ES2238674T3 - Inhibidores peptidicos sinteticos de la transmision de hiv. - Google Patents

Inhibidores peptidicos sinteticos de la transmision de hiv.

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ES2238674T3
ES2238674T3 ES94919201T ES94919201T ES2238674T3 ES 2238674 T3 ES2238674 T3 ES 2238674T3 ES 94919201 T ES94919201 T ES 94919201T ES 94919201 T ES94919201 T ES 94919201T ES 2238674 T3 ES2238674 T3 ES 2238674T3
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Dani P. Bolognesi
Thomas J. Matthews
Carl T. Wild
Shaen O'lin Barney
Dennis M. Lambert
Stephen R. Petteway, Jr.
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION HACE REFERENCIA A PEPTIDOS QUE MUESTRAN UNA POTENTE ACTIVIDAD RETROVIRAL. LOS PEPTIDOS DE LA INVENCION INCLUYEN EL PEPTIDO DP-178 (SEQ ID:1) CORRESPONDIENTE A LOS AMINOACIDOS 638 A 673 DE LA PROTEINA HIV-1{SUB,LAI GPT}41, Y FRAGMENTOS, ANALOGOS, Y HOMOLOGOS DE DP-178. LA INVENCION ADEMAS HACE REFERENCIA A LOS USOS DE DICHOS PEPTIDOS COMO INHIBIDORES DE LA TRANSMISION RETROVIRAL HUMANA Y NO HUMANA, ESPECIALMENTE HIV, A LAS CELULAS NO INFECTADAS.

Description

Inhibidores peptídicos sintéticos de la transmisión de HIV.
1. Introducción
La presente invención se refiere a DP-178 (ID SEC:1), un péptido correspondiente a los aminoácidos 638 a 673 de la proteína de transmembrana (TM) gp41 de HIV-1_{LAI}, y a porciones, análogos y homólogos de DP-178 (ID SEC:1), todos los cuales exhiben actividad antiviral. Tal actividad antiviral incluye, pero no se limita a, la inhibición de la transmisión de HIV a células CD-4^{+} no infectadas. DP-178 (ID SEC:1) y fragmentos y/o análogos u homólogos de DP-178 pueden usarse como inhibidores de la transmisión retroviral, especialmente de HIV, humana y no humana a células no infectadas. También se describen: (i) el uso de DP-178 como un diagnóstico específico para el subtipo de HIV; (ii) péptidos análogos a DP-107, un péptido correspondiente a los aminoácidos 558 a 595 de la proteína de transmembrana (TM) gp41 de HIV-1_{LAI}, que están presentes en otros virus con envuelta; y (iii) métodos para identificar compuestos antivirales que rompen la interacción entre DP-178 y DP-107 y/o entre péptidos similares a DP-107 y similares a DP-178. La invención se demuestra por medio de un ejemplo de trabajo en el que se muestra que cada uno de DP-178 (ID SEC:1) y un péptido cuya secuencia es homóloga a DP-178 son potentes inhibidores no citotóxicos de la transferencia de HIV-1 a células CD4^{+} no infectadas. También se describen ejemplos en los que se identifican péptidos que tienen similitud antiviral y/o estructural con DP-107 y DP-178.
2. Antecedentes de la invención 2.1 El virus de inmunodeficiencia humana
El virus de inmunodeficiencia humana (HIV) se ha considerado la causa principal de la enfermedad del sistema inmunitario lentamente degenerativa denominada síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) (Barre-Sinoussi, F. y otros, 1983, Science 220:868-870; Gallo, R. y otros, 1984, Science 224:500-503). Hay al menos dos tipos diferentes de HIV: HIV-1 (Barre-Sinoussi, F. y otros, 1983, Science 220:868-870; Gallo R. y otros, 1984, Science 224:500-503) y HIV-2 (Clavel, F. y otros, 1986, Science 233:343-346; Guyader, M. y otros, 1987, Nature 326:662-669). Además, existe una gran cantidad de heterogeneidad genética dentro de poblaciones de cada uno de estos tipos. La infección de linfocitos T CD-4^{+} humanos con un virus HIV conduce a un agotamiento del tipo de célula y finalmente a infecciones oportunistas, disfunciones neurológicas, crecimiento neoplástico y finalmente la muerte.
El HIV es un miembro de la familia lentiviral de retrovirus (Teich, N. y otros, 1984, RNA Tumor Viruses, Weiss, R. y otros, eds., CSH-Press, pp. 949-956). Los retrovirus son pequeños virus con envuelta que contienen un genoma de RNA de doble hebra diploide y se replican a través de un producto intermedio de DNA producido por una transcriptasa inversa codificada viralmente, una DNA polimerasa dependiente de RNA (Varmus, H., 1988, Science 240:1427-1439). Otros retrovirus incluyen, por ejemplo, virus oncogénicos tales como virus de leucemia de células T humanas (HTLV-I, -II, -III) y virus de leucemia felina.
La partícula viral del HIV consiste en un núcleo viral, compuesto por proteínas de la cápsida, que contiene el genoma de RNA viral y las enzimas requeridas para los sucesos replicativos iniciales. La proteína Gag miristilada forma una cubierta viral externa alrededor del núcleo viral, que a su vez está rodeada por una envuelta de membrana lipídica derivada de la membrana celular infectada. Las glicoproteínas de la superficie de la envuelta de HIV se sintetizan como una sola proteína precursora de 160 Kd que es segmentada por una proteasa celular durante el brote viral en dos glicoproteínas, gp41 y gp120. gp41 es una proteína de transmembrana y gp120 es una proteína extracelular que permanece asociada no covalentemente con gp41, posiblemente en una forma trímera o multímera (Hammarskjold, M. y Rekosh, D., 1989, Biochem. Biophys. Acta 989:269-280).
El HIV se orienta a células CD-4^{+} debido a que la proteína de la superficie celular de CD-4 actúa como el receptor celular para el virus HIV-1 (Dalgleish, A. y otros, 1984, Nature 312:763-767; Klatzmann y otros, 1984, Nature 312:767-768; Maddon y otros, 1986, Cell 47:333-348). La entrada viral en las células depende de que gp120 se una a las moléculas receptoras CD-4^{+} celulares (McDougal, J. S. y otros, 1986, Science 231:382-385; Maddon, P. J. y otros, 1986, Cell 47:333-348) y así explica el tropismo del HIV para células CD-4^{+}, mientras que gp41 se ancla al complejo glicoproteínico de la envuelta en la membrana viral.
2.2. Tratamiento del HIV
La infección por HIV es pandémica y las enfermedades asociadas con el HIV representan un problema sanitario mundial principal. Aunque se está realizando un esfuerzo considerable en el diseño satisfactorio de agentes terapéuticos eficaces, actualmente no existen fármacos antirretrovirales curativos contra el SIDA. En intentos de desarrollar tales fármacos, varias fases del ciclo vital del HIV se han considerado como objetivos para la intervención terapéutica (Mitsuya, H. y otros, 1991, FASEB J. 5:2369-2381). Por ejemplo, la transcriptasa inversa codificada viralmente ha sido un foco de desarrollo de fármacos. Se ha desarrollado un número de fármacos dirigidos a la transcriptasa inversa, incluyendo análogos de 2',3'-didesoxinucleósidos tales como AZT, ddI, ddC y d4T, que se ha mostrado que son activos contra HIV (Mitsuya, H. y otros, 1991, Science 249:1533-1544). Aunque beneficiosos, estos análogos de nucleósidos no son curativos, probablemente debido a la aparición rápida de mutantes de HIV resistentes a fármacos (Lander, B. y otros, 1989, Science 243:1731-1734). Además, los fármacos a menudo exhiben efectos secundarios tóxicos tales como supresión de la médula ósea, vómitos y anormalidades en la función hepática.
También se han hecho intentos de desarrollar fármacos que puedan inhibir la entrada viral en la célula, la fase primaria de la infección por HIV. Aquí, el foco ha estado puesto sobre CD4, el receptor de la superficie celular para HIV. Se ha mostrado que CD soluble recombinante, por ejemplo, inhibe la infección de células T CD-4^{+} por algunas cepas de HIV-1 (Smith, D. H. y otros, 1987, Science 238:1704-1707). Ciertos aislados de HIV-1 primarios, sin embargo, son relativamente menos sensibles a la inhibición por CD-4 recombinante (Daar, E. y otros, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6574-6579). Además, las pruebas clínicas con CD-4 soluble recombinante han producido resultados poco concluyentes (Schooley, R. y otros, 1990, Ann. Int. Med. 112:247-253; Kahn, J. O. y otros, 1990, Ann. Int. Med. 112:254-261; Yarchoan, R. y otros, 1989, Proc. Vth Int. Conf. on AIDS, p. 564, MCP 137).
Las últimas fases de la replicación del HIV, que implican el crucial procesamiento secundario específico para el virus de ciertas proteínas virales, también se han sugerido como posibles objetivos de fármacos anti-HIV. El procesamiento de las últimas fases depende de la actividad de una proteasa viral y se están desarrollando fármacos que inhiben esta proteasa (Erickson, J., 1990, Science 249:527-533). El éxito clínico de estos posibles fármacos todavía está en cuestión.
También se está prestando atención al desarrollo de vacunas para el tratamiento de infección por HIV. Las proteínas de la envuelta de HIV-1 (gp160, gp120, gp41) han demostrado ser los principales antígenos para anticuerpos anti-HIV presentes en pacientes con SIDA (Barin, y otros, 1985, Science 228:1094-1096). Hasta ahora, por lo tanto, estas proteínas parecen ser los candidatos más prometedores para actuar como antígenos para el desarrollo de una vacuna anti-HIV. A este fin, varios grupos han empezado a usar diversas porciones de gp160, gp120 y/o gp41 como objetivos inmunogénicos para el sistema inmunitario del huésped. Véanse, por ejemplo, Ivanoff, L. y otros, Patente de EE.UU. Nº 5.141.867; Saith, G. y otros, WO 92/22.654; Shafferman, A., WO 91/09.872; Formoso, C. y otros, WO 90/07.119. Sin embargo, los resultados clínicos relativos a estas vacunas posibles todavía quedan alejados en el futuro.
Así, aunque se está dirigiendo mucho esfuerzo al diseño y la prueba de fármacos antirretrovirales, todavía se necesita un tratamiento atóxico verdaderamente eficaz.
3. Sumario de la invención
La presente invención se refiere a DP-178 (ID SEC:1), un péptido sintético de 36 aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 638 a 673 de la proteína de transmembrana (TM) gp41 del aislado LAI de HIV-1, que exhibe potente actividad anti-HIV-1. Según se evidencia por el ejemplo presentado más adelante, en la Sección 6, la actividad antiviral de DP-178 (ID SEC:1) es tan alta que, sobre una base en peso, ningún otro agente anti-HIV conocido es eficaz a concentraciones tan bajas como aquellas a las que DP-178 (ID SEC:1) exhibe sus efectos inhibidores. La presente invención se refiere además a aquellas porciones, análogos y homólogos de DP-178 que también muestran tal actividad antiviral. La actividad antiviral de tales porciones, análogos y homólogos de DP-178 incluye, pero no se limita a, la inhibición de la transmisión de HIV a células CD-4^{+} no infectadas. La invención se refiere al uso de DP-178 (ID SEC:1) y fragmentos y/o análogos u homólogos de DP-178. Los péptidos pueden usarse como inhibidores de la transmisión retroviral, especialmente de HIV, humana y no humana a células no infectadas, y como herramientas de diagnóstico específicas para el tipo y/o el subtipo.
Se demuestra más adelante una modalidad de la invención en la que se muestra que una concentración extremadamente baja de DP-178 (ID SEC:1) y concentraciones muy bajas de un homólogo de DP-178 (ID SEC:3) son potentes inhibidores de la fusión célula-célula CD-4^{+} mediada por HIV-1 (es decir, formación sincitial) y la infección de células CD-4^{+} por virus libre de células. Además, se muestra que DP-178 (ID SEC:1) es atóxico para las células, incluso en concentraciones 3 logaritmos superiores que la concentración inhibidora de DP-178 (ID SEC:1).
También se describen péptidos de DP178 análogos en otros virus con envuelta que demuestran propiedades antivirales similares.
También se describen aquí péptidos análogos de DP-107, un péptido correspondiente a los aminoácidos 558-595 de la proteína de transmembrana (TM) de HIV-1_{LAI} de gp41, que están presentes en otros virus con envuelta, y demuestran propiedades antivirales. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento sorprendente de que los dominios DP-107 y DP-178 de la proteína gp41 se complejan no covalentemente entre sí, y que su interacción es necesaria para la actividad normal del virus. También se describen aquí métodos para identificar compuestos antivirales que rompen la interacción entre DP-107 y DP-178 y/o entre péptidos similares a DP-107 y similares a DP-
178.
Se proporcionan más adelante ejemplos en los que se identifican péptidos que tienen similitud estructural y/o antiviral con DP-07 y DP-178.
3.1. Definiciones
Los péptidos se definen aquí como compuestos orgánicos que comprenden dos o más aminoácidos ligados covalentemente por enlaces peptídicos. Los péptidos pueden mencionarse con respecto al número de aminoácidos constituyentes, es decir, un dipéptido contiene dos residuos de aminoácidos, un tripéptido contiene tres, etc. Los péptidos que contienen diez o menos aminoácidos pueden denominarse oligopéptidos, mientras que aquellos con más de diez residuos de aminoácido son polipéptidos.
Las secuencias peptídicas descritas aquí se representan mediante símbolos de una letra para los residuos de aminoácido como sigue:
A (alanina)
R (arginina)
N (asparagina)
D (ácido aspártico)
C (cisteína)
Q (glutamina)
E (ácido glutámico)
G (glicina)
H (histidina)
I (isoleucina)
L (leucina)
K (lisina)
M (metionina)
F (fenilalanina)
P (prolina)
S (serina)
T (treonina)
W (triptófano)
Y (tirosina)
V (valina)
4. Breve descripción de las figuras
Figura 1. Secuencia de aminoácidos de DP-178 (ID SEC:1) derivado de HIV_{LAI}; homólogos de DP-178 derivados de HIV-1_{SF2} (DP-185; ID SEC:3), HIV-1_{RF} (ID SEC:4) y HIV-1_{MN} (ID SEC:5); homólogos de DP-178 derivados de secuencias de aminoácidos de dos aislados de HIV-2 prototípicos, a saber, HIV-2_{rod} (ID SEC:6) y HIV-2_{NIHZ} (ID SEC:7); péptidos de control: DP-180 (ID SEC:2), un péptido que incorpora los residuos de aminoácido de DP-178 en una secuencia revuelta ("scrambled"); DP-118 (ID SEC:10) no relacionado con DP-178, que inhibe la infección por virus libres de células de HIV-1; DP-125 (ID SEC:8), no relacionado con DP-178, se mostró previamente que inhibía la infección por virus libres de células de HIV-1 (Wild y otros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:10, 537-10, 541); DP-116 (ID SEC:9), no relacionado con DP-178, se ha observado previamente que es negativo para la inhibición de la infección de HIV-1 usando el ensayo de infección de virus libres de células (Wild, y otros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:10, 537-10, 541). En todas las figuras, se usa el código de aminoácidos de una letra.
Figura 2. Inhibición de infección de virus libres de células de HIV-1 por péptidos sintéticos. IC50 se refiere a la concentración de péptidos que inhibe la producción de RT a partir de células infectadas en 50% en comparación con el control no tratado. Control: el nivel de RT producido por cultivos celulares no tratados infectados con el mismo nivel de virus que los cultivos tratados.
Figura 3. Inhibición de infección de virus libres de células de HIV-1 y HIV-2 por el péptido sintético DP-178 (ID SEC:1). IC50: concentración de péptido que inhibe la producción de RT en 50% en comparación con el control no tratado. Control: nivel de RT producido por cultivos celulares no tratados infectados con el mismo nivel de virus que los cultivos tratados.
Figura 4A. Ensayo de Inhibición de la Fusión. Inhibición por DP-178 (ID SEC:1) de la formación de sincitios mediada por aislados prototípicos de HIV-1. Los datos representan el número de sincitios inducidos por virus por célula.
Figura 4B. Ensayo de Inhibición de la Fusión. DP-180 (ID SEC:2): péptido de control revuelto ("scrambled"). DP-185 (ID SEC:3): homólogo de DP-178 derivado de aislado de HIV-1_{SF2}. Control: número de sincitios producidos en ausencia de péptido.
Figura 5. Ensayo de Inhibición de la Fusión: HIV-1 frente a HIV-2. Los datos representan el número de sincitios inducidos por virus por célula. NR: no realizado.
Figura 6. Estudio de citotoxicidad de DP-178 (ID SEC:1) y DP-116 (ID SEC:9) sobre células CEM. Se muestran datos de proliferación celular.
Figura 7. Representación esquemática de proteínas de fusión HIV-gp41 y proteína que se une a maltosa (MBP)-gp41. DP107 y DP178 son péptidos sintéticos basados en las dos hélices putativas de gp41. La letra P en las cajas de DP107 indica una mutación Ile a Pro en el número de aminoácido 578. Los residuos de aminoácido se numeran de acuerdo con Meyers y otros, Human Retroviruses and AIDS, 1991, Theoret. Biol. and Biophys. Group, Los Álamos Natl. Lab., Los Álamos, NM.
Figura 8. Una mutación puntual altera la conformación y la actividad anti-HIV de M41.
Figura 9. Supresión de actividad anti-HIV de DP178. Los ensayos de fusión celular se llevaron a cabo en presencia de DP178 10 nM y diversas concentraciones de M41\Delta178 o M41P\Delta178.
Figura 10. Unión de DP178 a la cremallera de leucina de gp41 analizada por ELISA.
Figuras 11A-B. Modelos para una transición estructural en la proteína de TM de HIV-1. Se proponen dos modelos que indican una transición estructural desde un oligómero natural a un estado fusogénico después de un suceso activador (posiblemente la unión de gp120 a CD4). Rasgos comunes de ambos modelos incluyen (1) el estado natural se mantiene unido por interacciones proteína-proteína no covalentes para formar el heterodímero de gp120/41 y otras interacciones, principalmente a través de sitios interactivos de gp41, para formar homooligómeros en la superficie viral de los complejos gp120/41; (2) protección del péptido fusogénico hidrófobo en el extremo N (F) en el estado natural; y (3) el dominio de la cremallera de leucina (DP107) existe como un homooligómero arrollado doblemente sólo en el estado fusogénico. Las principales diferencias en los dos modelos incluyen el estado estructural (natural o fusogénico) en el que los dominios DP107 y DP178 están complejados entre sí. En el primer modelo (A; figura 11A) esta interacción se produce en el estado natural y en B durante el estado fusogénico. Cuando se activa, el complejo de fusión en el modelo representado en (A) se genera a través de la formación de interacciones doblemente arrolladas en dominios DP107 homólogos dando como resultado una hélice \alpha extendida. Este cambio de conformación sitúa al péptido de fusión para la interacción con la membrana celular. En el segundo modelo (B; figura 11B), el complejo fusogénico se estabiliza mediante la asociación del dominio DP178 con el doble arrollamiento de DP107.
Figura 12. Diseño del motivo que usa la colocación repetida de heptadas de aminoácidos de dobles arrollamientos conocidos.
Figura 13. Diseño del motivo que usa la colocación repetida de heptadas propuesta de aminoácidos de DP-107 y DP-178.
Figura 14. Diseño de motivos híbridos que cruza GCN4 y DP-107.
Figura 15. Diseño de motivos híbridos que cruza GCN4 y DP-178.
Figura 16. Diseño de motivos híbridos 107x178x4, que cruza DP-107 y DP-178. Se encontró que este motivo era el más coherente para identificar regiones peptídicas similares a DP-107 y similares a DP-178 relevantes.
Figura 17. Diseño de motivos híbridos ALLMOTI5, que cruza GCN4, DP-107 y DP-178.
Figura 18. Diseño de motivos híbridos que cruza GCN4, DP-107, DP-178, c-Fos, c-Jun, c-Myc y el bucle Flu 36.
Figura 19. Motivos diseñados para identificar motivos de prolina-cremallera de leucina N-terminales.
Figura 20. Resultados de búsqueda para la proteína de la envuelta de HIV-1 (aislado BRU) gp41. Denominaciones de los motivos de búsqueda de secuencias: Picas (\ding{171}): 107x178x4; Corazones (\ding{170}) ALLMOTI5; Tréboles (\ding{168}): PLZIP; Diamantes (\ding{169}): región de transmembrana (los dominios de transmembrana putativos se identificaron usando un programa PC/Gene diseñado para buscar tales regiones peptídicas). Asterisco (*): método de Lupas. Las secuencias de aminoácidos identificadas por cada motivo están acotadas por los caracteres respectivos. Secuencias representativas elegidas basándose en todas las búsquedas están subrayadas y en negrita. Las secuencias DP-107 y DP-178 están marcadas y adicionalmente doblemente subrayadas y en cursiva.
Figura 21. Resultados de búsqueda para glicoproteína de fusión de la cepa A2 del virus sincitial respiratorio (RSV) humano, F1. Las denominaciones de los motivos de búsqueda de secuencias son como en la Figura 20.
Figura 22. Resultados de búsqueda para proteína de envuelta del virus de inmunodeficiencia simiesca (SIV), gp41 (aislado AGM3). Las denominaciones de los motivos de búsqueda de secuencias son como en la Figura 20.
Figura 23. Resultados de búsqueda para glicoproteína de fusión 1 del virus de fusión 1 del virus del moquillo canino (cepa Onderstepoort). Las denominaciones de los motivos de búsqueda de secuencias son como en la figura 20.
Figura 24. Resultados de búsqueda para glicoproteína de fusión F1 del virus de la enfermedad de Newcastle (cepa Australia-Victoria/32). Las denominaciones de los motivos de búsqueda de secuencias son como en la figura 20.
Figura 25. Resultados de búsqueda para glicoproteína de fusión F1 del virus de parainfluencia 3 humana (cepa NIH 47885). Las denominaciones de los motivos de búsqueda de secuencias son como en la figura 20.
Figura 26. Resultados de búsqueda para precursor de hemaglutinina HA2 del virus de influenza A (cepa A/AICHI/
2/68). Las denominaciones de búsqueda de secuencias son como en la figura 20.
Figura 27. Similitud estructural de doble arrollamiento y actividad antiviral anti-RSV de péptidos 35-meros sintetizados utilizando la secuencia de un péptido F2 de RSV de 48 aminoácidos que abarca las secuencias identificada utilizando las búsquedas asistidas por ordenador descritas aquí. Para la localización exacta y los motivos utilizados, véase la figura 21. Los símbolos "+" son relativamente indicadores de cualquier similitud estructural o actividad antiviral, indicando un mayor número de símbolos "+" una similitud o una actividad antiviral relativa superior.
Figura 28. Similitud estructural de doble arrollamiento y actividad antiviral anti-RSV de péptidos 35-meros sintetizados utilizando la secuencia de un péptido F1 de RSV de 53 aminoácidos que abarca las secuencias identificadas utilizando las búsquedas asistidas por ordenador descritas aquí. Véase la figura 21 para la localización exacta y los motivos usados. Los símbolos "+" son como se describen para la figura 27.
Figura 29. Similitud estructural de doble arrollamiento y actividad antiviral anti-virus de parainfluenza humana 3 (HPF3) de péptidos 35-meros sintetizados utilizando la secuencia de un péptido de HPF3 de 56 aminoácidos que abarca las secuencias identificadas utilizando búsquedas asistidas por ordenador descritas aquí. Para la localización exacta y los motivos utilizados, véase la figura 25. Los símbolos "+" son como se describe en la figura 27.
Figura 30. Similitud estructural de doble arrollamiento y actividad antiviral anti-HPF3 de péptidos 35-meros sintetizados utilizando la secuencia de un péptido de HPF3 de 70 aminoácidos que abarca las secuencias identificadas utilizando las búsquedas asistidas por ordenador descritas aquí. Para la localización exacta y los motivos utilizados, véase la figura 25. Los símbolos "+" son como se describe en la figura 27.
5. Descripción detallada de la invención
En diversos aspectos, la invención proporciona:
Un péptido que tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en:
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z (ID SEC Nº:1)
X-LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
y X-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
en la que los residuos de aminoácido son presentados mediante el código de una sola letra;
X es un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo, un grupo hidrófobo o un grupo portador macromolecular;
en el que el grupo hidrófobo X es carbobenzoxilo, dansilo o t-butoxicarbonilo;
Z es un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo hidrófobo t-butiloxicarbonilo o un grupo portador macromolecular;
en donde el grupo portador macromolecular es un conjugado de lípido-ácido graso, un polietilenglicol o un resto carbohidrato.
Un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos
X-YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z (ID SEC Nº:3)
en la que los residuos de aminoácido son presentados mediante el código de una sola letra;
X es un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo, un grupo hidrófobo o un grupo portador macromolecular;
en el que el grupo hidrófobo X es carbobenzoxilo, dansilo o t-butoxicarbonilo;
Z es un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo hidrófobo t-butiloxicarbonilo o un grupo portador macromolecular;
en donde el grupo portador macromolecular es un conjugado de lípido-ácido graso, un polietilenglicol o un resto carbohidrato.
Un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos
X-YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF-Z (ID SEC Nº:4)
en la que los residuos de aminoácido son presentados mediante el código de una sola letra;
X es un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo, un grupo hidrófobo o un grupo portador macromolecular;
en el que el grupo hidrófobo X es carbobenzoxilo, dansilo o t-butoxicarbonilo;
Z es un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo hidrófobo t-butiloxicarbonilo o un grupo portador macromolecular;
en donde el grupo portador macromolecular es un conjugado de lípido-ácido graso, un polietilenglicol o un resto carbohidrato.
Un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos
X-YTSLIYSLLEKSQTQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z (ID SEC Nº:5)
en la que los residuos de aminoácido son presentados mediante el código de una sola letra;
X es un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo, un grupo hidrófobo o un grupo portador macromolecular;
en el que el grupo hidrófobo X es carbobenzoxilo, dansilo o t-butoxicarbonilo;
Z es un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo hidrófobo t-butiloxicarbonilo o un grupo portador macromolecular;
en donde el grupo portador macromolecular es un conjugado de lípido-ácido graso, un polietilenglicol o un resto carbohidrato.
Un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (ID SEC Nº:1)
en la que los residuos de aminoácido son presentados mediante el código de una sola letra;
cualquiera de los péptidos mencionados previamente para usar como un agente antiviral en el tratamiento de HIV-1;
el uso de cualquiera de los péptidos mencionados previamente para la fabricación de un medicamento para usar como un agente antiviral en el tratamiento de la infección por HIV-1;
y
una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los péptidos mencionados previamente y un portador farmacéuticamente aceptable.
Sin embargo, se describen generalmente aquí péptidos que exhiben potente actividad antiviral. Estos péptidos incluyen DP-178 (ID SEC:1), un péptido de 36 aminoácidos derivado de gp41, fragmentos y/o análogos de DP-178, y péptidos que son homólogos a DP-178. Además, estos péptidos pueden incluir péptidos que exhiben actividad antiviral que son análogos a DP-107, un péptido de 38 aminoácidos correspondiente a los residuos 558 a 595 de la proteína de transmembrana (TM) gp41 de HIV-1_{LAI}, y que están presentes en otras proteínas virales con envuelta. También se describen aquí ensayos para probar las actividades antivirales de tales péptidos. Los inventores han realizado el descubrimiento sorprendente de que los dominios DP-107 y DP-178 de la proteína gp41 se complejan entre sí a través de interacciones proteína-proteína no covalentes que son necesarias para la actividad normal del virus. Como tales, se describen métodos para la identificación de compuestos antivirales que rompen la interacción entre péptidos DP-107 y DP-178 y entre péptidos similares a DP-107 y similares a DP-178. Finalmente, se detalla el uso de los péptidos como inhibidores de la transmisión viral y retroviral, especialmente de HIV, no humana y humana, como también el uso de los péptidos como indicadores diagnósticos de la presencia de virus, especialmente retrovirus, específicos.
Aunque sin limitarse a ninguna teoría de funcionamiento, el siguiente modelo se propone para explicar la potente actividad anti-HIV de DP-178 basándose, en parte, en los experimentos descritos en los ejemplos de trabajo, más adelante. En la proteína viral, gp41, DP-178 corresponde a una región de hélice \alpha putativa situada en el extremo C-terminal del ectodominio de gp41, y parece asociarse con un sitio distal de gp41 cuya estructura interactiva está influenciada por el motivo de la cremallera de leucina, una estructura de doble arrollamiento, denominado DP-107. La asociación de estos dos dominios puede reflejar una conexión molecular o "broche molecular" implicado íntimamente en el proceso de fusión. Es de interés que las mutaciones en el motivo de hélice \alpha C-terminal de gp41 (es decir, el motivo D178) tiendan a potenciar la capacidad de fusión de gp41, mientras que las mutaciones en la región de la cremallera de leucina (es decir, el motivo DP107) disminuyen o suprimen la capacidad de fusión de la proteína viral. Puede ser que el motivo de la cremallera de leucina esté implicado en la fusión de membranas mientras que el motivo de hélice \alpha C-terminal sirva como una seguridad molecular para regular la disponibilidad de la cremallera de leucina durante la fusión de membranas inducida por virus.
Basándose en lo precedente, se proponen dos modelos de fusión de membranas mediada por gp41 que se muestran esquemáticamente en la figura 11A-B. La razón de proponer dos modelos es que la naturaleza temporal de la interacción entre las regiones definidas por DP107 y DP178, hasta ahora, no puede concretarse. Cada modelo prevé dos conformaciones para gp41 -una en estado "natural" como podría encontrarse en un virión en reposo. La otra en un estado "fusogénico" para reflejar cambios de conformación activados después de la unión de gp120 a CD4 y justo antes de la fusión con la membrana celular elegida. La fuerte afinidad de unión entre gp120 y CD4 puede representar realmente el activador para el proceso de fusión obviando la necesidad de un cambio de pH tal como el que se produce para virus que se fusionan dentro de vesículas intracelulares. Los dos rasgos principales de ambos modelos son: (1) las secuencias de la cremallera de leucina (DP107) en cada cadena de la envuelta oligómera se mantienen separadas en estado natural y solo se dejan acceder una a otra en estado fusogénico a fin de formar los dobles arrollamientos extremadamente estables, y (2) la asociación de los sitios DP178 y DP107 según existen en gp41 se produce en estado natural o fusogénico. La figura 11A representa la interacción DP178/DP107 en estado natural como una clase molecular. Por otra parte, si se supone que la forma más estable de la envuelta se produce en el estado fusogénico, puede considerarse el modelo de la figura 11B.
Cuando se sintetizan como péptidos, tanto DP107 como DP178 son potentes inhibidores de la infección y la fusión por HIV, probablemente en virtud de su capacidad para formar complejos con gp41 viral e interferir con su proceso fusogénico; por ejemplo, durante la transmisión estructural de la proteína viral desde la estructura natural hasta el estado fusogénico, los péptidos DP178 y DP107 pueden obtener acceso a sus sitios de unión respectivos en la gp41 viral y ejercer una influencia disruptiva. Péptidos DP107 que demuestran actividad anti-HIV se describen en la solicitud Nº de Serie 07/927.532, en tramitación conjunta, de los solicitantes, presentada el 7 de Agosto de 1992.
Según se muestra en los ejemplos de trabajo, más adelante, una proteína gp41 recombinante truncada correspondiente al ectodominio de gp41 que contiene los dominios tanto DP107 como DP178 (excluyendo el péptido de fusión, la región de transmembrana y el dominio citoplásmico de gp41) no inhibía la fusión inducida por HIV-1. Sin embargo, cuando se introducía una sola mutación para interrumpir la estructura de doble arrollamiento del dominio DP107 -una mutación que da como resultado una pérdida total de actividad biológica en péptidos DP107- la proteína recombinante inactiva se transformaba en un inhibidor activo de la fusión inducida por HIV-1. Esta transformación puede resultar de la liberación del potente dominio DP178 procedente de un broche molecular con la cremallera de leucina, dominio DP107.
Para la claridad del análisis, los principios previos se describirán para inhibidores peptídicos DP178 de HIV. Sin embargo, los principios pueden aplicarse análogamente a otros virus con envuelta fusogénicos, incluyendo, pero no limitados a, los virus que contienen los péptidos listados en las Tablas V a X, más adelante.
5.1. Péptidos DP-178 y similares a DP-178
El péptido DP-178 (ID SEC:1) de la invención corresponde a los residuos de aminoácido 638 a 673 de la proteína de transmembrana gp41 del aislado de HIV-1_{LAI} y tiene la secuencia de 36 aminoácidos (leyendo desde el extremo amino al carboxi):
NH_{2}-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH (ID SEC Nº:1)
Además del 36-mero DP-178 (ID SEC:1) de longitud completa, péptidos útiles incluyen truncamientos del péptido DP-178 (ID SEC:1) que exhiben actividad antiviral. Tales péptidos DP-178 (ID SEC:1) truncados pueden comprender péptidos de entre 3 y 36 residuos de aminoácido (es decir, péptidos que varían en tamaño desde un tripéptido hasta un polipéptido 36-mero) y pueden incluir, pero no se limitan a, los listados en las Tablas I y II más adelante. Las secuencias peptídicas en estas tablas se listan desde el extremo amino (izquierda) hasta el carboxi (derecha). "X" puede representar un grupo amino (-NH_{2}) y "Z" puede representar un grupo carboxilo (-COOH). Alternativamente, según se describe más adelante, "X" y/o "Z" pueden representar un grupo hidrófobo, un grupo acetilo, un grupo FMOC, un grupo amido o una macromolécula ligada covalentemente.
TABLA I Truncamientos en carboxi de DP-178 (ID SEC:1)
1
Se usa el código de aminoácidos de una letra.
Adicionalmente,
"X" puede representar un grupo amino, un grupo hidrófobo, incluyendo, pero no limitado a, carbobenzoxilo, dansilo o t-butiloxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC); un grupo portador macromolecular incluyendo, pero no limitado a, conjugados de lípido-ácido graso, polietilenglicol o carbohidratos.
"Z" puede representar un grupo carboxilo, un grupo amido; un grupo t-butiloxicarbonilo; un grupo portador macromolecular incluyendo, pero no limitado a, conjugados de lípido-ácido graso, polietilenglicol o carbohidratos.
TABLA II Truncamientos en amino de DP-178 (ID SEC:1)
2
Se usa el código de aminoácidos de una letra.
Adicionalmente,
"X" puede representar un grupo amino, un grupo hidrófobo, incluyendo, pero no limitado a, carbobenzoxilo, dansilo o t-butiloxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo; un grupo portador macromolecular incluyendo, pero no limitado a, conjugados de lípido-ácido graso, polietilenglicol o carbohidratos.
"Z" puede representar un grupo carboxilo, un grupo amido; un grupo t-butiloxicarbonilo; un grupo portador macromolecular incluyendo, pero no limitado a, conjugados de lípido-ácido graso, polietilenglicol o carbohidratos.
Otros péptidos antivirales útiles incluyen análogos de DP-178 y/o truncamientos de DP-178 que pueden incluir, pero no se limitan a, péptidos que comprenden la secuencia de DP-178 (ID SEC:1) o la secuencia truncada de DP-178, que contienen una o más substituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos. Análogos de homólogos de DP-178 se describen más adelante. Los análogos de DP-178 de la invención exhiben actividad antiviral y, además, pueden poseer rasgos ventajosos adicionales, tales como, por ejemplo, biodisponibilidad y/o estabilidad incrementadas o reconocimiento inmunitario reducido del huésped.
Las proteínas de la envuelta de HIV-1 y HIV-2 son estructuralmente diferentes, pero existe una notable conservación de aminoácidos dentro de las regiones correspondientes a DP-178 de HIV-1 y HIV-2. La conservación de aminoácidos es de naturaleza periódica, sugiriendo alguna conservación de estructura y/o función. Por lo tanto, una posible clase de substituciones de aminoácidos incluiría aquellos cambios de aminoácidos que se predice que estabilizan la estructura de los péptidos DP-178 de la invención.
Las substituciones de aminoácidos pueden ser de naturaleza conservada o no conservada. Las substituciones de aminoácidos conservadas consisten en reemplazar uno o más aminoácidos de la secuencia peptídica de DP-178 (ID SEC:1) por aminoácidos de características de carga, tamaño y/o hidrofobia similares, tal como, por ejemplo, una substitución de aminoácidos de ácido glutámico (E) por ácido aspártico (D). Cuando solo se realizan substituciones conservadas, el péptido resultante es funcionalmente equivalente a DP-178 (ID SEC:1) o el péptido de DP-178 del que se deriva. Las substituciones no conservadas consisten en reemplazar uno o más aminoácidos de la secuencia peptídica de DP-178 (ID SEC:1) por aminoácidos que poseen características de carga, tamaño y/o hidrofobia diferentes, tal como, por ejemplo, una substitución de ácido glutámico (E) por valina (V).
Las inserciones de aminoácidos pueden consistir en residuos de aminoácidos simples o alargamientos de residuos que varían de 2 a 15 aminoácidos de longitud. Pueden introducirse una o más inserciones en DP-178 (ID SEC:1), fragmentos de DP-178, análogos y/u homólogos de DP-178 (descritos más adelante).
Las deleciones de DP-178 (ID SEC:1), fragmentos de DP-178, análogos y/u homólogos de DP-178 (descritos más adelante) también se describen aquí. Tales deleciones consisten en la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia peptídica de DP-178 o similar a DP-178, siendo la longitud límite inferior de la secuencia peptídica resultante de 4 a 6 aminoácidos. Tales deleciones pueden implicar una sola porción discreta contigua o más de una de las secuencias polipeptídicas.
Se describen aquí péptidos que son homólogos de DP-178 (ID SEC:1) y/o truncamientos de DP-178 que exhiben actividad antiviral. Tales homólogos de DP-178 son péptidos cuyas secuencias de aminoácidos están comprendidas por las secuencias de aminoácidos de regiones peptídicas de otros virus (es decir, diferentes a HIV-1_{LIA}) que corresponden a la región peptídica de gp41 de la que se derivaba DP-178 (ID SEC:1). Tales virus pueden incluir, pero no se limitan a, otros aislados de HIV-1 y aislados de HIV-2. Homólogos de DP-178 derivados de la región peptídica de gp41 correspondiente de otros aislados de HIV-1 (es decir, no HIV-1_{LIA}) pueden incluir, por ejemplo, las secuencias peptídicas que se muestran a continuación.
NH_{2}-YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH (DP-185; ID SEC Nº:3);
NH_{2}-YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF-COOH (ID SEC Nº:4);
NH_{2}-YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH (ID SEC Nº:5).
Las ID SEC:3 (DP-185), ID SEC:4 e ID SEC:5 se derivan de aislados de HIV-1_{SF2}, HIV-1_{RF} y HIV-1_{MN}, respectivamente. Los residuos de aminoácido subrayado se refieren a los residuos que difieren de la posición correspondiente del péptido DP-178 (ID SEC:1). Uno de tales homólogos de DP-178, DP-185 (ID SEC:3), se describe en el Ejemplo de Trabajo presentado en la Sección 6, más adelante, donde se demuestra que DP-185 (ID SEC:3) exhibe actividad antiviral. Homólogos de DP-178 también pueden incluir truncamientos, substituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos, según se describe previamente.
Además, existen notables similitudes, según se muestra en la figura 1, dentro de las regiones de aislados de HIV-1 y HIV-2 que corresponden a la secuencia de DP-178. Un homólogo de DP-178 derivado del aislado de HIV-2_{NIHZ} tiene la secuencia de 36 aminoácidos (leyendo desde el extremo amino al carboxi):
NH_{2}-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-COOH (ID SEC:7)
La Tabla III y la Tabla IV muestran algunos posibles truncamientos del homólogo de DP-178 de HIV-2_{NIHZ}, que pueden comprender péptidos de entre 3 y 36 residuos de aminoácido (es decir, péptidos que varían en tamaño desde un tripéptido hasta un polipéptido 36-mero). Las secuencias peptídicas en estas tablas se listan desde el extremo amino (izquierdo) hasta el carboxi (derecha). "X" puede representar un grupo amino (-NH_{2}) y "Z" puede representar un grupo carboxilo (-COOH). Alternativamente, según se describe más adelante, "X" y/o "Z" pueden representar un grupo hidrófobo, un grupo acetilo, un grupo FMOC, un grupo amido o una macromolécula ligada covalentemente, según se describe más adelante.
TABLA III Truncamientos en carboxi del homólogo de DP-178 de HIV-2_{NIHZ}
3
Se usa el código de aminoácidos de una letra.
Adicionalmente,
"X" puede representar un grupo amino, un grupo hidrófobo, incluyendo, pero no limitado a, carbobenzoxilo, dansilo o t-butiloxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC); un grupo portador macromolecular incluyendo, pero no limitado a, conjugados de lípido-ácido graso, polietilenglicol o carbohidratos.
"Z" puede representar un grupo carboxilo, un grupo amido; un grupo t-butiloxicarbonilo; un grupo portador macromolecular incluyendo, pero no limitado a, conjugados de lípido-ácido graso, polietilenglicol o carbohidratos.
TABLA IV Truncamientos en amino del homólogo de DP-178 de HIV-2_{NIHZ}
4
Se usa el código de aminoácidos de una letra.
Adicionalmente,
"X" puede representar un grupo amino, un grupo hidrófobo, incluyendo, pero no limitado a, carbobenzoxilo, dansilo o t-butiloxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC); un grupo portador macromolecular incluyendo, pero no limitado a, conjugados de lípido-ácido graso, polietilenglicol o carbohidratos.
"Z" puede representar un grupo carboxilo, un grupo amido; un grupo t-butiloxicarbonilo; un grupo portador macromolecular incluyendo, pero no limitado a, conjugados de lípido-ácido graso, polietilenglicol o carbohidratos.
5.2. Péptidos antivirales análogos de DP-107 Y DP-178
Secuencias peptídicas correspondientes funcionalmente, y así análogas a, las secuencias de DP-178 descritas previamente en la sección 5.1 pueden encontrarse en otros virus de envuelta diferentes a HIV-1. Además, secuencias peptídicas funcionalmente correspondientes, y así análogas a, DP-178, un péptido antiviral derivado de HIV-1, también pueden encontrarse en otros virus de envuelta distintos a HIV-1. DP-107 es un péptido de 38 aminoácidos correspondiente a los residuos 558 a 595 de la proteína de transmembrana (TM) gp41 de HIV-1_{LAI}, que exhibe potente actividad antiviral. DP-107 se describe más a fondo en la solicitud de Patente de EE.UU. en tramitación conjunta, del solicitante, Nº de Serie 07/927.532. Estos péptidos análogos y similares a DP-107 y similares a DP-178 presentes en proteína de TM de virus de envuelta exhiben preferiblemente actividad antiviral, lo más preferiblemente actividad antiviral que es específica para el virus en el que se encuentran sus secuencias naturales.
Los péptidos similares a DP-107 y similares a DP-178 pueden identificarse, por ejemplo, utilizando una estrategia de búsqueda asistida por ordenador tal como la que se describe y se demuestra, más adelante, en los Ejemplos presentados en las Secciones 9 a 16. La estrategia de búsqueda identifica regiones de otros virus que son similares en la estructura secundaria predicha a DP-107 y DP-178.
Esta estrategia de búsqueda se describe a fondo, más adelante, en el Ejemplo presentado en la Sección 9. Aunque esta estrategia de búsqueda se basa, en parte, en un motivo de aminoácidos primario deducido de DP-107 y DP-178, no se basa solamente en la búsqueda de homologías de secuencias de aminoácidos primarias, ya que tales homologías de secuencias de proteínas existen dentro, pero no entre grupos principales de virus. Por ejemplo, la homología de la secuencia de aminoácidos primaria es alta dentro de la proteína de TM de diferentes cepas de HIV-1 o dentro de la proteína de TM de diferentes aislados de virus de inmunodeficiencia simiesca (SIV). La homología de la secuencia de aminoácidos primaria entre HIV-1 y SIV, sin embargo, es suficientemente baja para no ser útil. No es posible, por lo tanto, encontrar péptidos similares a DP-107 o DP-178 dentro de otros virus, ya sea estructuralmente, o de otro modo, basándose en la homología de secuencia primaria solamente.
Además, aunque sería potencialmente útil identificar disposiciones de secuencia primarias de aminoácidos basándose en las características fisicoquímicas de diferentes clases de aminoácidos en vez de basándose en los propios aminoácidos específicos, por ejemplo, concentrándose en la naturaleza de doble arrollamiento de la secuencia peptídica, un algoritmo informático diseñado por Lupas y otros para identificar tales propensiones al doble arrollamiento de regiones dentro de proteínas (Lupas, A. Y otros, 1991, Science, 252:1162-1164) es inadecuado para identificar regiones proteínicas análogas a DP-107 o DP-178.
Específicamente, el análisis de gp160 de HIV-1 (que contiene tanto gp120 como gp41) usando el algoritmo de Lupas no identifica la región de doble arrollamiento dentro de DP-107. Sin embargo, sí identifica una región dentro de DP-178 empezando 8 aminoácidos N-terminales al inicio de DP-178 y terminando 8 aminoácidos desde el extremo C. Se ha mostrado experimentalmente que el péptido DP-107 forma un doble arrollamiento estable. Por lo tanto, una búsqueda basada en el algoritmo de búsqueda de Lupas no habría identificado la región de doble de arrollamiento de DP-107. A la inversa, el algoritmo de Lupas identificaba la región DP-178 como un motivo de doble arrollamiento potencial. Sin embargo, el péptido DP-178 derivado de esta región no formaba un doble arrollamiento en solución. Una posible explicación de la incapacidad del algoritmo de búsqueda de Lupas para identificar precisamente secuencias de doble arrollamiento dentro de la TM de HIV-1 es que el algoritmo de Lupas se basa en la estructura de dobles arrollamientos de proteínas que no son estructuralmente o funcionalmente similares a las proteínas de TM de virus, cuyos péptidos antivirales (por ejemplo, DP-107 y DP-178) se describen aquí.
La estrategia de búsqueda informática, según se demuestra en los ejemplos presentados más adelante, en las Secciones 9 a 16, identifica satisfactoriamente regiones de proteínas de TM virales similares a DP-107 o DP-178. Esta estrategia de búsqueda se diseñó para usarse con paquetes de bases de datos de secuencias disponibles comercialmente, preferiblemente PC/Gene. Una serie de motivos se diseñó y se trató mediante ingeniería para variar en restricción desde muy estricta a muy amplia, según se analiza en la Sección 9.
Entre los motivos de búsqueda de secuencias proteínicas que pueden utilizarse en tal búsqueda de péptidos antivirales similares a DP-107 y similares a DP-178 asistida por ordenador están el motivo 107x178x4, el motivo ALLMOTI5 y la serie PLZIP de motivos, cada uno de los cuales se describe en el ejemplo presentado en la Sección 9, más adelante, prefiriéndose 107x178x4.
Se cree que las secuencias de doble arrollamiento consisten en repeticiones de aminoácidos heptádicas. Para facilidad de descripción, las posiciones de los aminoácidos dentro de las repeticiones heptádicas se denominan a veces A a G, siendo la primera posición A, la segunda B, etc. Los motivos usados para identificar secuencias similares a DP-107 y similares a DP-178 aquí se diseñan para buscar e identificar específicamente tales repeticiones heptádicas. En las descripciones de cada uno de los motivos descritos más adelante, aminoácidos encerrados por corchetes, es decir [], indican los únicos residuos de aminoácido que son aceptables en la posición dada, mientras que los aminoácidos encerrados por llaves, es decir {}, indican los únicos aminoácidos que son inaceptables en la posición de la heptada dada. Cuando un grupo de aminoácidos entre corchetes o entre llaves es seguido por un número entre paréntesis, es decir (), se refiere al número de posiciones de aminoácidos subsiguientes para el que se mantiene el grupo diseñado de aminoácidos, por ejemplo un "2" significa "para las dos posiciones de aminoácido de la heptada siguientes".
El ALLMOTI5 se escribe como sigue:
5
Traduciendo este motivo, se leería: ``en la primera posición (A) de la heptada, cualquier residuo de aminoácido excepto C, D, G, H o P es aceptable, en las dos posiciones de aminoácido siguientes (B,C), cualquier residuo de aminoácido excepto C, F o P es aceptable, en la cuarta posición de la heptada (D), cualquier residuo de aminoácido excepto D, G, H o P es aceptable, en las tres posiciones de aminoácidos siguientes (E, F, G), cualquier posición de aminoácido es aceptable. Este motivo se diseña para buscar cinco repeticiones heptádicas consecutivas (así, la repetición de la primera línea cinco veces), significando que busca péptidos de un tamaño 35-mero. También puede diseñarse para buscar 28-meros, repitiendo sólo el motivo inicial cuatro veces. Con respecto al motivo ALLMOTI5, se prefiere una búsqueda de 35-meros. Las secuencias virales identificas de tal motivo ALLMOTI5 se listan en la Tabla 5, más adelante, al final de esta sección. Las secuencias virales listadas en la Tabla 5 exhiben potencialmente actividad antiviral y pueden ser útiles en la identificación de compuestos antivirales.
El motivo 107x178x4 se escribe como sigue:
6
Traduciendo este motivo, se leería: ``en la primera posición (A) de la heptada, cualquier residuo de aminoácido excepto E, F, I, K, L, N, Q, S, T, V, W o Y es aceptable, en las dos posiciones de aminoácido siguientes (B,C), cualquier residuo de aminoácido excepto C, F, M o P es aceptable, en la cuarta posición (D), cualquier residuo de aminoácido excepto E, F, I, K, L, N, Q, S, T, U, W o Y es aceptable, en las tres posiciones de aminoácidos siguientes (E, F, G), cualquier residuo de aminoácido excepto C, F, M o P es aceptable. Este motivo se diseña para buscar cuatro repeticiones heptádicas consecutivas (así, la repetición de la primera línea cuatro veces), significando que busca péptidos de un tamaño 28-mero. También puede diseñarse para buscar 35-meros, repitiendo el motivo inicial cinco veces. Con respecto al motivo 107x178x4, se prefiere una búsqueda de 28-meros. Las secuencias virales identificadas a través de tal motivo 107x178x4 se listan en la Tabla 5, más adelante, al final de esta Sección. Las secuencias virales listadas en la Tabla 5 exhiben potencialmente actividad antiviral y pueden ser útiles en la identificación de compuestos antivirales.
La serie PLZIP de motivos es como se lista en la figura 19. Estos motivos se diseñan para identificar heptadas similares al doble arrollamiento de la cremallera de leucina en las que está presente al menos un residuo de prolina a una distancia predefinida N-terminal a la repetición. Estos motivos PLZIP encuentran regiones de proteínas con similitudes con DP-178 de HIV-1 generalmente situadas justo N-terminales al anclaje de transmembrana. Estos motivos pueden producirse de acuerdo con la misma convención descrita previamente. Cada línea dibujada en la figura 19 representa un solo motivo de búsqueda completo. "X" en estos motivos se refiere a cualquier residuo de aminoácido. En casos en los que un motivo contiene dos números entre paréntesis, esto se refiere a un número variable de residuos de aminoácidos. Por ejemplo, X (1,12) se traduce por "los de uno a doce residuos de aminoácido siguientes, inclusive, pueden ser cualquier aminoácido".
Las Tablas VI a X, más adelante, al final de esta Sección, listan aciertos de tales motivos PLZIP. Las secuencias virales listadas en la Tabla VI a X exhiben potencialmente actividad antiviral y pueden ser útiles en la identificación de compuestos antivirales.
Los compuestos presentados en las Secciones 17 y 18, más adelante, demuestran que las secuencias del virus sincitial respiratorio y el virus de parainfluenza identificadas a través de tal búsqueda informática exhiben características antivirales y/o estructurales similares a las de DP-107 y DP-178.
Los péptidos análogos similares a DP-107 y similares a DP-178, además, pueden contener cualquiera de los grupos adicionales descritos para DP-178, previamente, en la Sección 5.1. Por ejemplo, estos péptidos pueden incluir cualquiera de los grupos aminoterminales adicionales que puede representar "X" de las Tablas I a IV, y también pueden incluir cualquiera de los grupos carboxiterminales que puede representar "Z" de las Tablas I a IV.
Adicionalmente, tales péptidos similares a DP-107 y similares a DP-178 pueden incluir además péptidos similares a DP-107 o similares a DP-178, tales como los listados en las Tablas V a X, previamente, que contienen una o más substituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos. Además, se describen análogos de tales péptidos similares a DP-107 y DP-178. Tales análogos pueden exhibir actividad antiviral incrementada y, además, pueden poseer biodisponibilidad y/o estabilidad incrementadas o reconocimiento inmunitario reducido.
Las substituciones, inserciones y deleciones de aminoácidos similares a DP-107 y similares a DP-178 son como se describen para DP-178, previamente, en la Sección 5.1. Modificaciones análogas son como las que se describen, más adelante, en la Sección 5.3.
TABLA V Sumario de Resultados de Búsqueda para los Motivos 107x178x4 y ALLMOTI5
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
TABLA VI Sumario de Resultados de Búsqueda para los Motivos PCTLZIP, P1CTLZIP y P2CTLZIP
21
22
23
24
25
26
27
TABLA VII Sumario de Resultados de Búsqueda para los Motivos P3CTLZIP, P4CTLZIP, P5CTLZIP y P6CTLZIP
28
29
30
31
TABLA VIII Sumario de Resultados de Búsqueda para los Motivos P7CTLZIP, P8CTLZIP, y P9CTLZIP
32
33
34
TABLA IX Sumario de Resultados de Búsqueda para el Motivo P12CTLZIP
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
TABLA X Sumario de Resultados de Búsqueda para el Motivo P23CTLZIP
48
49
50
51 
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5.3. Síntesis de péptidos
Los péptidos de la invención pueden sintetizarse o prepararse mediante técnicas bien conocidas en la especialidad. Véase, por ejemplo, Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., N.Y. Los péptidos cortos, por ejemplo, pueden sintetizarse sobre un soporte sólido o en solución. Los péptidos más largos pueden elaborarse usando técnicas de DNA recombinante. Aquí, las secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la invención pueden sintetizarse, y/o clonarse, y expresarse de acuerdo con técnicas bien conocidas por los expertos en la especialidad. Véanse, por ejemplo, Sambrook, y otros, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press, N.Y.
Los péptidos de la invención pueden sintetizarse alternativamente de modo que uno o más de los enlaces que conectan los residuos de aminoácido de los péptidos sean enlaces no peptídicos. Estos enlaces no peptídicos alternativos pueden formarse utilizando reacciones bien conocidas por los expertos en la especialidad y pueden incluir, pero no se limitan a, enlaces imino, éster, hidrazida, semicarbazida y azo, por nombrar solo unos pocos. En otra modalidad más, los péptidos de la invención pueden sintetizarse con grupos químicos adicionales presentes en sus extremos amino y/o carboxi, de modo que, por ejemplo, se mejore la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la actividad inhibidora de los péptidos. Por ejemplo, grupos hidrófobos tales como grupos carbobenzoxilo, dansilo o t-butiloxicarbonilo pueden añadirse a los extremos amino de los péptidos. Asimismo, un grupo acetilo o un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo puede situarse en los extremos amino de los péptidos. (Véase "X" en las Tablas I a IV, previamente). Adicionalmente, el grupo hidrófobo, t-butiloxicarbonilo o un grupo amido puede añadirse a los extremos carboxi de los péptidos. (Véase "Z" en las Tablas I a IV, previamente). Además, los péptidos de la invención pueden sintetizarse de modo que se altere su configuración estérica. Por ejemplo, puede usarse el isómero D de uno o más de los residuos de aminoácido del péptido, en lugar del isómero L habitual. Al menos uno de los residuos de aminoácido de los péptidos descritos aquí puede sustituirse por uno de los residuos de aminoácido no presentes en la naturaleza bien conocidos. Alteraciones tales como estas pueden servir para incrementar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la acción inhibidora de los péptidos.
Cualquiera de los péptidos descritos previamente, adicionalmente, puede tener un grupo portador macromolecular no peptídico ligado covalentemente a sus extremos amino y/o carboxi. Tales grupos portadores macromoleculares pueden incluir, por ejemplo, conjugados de lípido-ácido graso, polietilenglicol o carbohidratos. "X", en las Tablas I a IV, previamente, puede representar adicionalmente por lo tanto cualquiera de los grupos portadores macromoleculares previos ligados covalentemente al extremo amino de un péptido. Asimismo, "Z", en las Tablas I a IV, puede representar adicionalmente cualquiera de los grupos portadores macromoleculares descritos previamente.
5.4 Ensayos para la actividad antiviral
La actividad antiviral exhibida por los péptidos de la invención puede medirse, por ejemplo, realizando fácilmente ensayos in vitro, tales como los descritos más adelante, que pueden probar la capacidad de los péptidos para inhibir la formación de sincitios o su capacidad para inhibir la infección por virus libres de células. Usando estos ensayos, pueden determinarse parámetros tales como la actividad antiviral de los péptidos, la exhibición contra una cepa dada de virus, y/o la actividad inhibidora específica para la cepa del péptido. Puede utilizarse un ensayo de fusión celular para probar la capacidad de los péptidos para inhibir la formación de sincitios in vitro inducida por HIV. Tal ensayo puede comprender cultivar células CD-4^{+} no infectadas (tales como células Molt o CEM, por ejemplo) en presencia de células crónicamente infectadas por HIV y un péptido que ha de ensañarse. Para cada péptido, puede probarse un intervalo de concentraciones de péptido. Este intervalo debe incluir un cultivo de control en el que no se ha añadido péptido. Se usan condiciones estándar para el cultivo, bien conocidas para los expertos en la especialidad. Después de la incubación durante un período apropiado (24 horas a 37ºC, por ejemplo) el cultivo se examina microscópicamente con respecto a la presencia de células gigantes multinucleadas, que son indicativas de fusión celular y formación de sincitios.
Puede utilizarse un ensayo de transcriptasa inversa (RT) para probar la capacidad de los péptidos para inhibir la infección de células CD-4^{+} por HIV libre de células. Tal ensayo puede comprender cultivar una concentración apropiada (es decir, TCID_{50}) de virus y células CD-4^{+} en presencia del péptido que ha de probarse. Se usan condiciones de cultivo bien conocidas por los expertos en la especialidad. Como previamente, puede usarse un intervalo de concentraciones de péptido, además de un cultivo de control en el que no se ha añadido péptido. Después de la incubación durante un período apropiado (por ejemplo, 7 días) de cultivo, se prepara un sobrenadante libre de células, usando procedimientos estándar, y se prueba con respecto a la presencia de actividad de RT como una medida de infección satisfactoria. La actividad de RT puede probarse usando técnicas estándar tales como las descritas, por ejemplo, por Goff y otros, (Goff, S. y otros, 1981, J. Virol. 38:239-248) y/o Willey y otros (Willey, R. y otros, 1988, J. Virol. 62:139-147).
Métodos estándar que son bien conocidos por los expertos en la especialidad pueden utilizarse para ensayar actividad no retroviral. Véase, por ejemplo, Pringle y otros (Pringle, C.R. y otros, 1985, J. Medical Virology 17:377-386) para un análisis de técnicas de ensayo de la actividad de virus sincitial respiratorio y virus de parainfluencia. Además, véase, por ejemplo, "Zinsser Microbiology", 1988, Joklik, W.K. y otros, eds., Appleton & Lange, Norwalk, CT, 19ª ed., para una revisión general de tales técnicas.
5.5 Usos de los péptidos de la invención
Los péptidos DP-178 (ID SEC:1) de la invención y los fragmentos, análogos y homólogos de DP-178 exhiben actividad antiviral potencial. Además, los péptidos similares a DP-107 y similares a DP-178 exhiben preferiblemente actividad antiviral. Como tales, los péptidos pueden usarse como inhibidores de transmisión viral y retroviral, especialmente de HIV, humana y no humana a células no infectadas.
Los retrovirus humanos cuya transmisión puede ser inhibida por los péptidos incluyen, pero no se limitan a, todas las cepas de HIV-1 y HIV-2 y los virus de linfocitos T humanos (HTLV-I y II). Los retrovirus no humanos cuya transmisión puede ser inhibida por los péptidos incluyen, pero no se limitan a, virus de leucosis bovina, virus de sarcoma y leucemia felinos, virus de inmunodeficiencia, sarcoma y leucemia simiescos y virus de neumonía progresiva de la oveja.
Virus no retrovirales cuya transmisión puede ser inhibida por los péptidos incluyen, pero no se limitan a, virus sincitial respiratorio humano, virus del moquillo canino, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de parainfluencia humana y virus de influenza. Además, cualesquiera virus o retrovirus que contengan los péptidos listados en las Tablas V a X previamente pueden ser inhibidos por los péptidos.
Según se analiza más a fondo, a continuación, en la Sección 5.5.1 y en el Ejemplo presentado, más adelante, en la Sección 8, los péptidos DP-107 y DP-178 y similares a DP-107 y similares a DP-178 forman interacciones proteína-proteína no covalentes que se requieren para la actividad normal del virus. Así, los péptidos también pueden utilizarse como componentes en ensayos para la identificación de compuestos que interfieren con tales interacciones proteína-proteína y, por lo tanto, pueden actuar como agentes antivirales. Estos ensayos se analizan, a continuación, en la Sección 5.5.1.
5.5.1. Ensayos de rastreo de compuestos antivirales para compuestos que interactúan con el producto génico PKD1
Según se demuestra en el Ejemplo presentado en la Sección 8, más adelante, las porciones DP-107 y DP-178 de la proteína de TM gp41 forman interacciones proteína-proteína no covalentes. Como también se demuestra, el mantenimiento de tales interacciones es necesario para la infectividad viral normal. Así, los compuestos que se unen a DP-107, se unen a DP-178 y/o actúan para romper las interacciones proteína-proteína de DP-107/DP-178 normales pueden actuar como potentes agentes antivirales. Se describen más adelante ensayos para la identificación de tales compuestos. Nótese que, aunque, para presentar y aclarar el análisis, los péptidos DP-107 y DP-178 se usarán como componentes de los ensayos descritos, ha de entenderse que cualquiera de los péptidos similares a DP-107 o similares a DP-178 descritos, previamente, en las Secciones 5.1 y 5.2, también pueden utilizarse como parte de estos rastreos para compuestos antivirales.
Compuestos que pueden probarse con respecto a una capacidad para unirse a DP-107, DP-178 y/o romper interacciones DP-107/DP-178 y que, por lo tanto, representan potencialmente compuestos antivirales, incluyen, pero no se limitan a, péptidos formados por aminoácidos con configuración D y/o L (por ejemplo, en la forma de bibliotecas de péptidos aleatorias; véase Lam, K.S. y otros, Nature 354:82-84), fosfopéptidos (por ejemplo, en la forma de bibliotecas de fosfopéptidos dirigidas aleatorias o parcialmente degeneradas; véase, por ejemplo, Songyang, Z. y otros, 1993, Cell 72:767-778), anticuerpos y moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas. Compuestos sintéticos, productos naturales y otras fuentes de materiales potencialmente eficaces pueden rastrearse de una variedad de modos, según se describe en esta sección. Los compuestos, anticuerpos u otras moléculas identificadas pueden probarse con respecto a una capacidad para inhibir la actividad viral utilizando, por ejemplo, ensayos virales tales como los descritos, previamente, en la Sección 5.4.
Entre los péptidos que pueden probarse están péptidos solubles que comprenden dominios DP-107 y/o DP-178 y péptidos que comprenden dominios DP-107 y/o DP-178 que tienen una o más mutaciones dentro de uno o ambos de los dominios, tales como el péptido M41-P descrito, previamente, en el Ejemplo presentado en la Sección 8, que contiene una mutación de isoleucina por prolina dentro de la secuencia de DP-178.
Un ejemplo de tales métodos de rastreo es un método para identificar un compuesto que ha de probarse con respecto a la capacidad antiviral, que comprende:
(a) exponer al menos un compuesto a un péptido DP-107 durante un tiempo suficiente para permitir la unión el compuesto al péptido DP-107;
(b) retirar compuestos no unidos; y
(c) determinar la presencia del compuesto unido al péptido DP-107,
identificando de ese modo un agente que ha de probarse con respecto a la capacidad antiviral.
Un segundo ejemplo de tales métodos de rastreo es un método para identificar un compuesto que ha de probarse con respecto a la capacidad antiviral, que comprende:
(a) exponer al menos un compuesto a un péptido que comprende un péptido DP-178 durante un tiempo suficiente para permitir la unión del compuesto al péptido DP-178;
(b) retirar compuestos no unidos; y
(c) determinar la presencia del compuesto unido al péptido DP-178,
identificando de ese modo un agente que ha de probarse con respecto a la capacidad antiviral.
Un método que utiliza estos tipos de sistemas que puede seguirse en el aislamiento de tales compuestos que se unen a DP-107 o que se unen a DP-178 es un ensayo que incluiría la ligazón del péptido DP-107 o DP-178 a una matriz sólida, tal como, por ejemplo, cuentas de agarosa o plástico, pocillos de placas de microvaloración, cápsulas de Petri o membranas compuestas por, por ejemplo, nailon o microcelulosa. En tal sistema de ensayo, la proteína DP-107 o DP-178 puede anclarse a una superficie sólida y el compuesto, o la substancia de prueba, que no se ancla, se marca, directamente o indirectamente. En la práctica, se utilizan convenientemente placas de microvaloración. El componente anclado puede inmovilizarse mediante ligazones no covalentes o covalentes. Las ligazones no covalentes pueden efectuarse simplemente revistiendo la superficie sólida con una solución de la proteína y secando. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, específico para la proteína puede usarse para anclar la proteína a la superficie sólida. Las superficies pueden prepararse por adelantado y almacenarse.
Para efectuar el ensayo, el compuesto marcado se añade a la superficie revestida que contiene el péptido DP-107 o DP-178 anclado. Después de que la reacción se complete, los componentes sin reaccionar se retiran (por ejemplo, mediante lavado) bajo condiciones tales que cualesquiera complejos formados permanezcan inmovilizados sobre la superficie sólida. La detección de complejos anclados sobre la superficie sólida puede efectuarse de un número de modos. Cuando el compuesto se marca previamente, la detección de la marca inmovilizada sobre la superficie indica que se forman complejos. Cuando el componente marcado no está premarcado, puede usarse una marca indirecta para detectar complejos anclados en la superficie; por ejemplo, usando un anticuerpo marcado específico para el compuesto (el anticuerpo, a su vez, puede marcarse directamente o marcarse indirectamente con un anticuerpo anti-Ig marcado).
Alternativamente, tal ensayo puede efectuarse en fase líquida, los productos de reacción separarse de componentes sin reaccionar y los complejos detectarse; por ejemplo, usando un anticuerpo inmovilizado específico para DP-107 o DP-178, siempre que sea apropiado para el ensayo dado, o un anticuerpo específico para el compuesto, es decir, la substancia de prueba, para anclar cualesquiera complejos formados en solución, y un anticuerpo marcado específico para el otro miembro del complejo para detectar complejos anclados.
Utilizando procedimientos tales como este, pueden rastrearse grandes números de tipos de moléculas simultáneamente con respecto a la capacidad de unión a DP-107 y DP-178 y así la actividad antiviral potencial.
Además, pueden rastrearse compuestos con respecto a una capacidad para inhibir la formación de, o, alternativamente, romper complejos DP-107/DP-178. Tales compuestos pueden probarse a continuación con relación a la capacidad antiviral. Para facilitar la descripción, DP-107 y DP-178 se denominarán "socios de unión". Los compuestos que rompen tales interacciones pueden exhibir actividad antiviral. Tales compuestos pueden incluir, pero no se limitan a, moléculas tales como anticuerpos, péptidos y similares descritos previamente.
El principio básico de los sistemas de ensayo usados para identificar compuestos que interfieren con la interacción entre los péptidos DP-107 y DP-178 implica preparar una mezcla de reacción que contiene péptidos bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que los dos péptidos interactúen y se unan, formando así un complejo. Para probar un compuesto con respecto a la actividad disruptiva, la reacción se efectúa en presencia y ausencia del compuesto de prueba, es decir, el compuesto de prueba puede incluirse inicialmente en la mezcla de reacción o añadirse en un momento subsiguiente a la adición de uno de los socios de unión; los controles se incuban sin el compuesto de prueba o con un placebo. La formación de cualesquiera complejos entre los socios de unión se detecta a continuación. La formación de un complejo en la reacción de control, pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba, indica que el compuesto interfiere con la interacción de los péptidos DP-107 y DP-178.
El ensayo para compuestos que interfieren con la interacción de los socios de unión puede efectuarse en un formato heterogéneo u homogéneo. Ensayos heterogéneos implican anclar uno de los socios de unión sobre una fase sólida y detectar complejos anclados sobre la fase sólida al final de la reacción. En ensayos homogéneos, toda la reacción se lleva a cabo en fase líquida. En cualquier sistema, el orden de adición de reaccionantes puede variarse para obtener diferente información acerca de los compuestos que se prueba. Por ejemplo, los compuestos de prueba que interfieren con la interacción entre los socios de unión, por ejemplo mediante competición, pueden identificarse efectuando la reacción en presencia de la substancia de prueba, es decir, añadiendo la substancia de prueba a la mezcla de reacción antes de o simultáneamente con los socios de unión. Por otra parte, los compuestos de prueba que rompen complejos preformados, por ejemplo compuestos con constantes de unión superiores que desplazan uno de los socios de unión del complejo, pueden probarse añadiendo el compuesto de prueba a la mezcla de reacción después de que se hayan formado complejos. Los diversos formatos se describen brevemente más adelante.
En un sistema de ensayo heterogéneo, un socio de unión, por ejemplo el péptido DP-107 o DP-178, se ancla en una superficie sólida y su socio de unión, que no está anclado, se marca, directamente o indirectamente. En la práctica, se utilizan convenientemente placas de microvaloración. La especie anclada puede inmovilizarse mediante ligazones no covalentes o covalentes. La ligazón no covalente puede efectuarse simplemente revistiendo la superficie sólida como una solución de la proteína y secando. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado específico para la proteína puede usarse para anclar la proteína a la superficie sólida. Las superficies pueden prepararse por adelantado y almacenarse.
Para efectuar el ensayo, el socio de unión de la especie inmovilizada se añade a la superficie revestida con o sin un compuesto de prueba. Después de que la reacción se complete, los componentes sin reaccionar se retiran (por ejemplo, mediante lavado) y cualesquiera complejos formados permanecerán inmovilizados sobre la superficie sólida. La detección de complejos anclados sobre la superficie sólida puede efectuarse de un número de modos. Cuando el socio de unión estaba premarcado, la detección de la marca inmovilizada sobre la superficie indica que se formaban complejos. Cuando el socio de unión no está premarcado, puede usarse una marca indirecta para detectar complejos anclados sobre la superficie; por ejemplo, usando un anticuerpo marcado específico para el socio de unión (el anticuerpo, a su vez, puede marcarse directamente o marcarse indirectamente mediante un anticuerpo anti-Ig marcado). Dependiendo del orden de adición de los componentes de reacción, pueden detectarse compuestos de prueba que inhiben la formación de complejos o que rompen complejos preformados.
Alternativamente, la reacción puede efectuarse en fase líquida en presencia o ausencia del compuesto de prueba, los productos de reacción separarse de componentes sin reaccionar y los complejos detectarse; por ejemplo, usando un anticuerpo inmovilizado específico para un socio de unión para anclar cualesquiera complejos formados en solución, y un anticuerpo marcado específico para el otro socio de unión para detectar complejos anclados. De nuevo, dependiendo del orden de adición de los reaccionantes a la fase líquida, pueden identificarse compuestos de prueba que inhiben el complejo o que rompen complejos preformados.
Alternativamente, puede usarse un ensayo homogéneo. En este sistema, se prepara un complejo preformado de los péptidos DP-107 y DP-178 en el que uno de los socios de unión se marca, pero la señal generada por la marca se extingue debido a la formación del complejo (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.109.496 de Rubenstein que utiliza este sistema para inmunoensayos). La adición de una substancia de prueba que compite con y desplaza uno de los socios de unión del complejo preformado dará como resultado la generación de una señal por encima del fondo. De este modo, pueden identificarse substancias de prueba que rompen interacciones proteína-proteína de DP-107/DP-178.
5.5. Formulaciones farmacéuticas, dosificaciones y modos de administración
Con respecto al HIV, los péptidos de la invención pueden usarse como un agente terapéutico en el tratamiento del SIDA. Los péptidos de la invención pueden administrarse usando técnicas bien conocidas para los expertos en la especialidad. Preferiblemente, los agentes se formulan y se administran sistémicamente. Técnicas para la formulación y la administración pueden encontrarse en "Remington's Pharmaceutical Sciences" 18ª ed., 1990 Mack Publishing Co., Easton, PA. Rutas adecuadas pueden incluir la administración oral, rectal, transmucosal o intestinal; el aporte parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares, solo por nombrar unas pocas. Lo más preferiblemente, la administración es intravenosa. Para la inyección, los agentes de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. Para tal administración transmucosal, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que ha de ser penetrada. Tales penetrantes se conocen generalmente en la especialidad.
Además, los péptidos pueden usarse como una medida profiláctica en individuos previamente no infectados después de exposición aguda a un virus HIV. Ejemplos de tal uso prolifáctico de los péptidos pueden incluir, pero no se limitan a, la prevención de la transmisión de virus de madre a hijo y otras situaciones en las que existe la probabilidad de transmisión de HIV, tales como, por ejemplo, accidentes en entornos de cuidado sanitario en los que los trabajadores están expuestos a productos sanguíneos que contienen HIV. Los péptidos de la invención pueden representar en tales casos el papel de una vacuna profiláctica, en donde el huésped produce anticuerpos contra los péptidos de la invención, que pueden servir para neutralizar virus HIV, por ejemplo, inhibiendo la infección por HIV adicional. Por lo tanto, la administración de los péptidos de la invención como una vacuna profiláctica comprenderá administrar a un huésped una concentración de péptidos eficaz para producir una respuesta inmunitaria que sea suficiente para neutralizar el HIV, por ejemplo, inhibiendo la capacidad del HIV para infectar células. La concentración exacta dependerá del péptido específico que ha de administrarse, pero puede determinarse usando técnicas estándar para ensayar el desarrollo de una respuesta inmunitaria que son bien conocidas por los expertos normales en la especialidad. Los péptidos que han de usarse como vacunas se administran de forma habitual intramuscularmente.
Los péptidos pueden formularse con un adyuvante adecuado para mejorar la respuesta inmunológica. Tales adyuvantes pueden incluir, pero no se limitan a, geles minerales tales como hidróxido de aluminio; substancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles Pluronic, polianiones; otros péptidos; emulsiones oleosas y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG y Corynebacterium parvum. Pueden usarse muchos métodos para introducir las formulaciones de vacuna descritas aquí. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, las rutas oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea e intranasal.
Alternativamente, una concentración eficaz de anticuerpos policlonales o monoclonales producidos contra los péptidos de la invención puede administrarse a un huésped de modo que las células no infectadas no sean infectadas por HIV. La concentración exacta de tales anticuerpos variará de acuerdo con cada preparación de anticuerpo específica, pero puede determinarse usando técnicas estándar bien conocidas por los expertos normales en la especialidad. La administración de los anticuerpos puede efectuarse usando una variedad de técnicas, incluyendo, pero no limitadas a, las descritas en esta sección.
Dosificaciones eficaces de los péptidos de la invención que han de administrarse pueden determinarse a través de procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica que se dirigen a parámetros tales como la semivida biológica, la biodisponibilidad y la toxicidad. Dados los datos presentados más adelante en la Sección 6, DP-178, por ejemplo, puede resultar eficaz in vivo en dosis requeridas para alcanzar niveles en circulación de 10 ng por ml de péptido.
Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de compuesto suficiente para dar como resultado la mejora de síntomas o una prolongación de la supervivencia en un paciente. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, determinando la LD50 (la dosis total para 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en 50% de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD50/ED50. Se prefieren compuestos que exhiben índices terapéuticos grandes. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de cultivo celular y estudios animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para usar en seres humanos. La dosificación de tales compuestos está preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para alcanzar un intervalo de concentración en plasma en circulación que incluye la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que alcanza una ruptura semimáxima del complejo PTK/proteína adaptadora, o una inhibición semimáxima del nivel y/o la actividad celular de un componente complejo) según se determina en el cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar más exactamente dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
La formulación exacta, la ruta de administración y la dosificación pueden ser elegidas por el médico individual en vista del estado del paciente (Véase, por ejemplo, Fingl y otros, 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", C. 1, p 1).
Debe apuntarse que el médico asistente sabrá cómo y cuando terminar, interrumpir o ajustar la administración debido a la toxicidad o a disfunciones orgánicas. A la inversa, el médico asistente también sabrá ajustar el tratamiento a niveles superiores si la respuesta clínica no fuera adecuada (evitando la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el tratamiento del trastorno oncogénico de interés variará con la gravedad del estado que ha de tratarse y con la ruta de administración. La dosis y quizás la frecuencia de la dosis también variarán con la edad, el peso corporal y la respuesta del paciente individual. Un programa comparable con el analizado previamente puede usarse en medicina veterinaria.
Según se demuestra en el Ejemplo presentado más adelante en la Sección 6, la actividad antiviral de los péptidos de la invención puede mostrar una especificidad pronunciada para tipos y subtipos, es decir, péptidos específicos pueden ser eficaces para inhibir la actividad solo de virus específicos. Este rasgo de la invención presenta muchas ventajas. Una de tales ventajas, por ejemplo, reside en el campo del diagnóstico, en el que puede usarse la especificidad antiviral del péptido de la invención para determinar la identidad de un aislado viral. Con respecto al HIV, puede determinarse fácilmente si un aislado viral consiste en una cepa de HIV-1 o HIV-2. Por ejemplo, células CD-4^{+} no infectadas pueden coinfectarse con un aislado del que se ha identificado que contiene el péptido DP-178 (ID SEC:1) de HIV, después de lo cual la actividad retroviral de los sobrenadantes celulares puede ensayarse usando, por ejemplo, las técnicas descritas previamente en la Sección 5.2. Estos aislados cuya actividad retroviral está completamente o casi completamente inhibida contienen HIV-1. Puede considerarse que aquellos aislados cuya actividad viral está inalterada o solo reducida en una pequeña cantidad no contienen HIV-1. Tal aislado puede tratarse a continuación con uno o más de lo otros péptidos DP-178 de la invención y subsiguientemente probarse con respecto a su actividad viral para determinar la identidad del aislado viral.
Pueden usarse portadores farmacéuticamente aceptables para formular los compuestos descritos aquí en dosificaciones adecuadas para la administración sistémica. Con la elección apropiada de portador y la práctica de fabricación adecuada, las composiciones, en particular las formuladas como soluciones, pueden administrarse parenteralmente, tal como mediante inyección intravenosa. Los compuestos pueden formularse fácilmente usando portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica como dosificaciones adecuadas para la administración oral. Tales portadores permiten que los compuestos de la invención se formulen como tabletas, píldoras, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para la ingestión oral por parte de un paciente que ha de tratarse.
Las composiciones farmacéuticas incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para alcanzar su propósito pretendido. La determinación de las cantidades eficaces está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada aquí.
Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener portadores farmacéuticamente aceptable adecuados que comprenden excipientes y adyuvantes que facilitan el procesamiento de los compuestos activos como preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Las preparaciones formuladas para la administración oral pueden estar en la forma de tabletas, grageas, cápsulas o soluciones.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse de una manera que es conocida de por sí, por ejemplo, por medio de procedimientos de mezcladura, disolución, granulación, elaboración de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización convencionales.
Formulaciones farmacéuticas para la adminsitración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, pueden prepararse suspensiones de los compuestos activos como suspensiones para inyección oleosas apropiadas. Disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen ácidos grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener substancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse combinando los compuestos activos con un excipiente sólido, opcionalmente triturando una mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir adyuvantes adecuados, si se desea, para obtener tabletas o núcleos de gragea. Excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes desintegrantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato sódico.
Los núcleos de gragea se proporcionan con revestimientos adecuados. Para este propósito, pueden usarse soluciones de azúcar concentras, que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel Carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes orgánicos adecuados. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a las tabletas o los revestimientos de gragea para identificación para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.
Preparaciones farmacéuticas que pueden usarse oralmente incluyen cápsulas ajustadas a presión hechas de gelatina, así como cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas ajustadas a presión pueden contener los ingredientes activos mezclados con una carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato magnésico y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizantes.
6. Ejemplo: DP-178 (ID SEC:1) es un potente inhibidor de la infección por HIV-1
En este ejemplo, se muestra que el DP-178 (ID SEC:1) es un potente inhibidor de la fusión célula-célula CD-4^{+} mediada por HIV-1 y la infección por virus libre de células. En el ensayo de fusión, este péptido bloquea completamente la formación de sincitios inducida por virus a concentraciones de 1-10 ng/ml. En el ensayo de infectividad, la concentración inhibidora es algo superior, bloqueando la infección a 90 ng/ml. Se muestra además que DP-178 (ID SEC:1) muestra que la actividad antiviral de DP-178 (ID SEC:1) es altamente específica para HIV-1. Adicionalmente, también se encuentra que un péptido sintético, DP-185 (ID SEC:3), que representa un homólogo de DP-178 derivado de HIV-1, bloquea la formación de sincitios mediada por HIV-1.
6.1. Materiales y métodos 6.1.1. Síntesis de péptidos
Los péptidos se sintetizaban usando la química Fast Moc en un sintetizador de péptidos modelo 431A de Applied Biosystems. Los péptidos amidados se prepararon usando resina Rink (Advanced Chemtech) mientras que los péptidos que contenían extremos carboxi libres se sintetizaron sobre resina de Wang (alcohol p-alcoxibencílico) (Bachem). Los primeros residuos se acoplaron doblemente a la resina apropiada y los residuos subsiguientes se acoplaron de forma simple. Cada etapa de acoplamiento fue seguida por protección con anhídrido acético. Los péptidos se segmentaron de la resina mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA) (10 ml), H_{2}O (0,5 ml), tioanisol (0,5 ml), etanoditiol (0,25 ml) y fenol cristalino (0,75 g). La purificación se llevó a cabo mediante HPLC en fase inversa. Se cromatografiaron muestras de aproximadamente 50 mg de péptido en bruto en una columna Waters Delta Pak C18 (19 mm x 30 cm, esférica 15 \mu) con un gradiente lineal; H_{2}O/acetonitrilo, TFA al 0,1%. Los péptidos liofilizados se almacenaron desecados y se realizaron soluciones de péptidos en agua en aproximadamente 1 mg/ml. La espectrometría de masas por electropulverización daba los siguientes resultados: DP-178 (ID SEC:1):4491.87 (calculado 4491.94); DP-180 (ID SEC:2):4491.45 (calculado 4491.94); DP-185 (ID SEC:3): no realizado (calculado 4546.97).
6.1.2. Virus
Se obtuvo virus HIV-1_{LAI} de R. Gallo (Popovic, M. y otros, 1984, Science 224:497-508) y se propagó en células CEM cultivadas en RPMI 1640 que contenía suero de ternero fetal al 10%. El sobrenadante de las células CEM infectadas se hizo pasar a través de un filtro de 0,2 \mum y la concentración infecciosa se estimó en un ensayo de microinfectividad usando la línea celular AA5 para soportar la replicación del virus. Para este propósito, se añadieron 25 \mul de virus diluido en serie a 75 \mul de células AA5 a una concentración de 2 x 10^{5}/ml en una placa de microvaloración de 96 pocillos. Cada dilución de virus se probó por triplicado. Las células se cultivaron durante 8 días mediante la adición de medio reciente cada 2 días. El día 8 después de la infección, las muestras de sobrenadante se probaron con respecto a la replicación del virus según se evidencia por la actividad de transcriptasa inversa liberada al sobrenadante. La TCID_{50} se calculó de acuerdo con la formula de Reed y Muench (Reed, L. J. y otros, 1938, Am. J. Hyg. 27:493-497). La concentración de las reservas de HIV-1_{LAI} y HIV-1_{MN} usadas para esos estudios, según se mide en la línea celular AA5, era aproximadamente 1,4 x 10^{6} y 3,8 x 10^{4} TCID_{50}/ml, respectivamente.
6.1.3. Ensayo de fusión celular
Se incubaron aproximadamente 7 x 10^{4} células Molt con 1 x 10^{4} células CEM infectadas crónicamente con el virus HIV-1_{LAI} en placas de 96 pocillos (placas de racimo de media área; Costar, Cambridge, MA) en un volumen final de 100 \mul de medio de cultivo según se describe previamente (Matthews, T. J. y otros, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5424-5428). Se añadieron inhibidores peptídicos en un volumen de 10 \mul y las mezclas de células se incubaron durante 24 horas a 37ºC. En ese momento, las células gigantes multinucleadas se estimaron mediante examen microscópico con una ampliación de 40 aumentos que permitía la visualización de todo el pocillo en un solo campo.
6.1.4. Ensayo de infección con virus libres de células
Se incubaron péptidos sintéticos a 37ºC con 247 unidades de TCID_{50} (para el experimento representado en la figura 2) o 62 TCID_{50} (para el experimento representado en la figura 3) de virus HIV-1_{LAI} o 25 unidades de TCID_{50} de HIV-2_{NIH2} y células CD4^{+} CEM con concentraciones de péptido de 0, 0,04, 0,4, 4,0 y 40 \mug/ml durante 7 días. La actividad de transcriptasa inversa (RT) resultante en conteos por minuto se determinó usando el ensayo descrito más adelante, en la Sección 6.1.5. Véase, Reed, L. J. y otros, 1938, Am. J. Hyg. 27:493-497 para una explicación de los cálculos de TCID_{50}.
6.1.5 Ensayo de transcriptasa inversa
El micro-ensayo de transcriptasa inversa (RT) se adaptó de Goff y otros (Goff, S. y otros, 1981, J. Virol. 38:239-248) y Willey y otros (Willey, R. y otros, 1988, J. virol. 62:139-147). Los sobrenadantes de cultivos de virus/células se ajustaron hasta Triton-X100 al 1%. Una muestra de 10 \mul de sobrenadante se añadió a 50 \mul de cóctel de RT en una placa de microvaloración de fondo en U de 96 pocillos y las muestras se incubaron a 37ºC durante 90 minutos. El cóctel de RT contenía KCl 75 mM, ditiotreitol 2 mM, MgCl_{2} 5 mM, 5 \mug/ml de poli A (Pharmacia, cat. Nº 27-4110-01), 0,25 unidades/ml de oligo dT (Pharmacia, cat. Nº 27-7858-01), NP40 al 0,05%, Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, dTTP no radiactivo 0,5 \muM y 10 \muCi/ml de ^{32}P-dTTP (Amersham, cat. Nº PB.10167).
Después del período de incubación, se aplicaron 40 ml de mezcla de reacción a una membrana NA45 de Schleicher y Schuell (S+S) (o papel DE81) saturada en 2 x tampón SSC (NaCl 0,3 M y citrato sódico 0,003 M) mantenida en un Minifold de S+S sobre una lámina de papel de filtro GB003 (S+S), con vacío parcial aplicado. Cada pocillo del Minifold se lavó cuatro veces con 200 \mul de 2xSSC, bajo vacío completo. La membrana se retiró del Minifold y se lavó 2 veces más en un plato de Pyrex con un exceso de 2xSSC. Finalmente, la membrana se drenó sobre papel absorbente, se colocó sobre papel Whatman Nº 3, se cubrió con envoltorio Saran y se expuso a la película durante la noche a -70ºC.
6.2. Resultados 6.2.1. Inhibición peptídica de la formación de sincitios inducida por células infectadas
El rastreo inicial con respecto a la actividad antiviral ensayaba la capacidad de los péptidos para bloquear la formación de sincitios inducida mediante cultivo nocturno de células Molt4 no infectadas, con células CEM infectadas por HIV-1 de forma crónica. Los resultados de varios detalles y experimentos se presentan aquí. En el primero de estos experimentos, se probaron concentraciones de péptido DP-178 (ID SEC:1) en serie entre 10 \mug/ml y 12,5 mg/ml con respecto al bloqueo del proceso de fusión celular. Para estos experimentos, células CEM infectadas crónicamente con virus HIV-1_{LAI}, HIV-1_{MN}, HIV-1_{RF} o HIV-1_{SF2} se cocultivaron durante la noche con células Molt4 no infectadas. Los resultados (figura 4) muestran que DP-178 (ID SEC:1) proporcionaba la protección completa contra cada uno de los aislados de HIV-1 hasta la concentración más baja de DP-178 (ID SEC:1) usada. Para la inhibición de HIV_{LAI}, la concentración más baja probada era 12,5 ng/ml; para todos los otros virus HIV-1, la concentración más baja de DP-178 (ID SEC:1) usada en este estudio era 100 ng/ml. Un segundo péptido, DP-180 (ID SEC:2), que contenía los mismos residuos de aminoácido que DP-178 (ID SEC:1) pero dispuestos en un orden aleatorio, no exhibía evidencia de actividad antifusogénica incluso a la concentración más alta de 40 \mug/ml (figura 4). Estas observaciones indican que el efecto inhibidor de DP-178 (ID SEC:1) es principalmente específico de la secuencia y no está relacionado con interacciones péptido/proteína no específicas. El punto final real (es decir, la concentración inhibidora eficaz más baja) de la acción inhibidora de DP-178 está dentro del intervalo de 1-10 ng/ml.
La siguiente serie de experimentos implicaba la preparación y la prueba de un homólogo de DP-178 (ID SEC:1) con respecto a su capacidad para inhibir la formación de sincitios inducida por HIV-1. Según se muestra en la figura 1, la secuencia de DP-185 (ID SEC:3) es ligeramente diferente de DP-178 (ID SEC:1) ya que su secuencia primaria se toma del aislado de HIV-1_{SF2} y contiene varias diferencias de aminoácidos con relación a DP-178 (ID SEC:1) cerca del extremo N. Según se muestra en la figura 4, DP-185 (ID SEC:3) exhibe actividad inhibidora incluso a 312,5 ng/ml, la concentración más baja probada.
La siguiente serie de experimentos implicaba una comparación de la actividad inhibidora de HIV-1 y HIV-2 por DP-178 (ID SEC:1). Según se muestra en la figura 5, DP-178 (ID SEC:1) bloqueaba la formación de sincitios mediada por HIV-1 a concentraciones de péptido por debajo de 1 ng/ml. Sin embargo, DP-178 (ID SEC:1) no bloqueaba la formación de sincitios mediada por HIV-2 a concentraciones tan altas como 10 \mug/ml. Esta notable selectividad de 4 logaritmos de DP-178 (ID SEC:1) como un inhibidor de la fusión celular mediada por HIV-1 demuestra una especificidad para HIV-1 inesperada en la acción de DP-178 (ID SEC:1). La inhibición por DP-178 (ID SEC:1) de la fusión celular mediada por HIV-1, pero la incapacidad del péptido para inhibir la fusión celular mediada por HIV-2 en el mismo tipo de célula a las concentraciones probadas, proporciona una evidencia adicional del alto grado de selectividad asociado con la acción antiviral de DP-178 (ID SEC:1).
6.2.2. Inhibición peptídica de la infección por virus libres de células
Se probó a continuación DP-178 (ID SEC:1) con respecto a su capacidad para bloquear la infección de células CEM CD-4^{+} por virus HIV-1 libre de células. Los resultados, mostrados en la figura 2, son a partir de un experimento en el que se ensayó DP-178 ((ID SEC:1) con respecto a su capacidad para bloquear la infección de células CEM por un aislado de HIV-1_{LAI}. Se incluyeron en el experimento tres péptidos de control, DP-116 (ID SEC:9), DP-125 (ID SEC:8) y DP-118 (ID SEC:10). DP-116 (ID SEC:9) representa un péptido que se muestra previamente que es inactivo usando este ensayo y DP-125 (ID SEC:8; Wild, C. y otros, 1992, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 89:10,537) y DP-118 (ID SEC:10) son péptidos que se ha mostrado previamente que son activos en este ensayo. Cada concentración (0, 0,04, 0,4, 4 y 40 \mug/ml) de péptido se incubó con 247 unidades TCID_{50} de virus HIV-1_{LAI} y células CM. Después de 7 días de cultivo, el sobrenadante libre de células se probó con respecto a la presencia de actividad de RT como una medida de infección satisfactoria. Los resultados, mostrados en la figura 2, demuestran que DP-178 (ID SEC:1) inhibía el proceso de infección de novo mediado por el aislado viral de HIV-1 a concentraciones tan bajas como 90 ng/ml (IC50 = 90 ng/ml). En contraste, los dos péptidos de control positivo, DP-125 (ID SEC:8) y DP-118 (ID SEC:10), tenían concentraciones IC50 más de 60 veces superiores de aproximadamente 5 \mug/ml.
En un experimento separado, la acción inhibidora para HIV-1 y HIV-2 de DP-178 (ID SEC:1) se probó con células CEM y HIV-1_{LAI} o HIV-2_{NIHZ}. Se usaron 62 TCID_{50} de HIV-1_{LAI} o 25 GCID_{50} de HIV-2_{NIHZ} en estos experimentos y se incubaron durante 7 días. Como puede observarse en la figura 3, DP-178 (ID SEC:1) inhibía la infección por HIV-1 con una IC50 de aproximadamente 31 ng/ml. En contraste, DP-178 (ID SEC:1) exhibía una IC50 muy superior para HIV-2_{NIHZ}, haciendo así al DP-178 (ID SEC:1) 2 logaritmos más potente como un inhibidor de HIV-1 que como un inhibidor de HIV-2. Este hallazgo está de acuerdo con los resultados de los ensayos de inhibición de la fusión descritos previamente, en la Sección 6.2.1, y apoya adicionalmente un nivel significativo de selectividad (es decir, para HIV-1 sobre HIV-2).
7. Ejemplo: el inhibidor de HIV-1 DP-178 (ID SEC:1) es no citotóxico
En este Ejemplo, se muestra que el inhibidor peptídico sintético de 36 aminoácidos DP-178 (ID SEC:1) es no citotóxico para células en cultivo, incluso a las concentraciones de péptido más altas (40 \mug/ml) probadas.
7.1. Materiales y métodos Ensayo de proliferación celular y toxicidad
Se incubaron aproximadamente 3,8x10^{5} células CEM para cada concentración de péptido durante 3 días a 37ºC en matraces T25. Los péptidos probados eran DP-178 (ID SEC:1) y DP-116 (ID SEC:9), según se demuestra en la figura 1. Las concentraciones de cada péptido usadas eran 0, 2,5, 10 y 40 \mug/ml. Los conteos celulares se tomaron a tiempos de incubación de 0, 24, 48 y 72 horas.
7.2. Resultados
Se determinó si el potente inhibidor de HIV-1 DP-178 (ID SEC:1) exhibía efectos citotóxicos ensayando los efectos del péptido sobre la proliferación y la viabilidad de células en cultivo. Se incubaron células CEM en presencia de concentraciones variables de DP-178 (ID SEC:1) y DP-116 (ID SEC:9), un péptido que se sabe previamente que es ineficaz como un inhibidor de HIV (Wild, C. y otros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10,537-10, 541). Adicionalmente, las células se incubaron en ausencia de cualquier péptido.
Los resultados del estudio citotóxico demuestran que DP-178 (ID SEC:1) no exhibe efectos citotóxicos sobre células en cultivo. Como puede observarse más adelante, en la Tabla XI, incluso las características de proliferación y viabilidad de células cultivadas durante 3 días en presencia de la concentración más alta de DP-178 (ID SEC:1) probada (40 \mug/ml) no difieren significativamente del DP-116 (ID SEC:9) o los controles sin péptido. Los datos de proliferación celular también se representan en forma gráfica en la figura 6. Como se demostró en el Ejemplo de Trabajo presentado previamente en la Sección 6, DP-178 (ID SEC:1) inhibe completamente la formación de sincitios mediada por HIV-1 a concentraciones de péptido entre 1 y 10 ng/ml, e inhibe completamente la infección viral libre de células a concentraciones de al menos 90 ng/ml. Así, este estudio demuestra que incluso con concentraciones de péptido mayores que 3 logaritmos superiores que la dosis inhibidora para HIV, DP-178 (ID SEC:1) no exhibe efectos citotóxicos.
TABLA XI
52
8. Ejemplo: la interacción de DP178 y DP107
Formas recombinantes solubles de gp41 usadas en el ejemplo descrito más adelante proporcionan evidencia de que el péptido DP178 se asocia con un sitio distal en gp41 cuya estructura interactiva está influenciada por el motivo de la cremallera de leucina de DP107. Una sola mutación que rompe la estructura de doble arrollamiento del dominio de la cremallera de leucina transformaba la proteína gp41 recombinante soluble desde un inhibidor inactivo de la fusión de HIV-1 a uno activo. Esta transformación puede resultar de la liberación del dominio de DP178 potente procedente de un broche molecular con el determinante de la cremallera de leucina, DP107. Los resultados también indican que la actividad anti-HIV de diversos derivados de gp41 (péptidos y proteínas recombinantes) puede deberse a su capacidad para formar complejos con gp41 viral e interferir con su proceso fusogénico.
8.1. Materiales y métodos 8.1.1. Construcción de proteínas de fusión y mutantes de GP41
La construcción de proteínas de fusión y mutantes mostrada en la figura 7 se efectuó como sigue: la secuencia de DNA correspondiente al dominio extracelular de gp41 (540-686) se clonó en el sitio Xmx I del vector de expresión pMal-p2 (New England Biolab) para dar M41. La secuencia de gp41 se amplificó desde pgtat (Malim y otros, 1988, Nature 355: 181-183) usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con un cebador aguas arriba 5'-ATGACGCTGACGGTACAGGCC-3' (cebador A) y un cebador aguas abajo 5'-TGACTAAGCTTAATAC
CACAGCCAATTTGTTAT-3' (cebador B). Se construyó M41-P usando el estuche de mutagénesis in vitro T7-Gen de United States Biochemicals (USB) siguiendo las instrucciones del suministrador. El cebador mutagénico (5'-GGAGCTGCTTGGGGCCCCAGAC-3') introduce una mutación de Ile a Pro en M41 en la posición 578. Se elaboró M41\Delta107 usando un cebador mutagénico de deleción (5'-CCAAATCCCCAGGAGCTGCTCGAGCTGCACTATAC
CAGAC-3' (cebador C) siguiendo el procedimiento de mutagénesis T7-Gen de USB. Se elaboró M41\Delta78 clonando el fragmento de DNA correspondiente a los aminoácidos de gp41 540-642 en el sitio Xmn de pMa1-p2. El cebador A y 5'-ATAGCTTCTAGATTAATTGTTAATTTCTCTGTCCC-3' (cebador D) se usaron en la PCR con la plantilla pgtat para generar los fragmentos de DNA insertados. Se usó M41-P como la plantilla con cebador A y D en la PCR para generar M41-P\Delta178. Todas las secuencias insertadas y los residuos mutados se verificaron mediante análisis con enzimas de restricción y se confirmaron mediante secuenciación de DNA.
8.1.2. Purificación y caracterización de proteínas de fusión
Las proteínas de fusión se purificaron de acuerdo con el procedimiento descrito en el folleto del fabricante de sistemas de fusión y purificación de proteínas de New England Biolabs (NEB). Se analizaron proteínas de fusión (10 ng) mediante electroforesis sobre SDS al 8%-geles de poliacrilamida. Se realizó un análisis de transferencia Western según se describe por Sambrook y otros, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, C. 18, pp. 64-75. Se usó un suero positivo a HIV-1 diluido 1000 veces o un Fab humano derivado de la clonación de repertorio para reaccionar con las proteínas de fusión. El segundo anticuerpo era anti-(Fab humano) caprino conjugado a HRP. Se usó un sistema de detección por transferencia Western ECL (Amersham) para detectar el anticuerpo unido. Un procedimiento detallado para este sistema de detección fue proporcionado por el fabricante. Se usó un marcador del peso molecular Rainbow (Amersham) para estimar el tamaño de las proteínas de fusión.
8.1.3. Ensayos de fusión celular para actividad anti-HIV
Se realizaron ensayos de fusión celular como se describe previamente (Matthews y otros, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5424-5428). Células CEM (7 x 10^{4}) se incubaron con células CEM infectadas crónicamente con HIV-1_{IIIB} (10^{4}) en placas de semiárea de fondo plano de 96 pocillos (Costar) en 100 \mul de medio de cultivo. El péptido y las proteínas de fusión a diversas concentraciones en 10 \mul de medio de cultivo se incubaron con las mezclas de células a 37ºC durante 24 horas. Los sincitios multinucleados se estimaron con examen microscópico. Ni M41 ni M41-P mostraban toxicidad a las concentraciones probadas y mostradas en la figura 8.
La inhibición de la actividad de fusión célula-célula inducida por HIV-1 se llevó a cabo en presencia de DP178 10 nM y diversas concentraciones de M41\Delta178 o M41P\Delta178 según se indica en la figura 9. No había sincitios observables en presencia de DP178 10 nM. No se añadía péptido o proteína de fusión en las muestras de control.
8.1.4. Análisis de elisa de la unión de DP178 al motivo de la cremallera de leucina de GP41
La secuencia de aminoácidos de DP178 usada es: YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF. Para el inmunoensayo con enzimas ligadas (ELISA), M41\Delta178 o M41-P\Delta178 (5 \mug/ml) en NaHCO_{3} 0,1M, pH 8,6, se revistieron sobre placas para ELISA Linbro de 96 pocillos (Flow Lab, Inc.) durante la noche. Cada pocillo se lavó tres veces con agua destilada y a continuación se bloqueó con albúmina de suero bovino (BSA) al 3% durante 2 horas. Después del bloqueo, se añadieron péptidos con BSA al 0,5% en TBST (Tris-HCl 40 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,05%) a las placas de ELISA y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces con TBST, se añadió Fab-d a una concentración de 10 ng/ml con BSA al 0,5% en TBST. Las placas se lavaron tres veces con TBST después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió a cada pocillo antisuero anti-(Fab humano) caprino conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) con una dilución de 2000 veces en TBST con BSA al 0,5% y se incubó a temperatura ambiente durante 45 minutos. Las placas se lavaron a continuación 4 veces con TBST. Se añadieron el substrato de peroxidasa o-fenilendiamina (2,5 mg/ml) y H_{2}O_{2} al 0,15% para desarrollar el color. La reacción se detuvo con un volumen igual de H_{2}SO_{4} 4,5 N después de la incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos. La densidad óptica de la mezcla de reacción detenida se midió con un lector de microplacas (Molecular Design) a 490 nm. Los resultados se muestran en la figura 10.
8.2. Resultados 8.2.1. La expresión y la caracterización del ectodominio de GP41
Como una etapa para la comprensión de los papeles de las dos regiones helicoidales en la estructura y la función de gp41, el ectodominio de gp41 se expresó como una proteína de fusión que se une a maltosa (M41) (figura 7). La secuencia peptídica fusogénica en el extremo N de gp41 se omitió de esta proteína recombinante y sus derivados para mejorar la solubilidad. La proteína que se une a maltosa facilitaba la purificación de las proteínas de fusión bajo condiciones no desnaturalizantes relativamente suaves. Debido a que la gp41 recombinante soluble de M41 no estaba glicosilada, carecía de varias regiones de la proteína de transmembrana (es decir, los dominios del péptido de fusión, de franqueo de membrana y citoplásmico) se expresaba en ausencia de gp120, no se esperaba reflejar precisamente la estructura de gp41 natural sobre viriones de HIV-1. Con todo, M41 purificada se plegaba de una manera que conservaba ciertos epítopos discontinuos según se evidenciaba por reactividad con anticuerpos monoclonales humanos, 98-6, 126-6 y 50-69, mostraba previamente que se unía a epítopos conformacionales sobre gp41 natural expresada en células eucarióticas (Xu y otros, 1991, J. Virol. 65: 4832-4838; Chen, 1994, J. Virol. 68:2002-2010). Así, al menos ciertas regiones de gp41 natural definidas por estos anticuerpos parecen reproducirse en la proteína de fusión recombinante M41. Por otra parte, M41 reaccionaba con un Fab recombinante humano (Fab-d) que reconoce un epítopo conformacional sobre gp41 y se une a viriones de HIV-1 así como a células infectadas con HIV-1 pero no a células no infectadas, según se analiza por FACS. La deleción de cualquier motivo helicoidal, es decir, DP107 o DP178, de la proteína de fusión M41 eliminaba la reactividad con Fab-d. Estos resultados indican que ambas regiones helicoidales, separadas por 60 aminoácidos en la secuencia principal, se requieren para mantener el epítopo Fab-d.
8.2.2 Actividad anti-HIV del ectodominio recombinante de GP41
La proteína de fusión M41 silvestre se probó con respecto a la actividad anti-HIV-1. Según se explica previamente, los péptidos sintéticos correspondientes a la cremallera de leucina (DP107) y la hélice putativa C-terminal (DP178) muestran potente actividad anti-HIV. A pesar de la inclusión de ambas regiones, la proteína M41 recombinante no afectaba a la fusión de membranas inducida por HIV-1 a concentraciones tan altas como 50 \muM (Tabla XII, a continuación).
TABLA XII La ruptura de la cremallera de leucina de GP41 libera el motivo anti-HIV
53 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 1 \+  \begin{minipage}[t]{137mm} Las constantes de afinidad de
la unión de Fab-d a las proteínas de fusión se
determinaron usando un procedimiento descrito por B. Friguet y
otros, 1985, J. Immunol. Method.
77:305-319.\end{minipage} \cr  \+
 \begin{minipage}[t]{137mm} - = Unión no detectable de
Fab-d a las proteínas de
fusión.\end{minipage} \cr  \+  \begin{minipage}[t]{137mm}
 Ensayos de Infectividad Antivirales . Se incubaron 20  \mu l
de reserva de virus diluida en serie durante 60 minutos a
temperatura ambiente con 20  \mu l de la concentración indicada de
proteína de fusión recombinante purificada en RPMI 1640 que contiene
suero bovino fetal al 10% y antibióticos en una placa de
microvaloración de 96 pocillos. Se añadieron a cada pocillo 20
 \mu l de células CEM4 a 6 x 10 ^{5}  células/ml y los cultivos se
incubaron a 37ºC en una incubadora de CO _{2}  humidificada. Las
células se cultivaron durante 9 días mediante la adición de medio
reciente cada de 2 a 30 días. Los días 5, 7 y 9 después de la
infección, muestras de sobrenadantes se ensayaron con respecto a la
actividad de transcriptasa inversa (RT), según se describe más
adelante, para verificar la replicación viral. La dosis infecciosa
de cultivo tisular al 50% (TCID _{50} ) se calculó para cada
condición de acuerdo con la fórmula de Reed  \textamp 
Muench, 1937, Am. J. Hyg. 27:493  -  497. La actividad
de RT se determinó mediante una modificación de los métodos
publicados de Goff y otros, 1981, J. Virol.
38:239  -  248 y Willey y otros, 1988, J. Virol.
62:139  -  147 según se describe en Chen y otros, 1993,
AIDS Res. Human. Retroviruses
9:1079  -  1086.\end{minipage} \cr}
Sorprendentemente, una sola substitución de aminoácidos, prolina en lugar de isoleucina en el medio del motivo de la cremallera de leucina, daba una proteína de fusión (M41-P) que exhibía actividad antiviral (Tabla XII y figura 8). Según se observa en la Tabla XII, M41-P bloqueaba la formación de sincitios en 90% a aproximadamente 85 nM y neutralizaba la infección por HIV-1_{IIIB} en 90% a concentraciones de aproximadamente 70 nM. La actividad anti-HIV-1 de M41-P parecía estar mediada por las secuencia helicoidal C-terminal ya que la deleción de esa región de M41-P daba una proteína de fusión inactiva M41-P\Delta178 (Tabla XII). Esa interpretación estaba reforzada por experimentos que demostraban que una proteína de fusión truncada que carecía de la secuencia de DP178, M41\Delta178, suprimía la potente actividad antifusión del péptido DP178 de una manera dependiente de la concentración (figura 9). La misma proteína de fusión truncada que contenía la mutación de prolina que rompe la cremallera de leucina, M41-P\Delta178, no era activa en experimentos de competición similares (figura 9). Los resultados indican que el péptido DP178 se asocia con un segundo sitio sobre gp41 cuya estructura interactiva depende de una secuencia de la cremallera de leucina silvestre. Puede producirse una interacción similar dentro de la proteína de fusión silvestre, M41, y actuar para formar un broche intramolecular que secuestra la región DP178, haciéndola no disponible para la actividad antiviral.
Una asociación específica entre estos dos dominios también está indicada por otros estudios de Fab-d monoclonal humano, por ejemplo, Fab-d no se unía al péptido DP-178 o la proteína de fusión M41\Delta178, pero su epítopo se reconstituía simplemente mezclando estos dos reaccionantes entre sí (figura 10). De nuevo, la mutación de prolina en el dominio de la cremallera de leucina de la proteína de fusión, M41-P\Delta178, no reconstituía el epítopo en experimentos de mezcladura similares.
9. Ejemplo: método para la identificación asistida por ordenador de secuencias similares a DP-107 y similares a DP-178
Un número de secuencias de doble arrollamiento conocidas se ha descrito bien en la literatura y contiene el posicionamiento repetido heptádico para cada aminoácido. La nomenclatura del doble arrollamiento marca cada uno de los siete aminoácidos de una repetición heptádica A a G, tendiendo los aminoácidos A y D a ser posiciones hidrófobas. Los aminoácidos D y G tienden a estar cargados. Estas cuatro posiciones (A, D, E y G) forman la estructura de cadena principal anfipática de una hélice alfa monómera. Las cadenas principales de dos o más hélices anfipáticas interactúan entre sí para formar estructuras de doble arrollamiento di-, tri-, tetrámeras, etc. Para empezar a diseñar motivos de búsqueda informática, se eligió una serie de dobles arrollamientos bien caracterizados incluyendo factor de transcripción de levadura GCN4, bucle 36 de hemaglutinina de virus de influenza y protooncogenes humanos c-Myc, c-Fos y c-Jun. Para cada secuencia peptídica, se determinó una homología estricta para las posiciones A y D y una lista de los aminoácidos que podrían excluirse para las posiciones B, C, E, F y G (debido a que no se observan en estas posiciones). Los motivos se adaptaron a las secuencias de DP-107 y DP-178 deduciendo las posibilidades más probables para el posicionamiento heptádico de los aminoácidos de DP-107 de HIV-1 Bru, que se sabe que tiene estructura de doble arrollamiento, y DP-178 de HIV-1 Bru, que todavía está estructuralmente indefinido. El análisis de cada una de las secuencias está contenido en la figura 12. Por ejemplo, el motivo para GCN4 se diseñó como sigue:
1.
Los únicos aminoácidos (usando códigos de aminoácidos de una sola letra estándar) encontrados en las posiciones A o D de GCN4 eran [LMNV].
2.
Todos los aminoácidos se encontraban en las posiciones B, C, E, F y G excepto {CFGIMPTW}.
3.
Por lo tanto, el motivo PESEARCH se escribiría como sigue:
54
Traduciendo o leyendo el motivo: "en la primera posición A, deben estar presentes L, M, N o V; en las posiciones B y C (las dos posiciones siguientes) se acepta todo excepto C, F, G, I, M, P, T o W; en la posición D, deben estar presentes L, M, N o V; en las posiciones E, F y G (las 3 posiciones siguientes) se acepta todo excepto C, F, G, I, M, P, T o W". Esta relación está contenida cuatro veces en un motivo 28-mero y cinco veces en un motivo 35-mero. La clave del motivo básica sería entonces: [LMNV]-{CFGIMPTW}. Las claves del motivo para las secuencias de doble arrollamiento bien descritas restantes se resumen en la figura 12.
El diseño del motivo para DP-107 y DP-178 era ligeramente diferente de las secuencias del modelo 28-mero descrito previamente debido al hecho de que las posiciones repetidas heptádicas no están definidas y los péptidos son ambos más largos que 28 residuos. La figura 13 ilustra varios alineamientos de secuencia posibles tanto para DP-107 como para DP-178 y también incluye diseños de motivos basados en 28-meros, 35-meros y péptidos de longitud completa. Nótese que solo se presentan ligeras diferencias en los motivos ya que los péptidos están alargados. Generalmente, alargar el péptido base da como resultado un motivo menos restrictivo. Esto es muy útil para ampliar las posibilidades de identificar secuencias de aminoácidos primarias similares a DP-107 o DP-178 denominadas en este documento "aciertos".
Además de elaborar motivos altamente específicos para cada secuencia peptídica típica que ha de buscarse, también es posible elaborar motivos "híbridos". Estos motivos se elaboran "cruzando" dos o más motivos muy restrictivos para elaborar un nuevo algoritmo de búsqueda que no solo encontrará ambas secuencias de motivos "parentales" sino también cualesquiera secuencias peptídicas que tengan similitudes con uno, el otro o ambos "padres". Por ejemplo, en la Tabla 3, la secuencia "parental" de GCN4 está cruzada con cada uno de los posibles motivos "parentales" de DP-107. Ahora, el motivo híbrido debe contener todos los aminoácidos encontrados en las posiciones A y D de ambos padres y excluir todos los aminoácidos no encontrados en cualquier padre en las otras posiciones. El híbrido resultante de cruzar GCN4 o [LMNV] {CFGIMPTW} y DP-107 (28-mero con la primera L en la posición D) o [ILQT] {CDFIMPST} es [ILMNQTV]{CFIMPT}. Nótese que ahora solo existen dos motivos híbridos básicos que cubren ambas posibilidades de estructuración, así como todas las longitudes peptídicas de la molécula DP-107 parental. La figura 15 representa las hibridaciones de GCN4 con DP-178. La figura 16 representa las hibridaciones de DP-107 y DP-178. Es importante tener en cuenta que los motivos representados, tanto parentales como híbridos, son claves de motivos y no la representación del motivo de longitud completa necesario para realizar realmente la búsqueda informática.
Pueden realizarse hibridaciones sobre cualquiera combinación de dos o más motivos. La Tabla 5 resume varias hibridaciones de tres motivos incluyendo GCN4, DP-107 (ambas configuraciones) y DP-178 (también ambas configuraciones). Nótese que los motivos resultantes están ahora volviéndose mucho más similares entre sí. De hecho, los motivos híbridos primero y tercero son realmente subgrupos de los motivos híbridos segundo y cuarto, respectivamente. Esto significa que los motivos híbridos primero y tercero son ligeramente más restrictivos que el segundo y cuarto. También debe apuntarse que con cambios solo mínimos en estos cuatro motivos, o hibridándolos, podría obtenerse un solo motivo que encontraría todas las secuencias. Sin embargo, debe recordarse que la restricción también se reduce. Finalmente, el motivo híbrido de espectro más amplio y menos restrictivo se describe en la figura 8, que resume la hibridación de GCN4, DP-107 (ambas configuraciones), DP-178 (ambas configuraciones), c-Fos, c-Jun, c-Myc y el bucle 36 de Flu.
Se diseñó un grupo especial de motivos basado en el hecho de que DP-178 está situado solo aproximadamente 10 aminoácidos aguas arriba de la región que abarca la transmembrana de gp41 y justo C-terminal a una prolina que separa DP-107 y DP-178. Se ha postulado que DP-178 puede ser una hélice anfipática cuando está asociada a la membrana y que la prolina podría ayudar a la iniciación de la formación de la hélice. La misma disposición se observó en el virus sincitial respiratorio; sin embargo, la región similar a DP-178 en este virus también tenía una cremallera de leucina justo C-terminal a la prolina. Por lo tanto, los motivos de prolina N-terminal-cremallera de leucina diseñados se diseñaron para analizar si cualesquiera otros virus contienen este mismo patrón.
Los motivos se resumen en la figura 19. La base de datos de proteínas PC/Gene contiene 5879 secuencias de aminoácidos virales (archivo de la biblioteca PVIRUSES; CD-ROM edición 11.0). De estas, 1092 son secuencias de envuelta o glicoproteína virales (archivo de la biblioteca PVIRUSE1). Las Tablas V a X contienen listas de nombres de secuencias proteínicas y localizaciones acertadas de motivos para todos los motivos buscados.
10. Ejemplo: identificación asistida por ordenador de secuencias similares a DP-107 y DP-178 en virus de inmunodeficienica humana
La figura 20 representa resultados de búsqueda para gp41 de aislado BRU de HIV-1 (secuencia proteínica de PC/Gene PENV_HV1BR). Nótese que el motivo híbrido que cruza DP-107 y DP-178 (denominado 107x178x4; el mismo motivo que se encuentra en la figura 16) encontraba tres aciertos, incluyendo los aminoácidos 550-599, 636-688 y 796-823. Estas áreas incluyen DP-107 más ocho aminoácidos N-terminales y cuatro C-terminales; DP-178 más siete aminoácidos N-terminales y diez C-terminales; y un área dentro de la región de transmembrana (citoplásmica). La figura 20 también contiene los resultados obtenidos de la búsqueda con el motivo denominado ALLMOTI5, del que la clave se encuentra en la figura 17 ({CDGHP}{CFP}x5). Este motivo también encontraba tres aciertos incluyendo DP-107 (aminoácidos 510-599), DP-178 (615-717) y una región citoplásmica (772-841). Estos aciertos se solapan con los aciertos encontrados por el motivo 107x178x4 con secuencias adicionales considerables sobre los extremos tanto amino como carboxi. Esto no es sorprendente ya que 107x178x4 es un subgrupo del motivo híbrido ALLMOTI5. De forma importante, aun cuando la restricción de ALLMOTI5 sea considerablemente menor que 107x178x4, todavía identifica selectivamente las regiones DP-107 y DP-178 de gp41 que se muestra que contienen secuencias para péptidos inhibidores de HIV-1. Los resultados de estas dos búsquedas de motivos se resumen en la Tabla V bajo la secuencia proteínica de PC/Gene llamada PENV HV1BR. Los motivos de prolina-cremallera de leucina también dan varios aciertos en HIV-1 BRU incluyendo 503-525 que está en el propio extremo C de gp120, justo aguas arriba del sitio de segmentación (P7LZIPC y P12LZIPC); y 735-768 en el dominio citoplásmico de gp41 (P23LZIPC). Estos resultados se encuentran en la Tablas VIII, IX y X bajo el mismo nombre de secuencia que se menciona previamente. Nótese que el único área de HIV-1 BRU que se predice mediante el algoritmo de Lupas que contiene una región de doble arrollamiento es a partir de los aminoácidos 635-670. Esta comienza ocho aminoácidos N-terminal al inicio y acaba ocho aminoácidos N-terminal al final de DP-178. No se predice usando el método de Lupas que DP-107, a pesar del hecho de que es un doble arrollamiento conocido, contenga una región de doble arrollamiento.
11. Ejemplo: identificación asistida por ordenador de secuencias similares a DP-107 y similares a DP-178 en virus sincitial respiratorio humano
La figura 21 representa resultados de búsqueda para glicoproteína de fusión F1 de virus sincitial respiratorio humano (RSV; Cepa A2) (nombre de la secuencia proteínica de PC/Gene PVGLF_HRSVA). El motivo 107x178x4 encuentra tres aciertos que incluyen los aminoácidos 152-202, 213-243 y 488-515. La disposición de estos aciertos es similar a la que se encuentra en HIV-1 excepto que el motivo encuentra dos regiones con similitudes con DP-178, una justo aguas abajo de lo que se denominaría la región DP-107 o los aminoácidos 213-243, y una justo aguas arriba de la región de transmembrana (también similar a DP-178) o los aminoácidos 488-515. El motivo ALLMOTI5 también encuentra tres áreas que incluyen los aminoácidos 116-202, 267-302 y 506-549. Los motivos de prolina-cremallera de leucina también tienen varios aciertos que incluyen los aminoácidos 205-221 y 265-287 (P7LZIPC 265-280, P12LZIPC) y 484-513 (P7LZIPC y P12LZIPC 484-506, P23LZIPC). Nótese que los motivos PLZIP también identifican regiones que comparten similitudes de localización con DP-178 de HIV-1.
12. Ejemplo: identificación asistida por ordenador de secuencias similares a DP-107 y similares a DP-178 en virus de inmunodeficiencia simiesca
Los aciertos de los motivos para gp41 de virus de inmunodeficiencia simiesca (aislado AGM3; nombre de la secuencia proteínica de PC/Gene PENV_SIVAG) se muestran en la figura 22. El motivo 107x178x4 encuentra tres aciertos que incluyen los aminoácidos 566-593, 597-624 y 703-730. Los dos primeros aciertos solo tienen tres aminoácidos entre ellos y probablemente podrían combinarse en un acierto de 566-624 que representaría un acierto similar a DP-107. Los aminoácidos 703 a 730 representarían entonces un acierto similar a DP-178. ALLMITO5 también encuentra tres aciertos que incluyen los aminoácidos 556-628 (similar a DP-107), 651-699 (similar a DP-178) y 808-852 que representa la región que abarca la transmembrana. SIV también tiene una región de 655-692 con una alta propensión a formar un doble arrollamiento según se predice mediante el algoritmo de Lupas. Los motivos tanto 107x178x4 como ALLMOTI5 encuentran la misma región. SIV no tiene aciertos para el motivo PLZIP en gp41.
13. Ejemplo: identificación asistida por ordenador de secuencias similares a DP-107 y similares a DP-178 en virus de moquillo canino
La glicoproteína de fusión F1 del virus del moquillo canino (cepa Onderstepoort) (nombre de la secuencia proteínica de PC/Gene PVGLF_CDVO) tiene regiones similares a RSV humano que se predice que son similares a DP-107 y similares a DP-178 (figura 23). El motivo 107x178x4 destaca un área justo C-terminal al péptido de fusión en los aminoácidos 252-293. También se predice que los aminoácidos 252-286 son de doble arrollamiento usando el algoritmo de Lupas. Casi 100 aminoácidos C-terminales a la primera región son un área similar a DP-178 en los residuos 340-376. ALLMOTI5 destaca tres áreas de interés que incluyen: los aminoácidos 228-297, que se solapan completamente tanto con la predicción de Lupas como con el acierto de 107x178x4 similar a DP-107; los residuos 340-381, que se solapan con el segundo acierto de 107x178x4; y los aminoácidos 568-602, que son similares a DP-178 ya que están situados justo N-terminales a la región de transmembrana. También se solapa con otra región (residuos 570-602) que se predice mediante el método de Lupas que tiene una alta propensión a formar un doble arrollamiento. Varios motivos PLZIP identificaban satisfactoriamente áreas de interés incluyendo P6 y P12LZIPC que destacan los residuos 336-357 y 336-361, respectivamente; P1 y P12LZIPC que encuentran los residuos 398-414; y P12 y P23LZIPC que encuentran los residuos 562-589 y 562-592, respectivamente.
14. Ejemplo: identificación asistida por ordenador de secuencias similares a DP-107 y similares a DP-178 en el virus de la enfermedad de newcastle
La figura 24 muestra los aciertos de los motivos encontrados en el virus de la enfermedad de Newcastle (cepa Australia/Victoria/32; nombre de la secuencia proteínica de PC Gene PVGLF_NDVA). El motivo 107x178x4 encuentra dos áreas incluyendo un acierto similar a DP-107 en los aminoácidos 157-178 y un acierto similar a DP-178 en los residuos 426-515. ALLMOTI5 encuentra tres áreas que incluyen los residuos 117-182, 231-272 y 426-512. Los aciertos de 426-512 incluyen una región que se predice mediante el método de Lupas que tiene una alta propensión al doble arrollamiento (460-503). Los motivos PLZIP identifican solo una región de interés en los aminoácidos 273-289 (P1 y 12LZPIC).
15. Ejemplo: identificación asistida por ordenador de secuencias similares a DP-107 y similares a DP-178 en virus de parainfluenza humana
Ambos motivos 107x178x4 y ALLMOTI5 exhiben aciertos similares a DP-107 en la misma región, 115-182 y 117-182, respectivamente, del virus de parainfluenza humana (cepa NIH 47885; nombre de la secuencia proteínica de PC/Gene PVGLF_p13H4; figura 25). Además, los dos motivos tienen un acierto similar a DP-178 justo ligeramente C-terminal en los aminoácidos 207-241. Ambos motivos tienen también aciertos similares a DP-178 más cerca de la región de transmembrana que incluyen los aminoácidos 457-497 y 462-512, respectivamente. También se observan varios aciertos del motivo PLZIP que incluyen 283-303 (P5LZIPC), 283-310 (P12LZIPC), 453-474 (P6LZIPC) y 453-481 (P23LZIPC). El algoritmo de Lupas predice que los aminoácidos 122-176 tienen propensión a formar un doble arrollamiento.
16. Ejemplo: identificación asistida por ordenador de secuencias similares a DP-107 y similares a DP-178 de virus de influenza A
La figura 26 ilustra la predicción de Lupas para un doble arrollamiento en virus de influenza A (cepa A/Aichi/2/68) en los residuos 379-436, así como los aciertos del motivo para 107x178x4 en los aminoácidos 387-453 y para el motivo ALLMOTI5 en los residuos 380-456. Fue mostrado por Carr y Kim que Los residuos 383-471 (38-125 de HA2) son un doble arrollamiento extendido cuando están bajo pH ácido (Carr y Kim, 1993, Cell 73: 823-832). El algoritmo de Lupas predice un doble arrollamiento en los residuos 379-436. Los tres métodos predecían satisfactoriamente que la región mostrada tenía realmente estructura de doble arrollamiento; sin embargo, ALLMOTI5 predecía la mayor porción del alargamiento del residuo 88.
17. Ejemplo: compuestos antivirales de RSV
En los ejemplos presentados aquí, se muestra que secuencias peptídicas del virus sincitial respiratorio (RSV) identificadas utilizando las búsquedas de secuencias peptídicas de doble arrollamiento asistidas por ordenador descritas en el Ejemplo 9, previamente, codifican dominios peptídicos que exhiben similitud estructural con péptidos de doble arrollamiento conocidos reales y, adicionalmente, se encuentra que exhiben actividad antiviral.
17.1 Materiales y métodos
Los análisis estructurales consistían en estudios de dicroismo circular (CD) que se efectuaron de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de Patente de EE.UU. en tramitación conjunta, de los solicitantes, Nº de Serie 08/073.028.
La actividad antiviral anti-RSV se ensayó como se describe en Pringle, C.R. y otros, 1985, J. Medical Vir. 17:377-386.
Se utilizaron un péptido F2 de RSV de 48 aminoácidos y un péptido T67 de RSV de 53 aminoácidos que abarcan secuencias que se identifican a través de las estrategias de búsqueda de secuencias peptídicas asistidas por ordenador descritas en el Ejemplo 9, previamente. Véase la figura 21 para la posición exacta de estas secuencias y para los motivos utilizados.
17.2 Resultados
Se sintetizaron oligopéptidos 35-meros que constituían porciones de la secuencia peptídica F2 de RSV de 48 aminoácidos (figura 27) y porciones de la secuencia peptídica T62 de RSV de 53 aminoácidos (figura 28). Los oligopéptidos se ensayaron, a través de análisis de CD, con respecto a la similitud estructural con estructuras de doble arrollamiento conocidas y con respecto a la actividad anti-RSV. Según se muestra en las figuras 27 y 28, un número de estos oligopéptidos exhibía similitud estructural de doble arrollamiento y/o actividad antiviral substanciales.
Así, las búsquedas asistidas por ordenador descritas aquí, en el Ejemplo 9, por ejemplo, identificaban satisfactoriamente dominios peptídicos virales que representan compuestos antivirales anti-RSV muy prometedores.
18. Ejemplo: compuestos antivirales de HPF3
En el ejemplo presentado aquí, se muestra que secuencias peptídicas de virus de parainfluenza humana 3 (HPF3) identificadas utilizando las búsquedas de secuencias peptídicas de doble arrollamiento asistidas por ordenador descritas en el Ejemplo 9 codifican dominios peptídicos que exhiben similitud estructural con péptidos de doble arrollamiento conocidos reales, y se encuentra adicionalmente que exhiben actividad antiviral.
18.1 Materiales y métodos
Los análisis estructurales consistían en estudios de dicroismo circular (CD), que se efectuaron de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de Patente de EE.UU. en tramitación conjunta, de los solicitantes, Nº de Serie 08/073.028.
La actividad antiviral anti-HPF3 se ensayó según se describe en Pringle, C.R. y otros, 1985, J. Medical Vir. 17:377-386.
Se utilizan un péptido de HPF3 de 56 aminoácidos y uno de 70 aminoácidos que abarcan las secuencias que se identificaron a través de las estrategias de búsqueda de secuencias peptídicas asistidas por ordenador descritas en el Ejemplo 9, previamente. Véase la figura 25 para las posiciones exactas de estas secuencias y para los motivos utilizados.
18.2 Resultados
Se sintetizaron oligopéptidos 35-meros que constituían porciones de la secuencia peptídica de HPF3 de 56 aminoácidos (figura 29) y porciones de la secuencia peptídica de HPF3 de 70 aminoácidos (figura 30). Los oligopéptidos se ensayaron, a través de análisis de CD, con respecto a la similitud estructural con estructuras de doble arrollamiento conocidas y con respecto a la actividad anti-HPF3. Según se muestra en las figuras 29 y 30, un número de estos oligopéptidos exhibía similitud estructural de doble arrollamiento y/o actividad antiviral substanciales.
Así, las búsquedas asistidas por ordenador descritas aquí, en el Ejemplo 9, por ejemplo, identificaban satisfactoriamente dominios peptídicos virales que representan compuestos antivirales anti-HPF3 muy prometedores.
La presente invención no ha de limitarse en el alcance mediante las modalidades específicas descritas que deben entenderse como ilustraciones simples de aspectos individuales de la invención, y métodos y componentes funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. En efecto, diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas aquí, se harán evidentes para los expertos en la especialidad a partir de la descripción precedente y los dibujos adjuntos. Tales modificaciones pretenden estar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
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(i)
SOLICITANTE:
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: INHIBIDORES PEPTÍDICOS SINTÉTICOS DE LA TRANSMISIÓN DE HIV
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(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 36
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO:CABINET WEINSTEIN LAW OFFICE
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(B)
CALLE: 20 AVENUE DE FREIDLAND
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(C)
CIUDAD: PARÍS
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(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
ZIP: 75008
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(iv)
FORMA LEIBLE POR COMPUTADORA:
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(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
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(B)
COMPUTADORA: PC Compatible con IBM
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
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(D)
SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release # 1.0, Versión # 1.25
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(vi)
DATOS DE SOLICITUD PREVIOS:
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 94919201.7
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-JUNIO-1994
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(C)
CLASIFICACIÓN:
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(vii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE
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(A)
NOMBRE: YVES DURAND
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 48363 EURO/PCT
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(viii)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
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(A)
TELÉFONO: 45 63 2231
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(B)
TELEFAX: 45 62 0423
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(C)
TELEX: 651 241 POPRI
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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 1:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 aminoácidos
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(B)
TIPO: aminoácido
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(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 1:
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500 
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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
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(A)
LONGITUD: 36 aminoácidos
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(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
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(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
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(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 2:
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501 
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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 3:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
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(A)
LONGITUD: 36 aminoácidos
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(B)
TIPO: aminoácido
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(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
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(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
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(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 3:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
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(A)
LONGITUD: 36 aminoácidos
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(B)
TIPO: aminoácido
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(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
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(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
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(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 3:
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502 
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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 4:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
503 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
504 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
505 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
506 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
507 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln}
\sac{Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
509 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGACGCTGA CGGTACAGGC C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGACTAAGCT TAATACCACA GCCAATTTGT TAT 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAGCTGCTT GGGGCCCCAG AC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAAATCCCC AGGAGCTGCT CGAGCTGCAC TATACCAGAC 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATAGCTTCTA GATTAATTGT TAATTTCTCT GTCCC 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = A
\vskip0.500000\baselineskip
/nota = "X comprende un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorometoximetilcarbonilo, un grupo hidrófobo o un portador macromolecular"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 50
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = B
\vskip0.500000\baselineskip
/nota = "X comprende un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo hidrófobo o un grupo un portador macromolecular"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
510 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = A
\vskip0.500000\baselineskip
/nota = "X comprende un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorometoximetilcarbonilo, un grupo hidrófobo o un portador macromolecular"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 39
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = B
\vskip0.500000\baselineskip
/nota = "X comprende un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo hidrófobo o un grupo un portador macromolecular"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
511 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 37 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = A
\vskip0.500000\baselineskip
/nota = "X comprende un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorometoximetilcarbonilo, un grupo hidrófobo o un portador macromolecular"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 37
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = B
\vskip0.500000\baselineskip
/nota = "X comprende un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo hidrófobo o un grupo un portador macromolecular"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
512 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 37 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = A
\vskip0.500000\baselineskip
/nota = "X comprende un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorometoximetilcarbonilo, un grupo hidrófobo o un portador macromolecular"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 37
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = B
\vskip0.500000\baselineskip
/nota = "X comprende un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo hidrófobo o un grupo un portador macromolecular"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
513 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
514 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
515 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
516 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
517 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
518 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
519 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 338 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
520 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 437 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
521 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 328 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
522 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 438 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
523 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 436 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
524 
\vskip1.000000\baselineskip
525 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 430 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
526 
\vskip1.000000\baselineskip
527 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 221 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
528 
\vskip1.000000\baselineskip
529 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 48 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
530 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 53 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
531 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 56 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
532 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 70 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
533

Claims (13)

1. Un péptido que tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en:
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z (ID SEC Nº:1)
X-LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
y X-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
en la que los residuos de aminoácido son presentados mediante el código de una sola letra;
X es un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo, un grupo hidrófobo o un grupo portador macromolecular;
en donde el grupo hidrófobo X es carbobenzoxilo, dansilo o t-butoxicarbonilo;
Z es un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo hidrófobo t-butiloxicarbonilo o un grupo portador macromolecular;
en donde el grupo portador macromolecular es un conjugado de lípido-ácido graso, un polietilenglicol o un resto carbohidrato.
2. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácidos
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z (ID SEC Nº:1)
en la que los residuos de aminoácido son presentados mediante el código de una sola letra;
X es un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo, un grupo hidrófobo o un grupo portador macromolecular;
en donde el grupo hidrófobo X es carbobenzoxilo, dansilo o t-butoxicarbonilo;
Z es un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo hidrófobo t-butiloxicarbonilo o un grupo portador macromolecular;
en donde el grupo portador macromolecular es un conjugado de lípido-ácido graso, un polietilenglicol o un resto carbohidrato.
3. Un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos
X-YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z (ID SEC Nº:3)
en la que los residuos de aminoácido son presentados mediante el código de una sola letra;
X es un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo, un grupo hidrófobo o un grupo portador macromolecular;
en donde el grupo hidrófobo X es carbobenzoxilo, dansilo o t-butoxicarbonilo;
Z es un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo hidrófobo t-butiloxicarbonilo o un grupo portador macromolecular;
en donde el grupo portador macromolecular es un conjugado de lípido-ácido graso, un polietilenglicol o un resto carbohidrato.
4. Un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos
X-YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF-Z (ID SEC Nº:4)
en la que los residuos de aminoácido son presentados mediante el código de una sola letra;
X es un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo, un grupo hidrófobo o un grupo portador macromolecular;
en donde el grupo hidrófobo X es carbobenzoxilo, dansilo o t-butoxicarbonilo;
Z es un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo hidrófobo t-butiloxicarbonilo o un grupo portador macromolecular;
en donde el grupo portador macromolecular es un conjugado de lípido-ácido graso, un polietilenglicol o un resto carbohidrato.
5. Un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos
X-YTSLIYSLLEKSQTQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z (ID SEC Nº:5)
en la que los residuos de aminoácido son presentados mediante el código de una sola letra;
X es un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo, un grupo hidrófobo o un grupo portador macromolecular;
en donde el grupo hidrófobo X es carbobenzoxilo, dansilo o t-butoxicarbonilo;
Z es un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo hidrófobo t-butiloxicarbonilo o un grupo portador macromolecular;
en donde el grupo portador macromolecular es un conjugado de lípido-ácido graso, un polietilenglicol o un resto carbohidrato.
6. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, en el que un enlace que conecta aminoácidos adyacentes es un enlace no peptídico, además, en el que el enlace no peptídico es un enlace imino, éster, hidrazina, semicarbazida o azo.
7. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, en el que al menos un residuo de aminoácido está en una configuración de isómero D.
8. El péptido de acuerdo con la reivindicación 2, en el que X es un grupo amino y Z es un grupo carboxilo.
9. El péptido de acuerdo con la reivindicación 2, en el que X es un grupo carbobenzoxilo, dansilo o hidrófobo t-butiloxicarbonilo; y Z es un grupo hidrófobo t-butiloxicarbonilo o un grupo amido.
10. El péptido de acuerdo con la reivindicación 2, en el que X es un grupo acetilo o un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo; y Z es un grupo hidrófobo t-butiloxicarbonilo o un grupo amido.
11. Un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos
YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (ID SEC Nº:1)
en la que los residuos de aminoácido son presentados mediante el código de una sola letra.
12. El péptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, para usar como un agente antiviral en el tratamiento de HIV-1.
13. Uso del péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para la fabricación de un medicamento para usar como un agente antiviral en el tratamiento de infección por HIV-1.
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