sustituida o
arginina N^{G}N^{G}-disustituda. En una
realización, estos antagonistas tienen sustituyentes alquilos
seleccionados, preferentemente los grupos metilo, etilo, propilo y
butilo. Antagonistas análogos podrían incluir sustituyentes de
derivados alquilos seleccionados entre los grupos que constan de
hidroxialquilo, carboxialquilo y aminoalquilo. Los antagonistas de
arginina empleados en la práctica de la presente invención
comprenden arginina con al menos un sustituyente N^{G} que se
selecciona de los grupos que constan de alquilo, hidroxialquilo, y
alquenilo. La cantidad terapéutica eficaz de los antagonistas de
arginina de la presente invención es una cantidad suficiente para
inhibir la producción de óxido nítrico a partir de arginina. El
oxido nítrico se degrada rápidamente a nitrato (principalmente) y a
iones nitrito (en una proporción fija) en presencia de oxígeno; por
lo tanto, los nitritos son medidos clínicamente para demostrar la
producción de óxido
nítrico.
nítrico.
Cuando administramos intravascular una cantidad
eficaz terapéuticamente de NMA ó
N^{G}-metilarginina (lo mismo que
N^{G}-monometil-L-arginina
ó NMMA) a un perro, la cantidad eficaz terapéuticamente está entre
aproximadamente 4 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg. La dosis
apropiada para un ser humano de NMMA y/o otros antagonistas de
arginina debe estar aproximadamente entre 0,1 mg/kg y
aproximadamente 100 mg/kg.
Las abreviaturas usadas en los dibujos y otros
lugares en esta solicitud incluyen las siguientes. Las otras son
definidas en el texto.
ACh = Acetilcolina
CO = Gasto cardíaco
EDRF = Factor relajante derivado del
endotelio
ET = Endotoxinas
GP = Cobaya
HIST = Histamina
IFN = I = gamma-interferón
IV = Intravenosa
L-Arg =
L-arginina
L-NMA (o NMMA) =
N^{G}-metil-L-arginina
=
N^{G}-monometil-L-arginina
LPS = endotoxinas en búfer de fosfato salino
LTD_{4} = leucotrieno D_{4}
MBEC = células endotelio del cerebro murino
MDP = dipéptido muramilo
NE = norepinefrina
NMA = L-NMA = NMMA =
N^{G}-monometil-L-arginina
NO = Oxido Nítrico
PAF = Factor Activador de Plaquetas
SAP = Tensión arterial sistémica
SNP = nitroprusido de sodio
SVR = resistencia vascular sistémica
TNF = Factor de Necrosis Tumoral
La figura 1 muestra los efectos de IFN en
combinación con varias citoquinas sobre la producción de nitritos
por células del endotelio de cerebro (MBEC).
La figura 2a muestra la concentración de nitrito
asociada con MBEC a una concentración de factor necrosis tumoral
(TNF) y un intervalo de concentraciones de IFN.
La figura 2b muestra la concentración de nitrito
relacionada con MBEC a concentración de IFN constante y un
intervalo de concentraciones de TNF.
La figura 3 muestra la concentración de nitrito
relacionada con MBEC inducida por TNF y IFN (como una función del
tiempo).
La figura 4 muestra la concentración de nitrito
relacionada con MBEC expuesto a TNF e INF como una función de la
concentración de arginina.
La figura 5 muestra la reducción por NMMA de TNF
y concentración de nitrito inducida IFN por MBEC.
\global\parskip0.950000\baselineskip
La figura 5a muestra el revés por arginina de la
inhibición de NMMA de la concentración de nitrito.
La figura 6 muestra las concentraciones de
nitrito inducidas por MBEC con 100 U IFN/mL como una función de la
concentración de endotoxinas.
La figura 7 ilustra las variaciones en la tensión
sanguínea sistémica canina (BP) y frecuencia cardiaca (HR) como una
función del tiempo después de la administración secuencial de TNF,
NMMA, y L-arginina.
La figura 7a también ilustra las variaciones en
BP y HR sistémica en caninos como una función del tiempo después de
administración secuencial de TNF, NMMA, y
L-arginina.
La figura 7b ilustra los experimentos de control
en donde NMMA fue administrado a perros antes sin tratarlos.
La figura 7c ilustra los efectos de NMMA sobre
hipotensión canina inducida por nitroglicerina.
La figura 8 demuestra el efecto de NMMA sobre la
relajación dependiente de endotelio de cobayas (cavian) en anillos
de arterias pulmonares en respuesta a ACh, LTDD_{4} y HIST, y
sobre la relajación dependiente de endotelios causada por SNP.
La figura 9 muestra las curvas de inhibición en
respuesta a las dosis para la relajación, inducida por
acetilcolina, de los anillos de arterias para ciertos derivados de
arginina sustituidos con N^{G}.
La figura 9a muestra la inhibición de liberación
de nitrito, estimulada por A23187, en células endoteliales de
aórticas bovinas por algunos análogos de arginina mono y
disustituida.
La figura 9b muestra la inhibición de relajación
en anillos aórticos aislados de conejos, inducida por ACh por
algunos análogos de arginina mono y
di-sustituidos.
La figura 10 muestra la modificación con NMMA,
L-citrulina, D-arginina y
L-arginina de la relajación inducida por ACh, en los
anillos vasculares de varias especies.
La figura 11 describe la relajación Inducida por
ACh de aortas de conejos constreñidas por NE y arterias mamarias
internas humanas, cuando se modifican con L-NMA,
D-arginina (D-arg),
L-citrulina (L-cit) y
L-arginina (L-arg).
La figura 12 muestra la inhibición por NMMA de la
liberación de nitritos inducida por ionoforo de calcio, en células
endoteliales aórticas bovinas (BAEC's).
La figura 13 muestra la liberación de nitrito
inducida por histamina desde el corazón de cavian; el bloqueo por
NMMA y la restaurado por L-arginina.
La figura 14 muestra la relación entre la
respuesta a la dosis y el efecto de NMMA sobre la elevación de la
tensión sanguínea en una cobaya anestesiada.
La figura 15 muestra la hipertensión durante el
transcurso del tiempo y su dependencia de la dosis con NMMA en
cobayas.
La figura 16 muestra la hipertensión durante el
transcurso del tiempo y su dependencia de la dosis, inducida con
L-N^{G}-aminoarginina en
cobayas.
La figura 17 muestra los efectos de aumento de
tensión por L-N^{G}-aminoarginina
y NMMA como una función de la concentración en cobayas.
La figura 18 muestra el efecto de la estimulación
por IFN y ET de células de EMT6 sobre la concentración de nitrito
citosol en estas células.
La figura 19 muestra que la formación de nitrito
en el citosol de células EMT6, estimulada por IFN y ET es
dependiente sobre la arginina y NADPH.
La figura 20 es una dependencia de
Lineweaver-Burke para la síntesis de nitritos
dependiente de L-arginina con la actividad de enzima
presente en el citosol de EMT6 estimuladas (estimuladas con IFN y
ET).
La figura 21 muestra que NMMA es un inhibidor
competitivo de la enzima descrita en la figura 20.
La figura 22 muestra una correlación de
Lineweaver-Burke mostrando que
N^{G}-monoetilarginina (L-NEA) es
un inhibidor competitivo de la actividad enzimática mostrada en La
figura 20.
La figura 23 muestra durante el transcurso del
tiempo los cambios en la media de la tensión arterial sistémica
(SAP) en un perro anestesiado con pentobarbital seguido por la
administración de endotoxinas (ET),
NG-metil-L-arginina
(L-NMA), y L-arginina
(L-Arg).
\global\parskip0.990000\baselineskip
La figura 24 muestra durante el transcurso del
tiempo los cambios en la tensión arterial sistémica (SAP) en un
perro anestesiado con pentobarbital, seguido por la administración
de endotoxinas, L-NMA y L-ARG.
La figura 25 muestra durante el transcurso del
tiempo la hipotensión canina sistémica mediada por TNF y el inverso
por N^{G}-aminoarginina.
La figura 26 muestra el inverso de la hipotensión
sistémica inducida por endotoxinas por
N^{G}-aminoarginina.
La figura 27 muestra el inverso de la hipotensión
mediada por interleuquina-1 por
N^{G}-aminoarginina.
Los estudios clínicos de los modificadores de
respuestas biológicos como ciertas citoquinas han mostrado que una
importante dosis límite de toxicidad es la hipotensión. Estas
citoquinas se ha también encontrado que activan macrófagos, un
proceso que suministra macrófagos citotóxicos para células de
tumores. Los estudios recientes han implicado que el óxido nítrico
obtenido de macrófagos, como la molécula efectora responsable de la
citotoxicidad de las células de tumores. El óxido nítrico (NO) es
un compuesto muy reactivo que se descompone espontáneamente a para
el ensayo en la producción de NO. También ha sido demostrado que el
NO se produce por células endoteliales vasculares, siendo conocido
previamente como el factor relajante endotelial (EDRF). El EDRF se
ha encontrado que causa la relajación del músculo suave de las
arterias en respuesta a la inyección de agentes hipotensivos por lo
demás como bradiquinina o acetilcolina.
La presente invención consta de un descubrimiento
que el IFN (100 U/mL) en combinación sea con TNF 500 U/mL),
IL-1 (10 U/mL), ó endotoxinas (1 \mug/mL), puede
inducir que el MBEC's acumule nitrato en el medio de cultivo (15 a
80 \muM en 48 horas). Estos niveles son comparables a los
producidos por macrófagos activados. Solos el TNF,
IL-1 ó la endotoxina inducen la producción de
niveles mínimos de nitritos (1-3 \muM).
La liberación de los factores vasoactivos tales
como NO por células endoteliales puede jugar un papel en el
desarrollo de la hipotensión asociada con la administración estos
agentes in vivo. Esta invención se refiere a una
demostración de que MBEC's cultivada produce NO en respuesta a
varias combinaciones de citoquinas y al papel potencial de NO en la
patogénesis de la lesión de células endoteliales vasculares.
Estos ejemplos son presentados para describir del
mejor modo, las realizaciones preferidas y la utilidad de la
presente invención y no significa que constituyan una limitación a
la presente invención, a no ser se indique lo contrario en las
reivindicaciones añadidas a la presente solicitud.
Materiales-IFN, IL-1 y TNF
recombinante murino (Genzyme). NMMA fue un obsequio del Dr.
Moncada, Londres, Inglaterra. La endotoxinas (de E. coli
B126) y todos los otros reactivos fueron obtenidos del Sigma
Chemical Co. (Sigma).
Células endoteliales-MBEC's fue aislado de
microrecipientes de cerebro murino y cultivado en placas de cultivo
de tejidos, recubiertas con gelatina en medio DME/F12 suplementado
con 2% PPPHS, 5% FBS (Hyolone), 50 \mug/mL de ECGF
(Biomed Tech), y 10 U/mL de heparina (Sigma) como se
describió previamente (Belloni y col. 1989). La
derivación endotelial de MBEC's fue determinada por la presencia de
una superficie no trombogénica a plaquetas y e inmunofluorescencia
teñida con antígeno relacionado a Factor VIII. MBEC's fue usado
entre los pasos 6-9 para todos los experimentos.
Ensayo de Nitrito-Células MBE fueron
cultivadas sobre las placas de pocillos recubiertas con gelatina
(Corning) en 100 \muL de medio de cultivo y tratado con
citoquinas a 3 días de post-confluencia. Después de
48 horas, la producción de nitrito fue determinada por un ensayo
calorimétrico. Brevemente, 50 \muL de medio fueron retirados de
cada cultivo y mezclado bien con 50 \muL de reactivo de Greiss
(sulfanilamida de 1% y 0,1% con el dihidrocloruro de diamina
naftietileno en H_{3}PO_{4} al 2%, se incubó durante 10 minutos
con agitación a 25ºC, y la absorbancia (OD) fue medida en un lector
de placas (Molecular Device Corp.) y las concentraciones
determinadas en comparación con una solución estándar de NaNO_{2}
en agua. Los niveles de fondo de nitrito de los cultivos controles
que no recibían citoquinas fueron sustraídos de los valores
experimentales. En ciertos experimentos NMMA fue añadido al medio
de crecimiento al tiempo de la adición de citoquinas, mientras que
en otros medios libres de arginina fueron suplementados para el
medio de crecimiento. Todos los tratamientos fueron llevados a cabo
por triplicado y los datos presentados como el valor de media \pm
desviación típica.
Los efectos de IFN en combinación con varias
citoquinas o inmunomoduladores sobre la producción de nitrito por
MBEC son ilustrados en la figura 1. La exposición de células
endoteliales a IFN (100 U/mL) no tenía ningún efecto sobre la
producción de nitrito, sin embargo las combinaciones de interferón
con TNF (500 U/ mL), IL-1 (10 U/mL) o endotoxinas
(1 ug/mL) dieron como resultado un efecto sinérgico sobre la
producción de nitrito comparado con los efectos de estos agentes
solos. Ni el dipéptido de muramilo (MDP) o II-2
sólo, o en combinación con IFN provocó la producción de nitrito por
MBEC. Esta falta de la respuesta distingue al MBEC's de los
macrófagos activados que producen cantidades importantes de
nitritos después de la exposición a MDP y IFN (Drapier y
col. 1988). IFN más TNF es la combinación de citoquinas
que se encontró más eficaz para producir nitrito (19,5 \pm 5 mM).
Las curvas de respuesta de las dosis para TNF e IFN son mostradas
en La Figuras 2a y 2b. La acumulación de nitritos es proporcional a
la concentración de TNF añadido cuando IFN estaba presente en una
concentración de 100 U/mL (figura 2b).
La acumulación de nitritos en el medio de cultivo
también se encontró que ocurre de una manera dependiente del tiempo
con el primer aumento detectable a las 8 horas después de la
adición de TNF e IFN (figura 3). La acumulación máxima fue
observada a 48 horas y por lo tanto, todas las mediciones de nitrito
de los estudios siguientes fueron llevadas a cabo 48 horas después
de la adición de TNF (500 U/mL) y IFN (100 U/ mL). Aunque tanto el
TNF como IFN han sido informados que causan alteraciones
morfológicas a las células endoteliales de cordón umbilicales
humanos, la morfología de estas células endoteliales microvasculares
murinas no se detectó que cambian en estas condiciones.
Concentraciones aumentadas de nitritos no fueron
relacionadas con MBEC expuestas a TNF y IFN en el medio de cultivo
libre de arginina; la concentración de nitrito aumentó de una
manera dependiente de la dosis después de la adición de
L-arginina, de su regreso al medio (figura 4). La
producción de Nitrito también se inhibe por adición del NMMA
obtenido a partir de arginina (figura 5). Esta inhibición es
proporcional a la concentración de NMMA y es máxima en presencia de
1 mM de NMMA (E.D. 50% = 0,33 mM). Además, el efecto inhibitorio de
NMMA podría ser anulado por la adición de L-arginina
en exceso, con L-arginina 8 mM se invierten los
efectos de 1 mM de NMMA (La figura 5). Estos resultados indican que
las células del endotelio micro-vascular producen
NO en respuesta a las citoquinas específicas de la síntesis que
utiliza L-arginina como precursor fisiológico. Una
vía metabólica similar ha sido identificado para la producción de
NO por las células endoteliales de recipientes grandes en respuesta
a los agentes hipotensivos como bradiquinina y acetilcolina
(Palmer y col. 1988 153: 1251-1256 de
BBRC; Kelm y col. 1988).
Como se muestra en La figura 6, la endotoxina
causa una estimulación dependiente de la dosis de la producción de
nitrito con MBEC en presencia de 100 U IFN/mL.
La hipotensión asociada con la administración de
TNF en el perro puede ser bloqueada por la subsiguiente
administración de NMMA, que en su forma de base libre tiene la
fórmula estructural:
Además, esta inhibición de hipotensión puede ser
invertida por administración de un exceso de arginina. Estos
resultados muestran que el NO es el mediador de la hipotensión
inducida por TNF. Además, la activación de la síntesis de NO podría
estar involucrada en la patogénesis del shock séptico.
Actividad específica de 2 x 10^{7} U/mg de TNF
humano recombinante de la Nippon Chemical Corporation;
Tokio, Japón. El TNF fue administrado en una dosis de 10 \mug/kg
de en un volumen de 10 ml de búfer salino fosfato conteniendo 2
mg/mL de albúmina de perro. El NMMA fue sintetizado por la
adaptación del método de Corbin y el informado en Anal.
Biochem. 57: 310-312, 1974) y fue
disuelto en 5 mL de búfer salino fosfato para la administración de
una dosis de 15 mg/kg. Arginina fue obtenido de Sigma Chemical
Company, St. Louis, Mo.
Fueron estudiados cuatro perros chuchos
condicionados, 2 machos y 2 hembras, que pesaban 28 a 30 kg. El
cuidado de los animales fue según la recomendación de la
American Association for Accreditation of Laboratory Animals
[DHEW (DHHS). (NIH) 78-23, revised
1978]. En el día del experimento, los perros ayunaron toda
la noche. Se anestesiaron con fenobarbital (10 mg/kg). Fueron
entubados y luego de forma oral con un tubo endotraqueal # 10 y
ventilados con un ventilador de bomba Harvard a una velocidad de 12
respiraciones por minuto y un volumen de marea de 15 mL/kg. El día
del experimento fue puesta una línea arterial percutaneamente en la
arteria
femoral.
femoral.
Las presiones arteriales sistémicas fásica (SAP)
y media (electrónica) fueron grabadas constantemente sobre un
sistema de grabación de Hewlett Packard (modelo 7758B)
usando manómetros (Hewlett Packard modelo 1290A) que estaban
conectados con la línea arterial. La Frecuencia cardiaca (HR) fue
determinada en un electrocardiograma que trazaba y grababa sobre el
sistema de grabación de Hewlett Packard constantemente. La
saturación de oxihemoglobina (SaO_{2}) es obtenida usando un
oxímetro de pulso (BIOX 111; Boulder, CO). Los registros continuos
de tiempo de SAP, HR, y SaO_{2} fueron obtenidos usando un
convertidor digital análogo Lab Master (16 canal; 12 bits, 30
kHz Scientific Solutions, Inc.) Muestreando a 55 Hz y guardando los
promedios cada 6 segundos en un disco magnético.
Fue encontrado que NMMA invierte la hipotensión
relacionado con la administración de TNF. El efecto de subida de la
tensión de NMMA ocurre rápidamente (dentro de los 2 minutos) y
podría ser antagonizada por la administración de un exceso de
L-arginina. El antagonismo del efecto de subida de
tensión de NMMA es estereoespecífico para la
L-arginina.
Los datos indicados en la figura 7 son
representativos de algunos experimentos en animales. Había algunas
variaciones notadas en el grado de hipotensión, así como el tiempo
del inicio de hipotensión después de la administración de TNF. Diez
\mug de TNF/kg de peso corporal fue administrado por vía
intravenosa en el tiempo de diez minutos; 4.4 mg NMMA/kg
aproximadamente 52 minutos; y 3 g de L-arginina
aproximadamente 63 minutos. El inicio de hipotensión se encontró
que ocurre entre 30 a 60 minutos después de TNF. En el perro número
3, el SAP cayó rápidamente de 106 a 36. La administración de NMMA
dio como resultado el aumento rápido en la tensión sanguínea a un
SAP de 116. La respuesta de los dos perros restantes para TNF era
similar a lo descrito en la figura 7.
La administración de NMMA se evalúa solamente
para perros sin tratar (n = 3). Dentro de los 1,7 minutos después
de la inyección de NMMA, la tensión sanguínea aumentó inicialmente.
Esto fue seguido por un decrecimiento compensatorio en el HR con un
regreso del BP a línea base. La bradicardia inducida por NMMA dura
31 minutos. Esta respuesta no fue observada en animales que habían
sido tratados antes con TNF. En el experimento siguiente (Figura
7a) la respuesta hipotensiva para TNF fue especialmente grave, con
un decrecimiento en BP de 125 mm a 36 mm de Hg. La administración
de NMMA dio como resultado un aumento en la tensión sanguínea hasta
de 115 mm, un aumento de 79 mm. Este aumento en la tensión
sanguínea fue contrario por la administración de
L-arginina que causa que la tensión sanguínea
cayera otra vez a 37 mm de Hg totalmente. Los experimentos de
Control en los que NMMA fue administrado a perros sin tratar son
mostrados en la figura 7b. Dentro de 2 minutos la tensión sanguínea
se observa que aumenta en 12 mm de Hg. Esto fue relacionado con un
decrecimiento de HR de 101 a 92 latidos/min. La administración
siguiente de L-arginina anula estos cambios
pequeños observados en la tensión arterial sistémica. En un segundo
estudio control la nitroglicerina fue hecha una infusión de en una
proporción de 28 \mug/kg/min, para bajar la tensión sanguínea al
mismo nivel como se observó con el factor de necrosis tumoral
(figura 7c). Después que la administración de NMMA en
nitroglicerina penetró a los perros, la tensión sanguínea incrementó
solamente en 14 mm. La administración siguiente de
L-arginina anuló este efecto moderado.
La administración de L-arginina
para perros tratados con NMMA dio como resultado el decrecimiento
rápido de la tensión sanguínea. La tensión sanguínea no fue
afectada por la administración de L-arginina a
perros antes del tratamiento.
La toxicidad limitante de la dosis de TNF
administrada a pacientes es la hipotensión. Estos experimentos
implican que NO, también conocido como EDRF, es el mediador de la
hipotensión. Además, estos cambios hemodinámicos pueden ser
contrarios por un derivado de arginina
N^{G}-sustituida y restaurarse posteriormente por
adición de arginina en exceso; soportando el papel para arginina
como el sustrato para ninguna síntesis. Los inventores actuales han
mostrado que NMMA puede incrementar la tensión sanguínea de
relajación en los cobayos. Por lo tanto, el NO puede tener un papel
en homeostasis de tensiones arteriales normales. Esto también
parece ser verdadero en el perro.
La respuesta de subida de tensión para NMMA es
mucho más dramática en los perros con hipotensión inducida por TNF,
que la presente en los perros con tensión normal. Esto indica que
la hipotensión inducida por TNF es debida a un exceso en la
producción de un factor vasoactivo (es decir, NO) que actúa para
regular la tensión sanguínea de relajación normal.
El TNF también está involucrado en el desarrollo
de la toxicidad observada en el shock séptico. El shock séptico es
causado por las endotoxinas, un componente de la pared celular de
los organismos GRAM negativos. La administración de anticuerpos
anti-TNF después de la exposición a los TNF no
protege contra la hipotensión. Esto implica que TNF puede inducir a
otro mediador de hipotensión. Los resultados presentados en este
caso indican que el NO es el verdadero mediador de esa
respuesta.
Los análogos de L-arginina
N^{G}-sustituida no bloquean la síntesis de NO a
partir de arginina. El NMMA bloquea la relajación dependiente de
endoteliales en respuesta a varios dilatadores que actúan vía la
liberación de EDRF/NO. La figura 8 indica las curvas de
concentración vs. respuesta para la relajación de anillos de
arteria pulmonar en cobayas por vasodilatadores dependiente de
endotelios e independiente de endotelios por el efecto de NMMA.
Anillos vasculares fueron contraídos con 1 \muM de noradrenalina
y la relajación fue extraída por la adición acumulativa de
acetilcolina (ACh, panel A), D4 leucotrieno (LTD4, paneles B),
histamina (HIST, panel C) o nitroprusido de sodio (SNP, D de
paneles), a solas (el control), y en presencia de NMA. Los puntos
son media \pm SEM de valores de (n = 4-8).
NMMA bloquea la acción de ACh, LTD4 y HIST,
agentes que vasodilatan y producen como respuesta la liberación de
EDRF, mientras que NMMA no inhiben la vasodilatación por SNP (que
actúa directamente sobre el músculo vascular suave). Por lo tanto,
el NMMA tiene una acción específica sobre la vasodilatación mediada
por EDRF. Es digno de atención que la relajación restaurada de
L-arginina en presencia de NMMA y que el
D-estero-isómeros no fuera un
inhibidor de la síntesis de NO/EDRF.
En esta preparación la arteria pulmonar de la
cobaya, con los análogos de arginina
N^{G}-sustituidas aparte de metilo sirven también
de inhibidores de la síntesis de EDRF/NO. Los evaluados incluyen:
NO_{2}-, NH_{2}-, CH_{3}, y dimetil- (las curvas de
dosis-respuesta de algunos de éstos son mostradas
en La figura 9). La figura 9 indica curvas de
dosis-respuesta para la inhibición de la relajación
de ACh -inducida en anillos de arteria pulmonar de cobaya por los
análogos de L-arginina
N^{G}-sustituidas. Los anillos fueron estrechados
con 1 \muM de NE, luego relajado por la adición acumulativa de
ACh, a solas (el control), y luego en presencia de varias
concentraciones de los análogos de arginina
N^{G}-aminoarginina,
N^{G}-nitroarginina y NMMA. El % de inhibición de
relajación está calculada de la relajación ACh -inducida a la
máxima observada en presencia del análogo de arginina en comparación
con su falta. Los puntos representan valores de media \pm SEM (n
= 4-6). De los compuestos evaluados hasta ahora, el
derivado de NH_{2} sustituida parecía tener mayor actividad. Otro
N^{G} sustituido evaluado por la inhibición de liberación de
nitrito inducido tenía dos grupos metilo sobre uno de los
nitrógenos del guanidio de arginina. En la figura 9a son indicadas
las relaciones de concentración-respuesta para la
inhibición de la liberación de nitrito estimulado por A23187
células endoteliales aórticas bovinas (BAEC) por el
N,N-di-sustituido carente de
originalidad en la comparación con algunos derivados
mono-sustituidos. La producción de Nitrito es medida
como una indicación de síntesis de óxido nítrico ya que el óxido
nítrico se descompone espontáneamente a nitrito. La producción de
Nitrito por BAEC en un período de 2 horas fue determinada en un
medio libre de L-arginina sola o en presencia de
concentración de los análogos de arginina. Los puntos trazados
representan las medias \pm el error estándar del porciento de
inhibición de la producción de nitrito observado en 3 pozos
individuales de cultivo de BAEC. La marca sobre La figura 9a indica
que los grupos sustituidos sobre los nitrógenos del guanidio de
L-arginina. Me, Me- indica el análogo
di-sustituido evaluado; nótese que este compuesto es
aproximadamente igual a la potencia de
L-N^{G}-metilarginina.
La figura 9b compara la relación de concentración
vs. respuesta para el mismo juego que los análogos de arginina mono
y di-sustituido como en la figura 9a, más un
análogo dimetilo adicional con los dos grupos de metilo sobre los
nitrógenos de diferentes guanidio. La prueba es para la inhibición
de ACh inducida de vaso relajación en los anillos aórticos aislados
de conejo. Los puntos trazados representan las medias \pm error
estándar de las respuestas máximas para ACh observadas en presencia
de las concentraciones indicadas de los análogos (n = 4). Notar que
los análogo con dos grupos metilo sobre un nitrógeno de guanidio
(Me; Me') es un inhibidor activo mientras que el compuesto con un
grupo de metilo sobre cada uno de los nitrógenos de guanidio (Me,
Me') no es un buen inhibidor.
Fue encontrado que el L-NMA actúa
como un inhibidor reversible de arginina de NO/EDRF en
preparaciones vasculares a partir de una selección de especies que
incluyen cobaya, rata, conejo, perro y más notablemente humano (ver
figuras 10 y 11). La figura 10 indica la inhibición de la
relajación de ACh inducida por NMMA en arterias de varias depósitos
vasculares de especies y el cambio estero específico por
L-arginina. La arteria pulmonar de cobaya (GP PA),
aorta de rata y conejo (Ao), y coronaria de perro (CA) y arteria
femoral (FA) fueron contraídas con NE (1 \muM) y relajado con una
única concentración de ACh. La concentración de ACh: GP PA 1
\muM, rata Ao 0,3 \muM, conejo Ao 0,3, perro 0,1 \muM y de
perro Ca 0,3 \muM. La concentración de NMMA era 100 \muM menos
para la rata Ao el que fue de 5 \muM. Las concentraciones de
L-citrulina (L-cit),
D-arginina (D-arg) y
L-arginina (L-arg) son todas de 0,5
mM. Las barras son valores de media \pm SEM (n =
4-6).
La figura 11 contiene las trayectorias de
fisiografías representativas que describen la relajación inducida
de ACh de anillos constreñidos de NE preparados desde la aorta de
conejo (panel superior) y arteria mamaria interna humana (panel
inferior). En ambos tejidos, NMMA demuestra que atenúa la relajación
vascular de la ACh -inducida; la adición de
L-arginina en exceso restaura la relajación.
L-NMA también inhibe la
liberación de NO/EDRF de células endoteliales bovinas creciendo en
cultivo (La figura 12) y del corazón de cobaya aislado (La figura
13) cuando se someten a un vasodilatador de endotelios
dependiente.
La figura 12 ilustra la inhibición por NMMA de
ionofosforo de calcio estimulado por la liberación de nitrito de
las células endoteliales aórticas bovinas creciendo en un cultivo
de células. Las células que fueron estimuladas liberan NO por la
adición de 3 \mug/mL de ionofosforo (A23187) al medio de cultivo,
a solas, y en la presencia de varias concentraciones de NMMA. La
liberación acumulativa de nitrito (el producto de oxidación estable
de NO) durante una incubación de 4 hora a 37ºC es descrito como una
función de la concentración de NMMA. Los puntos son valores medios
\pm SEM (n = 3).
La figura 13 describe la inhibición por NMMA de
histamina induciendo la liberación de nitrito que inunda las
coronarias aisladas del corazón de cobaya y se restaura por
L-arginina. Los corazones fueron inundados a tensión
continua (40 cm H_{2}O) con búfer
Krebs-Henseleit que contiene al análogo
tromboxano A2 (U-46619, 86 nm) para inducir la
vasoconstricción coronaria. La Histamina que se determina fue
administrada como una inyección de bolo rápida en la aorta y atrapa
el nitrito liberado durante los 2,5 minutos siguientes. Las barras
representan valores de media \pm SEM (n = 4-6). Lo
que no es mostrado aquí es que la histamina produce un aumento
dependiente de las dosis al flujo coronaria (vasodilatación) que es
atenuado por L-NMA, pero restituido por la adición
de un exceso de L-arginina, Por lo tanto, parece que
la síntesis de NO mediada por L-arginina por lo
menos en parte la histamina induce vasodilatación en la arteria
coronaria, en el corazón de la cobaya.
La administración de L-NMA
(1-10 mg/kg, por vía intravenosa) pero no
D-NMA para una cobaya anestesiada produce un
aumento sostenido en BP diastólico debido a la inhibición de los
niveles de relajación en la síntesis de NO/EDRF (La figuras 14 y
15). Un movimiento similar pero más potente fue observado con
L-N^{G}-aminoarginina (figuras 16
y 17). Las figuras 15 y 16 describen el tiempo transcurrido con el
efecto de subida de tensión producido por NMMA (NMA; figura 15) y
L-N^{G}-amino arginina (NAA;
figura 16) en cobaya anestesiadas con fenobarbital. Los puntos son
los cambios de la media en la tensión arterial diastólica (\pm
SEM; n = 4-5). Control sistólico y BP diastólico
son 75 \pm 3 y 51 \pm 3 mm de Hg, respectivamente. De forma
semejante L-N^{G}-etilarginina
(L-NEA) fue evaluada in vivo y fue
encontrado también que causa un efecto sostenido de subida de la
tensión en cobayas.
Una línea de célula murina cancerígena, EMT6, se
ha visto que libera cantidades grandes de nitrito en el medio de
cultivo cuando se activa por ET bacteriana, varios IFN y
citoquinas. Por lo tanto, se prepararon preparaciones citosólicas
de EMT6 (es decir soluciones libre de células) y se caracterizó la
actividad de la enzima para formar NO y citrulina a partir de
arginina. Esta reacción requiere NADPH (figura 18 y 19) y otros
cofactores.
La figura 18 indica el comportamiento con el
tiempo t de la producción de nitrito a 37ºC por las preparaciones
citosólicas a partir de células de EMT6 que no fueron tratadas
(control) o estimuladas con IFN y endotoxinas. Las mezclas de
incubación fueron de 100 \mul del volumen total conteniendo: 40
\mul de citosol (sobrenadante 100,000 X g) 2 mM de
L-arginina, 2 mM de NADPH, 20 mM de TRIS (pH = 8,0)
y un "Cóctel" de inhibidores de proteasa. La síntesis de
Nitrito se observa con citosol preparado a partir de las células
estimuladas pero no a partir de las células control.
A partir de los estudios cinéticos fue deducida
una constante aparente Michaelis-Menten para
la utilización de L-arginina por la enzima. La
figura 20 es una relación de Lineweaver-Burke
para la síntesis de nitrito de L-arginina por
citosol a partir de células de EMT6 estimuladas. La velocidad de la
formación de nitrito fue evaluada en un intervalo de
concentraciones de L-arginina (ARG)
(0,03-2,0 mM) en condiciones similares a las que se
describieron para la figura 18, exceptuando las incubadas que
contenían 50 \muL de citosol en un volumen total de 80 \muL. Los
círculos abiertos y llenos representan los resultados obtenidos con
cada uno de las dos preparaciones de citosol. De estos resultados,
puede ser extrapolado el valor de Km de 61,6 \muM para la
utilización de ARG por la ruta de la enzima que forma NO. Los
análogos sustituidos por N^{G} de la arginina fueron
seleccionados para precisar la cuantificación de su capacidad de
inhibir la formación de NO dependiente de arginina por el sistema
de enzima de EMT6. Por lo tanto, de los datos como los presentados
en la figura 21, puede ser calculado NMMA, que es un inhibidor
competitivo de la utilización de arginina con una Ki evidente de
5-10 \muM. El compuesto sustituido como etilo es
aproximadamente 10 veces menos activos en este ensayo (figura
22).
Se llega a la conclusión que en estos estudios la
síntesis de NO a partir de L-arginina se demuestra
en una gran variedad de preparaciones in vitro, a partir de
un arreglo de especies. El NO es un mediador importante de la
vasodilatación in vivo y tiene un papel importante
probablemente en las homeostasis vasculares. Definitivamente, los
análogos sustituidos de N^{G} arginina pueden ser usados como
bloqueadores específicos de la ruta enzimática para la generación
de NO. Por lo tanto, esta clase de antagonistas de arginina puede
ofrecer el atenuante específico de la hipotensión y resultan en las
condiciones que causan el exceso en la generación de NO, tales como
los indicados en los Ejemplos 1 y 2.
El shock séptico, que es una complicación de
infecciones bacterianas con peligro de muerte, afecta a 150,000 a
300,000 pacientes anualmente en los Estados Unidos (Parrillo,
J.E., 1989, Septic Shock in Humans: Clinical
Evaluation, Pathogenesis, and Therapeutic Approach. In Textbook
of Critical Care, 2nd edition. Shoemaker, et al, editors,
Saunders Publishing Co. Philadelphia, PA, pp. 1006). El
colapso cardiovascular y trastornos mentales y metabólicos
múltiples relacionado con el shock séptico son atribuibles en gran
parte a ET bacterianas, que ha sido demostrado producen una
afección como shock séptico cuando se administra a animales
(Natanson, y col., 1989, Endotoxinas and Tumor
Necrosis Factor Challenges in Perros Simulate the Cardiovascular
Profile of Human Septic Shock. J. Exp. Med. 169: 823).
Es conocido que ET estimula la síntesis y liberación de algunas
citoquinas y mediadores biológicos que tienen actividad hipotensiva;
entre los factores que se liberan, el TNF, PAF, han sido propuestos
la prostaciclina y complemento obtenido de anafilatoxina C5a como
colaboradores importantes del colapso cardiovascular del shock
séptico (Hesse, et al., 1988, Cytokine Appearance
in Human Endotoxemia and Primate Bacteremia, Surg. Gynecol.
Obstet. 166:147; Etienne, et al, 1986,
The Relative Role of PAF-acether and Icosanoids
in Septic Shock, Pharmacol. Res. Commun. 18:71;
Halushka, et al., 1985, Elevated plasma
6-keto-prostaglandin F1 alpha in
Patients in Septic Shock, Crit. Care Med. 13:451; Smedegard,
et al.; 1989, Endotoxinas-induced
Shock in the Rat: A Role for C5a, Am. J.Pathol.
135:489). Aunque ha sido mostrado que animales pretratados
con anticuerpos anti-TNF (Beutler et al., Passive
immunization against cachectin/TNF protects mice from lethal
effects of ET, Science, 229:869); Receptor PAF
antagonistas (Casals-Stenzel, 1987,
Protective Effect of WEB 2086, a Novel Antagonist of Platelet
Activating Factor in Endotoxinas Shock, European J. Pharmacology
135:117) e inhibidores de síntesis de prostaciclina
(Wise, et al., 1985, Ibuprofen,
Methylprednisolone, and Gentamycin as Cojoint Therapy in Septic
Shock, Circ. Shock 17:59) son significativamente
protegidos contra el shock séptico, la importancia relativa de
estos mediadores en la patología del shock séptico son actualmente
inciertos. También hay pruebas de que algunos de estos mediadores
pueden actuar indirectamente vía la liberación de mediadores
secundarios. Por lo tanto, la conclusión de que los anticuerpos
anti-TNF tienen poco o ningún efecto protector
cuando se dan después de la exposición a los efectos de ET
(Beutler, et al., 1985, Passive immunization
against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal
effects of endotoxinas. Science, 229:869) sugiere que TNF
estimula la producción de otro factor que es el agente hipotensivo
actual; una vez iniciada, la síntesis y liberación de ese factor
pueden aparentemente continuar incluso en la ausencia de niveles de
TNF detectables.
Los presentes inventores han mostrado que el
nitrito se acumula cuando cultivamos las células endoteliales del
ratón y son expuestas a inmunomoduladores y a endotoxinas
(Kilbourn, et al., 1990, Endothelial cell
production of nitrogen oxides in response to interferon gamma in
combination with tumor necrosis factor,
interleukin-1, or endotoxin. J. Natl. Cancer
Inst. 82: 722). Este nitrito eleva el óxido nítrico (la
vía sintética de N es indicada por la observación que se acumula y
es dependiente de L-arginina y bloqueada por
N^{G} metil-L-arginina
(L-NMA), un inhibidor selectivo de NO sintetasa
(Hibbs, et al., 1988, Macrophage Cytotoxicity:
Role for L-Arginine Deiminase and imino Nitrogen
Oxidation to Nitrite. Biochem. Biophys. Res. Commun.
157:87). Debido a que el NO es un convincente factor
relajante de endotelios (EDRF), estos estudios indicaron que la
sobreprotección de NO podría explicar los cambios cardiovasculares
relacionado con endotoxinas y con la administración de citoquinas.
Compatible con este punto de vista, los presentes inventores han
descubierto que la respuesta hipotensiva producida por TNF en perros
puede ser revocada totalmente por la administración de
L-NMA (Kilbourn, et al., 1990,
N^{G}-methyl-L-arginine
inhibits tumor necrosis factor induced hypotension: implications
for the involvement of nitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci.,
U.S.A. 87:3629). En el presente estudio fue examinado el
efecto de L-NMA al inducir el shock sobre la
endotoxinas en perros. Las conclusiones actuales indican que NO es
un mediador importante de hipotensión inducida por endotoxinas e
inhibe síntesis de NO que debe ser de valor en el tratamiento del
shock séptico.
Reactivos:
N^{G}-metil-L-arginina
fue sintetizado como previamente fue descrito (Corbin, et
al., 1974, N^{G}-Methylated
Arginines: Convenient Preparation of
N^{G}-Methylarginines. Anal. Biochem.
57, 310-312) y purificado por cristalización
como una sal de monoflavianato. Una solución del aminoácido libre
fue obtenida por agitación de una suspensión de la sal con
Dowex-1 (OH); después de la neutralización con HCl,
la concentración de L-NMA fue determinada por
análisis de aminoácidos usando la sal cristalina de monoflavianato
como estándar. Endotoxinas (Escherichia coli; B0128:B12) y
todos otros reactivos fueron comprados Sigma Chemical Company, St.
Louis, Missouri. La nitroglicerina fue comprada por DuPont
Pharmaceuticals, Wilmington, D.E.
Animales: Los estudios fueron llevados a
cabo en 12 perros mongrel condicionados (9 machos y 3 hembras)
pesando 22-32 kg (promedio = 25,3 kg). El cuidado
de los animal se realizó según las recomendaciones de la American
Association for Accreditation of Laboratory Animal Care, y se
encuentran todos los patrones prescritos por la guía para el
cuidado y uso de animales de laboratorios (Guía para el cuidado y
uso de Animales de Laboratorios (1978), Departamento de Salud,
Educación y Seguridad Social, Washington, D.C. (Publ. No.
78-23). Los protocolos de animales fueron aprobados
por el Comité del Cuidado de Animales de la Universidad de Texas.
Los perros fueron ayunados toda la noche antes del día de la
experimentación. Fueron anestesiados con pentobarbital de sodio (25
mg/kg.l.v.). Los perros luego son entubados vía endotraquea y
ventilado con un respirador manejado por pistón (Harvard
Instruments) usando el aire de la habitación a un volumen de
flujo de 20 ml/kg de peso y a una velocidad de 10 a 12 respiraciones
por minuto, ajustado para conseguir un pH y pCO_{2} arterial
normal (analizador de Gas pH/sangre IL1302 de Instruments
Laboratories). Los catéteres fueron puestos percutaneamente en
el femoral y las arterias pulmonares; en el último, fue usado un
catéter de dilatación térmica a flujo directo (Abbott Critical
Care System).
Las mediciones fisiológicas: SAP promedio y
frecuencia cardiaca fueron monitoreados (Parametron 7048 Monitoring
System, Roche) y se grababan en un disco magnético que usa un
convertidor analógico digital (Scientific Solution, Inc.). La
salida cardiaca (CO) fue determinada como la media de seis
mediciones por dilución térmica. La resistencia sistémica vascular
se calcula como (SAP X80)/CO y se expresa como
Dina-seg./cm^{2}.
Protocolo: Después que la tensión
sanguínea y la frecuencia cardiaca se estabilizan, las endotoxinas
(40 ug/kg, en 10 mL de búfer salino de fosfato (PBS), pH 7,4) es
infundido por unos 2 minutos. Esta dosis de endotoxinas produce un
colapso cardiovascular grave y a menudo letal típicamente en el
perro. La tensión sanguínea fue monitoreada, y cuando el SAP cayó
por debajo de 60 mm Hg o un nadir estable en tensión arterial
sistémica (SAP), fue mantenido durante 10 minutos, fue administrada
(L-NMA 20 mg/kg en 5 ml de PBS sobre 1 min.). En la
mayoría de los experimentos, fue administrada
L-arginina (400 mg/kg en 20 mL PBS) durante diez
minuto, después adicionalmente por inyección durante unos 2
minutos. En los experimentos de control, los perros sin una
exposición previa a endotoxinas recibieron solo
L-NMA. Para simular la hipotensión observada en
perros que recibían endotoxinas; un grupo de perros recibió
ininterrumpidamente una inyección de nitroglicerina (2 mg/mL) en una
proporción ajustada para mantener el SAP entre
60-70 mm Hg. Los perros tratados con nitroglicerina
recibieron L-NMA (20 mg/kg) y después de 20 minutos
fue administrada la L-arginina (400 mg/mL).
Estadística: La trascendencia estadística
fue valorada usando la prueba de Student, sea un análisis simple o
por duplicado como fuera apropiado para las comparaciones.
La búsqueda de una tensión sanguínea
representativa que describa el efecto de endotoxinas sobre la
tensión arterial sistémica en el perro anestesiado se muestra en la
figura 23. Los parámetros cardiovasculares para estos y 3 perros
adicionales son resumidos en Tabla 1 (Estudio 1).
| Efectos hemodinámicos de L-NMA durante la Hipotensión | ||||
| Tipo de Evaluación | Tensión Arterial | Frecuencia | Gasto cardíaco | Resistencia |
| sistémica (mHg) | cardíaca | (L/min) | vascular | |
| (pulsaciones/min) | (dinas-seg/cm^{5}) | sistémica | ||
| Estudio 1: Tratados con endotoxinas (n=4) | ||||
| Línea Base | 128,3 \pm 9,4 | 119,5 \pm 6,0 | 2,99 \pm 0,32 | 3564 \pm 454 |
| Después | 59,5 \pm 3,1** | 124,0 \pm 7,6 | 2,17 \pm 0,44 | 2403 \pm 352 |
| Endotoxina | 107,3 \pm 9,6** | 123,3 \pm 4,8 | 2,03 \pm 0,32 | 4462 \pm 552* |
| Después L-NMA | 52,7 \pm 8,8** | 116,7 \pm 18,8 | 2,31 \pm 0,43 | 1851 \pm 171* |
| Después L-Arginina | ||||
| Estudio 2: Tratados con Nitroglicerina (n=3) | ||||
| Línea base | 128,3 \pm 10,2 | 143,7 \pm 12,1 | 3,14 \pm 0,21 | 3294 \pm 74 |
| Durante | 64,7 \pm 2,7** | 137,3 \pm 5,0 | 2,72 \pm 0,27 | 1924 \pm 132** |
| Nitroglicerina | 81,8 \pm 3,5* | 191,7 \pm 35,0 | 3,85 \pm 0,8 | 1851 \pm 399 |
| Después L-NMA | 56,9 \pm 13,0 | 148,7 \pm 19,9 | 5,15 \pm 1,08 | 1088,2 \pm 491 |
Para el Estudio 1, los perros fueron
anestesiados, instrumentados, y registradas las mediciones
cardiovasculares de la línea base). Luego fue administrada
endotoxinas (40 ug/kg) y fueron monitoreados los parámetros
cardiovasculares. Cuando la tensión sanguínea llega a un nadir
estable o disminuye por debajo de 60 mm Hg (después de endotoxinas),
se administra L-NMA (20 mg/kg), y se determinan los
parámetros cardiovasculares otra vez (después de
L-NMA). Después de diez minutos adicionales,
L-arginina (400 mg/kg) se administran y las
mediciones cardiovasculares se determinan 2 minutos más tarde
(después de L-Arginina). Los resultados son
informados como la media \pm S.E., (n = 4). El estudio 2 fue
llevado a cabo de forma semejante, excepto que no se administran las
endotoxinas. En vez de esto, los perros reciben una infusión
continua de nitroglicerina (2 mg/mL) titulada para mantener SAP AT
65 MM hG, (n = 3). Los asteriscos muestran la diferencia estadística
significativa (*p< 0,001, **p < 0.005) desde la condición
inmediata procedente.
El ET (40 ug/kg) produce un decrecimiento notable
de la tensión sanguínea dentro de los 120 minutos (\DeltaSAP =
-69 \pm 16 mmHg, p < 0.05). Sin tratar, a esta dosis de
endotoxinas normalmente se provoca un colapso cardiovascular letal
al perro. La L-NMA invierte la hipotensión dentro de
los 1,5 minutos, incrementando SAP por 47,8 \pm 6,8 mm Hg (p<
0.01) y SVR por 2060 \pm 338 dinas-seg/cm^{5}
(p < 0.01); HR y CO permanecen iguales (Tabla 1). La
L-arginina invierte el efecto de la
L-NMA y restaura la hipotensión inducida por
endotoxinas, reduce tanto el SAP (p< 0.0.01) como SVR (p <
0.01) para valores similares de los observados antes de la
administración de L-NMA. Como se ilustra en la
figura 23, después de L-arginina, la tensión
sanguínea disminuyó a niveles más bajos que los observados antes de
la administración de L-NMA, sugiriendo que la
capacidad para sobreproducir NO progresó durante el período cuando
fue bloqueada la producción de NO por L-NMA (p =
NS). La figura 23 indica los cambios que ocurren en el transcurso
del tiempo en la media de tensión arterial sistémica (SAP) en un
perro anestesiado con pentobarbital y seguido de i.v. la
administración de endotoxinas (ET),
N^{G}-metil-L-arginina
(L-NMA), y L-arginina
(L-Arg). Los datos de éstos y experimentos
adicionales son resumidos en la Tabla 1 (de arriba).
En vista del uso clínico potencial de los
inhibidores de síntesis de NO en endotoxinas y shock la reversión a
largo plazo de la hipotensión. Fue descubierto que una simple dosis
i.v. de L-NMA (20 mg/kg) restituye la tensión
sanguínea normal durante 30-60 minutos. Si fuera
dada una dosis adicional de L-NMA (20 mg/kg) cuando
la tensión sanguínea empieza a disminuir otra vez, podría ser
mantenida la tensión sanguínea normal durante al menos 2 horas en el
perro tratado por endotoxinas. Los resultados de un estudio típico
son mostrados en la figura 24. El mantenimiento de la tensión
sanguínea normal continuará estando en función de
L-NMA incluso después de 2 horas a partir de que
L-arginina todavía podía restituir hipotensión
endotóxica en este momento (i.e., una disminución en la tensión
sanguínea < 45 mm Hg). La figura 24 indica los cambios en el
transcurso del tiempo en la media de la tensión arterial sistémica
(SAP) en un perro anestesiado con pentobarbital seguido de la
administración de endotoxina. Después de 53 minutos, la tensión
sanguínea disminuyó a 47 mm Hg (\DeltaSAP = -61 mm Hg). La
administración de L-NMA (20 mg/kg) da como
resultado un rápido cambio completo de la hipotensión grave
(aumenta 73 mm Hg en el SAP dentro de los 10 minutos). La tensión
sanguínea fue mantenida durante 48 minutos por la primera dosis de
L-NMA y luego empieza a descender. Una segunda
dosis de L-NMA restituyó la tensión sanguínea al
nivel equivalente a la primera dosis y mantuvo el SAP más que 100
mm Hg durante 2 horas. Demostrar que el potencial por hipotensión
permanece, fue invertido el efecto de L-NMA con un
exceso de L-arginina (400 mg/mL). Esto da como
resultado una disminución en la tensión sanguínea a 43 mm Hg
(\DeltaSAP = -77 mm de Hg).
Como se muestra en la Tabla 2, la
L-NMA solamente tenía un significativo pero
moderado efecto hipertenso en los perros control no tratados con
endotoxinas; la L-NMA incrementó el SAP en
solamente 24,8 \pm Hg 2,7 mm (p, 0,01) con un aumento asociado en
SVR (p, 0,01), y decrecimiento de la frecuencia cardiaca (HR) y el
gasto cardíaco (CO) que no llegaron a una significancia estadística.
La L-arginina (400 mg/kg) invirtió completamente
el efecto de la subida de tensión de L-NMA.
| Efectos hemodinámicos de L-NMA durante la Hipotensión | ||||
| Tensión Arterial | Frecuencia | Gasto cardíaco | Resistencia | |
| sistémica (mm Hg) | cardiaca | (L/min) | vascular | |
| (pulsaciones/min.) | (dinas-s/cm^{5}) | sistémica | ||
| Línea base | 129,3 \pm 10,9 | 121,0 \pm 17,9 | 3,54 \pm 0,68 | 3115 \pm 347 |
| después de L-NMA | 153,8 \pm11,4** | 82,5 \pm 6,1 | 2,12 \pm 0,26 | 5967 \pm 523 |
Los experimentos fueron descritos en la figura
23, excepto que las endotoxinas no fueron administradas. Los
resultados son informados como la media \pm S.E. (n=4). Los
asteriscos muestran diferencias significativas respecto a la línea
base, (*p, 0,005, **p, 0,001) L-NMA =N^{G}
monometil-L-arginina.
En una serie adicional de experimentos, la
tensión sanguínea fue reducida a 65 mm Hg por una continua infusión
de nitroglicerina, un agente hipotensivo que forma NO por
L-arginina y un mecanismo independiente de NO
sintetasa. La administración de L-NMA (20 mg/kg) a
estos perros dio como resultado un cambio solamente de 17,1 \pm
5,0 mm Hg sin una alteración significativa en HR, CO o SVR (Tabla
1, Estudio 2).
La patogénesis del colapso cardiovascular que
ocurre durante el shock séptico es pobremente comprendida. El
tratamiento actual incluye la administración de fluidos y el uso de
drogas que suben la tensión e incrementan la resistencia vascular
periférica y el gasto cardíaco. Muy recientemente han sido usados
agentes ligantes de endotoxinas incluyendo el Polimixin B
(Hanasawa, et al., 1989, New Approach to Endotoxic
and Septic Shock by Means of Polymyxin B Immobilized Fiber Surg.
Gynecol. Obstet. 168:232) y anticuerpos que neutralizan a TNF
(Tracey, et al., 1987,
Anti-cachectin /TNF monoclonal antibodies
prevent septic shock during lethal bacteremia, Nature
330: 662-664) en un intento de modificar la
secuela del shock séptico. Aunque las últimas aproximaciones
podrían tener valor profiláctico, no hay pruebas de que el shock
séptico pueda ser fácil o rápidamente revertido por el retiro de
endotoxinas o TNF. La terapia de pacientes ya en el shock séptico
requiere la intervención de pasos secundarios y terciarios en la
cascada de los eventos iniciados por endotoxinas. Porque el
desarrollo de la hipotensión y de otros cambios relacionados con el
shock séptico pueden depender de las interacciones complejas entre
citoquinas, eicosanoides, PAF, componentes de complementos
activados, y otros factores, no es sorprendente que algunas
intervenciones hayan sido encontradas ser por lo menos parcialmente
eficaz en algunos modelos. Los inhibidores de la síntesis de
prostaglandina y el antagonista de receptor de PAF son dos clases
muy importantes de compuestos que pueden tener un potencial
terapéutico (8-9). Aunque estos agentes parecen ser
efectivos, han sido evaluados principalmente en dosis muy grandes en
animales administrando dosis de endotoxinas (por ej., 1 a 40 mg/kg,
o aproximadamente 1000 veces mayores que la dosis usada aquí). El
inicio de la hipotensión ocurre dentro de pocos minutos en tales
animales y podrían no reflejar con exactitud los procesos mediados
por citoquinas característicos del shock séptico clínico. En el
presente estudio con endotoxinas y en el previo shock séptico
clínico con TNF (Kilbourn, et al. 1990,
N^{G}-methyl-L-arginine
inhibits tumor necrosis factor induced hypotension: Implications
for the Involvement of Nitric Oxide, Proc. Natl. Acad. Sci.,
U.S.A. 87:3629.), fueron administradas dosis de microgramos de
ET o TNF, y la respuesta hipotensiva ocurre después de una demora
de 30 a 90 minutos.
La demostración por los presentes inventores de
que los perros, a los que se administró TNF, presentan una
hipotensión grave, la cual puede ser invertida por administración
de L-NMA sugiriendo que el exceso de producción de
NO es un factor muy importante en el shock inducido de TNF
(Kilbourn, et. al. 1990,
N^{G}-methyl-L-arginine
inhibits tumor necrosis factor induced hypotension: implications
for the involvement of NO, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.
87:3629). Los datos en la tabla 1 muestran que
L-NMA tiene un efecto
anti-hipotensivo rápido y fuerte en el perro
endotoxémico.
Los efectos de L-NMA sobre el
gasto cardíaco y SVR en los cuatro perros del control indicaban una
variación considerable. En dos perros el gasto cardíaco se reduce
(\Delta>1,5 L/min) y el SVR calculado aumenta dramáticamente
(\Delta>3500 dinas-seg./cm^{5}). Por el
contrario, no fueron vistos cambios importantes en el gasto
cardíaco después de la administración de L-NMA en
cualquiera de los perros tratados por ET o en los otros dos perros
del control; en los últimos, el SVR aumentó en solamente alrededor
de 1400 dinas-seg./cm^{5}. Aunque estos
resultados indican la posibilidad de que L-NMA
podría tener un efecto directo sobre el gasto cardíaco en las
condiciones de control se requieren estudios adicionales. Es
probable que la activación del mecanismo de reflejo del
baroreceptor arterial (Lodato, Control of Cardiac Output, In:
Dantzer, D.R. (ed. Cardiopulmonary Critical Care, el W.B. Saunders,
Philadelphia, PA) (en prensa), cuente con el decrecimiento inducido
de L-NMA en condiciones de control en HR y CO. A
favor de este punto de vista, fue observado que los perros del
control a los que se administró fenilefrina en una dosis que elevó
el SAP a un nivel similar al producido por la L-NMA
sola, muestran también decrecimientos similares de HR y CO. La
falta del efecto de L-NMA sobre HR ó CO en perros
hipotensivos puede ser porque el nivel de hipotensión estaba por
debajo del alcance del baroreceptor y la sensibilidad de reflejo
(Lodato, Control of Cardiac Output, In: Dantzer, D.R. (ed.
Cardiopulmonary Critical Care, el W.B. Saunders, Philadelphia, PA)
(en prensa).)
A la vista de los múltiples mediadores informados
que contribuyen al shock séptico, existía la expectativa que
incluso la inhibición completa de formación de NO no se podría
revertir completamente la hipotensión del shock inducido por ET.
Efectivamente, que la tensión sanguínea no fuese restaurada a los
valores de pretratamiento de 20 mg/kg, sugieren que otros
mediadores de L-NMA aparte del NO contribuyen
modestamente a la hipotensión en el perro endotoxémico. La
posibilidad de que la síntesis de NO se inhiba por las dosis
administradas de L-NMA proporciona una explicación
alternativa para la falla total de restaurar la tensión sanguínea a
los niveles de pre-tratamiento. Aunque la
determinación directa de la extensión de la inhibición de síntesis
de NO no sea posible in vivo, los estudios de respuesta a
las dosis limitantes indican que una dosis de L-NMA
mayor que 20 mg/kg no tiene un efecto significativamente mayor de
subida de tensión. El bloqueo de la pérdida de la hipotensión
inducida por ET en 20 mg/kg de L-NMA podría ser
atribuible a otros mediadores aparte de NO. Mientras pueda ser la
inhibición a largo plazo por L-NMA puede ser auto
limitada por conversión a L-Arginina (Salvemini,
et al., 1990, Immediate Release of a Nitric
Oxide-Like Factor from Bovine Aortic Endothelial
Cells by Escherichia coli Lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad.
Sci. 87:2593) tal metabolismo no se espera que disminuya
a corto plazo el efecto de subida de tensión de
L-NMA, el que se muestra en la figura 23. Sin
embargo, la conclusión de que L-NMA restituye la
tensión sanguínea a la normalidad o cerca de valores normales,
indica que el exceso de producción de NO es el principal, y quizás
la más importante causa de hipotensión en el shock endotóxico.
En un experimento, de una inyección única de
L-NMA (20 mg/kg) podría ser capaz de anular la
hipotensión extraída por endotoxinas durante 30 a 60 minutos. Como
se muestra en la figura 24, la tensión normal podría ser mantenida
por lo menos durante 2 horas por una dosis siguiente de
L-NMA. El cambio completo a largo plazo de
hipotensión inducida por endotoxinas con L-NMA
demuestra la utilidad clínica potencial de este agente. En
conclusión, estos resultados indican que el inhibidor de síntesis
de NO debe ser de valor considerable en el tratamiento del shock
séptico.
La administración de ET para perros fue
evidentemente más tóxica y menos predecible que la administración
de TNF. En esta serie experimental, con dosis pequeñas de ET (1
\mug/kg), la tensión sanguínea disminuyó entre
60-90 minutos. Después de que fuese alcanzado el
nadir de la tensión sanguínea, fue administrada NMMA (5 mg/kg).
Dentro de los 1,5 minutos, la tensión sanguínea se incrementó 33
\pm 2,5 mm Hg. Este aumento en la tensión sanguínea fue invertida
por la administración siguiente de L-arginina (100
mg/kg) y la tensión sanguínea se observa caer precipitadamente por
debajo del nivel pre-NMMA. La administración de
NMMA a perros endotoxémicos dio como resultado un aumento
significativamente mayor en la tensión sanguínea cuando se compara
con animales sin tratar (33 mm Hg versus 12 mm Hg). Para demostrar
si el shock letal inducido por endotoxinas pueda ser invertido por
NMMA, el shock inducido por endotoxinas podría ser invertido con
NMMA, en perros endotoxémicos que habían recibido 100 \mug/mL de
endotoxinas cuando fueron tratados con 20 mg/kg de NMMA (La figura
23). Esto dio como resultado un aumento extraordinario de 65 mm en
la tensión sanguínea comparado con el aumento de 35 mm en un perro
normal sin tratar. Además, la tensión sanguínea podía ser mantenida
con una readministración de NMMA
(La figura 24).
(La figura 24).
A partir de que el NMMA bloquea específicamente
la síntesis de NO, estos comentarios indican un papel
inmunomodulador para NO en el shock inducido y en el shock séptico.
Debido a que el administración de L-arginina vence
la inhibición competitiva afectada por L-NMMA
suministrando un exceso del precursor requerido para la síntesis de
NO, este trabajo también indica un papel para la arginina en la
generación de la hipotensión relacionada con estos dos procesos. La
conversión completa de la hipotensión por NMMA parece ser selectiva
para TNF y la hipotensión inducida por ET a partir de la reducción
de la tensión sanguínea con nitroglicerina a un nivel similar de
hipotensión y no fue antagónica a la administración de NMMA. Esto
proporciona un soporte adicional para el papel de NO en estos
procesos desde hipotensión no fue antagónico por NMMA cuando se
induce por un agente que actúa una arginina de vía
independiente.
La respuesta del perro para TNF y ET es similar a
la observada en seres humanos. En los ensayos clínicos en los que
TNF fue administrado a pacientes de cáncer, la hipotensión es la
toxicidad a la dosis límite, la que restringe la dosis de TNF que
puede ser administrada. Como se observa en el paciente, el tiempo
de inicio y gravedad de la hipotensión es variable en el perro. La
administración de ET para el perro es relacionada con una de forma
hipotensión más grave e incontrolable que una inyección de
bolus de TNF. Esto puede ser debido a que TNF tiene una vida
corta en circulación (5 minutos), sin embargo, se produce por
fuentes endógenas continuamente después de la administración de ET.
Esto podría puede dar como resultado un aumento inductivo para
producir grandes cantidades de NO en respuesta a ET comparado con
TNF. Esta hipótesis es confirmada por el hecho de que a bajas dosis
de NMM inducido por
ET.
ET.
NMMA no inhibe in vitro la actividad
anti-tumoral de TNF e IL-2. La
bioactividad de TNF fue medida por la citotoxicidad hacia las
células L929 murina, in vitro. La adición de NMMA o
N^{G}-aminoarginina no modificó el efecto
citolítico de TNF hacia las células de tumores in vitro
(Tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
| Efectos de NMMA en la actividad citolítica de rh-TNF contra las células L 929 tratadas con Actinomicina | |
| [NMMA] (mM) | TNF Activity (Units/ml) |
| 0 | 594,5 |
| 0,125 | 536,9 |
| 0,250 | 538,2 |
| 0,500 | 562,4 |
| 0,750 | 404,7 |
| 1,0 | 415,7 |
Similarmente, NMMA no lo hace, ni luego de la
fase de proliferación (datos no están mostrados) o la fase lítica de
las células LAK humanas expuestas a IL-2, in
vitro (tabla 4)
\vskip1.000000\baselineskip
| Efectos de NMMA sobre IL-2 Mediada por Linfoquinas, Activadas y con Actividad celular | |
| [NMMA] (mM) | % Lisis de células objetivo* |
| 0 | 66,1 \pm 9,5 |
| 0,25 | 63,3 \pm 11,8 |
| 0,5 | 67,7 \pm 10,8 |
| 1,0 | 59,3 \pm 7,5 |
| 2,0 | 75,1 \pm 4,1 |
| % \begin{minipage}[t]{150mm} Lisis calculado a partir del % de liberación de la radiactividad de 51 celdas de meta de Raji de Cr-labeled menos el liberación espontánea. Células efectoras eran cultivos de linfocitos de sangre humanas durante 4 días en presencia de 40 U/mL de IL-2 (E:T = 80: 1).\end{minipage} | |
La aminoarginina es el inhibidor más potente de
producción medida por óxido nítrico thusfar. Debido a que NMMA es
metabolizada a citrulina que podía servir de un precursor
posteriormente para la biosíntesis de arginina, fueron probados
otros análogos de arginina en su habilidad para impedir la
producción de óxido nítrico (Tabla 5).
\newpage
| Comparación de los ED_{50%}* valores | Análogos |
| de arginina N^{G}-sustituidas | |
| Análogos | ED_{50%} |
| NMMA | 336,7 |
| Aminoarginina | 109,5 |
| Nitro-L-Arginina | 2115 |
| Nitro-D-Arginina | >4500 |
| Nitro-L-Arginina bencil éster | >1200 |
| Nitro-L-Arginina metil éster | 1826 |
| Nitro-D-Arginina metil éster | >4500 |
| * \begin{minipage}[t]{150mm} ED_{50%} + La dosis eficaz de la droga que inhibe el 50% de la producción de nitrito por células endoteliales murina expuestas a Interferon Gamma- (1000 U/mL) y TNF (500 U/mL) in vitro.\end{minipage} |
El derivado más potente evaluado fue
N^{G}-aminoarginina. La prueba siguiente in
vivo, muestra que la aminoarginina era más eficaz que NMMA en
invertir la hipotensión relacionada con la administración de TNF en
el perro (La figura 25).
El revertir el shock por ET (dosis letal) por
N^{G}-aminoarginina (NAA) durante 4 hora y 38
minutos fue demostrado usando dosis múltiples de aminoarginina
(NAA). La figura 26 describe el cambio de la tensión arterial
sistémica (SAP) versus tiempo (minuto). Una dosis letal de ET (2
mg/kg) fue infundida durante 60 minutos y se administró NAA a 97,
165, y 374 minutos para mantener la tensión sanguínea. El animal
sobrevivió durante 24 horas y luego fue hecho su autopsia ningún
cambio patológico fue observado en hígado, pulmones, corazón,
cerebro, intestino o riñón.
La figura 27 demuestra la capacidad de
N^{G}-aminoarginina de revertir la hipotensión
sistémica mediada por interleuquina-1. La
subsiguiente administración de L-arginina obviaba
este recambio.
La invención también incluye los siguientes
compuestos:
Una composición farmacéutica que comprende
N^{G}-metilarginina o
N^{G},N^{G}-dimetilarginina, para uso en el
tratamiento de un animal por hipotensión sistémica producida por
gamma-interferón, factor de necrosis tumoral,
interleuquina-1 o
interleuquina-2.
Una composición farmacéutica que comprende
N^{G}-metilarginina o
N^{G},N^{G}-dimetilarginina, para uso en la
profilaxis de un animal por hipotensión sistémica causado por la
producción de óxido nítrico producida por la terapia con
gamma-interferón, factor de necrosis tumoral,
interleuquina-1 o
interleuquina-2.
Una composición farmacéutica que comprende
N^{G}-metilarginina o
N^{G},N^{G}-dimetilarginina para uso en el
tratamiento de un animal con hipotensión sistémica inducida por la
exposición a endotoxinas.
Claims (19)
1. El inhibidor de formación de óxido nítrico a
partir de arginina para uso en seres humanos o medicina veterinaria,
en el que el inhibidor es una N^{G}-aminoarginina,
N^{G}-nitroarginina,
N^{G}-metilarginina,
N^{G}-etilarginina,
N^{G}-propilarginina,
N^{G}-butilarginina, o una
N^{G},N^{G}-arginina disustituida ó metiléster
de L-nitroarginina.
2. Un inhibidor según la reivindicación 1, el
cual es N^{G}-metilarginina.
3. Un inhibidor según la reivindicación 2, el
cual es
N^{G}-metil-L-arginina.
4. Un inhibidor según la reivindicación 1, el
cual es N^{G},N^{G}-dialquilarginina.
5. Un inhibidor según la reivindicación 4, el
cual es una N^{G},N^{G}-dialquilarginina que
tiene un sustituyente alquilo seleccionado entre metilo, etilo,
propilo y butilo.
6. Un inhibidor según la reivindicación 4 ó 5, el
cual es N^{G},N^{G}-dimetilarginina.
7. Uso de un inhibidor de formación de óxido
nítrico a partir de arginina para la fabricación de un medicamento
para la profilaxis o el tratamiento de la hipotensión sistémica.
8. El uso según la reivindicación 7, en el que la
hipotensión sistémica se induce por la producción de óxido
nítrico.
9. El uso según la reivindicación 7 o 8, en el
que el inhibidor es un antagonista de arginina.
10. El uso según la reivindicación 9, en el que
el antagonista de arginina es una arginina
N^{G}-sustituida o una arginina
N^{G}N^{G}-disustituda.
11. El uso según la reivindicación 10, en el que
el antagonista de arginina es una arginina
N^{G}-sustituida o una arginina
N^{G}N^{G}-disustituda que tiene un grupo
sustituyente nitro, amino, alquilo, hidroxialquilo, carboxialquilo,
aminoalquilo o alquenilo reemplazando un hidrógeno por un grupo
amino guanidio.
12. El uso según la reivindicación 10 ó 11, en el
que el antagonista de arginina es una
N^{G}-aminoarginina,
N^{G}-nitroarginina, o un
N^{G}-alquilarginina como
N^{G}-metilarginina,
N^{G}-etilarginina,
N^{G}-propilarginina o
N^{G}-butilarginina.
13. El uso según la reivindicación 12, en el que
el antagonista de arginina es una
N^{G}-metilarginina.
14. El uso según la reivindicación 13, en el que
el antagonista de arginina es
N^{G}-metil-L-arginina.
15. El uso según la reivindicación 10 ó 11, en el
que el antagonista de arginina es una arginina
N^{G},N^{G}-disustituida.
16. El uso según la reivindicación 10 ó 11, en el
que el antagonista de arginina es una
N^{G},N^{G}-dialquilarginina.
17. El uso según la reivindicación 16, en el que
el antagonista de arginina es una
N^{G},N^{G}-dialquilarginina que tiene un
sustituyente alquilo seleccionado entre metilo, etilo propilo y
butilo.
18. El uso según la reivindicación 16 ó 17, en el
que el antagonista de arginina es
N^{G},N^{G}-dimetilarginina.
19. El uso según la reivindicación 9, en el que
el antagonista de arginina es metiléster de
L-nitroarginina.
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