ES2240957T3 - Tecnicas y composicicones de deteccion y evaluacion de la transduccion intracelular de una señal extracelular. - Google Patents
Tecnicas y composicicones de deteccion y evaluacion de la transduccion intracelular de una señal extracelular.Info
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Abstract
SE MUESTRA LA TRANSCRIPCION BASADA EN ENSAYOS QUE IDENTIFICAN SEÑALES EXTRACELULARES QUE MODULAN LA ACTIVIDAD DE PROTEINAS DE LA SUPERFICIE CELULAR. LAS SEÑALES CELULARES SE IDENTIFICAN MEDIANTE LA MEDICION DE LA CANTIDAD DE TRANSCRIPCION DE UN GEN INFORMANTE EN UNA CELULA RECOMBINANTE QUE EXPRESA LA PROTEINA DE LA SUPERFICIE CELULAR Y CONTIENE DNA CODIFICANDO AL GEN INFORMANTE BAJO EL CONTROL TRANSCRIPCIONAL DE UN PROMOTOR QUE ES REGULADO, DIRECTA O INDIRECTAMENTE, POR LA PROTEINA DE LA SUPERFICIE CELULAR. LOS ENSAYOS PROPORCIONAN UN MEDIO PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS FARMACEUTICOS POTENCIALES QUE PUEDEN SER USADOS PARA TRATAR ENFERMEDADES EN VIRTUD DE SUS EFECTOS AGONISTAS O ANTAGONISTAS SOBRE LA PROTEINA DE LA SUPERFICIE CELULAR. TAMBIEN SE PROPORCIONAN LAS CELULAS RECOMBINANTES QUE EXPRESAN RECEPTORES EN LA SUPERFICIE CELULAR Y QUE CONTIENEN CONSTRUCCIONES DEL GEL INFORMANTE QUE INCLUYEN ELEMENTOS REGULADORES TRANSCRIPCIONALES QUE SON RESPONSABLES DE LA ACTIVIDAD DE LOS RECEPTORES DE LASUPERFICIE CELULAR.
Description
Técnicas y composiciones de detección y
evaluación de la transducción intracelular de una señal
extracelular.
Esta invención se relaciona con métodos de
identificación y evaluación de las propiedades farmacológicas de
compuestos que modulan las actividades de las proteínas de la
superficie celular, a saber, de los receptores copulados a proteína
G. Esta invención se relaciona también con ensayos que valoran la
transducción intracelular de una señal extracelular usando células
recombinantes que se modifican por introducción de un gen
informador bajo el control de un promotor regulable y que expresan
proteínas de la superficie celular cuyas actividades están
moduladas por la señal extracelular y cuyas actividades indirecta o
directamente regulan la expresión del promotor.
En particular, esta invención se relaciona con
métodos para detectar y valorar la capacidad de substancias para
actuar como agonistas o antagonistas de la actividad de receptores
específicos localizados en la superficie celular, a saber, de
receptores copulados a proteína G.
Los organismos eucarióticos están compuestos por
una multitud de células, tejidos y órganos que deben reaccionar
rápidamente y de un modo concertado a los estímulos ambientales,
incluyendo estímulos externos e internos, y a los estímulos
intercelulares e intracelulares. Para que los organismos
eucarióticos lo hagan, se han desarrollado mecanismos y rutas
bioquímicas para conseguir respuestas rápidas y concertadas. Las
proteínas de la superficie celular que se extienden por la membrana
celular proporcionan un medio para conseguir estas respuestas.
Las proteínas de la superficie celular permiten
la transducción intracelular de señales extracelulares. Las
proteínas de la superficie celular proporcionan a las células
eucarióticas, así como a las procarióticas, un medio para detectar
señales extracelulares y transducir dichas señales intracelularmente
de un modo que da como resultado en último lugar una respuesta
celular o una respuesta tisular u orgánica concertada. Las
proteínas de la superficie celular, transmitiendo intracelularmente
información concerniente al ambiente extracelular a través de rutas
intracelulares específicas, inducen una respuesta apropiada a un
estímulo particular. La respuesta puede ser inmediata y
transitoria, lenta y mantenida, o alguna mezcla de éstas. En virtud
de una serie de proteínas de superficie de membrana variadas, las
células eucarióticas son exquisitamente sensibles a su ambiente.
Las moléculas de señales extracelulares, tales
como las hormonas del crecimiento, los vasodilatadores y los
neurotransmisores, ejercen sus efectos, al menos en parte, a través
de la interacción con las proteínas de la superficie celular. Por
ejemplo, algunas moléculas de señales extracelulares causan cambios
en la transcripción de genes diana mediante cambios en los niveles
de segundos mensajeros, tales como el AMPc. Otras señales alteran
indirectamente la expresión génica activando la expresión de genes,
tales como los genes inmediatos-precoces que
codifican para proteínas reguladoras, que a su vez activan la
expresión de otros genes que codifican para proteínas reguladoras de
la transcripción. Por ejemplo, la expresión de genes neuronales
está modulada por numerosas señales extracelulares, incluyendo los
neurotransmisores y la actividad eléctrica de la membrana. Las
señales trans-sinápticas causan respuestas rápidas
en neuronas, que se producen a lo largo de un período de tiempo que
varía entre milisegundos, tales como la apertura de canales abiertos
por ligandos, y segundos y minutos, tales como los fenómenos
mediados por segundos mensajeros. Los genes en células neurales que
responden a la estimulación trans-sináptica y a la
actividad eléctrica de la membrana incluyen genes, llamados genes
inmediatos- precoces, cuya transcripción se activa rápidamente en
cuestión de minutos y de forma transitoria (véase, por ejemplo,
Sheng y col. (1990), Neuron 4: 477-485) y
genes cuya expresión requiere síntesis de proteínas y cuya
expresión es inducida o alterada en el transcurso de horas.
Los receptores y los canales iónicos de la
superficie celular están entre las proteínas de la superficie
celular que responden a señales extracelulares e inician los
sucesos que conducen a esta variada expresión génica y respuesta.
Los canales iónicos y los receptores localizados en la superficie
celular son proteínas de la membrana de la superficie celular
ubicuas y fisiológicamente importantes. Tienen un papel central en
la regulación de los niveles intracelulares de diversos iones y
agentes químicos, muchos de los cuales son importantes para la
viabilidad y función de la célula.
Los canales iónicos, que aparecen en una amplia
variedad de organismos, incluidos los hongos, las plantas y los
animales, son proteínas que se extienden por la membrana y que
permiten la entrada controlada de diversos iones en las células
desde el fluido extracelular. Funcionan como poros con compuerta en
la membrana celular y permiten el flujo de iones en gradientes
eléctricos o químicos. Los canales iónicos se clasifican en base al
ion que entra en la célula a través del canal.
La modulación del transporte iónico de
transmembrana es con frecuencia el fenómeno primario en el
acoplamiento de las señales extracelulares a los fenómenos
intracelulares. Los flujos iónicos tienen papeles esenciales en el
estímulo-secreción, el
estímulo-mitosis y el
estímulo-contracción (véase Curran y col. (1986),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8521-8524).
Por ejemplo, la apertura por voltaje de los iones calcio media en
el acoplamiento de los estímulos despolarizantes de la membrana a
la activación transcripcional del gen c-fos.
La elevación del calcio intracelular activa un sistema de
calmodulina/calmodulina kinasa que induce la expresión de
c-fos.
Los canales de sodio son responsables de la fase
de elevación del potencial de acción en células excitables. Los
canales de sodio sienten el campo eléctrico de transmembrana y
responden abriendo un canal iónico de transmembrana con
especificidad por el Na^{+}.
Los canales de sodio han sido estudiados y están
bien caracterizados. Se han clonado los genes codificantes del canal
del sodio, que es una glicoproteína, a partir de numerosas fuentes
y se han usado para expresar corrientes de sodio dependientes del
voltaje cuando se inyectan en oocitos de Xenopus (véase Noda
y col. (1986), Nature 322: 826-828.
Los canales de calcio son proteínas de múltiples
subunidades que se extienden por la membrana y que permiten la
entrada controlada de iones Ca^{+2} en las células desde el
fluido extracelular. Todas las células a través de todo el reino
animal, y al menos algunas células bacterianas, fúngicas y
vegetales, poseen uno o más tipos de canales de calcio.
El tipo más común de canal de calcio es
dependiente del voltaje. En un canal dependiente del voltaje, la
"apertura" para permitir que se inicie un influjo de iones
Ca^{+2} hacia el interior de las células requiere una
despolarización a un cierto nivel de la diferencia de potencial
entre el interior de la célula portadora del canal y el ambiente
extracelular. La velocidad de influjo de Ca^{+2} hacia el
interior celular depende de esta diferencia de potencial. Todas las
células "excitables" de animales, tales como las neuronas del
sistema nervioso central, las células de los nervios periféricos y
las células musculares, incluyendo las de los músculos esqueléticos,
las de los músculos cardíacos y las de los músculos lisos venosos y
arteriales, tienen canales de calcio dependientes del voltaje. Se
piensa que los canales de calcio dependientes del voltaje consisten
en dos grandes subunidades, de entre aproximadamente 130 y
aproximadamente 200 kilodaltons ("kD") de peso molecular, y una
serie (generalmente se piensa que de una a tres) de diferentes
subunidades más pequeñas, de menos de aproximadamente 60 kD de peso
molecular. Al menos una de las subunidades mayores y posiblemente
algunas de las menores están glicosiladas. Algunas de las
subunidades son capaces de fosforilarse.
Los canales de Ca^{2+} dependientes del voltaje
regulan la función celular en células excitables en muchos tejidos,
incluyendo el cerebro y las células musculares. En las células
excitables, estos canales de calcio median en la despolarización
dependiente de calcio y traducen los cambios en el potencial de
membrana en una señal de calcio intracelular que inicia funciones
celulares específicas.
Los antagonistas del calcio bloquean el flujo a
través de los canales del calcio y se unen a distintos sitios, que
se llaman el receptor de antagonistas del calcio. Los fármacos
antagonistas del Ca^{2+} se unen específicamente a los canales
del Ca^{2+} y se usan para tratar enfermedades cardiovasculares.
Se sabe que una variedad de compuestos orgánicos, tales como los
derivados de 1,4-dihidropiridina (DHP), modulan el
flujo iónico a través de los canales de calcio lentos de tipo L. El
canal de calcio de tipo L sensible a DHP es una ruta de entrada
principal del Ca^{2+} extracelular.
Entre los canales iónicos abiertos por ligandos,
se incluyen los receptores nicotínicos de acetilcolina, los
receptores del ácido gamma-aminobutírico
("GABA") y los receptores de aminoácidos excitatorios.
Debido a las consecuencias para la salud de la
nicotina derivada del tabaco, que es un análogo de
neurotransmisores, el receptor nicotínico de acetilcolina, que se
expresa en el sistema nervioso central, ha sido ampliamente
estudiado. El receptor nicotínico de acetilcolina es un canal iónico
abierto por ligando que se une al neurotransmisor, la acetilcolina
("ACh") y media en la transmisión sináptica entre nervio y
músculo (véase, por ejemplo, Claudio y col. (1987), Science
238: 1688-1694). El receptor contiene cuatro
cadenas polipeptídicas, \alpha, \beta, \tau y \delta, con
una estequiometría \alpha_{2}\beta\tau\delta. Estudios de
clonación han identificado varios genes que codifican para las
diversas subunidades. Los genes tienen distintos patrones de
expresión en diversos tejidos y, por lo tanto, forman una variedad
de subtipos de receptores, que son farmacológica y funcionalmente
diversos.
La línea celular PC12, que es una línea de
células de feocromocitoma de rata, expresa tanto receptores de
acetilcolina nicotínico como muscarínicos. El
proto-oncogén c-fos y la
actina son inducidos en cuestión de minutos tras la unión de
agonistas nicotínicos a sus receptores en células PC12. El gen
c-fos es también inducido por tratamiento de
células PC12 con factor de crecimiento de los nervios ("NGF").
La inducción por nicotina y NGF, sin embargo, exhibe diferentes
dependencias del flujo de Ca^{+2} extracelular hacia el interior
de la célula. La inducción por nicotina se basa en el flujo de los
canales de Ca^{2+}, mientras que la inducción por NGF es
dependiente del Ca^{2+} extracelular.
Los receptores localizados en la superficie
celular son proteínas que se extienden por la membrana y que se unen
a moléculas de señalización extracelulares o detectan cambios en el
ambiente extracelular y transmiten la señal a través de rutas de
transducción de señal para producir una respuesta celular. Los
receptores de la superficie celular se unen a polipéptidos de señal
circulantes, tales como factores de crecimiento y hormonas, como
etapa de iniciación en la inducción de numerosas rutas
intracelulares. Los receptores se clasifican en base al tipo
particular de ruta que se induce. Se incluyen entre estas clases de
receptores los que se unen a factores de crecimiento y tienen
actividad intrínseca de tirosina kinasa, tales como los receptores
del factor de crecimiento que se une a heparina ("HBGF"), y los
que se copulan a proteínas efectoras a través de proteínas
reguladoras que se unen a nucleótidos de guanina, a los que se hace
referencia como receptores copulados a proteínas G y proteínas G,
respectivamente.
Las rutas de señalización de transmembrana de
proteínas G consisten en tres proteínas: receptores, proteínas G y
efectores. Las proteínas G, que son los intermediarios en las rutas
de señalización de transmembrana, son heterómeros y consisten en
subunidades \alpha, \beta y \gamma. Entre los miembros de una
familia de proteínas G, las subunidades \alpha difieren. Las
funciones de las proteínas G se regulan por la asociación cíclica de
GTP con la subunidad \alpha, seguido de hidrólisis de GTP a GDP y
disociación del GDP.
Los receptores copulados a proteínas G son una
clase diversa de receptores que median en la transducción de señal
uniéndose a proteínas G. La transducción de señal se inicia por
unión de ligandos al receptor de la membrana celular, que estimula
la unión del receptor a la proteína G. La interacción
receptor-proteína G libera GDP, que se une
específicamente a la proteína G y permite la unión de GTP, que
activa la proteína G. La proteína G activada se disocia del
receptor y activa la proteína efectora, que regula los niveles
intracelulares de segundos mensajeros específicos. Como ejemplos de
dichas proteínas efectoras, se incluyen la adenil ciclasa, la
guanil ciclasa, la fosfolipasa C y otras.
Se sabe que los receptores, que son
glicoproteínas, copulados a proteínas G, comparten cierta
similitudes y homologías estructurales (véanse, por ejemplo,
Gilman, A.G., Ann. Rev. Biochem. 56: 615-649 (1987);
Strader, C.D. y col., The FASEB Journal 3:
1825-1832 (1989); Kobilka, B.K. y col., Nature 329:
75-79 (1985), y Young y col., Cell 45:
711-719 (1986)). Entre los receptores copulados a
proteínas G que han sido identificados y clonados, están el receptor
de la substancia K, el receptor de angiotensina, los receptores
\alpha- y \beta-adrenérgicos y los receptores
de serotonina. Los receptores copulados a proteínas G comparten una
unidad estructural conservada. Las características estructurales
generales y comunes de los receptores copulados a proteínas G son
la existencia de siete tramos hidrofóbicos de aproximadamente
20-25 aminoácidos cada uno rodeados por siete
regiones hidrofílicas de longitud variable. Se ha postulado que
cada una de las siete regiones hidrofóbicas forma una
\alpha-hélice de transmembrana y que las regiones
hidrofílicas intermedias forman bucles expuestos de forma alternante
intracelular y extracelularmente. El tercer bucle citosólico entre
los dominios de transmembrana cinco y seis es el dominio
intracelular responsable de la interacción con las proteínas G.
Se sabe que los receptores copulados a proteínas
G son inducibles. Esta inducibilidad fue originalmente descrita en
eucariontes inferiores. Por ejemplo, el receptor de AMPc del moho
del limo celular, Dictyostelium, es inducido durante la
diferenciación (Klein y col., Science 241: 1467-1472
(1988). Durante la ruta de diferenciación de Dictyostelium
discoideum, el AMPc induce la expresión a alto nivel de su
receptor copulado a proteínas G. Este receptor transduce la señal
para inducir la expresión de otros genes implicados en la
quimiotaxis, lo que permite que los agregados multicelulares se
alineen, se organicen y formen tallos (véanse Firtel, R.A. y col.,
Cell 58: 235-239 (1989), y Devreotes, P., Science
245: 1054-1058 (1989)).
Los factores de crecimiento polipeptídicos son
modulares de la proliferación y diferenciación celular cuyas
funciones biológicas están mediadas por la interacción del factor
de crecimiento con receptores de la superficie celular y las
posteriores alteraciones en la expresión génica. Los factores de
crecimiento se unen a receptores específicos y parecen inducir la
fosforilación de la tirosina y la síntesis de ARNm
c-fos. Además, al menos algunos factores de
crecimiento, tales como el factor de crecimiento derivado de
plaquetas (Yeh y col. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
84: 2317) y el factor-2 de crecimiento que se
une a la heparina o el factor de crecimiento de fibroblastos básico
(véase Bouche y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
84: 6770), se translocan al núcleo.
La activación de los receptores de factores de
crecimiento por interacción con factores de crecimiento específicos
o con agentes tales como el acetato místrico de forbol ("PMA")
activa la proteína kinasa C, que es una familia de proteína kinasas
activadas por fosfolípidos y calcio. Esta activación da lugar a la
transcripción de una variedad de genes codificantes de factores de
transcripción proto-oncogénicos, incluyendo
c-fos, c-myc y
c-jun, proteasas, inhibidores de proteasas,
incluyendo la colagenasa de tipo I y el inhibidor del activador del
plasminógeno, y moléculas de adhesión, incluyendo la molécula I de
adhesión intercelular. La activación de la proteína kinasa C
antagoniza la actividad de los factores de crecimiento mediante la
rápida fosforilación de los receptores de los factores de
crecimiento, que reduce así la actividad de la tirosina kinasa.
La interacción del factor de crecimiento de los
nervios ("NGF") con su receptor es típica de la variedad de
respuestas que una señal extracelular tal induce. El NGF es una
hormona de crecimiento polipeptídica necesaria para la
diferenciación y el crecimiento de la neurona sensorial derivada de
las crestas neurales. El NGF se une a su receptor específico de la
superficie celular y se transporta de un modo retrógrado al cuerpo
celular (véase Changelian y col. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86: 377-381). Esto inicia una
cascada de sucesos intracelulares, que culminan en un fenotipo
diferenciado. Se usan células PC12, que son una línea de células de
feocromocitoma de rata, como modelo para el estudio de la
diferenciación mediada por NGF. Cuando se tratan con NGF, las
células PC12 cambian de células de tipo cromafín adrenal replicante
a células de tipo neurona simpática eléctricamente excitable.
Concomitantemente con los cambios fenotípicos,
hay inducción y expresión de genes específicos. La unión de NGF a
células PC12 induce la expresión inmediata y rápida de determinados
genes, incluyendo los genes c-fos,
NGF1-A y NGF1-B, a los que se hace
referencia como genes precoces. Se piensa que dichos genes precoces
codifican para reguladores transcripcionales. El producto del gen
NGF1-A contiene dominios de "dedos de zinc" que
se repiten en tándem y que son característicos de proteínas que se
unen a ADN y la proteína NGF1-B es homóloga a
miembros de la familia de receptores de glucocorticoides y, por lo
tanto, pueden funcionar como un modulador dependiente de ligando de
la transcripción. El producto del gen c-fos,
FOS, parece funcionar como una molécula reguladora
transcripcional.
Como se ha discutido anteriormente, la inducción
de la expresión del gen c-fos es un fenómeno
común a una serie de rutas de respuesta que se inician por la
actividad de una variedad de proteínas de la superficie celular.
El producto génico c-fos,
FOS, se asocia con el activador de la transcripción JUN, que es el
producto del gen c-jun, para formar un
complejo que forma un complejo de activación de la transcripción,
AP-1. La transcripción tanto de
c-fos como de c-jun es
inducida rápida y transitoriamente después de la estimulación. Los
ARNm inducidos se acumulan durante 1-2 horas en el
citoplasma, donde se traducen las proteínas FOS y JUN, que tienen
una vida corta, y se translocan después al núcleo, para formar un
complejo proteico heterodimérico que se une al elemento regulador
del ADN, el sitio de unión a AP-1.
Los genes c-fos y
c-jun son miembros de familias génicas que
codifican para proteínas que participan en la formación de complejos
heterodiméricos que interaccionan con los sitios de unión a
AP-1. El factor de transcripción
AP-1 está compuesto por varios complejos proteicos
cuyas concentraciones cambian con la estimulación celular. Estos
complejos interaccionan específicamente con unidad de secuencia
nucleotídica núcleo de siete bases, que se sabe que es un
constituyente relativamente común de elementos reguladores
transcripcionales tanto positivos como negativos y que se requiere
para niveles tanto basales como inducidos de expresión génica.
Los productos génicos, FOS y JUN, cooperan en la
regulación de genes diana que subyacen a muchas respuestas celulares
y adaptativas al ambiente. Están implicados en una serie de
procesos neurofisiológicos. Por ejemplo, en células PC12, FOS y JUN
son inducidos por estímulos farmacológicos, eléctricos, quirúrgicos
y fisiológicos, factores neurotróficos, neurotransmisores,
condiciones despolarizantes y otros agentes que causan un influjo de
iones Ca^{2+} a través de canales de Ca^{2+} dependientes de
voltaje. Estos estímulos o señales causan la inducción de
c-fos por interacción con elementos
reguladores localizados en las regiones flanqueantes 5' del gen.
Algunos estímulos extracelulares también conducen a cambios en el
grado y tipo de modificación post-traducción, que
implica fosforilación de la serina y de la treonina, de la proteína
FOS.
Así, la inducción de c-fos
implica distintas rutas de segundos mensajeros que actúan mediante
elementos reguladores independientes y que modifican
diferencialmente el producto génico resultante, FOS, que a su vez
interacciona de diferentes maneras con proteína JUN diferencialmente
modificada. Por lo tanto, una multitud de fenómenos extracelulares
inducen la expresión de un pequeño número de proteínas inducibles
que forman una variedad de complejos proteicos que pueden unirse
diferencialmente a elementos reguladores de ADN que contienen sitios
de unión a AP-1.
Por lo tanto, numerosas proteínas de la
superficie celular pueden actuar por rutas de transducción
solapantes y transducir señales extracelulares que en último lugar
inducen una variedad de respuestas.
Las proteínas de la superficie celular, por lo
tanto, juegan un importante papel fisiológico. Existen muchos usos
farmacológicos potenciales para compuestos que interaccionan con, y
modulan, la actividad de las proteínas de la superficie celular.
Por ejemplo, los canales del calcio tienen un papel central en la
regulación de los niveles intracelulares de Ca^{2+}, que influyen
en la viabilidad y función celular. Las concentraciones de
Ca^{2+} intracelulares están implicadas en una serie de procesos
vitales en animales, tales como la liberación de neurotransmisores,
la contracción muscular, la actividad marcapasos y la secreción de
hormonas y otras substancias. Otras moléculas de la superficie
celular tienen también papeles fisiológicos vitales. Por ejemplo,
el receptor nicotínico de acetilcolina abierto por ligandos puede
mediar en los efectos perjudiciales de la nicotina derivada del
tabaco. Se cree que los factores de crecimiento y otros mitógenos
que inducen la proliferación celular y el crecimiento celular
tienen un papel en el crecimiento de tumores, que frecuentemente
llevan receptores de la superficie celular identificables
específicos para factores de crecimiento y otras señales
extracelulares.
Se piensa que una serie de compuestos útiles en
el tratamiento de diversas enfermedades en animales, incluidos los
humanos, ejercen sus efectos beneficiosos por sus interacciones con
las proteínas de la superficie celular. Los vasodilatadores y otros
fármacos cardiovasculares modulan las actividades de los canales de
calcio dependientes de voltaje. Muchos de estos compuestos se unen
a los canales del calcio y bloquean el influjo de Ca^{2+} a las
células, o reducen su velocidad, en respuesta a la despolarización
de la membrana celular. Se han usado factores de crecimiento para
dirigir toxinas a células tumorales que expresan receptores de
factores de crecimiento.
La comprensión de la farmacología de compuestos
que interaccionan con canales iónicos y/o receptores localizados en
la superficie celular, y la capacidad de identificar racionalmente
compuestos que interaccionan específicamente con canales iónicos
y/o receptores localizados en la superficie celular para obtener
efectos terapéuticos deseados, se han visto obstaculizadas por la
falta de medios rápidos y efectivos para identificar aquellos
compuestos que interaccionan con canales iónicos específicos y/o
receptores localizados en la superficie celular específicos.
La disponibilidad de medios rápidos y efectivos
para identificar compuestos que modulan o interaccionan con canales
iónicos y/o receptores localizados en la superficie celular
permitiría el rastreo rápido de un gran número de compuestos para
identificar aquellos candidatos adecuados para posteriores estudios
en profundidad de aplicaciones terapéuticas.
Stumpo y col. (J. Biol. Chem., 236, pp.
1611-14, 1988) y Chen y col. (Nature, 328, pp.
820-23, 1987) describen el uso de construcciones
génicas informadoras para investigar los mecanismos de la actividad
del receptor de la tirosina kinasa. WO 89/09834 describe el uso de
dichas construcciones en el contexto de los canales iónicos
abiertos por voltaje, específicamente de los canales del
calcio.
Por lo tanto, es un objeto de esta invención
proporcionar un ensayo para estudiar e identificar compuestos
farmacéuticamente efectivos potenciales que interaccionen
específicamente con las proteínas de la superficie celular y
modulen su actividad, particularmente con receptores copulados a
proteínas G.
Es también un objeto de esta invención
proporcionar células recombinantes que expresan receptores de la
superficie celular específicos, receptores copulados a proteínas G,
y que han sido modificadas para uso en ensayos que detectan
compuestos que interaccionan con estos receptores de la superficie
celular o modulan sus actividades.
Se describen, aunque no forman parte de la
invención, células recombinantes que son útiles para estudiar
compuestos en cuanto a su actividad agonista o antagonista con
respecto a receptores copulados a proteínas G. Las células
recombinantes son sometidas a ingeniería genética para expresar los
receptores específicos localizados en la superficie celular y
también contienen construcciones de ADN que incluyen un gen
informador, una región promotora y otras secuencias reguladoras
transcripcionales de nucleótidos que modulan el nivel de
transcripción procedente del promotor. Las secuencias reguladoras
transcripcionales y/o la región promotora seleccionadas están
reguladas, directa o indirectamente, por señales intracelulares que
resultan de la interacción de la proteína de la superficie celular
con una señal extracelular. Se facilitan métodos de ensayo basados
en la transcripción que usan células recombinantes para detectar
señales extracelulares que actúan como agonistas o antagonistas de
la actividad de estas proteínas de la superficie celular.
También se describen, aunque no forman pare de la
invención, métodos para identificar señales extracelulares que
modulan la transcripción mediada por proteínas de la superficie
celular. Estos métodos comparan la diferencia en la cantidad de
transcripción de un gen informador en células recombinantes en
presencia de la señal con la cantidad de transcripción en ausencia
de la señal o con la cantidad de transcripción en una célula
control que no expresa la proteína de la superficie celular. Las
células recombinantes usadas en estos métodos expresan la proteína
de la superficie celular y contienen una construcción de gen
informador en donde la transcripción del gen informador está bajo
el control de una secuencia de control transcripcional promotora
cuya actividad está regulada por la proteína de la superficie
celular. Las células recombinantes pueden expresar endógenamente la
proteína de la superficie celular o pueden expresar ADN heterólogo
que codifique para la proteína de la superficie celular.
Las proteínas de la superficie celular son
receptores copulados a proteínas G. Específicamente, la invención se
relaciona con un método para estudiar compuestos de ensayo con
objeto de determinar la actividad agonista o antagonista de cada
uno de dichos compuestos con respecto a un receptor copulado a
proteína G de la superficie celular, consistente en las siguientes
etapas:
a) poner en contacto una célula eucariótica que
contiene un receptor copulado a proteína G heterólogo expresado a
partir de un gen heterólogo y una construcción de gen informador
heteróloga con el compuesto,
donde la construcción del gen informador consiste
en un gen informador bajo el control de al menos un elemento de
control transcripcional que responde a una condición intracelular
que se produce cuando dicho receptor interacciona con el compuesto,
y
b) medir la cantidad de transcripción o
traducción del gen informador.
En realizaciones más preferidas, las proteínas de
la superficie celular son cualesquiera de los receptores
muscarínicos, receptores adrenérgicos, receptores de dopamina y
receptores de serotonina. La región promotora y las secuencias
reguladoras de la transcripción son cualesquiera del promotor del
gen c-fos y secuencias nucleotídicas
reguladoras transcripcionales derivadas del gen
c-fos, el promotor del gen del péptido
intestinal vasoactivo ("VIP"), el promotor del gen de
somatostatina, el promotor de la proencefalina, el promotor del gen
de la fosfoenolpiruvato carboxikinasa y el promotor del gen del
factor de crecimiento de los nervios 1 A. Los genes informadores son
cualesquiera de los genes codificantes de la cloranfenicol
acetiltransferasa bacteriana, de la luciferasa de luciérnaga, de la
luciferasa bacteriana, de la \beta-galactosidasa
y de la fosfatasa alcalina y otros elementos reguladores
transcripcionales, incluyendo elementos que responden al monofosfato
cíclico de adenosina, y elementos que responden a los niveles
intracelulares de iones calcio.
En la mayoría de las realizaciones preferidas,
los receptores son receptores muscarínicos y el promotor y otras
secuencias reguladoras derivan del gen
c-fos, incluyendo la región promotora
c-fos y el elemento regulador intragénico
del gen c-fos (FIRE).
También se facilitan métodos rápidos, fiables y
sensibles para determinar si las células están produciendo
receptores localizados en la superficie funcionales específicos de
célula, incluyendo subtipos de receptores específicos.
Los ensayos basados en la transcripción
proporcionan medios rápidos, fiables y sensibles para identificar
compuestos que interaccionan con los receptores específicos
localizados en la superficie celular y afectan así a su función. En
particular, los ensayos proporcionan medios para rastrear o detectar
compuestos farmacéuticos potenciales. Dependiendo de la afinidad
del compuesto por la proteína de la superficie celular o de la
naturaleza de la interacción, los ensayos tendrían que poder
detectar compuestos a concentraciones en el rango nanomolar y,
posiblemente, inferior.
Al desarrollar ensayos con células recombinantes,
se reconoció que un hilo común entre las respuestas tisulares
concertadas y las respuestas y actividades celulares, tales como la
contracción muscular, la vasodilatación y el crecimiento y la
proliferación celular, que están mediadas por proteínas de la
superficie de la membrana, es que la transcripción de genes
específicos se inicia rápidamente, en cuestión de minutos desde la
exposición de la proteína de la membrana de la superficie celular a
una señal extracelular que induce dicha actividad. Así, la actividad
de dichos promotores y la transcripción de genes controlada por los
promotores refleja la actividad de la proteína de la superficie en
virtud de la transducción de una señal intracelular.
La señal intracelular que se transduce se inicia
generalmente gracias a la interacción de una señal extracelular,
particularmente de un ligando, con un receptor copulado a proteínas
G presente sobre la superficie celular. Esta interacción pone en
marcha una cascada de sucesos intracelulares, cuya última
consecuencia es un cambio rápido y detectable en la transcripción o
traducción de un gen. Seleccionando promotores que responden a las
señales intracelulares transducidas y uniendo operativamente los
promotores seleccionados a genes informadores, cuya transcripción,
traducción o actividad final es fácilmente detectable y mensurable,
el ensayo basado en la transcripción proporciona una rápida
indicación de si un receptor o canal iónico específico interacciona
con un compuesto de ensayo de algún modo que influya en la
transducción intracelular. La expresión del gen informador, por lo
tanto, proporciona una valiosa herramienta de rastreo para el
desarrollo de compuestos que actúan como agonistas o antagonistas
de estos receptores celulares.
Los ensayos de esta invención miden la etapa
final de la cascada de sucesos antes descrita, la expresión de un
gen informador. Se consigue esto mediante el uso de una
construcción de expresión de un gen informador que contiene un gen
informador y un elemento de control transcripcional que responde a
la condición intracelular que se produce cuando el receptor celular
interacciona con un compuesto que tiene propiedades agonistas o
antagonistas con respecto a dicho receptor. Se pone el gen
informador en asociación operativa con el elemento de control
transcripcional. La aparición del producto del gen informador sirve
como indicación fácilmente observada de la transcripción.
A menos que se definan de algún otro modo, todos
los términos técnicos y científicos tienen aquí el mismo significado
que el que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que
esta invención pertenece.
Tal como se usan aquí, las células recombinantes
incluyen cualquier célula que haya sido modificada por la
introducción de ADN heterólogo. Las células control incluyen
células que son substancialmente idénticas a las células
recombinantes, pero que no expresan la una o más proteínas
codificadas por el ADN heterólogo. Por ejemplo, se producen las
células recombinantes a partir de células por introducción de ADN
que codifica para una construcción de gen informador y eventualmente
de un ADN heterólogo codificante de un receptor de la superficie
celular. Las células control, con respecto a dichas células
recombinantes, son células que, o bien no incluyen o expresan la
construcción del gen informador, o bien no incluyen o expresan el
receptor.
Tal como se usa aquí, ADN heterólogo incluye ADN
que no aparece de forma natural como parte del genoma en el que está
presente o que se encuentra en una localización o localizaciones
del genoma que difieren de aquéllas en las que aparece en la
naturaleza. El ADN heterólogo no es endógeno para la célula en la
que se introduce, sino que se ha obtenido de otra célula. En
general, aunque no necesariamente, dicho ADN codifica para ARN y
proteínas que no son normalmente producidos por la célula en la que
se expresa. También se puede hacer referencia al ADN heterólogo
como ADN extraño. Cualquier ADN que un experto en la técnica
reconocería o consideraría como heterólogo o extraño para la célula
en la que se expresa es aquí incluido como ADN heterólogo. Como
ejemplos de ADN heterólogo, se incluyen, aunque sin limitación, ADN
que codifica para receptores, genes informadores, secuencias
reguladoras de la transcripción y de la traducción y proteínas
marcadoras seleccionables o rastreables, tales como una proteína
que confiere resistencia a fármacos.
Tal como se usan aquí, las proteínas de la
superficie celular incluyen moléculas que aparecen en la superficie
de las células, que interaccionan con el ambiente extracelular y que
transmiten o transducen la información concerniente al ambiente
intracelularmente, de un modo que finalmente modula la transcripción
de promotores específicos, dando lugar a la transcripción de genes
específicos.
Tal como se usan aquí, las señales extracelulares
incluyen una molécula o un cambio en el ambiente que se transduce
intracelularmente a través de las proteínas de la superficie
celular que interaccionan directamente o indirectamente con la
señal. Una señal extracelular o una molécula efectora es cualquier
compuesto o substancia que de algún modo altera específicamente la
actividad de una proteína de la superficie celular. Como ejemplos
de dichas señales, se incluyen, aunque sin limitación, moléculas
tales como acetilcolina, factores de crecimiento, hormonas y otras
substancias mitogénicas, tales como al acetato místrico de forbol
("PMA"), que se unen a los receptores de la superficie celular
y modulan la actividad de dichos receptores. Por ejemplo, los
antagonistas son señales extracelulares que bloquean o disminuyen
la actividad de las proteínas de la superficie celular y los
agonistas son ejemplos de señales extracelulares que potencian,
inducen o aumentan de algún otro modo la actividad de las proteínas
de la superficie celular.
Tal como se usan aquí, las señales extracelulares
también incluyen substancias hasta ahora no identificadas que
modulan la actividad de la proteína de la superficie celular,
afectando así a las funciones intracelulares, y que son agentes
farmacológicos potenciales que pueden ser usados para tratar
enfermedades específicas modulando la actividad de receptores
copulados a proteínas G.
Tal como se usan aquí, los receptores que se
estimulan mediante la acetilcolina son receptores nicotínicos y
muscarínicos, que pueden distinguirse entre sí por métodos
conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden
distinguir los receptores nicotínicos y muscarínicos en base a su
respuesta a los alcaloides nicotina y muscarina.
Tal como se usan aquí, los receptores
muscarínicos se refieren colectivamente a cualquiera de las formas
farmacológica o estructuralmente distinguibles de los receptores
muscarínicos. Se hace referencia a cualquier forma particular
mediante cualquier nomenclatura reconocida por los expertos en la
técnica. Por ejemplo, se han representado los subtipos
farmacológicamente definidos por una M mayúscula, es decir,
M_{1}, M_{2} y M_{3}, y se han representado las formas
moleculares distinguibles por una m minúscula, es decir,
m_{1}, m_{2} ... m_{5} (véase, por ejemplo, Flier y col.
(1989), New Engl. J. Med. 321:
1022-1029.
Tal como se usa aquí, una construcción de gen
informador es una molécula de ADN que incluye un gen informador
operativamente unido a secuencias para el control de la
transcripción. La transcripción del gen informador es controlada
por estas secuencias. La actividad de al menos una o más de estas
secuencias control está directamente o indirectamente regulada por
la proteína de la superficie celular. Las secuencias para el
control de la transcripción incluyen el promotor y otras regiones
reguladoras, tales como secuencias intensificadoras, que modulan la
actividad del promotor, o secuencias control que modulan la
actividad o eficiencia de la ARN polimerasa que reconoce el
promotor, o secuencias control que son reconocidas por moléculas
efectoras, incluyendo las que son específicamente inducidas por la
interacción de una señal extracelular con una proteína de la
superficie celular. Por ejemplo, se puede afectar a la modulación
de la actividad del promotor alterando la unión de la ARN
polimerasa a la región promotora o, alternativamente, interfiriendo
con la iniciación de la transcripción o la elongación del ARNm.
Dichas secuencias son aquí denominadas colectivamente elementos o
secuencias para el control de la transcripción. Además, la
construcción puede incluir secuencias de nucleótidos que alteren la
traducción del ARNm resultante, alterando así la cantidad de
producto del gen informador.
Tal como se utiliza aquí, el promotor se refiere
a la región de ADN que está secuencia arriba con respecto a la
dirección de la transcripción del sitio de iniciación de la
transcripción. Incluye los sitios de unión a la ARN polimerasa y de
imitación de la transcripción y cualesquiera otras regiones,
incluyendo, aunque sin limitación, sitios de unión a proteínas
represoras o activadoras, sitios que responden al calcio o al AMPc
y cualesquiera secuencias tales de nucleótidos que los expertos en
la técnica saben que alteran la cantidad de transcripción del
promotor, ya sea directa o indirectamente.
Tal como se usa aquí, un promotor que está
regulado o mediado por la actividad de una proteína de la superficie
celular es un promotor cuya actividad cambia cuando se expone una
célula a una señal extracelular particular en virtud de la
presencia de proteínas de la superficie celular cuyas actividades
están afectadas por la proteína extracelular. Por ejemplo, el
promotor c-fos, que resulta específicamente
activado con la interacción específica de determinadas señales
extracelulares, tales como hormonas de crecimiento, con una
proteína de la superficie celular, tal como un receptor de hormonas
de crecimiento. En particular, la regulación de dichos promotores
por la proteína de la superficie celular, aunque indirecta, se
produce en cuestión de minutos de la interacción de la proteína de
la superficie celular con la señal extracelular. Tal como se usa
aquí, unión operativa se refiere a un fragmento de ADN, tal como una
unión de un promotor a una molécula de ADN que se transcribe por la
ARN polimerasa que se une al promotor, de tal forma que la región
reguladora se sitúa apropiadamente para esta actividad. Así, un
fragmento de ADN en unión operativa con un promotor está secuencia
abajo, con respecto a la dirección de la transcripción, del
promotor, está en el marco abierto de lectura correcto con respecto
al sitio de iniciación de la transcripción y se inserta de tal
forma que la elongación de la transcripción procede a través del
fragmento de ADN.
Al llevar el ensayo a la práctica, se inserta una
construcción de gen informador en una célula eucariótica para
producir una célula recombinante que tiene presente en su
superficie una proteína de superficie celular del tipo específico
antes descrito. El receptor de la superficie celular puede
expresarse endógenamente o puede expresarse a partir de un gen
heterólogo que se ha introducido en la célula. Los métodos para
introducir ADN heterólogo en células eucarióticas son bien conocidos
en la técnica y se puede usar cualquiera de tales métodos. Además,
el ADN codificante de varias proteínas de la superficie celular es
conocido para los expertos en la técnica o puede ser clonado por
cualquier método conocido para los expertos en la técnica.
Se pone en contacto la célula recombinante con un
compuesto de ensayo y se mide el nivel de expresión del gen
informador. Se puede efectuar el contacto en cualquier vehículo y
se pueden hacer las pruebas por cualquier medio usando cualquier
protocolo, tal como la dilución seriada, para valorar interacciones
moleculares específicas conocidas para los expertos en la
técnica.
Después de poner en contacto la célula
recombinante durante un tiempo suficiente como para efectuar
cualquier interacción, se mide el nivel de expresión génica. Se
puede determinar empíricamente la cantidad de tiempo necesaria para
efectuar dichas interacciones, tal como desarrollando un curso
temporal y midiendo el nivel de transcripción en función del
tiempo.
La cantidad de transcripción puede ser
determinada usando cualquier método conocido para los expertos en la
técnica como adecuado. Por ejemplo, se puede detectar la expresión
de ARNm específico usando Northern blots, o se puede identificar un
producto proteico específico mediante una tinción
característica.
Se compara entonces la cantidad de transcripción
con la cantidad de transcripción en la misma célula en ausencia del
compuesto de ensayo, o se puede comparar con la cantidad de
transcripción en una célula substancialmente idéntica que carece de
los receptores específicos. Una célula substancialmente idéntica
puede derivar de las mismas células a partir de las cuales se
preparó la célula recombinante, pero que no habían sido modificadas
por introducción de ADN heterólogo. Alternativamente, puede tratarse
de una célula en la que se eliminan los receptores específicos.
Cualquier diferencia estadísticamente o de algún otro modo
significativa en la cantidad de transcripción indica que el
compuesto de ensayo ha alterado de alguna forma la actividad del
receptor específico.
Si el compuesto de ensayo no parece aumentar,
activar o inducir la actividad de la proteína de la superficie
celular, se puede repetir el ensayo y modificarlo por introducción
de una etapa en la cual se estudia primeramente la célula
recombinante en cuanto a la capacidad de un agonista o activador
conocido del receptor específico para activar la transcripción. Si
se induce la transcripción, el compuesto de ensayo es entonces
estudiado en cuanto a su capacidad para inhibir, bloquear o afectar
de algún otro modo a la actividad del agonista.
El ensayo basado en la transcripción es útil para
identificar compuestos que interaccionan con cualquier proteína de
la superficie celular cuya actividad altere finalmente la expresión
génica. En particular, se pueden utilizar los ensayos para estudiar
interacciones funcionales ligando-receptor para
receptores copulados a proteína G. Como ejemplos de éstos se
incluyen:
Receptores copulados a proteína G:
receptores adrenérgicos, receptores muscarínicos y similares.
Se puede usar cualquier célula transfectable que
pueda expresar la proteína de la superficie celular deseada de una
forma tal que la proteína funcione para transducir
intracelularmente una señal extracelular. Las células pueden ser
seleccionadas de tal forma que expresen endógenamente la proteína de
la superficie celular, o pueden ser sometidas a ingeniería genética
para hacerlo. Muchas de esas células son conocidas para los
expertos en la técnica. Dichas células incluyen, aunque sin
limitación, células Ltk^{-}, células PC12 y células
COS-7.
La preparación de células que expresen el
receptor y una construcción de expresión de genes informadores y que
sean útiles para estudiar compuestos con objeto de determinar sus
actividades es ejemplificada en los Ejemplos que se facilitan aquí
en relación a las líneas celulares Ltk^{-} y COS-7
de mamíferos, que expresan el receptor muscarínico humano de Tipo 1
(HM1) y que se transforman con una construcción de expresión génica
de promotor c-fos-informador de CAT o con
una construcción de expresión génica de promotor
c-fos-informador de luciferasa.
La proteína de la superficie celular puede
expresarse endógenamente sobre la célula seleccionada o puede
expresarse a partir de ADN clonado.
Como ejemplos de proteínas de la superficie
celular, se incluyen, aunque sin limitación: receptores muscarínicos
(por ejemplo, M2 humano (acceso del GenBank #M16404), M3 de rata
(acceso del GenBank #M16407), M4 humano (acceso del GenBank
#M16405), M5 humano (Bonner y col. (1988), Neuron 1:
403- 410) y similares); receptores adrenérgicos (por ejemplo,
\beta_{1} humano (Frielle y col. (1987), Proc. Natl. Acad.
Sci. 84: 7920-7924), \alpha_{2}
(Kobilka y col. (1987), Science 238:
650-656), \beta_{2} de hámster (Dixon y col.
(1986), Nature 321: 75-79) y
similares); receptores de dopamina (por ejemplo, D2 humano (Stormann
y col. (1990), Molec. Pharm. 37:
1-6), rata (Bunzow y col. (1988), Nature
336: 783-787) y similares, y receptores de
serotonina (por ejemplo, 5HT1a humano (Kobilka y col. (1987),
Nature 329: 75-79), 5HT2 de rata
(Julius y col. (1990), PNAS 87:
928-932), 5HT1c de rata (Julius y col. (1988),
Science 241: 558-564) y
similares).
Se preparan construcciones de genes informadores
uniendo operativamente un gen informador con al menos un elemento
regulador de la transcripción. Si sólo se incluye un elemento
regulador de la transcripción, debe ser un promotor regulable. Al
menos uno de los elementos reguladores de la transcripción
seleccionados debe ser regulado indirecta o directamente por la
actividad del receptor de la superficie celular seleccionado, por
lo cual se puede monitorizar la actividad del receptor por la
transcripción de los genes informadores.
La construcción puede contener elementos
reguladores de la transcripción adicionales, tales como una
secuencia FIRE u otra secuencia que no está necesariamente regulada
por la proteína de la superficie celular, pero que es seleccionada
en cuanto a su capacidad para reducir la transcripción del nivel de
fondo o para amplificar la señal transducida y aumentar así la
sensibilidad y fiabilidad del ensayo.
Muchos genes informadores y elementos reguladores
de la transcripción son conocidos para los expertos en la técnica y
otros pueden ser identificados o sintetizados por métodos conocidos
para los expertos en la técnica.
Un gen informador incluye cualquier gen que
exprese un producto génico detectable, que puede ser ARN o proteína.
Son genes informadores preferidos los que son fácilmente
detectables. El gen informador puede estar también incluido en la
construcción en forma de un gen de fusión con un gen que incluye
secuencias reguladoras de la transcripción deseadas o que exhibe
otras propiedades deseables.
Como ejemplos de genes informadores, se incluyen,
aunque sin limitación, CAT (cloranfenicol acetil transferasa) (Alton
y Vapnek (1979), Nature 282:
864-869), luciferasa y otros sistemas de detección
enzimáticos, tales como la beta-galactosidasa, la
luciferasa de luciérnaga (deWet y col. (1987), Mol. Cell.
Biol. 7: 725-737), la luciferasa
bacteriana (Engebrecht y Silverman (1984), PNAS 1:
4154-4158; Baldwin y col. (1984),
Biochemistry 23: 3663-3667), la
fosfatasa alcalina (Toh y col. (1989), Eur. J. Biochem.
182: 231-238; Hall y col. (1983), J. Mol.
Appl. Gen. 2: 101).
Como elementos de control de la transcripción, se
incluyen, aunque sin limitación, promotores, intensificadores y
sitios de unión a represores y activadores. Elementos reguladores
de la transcripción adecuados pueden derivar de las regiones
reguladoras de la transcripción de genes cuya expresión es
rápidamente inducida, generalmente en cuestión de minutos desde el
contacto entre la proteína de la superficie celular y la proteína
efectora que modula la actividad de la proteína de la superficie
celular. Como ejemplos de tales genes, se incluyen, aunque sin
limitación, los genes inmediatos-precoces (véase
Sheng y col. (1990), Neuron 4:
477-485), tales como c-fos.
Los genes inmediatos-precoces son genes que se
inducen rápidamente al unirse un ligando a una proteína de la
superficie celular. Los elementos de control de la transcripción que
se prefieren para uso en las construcciones génicas, incluyen
elementos de control de la transcripción de genes
inmediatos-precoces, elementos derivados de otros
genes que exhiben alguna o todas de las características de los
genes inmediatos-precoces o elementos sintéticos que
se construyen de tal forma que los genes en unión operativa con
ellos exhiben dichas características. Las características de genes
preferidos de los que derivan los elementos de control de la
transcripción incluyen, aunque sin limitación, expresión baja o
indetectable en células quiescentes, inducción rápida a nivel
transcripcional en cuestión de minutos de la simulación
extracelular e inducción que es transitoria e independiente de nueva
síntesis de proteínas; la desactivación posterior de la
transcripción requiere nueva síntesis de proteína y los ARNm
transcritos a partir de estos genes tienen una corta vida media. No
es necesario que estén presentes todas estas propiedades.
En las construcciones más preferidas, los
elementos reguladores de la transcripción derivan del gen
c-fos.
El proto-oncogén
c-fos es el homólogo celular del gen
transformante del virus del osteosarcoma FBJ. Codifica para una
proteína nuclear que está muy probablemente implicada en el
crecimiento y la diferenciación celulares normales. La
transcripción de c-fos es transitoria y
rápidamente activada por factores de crecimiento y por otros
inductores de otras proteínas de la superficie celular, incluyendo
hormonas, agentes específicos de la diferenciación, estrés,
mitógenos y otros inductores conocidos de las proteínas de la
superficie celular. La activación es independiente de la síntesis
de proteína. Los elementos reguladores c-fos
incluyen (véase Verma y col. (1987), Cell 51): una
caja TATA necesaria para la iniciación de la transcripción, dos
elementos secuencia arriba para la transcripción basal y un
intensificador, que incluye un elemento con simetría de diada y que
se requiere para la inducción por TPA, suero, EGF y PMA.
El elemento intensificador de la transcripción de
20 pb localizado entre -317 y -298 pb secuencia arriba del sitio de
remate de ARNm c-fos es esencial para la
inducción con suero en células NIH 3T3 privadas de suero. Uno de los
dos elementos secuencia arriba se localiza en -63 - -57 y se parece
a la secuencia consenso para la regulación del AMPc.
Otros promotores y elementos de control de la
transcripción, además de los descritos anteriormente, incluyen el
promotor del gen del péptido intestinal vasoactivo ("VIP")
(que responde a AMPc, Fink y col. (1988), Proc. Natl. Acad.
Sci. 85: 6662-6666), el promotor del gen
de la somatostatina (que responde a AMPc, Montminy y col. (1986),
Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 6682-6686),
el promotor de la proencefalina (que responde a AMPc, agonistas
nicotínicos y ésteres de forbol; Comb y col. (1986), Nature
323: 353-356), el promotor de la
fosfo-enolpiruvato carboxikinasa (que responde a
AMPc, Short y col. (1986), J. Biol. Chem. 261:
9721-9726), el promotor del gen
NGFI-A (que responde a NGF, AMPc y suero;
Changelian y col. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86:
377-381) y otros que pueden ser conocidos o
preparados por los expertos en la técnica.
Los siguientes ejemplos son incluidos con fines
meramente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la
invención.
Se prepararon líneas celulares estables y líneas
celulares de células transitoriamente transfectadas para uso en el
ensayo basado en la transcripción. Se cotransfectaron células
Ltk^{-}, que son una línea celular de fibroblastos de ratón
deficientes en timidina kinasa, con un plásmido que contenía ADN que
codifica para HM1, un plásmido de selección que contenía el gen de
la timidina kinasa de tipo salvaje o mutilado y una construcción de
expresión de genes informadores. Se cotransfectaron
transitoriamente células COS-7 (células de riñón de
mono verde Africano) con una construcción de gen informador y un
plásmido de expresión de la \beta-galactosidasa,
pCH110 (Hall y col. (1983), J. Mol. Appl. Gen. 2:
101), que contiene ADN codificante del receptor HM1.
Se usaron las siguientes líneas celulares como
células huésped: HEK 293, que puede ser adquirida de la ATCC (acceso
#CRL 1573); células Ltk^{-}, que pueden ser adquiridas de la ATCC
(acceso #CCL1.3); células COS-7, que pueden ser
adquiridas de la ATCC (acceso #CRL 1651), y células DG44 (véase, por
ejemplo, L. Chasin (1986), Cell. Molec. Genet. 12:
555).
Se describe la secuencia del fragmento de ADN
codificante de HM1 en Allard y col. (1987), Nucl. Acids Res.
15: 10604. Se puede preparar sintetizando el ADN, preparado
como describen Allard y col., o se puede aislar por rastreo de una
librería de ADN genómico humano parcial. Se ha aislado por rastreo
de una librería genómica humana parcial que contiene fragmentos
EcoRI de 2,5-4,5 kb de tamaño en el vector
\lambdagt11 con un oligonucleótido homólogo a los nucleótidos
250-279 de la secuencia del gen HM1. Las condiciones
de rastreo empleadas eran las siguientes:
Hibridación: formamida desionizada al 20%,
5X Denhardt, 6X SSPE, SDS al 0,2%, 200 \mug/ml de ADN de esperma
de arenque sonicado, 42ºC.
Lavado: 0,2X SSPE, SDS al 0,2%, 50ºC.
Se identificó un clon positivo y se confirmó que
codificaba para el receptor HM1 por secuenciación de ADN. Se aisló
la inserción EcoRI de ese clon y se insertó en el sitio
EcoRI de pIBI24 (International Biotechnologies, Inc., New
Haven, CT), obteniéndose el clon pIBI24/HM1.
Se modificó el fragmento codificante de HM1 de
pIBI24/HM1 por inserción en el plásmido basado en el promotor SV40
pSV2dhfr (véase Subramani y col. (1981), Mol. Cell. Biol.
1: 854-864). Se ligaron 50 ng del fragmento
BamHI de 1,97 kb de pIBI24/HM1 con 50 ng de M13mp18 digerido
con BamHI. Se transformó la ligación en la cepa de E.
coli JM103 y se seleccionaron las colonias Amp^{R}. Se
identificó el plásmido correcto por la presencia de un fragmento de
digestión KpnI de 1,45. Se preparó una plantilla a partir de
este plásmido para introducir un sitio EcoRI inmediatamente
antes del codon de iniciación de la región codificante de HM1
humana. Se hizo esto por mutagénesis estándar usando un
oligonucleótido que tiene la secuencia ATG CCCCAGCCCC ACCTTGAATT
CATGAACACT TCAGCC (SEC. ID. Nº 1).
Los productos de la mutagénesis fueron
transformados en JM103 y rastreados en levantamientos de placa con
un oligonucleótido de 18 bases (SEC. ID. Nº 4). Cuatro de los
clones positivos fueron sometidos a secuenciación didesoxi y todos
resultaron tener la secuencia correcta, es decir, un sitio
EcoRI añadido inmediatamente 5' del ATG 5'. Uno de los
clones de secuencia positiva, mHM1AChR103, fue seleccionado y se
introdujo un segundo sitio EcoRI usando mutagénesis dirigida
a oligonucleótidos después del codon de finalización del HM1 humano
usando un oligonucleótido de 37 nucleótidos (SEC. ID. Nº 2).
Se transformaron los productos de mutagénesis en
JM103 y se rastrearon en levantamientos de placa con un
oligonucleótido de 17 bases (SEC. ID. Nº 3). Se identificaron los
clones positivos y cuatro fueron secuenciados para confirmar que se
había introducido el sitio EcoRI y que el resto de la
secuencia permanecía inalterada. Los cuatro clones secuenciados
tenían la secuencia correcta.
Uno de los clones secuenciados, M3HM1AR04, fue
digerido con EcoRI y se purificó el fragmento de 1,4 kb que
representaba la región codificante del M1 humano y se eluyó usando
papel DE-81. Se ligaron 60 ng del fragmento de 1,4
kb con 20 ng de pUC19 digerido con EcoRI. Se identificaron
los clones correctos por la presencia de un fragmento KpnI de
1,2 kb. Se escogió uno de éstos y se le denominó pHM1RO2. Se
extrajo el fragmento EcoRI de 1,4 kb de pHM1RO2 y se insertó
(38,5 ng) en 50 ng de pSV2dhfr digerido con EcoRI. Se
transformó el producto resultante en células DH5\alpha (Sambrook
y col., Molecular Cloning, 2ª ed., Cold Spring Harbor Lab.,
1989, p. 10) y se seleccionaron las colonias Amp^{R}. De las
colonias seleccionadas, aquéllas que, tras el aislamiento y la
digestión del ADN plasmídico con EcoRI, dieron fragmentos
de 1,4 y 5,0 kb y, tras la digestión con PvuII, dieron
fragmentos de 250, 1.150 y 5.000 pares de bases, tenían los
plásmidos esperados o deseados. Se llamó al vector de expresión de
HM1 final HM1pSV2dHFR.
Se cotransfectó pThx59 (Zipser y col. (1981),
Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 6276-6280),
que codifica para el gen TK de tipo salvaje, o pThx24 (ídem), que
codifica para un gen TK mutilado, en células Ltk^{-} junto con los
plásmidos de expresión de receptores muscarínicos para preparar
células Ltk establemente transfectadas que expresan el receptor HM1
clonado sobre sus superficies celulares.
Se usó el plásmido de expresión de genes
informadores, pFC4 (Deschamps y col. (1985), Science
230: 1174-1177), que contiene el gen CAT
bajo el control del promotor del gen c-fos,
como fuente del promotor c-fos y del gen
informador CAT y se introdujo también en células Ltk^{-} por
cotransfección con ADN codificante de receptores. Para explicarlo
brevemente, Deschamps y col. describe la preparación de una serie de
plásmidos que contienen el promotor c-fos y
cantidades variables de secuencias corriente arriba. Se introdujo un
fragmento EcoRI-NaeI de 2,25 kb (FC1) del gen
c-fos humano (van Straaten y col. (1983),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3183), que contiene el
promotor c-fos y la secuencia corriente
arriba, en el vector, pSV2CAT (Gorman y col. (1982), Mol. Cell
Biol. 2: 1044) el lugar del fragmento
AceI-HindIII en pSV2CAT usando ligantes
HindIII. El plásmido resultante era pFC1. Se preparó un
segundo plásmido, pFC2, aislando el fragmento NaeI de 1,4 kb
(FC2) de la región secuencia arriba del gen
c-fos humano e insertándolo usando ligantes
HindIII en pSV2CAT como se ha descrito para FC1. Se generó
una serie de plásmidos adicionales suprimiendo porciones de la
secuencia corriente arriba de FC2. Las deleciones de SmaI a
XhoI y SstII a SstII en FC2 dieron FC3 y FC4,
respectivamente. Después de digerir los fragmentos suprimidos que
corresponden a las secuencias flanqueantes residuales y el promotor
c-fos con HindIII y de separarlos por
electroforesis en gel, éstos fueron clonados en el ADN digerido con
SmaI-HindIII en lugar del fragmento de 1,3 kb
original. Deschamps y col. también describen la preparación de
construcciones FC5-11, -10, -20, -30 y -40 y de los
correspondientes plásmidos.
En las construcciones descritas a continuación, a
menos que se indique en contrario, se obtiene la región promotora
c-fos como el fragmento de 400 pb de pFC4,
que incluye una inserción de 500 pb del promotor
c-fos. La porción 5' de 100 pares de bases
deriva de una región secuencia arriba distal no contigua.
Se prepararon plásmidos, pFC4XP1 y pFC4XP2,
insertando el fragmento FC4 de pFC4 (Deschamps y col. (1985),
Science 230: 1174-1177) en pXP1 y
pXP2, que contienen construcciones de genes informadores de
luciferasa de luciérnaga (véase Nordeen S.K. (1988),
Biotechniques 6(5): 454-457). Los
plásmidos pFC4XP1 y pFC4XP2 incluyen dos secuencias tándem de
finalización de la transcripción/traducción en el extremo 5' del
fragmento promotor c-fos. Las dos
construcciones difieren en la situación del promotor
c-fos en relación al gen de la luciferasa. En
el plásmido pFC4XP1, se inserta el promotor
c-fos próximo al extremo 3' del poliligante,
con sólo una secuencia de 66 pb separándolo del gen de la
luciferasa. En el plásmido pFC4XP2, el promotor
c-fos se sitúa próximo al extremo 5' del
poliligante y hay una secuencia de 36 pb que lo separa del gen de
la luciferasa. Los plásmidos de expresión que contienen el gen de
informador de la luciferasa resultantes, pFC4XP1 y pFC4XP2, son
intercambiables y se utilizaron para transfectar células PC12 y
COS-7.
Se alteró el tamaño del segmento promotor
c-fos en el gen informador como medio de
maximización del nivel de inducción de expresión del gen informador
en células que expresan receptores transfectadas con la construcción
génica promotor-informador
c-fos- El segmento promotor
c-fos usado en las construcciones génicas
promotor c-fos-informador de luciferasa,
pFC4XP1 y pFC4XP2, antes descritas, que se emplearon en las
transfecciones de células PC12 y COS-7 es el
fragmento FC4 del promotor c-fos del
plásmido pFC4. Aunque se ha demostrado en una variedad de
aplicaciones que esta porción del promotor
c-fos es capaz de activar la transcripción
del gen c-fos en respuesta a niveles elevados
de AMPc y/o calcio, no se sabía si porciones mayores o menores del
promotor c-fos son más, menos o igualmente
efectivas en la estimulación de la expresión de genes informadores
en líneas celulares que expresan receptores particulares. Para
investigar esta posibilidad, se juntaron construcciones génicas
promotor c-fos-informador de luciferasa que
contenían fragmentos mayores (2.200 pb) y menores (350 pb) del
promotor c-fos (obtenido de los plásmidos
pFC1 y pFC7, respectivamente) y se usaron para transfectar células
PC12 que expresan receptores endógenos de acetilcolina de rata
(nAChRs). Se estudiaron entonces las células transfectadas en
cuanto a las actividades luciferasa inducidas por carbacol.
Además de los dos plásmidos y de las
construcciones anteriores, se preparó un tercer plásmido que
contenía una construcción génica promotor
c-fos-informador de luciferasa y que contiene
el fragmento del promotor c-fos FC4 de 500
pb obtenido de pFC4, la secuencia codificante del gen de la
luciferasa y el elemento regulador intragénico del gen
c-fos (FIRE), que es un palíndromo
14-mérico TCCCCGG seguido de CCGGGGA (véase Lamb y
col. (1990), Cell 61: 485-496; véase
también Bonnieu y col. (1989), Oncogene 4:
881-888, y Blanchard y col. (1988), Biochimie
70: 877-884). Los plásmidos que contienen
estas construcciones, pFC4XP1FIRE y pFC4XP2FIRE, difieren de
pFC4XP1 y pFC4XP2 sólo en que la secuencia FIRE ha sido insertada
corriente debajo de la construcción génica promotor del
c-fos-informador de la luciferasa.
Como la secuencia FIRE reduce la expresión de
c-fos en células no inducidas, la inclusión
de esta secuencia en las construcciones usadas en el ensayo basado
en la transcripción debería reducir el nivel de ruido de fondo y
aumentar así la sensibilidad y fiabilidad del ensayo.
Se construyen otros plásmidos en los que se
inserta la secuencia FIRE en algún otro lugar en las construcciones
de genes informadores para optimizar la reducción del nivel de
ruido obtenida incluyendo esta secuencia. Como la secuencia FIRE se
localiza al final del primer exón en el gen
c-fos y parece actuar promoviendo la
finalización prematura de los transcritos
c-fos en células no inducidas, se construyen
construcciones que contienen fusiones del gen informador y diversas
porciones del gen c-fos. Estas fusiones
incluyen el primer exón y la secuencia FIRE del gen
c-fos y cantidades crecientes de la región
intragénica. La cantidad de región intragénica es optimizada
preparando las construcciones y estudiándolas en cuanto a la
expresión de c-fos en ausencia de inductor.
Aquéllas que exhiban los niveles más bajos de expresión en ausencia
de inductor y el nivel más alto de expresión inducida, es decir, la
mayor razón de señal a ruido, son seleccionadas para uso en el
ensayo basado en la transcripción. Las construcciones pueden ser
introducidas en células PC12, COS-7 y otras células
adecuadas que expresan receptores y células control.
Se preparó el plásmido de expresión del gen
informador, p\Delta(-71), que contiene el gen CAT regulado por el
promotor del gen de la somatostatina (véase Montminy, M.R. y col.
(1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
6682-6686), y se introdujo en células
COS-7.
Se usó el plásmido p\Delta(-71)XP1, que
contiene una construcción de gen informador de la luciferasa de
luciérnaga bajo el control del elemento promotor de la
somatostatina p\Delta(-71) (véase Montminy, M.R. y col. (1986),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
6682-6686), para transfectar células
COS-7.
Se prepararon líneas celulares estables que
expresaban HM1 usando transfección con fosfato de calcio para
introducir el ADN plasmídico (véase Wigler y col. (1979), Proc.
Natl. Acad. Sci. 76: 1373-1376). Para
explicarlo brevemente, se cultivaron células Ltk^{-} en medio no
selectivo, D + 10, que contiene medio de Eagle modificado de
Dulbecco + 10% de suero de ternera, 100 U/ml de penicilina y 100
\mug/ml de estreptomicina, en una placa de 10 cm de tamaño hasta
un 20% de confluencia. Se coprecipitaron los tres plásmidos
circulares, el plásmido TK^{+}, el plásmido que contenía HM1 y el
plásmido pFC4 con CaPO_{4} y se añadieron a la monocapa celular.
Las concentraciones de vectores eran las siguientes:
| Thx24:HM1:pFC4 | 2 \mug:2 \mug:2 \mug/ml. |
| Thx59:HM1:pFC4 | 0,25 \mug:2 \mug:2 \mug/ml. |
Se ajustó la concentración final de ADN a 20 a 40
\mug/ml añadiendo ADN de Ltk^{-} o PVC. Se cultivaron las
células transfectadas durante dos días en medio no selectivo.
Después de dos días, se pasaron las células, se substituyó el
medio no selectivo con medio HAT (D + 10 + 15 \mug/ml de
hipoxantina + 1 \mug/ml de aminopterina + 5 \mug/ml de timidina)
y se cultivaron las células durante 10-15 días,
durante cuyo tiempo se "alimentó" a las células con medio
selectivo (HAT) fresco cada 3-4 días. Después de
10-15 días, aparecieron colonias o clones que
indicaban la aceptación y la expresión de al menos el plásmido
portador del gen TK. Se transfirieron las colonias a pocillos por
separado de una placa de 24 pocillos y se cultivaron en medio
selectivo durante siete días. Se transfirieron entonces los clones
individuales a placas de 6 pocillos y se cultivaron durante otros
siete días en medio selectivo. Para obtener células para la
congelación y los posteriores análisis de receptores moleculares y
funcionales, se pasaron los clones individuales de las placas de 6
pocillos a placas de 100 ml. Se denominó a dos de las líneas
celulares resultantes LM1FC4-8 y
LM1FC4-15.
Se empleó el procedimiento de transfección con
CaPO_{4} en la transfección transitoria de células
COS-7. El protocolo empleado fue el descrito en
"Current Protocols in Molecular Biology", 1, Suplemento
14, Sección I, Unidad 9.1.1-3.1.3, Wiley
Interscience Publish (1990).
Se cultivaron células COS-7
(aproximadamente 1-2 x 10^{6} células) a una
confluencia del 20% en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Gibco
#320-1965 AJ) con un 10% de suero bovino fetal
(Gibco #200-6140 AJ), Pen./Estrep. 1x (Gibco
#600-5140 AG) y aminoácidos no esenciales MEM 1x
(Gibco #320-1140 AG). Se coprecipitaron los tres
plásmidos circulares que contenían el receptor HM1, el gen TK y el
gen informador con CaPO_{4} y se añadieron a la monocapa de
células. Las concentraciones de plásmidos eran las siguientes:
| pCH110:HM1pSV2dHFR:pFC4XP1 | 5 \mug:5 \mug:0,5 \mug/ml. |
| pCH110:HM1pSV2dHFR:p\Delta(-71) | 5 \mug:5 \mug:1 \mug/ml. |
| pCH110:HM1pSV2dHFR:p\Delta(-71)XP2 | 5 \mug:5 \mug:0,5 \mug/ml. |
Después de la transfección, se incubaron las
células durante 24-48 horas en el anterior medio
modificado de Dulbecco y se estudiaron luego en cuanto a la
expresión del gen informador usando el ensayo basado en la
transcripción y en cuanto a la expresión de la
\beta-galactosidasa como se describe en el
Ejemplo 3.D. a continuación.
Se prepararon líneas celulares control con las
que comparar los niveles de transcripción en células que expresan la
proteína de la superficie celular y que incluyen un gen informador.
Se prepararon dos series de líneas celulares control usando los
protocolos de transfección y de cultivo descritos en el Ejemplo
1.
Se preparó la primera serie de células control
cotransfectando células Ltk^{-} con plásmidos que contenían ADN
codificante de HM1 y TK^{+} usando los métodos y el ADN HM1 y TK
descritos en el Ejemplo 1. La primera serie de líneas celulares,
incluidas las líneas celulares LM159-10 y
LM124-3, contienen genes
c-fos endógenos y fueron sometidas a
ingeniería y seleccionadas para expresar receptores HM1 clonados.
Se preparó esta primera serie para uso como control positivo y
negativo en los ensayos basados en la transcripción. Se usó como
control positivo por demostrar que se expresaba el receptor HM1 y
que la activación del receptor HM1 expresado conduce a un aumento
en el ARN c-fos endógeno. Estas líneas
celulares sirvieron también como controles negativos, ya que no
incluyen la construcción del gen informador pFC4 y, por lo tanto,
se usaron para mostrar que no se detectaba ARNm CAT o actividad
enzimática en ausencia de la construcción informadora pFC4.
La segunda serie de líneas celulares control fue
preparada transfectando transitoriamente células
COS-7 con pFC4XP1 y cotransfectando células
Ltk^{-} con ADN pFC4 y TK^{+} y seleccionando los clones
TK^{+}. Las células Ltk^{-}, LFC4-3,
LFC4-5, LFC4-7,
LFC4-8 y LFC4-10 estaban entre los
clones positivos seleccionados.
Esta serie de líneas celulares basadas en Ltk,
incluyendo LCF4-3, LCF4-5,
LCF4-7, LCF4-8 y
LCF4-11, y las células COS-7
cotransfectadas no expresan receptores HM1, pero contienen la
construcción del gen informador. Han sido usadas, por lo tanto, con
controles positivos para mostrar el ARNm CAT y la actividad
enzimática en respuesta a compuestos que activan el promotor
c-fos de la construcción pFC4. Esta segunda
serie de líneas celulares sirvió también como control negativo en
los ensayos basados en la transcripción, ya que no se alteraron el
ARNm CAT o las actividades luciferasa cuando estas células fueron
puestas en contacto con agonistas o antagonistas de HM1.
Se usaron células Ltk^{-} no transfectadas y
células Ltk^{-} transfectadas con pTHx59 (células
59-0) como controles negativos adicionales para
mostrar que los antagonistas y agonistas de HM1 no alteran la
expresión de c-fos en ausencia de receptores
HM1. También se usaron células PC12 (ATCC CRL1721 y Michel y col.
(1989), Br. J. Pharmacol. 97: 914-920)
y células SH-SY5Y (véase Lambert y col. (1989),
Eur. J. Pharmacol. 165: 71-77, y Serra
y col. (1988), Neurochem. 50:
1513-1521), que expresan receptores endógenos de la
superficie celular, como líneas celulares de control positivo en
los ensayos basados en la transcripción.
Se analizaron células Ltk^{-} establemente
cotransfectadas por hibridación Northern blot, ensayos de unión y
ensayos de hidrólisis del fosfatidilinositol, así como por el ensayo
basado en la transcripción.
Se analizaron primeramente las líneas celulares
en cuanto a la expresión de ARN codificante de HM1. Se aisló el ARN
total de 1x10^{7} células y se separaron 10-15
\mug de cada ARN en un gel de agarosa al 1%-formaldehído, seguido
de transferencia sobre nitrocelulosa. Se sondó por separado el
Northern blot con una o más de las siguientes sondas: fragmento
EcoRI de 1,2 ó 1,4 kb cebado aleatoriamente del plásmido
pSV2HM1, para detectar la expresión del gen HM1; fragmento
TaqI de 788 pb cebado aleatoriamente del plásmido pCaMVCN
(Alton y col. (1979), Nature 282. 864), para detectar
la expresión del gen CAT, y fragmento PstI de 1,1 kb cebado
aleatoriamente del plásmido p-fos1 (Curran y col. (1982),
J. Virol. 44: 674-682), para detectar
la expresión de c-fos.
Se hibridaron los filtros a las sondas en
formamida desionizada al 50%, Denhardt 5X, SSPE 5X y 100 \mug/ml
de ADN de esperma de arenque sonicado a 42ºC y se lavaron en SSPE
0,2X/SDS al 0,2% a 65ºC.
Los tamaños esperados de las bandas de
hibridación sobre las manchas deberían ser de aproximadamente 3 kb
para HM1, de aproximadamente 2 kb para CAT y de aproximadamente 2,2
kb para c-fos.
Se incubaron aproximadamente 1x10^{6} células
con 1,4 nM del antagonista
[^{3}H]-N-metilescopolamina
("NMS") durante 1 h a 37ºC en ausencia o presencia de diversas
concentraciones de agonistas, incluyendo atropina, pirenzepina,
carbamilcolina y escopolamina. Se separó el ligando marcado no unido
del marcaje unido a células por filtración de la mezcla de ensayo a
través de filtros Whatman GF/C, que habían sido pretratados con
polietilenimina. Se lavaron los filtros con 4 ml de tampón de
ensayo helado (NaCl 144 mM, KCl 4,7 mM, KH_{2}PO_{4} 1,7 mM,
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O 2,5 mM, MgCl_{2} 1,1 mM, glucosa 10 mM,
Tris/HCl 10 mM), se secaron y se analizaron en un contador de
centelleo para detectar la cantidad de ^{3}H-NMS
unida. Se restaron las cuentas unidas en presencia de atropina de
las cuentas unidas en ausencia de atropina para determinar el
alcance de la unión específica.
Los resultados de estos experimentos de unión
competitiva dieron valores de CI_{50} para el desplazamiento de
^{3}H-NMS específicamente unida como se indica a
continuación:
| Línea celular | Pirenzepina | Carbamilcolina | Atropina | Escopolamina |
| PC12 | 900 nM | 200 \muM | 7,0 nM | 5 nM |
| SH-SY5Y | 300 nM | 17 \muM | 4,0 nM | 4 nM |
| LM159-10 | 200 nM | 1 mM | 4,5 nM | 2 nM |
| LM124-3 | 200 nM | > 1 mM | 1,5 nM | 2 nM |
| LM1FC4-8 | 40 nM | 100 \muM | 5,0 nM | 2 nM |
| LM1FC4-15 | 60 nM | 170 \muM | 4,0 nM | 3 nM |
Estos resultados guardan una estrecha
concordancia con los publicados por Michel y col. ((1989) Br. J.
Pharmacol. 97: 914-920) con respecto a la
farmacología muscarínica de las células PC12. Además, las líneas
celulares que fueron preparadas por transfección con ADN
codificante de HM1, LM159-10 y
LM124-3 o con ADN codificante de HM1 y de las
construcciones de ADN c-fos-CAT expresaban
receptores HM1 que exhibían las propiedades farmacológicas
esperadas.
El protocolo seguido era una modificación del
descrito por Sevva y col. (1986), Biochem. Biophys. Res.
Comm. 140: 160-166, y Peralta y col.
(1988), Nature 334: 434-437.
Resumiendo, como la activación del receptor muscarínico M1 por un
agonista da lugar a la activación de la cascada de hidrólisis del
fosfatidilinositol (PI), el ensayo funcional conlleva el marcaje de
células con ^{3}H-mioinositol durante 48 h o más.
Se tratan las células marcadas con el agonista muscarínico, la
carbamilcolina (CCh), en presencia y ausencia del antagonista
muscarínico, la atropina, durante una hora. Se lisan las células
tratadas y se extraen en
cloroformo-metanol-agua, después de
lo cual se separan los fosfatos de inositol por cromatografía de
intercambio iónico y se cuantifican por contaje de centelleo.
Se plaquearon células de control positivo,
células SH-SY5Y y PC12, células de control negativo,
la línea celular 59-0 y las células experimentales
recombinantes, LM159-10, LM124-3,
LM1FC4-8 y LM1FC4-15, en placas de
12 pocillos (Costar) a una densidad de 5x10^{5} células /pocillo y
se marcaron con ^{3}H-mioinositol (3
\muCi/pocillo) durante 65-70 h. Se decantó el
medio y se lavaron los pocillos con 1 ml de tampón de ensayo PI 2X
(Hepes 10 mM, CaCl_{2} 0,5 mM, MgCl_{2} 1 mM y LiCl 10 mM en
500 ml de DMEM). Se incubaron las células en presencia de diversas
concentraciones de agonistas o se incubaron con agonista en
presencia o ausencia de diversas concentraciones de antagonistas
durante 60 minutos a 37ºC. Después de la incubación, se lisaron las
células y se extrajo la suspensión con 3 ml de CHCl_{3}/MeOH
(1:1). Tras la centrifugación (3.200 rpm durante 5 minutos), se
separó la fase acuosa superior y se diluyó con 2 ml de H_{2}O y
se centrifugó de nuevo. Se cargaron los sobrenadantes en columnas
que contenían 1 ml de resina Dowex® 1X8 AG previamente equilibradas
con mioinositol 5 mM y lavadas con 9 ml de mioinositol 5 mM,
seguido de 8 ml de formiato de sodio 60 mM y borato de sodio 5 mM.
Todos los fosfatos de inositol (IP1, IP2 e IP3) eluyeron juntos con
6 ml de ácido fórmico 0,1 M y formiato de amonio 1 M. Se retiraron 3
ml de los eluatos y se contaron con 20 ml de fluido de centelleo
para análisis.
Se determinaron las veces de aumento de la
estimulación calculando la razón de cpm en presencia de agonista a
cpm en presencia de control de tampón.
Se determinaron los valores de la CE_{50} para
la estimulación por agonistas de la hidrólisis del PI midiendo la
hidrólisis del PI a varias concentraciones de agonista. Se restaron
las cpm medidas en presencia sólo de tampón de las cpm medidas en
presencia de agonista para obtener la cantidad de hidrólisis de PI
resultante de la unión del agonista. Se determinó la cantidad
máxima de PI hidrolizado, la respuesta máxima, para cada agonista y
se representó el porcentaje de respuesta máxima frente a la
concentración del agonista y se determinó el valor de la CE_{50}
por el
gráfico.
gráfico.
Se determinaron los valores de la CI_{50} para
la inhibición por antagonistas de la estimulación por agonistas de
la hidrólisis del PI midiendo el valor específico de hidrólisis del
PI en presencia de una concentración constante de agonista y
varias concentraciones de antagonista. Para cada concentración de
antagonista, se representó el porcentaje de la respuesta máxima en
ausencia de antagonista en función de la concentración de
antagonista a partir de la cual se determinaron los valores de la
CI_{50}.
Como en los ensayos de unión a receptores, se
usaron células SH-SY5Y (Serra y col. (1988),
Neurochem. 50: 1513-1521) y PC12
(Horowitz, J., J. Neurochem. 53:
197-204 (1989)) como sistemas de control positivo
para la activación de la ruta de hidrólisis del PI por agonistas
muscarínicos y la inhibición de la estimulación por antagonistas
muscarínicos. En la línea celular de control positivo
SH-SY5Y, el tratamiento con carbamilcolina 1 mM dio
como resultado una estimulación aproximadamente 50 veces mayor de
la acumulación de fosfato de inositol, que se bloqueaba con atropina
100 nM. En las células PC12, el tratamiento con carbamilcolina 1 mM
dio lugar a una activación 27 veces mayor. La línea celular de
control negativo, las células 59-0, no respondían
al tratamiento con carbamilcolina, mientras que las células
transfectadas con el ADNc M1 exhibían niveles variables de
estimulación por carbamilcolina. La estimulación observada con
carbamilcolina 1 mM es resumida a continuación para las líneas
celulares de control positivo y las líneas celulares
transfectadas.
| Línea celular | Veces de aumento | DE_{50}, \muM |
| de la estimulación | ||
| PC12 | 27 | 7 |
| SH-SY5Y | 48 | 18 |
| LM159-10 | 9 | 90 |
| LM124-3 | 28 | 48 |
| LM1FC4-8 | 30 | 61 |
| LM1FC4-15 | 4 | 48 |
Las propiedades farmacológicas de las líneas
celulares transfectadas, células LM124-3,
LM159-10, LM1FC4-8 y
LM1FC4-15, así como de las células
SH-SY5Y y PC12, fueron caracterizadas estudiando la
inhibición dosis-dependiente de la acumulación de
fosfato de inositol estimulada por carbamilcolina por los
antagonistas muscarínicos atropina, pirenzepina y escopolamina. A
continuación, se dan los valores de la CI_{50} obtenidos para
los
antagonistas:
antagonistas:
| Línea celular | Pirenzepina | Atropina | Escopolamina |
| PC12 | 900 \muM | > 100 nM | ND |
| SH-SY5Y | 3,3 \muM | 47 nM | 36 nM |
| LM159-10 | 0,5 \muM | 13 nM | 31 nM |
| LM124-3 | 0,2 \muM | 15 nM | 15 nM |
| LM1FC4-8 | 0,3 \muM | 21 nM | 18 nM |
| LM1FC4-15 | ND | 10 nM | ND |
| ND = No determinado. |
Se cultivaron las células Ltk^{-} establemente
cotransfectadas y las células control hasta un
70-80% de confluencia en medio que contenía un 0,5%
de suero durante dos días antes del ensayo. Esta etapa de privación
de suero reduce los niveles de fondo de transcripción del promotor
c-fos. Para cada tipo de célula que había de
ser estudiado, se trataron grupos de tres placas de células de forma
similar. Los diversos tratamientos incluían tratamiento con
100-500 \muM de carbacol durante
15-45 minutos, tratamiento con un 20% de suero
durante 15-45 minutos, sin tratamiento pero
incluyendo agitación por remolino como en los demás y tratamiento
con 10 \muM de atropina durante 5 minutos antes del tratamiento
con carbacol. Se incubó una placa de cada grupo durante
30-60 minutos a 37ºC y se usó luego para aislar el
ARN total para el análisis Northern (véase el Ejemplo 3.A.). Se
incubaron las otras dos placas durante 5 h a 37ºC y se estudiaron
después en cuanto a la actividad CAT.
Se prepararon lisados proteicos lavando las
placas con solución salina tamponada con fosfatos ("PBS") y
lisando luego las células sobre la placa en 500 \mul de
Tris-HCl 0,25 M, pH 7,8, Tritón X100 al 1%. Se
transfirió el lisado a un tubo Eppendorf y se incubó entonces a
65ºC durante 10 minutos. Después de centrifugar el tubo durante 5
minutos en una microcentrífuga a 4ºC, se transfirió el sobrenadante
a tubos frescos y se congeló a -20ºC hasta su uso en el ensayo
CAT.
Al descongelarlos, se estudiaron los lisados por
duplicado en cuanto a proteína; se usaron 150 \mul de lisado
celular en el ensayo CAT. Se añadieron 90 \mul de dH_{2}O, 0,5
\mul de cloranfenicol 500 mM y 10 \mul de
^{14}C-acetil-CoA o
^{3}H-acetil-CoA al lisado para
iniciar la reacción, que se incubó durante 1-4 h a
37ºC. Se detuvo la reacción sobre hielo y se añadieron 300 \mul
de acetato de etilo frío. Se agitaron los tubos vorticialmente, se
centrifugaron en una microcentrífuga durante 1 minuto y se
transfirieron 200 \mul de la fase orgánica a un vial de centelleo
de vidrio. Se repitió la extracción con 300 \mul de acetato de
etilo y se combinaron los extractos orgánicos con 5 ml de solución
de contaje de centelleo Econofluor. Se determinó la radiactividad
en un contador de centelleo.
Se sondó el ARN en cuanto a la presencia de ARN
c-fos y CAT según se ha descrito en el
Ejemplo 3.A. Se detectó ARN específico de CAT del tamaño
esperado.
Se analizaron las líneas de células Ltk^{-},
incluyendo LM159-10 y LM124-3, que
habían sido transfectadas con plásmidos que contenían el gen HM1,
en cuanto a la expresión de ARN c-fos
endógeno tras el tratamiento con el agonista colinérgico carbacol o
carbacol y atropina, un antagonista muscarínico. Si hay presencia
de receptores HM1 funcionales sobre la superficie de las células, el
carbacol debería interaccionar con el receptor, dando lugar a
mayores niveles de Ca^{2+} y AMPc, y activar así el elemento de
control transcripcional del gen c-fos
endógeno, de tal forma que el gen c-fos
debería transcribirse a un mayor nivel, que sería detectable a
nivel de ARN, por inducción de ARN c-fos
endógeno. Más aún, la inducción mediada por el agonista de M1 de
c-fos debería bloquearse por los antagonistas
de M1.
Como se muestra en la tabla siguiente, estos
resultados fueron conseguidos en las líneas celulares
LM159-10 y LM124-3, lo que indica
que expresan receptores HM1 que están asociados con una ruta de
inducción de c-fos funcional.
| Línea celular | Sin tratamiento | Carbacol 100 \muM | Carbacol 100 \muM + atropina 10 \muM |
| LM159-10 | - | +++ | + |
| LM124-3 | - | +++ | + |
| Ltk^{-} | - | - | - |
En células transfectadas con el vector de
expresión de HM1 más el plásmido marcador
c-fos-CAT, por ejemplo,
LM1FC4-8 y LM1FC4-15, las células
que expresan receptores HM1 funcionales muestran igualmente un
aumento en el ARN c-fos al interaccionar con
un agonista de HM1. Estas células, sin embargo, deben demostrar
también un aumento en el ARN específico de CAT y en la actividad
enzimática debido a la activación de la construcción de expresión
c-fos-CAT. Al tratar la línea celular
LM1FC4-15 con el agonista de HM1, el carbacol, y
también con un inductor general de la expresión de
c-fos, el suero al 20%, se detectaron
aumentos en el ARNm c-fos y en el ARNm
CAT.
| Línea celular | Sin tratamiento | Carbacol 100 \muM | Suero al 20% |
| LM1FC4-8 | |||
| ARN c-fos | - | - | + |
| ARN CAT | + | + | + |
| Actividad CAT | + | + | + |
| LM1FC4-15 | |||
| ARN c-fos | - | ++ | ++ |
| ARN CAT | + | ++ | ++ |
| Actividad CAT | + | ++ | ++ |
| LFC4-7 | |||
| (control | |||
| negativo) | |||
| ARN c-fos | - | - | + |
| ARN CAT | + | + | ++ |
| Actividad CAT | + | + | ++ |
Veinticuatro a 48 horas después de la
cotransfección transitoria de células COS-7 con el
ADN del receptor HM1, la construcción génica promotor
c-fos-informador de luciferasa (pFC4XP1) y el
gen de la \beta-galactosidasa (pCH110), se expuso
a los transfectantes a 500 \muM de carbamilcolina o se dejaron sin
tratar durante 5 horas. A las 3 a 5 horas del tratamiento con el
fármaco, se lisaron las células y se analizaron en cuanto a
luciferasa (véase Brasier y col. (1989), Biotechniques
7: 1116-1122),
\beta-galactosidasa (Miller (1972),
"Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) y concentración proteica
(Biorad; Bradford (1976), Analytical Biochemistry 72:
248). Se usaron las concentraciones de
\beta-galactosidasa y proteína para normalizar los
niveles de luciferasa a la eficacia de transfección y al
rendimiento proteico por placa. Luciferasa normalizada = actividad
luciferasa/\DeltaA420 (actividad
\beta-galactosidasa)/\mug de proteína/\mul,
donde los volúmenes usados para la luciferasa y la
\beta-galactosidasa son constantes para todos los
lisados. En la Tabla VI se exponen los resultados.
Estos resultados indican que los niveles de
luciferasa de las células COS-7 cotransfectadas con
el ADN del receptor HM1 y el promotor
c-fos-gen de luciferasa y expuestas a 500
\muM de carbamilcolina eran 10 veces mayores que los de los
transfectantes no tratados. Los niveles de luciferasa de células
COS-7 que fueron transfectadas con pFC4XP1 no
resultaron afectados por la carbamilcolina. Estos datos confirman
que las inducciones de la luciferasa en estas células eran
específicas para la expresión del receptor HM1.
También se usó el ensayo basado en la
transcripción para generar curvas de dosis-respuesta
de agonistas y antagonistas de los receptores muscarínicos de
acetilcolina. Se cotransfectaron transitoriamente 14 placas de 10
cm de células COS-7 mediante el protocolo del
fosfato de calcio (véase el Ejemplo I.F.) con HM1pSV2dHFR, pFC4XP1
y pCH110. A las 48 h de la transfección, se trataron placas de
células por duplicado con 0, 0,01, 0,10, 1,0, 10, 100 ó 1.000 \muM
de carbamilcolina durante 5 horas antes de la lisis de las células
y del estudio de la actividad luciferasa inducida por
carbamilcolina. Se observó inducción de luciferasa
dosis-respuesta por carbamilcolina en un rango de 1
a 1.000 \muM de carbamilcolina.
\newpage
Se calculó un valor aproximado de CE_{50} (6
\muM) a partir de estos datos. Este valor de CE_{50} guarda
correlación con los valores de CE_{50} publicados para la
inducción por carbamilcolina de la hidrólisis de PI en células HEK
293 transfectadas con el gen del receptor HM1 (véase Peralta y col.
(1988), Nature 334: 434-437).
También se han generado curvas para la
dosis-respuesta de la inhibición por atropina de las
actividades luciferasa inducidas por carbamilcolina en células
COS-7 transitoriamente cotransfectadas usando el
ensayo basado en la transcripción. Para estos experimentos, se
cotransfectaron transitoriamente 16 placas de 10 cm de células
COS-7 por el protocolo del fosfato de calcio con
pCH110, HM1pSV2dHFR y pFC4XP1. A las 48 horas de la transfección, se
incubaron placas por duplicado de células durante 5 minutos en 0,
0,01, 0,1, 1,0, 10, 100, 1.000 ó 10.000 nM de atropina en tampón
STBS (solución salina tamponada con Tris) antes de añadir 500
\muM de carbamilcolina a las placas. Después de 5 minutos de
incubación de las células en presencia de carbamilcolina y atropina,
se retiraron los fármacos de las células y se substituyeron con
medio condicionado. A las 5 h de la adición de carbamilcolina, se
prepararon lisados celulares y se analizaron en cuanto a las
actividades \beta-galactosidasa y luciferasa y a
los niveles totales de proteína.
La atropina inhibía los niveles inducidos por
carbamilcolina de luciferasa de un modo
dosis-dependiente en un rango de concentraciones de
10-10.000 nM. Como la inhibición de la actividad
luciferasa inducida por carbamilcolina era completa en presencia de
atropina 10.000 nM en este experimento (es decir, que el nivel de
luciferasa de células tratadas con 500 \muM de carbamilcolina y
10.000 nM de atropina era equivalente al de células que no fueron
tratadas con carbamilcolina), se calculó una CI_{50} de 80 mM
para la inhibición por atropina a partir de estos datos. Este valor
de CI_{50} está dentro del rango del determinado en ensayos de
inhibición por atropina de la hidrólisis de PI inducida por
carbamilcolina en células Ltk^{-} transfectadas con el gen del
receptor HM1.
Se cotransfectaron transitoriamente células
COS-7 con el promotor de
somatostatina-gen CAT (p\Delta-71)
y el ADN del receptor HM1 usando el método del fosfato de calcio. A
las 48 horas de la transfección, se trataron las células con
0,500-1 \muM de carbamilcolina o se dejaron sin
tratar y se incubaron durante 5 horas. Después de la incubación, se
estudiaron las células en cuanto a actividad CAT según se describe
en el Ejemplo 3.D. Las células control COS-7 no
transfectadas y no tratadas exhibían un alto nivel de fondo de
actividad CAT. Los niveles de CAT de las células
COS-7 transfectadas que no habían sido expuestas a
carbamilcolina eran equivalentes a los de las células control. Los
niveles de CAT de las células COS-7 transfectadas
tratadas con carbamilcolina eran aproximadamente 1,7 veces mayores
que los de las células transfectadas no tratadas.
Se transfectaron transitoriamente células PC12
con 0,5 \mug de pFC4XP1 usando el método de precipitación con
fosfato de calcio. A las 48 horas de la transfección, se expusieron
las células a 500 \muM de carbamilcolina o se dejaron sin tratar
durante 5 horas. Se prepararon lisados celulares y se estudiaron en
cuanto a la actividad luciferasa según se describe en el Ejemplo
3.D. (véase Brasier y col.(1989), Biotechniques 7:
1116-1122). Los resultados de estos ensayos
indicaron que el nivel de luciferasa de las células tratadas con
carbamilcolina era 30 veces mayor que el nivel de luciferasa de las
células no tratadas.
Lamb y col. ((1990) Cell 61:
485-496) demostraron que la secuencia FIRE, cuando
se inserta en la secuencia codificante de un gen de fusión promotor
c-fos-\beta-galactosidasa,
reduce los niveles constitutivos o no inducidos de transcripción de
\beta-gal regulada por el promotor
c-fos. Por lo tanto, las células
transfectadas con una construcción promotor
c-fos (fragmento pFC4)-gen de
luciferasa que contiene la secuencia FIRE deben exhibir menores
niveles de actividades luciferasa no inducidas y constitutivamente
expresadas (ruido) que las células transfectadas con un gen
promotor c-fos-informador de luciferasa que
carece de la secuencia FIRE. Menores niveles de fondo de luciferasa
deberían, a su vez, dar lugar a mayores razones de
señal-a-ruido (es decir, la razón de
actividades luciferasa de células tratadas con carbamilcolina y no
tratadas) generadas en ensayos de inducción de luciferasa de las
células transfectadas con genes informadores.
Se usaron células PC12 para analizar la inducción
por carbacol de las tres construcciones promotor
c-fos-gen de luciferasa, pFC4X2FIRE,
pFC1XP2, que incluyen un fragmento c-fos de
2.200 pb de c-fos, y pFC7XP2, que incluye un
fragmento de 350 pb del promotor c-fos. Con
fines comparativos, se transfectaron también células PC12 con
pFC4XP2, un plásmido que contiene un gen de fusión informador
consistente en el fragmento de 500 pb del promotor
c-fos de pFC4 y la secuencia codificante del
gen de la luciferasa.
Se midieron las razones
señal-a-ruido de las actividades
luciferasa de células PC12 tratadas con carbacol frente a las no
tratadas, transfectadas con los tres plásmidos alternativos
promotor c-fos-gen de la luciferasa y la
construcción sin modificar promotor
c-fos-luciferasa, pFC4XP2. Los niveles de
luciferasa inducidos por carbacol de células PC12 transfectadas con
la construcción del gen informador sin modificar pFC4XP2 y la
construcción del gen de fusión informador que contiene la secuencia
FIRE (pFC4XP2FIRE) eran aproximadamente 12 y 17 veces mayores,
respectivamente, que los niveles de fondo de luciferasa de células
no tratadas. Los niveles de luciferasa de células PC12 tratadas con
carbacol que habían sido transfectadas con construcciones de genes
informadores que contenían fragmentos del promotor
c-fos mayores (pFC1XP2) y menores (pFC7XP2)
eran 14 y 11 veces superiores a los niveles de luciferasa de fondo,
respectivamente.
Dado que se consiguió mejorar la inducción por
carbacol de la actividad luciferasa en células PC12 transfectadas
con la construcción promotor c-fos-gen de la
luciferasa que contenía la secuencia FIRE, pFC4XP2FIRE, sería
posible conseguir una mejor inducción y mayores razones de señal a
ruido modificando la construcción y optimizando la localización de
la secuencia FIRE en la construcción con respecto a estos
parámetros. La razón señal-a-ruido
y, por lo tanto, la sensibilidad y fiabilidad del ensayo deberían
mejorar cuando se transfectan células PC12, COS-7 u
otras con estos plásmidos y se usan en el ensayo basado en la
transcripción.
En particular, se espera que construcciones en
las que la localización de la secuencia FIRE imita más estrechamente
su localización en el gen c-fos den mejores
niveles de inducciones y razones señal a ruido. Por ejemplo, las
construcciones que contienen una fusión de gen informador que
incluye al menos el primer exón del gen
c-fos, incluyendo la secuencia FIRE y
posiblemente toda o una porción de la región intragénica, deberían
exhibir una razón señal a ruido relativamente alta al inducir la
región promotora de c-fos. Se pueden
construir una serie de construcciones que contienen diversas
porciones del gen c-fos y fusionarlas a un
gen informador y unirlas operativamente al promotor
c-fos. Se pueden transfectar células
COS-7, PC12 u otras células adecuadas apropiadamente
y medir los niveles de inducción del gen informador. Se puede usar
cualquier otro gen informador que funcione como gen informador, tal
como el gen codificante de la
\beta-galactosidasa, cuando se fusiona a una
porción del promotor c-fos.
Como serán aparentes modificaciones para los
expertos en la técnica, se pretende que esta invención esté sólo
limitada por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. También se
describen en las siguientes reivindicaciones diversas
características de la invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Harpold, Michael M.
\hskip3,9cmBrust, Paul
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODOS DE ENSAYO Y COMPOSICIONES PARA DETECTAR Y EVALUAR LA TRANSDUCCIÓN INTRACELULAR DE UNA SEÑAL EXTRACELULAR
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Fitch Even Tabin & Plannery
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 135 So. LaSalle Street, Suite 900
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Chicago
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: IL
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 60603
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEÍBLE DEL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flotante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.24
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US PCT/US91/05625
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 07-AGOSTO-1991
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/563.751
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 07-AGOSTO-1990
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Saidman, Stephanie L.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33.779
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 1838-51826
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 619-552-1311
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 619-552-0095
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 16..21
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "secuencia de reconocimiento de restricción con EcoRI" {}\hskip3.7cm /marcaje = EcoRI
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc signal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 22..34
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "codon de inicio de la transcripción"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCAGCCCC ACCTTGAATT CATGAACACT TCAGCC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 17..22
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "secuencia de reconocimiento de restricción con EcoRI" {}\hskip3.7cm /marcaje = EcoRI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCCCGCCAA TGCTGAGAAT TCTATCTCCT GCATCCC
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 5..10
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "secuencia de reconocimiento de restricción con EcoRI" {}\hskip3.7cm /marcaje = EcoRI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGAGAATTC TATCTCC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 7..12
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "secuencia de reconocimiento de restricción con EcoRI" {}\hskip3.7cm /marcaje = EcoRI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACCTTGAAT TCATGAAC
\hfill18
Claims (12)
1. Un método de estudio de compuestos de ensayo
para determinar la actividad agonista o antagonista de cada uno de
dichos compuestos con respecto a un receptor copulado a proteínas G
de la superficie celular, consistente en las siguientes etapas:
a) poner en contacto una célula eucariótica que
contiene un receptor copulado a proteínas G heterólogo expresado a
partir de un gen heterólogo y una construcción de gen informador
heterólogo con el compuesto,
donde la construcción de gen informador contiene
un gen informador bajo el control de al menos un elemento de control
de la transcripción que responde a una condición intracelular que se
produce cuando dicho receptor interacciona con el compuesto, y
b) medir la cantidad de transcripción o de
traducción del gen informador.
2. El método de la reivindicación 1, que además
consiste en:
comparar la diferencia en la cantidad de
transcripción o de traducción de un gen informador en una célula
eucariótica en presencia del compuesto de ensayo con la cantidad de
transcripción o de traducción en ausencia de compuesto, o con la
cantidad de transcripción en ausencia del receptor copulado a
proteínas G, mediante lo cual se identifican los compuestos de
ensayo que modulan dicha actividad mediada por receptores.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde la
construcción de gen informador contiene una secuencia reguladora de
la transcripción que es el elemento regulador intragénico del gen
c-fos, mediante lo cual el nivel de
transcripción del gen informador en ausencia del receptor de la
superficie celular o del compuesto de ensayo es menor que en
ausencia del elemento regulador intragénico.
4. El método de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el receptor copulado a proteínas
G es seleccionado entre receptores muscarínicos, receptores
adrenérgicos, receptores de dopamina y receptores de serotonina.
5. El método de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el elemento de control
transcripcional incluye un promotor seleccionado entre: el promotor
del gen c-fos, el promotor del gen del
péptido intestinal vasoactivo, el promotor del gen de la
somatostatina, el promotor del gen de la proencefalina, el promotor
del gen de la fosfoenolpiruvato carboxikinasa o el promotor del gen
del factor de crecimiento de los nervios-1 A.
6. El método de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el gen informador es
seleccionado entre el gen codificante de la cloranfenicol
acetiltransferasa bacteriana, el gen codificante de la luciferasa de
luciérnaga, el gen codificante de la
\beta-galactosidasa o el gen codificante de la
fosfatasa alcalina.
7. El método de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde la construcción del gen
informador incluye al menos una secuencia de nucleótidos reguladora
de la transcripción seleccionada entre elementos que responden al
suero, elementos que responden al monofosfato cíclico de adenosina y
elementos que responden a los niveles intracelulares de iones
calcio.
8. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde se determina la cantidad de
transcripción midiendo la cantidad de ARNm que se transcribe a
partir del gen informador.
9. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde se mide la cantidad de transcripción o
de traducción midiendo la cantidad de proteína del gen informador
que se produce.
10. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, donde el compuesto de ensayo es un
antagonista.
11. El método de la reivindicación 10, que además
consiste, antes de comparar la diferencia en la cantidad de
transcripción o de traducción del gen informador, en poner en
contacto la célula eucariótica con un agonista que activa el
receptor copulado a proteínas G, mediante lo cual se induce la
transcripción del gen informador.
12. Un método de la reivindicación 1, donde el
ensayo es un rastreo de un gran número de compuestos potencialmente
efectivos desde el punto de vista farmacéutico.
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