ES2264723T3

ES2264723T3 - Uso de derivados de pirazolina en la preparacion de un medicamento para la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares.

Info

Publication number: ES2264723T3
Application number: ES02714233T
Authority: ES
Inventors: Maria Rosa Cuberes-Altisent; Juana Maria Berrocal-Romero; Maria Montserrat Contijoch-Llobet; Jordi Frigola-Constansa
Original assignee: Laboratorios del Dr Esteve SA
Current assignee: Esteve Pharmaceuticals SA
Priority date: 2001-04-06
Filing date: 2002-03-21
Publication date: 2007-01-16
Anticipated expiration: 2022-03-21
Also published as: IS6973A; DE60211681T2; PT1384477E; CN1299682C; IL158269A0; EP1516621A2; UA75402C2; ZA200308626B; ES2174757B1; AU2002246152B2; CA2442974A1; US20040034082A1; HUP0400918A2; EP1384477A1; ES2174757A1; CN1698602A; MXPA03009124A; MA27019A1; ATE326966T1; HK1067311A1

Abstract

Un aplicador de cera depilatoria que, al ser del tipo de los que están formados por la combinación de una recipiente contenedor de capacidad apropiada, destinado a que se le asocie, temporalmente, con un elemento calentador, con el fin de mantener la cera líquida, y una cabeza y un aplicador propiamente dicho, para unión a la boca de dicho recipiente contenedor, que se caracteriza porque en dicha cabeza se establece, después de un sector inicial (2) para acoplamiento al recipiente contenedor (1), un área restrictiva de la corriente (4), la cual tiende hacia una configuración troncopiramidal rectangular con estrechamiento pronunciado en su extremo (5) en la que está localizada una nervadura interior (7), que emerge desde uno de los bordes de la boca del tronco piramidal, definido en esta área intermedia, y asociada con los dos bordes laterales adyacentes, una nervadura que, con el lado opuesto de la boca, define un orificio ranurado (8), en sentido transversal, el cual genera una corriente laminar en la emisión de la cera, habiéndose hecho provisión para que la pared del área intermedia (4), opuesta a la nervadura (7) se extienda más allá del orificio ranurado (7) en una paleta arqueada grande (10) con una concavidad que mira hacia fuera lo cual facilita la aplicación de la cera sobre el cuerpo del usuario, una paleta arqueada que está circundada por dos paredes separadoras laterales triangulares (10) que se extienden desde los bordes laterales del pico (9) hasta el extremo (5) del área intermedia y que actúan de contención lateral de la cera, determinando la formación de la misma de una tira de cera aplicada con una anchura constante.,

Description

Uso de derivados de pirazolina en la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de derivados de pirazolina de fórmula general (I), así como de sus sales fisiológicamente aceptables, en la preparación de medicamentos útiles en terapia humana y/o veterinaria para la prevención o el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares, particularmente para el tratamiento de procesos preneoplásicos o neoplásicos, de angiogénesis tumoral, de caquexia y de procesos relacionados con el factor de necrosis tumoral (TNF) y, en general, de cualquier proceso que pueda beneficiarse de la inhibición de la expresión del gen responsable de la síntesis de ciclooxigenasa-2 (COX-2), o bien solos o en combinación con otros productos, produciendo en este último caso una sinergia.

Antecedentes de la invención

En la solicitud de patente número WO 99/62884 se describen compuestos de fórmula general (I) y sus sales fisiológicamente aceptables,

1

como inhibidores de la enzima ciclooxigenasa-2 (COX-2), con aplicación en medicina como antiinflamatorios.

El interés creciente de la regulación del gen responsable de la síntesis de COX-2 deriva de su aplicación no sólo en la respuesta antiinflamatoria, sino también en otros procesos patológicos importantes, tales como proliferación celular y cáncer, regulación de la respuesta inmune, enfermedades degenerativas del cerebro, etc., como se pone de manifiesto en la creciente bibliografía relacionada. Un conjunto de observaciones ha conducido a considerar a los inhibidores de COX-2 como potenciales agentes quimiopreventivos en el cáncer colorrectal (CCR). La elección de COX-2 como diana se basa en la frecuencia de su sobreexpresión: hasta un 90% de los carcinomas y un 40% de los adenomas de colon muestran niveles elevados de ARNm y proteína COX-2 (Eberhart et al.: Gastroenterology, 1994, 107: 1183-1188; Du Bois et al.: Gastroenterology, 1996, 110: 1259-1262; Prescott et al., Cell, 1996, 87: 783-786). Además parece claro que esta sobreexpresión contribuye al fenotipo tumoral en CCR: a) la sobreexpresión de COX-2 se ha relacionado con la inhibición de la apoptosis (Tsujii et al.: Cell, 1995, 83: 493-501); b) la inactivación de COX-2 en ratones Apc(-) está asociada a la inhibición del crecimiento tumoral; c) dos de las alteraciones genéticas mas frecuentes en el cáncer colorrectal, las mutaciones en los genes de supresión tumoral Apc y las mutaciones en los oncogenes ras, están relacionadas con la sobreexpresión de COX-2 (Boolbol et al.: Cancer Res., 1996, 56: 2556-2560; Sheng H. et al.: J. Biol. Chem. 1998, 273 (34): 2120-2127).

En la solicitud de patente PCT/ES00/00245 se describe una línea celular que comprende un constructo de ADN que consiste en la totalidad o parte de una secuencia promotora del gen COX-2 y un gen representativo, conectados operativamente entre sí de manera que dicha secuencia promotora del gen COX-2 dirija la expresión de dicho gen representativo en respuesta a un estímulo adecuado. El procedimiento de ensayo comprende poner en contacto dicha línea celular con el compuesto a ensayar y determinar la existencia de una señal indicativa de la expresión de actividad debida al gen representativo. Este procedimiento se reivindica como adecuado para la búsqueda de inhibidores selectivos de la inducción a nivel transcripcional de COX-2 mediante estímulos apropiados.

Se ha descubierto ahora que los compuestos de fórmula general (I), así como sus sales fisiológicamente aceptables, son especialmente útiles para la preparación de medicamentos de uso en terapia humana y/o veterinaria para la prevención o el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares, particularmente para el tratamiento de procesos preneoplásicos o neoplásicos, de angiogénesis, de caquexia y de procesos relacionados con el factor de necrosis tumoral (TNF) y, en general, de cualquier proceso que pueda beneficiarse de la inhibición de la expresión del gen responsable de la síntesis de ciclooxigenasa-2 (COX-2), o bien solos o en combinación con otros productos, apareciendo en este caso una sinergia.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al uso de pirazolinas derivadas de \Delta^{2}-pirazolina, también conocidas como 4,5-dihidro-1H-pirazoles, de fórmula general (I)

2

en la preparación de un medicamento de uso en terapia humana y/o veterinaria para la prevención o el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares, particularmente para el tratamiento de procesos preneoplásicos o neoplásicos, de angiogénesis, de caquexia y de procesos relacionados con el factor de necrosis tumoral (TNF) y, en general, de cualquier proceso que pueda beneficiarse de la inhibición de la expresión del gen responsable de la síntesis de ciclooxigenasa-2 (COX-2), bien solos o en combinación con otros productos, en cuyo caso aparece una sinergia.

En la fórmula (1)

R_{1} representa un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, ácido carboxílico, carboxilato de alquilo de menos de 1 a 4 átomos de carbono, carboxamida o ciano,

R_{2} representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo,

R_{3}, R_{4}, R_{7} y R_{8}, iguales o diferentes, representan un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo o metoxi,

R_{5} representa un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo, metoxi, trifluorometoxi, metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo,

R_{6} representa un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo, metoxi, trifluorometoxi, metilsulfonilo,

con la condición de que uno de los sustituyentes R_{5} o R_{6} sea un grupo metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo, y

con la condición de que cuando R_{1} representa un grupo metilo,

R_{2} representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo,

R_{3} y R_{8}, iguales o diferentes, representen un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo o trifluorometilo,

R_{4} represente un átomo de hidrógeno, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo o metoxi,

R_{5} represente un átomo de flúor, un grupo trifluorometilo, trifluorometoxi, metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo,

R_{6} represente un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo, metoxi, trifluorometoxi, metilsulfonilo,

R_{7} represente un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo o metoxi.

Los compuestos de fórmula general (I) tienen un centro estereogénico y por tanto pueden prepararse enantioméricamente puros o como racematos. Los racematos de los compuestos (I) pueden resolverse en sus isómeros ópticos mediante procedimientos convencionales, tales como cromatografía de separación quiral o por cristalización fraccionada de sus sales diastereoisoméricas, las cuales pueden obtenerse haciendo reaccionar los compuestos (I) con ácidos o bases enantioméricamente puros. Asimismo, también pueden obtenerse mediante síntesis enantioselectiva utilizando precursores quirales enantioméricamente puros.

La presente invención se refiere también a las sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de fórmula general (I), a las sales de adición de ácidos minerales y orgánicos y a las formadas con metales alcalinos.

Los compuestos de fórmula general (I), así como sus sales fisiológicamente aceptables, inhiben la expresión del gen responsable de la síntesis de ciclooxigenasa-2 (COX-2), como puede mostrarse con un sistema celular de células JURKAT transfectantes estables con el promotor del gen COX-2 asociado al gen de la luciferasa, según el procedimiento descrito en la solicitud de patente PCT/ES00/00245.

Los compuestos de fórmula general (I) pueden utilizarse, administrando una dosis terapéuticamente eficaz, en mamíferos, incluido el hombre, como agentes para la prevención o el tratamiento de procesos preneoplásicos y neoplásicos, la inhibición parcial o total del crecimiento, propagación o metástasis de la neoplasia, así como la destrucción total o parcial de células neoplásicas. Por ejemplo, los compuestos de fórmula general (I) pueden utilizarse en neoplasias tales como cáncer gastrointestinal, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer cervical y cáncer de mama, o para la prevención o el tratamiento de pólipos adenomatosos, incluyendo poliposis familiar.

Los compuestos de fórmula general (I) pueden utilizarse, administrando una dosis terapéuticamente eficaz, en mamíferos, incluido el hombre, como agentes para la prevención o el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis, tales como crecimiento y metástasis tumoral que se basan en un proceso angiogénico, y en otros trastornos tales como retinopatías y endometriosis.

Los compuestos de fórmula general (I) pueden utilizarse, administrando una dosis terapéuticamente eficaz, en mamíferos, incluido el hombre, como agentes para la prevención o el tratamiento de caquexia y otros trastornos en los que está implicado el factor \alpha de necrosis tumoral (TNF-\alpha).

Los derivados de fórmula general (I) pueden prepararse según los procedimientos descritos en la solicitud de patente WO 99/62884. A continuación se describe, a modo de ejemplo, la preparación de 1-(4-aminosulfonilfenil)-5-(2,4-difluorofenil)-4,5-dihidro-3-trifluorometil-1H-pirazol (ejemplo 3) y sus enantiómeros (ejemplos 79 y 80). Las tablas 1 y 2 muestran una familia de compuestos de particular interés que responden a la fórmula general (I), así como sus propiedades fisicoquímicas características.

Ejemplo 3 Preparación de 1-(4-aminosulfonilfenil)-5-(2,4-difluorofenil)-4,5-dihidro-3-trifluorometil-1H-pirazol

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Preparación, vía acetimidoílo, de (E)-1,1,1-trifluoro-4-(2,4-difluorofenil)-3-buten-2-ona

En un matraz a atmósfera seca e inerte se introducen 260 ml de THF anhidro, se enfría a -78ºC y se añaden 225 ml de solución de LDA 2M en THF/n-heptano a una velocidad que permita mantener la temperatura por debajo de -65ºC. A continuación, se añade gota a gota rápidamente dietilmetilfosfonato (43,25 g, 0,225 mol) disuelto en 30 ml de THF y se agita durante 30 minutos a -78ºC. Se añade gota a gota cloruro de N-feniltrifluoroacetimidoílo (46,7 g, 0,225 mol) disuelto en 40 ml de THF y se deja agitar en las mismas condiciones durante 1 hora. Se añade una solución de 2,4-difluorobenzaldehído (33,6 g, 0,236 mol) en 40 ml de THF, se retira el baño frío y se deja que la temperatura vaya subiendo hasta temperatura ambiente. Se deja agitar durante una noche en estas condiciones. A la mañana siguiente, se añaden 450 ml de HCl 2N y se continúa la agitación durante 24 horas. Se elimina el THF en rotavapor y la solución acuosa resultante se extrae con AcOEt (2x200 ml), se lava con solución de NaHCO_{3} al 5% y con solución saturada de NaCl, se seca sobre sulfato sódico, se filtra y se evapora el disolvente en rotavapor. Se obtienen así 54,6 g de líquido bruto rojizo que solidifica. Se destila el producto bruto a una presión de 3,5 kPa y se recoge una fracción de (E)-1,1,1-trifluoro-4-(2,4-difluorofenil)-3-buten-2-ona a 107-114ºC (43 g, 81%). Punto de fusión : 50-51ºC.

IR(KBr, cm^{-1}): 1717, 1602, 1583, 1277, 1146, 1059, 706.

^{1}H-RMN (CDCl_{3}): 6,9 (m, 2H), 7,05 (d, J=16 Hz, 1H, 7,6 (m, 1H), 8,0 (d, J=16 Hz, 1H)

^{13}C-RMN (CDCl_{3}): 105,1 (t, J=26 Hz), 112,6 (dd, J=4, 22 Hz), 116,4 (c, J= 291 Hz), 118,2, 118,5, 131,5 (dd, J=4, 11 Hz), 141,5, 162,5 (dd, J=13, 193 Hz), 165,7 (dd, J=190 Hz), 180 (c, J=36 Hz).

Preparación vía condensación aldólica de (E)-1,1,1-trifluoro-4-(2,4-difluorofenil)-3-buten-2-ona

En un matraz se disuelven 2,4-difluorobenzaldehído (250 g, 1,76 mol), ácido acético glacial (152,5 g, 2,54 mol) y piperidina (152,5 g, 1,79 mol) en 3 l de THF. Se enfría la solución a 5-10ºC y se burbujea en su interior CF_{3}COCH_{3} (\sim140 g, 1,2 mol). Se retira el baño frío, se deja subir la temperatura hasta temperatura ambiente y se deja agitar a dicha temperatura durante 2 horas. Se añade de nuevo CF_{3}COCH_{3} (\sim40 g, 0,36 mol) y se deja agitar durante 2 horas. Se añaden otros \sim40 g y se agita durante otras 2 horas, y así sucesivamente hasta la adición total de aproximadamente 415 g (3,7 mol) de CF_{3}COCH_{3}. Se añade solución de cloruro amónico al 20% (600 ml) y se elimina el disolvente a presión reducida (50ºC, 8 kPa). Se añaden 300 ml de agua y se extrae con AcOEt. La fase orgánica se lava con agua, H_{2}SO_{4} al 5%, agua y se seca sobre sulfato sódico anhidro. Se filtra y se evapora. El producto bruto resultante se destila, se recoge una fracción (3 kPa) (281,4 g 68%) de (E)-1,1,1-trifluoro-4-(2,4-difluorofenil)-3-buten-2-ona de punto de fusión 50-51ºC. IR, ^{1}H-RMN y ^{13}C-RMN idénticos a los del producto obtenido vía acetimidoílo.

Preparación de 1-(4 aminosulfonilfenil)-5-(2,4-difluorofenil)-4,5-dihidro-3-trifluorometil-1H-pirazol

Se calienta a reflujo una solución de clorhidrato de 4-(aminosulfonil)fenilhidrazina (243,8 g, 1,09 mol) y (E)-1,1,1-trifluoro-4-(2,4-difluorofenil)-3-buten-2-ona (281,4 g) en 1.600 ml de ácido acético durante 24 horas en atmósfera de nitrógeno. Se enfría, se vierte lentamente sobre agua-hielo (10-12 l) manteniendo una fuerte agitación y se filtra. Se lava con tolueno (500 ml) y se seca. Se obtienen 328 g de producto bruto (pureza: 95,6%) que se cristaliza en dioxano. Se obtienen 216,7 g de 1-(4-aminosulfonilfenil)-5-(2,4-difluorofenil)-4,5-dihidro-3-trifluorometil-1H-pirazol con una pureza del 98,1%. Las aguas madres de cristalización, una vez concentradas, proporcionan otros 69,3 g con 97,5% de pureza. La unión de estas dos fracciones se recristaliza en isopropanol, proporcionando 267,8 g (61%) de producto molido con un tamaño de partícula <100 \mum, pureza del 99,5% y punto de fusión 161-162ºC.

Análisis elemental:	%C	%H	%N	%F
Calculado	47,41	2,98	10,37	23,43
Obtenido	47,42	2,77	10,35	23,57

IR (KBr, cm^{-1}): 3315, 1179, 3232, 1099, 1617, 1593, 1506, 1326, 1067.

^{1}H-RMN [300 MHz, CDCl_{3}, 25ºC, \delta (ppm)]: 3,0 (dd, J=6,3 y 11,4 Hz, 1H); 3,80 (dd, J=11,4 y 12,6 Hz, 1H); 4,79 (s ancho, 2H); 5,70 (dd, J=6,3 y 12,6 Hz, 1H); 6,8-6,95 (m, 2H); 7,01-7,09 (m, 3H); 7,74 (d, J=8,7 Hz, 2H).

^{1}H-RMN [300 MHz, DMSO-d_{6}, 25ºC, \delta (ppm)]: 3,13 (dd, J=18,5 Hz, 1H); 3,89 (t, J=16 Hz, 1H); 5,96 (dd, J=13, 6 Hz, 1H); 7,03-7,16 (m, 5H); 7,33 (m, 2H); 7,64 (d, J=9 Hz, 2H).

^{13}C-RMN [75 MHz, CDCl_{3}, 25ºC, \delta (ppm)]: 40,2, 57,9, 104,9 (t, J=25 Hz), 112,4 (dd, J=4, 22Hz), 113,5, 120,4 (c, J=269 Hz), 122,1 (d, J=17 Hz), 128, 128,2, 133,5, 139,5 (c, J=38 Hz), 145,8, 159,6 (dd, J=12, 245 Hz), 163 (dd, J=12, 248 Hz).

^{13}C RMN [75 MHz, DMSO-d_{6} 25ºC \delta (ppm)]: 39,7, 58,8, 105,1 (t, J^{C-F}=26 Hz), 112,1 (dd, J^{C-F}=22, 3 Hz), 113,3, 120,9 (c, J^{C-F}=268 Hz), 123,1 (dd, J^{C-F}=14, 4 Hz), 127,4, 130,0 (dd, J^{C-F}=10, 5 Hz), 135,9, 139,0 (c, J^{C-F}=37 Hz), 144,6, 160,0 (dd, J^{C-F}=247, 13 Hz), 162,3 (dd, J^{C-F}=246, 13 Hz).

EM [IE, -70 eV, m/z (%)]: 405 (M^{+}, 100), 386 (4), 341 (7), 292 (14), 156 (26), 139 (16).

Preparación de (+)-1-(4-aminosulfonilfenil)-5-(2,4-difluorofenil)-4,5-dihidro-3-trifluorometil-1H-pirazol (ejemplo 79)

y

(-)-1-(4-aminosulfonilfenil)-5-(2,4-difluorofenil)-4,5-dihidro-3-trifluorometil-1H-pirazol (ejemplo 80)

La mezcla racémica (\pm)-1-(4-aminosulfonilfenil)-5-(2,4-difluorofenil)-4,5-dihidro-3-trifluorometil-1H-pirazol se resuelve en sus enantiómeros mediante cromatografía líquida de alta resolución utilizando una columna CHIRALPAK AS de 10 \mum de tamaño de partícula y dimensiones de 25 x 2 cm (Daicel), fase móvil 0,1% de dietilamina en metano) y caudal de 8 ml/min. Con un tiempo de retención de 7,4 minutos, se obtiene (+)-1-(4-aminosulfonilfenil)-5-(2,4-difluorofenil)-4,5-dihidro-3-trifluorometil-1H-pirazol en forma de un sólido blanco de p.f.: 173-174ºC; pureza enantiométrica 99,9%; [\alpha]_{D}=+183,9 (c=1 CH_{3}OH). Con un tiempo de retención de 9,2 minutos, se obtiene (-)-1-(4-aminosulfonilfenil)-5-(2,4-difluorofenil)-4,5-dihidro-3-trifluorometil-1H-pirazol en forma de un sólido blanco de p.f.: 173-174ºC; pureza enantiométrica >99,9%; [\alpha]_{D}=-189,4 (c=1 CH_{3}OH).

TABLA 1

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\*= fuera del alcance de las reivindicaciones.

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TABLA 2

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En terapia humana, la dosis de administración de los compuestos de la presente invención depende de la gravedad de la afección a tratar. Normalmente, se encontrará entre 10 y 500 mg/día. Los compuestos de la invención se pueden administrar como principio activo único, o junto con otro producto para obtener una sinergia. Los compuestos de la invención, con una formulación farmacéutica adecuada, pueden administrarse por vía oral, transdérmica, parenteral, subcutánea, intranasal, intramuscular o intravenosa. Se describen composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos de fórmula general (I) en la solicitud de patente WO 99/62884.

Evaluación biológica

Los productos de fórmula general (I) son útiles para el tratamiento de procesos preneoplásicos o neoplásicos, de angiogénesis, de caquexia y de procesos relacionados con el factor de necrosis tumoral (TNF) y, en general, de procesos que puedan beneficiarse de la inhibición de la expresión del gen responsable de la síntesis de ciclooxigenasa-2 (COX-2). Para demostrar estas actividades, se indican a continuación, a modo de ejemplo, algunas pruebas farma-
cológicas.

Inhibición de la inducción de COX-2

Para determinar la capacidad de inhibición de la inducción transcripcional de ciclooxigenasa-2, se ha utilizado un sistema celular de células JURKAT transfectantes estables con el promotor del gen COX-2 asociado al gen de la luciferasa. Se han utilizado 3 clones independientes (C3, C7 y F9) que difieren en su actividad luciferasa basal en el intervalo de 4.500 a 180.000 ULR/10^{5} células, que se incrementan en respuesta a agentes estimulantes tales como activadores de tipo protoinflamatorio de rutas de señalización celular como ésteres de forbol (TPA) e ionóforos (ionomicina).

Para el ensayo, se pretrataron las células durante 1 hora con los compuestos a ensayar y a continuación se estimularon con TPA + ionomicina durante 6 horas. A continuación, se obtuvieron extractos celulares en los que se examinó la actividad luciferasa y se determinó la concentración de proteína. La inhibición de la actividad luciferasa da una indicación de la inhibición de la inducción de COX-2.

Como ejemplo de la actividad de los compuestos de fórmula general (I), se muestran a continuación los resultados obtenidos con el compuesto del ejemplo 10, que muestran una clara inhibición de la inducción de COX-2.

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Ejemplo 10 (concentración \mug/ml)	Inhibición de la actividad luciferasa (%)
	Clon C7	Clon C9	Clon F9
0,5	20%	40%	32%
5	55%	75%	65%
50	85%	85%	95%
CI_{50} (\mug/ml)	5,8	0,9	1,8

Actividad antitumoral en carcinoma de colon humano

Se ha estudiado la actividad antitumoral de los compuestos de fórmula general (I) determinando su efecto sobre líneas celulares de carcinoma de colon humano (TD 20 y NC 59). Las dos líneas celulares tienen la proteína K-Ras silvestre. La TD20 contiene una mutación en el gen supresor p53, mientras que la NC59 tiene la proteína p53 silvestre.

Ambas líneas celulares se cultivaron en medio DMEM (Life Technologies) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Life Technologies) a 37ºC y 5% de CO_{2}.

Los ensayos de citotoxicidad se llevaron a cabo usando el kit de XTT (Boehringer-Manheim) que mide la capacidad celular de metabolizar una sal de tetrazoílo a formazano.

Concentración (\muM)	% Viabilidad de células de cáncer colorrectal \pm DE
	NC59	TD20
Ejemplo 3

1	99,64 \pm 0,51	98,58 \pm 2,83
20	76,52 \pm 8,70	84,96 \pm 3,05
30	56,50 \pm 0,25	66,34 \pm 5,84
40	16,74 \pm 10,53	27,38 \pm 4,12
60	1,16 \pm 0,83	1,79 \pm 2,09
100	0 \pm 0	0,69 \pm 0,01
	CI_{50} = 29,87	CI_{50} = 33,87
Ejemplo 10

1	92,09 \pm 9,35	95,03 \pm 8,87
20	76,14 \pm 7,17	90,24 \pm 5,97
40	15,77 \pm 9,37	43,13 \pm 13,77
60	2,59 \pm 1,54	5,42 \pm 4,11
80	1,66 \pm 1,57	3,22 \pm 3,46
	CI_{50} = 27,18 \muM	CI_{50} = 37,92 \muM

Como ejemplo de la actividad de los compuestos de fórmula general (I), los compuestos de los ejemplos 3 y 10 mostraron actividad citotóxica sobre ambas líneas celulares de carcinoma de colon humano. Sus CI_{50} sobre la línea celular NC59 fueron de 30 \muM y 27 \muM y sobre la línea TD20 fueron de 34 \muM y 38 \muM, respectivamente.

Con el objeto de profundizar en el mecanismo de acción de estos compuestos, se estudió la capacidad de inducir apoptosis del compuesto del ejemplo 3 (dosis 100 \muM) en la línea celular tumoral TD20. En estas condiciones, se obtuvo un 20% de células apoptóticas después de 24 h y un 80% después de 48 h, mientras que en células tratadas con vehículo las células apoptóticas no superaron un 1%. Los niveles de citotoxicidad, medidos por XTT, fueron similares a los niveles de apoptosis, lo que sugiere que la actividad citotóxica del ejemplo 3 se debe a su capacidad de inducir apoptosis.

Posteriormente, se estudiaron las rutas de transducción de señal asociadas al proceso apoptótico. Tras exponer las células NC59 a una concentración 100 \muM del compuesto del ejemplo 3, se estudiaron los niveles de expresión de p53, FAK y \beta-actina y el nivel de activación de MAP quinasas, JNK y PKB/Akt, después de 5 y 20 horas de exposición. Los resultados demostraron la activación de rutas de transducción de señales distintas de p53, JNK o p38, que son las rutas activadas por los fármacos genotóxicos convencionales (p. ej. 5-FU).

Resumiendo, puede decirse que los compuestos de los ejemplos 3 y 10 son agentes antitumorales eficaces en el carcinoma de colon humano, lo que sugiere la posibilidad de usar los compuestos de fórmula general (I) no sólo como productos quimiopreventivos, sino también en el cáncer de colon establecido. Además, su efecto antitumoral está mediado por la apoptosis y la activación de las rutas de transducción se efectúa mediante señales distintas de p53, JNK o p38, lo que sugiere que estos compuestos pueden constituir una adición a los protocolos de quimioterapia actual al poseer un mecanismo de acción citotóxica diferente.

Actividad antitumoral en carcinoma mamario

Se ha estudiado la actividad antitumoral de los compuestos de fórmula general (I) determinando su efecto sobre una línea celular de carcinoma de mama (MDAMB 453). Se cultivó la línea celular en medio DMEM (Life Technologies) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Life Technologies) a 37ºC y 5% de CO_{2}.

Concentración (\muM)	% Viabilidad de células de cáncer de mama \pm DE MDAMB 453
Ejemplo 3

1	94,76 \pm 8,71
20	31,52 \pm 9,12
40	12,77 \pm 4,80
60	5,97 \pm 5,06
80	2,84 \pm 1,71
	CI_{50}= 12,87 \muM
Ejemplo 10

1	97,53 \pm 3,25
20	42,75 \pm 9,31
40	33,30 \pm 7,34
60	8,25 \pm 6,82
80	5,8 \pm 4,76
	CI_{50}= 17,88 pM

Como ejemplo de la actividad de los compuestos de fórmula general (I), los compuestos de los ejemplos 3 y 10 mostraron actividad citotóxica sobre la línea celular de carcinoma de mama, con una CI_{50} de 3 \muM (ejemplo 3), y 18 \muM (ejemplo 10).

Resumiendo, puede decirse que los compuestos de los ejemplos 3 y 10 son agentes antitumorales eficaces en el carcinoma de mama, lo que sugiere la posibilidad de usar los compuestos de fórmula general (I) no sólo como productos quimiopreventivos, sino también en cáncer de mama establecido.

Actividad antiagiogénica

Esta actividad se ha estudiado determinando la inhibición de la inducción de la expresión de VEGF. La expresión incrementada del factor de crecimiento vasculoendotelial (VEGF) se ha relacionado con la progresión tumoral y la angiogénesis. El VEGF es un factor proangiogénico, promueve la mitogénesis, la migración y un incremento de la permeabilidad vascular en células endoteliales in vitro. Recientemente, se ha puesto de manifiesto que COX-2 puede regular el proceso de angiogénesis inducido por células de cáncer de colon, incrementando la expresión de factores proangiogénicos por dichas células. La inhibición de COX-2 puede bloquear este proceso, inhibiendo la expresión de algunos de estos factores, tales como VEGF.

A su vez, el VEGF induce también la expresión del factor tisular (TF) en la membrana de monocitos, células epiteliales y endotelio. Aunque la función principal del TF es iniciar la cascada de coagulación, puede transducir señales intracelulares que participan en la metástasis y la angiogénesis asociadas a tumores. El TF facilita el crecimiento del tumor in vivo al favorecer la angiogénesis. Se ha demostrado que las células tumorales transfectadas con TF producen mayor vascularización.

Para el estudio de la actividad antiagiogénica de los productos de fórmula general (I), se ha estudiado la expresión del promotor de VEGF en situación basal y estimulada usando la línea celular Caco-2 de carcinoma de colon humano, transfectada de forma transitoria con un vector que contiene el promotor del gen VEGF humano. Una vez establecidas las condiciones del ensayo, se estudió la capacidad inhibitoria de la expresión de los genes VEGF y TF del producto en estudio midiendo la actividad luciferasa de sus promotores.

En el ensayo se usaron 1,25 x 10^{5} células Caco-2 transfectadas transitoriamente con los ADN correspondientes en 500 \mul de medio DEMEM- 10% FCS en placas de 24 pocillos. Las células se pretrataron durante 1 hora con los compuestos a ensayar, y a continuación se estimularon con TPA durante 16 horas. Posteriormente, se obtuvieron extractos celulares en los que se examinó su actividad luciferasa, determinando la concentración de proteína.

A modo de ejemplo de la actividad de los compuestos de fórmula general (I), se proporcionan a continuación los resultados obtenidos con los compuestos de los ejemplos 3 y 10, que muestran un claro efecto antiangiogénico, al inhibir tanto VEGF como TF.

Compuesto	Inhibición de la inducción de
	VEGF CI_{50} (\mug/ml)	TF CI_{50} (\mug/ml)
Ejemplo 3	20	25
Ejemplo 10	25	22

Inhibición del factor de necrosis tumoral a (TNF-\alpha)

El factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha) es una citocina, un potente proinflamatorio e inmunomodulador implicado en diferentes afecciones inflamatorias tales como artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple y caquexia asociada al cáncer, así como en inmunodeficiencia humana asociada a infecciones víricas. El TNF-\alpha se describió por primera vez por su capacidad de inducir necrosis hemorrágica de ciertos tumores en animales tratados con lipopolisacáridos (LPS). También se le llamó caquectina, al ser un mediador en circulación del síndrome de desgaste relacionado con ciertas enfermedades parasitarias. La caquexia, o el desgaste resultante del TNF, se relaciona con su propiedad de aumentar la lipasa de lipoproteína, y por esta razón agota las células adiposas. El TNF-\alpha se produce de modo predominante por macrófagos cuando se activan por una gran variedad de estímulos, tales como la pre-
sencia de proteínas bacterianas o micobacterianas, antígenos fúngicos, virus, complemento C5a o interferón gamma.

El TNF-\alpha es uno de los mediadores del shock endotóxico bacteriano Gram-, y parece ser responsable de fiebre, acidosis metabólica, diarrea, hipertensión, coagulación vascular diseminada y en ciertos casos incluso la muerte. Además, el TNF-\alpha puede conducir a la activación de neutrófilos., inducir la expresión génica de IL-1, aumentar la expresión de antígenos MHC (de histocompatibilidad mayor de clase I) en células endoteliales y está implicado en la resorción de la médula ósea y en la producción de PGE_{2} y de colagenasa de las células sinoviales y fibroblastos humanos. Por tanto, los productos capaces de antagonizar la actividad de este mediador pueden ser de valor clínico al combatir sus efectos fatales (C.A. Mc Intyre et al.: "Drugs News and Perspectives", 1992, 5 (4): 207-213; A.J.H. Gearing et al.: Nature 1994, 370: 555-557; M.A. Pahlavani: Druqs of Today 1993, 29 (8): 525-533).

El estudio de la actividad inhibitoria de TNF-\alpha se ha realizado según el procedimiento descrito por P. Klemen et al. (Europ. J. Pharmacol. 1995, 281: 69-74), consistente en determinar la producción de TNF-\alpha en la zona localizada en la que la inflamación es aguda, usando específicamente el modelo de la bolsa de aire inflada con zimosán en ratones. Se determinó el TNF-\alpha presente en el exudado inflamatorio producido en dicha bolsa como resultado de la estimulación por zimosán. La determinación analítica del TNF-\alpha se realizó mediante ELISA.

A modo de ejemplo de la actividad de los compuestos de fórmula general (I), se muestran a continuación los resultados obtenidos con el compuesto del ejemplo 10, que muestra una considerable actividad inhibitoria del TNF-\alpha, muy bien correlacionada con la dosis.

Ejemplo 10	Modelo de bolsa de aire en ratones.
Dosis (mg/kg, i.p.)	% Inhibición de TNF-\alpha en exudado inflamatorio estimulado con zimosán
0,039	12,6 \pm 2,6
0,156	15,7 \pm 4,9
0,625	46,8 \pm 12,5
2,5	58,8 \pm 13,6
DE-50 = 1,20 mg/kg, i.p.
(r = 0,957) (*)
i.p. : intraperitoneal

Claims

1. Uso de un derivado de pirazolina de fórmula general (I)

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24

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en la que

R_{2} representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo,

con la condición de que cuando R_{1} representa un grupo metilo,

R_{2} represente un átomo de hidrógeno o un grupo metilo,

R_{5} represente un átomo de flúor, un grupo trifluorometilo, trífluorometoxi, metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo,

R_{7} represente un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo o metoxi; o una de sus sales fisiológicamente aceptables,

en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares, particularmente para la prevención o el tratamiento de procesos preneoplásicos o neoplásicos, de angiogénesis tumoral, de caquexia o de procesos relacionados con el factor de necrosis tumoral (TNF) y, en general, de procesos que puedan beneficiarse de la inhibición de la expresión del gen responsable de la síntesis de ciclooxigenasa-2 (COX-2) en mamíferos, incluido el hombre.

2. Uso según la reivindicación 1 de un compuesto de fórmula general (I) seleccionado de entre el grupo formado por:

[4] 4,5-dihidro-1-(4-metilfenil)-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[6] 4, 5-dihidro-5-fenil-1-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[7] 4,5-dihidro-5-(4-metilfenil)-1-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[9] 4,5-dihidro-5-(4-fluorofenil)-1-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[10] 4,5-dihidro-1-(4-fluorofenil)-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[12] 5-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1-(4-metilsulfonifenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[17] 4,5-dihidro-5-(2-fluorofenil)-1-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[19] 4,5-dihidro-5-(3-fluorofenil)-1-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[25] 5-(3,4-difluorofenil)-4,5-dihidro-1-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[27] 4,5-dihidro-5-(4-fluorofenil)-3-metil-1-(4-metilsulfonilfenil)-1H-pirazol;

[29] 4,5-dihidro-3-metil-5-(4-metilfenil)-1-(4-metilsulfonilfenil)-1H-pirazol;

[32] 4,5-dihidro-5-fenil-1-(4-metilsulfonilfenil)-1H-pirazol;

[33] 4,5-dihidro-3-metil-1-(4-metilsulfonilfenil)-5-(4-trifluorometilfenil)-1H-pirazol;

[36] ácido 4,5-dihidro-5-(4-metilfenil)-1-(4-metilsulfonilfenil)-1H-pirazol-3-carboxílico;

[39] 4,5-dihidro-5-(4-metilfenil)-1-(4-metilsulfonilfenil)-1H-pirazol-3-carboxilato de metilo;

[42] 4,5-dihidro-5-(4-metilfenil)-1-(4-metilsulfonilfenil)-1H-pirazol-3-carboxamida;

[43] 3-ciano-4,5-dihidro-5-(4-metilfenil)-1-(4-metilsulfonilfenil)-1H-pirazol;

[59] 1-(2,4-difluorofenil)-4, 5-dihidro-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[65] 1-(4-clorofenil)-4,5-dihidro-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[66] 4,5-dihidro-1-fenil-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[67] 4,5-dihidro-1-(2-fluorofenil)-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[68] 1-(4-cloro-2-metilfenil)-4,5-dihidro-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[69] 4,5-dihidro-1-(3-fluorofenil)-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[70] 4,5-dihidro-1-(3-metilfenil)-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[71] 4, 5-dihidro-1-(2,4-dimetilfenil)-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[72] 1-(2-clorofenil)-4,5-dihidro-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[73] 4,5-dihidro-1-(2-metilfenil)-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[74] 1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[75] 4,5-dihidro-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1-(2-trifluorometilfenil)-1H-pirazol;

[76] 5-(4-aminosulfonilfenil)-4,5-dihidro-1-(4-fluorofenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[77] 4,5-dihidro-1-fenil-3-metil-5-(4-metilsulfonilfenil)-1H-pirazol;

[78] 4,5-dihidro-1-(4-fluorofenil)-5-(4-metilsulfonilfenil)-1H-pirazol;

[81] (+)-4,5-dihidro-1-(4-fluorofenil)-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[82] (-)-4, 5-Dihidro-1-(4-fluorofenil)-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[83] (+)-1-(2,4-difluorofenil)-4,5-dihidro-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

[84] (-)-1-(2,4-difluorofenil)-4,5-dihidro-5-(4-metilsulfonilfenil)-3-trifluorometil-1H-pirazol;

o una de sus sales fisiológicamente aceptables; en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares, particularmente para la prevención o el tratamiento de procesos preneoplásicos o neoplásicos, de angiogénesis tumoral, de caquexia y de procesos relacionados con el factor de necrosis tumoral (TNF) y, en general, de procesos que puedan beneficiarse de la inhibición de la expresión del gen responsable de la síntesis de ciclooxigenasa-2 (COX-2) en mamíferos, incluido el hombre.

3. Uso según la reivindicación 1 de un compuesto de fórmula general (I), o una de sus sales fisiológicamente aceptables, junto con otro producto usado habitualmente para el tratamiento de neoplasias, produciendo en este caso una sinergia, en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares, particularmente para el tratamiento de procesos preneoplásicos o neoplásicos, de angiogénesis tumoral, de caquexia y de procesos relacionados con el factor de necrosis tumoral (TNF) y, en general, de procesos que puedan beneficiarse de la inhibición de la expresión del gen responsable de la síntesis de ciclooxigenasa-2 (COX-2) en mamíferos, incluido el hombre.