DE69535307T2 - Guanylhydrazon zur Behandlung von Entzündungen - Google Patents

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Description

  • 1. EINFÜHRUNG
  • Diese Erfindung betrifft neue Verbindungen und Zusammensetzungen, die zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen, d.h. Prävention und Verbesserung von Kachexie, dem klinischen Syndrom von Mangelernährung und körperlicher Auszehrung, die mit Krebs und anderen chronischen Erkrankungen einhergeht, nützlich sind. Genauer gesagt, bezieht sich die Erfindung auf aromatische Guanylhydrazon-Verbindungen („Ghy", richtiger als Amidinohydrazon bezeichnet, d. h. NH2(CNH)-NH-N=) und ihre Verwendung zur Hemmung der Aufnahme von Arginin durch Makrophagen und/oder seine Umwandlung in Harnstoff. Diese Zusammensetzungen und Verbindungen sind auch nützlich, die Erzeugung von Stickoxid (NO) und die Sekretion von Zytokinen durch Makrophagen und andere Zelltypen zu verhindern, um somit eine NO-vermittelte Entzündung und andere Reaktionen bei anfälligen Personen zu verhindern. In einer anderen Ausführungsform können die Verbindungen zur Hemmung der Argininaufnahme bei argininabhängigen Tumoren und Infektionen verwendet werden.
  • 2. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Kachexie ist ein Syndrom, das durch den Schwund von Gewebemasse bei erkrankten Tieren gekennzeichnet ist, und manifestiert sich stark durch Gewichtsverlust des Wirts. Kachexie ist eine progressive und oftmals tödliche Komplikation, die bei vielen verschiedenen chronischen Erkrankungen auftritt, und ihre Folgen erfordern, dass die Therapieziele nicht nur auf die Bereitung der zugrundeliegenden Krankheit ausgerichtet werden sollten. Der Verlust an Proteinvorräten und Körpergewicht und ein allgemein mangelhafter Ernährungsstatus von kachetischen Patienten können unabhängige Quellen von Morbidität und Mortalität sein. Auch die mit der Kachexie einhergehenden Entkräftung ist eine signifikante Einschränkung der Fähigkeit des Patienten, aggressive, auf die primäre Atiologie abgerichtete medizinische Therapien und chirurgische Eingriffe zu tolerieren.
  • 2.1. DIE ANZEICHEN VON KACHEXIE SIND VON DEN DES VERHUNGERNS VERSCHIEDEN
  • Kachexie ist eine schwere, oftmals lebensbedrohliche Komplikation, die häufig in Verbindung mit verschiedenen Insulten auftritt: Krebs, Chemotherapie, Strahlentherapie, chronische Infektion, Trauma und operativen Stress. Eine unzureichende Nahrungsaufnahme zur Deckung des Gesamtenergiebedarfs des Wirts ist ein konstantes Element des kachetischen Syndroms. Zusätzlich zu dieser relativen Hypophagie, einem bestimmenden Merkmal der Kachexie, wird oft auch Anorexia angetroffen.
  • Die Studien zu diesem Syndrom zeigen jedoch, dass Kachexie nicht einfach durch eine unter dem Bedarf des Wirts liegende diätische Aufnahme von Protein und Kohlehydraten bedingt ist. Kachexie unterscheidet sich von unbelastetem Kalorienentzug dadurch, dass das Schwundmuster, das bei partiellem oder vollständigem Verhungern beoachtet wird, mit einem anfänglichen Ganzkörper-Lipidverlust bei gleichzeitiger relativer Erhaltung des Gewebeproteins verbunden ist. Im Gegensatz dazu ist Kachexie durch einen signifikanten Lipid- und Proteinverlust aus dem Gewebevorrat gekennzeichnet.
  • 2.2. DIE IMPLIKATIONEN DER UNTERSCHIEDE ZWISCHEN KACHEXIE UND VERHUNGERN
  • Die weitestgehend akzeptierte allgemeine Erklärung für Kachexie ist, dass die Proteine des Wirts im Gewebe aufgespalten werden, um eine Quelle für Aminosäuren bereitzustellen. Von diesen Aminosäuren wiederum nimmt man an, dass sie in der Leber zur Synthese von Glukose, Albumin und Abwehrproteinen des Wirts benötigt werden.
  • Diese weit akzeptierte Theorie legt nahe, dass Therapien, die auf eine Steigerung der Gesamtaufnahme von Kalorien und Proteinen abzielen, das kachetische Syndrom wesentlich verbessern. Die Kachexie selbst kann jedoch mit einer so drastischen Intervention wie einer totalen parenteralen Ernährung nicht wirksam behandelt werden. (Brennan, 1986 NEJM 305:375, Detsky, et al., 1987, ANN INTERN MED 107:195, McGeer, et al., 1989, ANN INTERN MED 110:734, Koretz, 1984, J CLIN ONCOL 2:534).
  • Zusätzlich zum Versagen der ergänzenden Ernährung als Therapiemodalität weist der fundamentale Unterschied im Muster der Lipid- und Proteinverluste zwischen Kachexie und Verhungern auch darauf hin, dass Kachexie weder das alleinige Ergebnis eines abnorm erhöhtem Ernährungsbedarfs aufgrund der Grunderkrankung noch das Ergebnis von Anorexia aufgrund einer durch die Krankheit verursachten Störung der physiologischen Appetitregulierung ist. Die Unterschiede weisen eher auf das Vorliegen fundamentaler Veränderungen im Stoffwechsel des Wirts hin, die direkt oder indirekt durch die Grunderkrankung bedingt sind.
  • Diese Schlussfolgerung wird weiterhin durch eine Anhäufung von Beweismaterial untermauert, die lösliche, vom Wirt produzierte regulatorische und Effektorproteine (bekannt als Zytokine) in die Kette von Ereignissen, die zu Kachexie führen, einfügen. Es wurden Versuche durchgeführt, in denen die Blutzirkulation eines normalen und eines kachetischen Tiers verbunden wurde. In diesen Versuchen mit sogenannten „parabiosierten" Tieren wurde beoachtet, dass sich bei dem ansonsten normalen Tier schnell eine Kachexie entwickelte, obwohl die zugrundeliegende Erkrankung vollständig beim ursprünglichen Wirt verbleibt. Diese und andere Beobachtungen weisen auf einen starken Zusammenhang mit zirkulierenden Vermittlern als proximale Ursache der Kachexie hin, d. h. dieser katabolische Zustand ist weder das passive Ergebnis eines übermäßigen, auf dem Wachstum der eindringenden Zellen oder Organismen beruhenden Stoffwechselbedarfs, noch das schlichte Ergebnis einer geringeren Nahrungsmittelaufnahme, die zur Deckung des Stoffwechselbedarfs nicht ausreicht.
  • Eine mögliche Identität dieser humoralen Faktoren war, dass die bei Kachexie produzierten löslichen Vermittler die gleichen Moleküle waren, wie sie bereits als wirtsimmune/entzündungsbedingte Moleküle (Zytokine) identifiziert wurden und für die nachgewiesen wurde, dass sie von Lymphozyten und Makrophagen sezerniert werden. Die Theorie, dass diese Zytokine an Kachexie beteiligt waren, wurde durch die Beobachtung bestätigt, dass die Verabreichung des exogenen Tumornekrosefaktors (auch Kachektin genannt und hier als „TNF" abgekürzt) im Tierversuch viele Merkmale der Kachexie imitierte. (Darling et al., 1990, CANCER RES 50:4008; Beutler & Cerami, 1988, ADV IMMUNOL 42:213). Des Weiteren sind Anti-TNF-Antiseren in der Lage, viele, wenn auch nicht alle, Anzeichen von Kachexie in experimentellen Tumorsystemen zu bessern. (Sherry, et al., 1989, FASEB J 3:1956; Langstein, et al., 1989, SURG FORUM 15:408).
  • 2.3. DIE BEDEUTUNG VON ZYTOKINEN BEI KACHEXIE AUF DIE SUCHE NACH THERAPIEN
  • Es dürfte klar sein, dass, selbst wenn alle Aspekte des kachetischen Syndroms auf ein einzelnes Zytokin oder alternativ auf die Aktivität einer Kombination mehrerer Zytokine, Hormone und anderer humoraler Faktoren zurückzuführen wäre, diese Kenntnis allein keinen Zell- oder biochemischen Mechanismus der metaholischen, der Kachexie zugrundeliegenden Veränderungen erklären und auch nicht direkt zu einer wirksamen Therapie (ihren würde. Letztendlich müssen Zytokine mit Zielzellen interagieren und metabolische oder phänotypische Veränderungen in den Zielen herbeiführen, um eine physiologische bzw. pathophysiologische Signifikanz zu haben. Daher ist die allgemeine Identifikation der Zytokinvermittlung sowie die spezifischen Implikationen bestimmter Zytokinvermittler nur Zwischenziele bei der Bestimmung, welche genauen Zell- und/oder systemischen Stoffwechselveränderungen auftreten müssen, um das umfassende kachetische Krankheitsbild herbeizuführen.
  • Die Ergebnisse, die Zytokine, die zusammen mit der breiten Konzentration auf Leber und periphere Muskeln als Hauptfaktoren der Stoffwechselveränderungen, als Vermittler der verschiedenen kachetischen Syndrome implizieren, haben viele veranlasst, die Auswirkungen bekannter Zytokinen auf Leber- und Muskelzellen zu beobachten und nach neuen Zytokinen zu suchen, die auf diese Gewebe einwirken. Bis dato wurde jedoch für keine der bekannten Zytokine (und zwar weder einzeln noch in Kombination) nachgewiesen, dass sie Aminosäuren aus Proteinvorräten in in-vitro-Systemen mit Zellen, die für diese vermuteten Orte eines Proteinabbaus in vivo typisch sind, direkt mobilisieren.
  • 2.4. STICKOXID ALS VERMITTLER DES ENDOTOXISCHEN SCHOCKS
  • Stickoxid (NO), ein Molekül, das enzymatisch durch Stickoxidsynthase (NOS) aus L-Arginin produziert wird, ist ein Vermittler von sowohl physiologischer Homeostase als auch entzündlicher Zytotoxizität. Moncada, S. & Higgs, A., 1993, THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE 329, 2001-2012; Nathan, C., 1992, FASEB J 6, 3051-3064. NO-Produktion, z.B. über die konstitutiven und induzierbaren Isoformen von NOS in Endothelzellen, verursacht Vasodilatation und regelt den Blutdruck und die Gewebeperfusion. Kilbosn, R. G., Jubran, A., Gross, S. S., et al., 1990, BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. 172,1132-1138. NO-Produktion durch eine induzierbare NOS in aktivierten Makrophagen überträgt andererseits zytotoxische, erhöht die vaskuläre Permeabilität und verbessert die Freisetzung von TNFα und IL-1. Ding, A. H., Nathan, C. F. & Stuehr, D. J. Immunol. 141, 2407-2412 (1988); Kubes, P. & Granger, D. N. Am. J. Physiol. 262, H611-H615 (1992); Van Dervort, A. L., Yan, L., Madara, P. J., et al. J Immunol. 152, 4102-4109 (1994); Bouskela, E. & Rubanyi, G. M. SHOCK 1,347-353 (1994); Hibbs, J. B., Taintor, R. R. & Vavrin, Z. Science 235, 473-476 (1987); Granger, D. L., Hibbs, J. B., Perfect, J. R. & Durack, D. T. J. Clin. Invest. 85, 264-273 (1990). Einsichtnahme in die verschiedenartigen biologischen Aktionen von NO wurde durch Verbindungen erleichtert, die mit NOS interferieren, um die Produktion von NO zu hemmen. Weil die NOS-Isoformen stark erhalten bleiben, konnte jedoch nicht nachgewiesen werden, dass die verfügbaren NOS-Hemmer signifikant zwischen den Aktivitäten von konstitutiver verglichen mit induzierbarer NOS unterscheiden.
  • Zuvor verfügbare NOS-Hemmer waren in der Verbesserung eines Überlebens von Endotoxämie nur beschränkt erfolgreich, zum Teil weil sie den endothelialen relaxierenden Faktor (EDRF; endothelial-derived relaxing factor) unterschiedlos supprimieren. Cobb, J. P., et al., 1992, J. EXP. MED. 176:1175-1182; Minnard, E. A., et al., 1994, ARCH SURG. 129:142-148; Billiar., T. R., 1990, et al., J LEUKOCYTE BIOL. 48:565-569. Die Suppression von EDRF bei Endotoxämie kann das Überleben durch Vasokonstriktion und vermindertem Blutfluss zu den entscheidenen Gefäßbetten beeinträchtigen. Bis jetzt sind keine Verbindungen bekannt, die durch Zytokin induzierbares Makrophagen-NO hemmen, ohne dass sie gleichzeitig auch endotheliales NO hemmen.
  • US-Patent 3 560 557 offenbart Diguanylhydrazone aus Diphenyl-Harnstoffen und das GB-Patent 923 398 offenbart Diphenyl-mono- und -bis-formyl-guanylhydrazone.
  • Korytnyk et al., 1978, J. Med. Kern. 21:507-513 offenbaren Analoga von 4,4'-Diacetyl-N,N'-diphenyl-bis-Harnstoff (Guanylhydrazon).
  • Mihich, E. and Mulhern, A.I., 1968, Cancer Research 28:354-362 offenbaren Diacetyl-diphenyl-bis-Harnstoff (Guanylhydrazon).
  • Das US-Patent 3 143 461 offenbart Diamidinodiphenyl-Harnstoffverbindungen.
  • Alle diese Dokumente beschreiben Verbindungen mit zwei identischen aromatischen Anteilen, wobei jeder Anteil durch ein einzelnes Guanylhydrazon substituiert wird, während in den Verbindungen der Erfindung mindestens ein Wasserstoffatom des Phenylrings durch ein Guanylhydrazonanteil ersetzt wird.
  • 3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verbindungen und deren Verwendung zur Behandlung von Kachexie durch die Hemmung der Harnstoffproduktion, genauer gesagt die Produktion von Harnstoff durch Makrophagen, und die Hemmung der Transportprozesse, die die Argininaufnahme, insbesondere durch Makrophagen, vermitteln. Die Verbindungen der Erfindung können auch verwendet werden, um den Schaden, der durch NO-vermittelte Reaktionen im Zusammenhang mit Schlaganfall, Schock, Entzündung und anderen NO-bedingten Zuständen induziert wird, einzuschränken oder zu verhindern. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung bezieht sich auf die Hemmung der Argininaufnahme bei der Behandlung von Tumoren oder Infektionen, wo die Tumorzellen, die infizierten Zellen oder der Infektionserreger Arginin erfordern. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Hemmung der schädlichen Sekretion von Zytokinen (z. B. Tumornekrosefaktor) durch aktivierte Makrophagen.
  • Die Klasse der Verbindungen, die für die Zwecke der Erfindung nützlich sind, umfasst insbesondere Aromaten, die mit mehreren Guanylhydrazon (Ghy)-Anteilen substituiert sind, wobei diese richtiger als Aminohydrazone bezeichnet werden. Die Synthese und Verwendung solcher Verbindungen wird beschrieben. Die Erfindung umfasst weiterhin Screening-Assays zum Testen weiterer Verbindungen auf die oben erwähnten Aktivitäten, und pharmazeutische Zusammensetzungen, die in der Anwendung dieser Therapiemethode nützlich sind.
  • Aufgrund der engen Beziehung zwischen Harnstoffproduktion und der physiologischen Synthese von Stickoxid können die Verbindungen dieser Erfindung auch bei der Einschränkung der Zellproduktion von NO, insbesondere durch Makrophagen, wirksam sein.
  • Obwohl die Erfindung nicht auf eine Theorie des Wie und Warum die hier beschriebenen und beanspruchten Therapien wirken beschränkt ist, basiert sie zum Teil auf dem durch die Patentanmelder im Folgenden entwickelten Kachexiemodell: Bei Kachexie dezimieren aktivierte Makrophagen den Stickstoffpool des Wirts, indem sie zirkulierendes Arginin in stickstoffhaltige Endprodukte umwandeln, die vom Körper eliminiert werden, so dass ein Proteinkatabolismus durch Muskel und/oder Leber und andere Organe erforderlich ist, um das verlorene Serumarginin zu ersetzen. Auf diese Weise schaffen aktivierte Makrophagen ein „Stickstoff-Ausgussbecken", das beständig Stickstoff aus dem systemischen Pool entfernt und somit den Körper zum Kompensieren zwingt, indem Gewebeproteine katabolisiert werden, um Aminosäuren als neue Stickstoffquellen freizusetzen. Das Modell basiert auf Versuche der Patentanmelder, die – obwohl sie einen von aktivierten Makrophagen freigesetzten Faktor identifizieren wollten, der die Produktion von Harnstoff durch andere Gewebe verursacht – ergaben, dass aktivierte Makrophagen durch Spaltung von Arginin selbst Harnstoff direkt synthetisieren.
  • Aktivierte Makrophagen spalten Arginin auf zweierlei Weise auf: (a) in Harnstoff und Ornithin oder (b) in Citrullin und Stickoxid (1). Der so erzeugte Harnstoff und das Stickoxid entfernen Stickstoff aus dem Ganzkörper-Stickstoffpool, da diese Metaboliten zur Wiederverwendung nicht effizient recycelt werden können. Daher dezimieren aktivierte Makrophagen bei Kachexie das Arginin im Plasma. Die Körpermechanismen zur Erhaltung von Argininhomeostase im Plasma erfordert dann den Katabolismus von Protein aus Muskel, Leber und anderen Organen, um Stickstoff- und Argininquellen freizusetzen. Die Entdeckung, dass Argininspaltung im aktivierten Makrophagen eine wahrscheinliche Ursache der Fehlmobilisierung von Gewebeproteinvorräten ist, ermöglicht die Entwicklung der hier beschriebenen Therapien – d.h. Störung der Argininaufnahme durch aktivierte Makrophagen und/oder die Produktion von Harnstoff aus Arginin, um den unaufhaltsamen Verlust von Harnstoff in das metabolische „Stickstoff-Ausgussbecken" zu hemmen und weiteren Katabolismus von Protein aus den Geweben zu inhibieren.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist, Verbindungen und deren Verwendungen bereitzustellen, um die Stickoxidproduktion durch Makrophagen zu hemmen, und damit die Einschränkung, bedingt durch die Abwesenheit eines makrophagen-spezifischen Hemmers von Stickoxidsynthetase, zu überwinden. Ohne die Theorie einzuschränken ist unsere Argumentation, dass man aus dem Bedarf der Argininaufnahme durch Makrophagen, nicht aber Endothelzellen, die zur NO-Produktion induziert werden, Nutzen ziehen kann. Es wurde festgestellt, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung die Produktion von NO durch Makrophagen hemmen, während sie keine hemmende Wirkung auf die Produktion von vasoaktivem (endothelialem) NO haben. Daher können die Verbindungen der Erfindung vorteilhaft verwendet werden, um den makrophagen-induzierten, NO-vermittelten Auswirkungen, die z. B. endotoxischen und septischen Schock begleiten, entgegen zu wirken.
  • Die vorstehenden Informationen wurden nur zu Illustrationszwecken und nicht zur Einschränkung präsentiert.
  • Obwohl die Erfingung mit dem Hintergrundwissen des Modells für die Physiologie von Kachexie entwickelt wurde, beinhaltet sie selbst die Verwendung von Argininanalogen, Arginomimetik und anderen Verbindungen mit einer nicht-metabolisierbaren Guanylhydrazongruppe (bzw. -gruppen) zur Hemmung der Harnstoffproduktion durch Makrophagen.
  • Eine allgemeine Klasse dieser Verbindungen sind Aromaten, die Guanylhydrazone enthalten. Diese Verbindungen können durch Reaktion von Acetylbenzolen und Benzaldehyden mit Aminoguadinin und Säure bei hohen Tempearturen in wässrigem Ethanol synthetisiert werden. (Ulrich, et al., 1982, DRUG DEVELOPMENT RESEARCH 2:219, und Ulrich & Cerami, 1984 MEDICINAL CHEMISTRY 27:35, die hiermit per Referenz einbezogen werden.) Die Erfindung wird dargestellt durch Arbeitsbeispiele, die die Synthese von gemäß der Erfindung verwendeten Verbindungen beschreiben (Abschnitt 6, unten), ein Whole-Cell-Assay zur Identifikation von Verbindungen, die die Harnstoffaufnahme hemmen (Abschnitt 7, unten), ein Whole-Cell-Assay zur Identifizierung von Verbindungen, die die Argininaufnahme hemmen (Abschnitt 8, unten), ein Arginase-Hemmtest (Abschnitt 9, unten), die Darstellung der Wirksamkeit der Erfindung in einem Kachexie-Tiermodellsystem (Abschnitt 10, unten), die Darstellung der Wirksamkeit der Erfindung zur Reduktion von Entzündung im Tiermodell unter Verwendung von Carrageenan-induzierter Pfotenschwellung (Abschnitt 11, unten), die Darstellung der in vivo-Wirksamkeit der Erfindung zur Prävention von Lipopolysaccharid-induzierter Fatalität (Abschnitt 13, unten) ohne Blockierung der Wirksamkeit des endothelialen relaxierenden Faktors (Abschnitt 12, unten und der in-vitro-Wirksamkeit der Erfindung zur Verhinderung der Absonderung von Tumornekrosefaktor durch RAW 264.7-Zellen, die durch LPS und γ-Interferon stimuliert werden (Abschnitt 14, unten). Die Ergebnisse in Abschnitt 12-14 weisen auf eine Wirksamkeit bei der Prävention von Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit toxischem Schocksyndrom oder systemischem inflammatorischen Reaktionssyndrom hin. Weitere Beispiele zeigen die Wirksamkeit von Verbindung Nr. 14, die Schwere eines Infarkts zu reduzieren, der durch Verschluss der mittleren Hirnarterie einer Ratte induziert wurde, (Abschnitt 15, unten sowie das Wachstums eines experimentellen Neoplasmas in einem nackten Mausmodell zu reduzieren (Abschnitt 16, unten).
  • 4. KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • 1. Biochemie des Argininabbaus durch Entzündungszellen und „Substrate-Cycling" zwischen den Organen.
  • 2. Harnstoffproduktion durch residente Makrophagen.
  • 3. Harnstoffproduktion durch Makrophagen wird durch LPS und γ-Interferon stimuliert. Kontrolle -o-; IFNγ (25 U/ml) -•-; LPS (100 ng/ml) -♢-; IFNγ (25 U/ml) + LPS (100 ng/ml) -♦-.
  • 4. Dosis-Response-Beziehung der Wirkung von γ-Interferon und LPS auf RAW 264.7-Zellproduktion von Harnstoff bei Anwesenheit und Fehlen von komplementären Medikamenten. 4A. Verschiedene γ-Interferondosen mit und ohne 100 ng/ml LPS; 4B. Verschiedene Dosen LPS mit und ohne 25 U/ml γ-Interferon.
  • 5. Abhängigkeit der RAW 264.7-Harnstoffproduktion von extrazellulärem Arginin. Kontrolle -•-; IFNγ (25 U/ml) + LPS (100 ng/ml)
    Figure 00080001
    .
  • 6. Arginintransport. Aufnahme von Tetra-3H-Arginin durch RAW 264.7-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stimulation.
  • 7. Chemische Strukturen von exemplarischen Verbindungen der Erfindung. 7A. Nr. 1-7; 7B. Nr. 8-13; 7B. Nr. 14-20; 7D. Nr. 21-24; 7E. Nr. 25-27; 7F. Nr. 28-30; 7G. Nr. 31-33; 7H. Nr. 34-36; 7I Nr. 37-40; 7J. Nr. 41-43.
  • 8. Die Dosisabhängigkeit der Schutzwirkung von Verbindung Nr. 14 auf λ-Carrageenan-induzierte Pfotenschwellung bei der Maus.
  • 9. Vergleich der Wirkung auf Acetylcholin-induzierte Hypotonie von Verbindung Nr. 14 und des bekannten Stickoxidsynthasehemmers L-NG-Methylarginin.
  • 10. Wirkung von Verbindung Nr. 14 auf LPS-induzierte Mortalität.
  • 11. Wirkung von Verbindung Nr. 14 auf die Sekretion von TNF durch LPS/γ-Interferon-stimulierte RAW 264.7-Zellen.
  • 12. Western-Blot eines Mediums aus LPS/γ-IFN-stimulierten RAW 264.7-Zellen, das die TNF-Produktion durch Zellen, die mit 0, 1, 5 und 25 μM der Verbindung Nr. 14 behandelt wurden, aufzeigt.
  • 13. Vergleich der gemeinsamen Wirkung von Verbindung Nr. 14 und extrazellulärem Arginin auf die Produktion von NO und TNF durch LPS/γ-IFN-stimulierte RAW 264.7-Zellen. 13A. NO-Produktion: Kontrolle -•-; 1 μM Nr. 14
    Figure 00080002
    ; 5 μM Nr. 14
    Figure 00080003
    ; 25 μM No. 14
    Figure 00080004
    13B. TNF-Produktion: Kontrolle -•-; 5 μM Nr. 14
    Figure 00080005
    ; 25 μM Nr. 14,
    Figure 00080006
    ;
  • 14. Wirkung von Verbindung Nr. 14 auf die Produktion von Zytokinen durch LPS/γ-Interferon-stimulierte PBMC-Zellen. 14A. Tumornekrosefaktor; 14B. IL-6; 14C. Makrophagen-Entzündungsprotein-1α 14D. Makrophagen-Entzündungsprotein-1β.
  • 15. Wirkung von Verbindung Nr. 14 auf den Transport von Arginin in ruhenden, -•-, und stimulierten RAW 264.7-Zellen,
    Figure 00080007
    .
  • 16. Wirkung von Verbindung Nr. 14 auf NO-Ausgabe von RAW 264.7-Zellen, die 8 Stunden durch γ-IFN/LPS stimuliert wurden und 4 weitere Stunden Verbindung Nr. 14 ausgesetzt wurden.
  • 5. DETALLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verbindungen zur Behandlung von Kachexie durch die Hemmung der Harnstoffproduktion, genauer gesagt die Harnstoffproduktion durch Makrophagen. Die Verbindungen der Erfindung können auch angewendet werden, um den Schaden, der durch NO-vermittelte Reaktionen im Zusammenhang mit Schlaganfall, Schock, Entzündung und anderen NO-bedingten Zuständen induziert wird, einschränken oder verhüten. Zu diesem Zweck bezieht sich die Erfindung auf die Hemmung der Produktion von Harnstoff und NO durch Makrophagen, genauer gesagt auf die Hemmung der induzierten übermäßigen Harnstoffproduktion und die Hemmung der Transportprozesse, die die Argininaufnahme durch Makrophagen vermitteln. Die Erfindung umfasst weiterhin die Hemmung der schädlichen Sekretion von Zytokinen, z. B. des Tumornekrosefaktor (TNF). Eine alternative Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf die Hemmung der Argininaufnahme bei der Behandlung von Tumoren oder Infektionen, bei der die Tumorzellen oder der Infektionserreger Arginin erfordern.
  • Die Klasse der für die Erfindung nützlichen Verbindungen umfasst Aromaten, die mit mehreren Guanylhydrazonanteilen substituiert sind, wobei diese richtiger als Amidinohydrazone bezeichnet werden. Die Synthese und Verwendung solcher Verbindungen wird beschrieben. Die Erfindung umfasst weiterhin Screening-Assays zum Testen weiterer Verbindungen auf solche Aktivitäten, und pharmazeutische Zusammensetzungen, die in der Anwendung dieser Therapiemethode nützlich sind.
  • Ursprünglich waren unsere Studien auf die Entdeckung eines hypothetischen, von Makrophagen produzierten, löslichen Mediators ausgerichtet, der die Produktion von mehr Harnstoff durch kultivierte Hepatozyten verursachte. Genauer gesagt nahmen wir uns vor, einen Mediator zu finden, der von stimulierten oder aktivierten Makrophagen, wie sie beispielsweise bei vielen chronischen Erkrankungen im Zusammenhang mit Kachexie vorliegen, produziert wird.
  • Die während der apfänglichen Versuche zur Isolation eines Zytokins, das eine gesteigerte Hepatozyten-Harnstoffproduktion in vitro verursachte, durchgeführten Kontrollstudien führten zu der erfreulichen Entdeckung, dass die aktivierten Makrophagen selbst in beträchtlichen Mengen Harnstoff produzieren. Dass dies für in vivo-Bedingungen relevant war, wurde durch Versuche bestätigt, die eine gesteigerte Harnstoffproduktion durch Makrophagen, die aus durch einen transplantierten Tumor kachetisch gewordenen Mäusen isoliert wurden, aufzeigten (2). Diese Studien wurden weiterhin bestätigt durch den Nachweis, dass die murine Makrophagenlinie RAW 264.7 auf die Makrophagenaktivatoren LPS und γIFN mit gesteigerter Harnstoffproduktion reagiert, die von der extrazellulären Verfügbarkeit von Arginin abhängt (3-5). Diese Studien führten zum Test auf pharmakologische Aktivität, der weiter unten ausführlich beschrieben wird. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen wurden auf der Grundlage dieses Tests identifiziert und in Tiermodellen verwendet, die die Wirksamkeit der Erfindung aufzeigen (Abschnitte 10, 11, 12, 13, 15 und 16, unten).
  • Die vorstehenden Ergebnisse zeigen auf, dass die Sekretion von Zytokinen durch aktivierte Makrophagen nur ein Aspekt des kachetischen Prozesses ist. Wir entwickelten das folgende Modell und die folgende Hypothese, die nur zu Erläuterungszwecken und ohne Einschränkung der Erfindung auf einen spezifischen Mechanismus oder ein wissenschaftliches Modell präsentiert werden. Gleichermaßen wichtig in diesem Modell sind die direkten Stoffwechselprozesse von aktivierten Makrophagen. Die Daten weisen darauf hin, dass aktivierte Makrophagen bei Kachexie reichlich Harnstoff produzieren und sekretieren. Das Ausmaß des direkt auf Makrophagen zurückgezuführenden Stickstoffverlusts, kann aus experimentellen Kulturdaten geschätzt werden. Diese Studien zeigen, dass ein einziger aktivierter Makrophage ca. 50 pg Harnstoff/Tag produziert. Wenn man davon ausgeht, dass die Fraktion der aktivierten Makrophagen ca. 10% der Gesamtkörper-Immunzellenpopulation des Menschen beträgt, dann liegen insgesamt ca. 1011 aktivierte Makrophagen vor. Diese Population könnte dementsprechend den Verlust von ca. 5 g Stickstoff/Tag erklären, was umgerechnet ca. 30 g Protein/Tag entspricht. Dieses Ausmaß an Verlust stellt einen signifikanten Anteil des Gewichtsverlustes dar, der klinisch im Laufe der Zeit bei chronischer Kachexie beobachtet wird.
  • Gemäß der Erfindung kehrt die Hemmung der Harnstoffproduktion, insbesondere die von Makrophagen induzierte Harnstoffproduktion, den Prozess um. Der Zellmetabolismus der Makrophagen unterscheidet sich vom hepatischen Metabolismus hinsichtlich der Enzyme, die zur Vervollständigung des sogenannten „Harnstoffzyklus" verfügbar sind. In beiden Gewebearten ist der letzte Schritt der Harnstoffproduktion eine hydrolytische Spaltung durch das Enzym Arginase des Amidinanteils von Arginin in Omithin und Harnstoff (1). Ein hervorstehender Unterschied zwischen der Makrophagen- und der hepatischen Harnstoffproduktion ist, dass es Makrophagen erheblich an Mengen des Enzyms Ornithin-Transcarbamoylase mangelt, und sie daher das durch Arginase produzierte Omithin nicht effizient verwerten und auch Ammonium (NH4) nicht direkt zur Bildung von Harnstoff verwenden können, sondern von einer exogene Argininzuführung abhängig sind. Zweitens gibt es scheinbar zwei Arginaseenzyme, die beide die hydrolytische Freisetzung von Harnstoff katalysieren, wobei das eine besonders in Makrophagen und das andere typischerweise in Hepatozyten der Leber anzutreffen ist.
  • Diese Unterschiede zwischen Makrophagen- und hepatischer Harnstoffproduktion lassen zwei Schlusfolgerungen zu: Erstens dezimieren Makrophagen selektiv Arginin aus dem Plasma. Dieses zirkulierende Arginin muss letztendlich durch Proteinabbau in anderen Geweben ersetzt werden, weil die Umwandlung von Stickstoff in Harnstoff im wesentlich irreversibel ist, d.h. Harnstoff kann nicht weiter zur Wiederverwendung metabolisiert werden. Arginin selbst wird durch Glutamatsynthetase, Glutaminsynthetase und Carbamoylphosphatsynthetase aus α-Ketoglutarat und Ammonium synthetisiert. Zweitens ist es vielleicht möglich, da die Harnstoffproduktion der Makrophagen im Gegensatz zur hepatischen Harnstoffsynthese von der Argininaufnahme abhängt, den mit Kachexie verbundenen Stickstoffverlust selektiv zu blockieren, während die entsprechenden hepatischen Funktionen relativ ungestört bleiben.
  • Außerdem ist es möglicherweise von Vorteil, die Makrophagenform des Arginaseenzyms und nicht die Leberform spezifisch zu blockieren. Hier werden in-vitro-Tests beschrieben, um nachzuweisen, in welchem Ausmaß die Testverbindungen spezifisch jeden dieser Stoffwechselprozesse hemmen. Diese Tests verwenden die Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7. 20 Verbindungen, darunter 15 neue Verbindungen, wurden auf die Hemmung der Makrophagen-Harnstoffproduktion in einem RAW 264.7-Zelllinienassay getestet. Sechs der Verbindungen weisen ein IC50 von ca. 10 μM oder weniger auf, und fünf weitere Verbindungen wurden mit einem IC50 über 10 μM aber unter ca. 100 μM festgestellt (siehe Abschnitt 7.2).
  • Bekannte Wege, die Harnstoffproduktion durch Makrophagen zu hemmen, können die Verwendung rekombinanter DNA-Methoden umfassen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Zum Beispiel wird ein Vektor, der eine Antisense-Message exprimiert, die zum mRNA der Makrophagenform der Arginase komplementär ist, in die Makrophagen des kachetischen Wirts eingeführt. Alternativ könnte ein Ribozym, das für das mRNA der Makrophagenform der Arginase spezifisch ist, verwendet werden. Die spezifische Einführung von für beide geeignete Vektoren in Makrophagen wird durch die Verwendung von Liposom-Carrier erzielt.
  • Die vorliegende Erfindung kann zur Hemmung der Stickoxid (NO)-Produktion, insbesondere des Enzyms NO-Synthase, verwendet werden. NO wird von aktivierten Makrophagen sowie vaskulären Endothelzellen und anderen zellulären Quellen produziert. NO wurde als kausativer pathologischer Faktor mit einer Reihe von entzündlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht insbesondere bei Schockzuständen und ischämischer Nekrose (Infarkt) von Myokard und ZNS. NO-Synthase katalysiert die Oxidation von Arginin zu Citrullin mit begleitender Freisetzung von NO. Verbindungen, die die Argininaufnahme hemmen, sind daher effektive Suppressoren der NO-Synthaseaktivität auf Zellebene. Des Weiteren können Verbindungen der oben erwähnten Klassen spezifische Hemmer der NO-Synthase auf Molekularebene sein. Die hier gezeigten Daten zeigen auf, dass die gemäß der Erfindung verwendeten Verbindungen die NO-Produktion hemmen, ohne die EDRF-Aktivität zu hemmen.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann die Erfindung zur Behandlung von toxischem Schock, auch SIRS (systemic inflammatory response syndrome/systemisches Entzündungsreaktionssyndrom) genannt, verwendet werden. Die hier beschriebenen Daten zeigen, dass die Verbindungen der Erfindung auf zwei unabhängigen Wegen wirken, um die mit SIRS assoziierte Mortalität und Morbidität zu verhüten: (a) durch Verhindern der Argininaufnahme und dadurch Blockierung der NO-Synthese durch aktivierte Makrophagen, und (b) durch Blockierung der Sekretion von Zytokinen wie z. B. des Tumomekrosefaktors (TNF).
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Hemmung der Argininaufnahme zur Behandlung von Tumoren oder Infektionen verwendet werden, bei denen die Tumorzellen oder Infektionserreger Arginin erfordern. Tumore mit Argininbedarf sind insbesondere Tumore der Brust, Leber, Lunge und Gehirn. wohingegen Infektionserreger mit Argininbedarf insbesondere Pneumocystis carinii, Trypanosoma brucei, T congolgense und T evansi sind.
  • Beispiele für Hemmer, die gemäß der Erfindung verwendet werden könnten, sind insbesondere Argininanaloge; genauer gesagt eine Klasse von Arylenverbindungen, die mit [(Aminoiminomethyl)hydrazono]methyl-Anteilen und [2-(Aminoiminomethyl)hydrazono]ethyl-Anteilen substituiert sind (im Folgenden zusammen als „Guanylhydrazone" bezeichnet), und vorzugsweise Diphenyl-Verbindungen mit 2, 3 oder 4 Guanylhydrazon-Anteilen. Diese hemmenden Verbindungen haben ein oder mehrere nicht hydrolysierbare Analoge der Guanidingruppe des Arginins.
  • Von den in dieser Erfindung auf Aktivität untersuchten Guanylhydrazonverbindungen waren Verbindungen mit nur einem einzigen Guanylhydrazonanteil entweder inaktiv oder sie erforderten mM-Konzentrationen, um eine Reduktion von 50% der Harnstoffausgabe zu erzielen. Benzyl- und Diphenyl-Verbindungen mit 2, 3 oder 4 Guanylhydrazon-Anteilen waren in manchen Fällen mit weniger als 10 μM aktiv. In allen getesteten Fällen hemmten die hochaktiven Verbindungen nicht nur die Harnstoffproduktion, sondern auch den Transport von Arginin in die Zelle. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind mit Di-, Tri- und Tetra-Guanylhydrazon substituierte Phenylverbindungen mit zwei Phenylkernen, die durch ein Alkandiamid oder zwei durch ein Alkan verknüpfte Phenoxykerne verknüpft sind. Eine zweite bevorzugte Ausfürungsform sind Triacetylphenyl- order Triformylphnyltris-(guanylhydrazone). Beispiele solcher nützlicher, bereits bekannter Verbindungen umfassen Monoarylen-bisguanylhydrazon, z. B. 1,3-Diacetylpyridin-bis-(guanylhydrazon) (2), Ulrich, 1982, ein Monoarylen-tris-(guanylhydrazon), z. B. 1,3,5-Triacetylbenzol-tris-(guanylhydrazon) (1), Ulrich, 1984, und ein Bisarylen-bis-(guanylhydrazon), z. B. 4,4'-Diacetyldiphenyl-Harnstoffbis(guanylhydrazon) (8), Korytnyk, W. et al., J. MEDICINAL CHEMISTRY 21:507-13, 1978. Diese Verbindungen hemmen die Harnstoffproduktion der Makrophagen in vitro bei Konzentrationen zwischen ca. 10 μM und ca. 50 μM. Weitere neuartige Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen eine Hemmwirkung bei 5-mal niedrigeren Konzentrationen auf. Diese Verbindungen umfassen ein Bisarylen-tris-(guanylhydrazon), z. B. 3,5,4'-Triacetyldiphenyl-Harnstoff-tris-(guanylhydrazon) (7.9), ein Bisarylen-tetrakis (guanylhydrazon), z. B. N,N'-bis(3,5-Diacetylphenyl)-decan-diamid-tetrakis-(guanylhydrazon) (7.14) und 3,3'-(Ethylendioxy)dibenzaldehyd-bis-(guanylhydrazon) (7.16).
  • Weiterhin wurden im Rahmen der Erfindung tris-Arylen-guanylhydrazon-Verbindungen ins Auge gefasst, bei denen jede Arylengruppe 1 oder 2 Guanylhydrazonoalkyl-Substituenten hat. Diese Verbindungen können mit den hier dargelegten Verfahren synthetisiert werden.
  • 5.1. ASSAYS ZUR IDENTIFIKATION AKTIVER VERBINDUNGEN
  • Die folgenden Assays können verwendet werden, um Verbindungen, die in der Erfindung verwendet werden, zu identifizieren. Weiterhin können die Assays zur Bestimmung der IC50 (d. h. die Konzentration, die eine halb-maximale Hemmung der getesteten Parameter erzielt) für jede getestete Verbindung verwendet werden. Bei in-vivo-Verwendung sollte die Dosis einer jeden Verbindung so formuliert sein, dass ein Bereich von zirkulierenden Konzentrationen, die den in vitro gemessenen IC50 enthalten, erzielt wird.
  • Die Assays sind exemplarisch und nicht dafür gedacht, den Umfang des Verfahrens der Erfindung einzuschränken. Ein Fachmann wird erkennen, dass am Assaysystem Veränderungen vorgenommen werden können, um gleichwertige Assays, die das gleiche Ergebnis erzielen, zu entwickeln. In den hier beschriebenen Arbeitsbeispielen wurde die RAW 264.7-Zelllinie verwendet. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die RAW 264.7-Zelllinie beschränkt; diese könnte durch eine beliebige Makrophagenzelllinie oder durch aktivierte, nicht transformierte Makrophagen in einer Primärkultur ersetzt werden.
  • 5.1.1. GANZZELL-ASSAY FÜR HARNSTOFF- UND STICKOXIDPRODUKTION
  • Im Allgemeinen kann der Whole-Cell-Assay für Harnstoffproduktion wie folgt durchgeführt werden: Makrophagen oder Endothelzellen werden in Gegenwart von Testhemmern aktiviert (z. B. durch Verwendung von Faktoren, insbesondere γIFN und LPS, wie in den Beispielen unten beschrieben). Nach einer angemessenen Zeit in Kultur (z. B. ca. über Nacht bis zu 2 Tagen) wird der Kulturüberstand auf Anwesenheit von Harnstoff und Stickoxid analysiert. Die Produktion von Harnstoff und Stickoxid durch eine Zelllinie kann mit den gleichen kolorimetrischen Tests gemessen werden, die in klinischen Labors verwendet werden, um Serumkonzentrationen dieser gleichen Verbindungen zu bestimmen. Die Wirkungen der verschiedenen Inhibitorkonzentrationen können durch Vergleich mit dem Überstand der Kontrollkulturen, die nicht mit dem Testinhibitor behandelt wurden, bestimmt werden. Eine weitere Kontrolle zur Identifizierung der Toxizität bei jeder inhibitorischen Dosis kann mit aufgenommen werden. Ein Assay zur Freisetzung des intrazellulären Enzyms Laktatdehydrogenase, wie in den Beispielen unten beschrieben, oder eine gleichwertige Kontrolle kann zu diesem Zweck eingesetzt werden.
  • 5.1.2. WHOLE-CELL-ASSAY FüR ARGININAUFNAHME
  • Die Hemmung der Arginin-Transmembrankonzentrationsaktivität durch die Verbindungen der vorliegenden Erfindung wird mit trägerfreiem radiomarkierten Arginin gemessen. Zu diesem Zweck werden die Zellen kultiviert, um ihnen die Adhäsion (z. B. 2 Stunden bis über Nacht) und Aktivierung (z. B. durch Verwendung von Faktoren, insbesondere γIFN and LPS, wie in den Arbeitsbeispielen unten beschrieben) in Gegenwart des Testinhibitors zu ermöglichen. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird trägerfrei markiertes Arginin zur Kultur hinzugefügt. Nach einer kurzen Zeit (z. B. 5 Minuten) werden die Zellen mit einer Lösung, die nicht markiertes Arginin enthält, gewaschen, um jegliches radiomarkiertes Arginin, das nicht spezifisch an die Zellen der Kultur gebunden ist, zu verdrängen. Die Zellen werden dann lysiert und die Zelllysate auf Anwesenheit von radiomarkiertem Arginin analysiert. Die Wirkung der Testverbindungen wird durch Vergleich der Aufnahme von Radiomarkierung in behandelte Zellen gegenüber den nicht mit dem potentiellen Inhibitor behandelten Kontrollzellkulturen ermittelt.
  • In der hier im Arbeitsbeispiel beschriebenen Ausführungsform wurde eine Testpopulation von Zellen ca. 3 Stunden kultiviert, so dass die Zellen fest anhafteten. Verschiedene Konzentrationen der potentiellen Inhibitoren wurden dann Parallelkulturen hinzugegeben. Eine Stunde später wurden die Makrophagenstimulatoren (insbesondere z. B. LPS und γIFN) hinzugefügt. Achtzehn Stunden später wurden die Zellen in einem warmen, mit Glukose aufgestockten Mineralsalzmedium gewaschen. Dann wurde trägerfrei radiomarkiertes Arginin hinzugefügt. Nach 5 Minuten wurde die aktive Aufnahme von Arginin gestoppt, indem die Zellen dreimal mit einem auf 0°C abgekühlten Puffer, der 10 mM unmarkiertes Arginin enthielt, gewaschen würden, um alle extern gebundenen Markierungen zu verdrängen. Der Inhalt der gewaschenen Zellen wird in 100 μl Ameisensäure gelöst und mit den Standardtechniken gezählt.
  • 5.1.3. ZELLLYSAT-ASSAY FÜR ARGINASEAKTIVITÄT
  • Im Zelllysat-Assay für Arginaseaktivität wird ein Zelllysat einem Arginase-Aktivierungspuffer in in Gegenwart der Testverbindung ausgesetzt. Nach einer angemessenen Inkubationszeit wird Arginin hinzugefügt und die Enzymaktivität der Arginase z. B. durch Messung der Harnstoffkonzentration in der Probe bestimmt. Die inhibitorische Aktivität der Testverbindung wird bestimmt, indem die erhaltenen Ergebnisse mit Kontrollproben, die nicht der Testverbindung ausgesetzt wurden, verglichen werden. Wie in den Arbeitsbeispielen unten gezeigt, wird die direkte Arginasehemmung bestimmt, indem zuerst bei niedriger Geschwindigkeit ein Überstand eines Zelllysats mit einer Proteinkonzentration zwischen 0,5 und 4 mg/ml hergestellt wird. Der Überstand wird im Verhältnis von 1:4 mit einem MnCl2 enthaltenden Aktivierungspuffer gemischt, und Albumin und Aliquote werden mit verschiedenen Konzentrationen der potentiell inhibitorischen Verbindung inkubiert. Nach einer 20-minütigen Hitzeaktivierung bei 55°C wird die Lösung auf 0,25 M Arginin gebracht und 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Um Protein durch Zentrifugieren zu entfernen, wird TCA hinzugefügt, anschließend wird die Harnstoffkonzentration des Überstandes durch kolorimetrischen Assay auf der Grundlage von Diacetylmonoxim bestimmt.
  • 5.2. AKTIVE VERBINDUNGEN
  • Durch die Verwendung der oben erwähnten in-vitro-Bioassays wurden Verbindungen identifiziert, welche die Harnstoff- und Stickoxidproduktion und die Argininaufnahme inhibieren. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Abschnitt 7.2 zusammengefasst. Von den zwanzig (20) untersuchten Verbindungen sind sechs (6) bei Konzentrationen zwischen 1 und 10 μM wirksame Inhibitoren: Verbindungen Nr. 1, 9, 13, 14, 15, 16. Weitere sechs (6) Verbindungen waren bei Konzentrationen zwischen 10 und 100 μM wirksam: Die Verbindungen Nr. 2, 8, 11, 18 und 19. Die Verbindung, die als aktivste identifiziert wurde (Verbindung Nr. 14), wurde in vivo in Kachexie-Tiermodellen und bei NO-vermittelter Entzündung, endotoxin-induziertem Schock, Hirninfarkt und Neoplasie verwendet. In jedem dieser Modelle erwies sich Verbindung Nr. 14 als wirksam (Abschnitte 10, 11, 13, 15 und 16 unten).
  • 5.2.1. VERBINDUNGEN UND IHRE SYNTHESE
  • Im Folgenden gilt: GhyCH- = NH2(CNH)-NH-N=CH- und GhyCCH3- = NH2(CNH)-NH-N=CCH3-. Die Verbindungen der Erfindung umfassen die folgenden drei Hauptgattungen: Die erste besteht aus Verbindungen mit der Formel:
    Figure 00150001
    Wobei:
    X1 und X2 H- sind; und
    X'1 und X'2 unabhängig GhyCH- oder GhyCCH3- sind, wobei Ghy ein Guanylhydrazon-Anteil ist;
    Z -A-(CHZ)n-A- ist;
    n = 3-8; und
    A -NH(CO)-; -(CO)NH-; -NH(CO)NH-ist;
    oder
    Z -O-(CH2)2-O- ist
    und seine Salze;
  • Zur leichteren Synthese enthält eine bevorzugte Erscheinungsform Verbindungen, wobei A eine einzelne Funktionalität ist. Eine bevorzugte Erscheinungsform enthält Verbindungen mit derselben Formel, wobei
    X1 und X2- H- sind; und
    X'1 und X'2 GhyCCH3- sind, wobei Ghy ein Guanylhydrazon Anteil ist;
    Z -A-(CH2)n-A- ist;
    n 3-8 ist; und
    A -NH(CO)-; -(CO)NH-; -NH(CO)NH- ist;
    und seine Salze;
  • Ebenfalls eingeschlossen sind Verbindungen, wobei
    X1 und X2 H- sind; und
    X'1 und X'2 GhyCCH3- sind, wobei Ghy ein Guanylhydrazon Anteil ist; und
    Z -O-(CH2)2-O- ist;
    und seine Salze.
  • Die zweite Hauptgattung besteht aus Verbindungen mit der Formel:
    Figure 00170001
    wobei:
    X2 und X'2 H- sind;
    X1 und X'1 unabhängig GhyCH- oder GhyCCH3- sind, wobei Ghy ein Guanylhydrazon-Anteil ist;
    und
    n = 3-8 ist;
    und seine Salze;
  • Eine bevorzugte Erscheinungsform enthält Verbindungen mit derselben Formel, wobei
    X2 und X'2 H- sind;
    X1 und X'1 GhyCCH3- sind; und
    n 3-8 ist;
    und seine Salze.
  • Die dritte Hauptgattung besteht aus Verbindungen mit der Formel:
    Figure 00170002
    wobei:
    X2 und X'2 H- sind;
    X1 und X'1 unabhängig GhyCH- oder GhyCCH3- sind, wobei Ghy ein Guanylhydrazon-Anteil ist;
    und
    n 2-10 ist;
    und seine Salze.
  • Eine bevorzugte Erscheinungsform enthält Verbindungen mit derselben Formel, wobei
    X2 und X'2 H- sind;
    X1 und X'1 GhyCCH3- sind; und
    n 3-8 ist;
    und seine Salze.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können mit Hilfe von zwei fundamentalen Reaktionen synthetisiert werden. Der Fachmann wird erkennen, dass zahlreiche Varianten mit Hilfe dieser Reaktionen synthetisiert werden können, und dass diese Varianten gemeinsame Eigenschaften mit den hier offengelegten Verbindungen haben.
  • Reaktion 1 besteht aus der Reaktion eines substituierten Aromats mit einem primären oder sekundären Amin (z. B. 3,5-Diacetylanilin) und einem Dioyl-dichlorid (z. B. Glutaryl-dichlorid) in der das entsprechende N,N'-Diphenylalkan-diamid entsteht. Auch „umgekehrte" (reversed) Diamide können hergestellt werden. Acetyl- und Diacetylbenzoesäure kann durch Reaktion der entsprechenden substituierten Toluene und KMnO4 hergestellt werden. Die Säuren können dann mit Standardverfahren aktiviert und mit den entsprechenden α,ω-Alkandiaminen zur Reaktion gebracht werden, um die umgekehrten „Diamide" zu erhalten. Gemischte Forward- und Reversed-Diamide können mit Verfahren synthetisiert werden, die aus dem Bereich der Peptidsynthese gut bekannt sind. Daher kann eine N-t-Butyloxycarbonyl-aminosäure mit einem substituierten Anilin zur Reaktion gebracht werden, gefolgt von Entschützung und Reaktion der Aminogruppe mit einer aktivierten substituierten Benzoesäure. Wenn hier verwendet, umfasst das Symbol „-NH(CO)-" das -(CO)NH-Isomer, außer wenn anders angegeben.
  • Das Verfahren ist nicht auf Dioyldichloride beschränkt. Die Trichloridderivate von Trioylverbindungen können auf ähnliche Weise zur Synthese von Triphenyl-alkantriamiden verwendet werden. Geeignete dreibasige Säuren umfassen cyklische Säuren, z. B. 1,3,5-Cyclohexan-tricarbonsäure (Aldrich Chem. Co.), 1,3,5-Trimethyl,1,3,5-cyclohexantricarbonsäure (Kemp's dreibasige Säure, Kemp and Petrakis, 1981, J. Org. Chem 46:5140), 1,3,5-Benzintricarbonsäure (Aldrich Chem. Co.) und Linear-tricarbonsäuren wie z. B. 1,2,3-Propantricarbonsäure (Sigma Chem. Co.). Die identische Reaktion kann durchgeführt werden, in der Dioylchlorid durch Trichlormethyl-chlorformat ersetzt wird, um ein Diphenylharnstoff-Kondensationsprodukt zu erhalten. Eine Alternative zu Reaktion 1 kann durchgeführt werden, um ein 1,n-(n-Alkandioxy)-diarylen durch Reaktion des 1,n-Dibromalkans (z. B. 1.2-Dibromethan) mit einem Monohydroxylarylen (z. B. 3-Hydroxyacetophenon) zu erhalten.
  • Eine Methode umfasst die Verwendung von Triaminen in Form von H2N-(CH2)n-NH-(CH2)q-NH2, worin (n, q = 2-6), und der Form Y-((CH2)n-NH2)3, worin Y eines von N (n = 2-6), C(NO2) (n = 3), ein C-Alkan (n = 1), 1,3,5-Adamantantriyl (n = 3) oder 1,3,5-Benzintriyl (n = 1-3) sein kann.
  • In zwei weiteren Ausführungsformen der Erfindung wird ein Acetyl- oder Diacetylaryl-isocyanat mit einem Alkandiamin reagiert, oder alternativ ein Acetyl- oder Diacetylaryl-amin mit einem Alkandiyl-diisocyanat reagiert, um bis-ureido-Zwischenprodukte zu erhalten, die mit Aminoguanidin zur Reaktion gebracht werden können, um die Guanylhydrazon-Endprodukte zu ergeben. Die erforderlichen Isocyanate sind entweder im Handel erhältlich oder sie können aus den entsprechenden Aminen durch Reaktion mit Phosgen, Trichlormethyl-chlorformat, oder bis- (Trichlormethyl)-carbonat in Toluen oder Xylol bei einer höheren Temperatur synthetisiert werden.
  • Reaktion 2 besteht aus der Reaktion eines Anteils vom Typ Acetophenon oder Benzaldehyd und einem Aminoguanidin, um das Kondensationsprodukt zu erhalten, in dem ein Imino-gebundenes (N=C) Aminoguanidin den Keton- oder Carbonyl-Teil des Arylens ersetzt und somit ein Guanylhydrazon bildet, was durch die Freisetzung eines Wassermoleküls begleitet wird.
  • 5.22. PHARMAZEUTISCHE REZEPTUREN
  • Wegen ihrer pharmakologischen Eigenschaften können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung besonders als Wirkstoffe zur Behandlung von Patienten mit Kachexie, schädlichen NO-vermittelten Reaktionen, Infarkt, Tumoren oder Infektionen, die Arginin erfordern, verwendet werden. Eine solche Verbindung kann einem Patienten entweder allein oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen, wo sie mit geeigneten Arzneimittelträgern oder Hilfsstoff(en) gemischt werden, verabreicht werden.
  • Die Verwendung von phamazeutisch akzeptablen Trägern zur Formulierung der hier offengelegten Verbindungen für die Anwendung der Erfindung in Dosierungen, die zur systemischen Verabreichung geeignet sind, liegt im Rahmen der Erfindung. Mit der richtigen Auswahl des Trägers und geeigneter Herstellungspraxis können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, besonders die als Lösungen formulierten, parenteral (z. B. durch intravenöse Injektion) verabreicht werden. Die Verbindungen können einfach durch Einsatz von pharmazeutisch akzeptablen Trägern, die dem Stand der Technik gut bekannt sind, in Dosierungen formuliert werden, die für orale Verabreichung geeignet sind. Solche Träger ermöglichen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen als Tabletten, Pillen, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Syrupen, Breis, Suspensionen o. ä. zur oralen Einnahme eines zu behandelnden Patienten formuliert werden können.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Zusammensetzungen, in denen die aktiven Wirkstoffe in wirksamer Menge enthalten sind, um ihren beabsichtigten Zweck zu erfüllen. Die Bestimmung der wirksamen Mengen liegt im Rahmen der Fähigkeiten von Fachleuten, besonders angesichts der hier bereit gestellten detaillierten Offenlegung.
  • Außer den aktiven Wirkstoffen können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen auch geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger enthalten, die Hilfsstoffe und Bindemittel umfassen, die die Verarbeitung der aktiven Verbindungen in pharmazeutisch verwendbare Präparate erleichtern. Die zur oralen Verabreichung formulierten Präparate können in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln oder Lösungen sein.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auf eine Weise hergestellt werden, die an sich bekannt ist, z. B. durch herkömmliche Misch-, Auflösungs-, Granulier-, Drageeherstellungs-, Schwebe-, Emulgier-, Verkapselungs-, Einfang- oder Lyophilisierungsverfahren.
  • Die pharmazeutischen Formulierungen zur parenteralen Verabreichung umfassen wässrige Lösungen der aktiven Wirkstoffe in wasserlöslicher Form. Außerdem können Suspensionen der aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel umfassen Fettöle (z. B. Sesamöl) oder synthetische Fettsäureester (z. B. Ethyloleate oder Triglyceride) oder Liposome. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöht (z. B. Natriumcarboxymethyl-cellulose, Sorbitol oder Dextran). Die Suspension kann optional auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel enthalten, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöht, um die Herstellung hochkonzentrierter Lösungen zu ermöglichen.
  • Pharmazeutische Präparate zur oralen Einnahme können erhalten werden durch Kombination der aktiven Verbindungen mit festen Hilfsstuffen, optionaler Mahlung einer resultierenden Mischung und Verarbeitung der Mischung in Granulat, nachdem ggf. geeignete Hilfsstoffe hinzugefügt wurden, um Tabletten oder Drageekerne herzustellen. Geeignete Hilfsstoffe sind insbesondere Füllstoffe wie Zucker, einschließlich Laktose, Sukrose, Mannitol oder Sorbitol; Cellulosepräparate wie z. B. Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Auf Wunsch können auch zersetzende Mittel hinzugefügt werden, wie z. B. querverbundenes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon, wie zum Beispiel Natriumalginat.
  • Drageekerne werden mit geeigneten Überzügen versehen. Zu diesem Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die optional Gummiarabikum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Carbopol-Gel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelmischungen enthalten können. Farbstoffe oder Pigmente können den Tabletten- oder Drageebeschichtungen zur Identifizierung oder zur Kennzeichnung verschiedener Kombinationen der aktiven Verbindungsdosierungen hinzugefügt werden.
  • Pharmazeutische Präparate zur oralen Verwendung umfassen Push-fit-Kapseln aus Gelatine sowie weiche, versiegelte Kapseln, die aus Gelatine und einem Weichmacher wie z. B. Glycerol oder Sorbitol, bestehen. Die Push-fit-Kapseln können die aktiven Wirkstoffe als Zumischung mit Füllstoffen wie Laktose, Bindemitteln wie Stärken und/oder Gleitmittel wie zum Beispiel Talk oder Magnesiumstearat und optional Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten, wie z. B. Fettöle, Flüssigparaffin oder flüssige Polyethylenglykole aufgelöst oder suspendiert werden. Außerdem können Stabilisatoren hinzugefügt werden.
  • 5.3. VERWENDUNGEN DER VERBINDUNGEN
  • Für jede im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Verbindung ist die angemessene Dosis diejenige, die einen zirkulierenden Bereich von Konzentrationen erzielt, die die IC50 umfassen, als wirksam für diese Verbindung ermittelt wurde, wie hier in Tabelle I, II und III dokumentiert, oder wie es in der hier beschriebenen Weise bestimmt wurde. Wenn zum Beispiel die Verbindungen Nr. 1, 9, 13 oder 15 zur Behandlung von Kachexie, Entzündung, endotoxischem Schock oder septischem Schock, Infarkt oder Neoplasma, ohne Rücksicht auf die gewählte Formulierung, verwendet werden, dann sollte die verabreichte Menge ausreichend sein, um eine Serumkonzentration oder eine zirkulierende Plasmakonzentration zwischen ca. 5 μM and 100 μM zu erzielen. Wenn zum Beispiel die Verbindungen Nr. 14 zur Behandlung von Kachexie, Entzündung, endotoxischem Schock oder septischem Schock, Infarkt oder Neoplasma, ohne Rücksicht auf die gewählte Formulierung, verwendet wird, dann sollte die verabreichte Menge ausreichend sein, um eine Serumkonzentration oder eine zirkulierende Plasmakonzentration zwischen ca. 0,5 μM und 10 μM zu erzielen. Wie in den Arbeitsbeispielen gezeigt, sind eine tägliche parenterale Dosis der Verbindung Nr. 14 von ca. 0,4 mg/kg in der Kachexiebehandlung und eine einzige parenterale Dosis von 1,0 mg/kg zur Behandlung von LPS-induzierter Toxizität im Mausmodell wirksam. Fachleute werden erkennen, dass die für einen bestimmten Verabreichungsweg angemessene Dosis durch Anwendung der unter Fachleuten gut bekannten pharmakologischen Methoden ermittelt werden kann.
  • Wenn die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von chronischer Entzündung verwendet werden, sollte ein Dosisform durch Anwendung standardgemäßer pharmakologischer Techniken unter Verwendung der oben erwähnten Dosisbereiche als Ausgangspunkte bestimmt werden. Zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen kann eine einzelne größere Dosis in einer alternativen Ausführungsform verabreicht werden. Wie in den Arbeitsbeispielen gezeigt, hat sich eine einzige parenterale Dosis von 5,0 mg/kg der Verbindung Nr. 14 bei der Behandlung eines solchen akuten Ereignisses als wirksam erwiesen.
  • 6. BEISPIEL: SYNTHESE DER AKTIVEN VERBINDUNGEN
  • Dieser Abschnitt beschreibt im Detail die Synthese und Reinigung nützlicher Zwischenprodukte und der beispielhaften Verbindungen der vorliegenden Erfindung.
  • 6.1. SYNTHESE VON ZWISCHENPRODUKTEN
  • Im Folgenden versteht es sich, dass Amidinohydrazon und Guanylhydrazon und (Aminoiminomethyl)hydrazon- Synonyme sind.
  • Die folgenden Reaktionen werden zur Verknüpfung von substituierten Arylenverbindungen durch Alkanketten verschiedener Längen verwendet. Die Bindung kann ein Amid, ein Phenoxyalkan oder ein Harnstoff sein.
  • 6.1.1. N,N'-BIS-(3,5-DIACETYLPHENYL)-PENTANDIAMID
  • 3,5-Diacetylanilin (531 mg) in Dichlormethan (7 ml), das Pyridin (0,4 ml) enthielt, wurde mit 0,141 ml Glutaryldichlorid behandelt. Nach 1 Stunde ergab sich nach Filtrierung und Waschen mit Wasser 555 mg N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)pentandiamid, Schmelzpunkt 246-7°C.
  • Analog wurden die folgenden aus 3,5-Diacetylanilin und den entsprechenden Dioyldichloriden hergestellt:
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-butandiamid, Schmelzpunkt 293-6°C;
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-hexandiamid, Schmelzpunkt 269-70°C;
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-heptandiamid, Schmelzpunkt 200-3°C;
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-octandiamid, Schmelzpunkt 183-4°C;
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-nonandiamid, Schmelzpunkt 179-80°C;
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-decandiamid, Schmelzpunkt 196-9°C;
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-dodecandiamid, Schmelzpunkt 178-9°C;
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-(isophthalsäure-diamid), Schmelzpunkt 283-4°C.
  • Auch wurde analog N,N'-bis-(3-Acetylphenyl)-pentandiamid, Schmelzpunkt 174-5°C aus 3-Aminoacetophenon und Glutaryldichlorid hergestellt.
  • 6.1.2. N-(4-ACETYLPHENYL)-N'-(3,5-DIACETYLPHENYL)-HARNSTOFF
  • 4-Aminoacetophenon (1,35 g) in Toluen (20 ml) wurde mit Trichlormethyl-chlorformat (1,2 ml) behandelt. Die Mischung wurde unter Reflux 2 Stunden erhitzt. 3,5-Diacetylanilin (1,77 g) wurde hinzugefügt und die Mischung unter Reflux 1 Stunde erhitzt und dann 16 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Produkt wurde filtriert, mit Ethanol gewaschen und getrocknet und ergab 0,93 g N-(4-Acetylphenyl)-N'-(3,5-Diacetylphenyl)-Harnstoff, Schmelzpunkt 251-2°C.
  • 6.1.3. 1,2-BIS-(3-ACETYLPHENOXY)-ETHAN
  • 3-Hydroxyacetophenon (8,4 g) und 1,2-Dibromethan (5,07 g) wurden mit Kaliumhydroxyd (3,83 g) behandelt und unter Reflux unter Stickstoff 2 Tage erhitzt. Die Mischung wurde gekühlt, Wasser (200 ml) hinzugefügt und die Mischung 1 Stunde gerührt. Der Niederschlag wurde herausfiltriert, aus Isopropanol rekristallisiert und ergab 1,21 g 1,2-bis-(3-Acetylphenoxy)-ethan, Schmelzpunkt 120-1°C.
  • 6.1.4. 1,5-BIS-[([(3, 5-DIACETYLPHENYL)]AMINO-1-CARBONYLI-AMINO]-2-METHYLPENTAN
  • 1,5-Diisocyanato-2-methylpentan (0,18 ml) wurde zu einer Suspension von 3,5-Diacetylanilin (0,531 g) in Dichlormethan (7 ml), die katalytisches 4-Dimethylaminopyridin (10 mg) enthielt, hinzugefügt. Die Mischung wurde 2 Stunden refluxiert und über Nacht stehen gelassen. Filtrierung ergab weiße Kristalle, 0,30 g, Schmelzpunkt 124-130°C.
  • 6.1.5. TRIS-[2-([(3-ACETYLPHENYL)-AMINOI-CARBONYLAMINO)-ETHYL]AMIN
  • 3-Acetylphenyl-isocyanat (0,60 g) in Dichlormethan (10 ml) wurde mit tris-(2-Aminoethyl)-amin (0,146 g) reagiert. Es trat eine heftige Reaktion auf, die eine umfangreiche weiße Trübung ergab. Methanol wurde hinzugefügt und die Mischung rekonzentriert; es ergab ein kristallines Material, welches herausfiltriert wurde. Ertrag: 0,61 g, Schmelzpunktimp 193°C.
  • 6.1.6. 3,5-DIACETYLPHENYL-ISOCYANAT UND N,N'-BIS-(3,5-DIACETYLPHENYL)-HARNSTOFF
  • 3,5-Diacetylanilin (3,0 g, 16,9 mmol) wurde in Toluen (50 ml) unter Rühren in einem Eisbad suspendiert. Eine Lösung von bis-(Trichlormethyl)-carbonat (1,67 g, 5,9 mmol) in Toluen (10 ml) wurde hinzugefügt. Die Suspension wurde auf Raumtemperatur gebracht und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde dann unter Reflux 4 Stunden lang erhitzt, gekühlt und filtriert und ergab 1,1 g N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-Harnstoff, Schmelzpunkt dec 137-8°C (Gasentwicklung). Das Filtrat wurde verdampft und ergab 2,2 g 3,5-Diacetylphenyl-isocyanat als weißes Pulver, Schmelzpunkt 71°C.
  • 6.2. UMWANDLUNG VON ZWISCHENPRODUKTEN IN ENDPRODUKTE
  • Die folgenden Reaktionen sind Beispiele, die eine allgemeine Kondensationsreaktion illustrieren, in der das primäre Amin des Aminoguanidins den Sauerstoff eines Acetophenons, Benzaldehyds oder Ketons verdrängt, ein H2O herausbildet und das Guanylhydrazon bildet. Im Allgemeinen werden alle Reaktionen bei einer höheren Temperatur mit Säurekatalyse in wässrigem Alkohol ausgeführt. Die Produkte werden durch Kristallisierung nach Abkühlung und optionaler Hinzufügung von Waschbenzin oder Isopropanol wiedergewonnen. Die Reinigung wurde durch Rekristallisation durchgeführt.
  • Verbindung 4, 7A.4: 4-([(Aminoiminomethyl)-hydrazon]-methyl)-Zimtsäure-hydrochlorid:
    4-Formyl-zimtsäure (1,76 g) und Aminoguanidin-hydrochlorid (1,22 g) wurden 2 Stunden in 83%igem Ethanol (24 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 2,56 g 4-([(Aminoiminomethyl)-hydrazon]-methyl)-zimtsäure-hydrochlorid, Schmelzpunkt 285-8°C.
  • Verbindung 6, 7A.6: 2-([(1H-Imidazol-1-yl)-1,4-phenylen]-ethylidyn)-hydrazincarboximidamid-hydrochlorid:
    4-(1H-Imidazol-1-yl)-acetophenon (1,86 g) und Aminoguanidin-hydrochlorid (1,22 g) wurden 48 Stunden in 83%igem Ethanol (12 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 2,6 g 2-([(1H-Imidazol-1-yl)-1,4-phenylen]-ethylidyn)-hydrazincarboximidamid-hydrochlorid, Schmelzpunkt 275-6°C.
  • Verbindung 7, 7A.7: 2-[(3,4-Dihydroxyphenyl)-ethylidyn]-hydrazincarboximidamid-hydrochlorid:
    3,4-Dihydroxyacetophenon (3,04 g) und Aminoguanidin-hydrochlorid (2,44 g) wurden 4 Stunden in 75-%igem Ethanol (16 ml) unter Stickstoff erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 2,7 g 2-[(3,4-Dihydroxyphenyl)-ethylidyn]-hydrazincarboximidamid-hydrochlorid, Schmelzpunkt 242-5°C.
  • Verbindung 9, 7B.9:
    N-(4-Acetylphenyl)-N'-(3,5-diacetylphenyl)-Harnstoff-tris-(amidinohydrazon)-trihydrochlorid: N-(4-Acetylphenyl)-N'-(3,5-diacetylphenyl)-Harnstoff (0,676 g), Aminoguanidin-hydrochlorid (0,83 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,01 g) wurden 18 Stunden in 83-%igem Methanol (12 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 0,85 g N-(4-Acetylphenyl)-N'-(3,5-diacetylphenyl)-Harnstoff-tris-(amidinohydrazon)-trihydrochlorid, Schmelzpunkt 247-253°C dec.
  • Verbindung 10, 7B.10:
    5-(1-[2-(Aminoiminomethyl)-hydrazon]-ethyl)-salicylsäurehydrochlorid:
    5-Acetylsalicylsäure (3,6 g) und Aminoguanidin-hydrochlorid (2,4 g) wurden 2 Stunden in 80-%igem Ethanol (25 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 5,2 g rohes 5-(1-[2-(Aminoiminomethyl)-hydrazon]-ethyl)-salicylsäure-hydrochlorid. Davon wurden 0,58 g gereinigt durch Auflösen in wässigem NaOH (pH 12,5) und erneutes Ausfällen mit wässriger HCl (bis pH 2), ergab 0,45 g 5-(1-[2-(Aminoiminomethyl)-hydrazon]-ethyl)-salicylsäure-hydrochlorid, Schmelzpunkt 312-3°C (dec).
  • Verbindung 12, 7B.12: N,N'-bis-(3-Acetylphenyl)-pentandiamid-bis-(amidinohydrazon)-dihydrochlorid:
    N,N'-bis-(3-Acetylphenyl)-pentandiamid (3,66 g), Aminoguanidin-hydrochlorid (2,75 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,05 g) wurden 18 Stunden in Methanol (35 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 5,412 g N,N'-bis-(3-Acetylphenyl)-pentandiamid-bis-(amidinohydrazon)-dihydrochlorid, Schmelzpunkt 187-191°C.
  • Verbindung 13, 7B.13: N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-pentandiamidtetrakis-(amidinohydrazon)-tetrahydrochlorid:
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-pentandiamid (0,45 g), Aminoguanidin-hydrochlorid (0,55 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,01 g) wurden 18 Stunden in 91-%igem Ethanol (4,4 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 0,794 g N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-pentandiamid-tetrakis-(amidinohydrazon)-tetrahydrochlorid, Schmelzpunkt 299-301°C dec.
  • Verbindung 14, 7C.14:
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-decandiamidtetrakis-(amidinohydrazon)-tetrahydrochlorid:
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-decandiamid (0,65 g), Aminoguanidin-hydrochlorid (0,691 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,01 g) wurden 18 Stunden in 91-%igem Ethanol (5,5 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 0,87 g N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-decandiamid-tetrakis-(amidinohydrazon)-tetrahydrochlorid, Schmelzpunkt 323-4°C dec.
  • Verbindung 15, 7C.15:
    2,2'-[1,2-Ethandiyl-bis-(oxy-3,1-phenylenethylidyn)]-bis-hydrazincarboximidamiddihydrochlorid:
    1,2-bis-(3-Acetylphenoxy)-ethan (0,894 g), Aminoguanidin-hydrochlorid (0,83 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,01 g) wurden in wässr. 96-%igem Methanol (6,25 ml) 18 Stunden erhitzt. Abkühlung und Filtrieren ergab 1,378 g 2,2'-[1,2-ethan-diyl-bis-(oxy-3,1-phenylenethylidyn)]-bis-(hydrazin-carboximidamid)-dihydrochlorid, Schmelzpunkt 303-7°C.
  • Verbindung 16, 7C.16:
    3,3'-(Ethylendioxy)-dibenzaldehyd-bis-(amidinohydrazon)-dihydrochlorid:
    3,3'-(Ethylendioxy)-dibenzaldehyd (1,08 g) und Aminoguanidin-hydrochlorid (1,105 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,005 g) wurden 18 Stunden in 96-%igem Ethanol (6,25 ml) unter Stickstoff erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 1,428 g 3,3'-(Ethylendioxy)-dibenzaldehyd-bis-(amidinohydrazon)-dihydrochlorid, Schmelzpunkt 264-6°C.
  • Verbindung 17, 7C.17:
    4,4'-(Ethylendioxy)-di-m-anisaldehyd-bis-(amidinohydrazon)-dihydrochlorid:
    4,4'-(Ethylendioxy)-di-m-anisaldehyd (0,99 g), Aminoguanidin-hydrochlorid (0,829 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,01 g) wurden 16 Stunden in 95-%igem Methanol (10,5 ml) unter Stickstoff erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 1,52 g 4,4'-(Ethylendioxy)-di-m-anisaldehyd-bis-(amidinohydrazon)-dihydrochlorid, Schmelzpunkt 322-3°C dec.
  • Verbindung 18, 7C.18:
    3,3'-(Trimethylendioxy)-di-p-anisaldehyd-bis-(amidinohydrazon)-dihydrochlorid:
    3,3'-(Trimethylendioxy)-di-p-anisaldehyd (1,032 g), Aminoguanidin-hydrochlorid (0,829 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,02 g) wurden 16 Stunden in 95-%igem Methanol (10,5 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 1,372 g 3,3'-(Trimethylendioxy)-di-p-anisaldehyd-bis-(amidinohydrazon)-dihydrochlorid, Schmelzpunkt 233-5°C.
  • Verbindung 19, 7C.19: 1,4-bis-[2-(Aminoiminomethyl)-hydrazon]-cyclohexandihydrochlorid:
    1,4-Cyclohexandion (2,24 g), Aminoguanidin-bicarbonat (6,0 g) und konzentrierte Salzsäure (3,67 ml) wurden 5 Minuten in Wasser (50 ml) erhitzt. Die Lösung wurde abgekühlt und mit Isopropanol (50 ml) behandelt. Nach abgeschlossener Kristallisierung ergab die Filtration 2,91 g 1,4-bis-[2-(Aminoiminomethyl]-hydrazon]-cyclohexan-dihydrochlord, Schmelzpunkt 260°C dec.
  • Verbindung 20, 7C.20:
    2,2'-(1,4-Diphenyl-1,4-butandiyliden)-bis-hydrazincarboximidamid-dihydrochlorid:
    1,2-Dibenzoylethan (4,76 g), Aminoguanidin-bicarbonat (5,45 g) und konzentrierte Salzsäure (3,33 ml) wurden 24 Stunden in 50-%igem Ethanol (60 ml) erhitzt. Nach Abkühlung, Konzentration und Filtrieren ergab sich 4,3 g 2,2'-(1,4-Diphenyl-1,4-butandiyliden)-bis-(hydrazincarboximidamid)-dihydrochlorid, Schmelzpunkt 285-6°C.
  • 6.3. WEITERE BEISPIELHAFTE VERBINDUNGEN
  • Verbindung 21, 7D.21: N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-butandiamidtetrakis-(amidinohydrazon)-tetrahydrochlorid:
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-butandiamid (0,545 g), Aminoguanidin-hydrochlorid (0,69 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,01 g) wurden 18 Stunden in 91-%igem Ethanol (5,5 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 0,97 g N,N'-bis-(3,5-diacetylphenyl)-butandiamid-tetrakis-(amidinohydrazon)-tetrahydrochlorid, Schmelzpunkt 314°C.
  • Verbindung 22, 7D.22:
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-hexandiamid-tetrakis-(amidinohydrazon)-tetrahydrochlorid:
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-hexandiamid (0,58 g), Aminoguanidin-hydrochlorid (0,69 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,01 g) wurden 18 Stunden in 91-%igem Methoxyethanol (5,5 ml) erhitzt. Filtrieren in heißem Zustand ergab 0,936 g N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-hexandiamid-tetrakis-(amidinohydrazon)-tetrahydrochlorid, Schmelzpunkt (chars) 320-330°C.
  • Verbindung 23, 7D.23:
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-heptandiamidetetrakis-(amidinohydrazon)-tetrahydrochlorid:
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-heptandiamid (0,478 g), Aminoguanidin-hydrochlorid (0,553 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,01 g) wurden 18 Stunden in 91-%igem Ethanol (4,4 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 0,739 g N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-pentandiamid-tetrakis-(amidinohydrazon)-tetrahydrochlorid, Schmelzpunkt 273-7°C.
  • Verbindung 24, 7D.24:
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-(isophthalsäure-diamid)-tetrakis-(amidinohydrazon)-tetrahydrochlorid:
    N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-(isophthalsäure-diamid) (0,726 g) und Aminoguanidin-hydrochlorid (0,829 g) wurden 18 Stunden in 7:1 2-Methoxyethanol/Wasser (11,5 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 0,54 g N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-(isophthalsäure-diamid) tetrakis-(amidinohydrazon)-tetrahydrochlorid, (chars) Schmelzpunkt 322-330°C.
  • Verbindung 25, 7E.25: 3,3'-(Pentamethylendioxy)-di-p-anisaldehyd (0,748 g), Aminoguanidin-hydrochlorid (0,553 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,01 g) wurden 18 Stunden in Methanol (5 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 0,080 g 3,3'-(Pentamethylendioxy)-di-p-anisaldehyd-bis-(amidinohydrazon)-dihydrochlorid, Schmelzpunkt 195-8°C.
  • Verbindung 26, 7E.26: Eine Lösung aus 3,5-Diacetylanilin (0,885 g) und Tetrahydrofuran (10 ml) mit 0,45 ml Pyridin wurde mit 0,65 ml Benzoylchlorid behandelt. Die Mischung wurde 1 Stunden gerührt und dann mit 1 ml Wasser behandelt und 15 Minuten gerührt. Die Mischung wurde dann mit 40 ml Wasser verdünnt und 30 Minuten gerührt. Filtrieren und Waschen mit Wasser und Isopropanol ergaben farblose Nadeln N-Benzoyl-3,5-diacetylanilin, 1,36 g, Schmelzpunkt 188-189°C. Eine Suspension von N-Benzoyl-3,5-diacetylanilin (0,844 g) in wässr. 87,5-%igem Ethanol (8 ml) mit 0,73 g Aminoguanidin-hydrochlorid und einer Spur HCl wurde 18 Stunden unter Reflux erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 1,357 g N-Benzoyl-3,5-diacetylanilin-bis-(amidinohydrazon)-dihydrochlorid (Verbindung 26), Schmelzpunkt 268-72°C.
  • Verbindung 27, 7E.27: Eine Suspension 3,5-Diacetylanilin (0,531 g) in Wasser (8 ml) wurde mit Cyanamid (0,143 g) und konz. HCl (0,25 ml) behandelt und unter Reflux erhitzt. Weitere 0,080 g Teile Cyanamid wurden nach 2 und 4 Stunden hinzugefügt. Nach 6 Stunden wurde die Mischung im Vakuum konzentriert, bis das kristalline Material abgetrennt war, und dann filtriert, was 0,110 g eines kremfarbenen Feststoffs, Schmelzpunkt 120-2°C, ergab. Davon wurde 0,104 mit Aminoguanidin-hydrochlorid (0,112 g) in 2,5 ml wässrigem 80-%igem Ethanol, welches Aminoguanidin-Dihydrochlorid (0,01 g) enthielt, behandelt. Nach 18 Stunden [Erhitzung] unter Reflux ergaben sich nach Knäuelung und Filtrieren 133 mg (3,5-Diacetylphenyl)-guanidin-bis-(amidinohydrazon)-trihydrochlorid (Verbindung 27) als leicht kremfarber Feststoff, Schmelzpunkt 270-3°C.
  • Verbindung 28, 7F.28: Eine Suspension 3,5-Diacetylanilin (0,531 g) in Wasser (8 ml) wurde mit Cyanoguanidin (0,285 g) und konz. HCl (0,25 ml) behandelt und unter Reflux erhitzt. Nach 6 Stunden wurde die Mischung abgekühlt und konzentriert, es wurde 0,248 g eines kremfarbenen Feststoffs herausgefiltert, Schmelzpunkt 260-70 (dec). Davon wurde 0,238 g unter Reflux 24 Stunden mit Aminoguanidin-hydrochlorid (0,221 g) in 5.5 ml wässr. 91%-igem Methanol erhitzt. Nach Filtrieren ergab sich 0,290 g N-(3,5-Diacetylphenyl)-biguanid-bis-(amidinohydrazon)-trihydrochlorid (Verbindung 28) als feine weiße Nadeln, Schmelzpunkt 294-7°C.
  • Verbindung 31, 7G.31: 4-Acetylphenyl-isocyanat (1,2 g) und tris-(2-Aminoethyl)-amin (0,300 ml) in Methylenchlorid (10 ml) wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach Filtrieren ergab sich 1,35 g tris-(2-[([(4-Acetylphenyl)-amino]-carbonyl)-amino]-ethyl)-amin, Schmelzpunkt 189-90°C. Dieses Triketon (1,0 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,77 g) wurden 4 Stunden in Methanol (5 ml) erhitzt. Nach Hinzufügen von Ethanol (5 ml) und filtrieren ergab sich 1,08 g tris-(2-[([(4-Acetylphenyl)-amino]-carbonyl)-amino]-ethyl)-amin-tris-(amidinohydrazon)-trihydrochlorid (Verbindung 31) als das Dihydrat, Schmelzpunkt 224-5°C (dec).
  • Verbindung 32, 7G.32: 3'-Aminoacetophenon (0,446 g) und 1,3,5-Benzoltricarbonyltrichlorid (0,266 g) in Tetrahydrofuran (5 ml) wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt. Nach Filtrieren ergab sich 0,500 g N,N',N''-tris-(3-Acetylphenyl)-1,3,5-benzoltricarboxamid, Schmelzpunkt 270°C. Dieses Triketon (1,0 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,87 g) wurden 4 Stunden in 2-Methoxyethanol (5 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 1,4 g N,N',N''-tris-(3-Acetylphenyl)-1,3,5-benzoltricarboxamid-tris-(amidinohydrazon)-trihydrochlorid (Verbindung 32), solvatisiert mit einem Molekül 2-Methoxyethanol, Schmelzpunkt 270-5°C dec.
  • Verbindung 33, 7G.33, wurde analog aus 4'-Aminoacetophenon über das Triketon N,N',N''-tris-(4-Acetylphenyl)-1,3,5-benzoltricarboxamid, Schmelzpunkt 310°C, hergestellt, was N,N',N''-tris-(4-Acetylphenyl)-1,3,5-benzoltricarboxamid-tris-(amidinohydrazon)-trihydrochlorid (Verbindung 33), solvatisiert mit drei Molekülen 2-Methoxyethanol, Schmelzpunkt 295-300°C (dec) (langsames Erhitzen), ergab.
  • Verbindung 34, 7H.34: 3,5-Diacetylphenyl-isocyanat (0,6 g) und tris-(2-Aminoethyl)-amin (0,13 g) in Methylenchlorid (5 ml) wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt. Nach Filtrieren ergab sich 0,6 g tris(2-[([(3,5-Diacetylphenyl)-amino]-carbonyl)-amino]-ethyl)-amin, Schmelzpunkt 197-8°C. Dieses Hexaketon (0,47 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,61 g) wurden 4 Stunden in Methanol (5 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 0,86 g tris-(2-[([(3,5-diacetylphenyl)amino]-carbonyl)-amino]-ethyl)-amin-hexakis-(amidinohydrazon)-heptahydrochlorid (Verbindung 34) als das Dihydrat-hemiethanolat, Schmelzpunkt 245-6°C (dec).
  • Verbindung 35, 7H.35: 4-Acetylphenyl-isocyanat (3 g) und tris-(3-Aminopropyl)-amin (1,06 g) in Tetrahydrofuran (50 ml) wurden 30 Minuten gerührt. Ethanol (100 ml) wurde hinzugefügt und die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Filtrieren ergab sich 2,8 g tris(3-[([(4-Acetylphenyl)-amino]-carbonyl)-amino]-propyl)-amin, Schmelzpunkt 184-5°C. Dieses Diketon (0,4 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,29 g) wurden 4 Stunden in Methanol (3 ml) erhitzt. Nach Hinzufügen von Ethanol (3 ml) und Filtrieren ergab sich 0,5 g tris(3-[([(4-Acetylphenyl)-amino]-carbonyl)-amino]-propyl)-amin-tris-(amidinohydrazon)-trihydrochlorid (Verbindung 35) als das Dihydrat-ethanolat, Schmelzpunkt 209-10°C (dec).
  • Verbindung 36, 7H.36: 3,5-Diacetylphenyl-isocyanat (0,4 g) und tris-(3-Aminoethyl)-amin (0,12 g) in Tetrahydrofuran (5 ml) wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt. Nach Filtrieren ergab sich 0,32 g tris-(3-[([(3,5-Diacetylphenyl)-amino]-carbonyl)-amino]-propyl)-amin, Schmelzpunkt 147-8°C.
  • Dieses Hexaketon (0,4 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,49 g) wurden 4 Stunden in Methanol (3 ml) erhitzt. Nach Hinzufügen von Ethanol und Filtrieren ergab sich 0,58 g tris-(3-[([(3,5-Diacetylphenyl)-amino]-carbonyl)-amino]-propyl)-aminhexakis-(amidinohydrazon)-heptahydrochlorid (Verbindung 36) als das Dihydrat-hemiethanolat, Schmelzpunkt 250-1°C (dec).
  • Verbindung 37, 7I.37 [sic; 7I.37]: 3-Acetylphenyl-isocyanat (1 g) und 4'-Aminoacetophenon (0,84 g) in Methylenchlorid (5 ml) wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach Filtrieren ergab sich 2,0 g 3,4'-Diacetyl-N,N'-diphenylharnstoff, Schmelzpunkt 252-3°C (dec). Dieses Diketon (0,6 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,65 g) wurden in Ethanol (5 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 0,8 g 3,4'-Diacetyl-N,N'-diphenylharnstoff-bis-(amidinohydrazon)-dihydrochlorid (Verbindung 37) als das Hemihydrat, Schmelzpunkt 243-4°C dec.
  • Verbindung 38, 7I.38: 3-Acetylphenyl-isocyanat (0,27 g) und 3,5-Diacetylanilin (0,3 g) wurden in Methylenchlorid (5 ml) 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach Filtrieren ergab sich 0,5 g 3,3',5'-Triacetyl-N,N'-diphenylharnstoff, Schmelzpunkt 223-4°C. Dieses Triketon (0,34 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (0,49 g) wurden 4 Stunden in Ethanol (5 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 0,6 g 3,3',5'-Triacetyl-N,N'-diphenylharnstoff-tris-(amidinohydrazon)-tihydrochlorid (Verbindung 38) als das Hydrat, Schmelzpunkt 245°C dec.
  • Verbindung 39, 7I.39 [sic; 7I.39]: N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-harnstoff (0,38 g), Aminoguanidin-hydrochlorid (0,44 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (59 mg) wurden 6 Stunden in 2- Methoxyethanol (5 ml) auf 90-100°C erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 0,66 g N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-harnstoff-tetrakis-(amidinohydrazon)-tetrahydrochlorid (Verbindung 39) als das 2.5-Hydrathemimethanolat, Schmelzpunkt 263-4°C dec.
  • Verbindung 40, 7I.40 [sic; 7I.40]: N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-nonandiamid (0,100 g), Aminoguanidin-hydrochlorid (0,115 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (3 mg) wurden 5 Stunden in 95-%igem Ethanol (2,5 ml) unter Reflux erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 0,18 g N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-nonandiamid-tetrakis-(amidinohydrazon)-tetrahydrochlorid (Verbindung 40), Schmelzpunkt 295-6°C.
  • Verbindung 41, 7J.41: N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-dodecandiamid (0,100 g), Aminoguanidin-hydrochlorid (0,115 g) und Aminoguanidin-dihydrochlorid (3 mg) wurden Stunden [sic] in 95-%igem Ethanol (2,5 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 0,070 g N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-dodecandiamid-tetrakis-(amidinohydrazon)-tetrahydrochlorid (Verbindung 41) als das Tetrahydrat, Schmelzpunkt 268-9°C.
  • Verbindung 42, 7J.42: Eine Suspension von 3,5-Diacetylanilin (0,354 g) in Methylenchlorid (7 ml) mit 4-Dimethylaminopyridin (5 mg) wurde mit 2-Methyl-1,5-pentandiyl-diisocyanat (0,18 ml) behandelt. Nach Erhitzen unter Reflux für 2 Stunden wurde die Mischung abgekühlt. Ein Aliquot wurde mit t-Butylmethylether behandelt, was Keimkristalle ergeb, die zur Reaktionsmischung hinzugefügt wurden. Nach Rühren für einige Stunden ergab die Filtration 0,120 g 1,5-bis-[([(3,5-Diacetylphenyl)-amino]-carbonyl)-amino]-2-methylpentan, Schmelzpunkt 128°C. Dieses Tetraketon (0,100 g), Aminoguanidin-hydrochlorid (0,115 g) und Aminoguanidindihydrochlorid (3 mg) wurden 18 Stunden in 95-%igem Ethanol (2,5 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 0,16 g 1,5-bis-[([(3,5-Diacetylphenyl)-amino]-carbonyl)amino]-2-methylpentan-tetrakis-(amidinohydrazon)-tetrahydrochlorid (Verbindung 42) als das Tetrahydrat, Schmelzpunkt 258-9°C.
  • Verbindung 43, 7J.43: N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-octandiamid (0,100 g), Aminoguanidin-hydrochlorid (0,115 g), und Aminoguanidin-dihydrochlorid (10 mg) wurden 20 Stunden in 95-%igem Ethanol (2,5 ml) erhitzt. Nach Abkühlung und Filtrieren ergab sich 0,17 g N,N'-bis-(3,5-Diacetylphenyl)-octandiamid-tetrakis-(amidinohydrazon)-tetrahydrochlorid (Verbindung 43) als das 2,5-Hydrat, Schmelzpunkt 308-9°C.
  • 7. BEISPIEL: WHOLE-CELL-HEMMASSAYS FÜR HARNSTOFF UND KEINE AUSGABE
  • Dieser Abschnitt beschreibt im Detail die Verfahren und Ergebnisse eines Gewebekulturassays zur Bestimmung der Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, die Harnstoffsynthese in aktivierten Makrophagen zu hemmen.
  • 7.1. MATERIAL UND METHODEN
  • RAW 264.7-Zellen werden in Mikrokultur-Wellsbei 1 × 106/ml in RPMI 1640 mit 10% FBS und ansonsten Standardkulturbedingungen ausplattiert und 5 Stunden zur Adhäsion stehen gelassen. Sie werden dann mit 25 U/ml γIFN und 0,1 μg/ml LPS in Gegenwart der Testinhibitoren aktiviert. Die im Uberstandsmedium vorliegende Harnstoffkonzentration wird nach 18 Stunden Kultivierung mittels eines kolorimetrischen Blutharnstoff-Stickstoff-Diacetylmonoxim-Assays an einem Aliquot des Kulturüberstands bestimmt (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO), die Hemmung wird ausgedrückt als prozentualer Harnstoffanteil verglichen mit einer parallelen Kontrollkultur, die identisch behandelt wurde, außer dass die Konzentation des hinzugefügten Hemmers Null ist.
  • Die Nitritproduktion wird durch Testen des gleichen Gewebekulturüberstands mit einem kolorimetrischen Assay bestimmt. Kurz beschrieben werden 4 Teile der Testlösung, die 1% (w/v) Sulfanilamid, 0,1% Naphthylethylendiamin-di-HCl (Griess-Reagenz), 2,5% H3PO4 und einen Medienanteil enthält, gemischt, 10 Minuten lang inkubiert und anschließend die Absorbanz bei 560 nm ermittelt. Die Nitritkorzentrationen werden mittels mit NaNO2 erstellten Referenzkurven interpoliert.
  • Verschiedene Konzentrationen der Testverbindungen sind in den Medien der stimulierten RAW 264.7-Zellen in Kultur enthalten. Die Harnstoff- und/oder Nitritkonzentration nach 18 Stunden aktivierter Kultur wird bestimmt und mit dem ungehemmten Kontrollwert, der aus mindestens einer parallelen Kultur bezogen wird, verglichen. Die fraktionierte Reduktion wird für jede Konzentration des Hemmers berechnet und die IC50 (die Konzentration, die 50% Reduktion liefert) wird interpoliert. Die Verbindungen werden in Medien bei leichter Wärme (60°C) gelöst. Diejenigen mit begrenzter Löslichkeit wurden in Base gelöst. Die Konzentration von Stammlösungen dieser Verbindungen, die nicht komplett löslich waren, wurde anhand von OD280 ermittelt.
  • Die Kulturüberstände werden auf Anwesenheit des intrazellulären Enzyms Laktatdehydrogenase (LDH) getestet, um das Ausmaß, in dem die Testverbindung (ggf.) den Zelltod verursacht hat, zu ermitteln. In den im Folgenden berichteten Beispielen wurde keine solche Zelltoxizität aufgrund der Testverbindungen beobachtet.
  • 7.2. ERGEBNISSE
  • Die Ergebnisse der Untersuchung von Guanylhydrazonverbindungen zur Messung ihrer Fähigkeit, die Harnstoffproduktion zu hemmen, werden in den Tabellen I, II und III präsentiert. Die aktivsten Verbindungen, die in Tabelle I aufgeführt sind, wiesen eine IC50 von unter 10 μM auf. Die aktivste Verbindung war ein Tetraguanyihydrazon-decandiamid (Verbindung Nr. 14). Ebenfalls eine hohe Aktivität zeigten das Pentandiamid-Homolog der vorstehenden Verbindung Verbindung Nr. 13); das Ethandioxy-bis-(guanylhydrazon) (Verbindung Nr. 16); ein gemischtes Harnstoff-bis-(guanylhydrazon) (Verbindung Nr. 9); sowie Triacetylbenzin-tris-(guanylhydrazon) (Verbindung Nr. 1).
  • Verbindungen mit entweder einem oder zwei Phenylkernen waren wirksam. Wenn zwei Kerne vorlagen, war ihre Verknüpfung durch einen Harnstoff, Diamid oder eine Alkandioxy-Funktionalität wirksam. Testverbindungen mit einer einzigen Guanylhydrazonfunktionalität waren viel weniger wirksam.
  • TABELLE I ERGEBNISSE VON IN-VITRO-ASSAYS FÜR VERBINDUNGEN, DIE HOHE AKTIVITÄTSSTUFEN AUFWEISEN
    Figure 00330001
  • TABELLE II ERGEBNISSE VON IN-VITRO-ASSAYS FÜR AKTIVE VERBINDUNGEN
    Figure 00340001
  • TABELLE III ERGEBNISSE VON IN-VITRO-HARNSTOFFPRODUKTONS-ASSAYS FÜR AKTIVITÄTZEIGENDE VERBINDUNGEN
    Figure 00350001
  • 8. BEISPIEL: WHOLE-CELL-HEMMASSAY FÜR ARGININAUFNAHME
  • Dieser Abschnitt beschreibt im Detail die Verfahren und Ergebnisse eines Gewebekulturassays zur Bestimmung der Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, die Argininaufnahme in aktivierten Makrophagen zu hemmen.
  • 8.1. MATERIAL UND METHODEN
  • RAW 264.7-Zellen werden auf Standard-96-Well-Mikrokulturplatten bei einer Konzentration von 105/Well ausplattiert und zur Adhäsion für eine Zeitraum von 2 Stunden bzw. über Nacht stehen gelassen. Das Medium wird dann durch ein Medium ersetzt, das die zu testende Verbindung enthält. Eine Stunde später wird das Medium ergänzt, so dass es 25 U/ml γIFN und 0,1 μg/ml LPS enthält, und die Kulturen werden weiter inkubiert. Die Zellen werden dann zweimal in HEPES-gepufferter Krebs-Kochsalzlösung mit 0,1% Glukose gespült. Trägerfreies Tetra-3H-Arginin wird in jedes Well hinzugegeben (2,5 μCi/Well mit spezifischer Aktivität von 69 mCi/mmol) und 5 Minuten zur Fortsetzung der aktiven Aufnahme von Arginin stehengelassen, dann werden die Zellen schnell auf 0°C durch Waschen mit eiskalter Kochsalzlösung, die 10 mM unmarkiertes Arginin enthält, abgekühlt, um alle extern gebundenen Markierungen zu verdrängen. Der Inhalt der gewaschenen Zellen wird in 100 μl Ameisensäure solubilisiert und mit den Standardtechniken gezählt. Der Umfang der Tetra-3H-Argininaufnahme als Funktion der Inkubationszeit wird in 6 gezeigt. In anschließenden Versuchen zur Bestimmung der Aktivität der Inhibitoren wurden Inkubationen für einen Zeitraum von 8 Stunden durchgeführt.
  • 8.2. ERGEBNISSE
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die die größte Aktivität zur Suppression der Harnstoffproduktion in aktivierten Makrophagen zeigten, wurden getestet, um ihre Wirkung auf die Argininaufnahme zu bestimmen. Die Ergebnisse, die in Tabelle 1 von Abschnitt 7.2 aufgeführt sind, zeigen, dass jede der aktiven Verbindungen ein effektiver Aufnahmehemmer war, und zwar bei einer ähnlichen Dosis, die auch die Harnstoffproduktion effektiv hemmte. Diese Daten weisen darauf hin, dass ein Arginintransportprotein ein Target der Wirkung dieser Verbindungen ist.
  • 9. BEISPIEL: ARGINASE-HEMMASSAY
  • Dieser Abschnitt beschreibt im Detail die Verfahren und Ergebnisse eines zellfreien Assays zur Bestimmung der Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, die Aktivität der aus Makrophagen bezogenen Arginase zu hemmen.
  • 9.1. MATERIAL UND METHODEN
  • Ein Überstand aus 1200 g × 2 Minuten wird aus einem Zelllysat gewaschener RAW 264.7-Zellen, das durch Hinzufügung eines Lysepuffers mit 50 mM Hepes, 1% NP-40, 0,1 mg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und einem Aprotinin bei 1 μg/ml hergestellt wird, erhalten. Das Volumen des Überstands wird eingestellt, so dass die Proteinkonzentration zwischen 2 und 4 mg/ml liegt. Eine 1:4 Mischung des Überstands in einem Aktivierungspuffer (30 mM MnCl2; 0,3 M Glycin, 1% BSA, pH 9,8), der verschiedene Konzentrationen des Testhemmers enthält, wird bei 55°C 20 Minuten inkubiert. Die Arginaseaktivität wird durch Ansetzen einer 1:2 Mischung der oben genannten Lösung und 0,375 M Arginin, pH 9,8, für einen Zeitraum von 10 Minuten bei 37°C bestimmt. Die Harnstoffkonzentration wird wie oben beschrieben nach dieser Inkubation gemessen.
  • 9.2. ERGEBNISSE:
  • Die sechs Verbindungen, die die größte Aktivität bei der Suppression der zellulären Harnstoffproduktion zeigen, wurden getestet, um zu ermitteln, ob eine von ihnen die Aktivität der Arginase in dem oben beschriebenen Zelllysat-Assay hemmen könnte. Die Ergebnisse zeigen nicht, dass Arginase empfindlich ist gegenüber einer Hemmung durch die Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei den verwendeten Konzentrationen und unter den verwendeten Bedingungen.
  • 10. BEISPIEL: BEHANDLUNG VON KACHEXIE IN VIVO
  • Ein Tiermodell der mit Tumor assoziierten Proteinkatabolismus-Erkrankung (Kachexie) wurde angewandt, um die Wirksamkeit von Verbindung 14 zur Reduktion des Ganzkörper-Stickstoffverlusts direkt zu testen. Tumore wurden in den entsprechenden Gruppen durch intramusiculäre Inokulation mit 15 × 106 AtT-20-Zellen induziert. Dieses Modell verursacht bekannterweise eine Proteinkatabolismus-Erkrankung, die durch den Konsum von normalen Lebensmittelmengen und doch 20% Ganzkörper-Proteinverlusten innerhalb von Nr. 14 Tagen gekennzeichnet ist. Verbindung Nr. 14 wurde den „behandelten" Gruppen in einer täglichen Dosis von 0,4 mg/kg intraperitoneal verabreicht. Nackte Mäuse (nu/nu) wurden in Stoffwechselkäfigen (4 pro Käfig) untergebracht, um die tägliche Sammlung von Harnproben über einen Zeitraum von 14 Tagen zu erleichtern. Die Nahrungsmittelaufnahme wurde täglich gemessen. Es gab vier Gruppen von Tieren: 1) unbehandelte, keinen Tumor aufweisende Kontrollen; 2) unbehandelt, mit Tumor; 3) behandelt, mit Tumor, und 4) behandelt, ohne Tumor. Harn wurde gesammelt und die Harnstoffverluste im Harn wurden quantifiziert.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefasst (ausgedrückt als mg Harnstoff/Gruppe): TABELLE IV IN-VIVO-AKTIVITÄT VON VERBINDUNG NR. 14 BEI DER SUPPRESSION VON GANZKÖRPER-STICKSTOFFVERLUST IM HARN (mg/Gruppe)
    Figure 00380001
  • Die Gruppen verbrauchten ähnliche Nahrungsmengen (16 ± 2 g/Tag) in diesem Versuch. Die Daten zeigen auf, dass Verbindung Nr. 14 eine übermäßige Urin-Harnstoffexkretion, die normalerweise mit Kachexie verbunden ist, verhindert.
  • Da der Harnstoffverlust 80% der Ganzkörper-Stickstoffverluste ausmacht und die Stickstoffaufnahmen in allen Gruppen ähnlich waren, legen diese Daten weiterhin nahe, dass Verbindung Nr. 14 die Ganzkörper-Stickstoffretention verbessert.
  • Die Signifikanz dieser Beobachtungen wird durch die Schätzung der Auswirkung dieser Stickstoffverluste auf die Muskelmasse nachgewiesen. Verbindung Nr. 14 verhinderte den Verlust von ca. 200 mg Harnstoff/Maus über den Zeitraum von 14 Tagen. Das entspricht ca. 100 mg Stickstoff, 625 mg Protein oder 2,7 g Nassmuskelmasse, die durch Behandlung mit Verbindung Nr. 14 bewahrt wird.
  • 11. BEISPIEL: BEHANDLUNG VON ENTZÜNDUNG IN VIVO
  • Ein Standard-Tiermodell für Entzündung wurde verwendet, die Wirksamkeit von Verbindung Nr. 14 als Entzündungshemmer direkt zu testen. Eine Pfotenschwellung, die durch Injektion des Reizstoffs Carrageenan in die Fußballen von Mäusen induziert wurde, wird seit Anfang der 1960er Jahre zum Nachweis klinisch nützlicher entzündungshemmender Medikamente verwendet.
  • Ein Pfotenödem wurde durch Injektion von 50 Mikrolitern von 1-%igem Lambda-Carrageenan in HEPES 25 mM, pH 7,4, in die plantare Oberfläche der linken Hinterpfote von C3H/HeN-Mäusen induziert; in die rechte Pfote wurde nur 50 Mikroliter HEPES injiziert. Die Tiere wurden in zwei Gruppen aufgeteilt: Kontrollen (n = 3) erhielten nur das Vehikel, i.p. 1,5 Std. vor der Injektion in die Pfote; die Versuchsgruppe (n = 4) wurde mit Verbindung Nr. 14, 5 mg/kg, i.p. 1,5 Std. vor der Injektion in die Pfote behandelt. Drei Stunden nach der Injektion in die Pfote wurde die Dicke der Pfote mit einem Greifzirkel gemessen und die Daten wurden als Veränderung der Dicke der Carrageenan-Pfote im Vergleich zur HEPES-Pfote angegeben.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle V, die die durch Carrageenan induzierte Zunahme der Pfotendicke in mm bei drei Kontrollmäusen und drei mit Verbindung Nr. 14 behandelten Mäusen aufzeigt, zusammen gefasst. Die Hemmung kann auch als prozentuale Hemmung der Schwellung gemäß der folgenden Standardformel berichtet werden: Prozentuale Hemmung = (1 -(behandelt/Kontrolle)) × 100. Die Berechnung dieses Parameters für behandelte Tiere, bei denen Verbindung Nr. 14 die Schwellung hemmte, ergibt eine Hemmung von 70%. TABELLE V EFFEKT VON VERBINDUNG NR. 14 AUF ENTZÜNDUNGSVERÄNDERUNGEN IN PFOTENDICKE
    Figure 00390001
  • 8 präsentiert die Wirkungen verschiedener Dosierungen von Verbindung Nr. 14 im gleichen Assay. Die Daten zeigen, dass Dosen zwischen ca. 1 und 10 mg/kg Körpergewicht die Pfotenschwellung wirksam hemmen.
  • Diese Daten zeigen auf, dass Verbindung Nr. 14 Entzündungen verhinderte, von denen man annahm, dass sie durch die Hemmung der vom Arginintransport abhängigen Stickoxidproduktion in Entzündungszellen vermittelt wird.
  • 12. BEISPIEL: VERBINDUNG NR. 14 HAT KEINE WIRKUNG AUF VASODILATORISCHE REAKTIONEN, DIE DURCH DEN ENDOTHELIALEN RELAXIERENDEN FAKTOR VERMITTELT WERDEN
  • Eine wichtige, an ein Medikament gestellte Anforderung, das durch Makrophagen-NO-Produktion verursachten, vaskulären Zusammenbruch und Hypotonie kontrolliert, ist, dass es nicht die EDRF-Aktivität in vivo beeinträchtigen darf. Eine solche Beeinträchtigung kann eine unkontrollierte Hypertonie verursachen und steht der wirksamen klinischen Verwendung von NO-Synthase-Inhibitoren im Wege. Wir haben die Wirkung von Verbindung Nr. 14 auf die EDRF-Aktivität an einem Tiermodell gemessen und festgestellt, dass Verbindung Nr. 14 wohl die NO-Produktion, aber nicht die EDRF-Aktivität hemmt.
  • Weibliche Sprague-Dawley-Ratten (225-250 g Körpergewicht) wurden mit Nembutal (50 mg/kg, i.p.) anästhesiert, ein Tracheostomietubus eingeführt und die Carotis und die Jugularis mit Standardverfahren unter Verwendung eines Polyethylenschlauchs (PE 50) kannüliert. Tracey, K. J., et al., 1986, SCIENCE 234; 470-474. Der Blutdruck wurde ständig mit einem Druckwandler und -Recorder aufgezeichnet (Modell RS-3200, Gould Inc.). In dem hier beschriebenen Versuch erhielten die Tiere eine sterile intraarterielle Einzeldosis von entweder NG-Methyl-L-Arginin (NMA; Sigma; 10 mg/kg), Verbindung Nr. 14 (50 mg/kg) oder dem Vehikel (0,4 ml). In LPS-freiem Wasser verdünntes Acetylcholin (ACh) wurde über die Jugularis-Kanüle in den angegegebenen Dosen verabreicht. Die Lösungen wurden verdünnt, um ein konstant injizierbares Volumen von 1 ml/kg Körpergewicht herzustellen.
  • Die hypotensive (EDRF) Response wurde als Abnahme des mittleren arteriellen Blutdrucks, der 30 Sekunden nach der ACh-Administration aufgezeichnet wurde, gemessen. Die Anzahl der für jede Acetyicholindosis untersuchten Tiere betrug 4-6 für jede Versuchsbedingung; die Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts ausgedrückt.
  • Die EDRF-Aktivität wurde durch NMA gehemmt, wie es durch abgeschwächte Blutdruckreaktionen im Vergleich zu den mit Vehikel behandelten Kontrollen nachgewiesen wurde (9; siehe auch Kilbourn, R. G., et al., 1990, PROC NATL. ACAD SCI. 87, 3629-3632). Im Gegensatz dazu unterdrückte Verbindung Nr. 14 nicht die acetylcholin-induzierte EDRF-Aktivität in vivo, was anzeigt, dass mit Verbindung Nr. 14 behandelte Tiere die Funktionskapazität für endotheliale NO-Aktivität beibehielten.
  • 13. BEISPIEL: VERBINDUNG NR. 14 VERHINDERT TÖDLICHEN ENDOTOXISCHEN SCHOCK
  • Es wurden Versuche durchgeführt, um die Wirkung von Verbindung Nr. 14 zur Prävention der lethalen Toxizität von Lipopolysaccharid (LPS) zu beurteilen. LPS wurde verabreicht, um eine 50% Letalität innerhalb von 72 Stunden bei BALB/c-Mäusen (10) zu induzieren. BALB/c-Mäusen (19-21 g) wurde LPS (E. coli 0111:B4; Sigma) in einer Dosis von 13,75 mg/kg durch intraperitoneale Injektion (0,2 ml/Maus) verabreicht. SPS-Stammlösungen (10 mg/ml) wurden zunächst 20 Minuten lang beschallt, in LPS-freiem Wasser (1,375 mg/ml) verdünnt und dann noch einmal direkt vor der Injektion 10 Minuten beschallt. Verbindung Nr. 14 (1 mg/kg, i.p.) wurde 1,5 Std. vor LPS verabreicht. Das Verbindung Nr. 14-Injektat war LPS-frei, wie es durch quantitativen chromogenen Limulus-Amebocytlysattest (BioWhittaker, Walkersville, MD) gemessen wurde. Die Datenpunkte stammen von zwei Gruppen mit 10 Mäusen pro Gruppe.
  • Verbindung Nr. 14 wurde 1,5 Stunden bevor die Letalität durch LPS reduziert wurde, verabreicht. Die Daten wurden einer statistischen Analyse mit z-Test für unabhängige Proportionen unterworfen. Die Differenz zwischen Kontrolle und Verbindung Nr. 14 ist signifikant (einseitiger p-Wert < 0,05; z = 1,95).
  • Es traten keine großen Anzeichen systemischer Toxizität bei Tieren, die nur Verbindung Nr. 14 allein erhielten, auf. Nach LPS-Gabe sahen die Kontrolltiere krank aus, wiesen verringerte Mobilität auf und drängten sich zusammen. Diese sichtbaren Anzeichen von LPS-Toxizität wurden durch Verbindung Nr. 14 merklich supprimiert. Diarrhoe trat bei allen Tieren auf und wurde von Verbindung Nr. 14 nicht unterdrückt.
  • Zuvor erhältliche NOS-Hemmer waren nur beschränkt erfolgreich bei der Verbesserung des Überlebens bei Endotoxämie, zum Teil weil sie EDRF undifferenziert unterdrücken. Cobb, J. P., 1992, J. EXP. MED. 176:1175-1182; Minnard, E. A., 1994, ARCH SURG. 129:142-148; Billiar, T. R., 1990, J. LEUKOCYTE. BIOL. 48:565-569. Eine EDRF-Suppression bei Endotoxämie kann das Überleben durch Verursachen von Vasokonstriktion und eines verminderten Blutflusses in kritische Gefäßbetten beeinträchtigen. Die gegenwärtigen Daten zeigen jetzt auf, dass die Hemmung von zytokin-induzierbarem Makrophagen-NO mit einem Wirkstoff, der endotheliale NO-Reaktionen erhält, während eines septischen Schocks einen Überlebensvorteil liefert.
  • 14. BEISPIEL: VERBINDUNG NR. 14 VERHINDERT DIE PRODUKTION VON ZYTOKINEN UND NO
  • Dieser Abschnitt beschreibt im Detail die Verfahren und Ergebnisse eines Gewebekulturassays zur Bestimmung der Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, die Produktion von TNF durch aktivierte Makrophagen zu hemmen, und zeigt zu Erläuterungs- und Illustrationszwecken auf, dass Verbindung Nr. wirksam die Sekretion von TNF durch einen von der Hemmung der Argininaufnahme unabhängigen Mechanismus blockt.
  • RAW 264.7-Zellen wurden auf Standard-6-Well-Kulturplatten mit einer Dichte von 106/Well ausplattiert und zur Adhäsion für eine Zeitraum von 2 Stunden bis über Nacht stehen gelassen. Das Medium wurde dann durch ein Medium ersetzt, das die zu testende Verbindung enthält. Eine Stunde später wurde das Medium ergänzt, so dass es 25 U/ml γIFN und 0,1 μg/ml LPS enthält, und die Kulturen wurden weitere 18 Stunden inkubiert. Dann wurde das Medium gesammelt und die Zellablagerungen durch Zentrifugation entfernt. Dieser konditionierte Überstand wurde dann mit Standardmethoden auf TNF-Präsenz getestet: L929-Zellzytotoxizität-Bioassay, Radioimmunoassay oder ELISA und Western-Blot mit Antikörpern gegen murines TNF.
  • 11 zeigt, dass in der Gegenwart von zunehmenden Mengen der Verbindung Nr. 14 die Produktion von bioaktivem TNF, gemäß Bestimmung mit L929-Zell-Bioassay, durch RAW 264.7-Zellen verhindert wurde. Die Daten zeigen, dass bei 10 μM Verbindung Nr. 14 eine Reduktion der TNF-Akkumulation im Kulturmedium von mehr als 99% auftrat. 12 zeigt ein Western-Blot, das die Abwesenheit von TNF-Protein im Medium der Zellen, die mit 5 und 25 μM Konzentrationen von Verbindung Nr. 14 kultiviert wurden, nachweist. Das Ausbleiben der TNF-Sekretion in mit Verbindung Nr. 14 behandelten Zellen kann nicht einfach nur auf die Hemmung der NO-Synthese durch Verbindung Nr. 14 zurückgeführt werden. Der NOS-Hemmer N-Methylarginin (NMA) hemmte selbst bei Konzentrationen von 10 μM nicht die Produktion von TNF in diesem System. Die Hemmung der TNF-Produktion war auch nicht auf die Wirkung der Arginindezimierung, die durch die Blockierung des Arginintransports hervorgerufen wurde, zurückzuführen. 13A zeigt, dass Verbindung Nr. 14 bei einer Konzentration von 5 μM als Hemmer der NO-Synthese funktionierte, dass aber diese Hemmung zum Teil durch die Anwesenheit von ca. 50 bis 100 μM Arginin im Medium überwunden werden kann. Im Gegensatz dazu zeigen die Daten in 13B klar auf, dass die Wirkung von Verbindung Nr. 14 auf die TNF-Sekretion bei 5 μM nicht reduziert wurde, auch nicht um nur 1,0 mM extrazelluläres Arginin. Diese Ergebnisse zeigen, dass Verbindung Nr. 14 die Produktion von TNF aus aktivierten Makrophagen durch einen Mechanismus, der nicht kritisch von Arginin abhängt, spezifisch blockierte.
  • Qualitativ ähnliche Daten wurden durch Messung der Serum-TNF-Konzentrationen bei Ratten, die zur Produktion von TNF durch parenterale LPS-Verabreichung stimuliert wurden, erhalten. Den Ratten wurde Verbindung Nr. 14 i.p. 2,0 Stunden vor der LPS-Stimulation verabreicht. Die Serumkonzentrationen von TNF wurden zwischen 2 und 3 Stunden nach der LPS-Stimulation gemessen. Die Tiere, die mit Verbindung Nr. 14 behandelt wurden, wiesen nur ca. die Hälfte des Serum-TNFs auf, das in den unbehandelten Kontrollen vorgefunden wurde.
  • Ähnliche Ergebnisse in Bezug auf eine Reihe von Zytokinen neben TNF, z.B. IL-6 und Makrophagen-Entzündungsproteine-1α und -1βS (MIP-1α und MIP-1β) wurden unter Verwendung von menschlichem peripherem Blut als Monozytenquelle erhalten. Menschliche periphere Blutmononuklearzellen (PBMC) wurden mit „FICOLL®"-basierten Methoden isoliert und in Standard-6-Well-Kulturplatten mit einer Konzentration von 106/Well ausplattiert und zur Adhäsion für eine Zeitraum von 2 Stunden bis über Nacht stehen gelassen; anschließend wurden nicht adhärente Zellen ausgewaschen und das Medium wurde dann durch Medium ersetzt, das die zu testende Verbindung enthielt. Eine Stunde später wurde das Medium ergänzt, so dass es 25 U/ml γIFN und 0,1 μg/ml LPS enthielt, die Kulturen wurden weitere 18 Stunden inkubiert. Dann wurde das Medium gesammelt und die Zellablagerungen durch Zentrifugation entfernt. Dieser konditionierte Überstand wurde dann mit den Standardmethoden des L929-Zellzytotoxizität-Bioassays und Immunoassays (ELISA) auf Anwesenheit von Zytokinen getestet. Die Ergebnisse zeigten auf, dass Verbindung Nr. 14 beim Test in diesem System die Produktion von TNF, IL-6, MIP-1α und MIP-1β durch menschliche PBMC-Zellen bei einer Konzentration von ca. 10-20 μM wirksam hemmte. 14A-D zeigt, dass in Gegenwart zunehmender Mengen von Verbindung Nr. 14 von 1 bis 20 μM die Produktion dieser Zytokine durch menschliche PBMC-Zellkulturen verhindert wurde.
  • 15. BEISPIEL: VERBINDUNG NR. 14 LIEFERT SCHUTZ VOR FOKALEM HIRNINFARKT
  • Dieser Abschnitt beschreibt im Detail die Verfahren und Ergebnisse eines Tiermodells zur Bestimmung der Fähigkeit von Verbindung Nr. 14 Hirninfarkt (auch als zerebraler Infarkt oder „Schlaganfall" bekannt) zu behandeln.
  • Lewis-Ratten (männlich, 270-300 g) wurde Nahrung und Wasser nach Belieben vor und nach der Operation gegeben. Die Tiere wurden mit Ketamin (120 mg/kg i.m.) anästhesiert, so dass die spontane Atmung ermöglicht wurde, und ihre Körpertemperatur wurde mit einer Heizdecke auf 35,5-36,5°C gehalten. Der ventrale Nacken und der Bereich zwischen dem rechten Auge und Ohr wurden rasiert. Ein ventraler zervikaler Mittellinienschnitt wurde verwendet, um die linke A. carotis communis (CCA) freizulegen, welche vom umliegenden Gewebe unter Erhaltung des N. Vagus freigelegt wurde. Dann wurde eine 4-0 Seidenschlinge zur späteren Manipulation um die Arterie gelegt. Anschließend wurde die rechte A. carotis communis freigelegt und permanent mit 4-0 Seidendoppelligaturen verschlossen.
  • Zur Durchführung der Kraniotomie wurde ein Schnitt von 1 cm orthogonal zu der Linie vorgenommen, die den externen Gehörgang und den lateralen Canthus des rechten Auges verbindet. Mit Hilfe eines Dissektionsmikroskops wurde die rechte mittlere Hirnarterie durch eine 1 mm Bohröffnung, die ca. 2 cm rostral zur Fusion des Zygomas mit dem Schläfenbein gebohrt wurde, freigelegt. Die Bohrung wurde unter ständiger Tropfung von normaler Kochsalzlösung vorgenommen, um eine Wärmeübertragung zum darunterliegenden Kortex zu vermeiden. Der Knochen wurde mit dem Bohrer ausgedünnt und eine dünne Schale wurde mit einem Mikrohaken und Mikrozange entfernt. Die Dura Mater wurde sodann durchschnitten und mit einer 30 G Nadel reflektiert, um die rechte mittlere Hirnarterie (MCA) ca. 1 mm von der rhinalen Fissur freizulegen.
  • Unter Einsatz eines Mikromanipulators und einem 20-Mikron-Wolfram-Drahthaken wurde die rechte mittlere Hirnarterie 0,5 mm über der Kortikalisoberfläche angehoben und durch Applikation einer Elektrokauterisationsspitze auf den Wolframhaken über dem Gefäß aufgetrennt. Durch die Anwendung von Hitze wurde die Arterie schnell kauterisiert und abgetrennt, und fiel ohne zugrundeliegende Kortikalisverletzung auf die Kortikalis zurück. Um einen reproduzierbaren Schlaganfall zu verursachen, muss die linke CCA vorübergehend 30-60 Minuten verschlossen werden. Dementsprechend wurde im vorliegenden Modell die linke CCA 30 Minuten verschlossen. Chirurgischer Gelschaum wurde über den Kraniotomiedefekt aufgebracht und die Hautschnitte wurden mit Vicryl-Nähten geschlossen. Die Tiere wurden dann in ihre Käfige zurückgebracht, wo sie 24 Stunden lang freien Zugang zu Wasser und Nahrung hatten. Nach dem Eingriff waren die Tiere etwas schwerfällig, nahmen aber ihre Aktivitäten, wie z. B. Laufen, Essen und Trinken, wieder auf.
  • 24 Stunden nach der MCA-Abtrennung wurden die Tiere anästhesiert und geköpft und ihre Gehirne wurden schnell ohne Perfusion entnommen und koronal in 1-mm-Intervallen mit einem Gehirnscheibe zur Analyse unterteilt. Die frisch zubereiteten Scheiben wurden in 2,3,5-Triphenyltetrazolium (TTC) (2% in NaCl, 154 mM) eingetaucht und 30 Minuten bei 37°C im Dunkeln inkubiert, um sie für mitochondriale Dehydrogenase zu färben. Hirninfarkte wurden als Bereiche ungefärbten (weißen) Gewebes visualisiert, die leicht mit lebensfähigem Gewebe, welches sich rot färbte, kontrastiert werden konnten. Die Scheiben wurden dann in gepuffertes 10-%iges Formalin gelegt und der infarktbereich wurde mittels Planimetrie auf projizierten Bildern der fotografierten Gehirnscheiben bestimmt. Der Infarktumfang für die jeweiligen Tiere wurde berechnet, indem der auf jeder Gehirnscheibe vorhandene Infarktbereich summiert wurde und die Summe des Hemisphärenbereichs für alle Scheiben des betreffenden Tieres dividiert wurde (ausgedrückt als Prozentsatz des Hemisphärenbereichs für jede Scheibe). Die Tiere wurden in Gruppen von 10 untersucht und die Daten wurden als durchschnittliches Schlaganfallvolumen für die Gruppe angegeben.
  • Die mittlere Infarktgröße der Kontrollen (die nicht mit Verbindung Nr. 14 behandelt wurden) wurde als 3,1% ± 0.5% dokumentiert. Die Tiere, die Verbindung Nr. 14 eine Stunde vor Abtrennung der Arterie erhalten hatten (1 mg/kg, i.v.), entwickelten kleinere Infarktgrößen (1,7 ± 0,2%). Die Differenzen waren gemäß dem Student t-Test für ungepaarte Daten statistisch signifikant (p < 0,05). Diese Versuche zeigten auf, dass Verbindung Nr. 14 die Größe eines fokalen Hirninfarkts wirksam reduzierte.
  • 16. BEISPIEL: ANTINEOPLASTISCHE AKTIVITÄT VON VERBINDUNG NR. 14
  • Dieser Abschnitt beschreibt im Detail die Verfahren und Ergebnisse eines Tiermodels für Tumorwachstum zur Bestimmung der Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, das Tumorwachstum zu hemmen und Tumorregression hervorzurufen. Die Zellen werden in Standard-Gewebekulturflaschen in DMEM, ergänzt mit fötalem Kalbsserum (10%), ausplattiert. CHO-Zellen (Chinesische Hamster-Ovarienzellen) werden stabil mit einem „mammalian expression vectorconstitutively secrete human TNF (CHO-TNF)" transfiziert. Die Versuche mit dem CHO-TNF wurde wie folgt durchgeführt: Am Tag der Injektion in nackte Mäuse werden die Zellen geerntet und intramuskulär (10-15 × 106 Zellen pro Tier) in das Hinterbein von nu/nu nackten Mäusen injiziert (20 g Körpergewicht). Die Tiere werden untergebracht und nach Belieben mit Nahrung und Wasser versorgt. Das Tumorwachstum wird überwacht und bei Vorliegen fundierter Tumore (während Woche 6), werden die Testverbindungen täglich verabreicht (0,4 mg/kg intraperitoneal, einmal täglich) Nach zwei Wochen werden die Tiere euthanasiert, der Tumor gewogen und mit einem Greifzirkel gemessen. Der CHO-TNF-Tumor metastasiert auch in die Haut dieser Tiere. Die Anzahl der Metastasen wird gezählt.
  • Die parenterale Verabreichung von Verbindung Nr. 14 verursachte eine Reduktion der Tumorgröße bei vier von fünf Tieren. Die Tumore dieser Tiere wurden gewogen und ihre Größe wurde ermittelt. Die Untersuchung der Mäuse auf Hautmetastasen ergab, dass sich bei 4 von 5 Kontrollen durchschnittlich 2,5 ± 1 Hautmetastasen entwickelten. Die Hautmetastasen waren bei den behandelten Tieren nicht zu beobachten. Diese Daten zeigen, dass die Verbindung Nr. 14 eine Anti-Tumor-Wirkung hat.
  • Figure 00450001
  • 17. HEMMENDE WIRKUNG VON VERBINDUNG NR. 14 AUF ARGININAUFNAHME UND KEINE AUSGABE VON VORHER INAKTIVEN GEGENÜBER AKTIVIERTEN ZELLEN
  • Dieser Abschnitt beschreibt Versuche, die die Konzentration von Verbindung Nr. 14, die zur Hemmung der Argininaufnahme und NO-Ausgabe erforderlich ist. Die verwendeten Techniken wurden in Abschnitt 7.1 oben beschrieben.
  • 13A zeigt die Wirkungen von Verbindung Nr. 14 auf die Ausgabe von NO durch RAW 264.7-Zellen, die ständig Verbindung Nr. 14 ausgesetzt waren, und zwar von einer Stunde vor der γ-IFN/LPS-Stimulation bis zum Abschluss des Assays 18 Stunden nach der Stimulation. Die Daten zeigen, dass Verbindung Nr. 14 ein Hemmer der NO-Ausgabe war, der kompetitiv durch extrazelluläres Arginin antagonisiert wurde. Diese Daten zeigen, dass die IC50 für Verbindung Nr. 14 in diesem Assay bei physiologischen Argininkonzentrationen (100 μM) zwischen 3 und 5 μM lag.
  • Wie in 6 gezeigt, trat der Peak-Level der Argininaufnahme durch RAW 264.7-Zellen 8 Stunden nach der γ-IFN/LPS-Stimulation auf. Wenn RAW 264.7-Zellen vor der Stimulation Verbindung Nr. 14 ausgesetzt wurden (wie in 13B gezeigt) und das Niveau der Argininaufnahme nach 8 Stunden gemessen wurde, war die I.C.50 für Argininaufnahme von Verbindung Nr. 14 sehr ähnlich dem für NO-Ausgabe beobachteten, 7,5 μM (Daten nicht gezeigt).
  • Alle Wirkungen der Verbindung Nr. 14 auf Makrophagen-NO-Ausgabe konnten jedoch nicht komplett auf eine akute Blockade des Arginintransports zurückgeführt werden. 15 zeigt die beobachteten Ergebnisse, wenn RAW 264.7-Zellen in Abwesenheit eines Hemmers γ-IFN/LPS-stimuliert und die Zellen 8 Stunden später 10 Minuten der Verbindung Nr. 14 ausgesetzt wurden, und anschließend die Argininaufnahme zu messen. Ein IC50 = 60 ± 15 μM (Mittelwert ± Stand. fehler, n = 3) wurde gemessen, wenn RAW 264.7-Zellen, die 8 Stunden vorher mit γ-IFN/LPS stimuliert worden waren, Verbindung Nr. 14 zehn Minuten vor dem Assay der Argininaufnahme in argininfreiem Puffer ausgesetzt waren. Die Ergebnisse dieser akuten Expositionsversuche unterschieden sich von den vorher besprochenen Ergebnissen für ständige Exposition in zweierlei Hinsicht. Erstens trat ca. ein Drittel der gesamten Argininaufnahme über einen von Verbindung Nr. 14 unabhängigen Mechanismus auf, der anscheinend in unstimulierten wie auch stimulierten RAW 264.7-Zellen vorhanden war. Zweitens war die Konzentration von Verbindung Nr. 14, die zur 50%-igen Hemmung der Argininaufnahme erforderlich war, nachdem der γ-IFN/LPS-induzierte Arginintransport für einen Zeitraum von Stunden aufgebaut war, größer als die, die zur Verhinderung von 50% der gesteigerten Argininaufnahme oder NO-Ausgabe erforderlich war, wenn Verbindung Nr. 14 vor der Stimulation eingeführt wurde.
  • Eine Zwischenstufe der Empfindlichkeit von Verbindung Nr. 14 wurde beobachtet, wenn γ-IFN/LPS-stimulierte RAW 264.7-Zellen dem Hemmer über einen Zeitraum von 8 Stunden nach der erstmaligen Stimulation bis zum Ende des Versuchs ausgesetzt wurden. In diesen Versuchen wurde die NO-Ausgabe während 12-24 Stunden gemessen. 16 zeigt auf, dass unter diesen Versuchsbedingungen ein IC50 von 20 ± 2 μm (Mittelwert ± Standardfehler, n = 3) beobachtet wurde.
  • Zusammen zeigen diese Daten, dass, wenn RAW 264.7-Zellen Verbindung Nr. 14 vor der Aktivierung durch γ-IFN/LPS ausgesetzt werden, die NO-Ausgabe und die induzierbare Argininaufnahme gleichermaßen empfindlich gegen niedrige Konzentrationen von Verbindung Nr. 14 waren, während die Argininaufnahme von unstimulierten RAW 264.7-Zellen gegenüber Verbindung Nr. 14 nicht empfindlich war. Im Gegensatz dazu war die Argininaufnahme von RAW 264.7-Zellen, die mit γ-IFN/LPS stimuliert und nach einer Verzögerung kurz Verbindung Nr. 14 ausgesetzt wurden, weniger empfinlich gegenüber Verbindung Nr. 14, als wenn Verbindung Nr. 14 vor der Stimulation verabreicht wurde. Ebenso wurde gezeigt, dass die NO-Ausgabe von Zellen, die mit Verbindung Nr. 14 nach der Stimulation behandelt wurden, weniger empfindlich auf Hemmung durch Verbindung Nr. 14 ist, als die Induktion der NO-Produktion durch vorher inaktive Zellen.
  • Diese Daten zeigen, dass in vivo höhere Konzentrationen von Verbindung Nr. 14 erforderlich sein werden, um die laufende NO-Produktion durch aktivierte Makrophagen zu blockieren, als sie erforderlich wären, um die Einleitung der NO-Produktion durch nicht aktivierte Makrophagen zu verhindern, und dass Verbindung Nr. 14 wirksamer sein wird, wenn sie chronisch anstatt akut auf Zellen angewandt wird.
  • Die vorliegende Erfindung ist in ihrem Umfang nicht auf die spezifisch beschriebenen Ausführungsformen beschränkt; diese waren als jeweilige Illustration einzelner Aspekte der Erfidung interdiert, und funktional gleichwertige Verfahren und Komponenten lagen im Rahmen der Erfindung. In der Tat werden zusätzlich zu diesen hier aufgezeigten und beschriebenen unterschiedlichen Modifikationen der Erfindung für Fachleute aus der vorstehenden Beschreibung und den begleitenden Abbildungen erkennbar sein.

Claims (15)

  1. Eine Verbindung mit der Formel:
    Figure 00480001
    wobei: X1 und X2 H- sind; und X'1 und X'2 unabhängig GhyCH- oder GhyCCH3- sind, wobei Ghy ein Guanylhydrazon-Anteil ist; Z -A-(CH2)n-A- ist; n = 3-8; und A -NH(CO)-; -(CO)NH-; -NH(CO)NH- ist; oder Z -O-(CH2)2-O- ist und seine Salze; oder wobei the Verbindung folgende Formel hat:
    Figure 00480002
    wobei: X2 und X'2 H- sind; X1 und X'1 unabhängig GhyCH- oder GhyCCH3- sind, wobei Ghy ein Guanylhydrazon-Anteil ist; und n 3-8 ist; und seine Salze; oder wobei the Verbindung folgende Formel hat:
    Figure 00490001
    wobei: X2 und X'2 H- sind; X1 und X'1 unabhängig GhyCH- oder GhyCCH3- sind, wobei Ghy ein Guanylhydrazon-Anteil ist; und n 2-10 ist; und seine Salze.
  2. Die Verbindung von Patentanspruch 1 mit der Formel:
    Figure 00490002
    wobei: X1 und X2 H- sind; und X'1 und X'2 GhyCCH3- sind, wobei Ghy ein Guanylhydrazon Anteil ist; Z -A-(CH2)n-A- ist; n = 3-8; und A -NH(CO)-; -(CO)NH-; -NH(CO)NH-ist; und seine Salze;
  3. Die Verbindung von Patentanspruch 1 mit der Formel:
    Figure 00500001
    wobei: X1 und X2 H- sind; und X'1 und X'2 GhyCCH3- sind, wobei Ghy ein Guanylhydrazon Anteil ist; und Z -O-(CH2)2-O- ist; und seine Salze.
  4. Die Verbindung von Patentanspruch 1 mit der Formel:
    Figure 00500002
    wobei: X2 und X'2 H- sind; X1 und X'1 GhyCCH3- sind; und n 3-8 ist; und seine Salze.
  5. Die Verbindung von Patentanspruch 1 mit der Formel:
    Figure 00510001
    wobei: X2 und X'2 H- sind; X1 und X'1 GhyCCH3- sind; und n 2-10 ist; und seine Salze.
  6. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche die Verbindung von Patentanspruch 1 und einen pharmazeutisch zulässigen Trägerstoff umfasst.
  7. Die Verwendung der Verbindung aus Patentanspruch 1 oder sein pharmazeutisch zulässiges Salz zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Harnstoffsynthese aus Plasmaarginin bei einer Testperson.
  8. Die Verwendung der Verbindung aus Patentanspruch 1 oder sein pharmazeutisch zulässiges Salz zur Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der Kachexie bei einer Testperson.
  9. Die Verwendung der Verbindung aus Patentanspruch 1 oder sein pharmazeutisch zulässiges Salz zur Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der gesundheitsschädlichen Wirkungen der Stickoxidsynthese bei einer Testperson.
  10. Die Verwendung der Verbindung aus Patentanspruch 1 oder sein pharmazeutisch zulässiges Salz zur Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der gesundheitsschädlichen Wirkungen der Zytokinsekretion bei einer Testperson.
  11. Die Verwendung der Verbindung aus Patentanspruch 1 oder sein pharmazeutisch zulässiges Salz zur Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der gesundheitsschädlichen Wirkungen der Sekretion von Tumornekrosefaktor (TNF) bei einer Testperson.
  12. Die Verwendung der Verbindung aus Patentanspruch 1 oder sein pharmazeutisch zulässiges Salz zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Endotoxinschock bei einer Testperson.
  13. Die Verwendung der Verbindung aus Patentanspruch 1 oder sein pharmazeutisch zulässiges Salz zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumorleiden oder den Nebenwirkungen einer solchen Behandlung bei einer Testperson.
  14. Die Verwendung der Verbindung aus Patentanspruch 1 oder sein pharmazeutisch zulässiges Salz zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Stickoxidsynthese bei einer Testperson.
  15. Die Verwendung der Verbindung aus Patentanspruch 1 oder sein pharmazeutisch zulässiges Salz zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Zytokinsynthese bei einer Testperson.
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